WO2003005301A1 - Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala - Google Patents

Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala Download PDF

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WO2003005301A1
WO2003005301A1 PCT/ES2002/000327 ES0200327W WO03005301A1 WO 2003005301 A1 WO2003005301 A1 WO 2003005301A1 ES 0200327 W ES0200327 W ES 0200327W WO 03005301 A1 WO03005301 A1 WO 03005301A1
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angiogenesis
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Luis ÁLVAREZ VALLINA
Adolfo MUÑOZ CARREO
Mario Pascual Carrasco
Laura Sanz Alcober
Miguel GONZÁLEZ DE MINGO
Carlos HERNÁNDEZ SALVADOR
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Madrid Genetics, S.L.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates

Definitions

  • HTS high-throughput screening
  • Figure 1A the strategy to develop a specific examination platform (Figure 1A) to assess antiangiogenic activities was to scale the morphogenic matrix-based assay from a typical 96-well, 30-35 culture surface mm 2 , to a well cultivation area of 1.3 mm 2 (Terasaki microplate format). Under these conditions, the formation of macro and microvascular EC tubes was parallel to that observed in conventional trials ( Figure 1; data not shown). Next, the amount of matrix, the number of cells and other variables was optimized for formats of 384 wells (5 mm 2 culture surface) and 1536 wells (2.8 mm 2 culture surface) of high density, where CDs performed very reproducible angiogenesis bioassays (Figure 1; data not shown).
  • Figure 1C shows the images before and after their treatment, as well as the Al values assigned to each well. Al values were proportional to the degree of modulation in the EC tube formation ( Figure 1 D).
  • a computerized analysis has been applied to angiographic images in chorioallantoic membrane assays in chick embryo ⁇ or directly in solid tumor tissue samples 9 , although they require thorough manipulation and do not meet at all all the qualitative and quantitative criteria of HTS.
  • HMEC-1 cells were cultured in an MCDB-131 medium (Gibco BRL, Rockville, USA) supplemented with 10% FCS, 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF) and 1 mg / ml hydrocortisone . EGF and hydrocortisone were obtained in Sigma (St. Louis, MO, USA). Endothelial cells of normal human umbilical cord vein (HUVE) (CRL-1730) were grown in a Ham's F12K medium (Gibco BRL) supplemented with 10% FCS, 50 g / ml ECGS and 100 g / ml heparin .
  • HUVE human umbilical cord vein
  • the total volume of medium was adjusted to 100 I (384 well plates), 25 I (Terasaki plates), or 5 I (1536 well plates), the plates being incubated for 12-14h at 37 ° C in a humidified environment with 5% of C0 2 .
  • the antiangiogenic effect of the different reagents was assessed by incorporating them, diluted in a suitable medium to different concentrations, to the Matrigel coated plates by forming platelets with the EC cells.
  • the present invention proposes an assay platform consisting of a standardized and miniaturized model of in vitro angiogenesis described elsewhere [a16] and an image acquisition and processing system, which is set forth herein.
  • the method object of this invention is composed of the following phases: preparation and organization of an experiment; acquisition and characterization of the images; processing comprising three parts, determination of the useful work area, segmentation, and characterization and quantification of parameters; finally, synthesis of the angiogenesis index and synthesis of the relative angiogenesis index, storage, management and presentation of data and results obtained in each experiment.
  • Figure 1 Schematic representation of the high performance lead validation platform based on morphogenesis.
  • A Human macro or microvascular ECs are allowed to differentiate into capillary-like structures in reconstituted basement membrane components for 12-14 hours, in the presence or absence of potential inhibitory agents (diversity), followed by automated acquisition and treatment with Angiodrawer TM software to quantify tubular formation with respect to controls in predetermined positions.
  • B Reproducibility of method.
  • the angiogenic index (Al) is calculated based on [(total length of linked tubes / analysis surface) / 1000]. Each value represents the average of ten control wells, in the three formats used (microplates of 384 wells, 1536 wells and Terasaki), as well as typical deviations and coefficients of variation.
  • Figure 2.- Final result of the Ang ⁇ odrawer TM software a color code shows the percentage of tube formation in each well with respect to the average Al values obtained by the controls. In the left half of the plate (192 wells) all wells except the controls are tested with different concentrations of randomly distributed inhibitory agents (characterized by wells). In the right half of the plate (192 wells), identification of an inhibitory agent (four wells) against PBS in a double-blind experiment.
  • Figure 3. Shows from left to right the work plates with 72, 384, 1536 wells respectively.
  • Figure 4. It shows the possible geometries of the wells, whether they are frustoconical in the representations in elevation and left plan, or parallelepiped in the representations in elevation and plan to the right of the figure.
  • Figure 6. Shows the morphological characteristics present in an image.
  • Figure . Shows the block diagram of the processing.
  • Figure 8.- Sample a) Work area in "terasaky” microplates. b) Result application 15x15 medium filter.
  • Figure 9. Shows the determination of the work area in Terasaky microplates. a) Diagonal; b) Diagonal profiles; c) Work area
  • FIG. 10 Schematically shows the segmentation procedure.
  • Figure 13 Shows the decision algorithm for backg round determination.
  • Figure 14 Sample: a) Image X 0w ⁇ b) image X 0w in, c) image Y 0 , respectively.
  • Figure 15.- Shows the final image Y.
  • Figure 16. It is a representation of the application of storage, management and presentation of results
  • Figure 17. Shows case of a bubble in the matrix, a) Original image X; b) Final image Y.
  • Figure 18.- Shows a case of blur due to non-parallelism, a) Original image X; b) Final image Y.
  • Figure 19.- It shows a case of lump (giant), a) Original image X; b) Final image Y.
  • Figure 20 Shows Work Area smaller than original, a) Original image X; b) Final image Y.
  • Figure 21 Shows an example of inaccuracies in an exclusively morphological analysis.
  • the standard in vitro angiogenesis model is the one used to evaluate the test platform; It is based on the culture of endothelial cells on an extracellular matrix that determines their differentiation in capillary structures called "vessels" or "channels” [a9].
  • each well (2) four elements are deposited: - matrix (5), deposited at the bottom of the well (2) in such a way that, under optimal conditions, it results in a homogeneous and uniform volume parallel to the base of the well (2),
  • - Plate characterized by the number and geometry of the wells (see Fig. 3, 4). The number of plates in a series is dependent on the number of reagents to be tested.
  • - Well characterized by the presence (type and concentration) or absence of reagent.
  • the unit of analysis in a given experiment is plate (1), and within each plate the processing unit is well (2).
  • the distribution on each plate (1) and the specific content of the wells (2) follow predetermined rules and establish their classification into three categories: - not used, marked in advance and excluded from any subsequent procedure. - control, in predetermined number and predetermined location (the diagonal of the plaque), in which the cells have been allowed to evolve freely without the presence of angiogenic inhibitors; Y
  • the acquisition of images is carried out through a microscope (6) inverted Axiovert 100 (Cari Zeiss, Germany) motorized in the three X / Y / Z axes, and a digital camera (1 CCD) SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.) .
  • the optimal acquisition conditions are set for brightness, contrast, number of increases (x10), exposure time, etc .;
  • the images are acquired sequentially and automatically with a size per image of 328x256 pixels (1/4 maximum resolution) and 256 gray levels, resulting in an image file size (.bmp) of 84K.
  • the number of images obtained depends on the type of plate (1) used.
  • FIG. 6 shows an image acquired on a Terasaki plate in which all the characterizing morphological components that can be found in an in vitro angiogenesis experiment appear.
  • the cells deposited on the matrix (5) form unions and clusters, weaving a network of randomly interconnected channels [a9].
  • the specific morphological elements that characterize the images obtained are:
  • - Cell clumps (8) originated at the time of preparation of the experiment due to insufficient dispersion of the culture. They are characterized by having an indeterminate size and a rough texture greater than that of the cellular interconnection channels.
  • the processing of the experiment is divided into two parts: - image processing well, consisting of the characterization, extraction and quantification of the morphological and topological structures existing in the image.
  • AI angiogenesis index
  • AI angiogenesis index
  • each image is divided into three parts as illustrated in Figure 7: 1 or .- work area determination (/ - / ? ); 2nd .- segmentation (H 2 ) and 3rd .- characterization of parameters (H 3 ).
  • the two diagonals of the image are drawn (see fig. 9a), in order to determine the intersection points of these diagonals with the inner circle of the interference ring.
  • the respective profiles are extracted (see fig. 9b), and the derivatives are calculated by means of bidirectional filtering with the transfer function (Z-transform) indicated in (1).
  • the detection strategy proposed in this description follows an indirect path. ; instead of trying to detect the elements of the image associated with the structures angiogenic, the opposite is pursued: detect what is not an angiogenic structure and, as a complement, determine the areas that are.
  • the only element of the image that is not an angiogenic structure is the matrix (5), which corresponds to the background (see fig. 6). Unlike the channels, nodes and lumps of cells, the background is characterized by having a very rough and uniform texture throughout the image, so its characterization and detection is much simpler. Once the background or matrix (5) is removed, the resulting image will be conditioned so that the extraction of the parameters of interest can be performed. Figure 10 details each of these parts.
  • the magnitude criterion aims to characterize the range of amplitudes of the edges in the background areas.
  • the image ⁇ X d ⁇ is divided into a mosaic without overlapping cells of size 5% of the total; for each one of them the average of the amplitude is determined resulting in the image x d (see fig 120); a threshold of amplitude k m set at 10% of the maximum obtained was established.
  • the variance criterion aims to characterize the roughness of the background areas.
  • the image is divided in a similar way (cells 5% of the total), the variance of the amplitude is calculated resulting in the image ⁇ xd (see fig
  • a threshold of variance k ⁇ is also set at 10% of the maximum obtained.
  • the cells of average border width less than the threshold k m approximately coincide with those of average variance less than the threshold k ⁇ .
  • the blank areas correspond to cells in which the average width of the edges and the average variance both exceed the respective thresholds; the black areas correspond to cells where background predominates.
  • the linearity criterion for a given pixel is met if in its neighborhood of 3x3, at least 5 pixels have the direction (both directions) with respect to the pixel ⁇ 10 °.
  • the result of applying this criterion to the image ⁇ d is the image ⁇ Xd (see fig. 12d).
  • the background detection consists of the sequential application to each pixel of X 0 (see fig 11a) of the three criteria, magnitude, variance and linearity, following the algorithm of Figure 13.
  • the objective is to construct a mask, w 2 , in which elements with value 1 correspond to angiogenic structures, and elements with value 0 indicate background.
  • the mask w 2 is constructed, it is applied to the image X 0 , resulting in the image X 0w (see fig. 12a). In this image the background has been removed, the areas around the interconnection channels, nodes, lumps of cells and isolated cells being visible.
  • the last phase includes the conditioning of the image X 0w (see fig. 14a) which consists of a binarization followed by an approach operation 3x3 [b9] (see fig. 14b), ending with a skeletonization [b9] image Y 0 ( see fig. 14c).
  • the initial work matrices are the image Y 0 and the mask w 1 work area defined in (5).
  • the candidate pixels are identified in the matrix Y 0 , identified as those in whose immediate vicinity (neighborhood 3x3) there are at least 3 other pixels equal to 1.
  • they are marked in the matrix Y 0 as nodes the isolated candidates.
  • adjacent candidates are grouped, marking themselves in the matrix I as unique nodes.
  • the remaining non-zero pixels in Y 0 are not taken into account and constitute isolated channels (which do not include nodes).
  • the channel length is calculated and it is checked whether or not it exceeds a predetermined threshold (U).
  • a new matrix is generated in which each pixel is encoded with a color depending on its nature, see Table 1. This matrix can be superimposed on the original image X 0 to have a graphic result of the process, image Y (see fig. fifteen).
  • angiogenic quantification has consisted of assessing the density of vessels generated from the detection of these structures from a morphological point of view.
  • the commonly accepted indicator to quantify vascularization is MVD (microvessel density) [a10-11], which relates the vascularized area to the total area of analysis. It is a very general measure adaptable to all models of experiments, 'in vivo' and 'in vitro'. But precisely because of its general nature, it is not very specific and ignores factors that could be decisive in an analysis that requires more differentiated results or scrutiny.
  • the proposed quantification procedure bases its calculation on a topological analysis of the vessel network taking into account additional factors such as connectivity and lengths.
  • AI angiogenesis index
  • AI H [ ⁇ Average AI in group of high angiogenesis level (controls) ⁇ A IM ⁇ idem in group of intermediate angiogenesis level
  • the IAR of an unknown well is the percentage expression described in (17) of the degree of angiogenesis developed with respect to the average CT CT RL described in (16) obtained in the control wells of the plate.
  • the average acquisition and storage time of an original well image X is 4.8 secs, including calibration, positioning and focusing times.
  • the average processing time consumed to obtain the segmented image is 54 secs.
  • the total acquisition and processing time will depend on the type of microplate used and the available computing power.
  • Borland C ++ Builder A specific application written in Borland C ++ Builder has been developed for the management of the set, through which it is controlled: acquisition, processing, environment, and presentation of results (see fig. 16).
  • Experiment identification (UID, date, comments, number of series, etc.), equipment (microscope, camera, brand, model), matrix (type, origin, catalog, lot, volume per well), medium (type, supplier, catalog, lot, volume per well), cells (type, name, origin, passes, catalog, lot, concentration, volume, appearance, etc.).
  • identification UID, date, comments, number of series, etc.
  • equipment microscope, camera, brand, model
  • matrix type, origin, catalog, lot, volume per well
  • medium type, supplier, catalog, lot, volume per well
  • cells type, name, origin, passes, catalog, lot, concentration, volume, appearance, etc.
  • Figure 16 shows the presentation of the results of a plate mod. 384w
  • the IAR is encoded in five levels presented in different colors. To visualize your original X and final Y images, just click on the well.
  • angiogenesis implies in a first step the differentiation of cells in capillary structures to evolve over time forming networks of interconnected vessels.
  • the inhibition of this process is not so much to avoid the differentiation of the cells as to hinder the interconnection of the channels generated by them, that is, to avoid the formation of effective channeling.
  • a topological analysis of the vessel network is therefore necessary to perform channel screening taking into account factors such as length and connectivity.
  • the subsequent analysis Y 0 allows the classification of the channels in connected, not connected and isolated and the calculation of their respective lengths, which consumes the level of topological analysis of the network that we had proposed and the resolution of the third error.
  • the mathematical expression proposed for the determination of AI is based on: - determining a set of channels based on a combined criteria of connectivity and length
  • angiogenesis index the sum of the lengths of the channels of said set.

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Abstract

La formación de vasos sanguíneos (angiogénesis) es un proceso necesario para el crecimiento y diseminación (metástasis) de los tumores. El desarrollo de sistemas de examen 'screening' para la identificación de compuestos inhibidores de este proceso es un campo de investigación exhaustiva, que en los últimos años camina hacia el uso de sistemas informáticos y robotizados. Se presenta un sistema de adquisición y procesamiento de imágenes, diseñado y desarrollado para ser el núcleo de una plataforma dirigida a escenarios de 'screening' masivo en experimentos basados en modelos de angiogénesis 'in vitro' miniaturizados. El sistema adquiere y procesa secuencialmente imágenes obtenidas mediante microscopio y cámara digital de los pocillos de microplacas estándar. Se propone un procedimiento de cuantificación del grado de angiogénesis basado en un análisis morfológico y topológico de la red de vasos generados, que proporciona un valor añadido al tradicional parámetro de densidad microvascular. En su cálculo se toman en consideración factores adicionales como conectividad y longitud de los vasos. El sistema cumple con los requerimientos básicos en estos experimentos: objetividad, reproducibilidad y rapidez; alcanzados por la capacidad automática de cuantificación de la actividad angiogénica desarrollada.

Description

MÉTODO PARA EVALUAR IN VITRO EN CONDICIONES FISIOLÓGICAS O
PATOLÓGICAS RELEVANTES LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE
COMPUESTOS A GRAN ESCALA D E S C R I P C I Ó N
OBJETO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La creciente demanda de candidatos a medicamentos de relevancia clínica ha impulsado la búsqueda de estrategias alternativas para mejorar la eficacia del examen de alto rendimiento "high-throughput screening" (HTS)1 (superindice: ver bibliografía). Para estudiar el efecto de los compuestos en procesos celulares concretos de un modo relevante fisiológicamente, los modelos de cultivos in vitro han de asemejarse al microentorno natural en que se producen. El microentorno celular in vivo se caracteriza por interacciones concretas de una célula con otras, con la matriz extracelular (ECM) y con factores solubles 2. Este concepto aún no se ha aplicado al HTS, que se dedica sobre todo a ensayos no celulares, o se limita a comprobar el efecto de los compuestos en ensayos sencillos basados en líneas celulares muy alejados de las condiciones fisiológicas^. Respondiendo a estos retos, en este trabajo proponemos una plataforma de validación de plomo de alto rendimiento basada en criterios morfogenéticos, para el examen a gran escala de agentes con actividad antiangiogénica en potencia. Esto ha supuesto miniaturizar un ensayo de morfogénesis vascular in vitro para su ejecución en formato de alta densidad (microplacas de 384 o 1536 pozos), y desarrollar un sistema específico de análisis de imágenes digitales para la evaluación automatizada y cuantitativa de los cambios morfológicos. El sistema ha demostrado ser una herramienta reproducible, polivalente y potente para el examen masivo de agentes potencialmente útiles en la terapia contra el cáncer. Asimismo, esta plataforma es lo suficientemente versátil como para aplicarse a otros modelos de morfogénesis in vitro.
Se han desarrollado diversos sistemas para estudiar la morfogénesis^; entre otros, resulta especialmente atractivo el cultivo de células endoteliales (EC) vasculares en una matriz de membrana basal reconstituida para inducir la formación de tubos capilares, simulando las fases principales de la angiogénesis, porque la formación de vasos sanguíneos nuevos es crucial para el crecimiento y la extensión tumoral, y la terapia antiangiogénica es una herramienta prometedora en el tratamiento del cáncer^. En esas condiciones, las EC se adhieren rápidamente, dejan de proliferar, se alinean y forman estructuras tubulares, que se ha sugerido que representan las fases terminales de la angiogénesis^. La evidencia experimental sugiere que bloquear las interacciones entre las EC y componentes de la ECM puede ser una estrategia potente y general de inhibición de la formación de vasos sanguíneos asociados a tumores^. Así pues, la inhibición de la morfogénesis de las EC es un planteamiento útil y cómodo para realizar pruebas antiangiogénicas.
Teniendo presente la eficacia del HTS, la estrategia para desarrollar una plataforma específica de examen (Figura 1A) para valorar las actividades antiangiogénicas consistió en reducir a escala el ensayo basado en la matriz morfogénica desde una superficie de cultivo típica de 96 pozos y 30-35 mm2, a una superficie de cultivo de pozo de 1 ,3 mm2 (formato de microplaca Terasaki). En estas condiciones, la formación de tubos de EC macro y microvasculares fue paralela a la observada en ensayos convencionales (Figura 1 ; no se muestran los datos). Seguidamente, se optimizó la cantidad de matriz, el número de células y otras variables para formatos de 384 pozos (superficie de cultivo de 5 mm2) y 1536 pozos (superficie de cultivo de 2,8 mm2) de alta densidad, en donde las EC realizaron bioensayos de angiogénesis muy reproducibles (Figura 1 ; no se muestran los datos). Para comprobar el efecto de un gran número de compuestos en un breve espacio de tiempo, fue fundamental el desarrollo de una plataforma integrada asistida por ordenador para capturar y procesar las imágenes de los pozos individuales. Las imágenes digitales se adquirieron secuencialmente (con un tiempo de exposición de 0,5 segundos por pozo), tratándose con software de evaluación denominado Angiodrawer™ diseñado específicamente para una rápida evaluación de parámetros morfológicos en microplacas de alta densidad (Figura 1 ). Los parámetros morfológicos estudiados fueron el número total de nodos y el número total de tubos vinculados/desvinculados, así como sus longitudes. A partir de estos parámetros se obtuvo un valor numérico (índice angiogénico: Al) por pozo [(longitud total de tubos vinculados/superficie de análisis) x 1.000], que representa fielmente el grado del proceso angiogénico valorado bajo el microscopio. En la Figura 1C se muestran las imagines antes y después de su tratamiento, así como los valores de Al asignados a cada pozo. Los valores de Al eran proporcionales al grado de modulación en la formación de tubos de EC (Figura 1 D). Se ha aplicado un análisis informatizado a imágenes angiográficas en ensayos de membrana corioalantóica en embrión de polluelo^ o directamente en muestras de tejido tumoral sólido9, aunque requieren una manipulación exhaustiva y no reúnen en absoluto todos los criterios cualitativos y cuantitativos del HTS.
Para validar la capacidad de la plataforma para detectar y cuantificar la inhibición de la angiogénesis en una microplaca de 384 pozos, diseñamos unos experimentos doble-ciego con una diversidad de agentes antiangiogénicos bien caracterizados (anticuerpos antilaminina'O, péptidos de laminina con actividad biológica^ , TNP-47012 y paclitaxel^). El efecto del medicamento se valoró comparando los valores de Al asignados por Angiodrawer™ con los obtenidos por testigos sin tratar (pozos sin agentes inhibidores) ubicados en posiciones predeterminadas por placa. Los diferentes grados de inhibición se mostraron mediante un código de colores, que ¡lustra un porcentaje del valor de Al obtenido por cada pozo respecto del promedio de testigos en una figura que se asemeja a la placa original de 384 pozos (Figura 2). En la mitad izquierda de la placa mostrada, se trataron todos los pozos, salvo los testigos, con concentraciones diferentes de los agentes antiangiogénicos citados anteriormente. Los valores de Al fueron inferiores a los obtenidos por los testigos en todos los casos. En la mitad derecha, solo se trataron cuatro pozos. La plataforma identificó claramente los pozos donde se había perjudicado el proceso angiogéníco. Una vez comparados, los resultados fueron reproducibles entre los tres formatos diferentes de microplaca (no se muestran los datos).
En resumen, hemos demostrado la viabilidad de incorporar un bioensayo complejo histomorfogénico in vitro para desarrollar una plataforma de validación de plomo de alto rendimiento para aislar compuestos eficaces in vivo. Combinando un ensayo miniaturizado de angiogénesis in vitro y un sistema automatizado de análisis de imagines digitales, pueden examinarse miles de estructuras químicas en un día, en un contexto de relevancia fisiológica, abriendo perspectivas nuevas para el examen masivo de compuestos potencialmente terapéuticos en el tratamiento del cáncer. Deberían poderse adaptar fácilmente otros procesos morfogenéticos específicos para tejidos, mejorando nuestra comprensión de los mecanismos moleculares implicados en su regulación in vivo. Estos avances ayudarán a identificar compuestos de plomo de relevancia clínica, y facilitarán los planteamientos tecnológicos hacia los tejidos.
Desde hace tres décadas es sabido que la formación de nuevos vasos - angiogénesis- [a1] (ver bibliografía) es imprescindible para el crecimiento y diseminación de los tumores [a2-3], siendo motivo de investigación exhaustiva durante todo este tiempo la identificación de los factores antiangiogénicos que pudieran ser utilizados en el tratamiento del cáncer [a4-5].
Desde hace años, como estrategia de búsqueda se vienen utilizando técnicas de screening con grupos de reactivos potenciales inhibidores siguiendo modelos angiogénicos 'in vitro' o 'in vivo' [a6-9]. Actualmente, y siguiendo la tendencia general de introducción de sistemas informáticos y robóticos [xx] para agilizar y aumentar el rendimiento de estas nuevas estrategias de trabajo, es muy grande el interés en disponer de un sistema que permita el screening masivo de una forma objetiva, reproducible y rápida.
El análisis en laboratorio de la valoración de los efectos de los reactivos testados se ha estado realizando de una forma cualitativa, por inspección visual desde el microscopio. Esta metodología de evaluación lleva a clasificaciones subjetivas dependientes del observador y que no permiten replicar el experimento; se hace necesaria la adopción de métodos cuantitativos. La cuantificación del grado de angiogénesis de forma semi o automática ha sido propuesta por diferentes autores para diversos objetivos [a10-a15], pero no adaptada a tareas de screening.
Procedimiento experimental:
Materiales. Se adquirieron placas Terasaki de 384 y 1536 pozos de Nunc (Roskilde, Dinamarca), Costar (Corning, NY, EE.UU.) y Greiner (Frickenhausen, Alemania), respectivamente. Se adquirió Matrigel® de Becton Dickinson (Bedford, MA, EE.UU.). Se adquirió péptido de laminina CDPGYIGSR-amida, anticuerpo antilaminina de conejo policlonal, y paclitaxel de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), y TNP-470 de Takeda ( ). Células y condiciones de cultivo. La línea de células endoteliales microvasculares CDC/EU.HMEC-1 (HMEC-1 ) se consiguió por gentileza del Dr. E Ades (Centro de Control de Enfermedades, Atlanta, GA, EE.UU.). Las células HMEC- 1 se cultivaron en un medio MCDB-131 (Gibco BRL, Rockville, EE.UU.) complementado con 10% de FCS, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 1 mg/ml de hidrocortisona. El EGF y la hidrocortisona se consiguieron en Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Las células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVE) normal (CRL-1730), se cultivaron en un medio Ham's F12K (Gibco BRL) complementado con 10% de FCS, 50 g/ml de ECGS y 100 g/ml de heparina.
Ensayo de formación de cordón y examen funcional de factores antiangiogénicos. En un ensayo de formación de tubo miniaturizado de células endoteliales, se utilizaron 2, 3 y 10 I de 1:2 Matrigel® diluido (12 mg/ml) para revestir placas Terasaki, de 1536 y de 384 pozos, respectivamente, permitiendo su polimerización durante 30 minutos a 37°C. Sobre una matriz gelificada, se depositaron plaquetas de entre 2 y 6 x103 EC, en un medio consistente en 1% de FCS MCDB-131 (o Ham's F12K). El volumen total de medio se ajustó a 100 I (placas de 384 pozos), 25 I (placas Terasaki), o 5 I (placas de 1536 pozos), incubándose las placas durante 12-14h a 37°C en un entorno humidificado con un 5% de C02. Se valoró el efecto antiangiogénico de los reactivos diferentes mediante su incorporación, diluidos en un medio adecuado a concentraciones diferentes, a las placas revestidas de Matrigel al formar plaquetas con las células EC.
Análisis de imágenes digitales. Las imágenes digitales de cada pozo se tomaron de un microscopio Axiovert 100 (Cari Zeiss, Alemania) utilizando una cámara
SPOT (Diagnostics Instruments, Inc.), guardándose como ficheros BMP de 328x256 pixels y escala de gris de 8 bits. Las imágenes se trataron utilizando software Matlab
5.3 nuevo basado en Angiodrawer™.
Reconocimientos:
Se reconoce y agradece el apoyo financiero del Fondo de Investigación Sanitaria (beca 99/0496; L.A-V.). L.S. contó con el respaldo de la Unión Europea. Bibliografía:
1. Persidis, A. Plataformas de validación de plomo. Nat Biotechnol 16, 100-1. (1998).
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DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención propone una plataforma de ensayo que consta de un modelo estandarizado y miniaturizado de angiogénesis in vitro descrito ya en otra parte [a16] y un sistema de adquisición y procesamiento de imágenes, que se expone en la presente memoria descriptiva.
El valor añadido de nuestra propuesta reside en el uso combinado de: - miniaturización del modelo estándar de angiogénesis in vitro que mediante el reescalado permite utilizar microplacas, y así aumentar la capacidad de screening y la futura robotización del conjunto.
- adquisición de imágenes a través de microscopio y procesamiento automático de las mismas, que posibilita un análisis cuantitativo de los efectos antiangiogénicos de los reactivos depositados en los pocilios de las microplacas, lo que deriva en un tratamiento objetivo y a la reproducibilidad de los experimentos.
El método objeto de esta invención se compone de las siguientes fases: preparación y organización de un experimento; adquisición y caracterización de las imágenes; procesamiento que comprende tres partes, determinación del área útil de trabajo, segmentación, y caracterización y cuantificación de parámetros; finalmente, síntesis del índice de angiogénesis y síntesis del índice de angiogénesis relativo, almacenamiento, gestión y presentación de datos y resultados obtenidos en cada experimento.
No se describe en este texto la metodología de evaluación seguida, tanto para medir la 'bondad' del sistema en la identificación correcta de canales y nodos, como en la cuantificación de parámetros que se realiza para la obtención del grado de angiogénesis que se ha descrito en otro lugar [a16].
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Representación esquemática de la plataforma de validación de plomo de alto rendimiento basada en la morfogénesis. (A) Se permite que las EC macro o microvasculares humanas se diferencien en estructuras de tipo capilar en componentes de membrana basal reconstituida durante 12-14 horas, en presencia o ausencia de agentes inhibidores potenciales (diversidad), seguido de adquisición y tratamiento automatizado con software Angiodrawer™ para cuantificar la formación tubular respecto de testigos en posiciones predeterminadas. (B) Reproducibilidad del método. Se calcula el índice angiogénico (Al) en función de [(longitud total de tubos vinculados/superficie de análisis)/1000]. Cada valor representa el promedio de diez pozos testigo, en los tres formatos utilizados (microplacas de 384 pozos, de 1536 pozos y Terasaki), así como las desviaciones típicas y los coeficientes de variación. (C) Imágenes sin tratar y tratadas de pozos testigo y pozos experimentales donde se ha inhibido la angiogénesis con TNP-470 en los tres formatos de placa. Se indican los valores de Al obtenidos por imagen. (D) Modulación dependiente de la dosis de la diferenciación de EC (en respuesta a concentraciones diferentes de anticuerpos antilaminina o TNP-470) en una microplaca de 384 pozos. Cada punto representa el promedio de dos pozos ± desviaciones típicas. Se muestran imágenes representativas.
Figura 2.- Resultado final del software Angíodrawer™: un código de color muestra el porcentaje de formación de tubos en cada pozo respecto del promedio de valores de Al obtenidos por los testigos. En la mitad izquierda de la placa (192 pozos) todos los pozos salvo los testigos se prueban con concentraciones diferentes de agentes inhibidores distribuidos aleatoriamente (caracterizados por pozos). En la mitad derecha de la placa (192 pozos), identificación de un agente inhibidor (cuatro pozos) frente a PBS en un experimento doble-ciego.
Figura 3.- Muestra de izquierda a derecha las placas de trabajo con 72, 384, 1536 pocilios respectivamente.
Figura 4.- Muestra las posibles geometrías de los pocilios, ya sean troncocónicos en las representaciones en alzado y planta izquierdas, o paralelepipido en las representaciones en alzado y planta a la derecha de la figura.
Figura 5.- Muestra la jerarquía organizativa del experimento.
Figura 6.- Muestra las características morfológicas presentes en una imagen. Figura .- Muestra el diagrama de bloques del procesamiento.
Figura 8.- Muestra: a) Área de trabajo en microplacas "terasaky". b) Resultado aplicación 15x15 filtro mediano.
Figura 9.- Muestra la determinación del área de trabajo en microplacas Terasaky. a) Diagonales; b) Perfiles de las diagonales; c) Área de trabajo
Figura 10.- Muestra esquemáticamente el procedimiento de segmentación.
Figura 11.- Muestra: a) Imagen original X0; b) imagen de magnitud |Xd |, c) imagen de faseΦχd
Figura 12.- Muestra: a) Imagen xd; b) imagen σxd; c) imagen binaria; d) imagen φXd.
Figura 13.-Muestra el algoritmo de decisión para determinación de backg round.
Figura 14.- Muestra: a) Imagen X0w\ b) imagen X0w in, c) imagen Y0, respectivamente.
Figura 15.- Muestra la imagen final Y.
Figura 16.- Es una representación de la aplicación de almacenamiento, gestión y presentación de resultados
Figura 17.- Muestra caso de una burbuja en la matriz, a) Imagen original X; b) Imagen final Y. Figura 18.- Muestra un caso de desenfoque por no-paralelismo, a) Imagen original X; b) Imagen final Y.
Figura 19.- Muestra un caso de grumo (gigante), a) Imagen original X; b) Imagen final Y.
Figura 20.- Muestra Área de trabajo menor que original, a) Imagen original X; b) Imagen final Y.
Figura 21.- Muestra un ejemplo de imprecisiones en un análisis exclusivamente morfológico.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
MATERIAL Y MÉTODOS
A. Preparación y organización del experimento
El modelo estándar de angiogénesis in vitro es el utilizado para evaluar la plataforma de ensayo; se basa en el cultivo de células endoteliales sobre una matriz extracelular que determina su diferenciación en estructuras de tipo capilar denominadas "vessels" o "channels" [a9]. La miniaturización que nuestra plataforma introduce, conduce al reescalado de los experimentos para adecuarlos a tres formatos de placa (1 ) (ver Fig.3) con 72 (mod. Terasaki), 384 (mod. 384w) y 1536 (mod. 1536w) pocilios.
Las geometrías de los pocilios (2) que se manejan son las mostradas en la figura 4; se trata de perfiles tronco-cónico invertido (Terasaki) y paralelepípedo (384w y 1536w).
En cada pocilio (2) se depositan cuatro elementos: - matriz (5) , depositada en el fondo del pocilio (2) de tal forma que, en condiciones óptimas, resulta en un volumen homogéneo y uniforme paralelo a la base del pocilio (2) ,
- células (4) , que se depositan en el pocilio (2) para acabar fijándose de forma aleatoria sobre la superficie plana de la matriz (5).
- Medio (3), depositado sobre células (4) y matriz (5), hasta llenar el pocilio (2), y
- reactivo, objeto de estudio que interactúa con las células modulando los procesos angiogénicos, y cuyo efecto se desea cuantificar.
La organización global de cada experimento presenta cuatro niveles jerárquicos (ver Fig.5):
- Experimento, caracterizado por la matriz, medio y tipo de células utilizados.
- Serie, caracterizada por el antígeno target y la genoteca utilizada. El número de series en un experimento es dependiente de la naturaleza del reactivo utilizado.
- Placa, caracterizada por el número y geometría de los pocilios (ver Fig.3, 4). El número de placas en una serie es dependiente del número de reactivos a testar. - Pocilio, caracterizado por la presencia (tipo y concentración) o ausencia de reactivo.
Los dos niveles superiores, serie y experimento, tienen un carácter meramente organizativo de los resultados obtenidos.
La unidad de análisis en un experimento determinado es la placa (1 ), y dentro de cada placa la unidad de procesamiento es el pocilio (2). La distribución en cada placa (1 ) y el contenido específico de los pocilios (2) sigue unas reglas predeterminadas y establece su clasificación en tres categorías: - no usados, marcados con antelación y excluidos de todo procedimiento posterior. - control, en número determinado y ubicación predeterminados (la diagonal de la placa), en los que las células se han dejado evolucionar libremente sin la presencia de agentes inhibidores angiogénicos; y
- incógnita, en los que se pretende determinar el grado de angiogénesis relativo al promedio del conjunto de los pocilios control, producido por el reactivo presente cuya capacidad moduladora se desea evaluar.
β. Adquisición y caracterización de las imágenes
La adquisición de imágenes se efectúa a través de un microscopio (6) invertido Axiovert 100 (Cari Zeiss, Germany) motorizado en los tres ejes X/Y/Z, y una cámara digital (1 CCD) SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.). Se fijan las condiciones óptimas de adquisición en cuanto a luminosidad, contraste, número de aumentos (x10), tiempo de exposición, etc.; las imágenes son adquiridas secuencial y automáticamente con un tamaño por imagen de 328x256 píxeles (1/4 máxima resolución) y 256 niveles de gris, lo que resulta en un tamaño de fichero imagen (.bmp) de 84K. El número de imágenes obtenidas depende del tipo de placa (1 ) empleada.
En adelante, las descripciones se referirán siempre a la placa de 72 pocilios (mod. Terasaki), pues aunque este modelo es el que en el futuro tendrá menor interés práctico en la realización de experimentos de screening masivo, debido a su tamaño no-estándar y ser el de menor número de pocilios (2) , sin embargo por la geometría tronco-cónica de ellos, es el que mayor complejidad presenta de cara al procesamiento de la imagen de cada pocilio. Las consideraciones y observaciones que se realicen sobre los procedimientos aplicados en el procesamiento, con seguridad engloban todas las que se podrían hacer a los otros dos modelos de placa (1 ). En la figura 6 se muestra una imagen adquirida en placa Terasaki en la que aparecen todos los componentes morfológicos caracterizadores que se pueden encontrar en un experimento in vitro de angiogénesis.
Las células depositadas sobre la matriz (5) forman uniones y agrupaciones, tejiendo una red de canales interconectados de forma aleatoria [a9]. Los elementos morfológicos específicos que caracterizan las imágenes obtenidas son:
- Canales (7) de interconexión celular (vessels), de anchura variable, con alta linealidad, de textura altamente rugosa.
- Grumos de células (8), originados en el momento de preparación del experimento por una dispersión insuficiente del cultivo. Se caracterizan por tener un tamaño indeterminado y una textura rugosa mayor que la de los canales de interconexión celular. - Nodos (9), en las intersecciones de los canales de interconexión, de características morfológicas similares a los grumos de células (8) pero de un tamaño significativamente menor. A diferencia de los grumos de células, los nodos (9) son parte de los procesos angiogénicos.
- Background que corresponde a la matriz (5) depositada en el pocilio (2); se caracteriza por presentar una textura uniforme, muy poco rugosa.
- Artefacto (10), (en el mod. Terasaki) anillo concéntrico exterior sobreiluminado como consecuencia de la reflexión de la luz emitida por el microscopio en el menisco formado por el medio en la superficie del pocilio. En los otros dos modelos de placa aparecen también interferencias de adquisición aunque de origen y aspecto diferentes en cada caso. Las imágenes son adquiridas y almacenadas ordenadamente, creándose automáticamente un árbol de directorios semejante a la jerarquía: experimento->serie->placa.
El procesamiento del experimento se divide en dos partes: - procesamiento imagen pocilio, consistente en la caracterización, extracción y cuantificación de las estructuras a nivel morfológico y topológico existentes en la imagen.
El software MatLab Image and Signal Processing Libraries (The MathWorks, Inc.) for Windows98 ha sido usado como herramienta de desarrollo.
- Síntesis de dos parámetros. El primero cuantifica en términos absolutos la actividad angiogénica en cada pocilio (control e incógnita), sintetizándose un índice de angiogénesis (IA) [a15] obtenido a partir de parámetros morfológicos y topológicos extraídos de la imagen. El segundo cuantifica la actividad angiogénica en términos relativos, comparando los lAs de los pocilios incógnita respecto al promedio de los lAs de los pocilios control de la placa a la que pertenece, obteniéndose para cada pocilio incógnita un índice de angiogénesis relativo (IAR).
C. Procesamiento imagen pocilio
El procesamiento de cada imagen se divide en tres partes según ilustra la figura 7: 1o.- determinación de área de trabajo (/-/?); 2°.- segmentación (H2) y 3°.- caracterización de parámetros (H3).
• Determinación de área de trabajo (H-i). Este pre-procesamiento es necesario porque la imagen adquirida correspondiente a cada pocilio (ver fig. 6) aparece afectada por el artefacto (10). Se establece como área de trabajo el círculo (c, r) inscrito en el anillo sobreiluminado (10) según lo representado en la figura 8a; el centro c depende del alineamiento entre el objetivo del microscopio y el pocilio; el radio r depende de la cantidad de matriz y medio depositados en el pocilio y de la cantidad de luz empleada en la adquisición. Como primer paso se aplica un 15x15 median filter para suavizar las estructuras interiores y realzar el halo sobreiluminado (ver fig. 6b) sin degradar sus bordes [b1]. Una vez bien delimitado el artefacto (10) se trazan las dos diagonales de la imagen (ver fig 9a), con el objetivo de determinar los puntos de intersección de estas diagonales con el círculo interior del anillo de interferencia. Para ello se extraen los perfiles respectivos (ver fig.9b), y se calculan las derivadas mediante un filtrado bidireccional con la función de transferencia (Z-transform) indicada en (1).
G(z) = 1 - z" (1)
Como resultado se obtienen cuatro puntos pι( , pιy ) , p2( P∑x , Pzy ) , P3Í P3χ , P3y ) , P P4X , P4y )', por estos cuatro puntos es posible trazar cuatro circunferencias: CÍ{ p-, , p2, p3}, C2{ pi , p2, p4}, C3{ pi , p2, p4}, C4{ p2, p3, p4}, cada una de ellas con centro c(cx ,cy) y radio r a determinar. Partiendo de la ecuación genérica de la circunferencia expresada en (2), se puede determinar el centro c y radio rde cada una de ellas mediante la resolución del sistema mostrado en (3).
(x-cxf +(y-cy =r2 = 2 +y2 +Dx + Ey + F = 0 (2) donde:
D = -2c .
E = -2c, ,
F = cv. +c.
Figure imgf000020_0001
-,=- cy=--E, r = c,2 +cy 2 -F El c y r de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo es la que tiene como centro el promedio de los centros y como radio el mínimo de los radios como queda expresado en (4):
Figure imgf000021_0001
cx = -^L_ ; c = ; r = min(r.) (4)
Figure imgf000021_0002
donde (c¡x , c¡y ) and r¡ son respectivamente el centro y radio determinados previamente.
Con el centro y radio de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo, se construye una matriz de máscara wi que aplicada a la imagen original X, devuelve como resultado Xo, que es la imagen de trabajo definida en (5). El resultado es el mostrado en la figura 7c.
(*- ' +C,--,)' (5)
Figure imgf000021_0003
otherwise
• Segmentación (H2). El objetivo en esta fase es la obtención de una imagen en la que sea factible la detección de los canales (7) y nodos (9) existentes en el área de trabajo calculada en el apartado anterior. Numerosos procedimientos [b2] se describen en la literatura para la detección de pequeños vasos sanguíneos en angiografías de retina [b3-4], arterias coronarias [b5], o cerebro [b6].
No obstante, dado que la morfología de las estructuras bajo estudio es sumamente variable[b7]: longitudes y perfiles variables, texturas de muy diferentes rugosidades (grumos), anchuras aleatorias, etc, la estrategia de detección propuesta en esta descripción sigue un camino indirecto; en vez de tratar de detectar los elementos de la imagen asociados a las estructuras angiogénicas, se persigue lo contrario: detectar lo que no es una estructura angiogénica y, por complementariedad, determinar las zonas que sí lo son.
El único elemento de la imagen que no es una estructura angiogénica es la matriz (5), que se corresponde con el background (ver fig. 6). A diferencia de los canales, nodos y grumos de células, el background se caracteriza por poseer una textura muy poco rugosa y uniforme en toda la imagen, por lo que su caracterización y detección resulta mucho más sencilla. Una vez eliminado el background o matriz (5), se acondicionará la imagen resultante de forma que se pueda realizar la extracción de los parámetros de interés. En la figura 10 se detalla cada una de estas partes.
Inicialmente se aplica (ver fig.10) a la imagen de trabajo Xo el operador de Sobel [b8] para detección de bordes en direcciones ortogonales como se expresa en (6); a partir de la imagen obtenida, Xd, se extrae en (7) la imagen magnitud de bordes \Xd\ y en (8) la imagen fase de bordes φ d (ver figs. 11a,
1 1 b y 1 1 c)
Figure imgf000022_0001
De la imagen |Xd| (ver fig 11 b) se puede extraer información relativa a la amplitud de los bordes y a la rugosidad de las estructuras. De la imagen φ d (ver fig 11c) se puede extraer información relativa a la linealidad de los bordes.
De las figuras 11 b y 11c se pueden extraer las siguientes conclusiones: - En la imagen de magnitudes, los bordes más pronunciados aparecen en las zonas correspondientes a los canales de interconexión, nodos y grumos celulares; las zonas correspondientes a la matriz, más homogéneas, son prácticamente lisas. Sin embargo, existen zonas de la imagen en las que los canales son lo suficientemente delgados como para que la rugosidad que presentan se confunda con la de la matriz. - En la imagen de fases, aparecen líneas de fase constante a lo largo de los bordes de los canales de interconexión, lo que confirma la característica de linealidad de éstos. Sin embargo, en los grumos y nodos, la respuesta en fase es similar a las zonas correspondientes a la matriz.
No es posible por tanto basar en un criterio único la detección y clasificación de las estructuras de interés, sino que se hace necesario elaborar un criterio más complejo.
Se han establecido tres criterios, magnitud y varianza asociados a |Xd| y linealidad asociado a §χd y un algoritmo de aplicación. Tanto en los criterios como en el algoritmo los parámetros de ajuste tales como umbrales, tamaños de vecindad, rangos, etc tienen un fuerte componente empírico alcanzado tras múltiples ensayos.
El criterio de magnitud tiene como objetivo caracterizar el rango de amplitudes de los bordes en las zonas de background. Se divide la imagen \Xd\ en un mosaico sin solapamiento de celdas de tamaño 5% del total; para cada una de ellas se determina la media de la amplitud resultando la imagen xd (ver fig 120); se estableció un umbral de amplitud km fijado en el 10% del máximo obtenido.
El criterio de varianza tiene como objetivo caracterizar la rugosidad de las zonas de background. Se divide la imagen de forma similar (celdas 5% del total), se calcula la varianza de la amplitud resultando la imagen σxd (ver fig
12b), y se establece un umbral de varianza kσ fijado también en el 10% del máximo obtenido. Como puede observarse en las figuras 12a y 12b, las celdas de amplitud media de bordes menor que el umbral km aproximadamente coinciden con las de varianza media menor que el umbral kσ. En la imagen binaria de la fig. 12c, las zonas en blanco corresponden a celdas en las que la amplitud media de bordes y la varíanza media superan ambas los umbrales respectivos; las zonas en negro corresponden a celdas en las que predomina background.
El criterio de linealidad para un pixel dado, se cumple si en su vecindad de 3x3, al menos 5 pixeles tienen la dirección (ambos sentidos) respecto al pixel ±10°. El resultado de la aplicación de este criterio a la imagen φχd es la imagen φXd (ver fig. 12d).
Puede observarse que los mayores agrupamientos de pixeles que cumplen el criterio de linealidad se sitúan fundamentalmente en los canales de interconexión, si bien aparece un buen porcentaje de ellos dispersos igualmente por todo el área de trabajo. Es por tanto un mal criterio para diferenciar nodos, grumos de células y matriz, pero da muy buen resultado para detectar canales estrechos.
La detección del background consiste en la aplicación secuencial a cada pixel de X0 (ver fig 11a) de los tres criterios, magnitud, varianza y linealidad, siguiendo el algoritmo de la figura 13. El objetivo es construir una máscara, w2, en la que los elementos con valor 1 corresponden a estructuras angiogénícas, y los elementos con valor 0 indican background.
Para cada píxel de Xo se extrae su vecindario de 3x3 (z), y se comprueban los criterios de la siguiente forma:
- Si la amplitud media y varianza del vecindario son superiores a los umbrales establecidos (km y ka) se trata de un píxel no-background, y por lo tanto se le asigna un valor 1 en w2 matriz de máscara, - Si no supera ninguno de los dos umbrales se trata de un píxel background y se le asigna un 0 en w2 matriz de máscara,
- Si solo uno de los umbrales es superado (p.ej canales muy estrechos), y en la imagen φχd (ver fig 12d) su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad positiva, se trata de un píxel no-background,
- Si solo uno de los umbrales es superado, y en la imagen φXd (ver fig 12d) su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad negativa, se trata de un píxel background,
Una vez construida la máscara w2 se aplica a la imagen X0, resultando la imagen X0w (ver fig. 12a). En esta imagen se ha eliminado el background, quedando visibles las zonas en torno a los canales de interconexión, nodos, grumos de células y células aisladas.
La última fase comprende el acondicionamiento de la imagen X0w (ver fig.14a) que consiste en una binarización seguida de una operación de aproximación 3x3 [b9] (ver fig.14b), finalizando con una skeletonization [b9] imagen Y0 (ver fig.14c).
• Caracterización de parámetros (H3). Las matrices iniciales de trabajo son la imagen Y0 y la máscara w1 área de trabajo definida en (5).
Caracterización de nodos. En un primer paso se marcan en la matriz Y0 los pixeis candidatos a nodos, identificados como aquellos en cuya vecindad inmediata (vecindad 3x3) existen al menos otros 3 pixeis iguales a 1. En un segundo paso, se marcan en la matriz Y0 como nodos los candidatos aislados. En un tercer paso se agrupan candidatos adyacentes marcándose en la matriz Yo como nodos únicos.
Caracterización canales que parten de los nodos. Para ello se toma cada uno de los pixeles que componen un nodo y se investiga su vecindad para encontrar en Yo, los pixeles distintos de cero y que no hayan sido marcados en la fase anterior como nodos; estos puntos son el inicio de un canal. Tras ser marcados en Yo como tales, son seguidos de forma recurrente (se comprueba si en su vecindad hay pixeles distintos de cero en YO) hasta que se llega al final del mismo:
- todos los pixeles alrededor del último encontrado son cero (canal no conectado)
- alguno de esos pixeles pertenece a un nodo distinto del nodo de partida (canal conectado)
- alguno de esos pixeles está en el borde del área de trabajo -en w-i es distinto de cero- (canal de escape).
El resto de pixeles distintos de cero en Y0 no son tenidos en cuenta y constituyen canales aislados (que no incluyen nodos).
A continuación, se calcula la longitud del canal y se comprueba si ésta supera o no un umbral (U) predeterminado. Finalmente se genera una nueva matriz en la que cada pixel se codifica con un color dependiendo de su naturaleza, ver Tabla 1. Esta matriz se puede superponer a la imagen original X0 para tener un resultado gráfico del proceso, imagen Y (ver fig.15).
TABLA 1
Figure imgf000026_0001
La necesidad de introducir un umbral de longitud U se debe a que en ocasiones (en función de su textura) los grumos de células eran segmentados, no como un único nodo, sino como un cierto número de nodos interconectados por canales muy cortos. Tras numerosas pruebas fue adoptado U = 15 (pixeis) como valor de compromiso.
D. Síntesis de parámetros • índice de angiogénesis (IA)
Tradicionalmente, la cuantificación angiogénica ha consistido en la valoración de la densidad de vasos generados a partir de la detección de estas estructuras desde un punto de vista morfológico. El indicador comúnmente aceptado para cuantificar la vascularización es MVD (microvessel density) [a10-11], que relaciona el área vascularizada respecto al área total de análisis. Se trata de una medida de carácter muy general adaptable a la totalidad de modelos de experimentos, 'in vivo' e 'in vitro'. Pero precisamente por su carácter general, resulta poco específico y pasa por alto factores que podrían resultar decisivos en un análisis que exija resultados o escrutinios más diferenciados.
El procedimiento de cuantificación que se propone basa su cálculo en un análisis topológico de la red de vasos tomando en consideración factores adicionales como conectividades y longitudes.
Como expresión más específica que MVD, se propone en este paper el índice de angiogénesis (IA) con la expresión indicada en (9), la cual permitió estudiar la diferente "contribución" al IA de los canales conectados, canales no- conectados y canales aislados.
Se ensayó la misma expresión para seis diferentes conjuntos de canales que se expresan en (10-15). ∑LC
VceC,,
IA = xlOOO (9)
ClAl ≡{ce{Cc^Ce)} (10)
CIA2 ≡{ce(CcvCe)/Lc≥U} (11)
Cu. ≡{c Cc] (12)
C1A4 ≡{ceC Lc≥U} (13)
C¡A5 ≡{ce{CcvCe jCu)/Lc≥U} (14)
C!A6≡{ce(Cc Cu)/Lc≥U] (15)
donde:
SA ≡ Superficie del área de trabajo
Lc ≡ Longitud del canal c
CIA ≡ Conjunto de canales seleccionados para determinación del I A
Cc ≡ Conjunto de canales conectados
.Ce ≡ Conjunto de canales de escape
C„ ≡ Conjunto de canales no conectados
U ≡ Umbral de longitud
Para identificar cual de los seis conjuntos de canales determina un IA que discrimine mejor entre diferentes grados de actividad angiogénica se llevó a cabo un simple procedimiento con los siguientes pasos:
- se clasificaron manualmente un total de 648 imágenes en tres grupos por la actividad angiogénica observada (inhibición alta, intermedia y baja).
- cada imagen fue procesada y calculado su IA seis veces. - en cada uno de los grupos se calculó el valor medio de los IA.
- se calcularon las ratio entre los valores medios de cada IA de los tres grupos. Se puede observar (ver Tabla 2) que el conjunto de canales que determina el IA más discriminante es el descrito en (13) el cual incluye únicamente los canales conectados cuya longitud supera un umbral,
TABLA 2. SELECCIÓN DEL GRUPO DE CANALES PARA DETERMINACIÓN DEL IA.
Figure imgf000029_0002
donde:
IAH[ ≡ Promedio de IA en grupo de nivel de angiogénesis alto (controles) \AIM ≡ ídem en grupo de nivel de angiogénesis intermedio
IAW ≡ ídem en grupo de nivel de angiogénesis bajo
• índice de angiogénesis relativo (IAR)
El IAR de un pocilio incógnita es la expresión porcentual descrita en (17) del grado de angiogénesis desarrollado respecto al IACTRL promedio descrito en (16) obtenido en los pocilios control de la placa.
Figure imgf000029_0001
IA
LAR - -xl00 (%) (17)
IA CTRL donde:
Pc ≡ Conjunto de pocilios control cαrd(P) ≡ Cardinal de conjunto P Nc = cαrd(Pc ) RESULTADOS
A. Adquisición y procesamiento
Calculados sobre un total de 288 imágenes, el tiempo medio de adquisición y almacenamiento de una imagen pocilio original X es de 4.8 secs, incluidos tiempos de calibración, posicionamiento y enfoque. Utilizando un PC Pentium III (400 MHz), memoria 64 Mb, el tiempo medio de procesamiento consumido en obtener la imagen segmentada es de 54 secs.
El tiempo total de adquisición y procesamiento dependerá del tipo de microplaca utilizada y de la potencia de computing disponible.
B. Almacenamiento, gestión y presentación de la información
La futura realización de high-throughput screnning obligará a manejar abundante información adicional para una adecuada gestión de los resultados obtenidos.
Cada experimento es organizado jerárquicamente: experimento->serie-
>placa->pocillo y es almacenado en base de datos (MSAccess®). Para la gestión del conjunto se ha desarrollado una aplicación específica escrita en Borland C++ Builder, a través de la que se controla: adquisición, procesamiento, entorno, y presentación de resultados (ver fig 16).
Se almacenan los siguientes campos: Experimento: identificación (UID, fecha, comentarios, número de series, etc.), equipamiento (microscopio, cámara, marca, modelo), matriz (tipo, origen, catálogo, lote, volumen por pocilio), medio (tipo, proveedor, catálogo, lote, volumen por pocilio), células (tipo, nombre, origen, pases, catálogo, lote, concentración, volumen, aspecto, etc.).
Serie: UID, comentarios, antígeno objetivo, genoteca (descripción, fago "helper", fecha selección, número de rondas, número final de clones, usuario genoteca), número y tipo de placas, ordinal de la serie, usuario purificación, usuario 'screening'.
Placa: UID, ordinal de placa, tipo de placa, pocilios usados, control de purificación, resolución, lente, IACTRL-
Pocilio: ID, crecimiento, usado, control, IA, IAR, imagen pre y postprocesamiento.
En la figura 16 puede verse la presentación de resultados de una placa mod. 384w. El IAR se codifica en cinco niveles presentados en diferentes colores. Para visualizar sus imágenes original X y final Y basta hacer click encima del pocilio.
DISCUSIÓN
A. Preparación del experimento
Un factor que se ha mostrado crítico para conseguir un procesamiento adecuado, es lograr una distribución de la matriz homogénea y paralela al fondo del pocilio. Teniendo en cuenta que toda la actividad biológica se desarrolla en la superficie de la matriz, se entiende fácilmente que para lograr un enfoque de imagen adecuado es necesario que se cumpla esa condición. Por lo tanto no sólo se deben fijar buenas condiciones de adquisición respecto a cuestiones ópticas, sino a las de la propia preparación biológica del experimento: homogeneidad de la matriz, dispersión celular adecuada, etc. En las figuras 17, 18 y 19 pueden verse las imágenes original X y final Y cuando han ocurrido diversas anormalidades, respectivamente: burbuja, no paralelismo y grumo gigante.
En dichas tres figuras se observa que el procesamiento ha sido correcto en las zonas no afectadas por la anormalidad, pero en la figura 17 se aprecia como ha sido identificado como canal conectado (falso positivo) el borde de la burbuja; en la figura 18, presumible actividad angiogénica no ha sido detectada (posibles falsos negativos), y en la figura 19 se han detectado en el interior del grumo canales conectados que no lo son (falsos positivos).
β. Procesamiento imagen pocilio • Preprocesamiento (área de trabajo)
Se ha descrito el procesamiento de imagen pocilio en el tipo de microplaca Terasaki por su mayor dificultad en la detección del área de trabajo. En los casos de microplacas 384w y 1536w prácticamente no existe interferencia porque las paredes del pocilio son paralelas al haz de luz, no produciéndose reverberación (anillo luminoso) y pudiéndose por tanto obviar este pre-procesamiento. No obstante su robotización presenta otros problemas que no es el caso describir aquí.
El problema mas frecuente encontrado en la obtención del área de trabajo descrita en las expresiones (2)-(5), viene provocado por la detección incorrecta de alguno de los cuatro puntos pι...p . En estos casos (ver fig 20) el procedimiento establece que el área de trabajo no es la definida en (5) sino la intersección de las cuatro circunferencias existentes en (4), con lo que la superficie útil resultante es menor que en un caso normal.
• Segmentación.
Algunos errores de segmentación que han sido identificados como p.ej:
- identificación como un único canal de dos canales muy próximos
- considerar como dos canales no-conectados lo que en realidad es un solo canal con un estrechamiento podrían ser evitados con un aumento de la resolución espacial en adquisición (recordar que solo se trabaja a de la resolución máxima de la cámara digital). Sin embargo, todo aumento de la resolución provoca incrementos exponenciales en el tiempo global de procesamiento de un experimento. En las primeras fases de nuestro trabajo se utilizó una mayor resolución
(1/2 max); la que finalmente fue adoptada es un compromiso entre validación del sistema y tiempos de procesamiento aceptables para un entorno de screening.
• Síntesis de lA e lAR
Es obvio que para realizar un análisis detallado de los efectos inhibitorios ocasionados por un reactivo específico en un proceso angiogénico, o contrastar dichos efectos a diferentes concentraciones o entre dos reactivos diferentes, no se puede considerar de forma aislada o como indicador único la relación entre áreas vascularizada y total.
Como ya se ha comentado, la angiogénesis implica en un primer paso la diferenciación de las células en estructuras capilares para evolucionar en el tiempo formando redes de vasos interconectados. La inhibición de este proceso no es tanto evitar la diferenciación de las células como dificultar la interconexión de los canales generados por éstas, es decir, evitar la formación de canalizaciones efectivas.
Así pues, aunque un análisis morfológico sería suficiente (y eficaz) para distinguir casos claros de inhibición total o muy alta, es evidente que resulta insuficiente en estudios detallados; incluso, bajo ciertas circunstancias, un análisis exclusivamente morfológico podría llevar a resultados equívocos o contradictorios. Se hace pues necesario un análisis a nivel topológico de la red de vasos para realizar escrutinios de canales teniendo en cuenta factores como longitud y conectividad.
En nuestro trabajo, un estudio tradicional a nivel morfológico podría haber concluido en el paso mostrado en la figura 14a (Xow), o 14b (X0W b¡n)- En ese punto, es posible ya determinar la relación de área_vascularizada/área_total. Aunque como se puede ver, se incurriría en los siguientes errores (ver fig. 21 ):
- se incluiría como actividad angiogénica generada el área de los grumos o células aisladas, ver en fig. 21 , (21-1 ) y (21-2) - se valoraría de forma diferente los vasos generados más gruesos respecto a los más delgados, cuando su valoración real debe ser la misma ver fig. 21 , (21- 3) y (21-4)
- vasos no conectados o aislados serían cuantificados como canalizaciones efectivas ver fig. 19, (21-5) y (21-6)
El análisis topológico que proponemos exige el paso de esqueletonización mostrado en la figura 14c (Y0). Trabajar sobre la imagen Y0 resuelve los dos primeros errores comentados anteriomente, ya que: - grumos y células aisladas son reducidas a puntos (nodos)
- todos los vasos son reducidos a un píxel de grosor.
El análisis posterior Y0 permite la clasificación de los canales en conectados, no conectados y aislados y el cálculo de sus longitudes respectivas, lo que consuma el nivel de análisis topológico de la red que nos habíamos propuesto y la resolución del tercer error.
La expresión matemática propuesta para la determinación del IA, se basa en: - determinar un conjunto de canales a partir de un criterio combinado de conectividad y longitud
- considerar como índice de angiogénesis la suma de longitudes de los canales de dicho conjunto.
Ambos ítems son discutibles y se podrían contemplar múltiples variantes para la valoración del IA y llegar a diferentes niveles de sutileza en el análisis, o explorar diferentes aspectos del proceso. Se propusieron seis variantes definidas en (10-15) del conjunto de canales seleccionado, siendo seleccionada la más discriminante, mostrada en (13). Pero tanto el análisis topológico como la definición del conjunto de canales podría llevarse más allá, por ejemplo buscando conjuntos de canales que forman sub-mallas cerradas, y de alguna forma estudiar sus implicaciones para añadirlo (o no) como factor válido de cuantificación en la definición de nuevas agrupaciones de canalizaciones o para la valoración de otro tipo de efectos.
C. Resultados Dados los poco exigentes requerimientos en esta fase del trabajo, se ha utilizado un mismo PC (con un performance medio-bajo) para adquisición y procesamiento. Con esa potencia de cálculo el tiempo global necesario para adquirir y procesar una microplaca 1536w es superior a 24 horas.
En entornos de high throughput screening será necesario desarrollar un sistema compuesto de varios más potentes PCs en red, uno para adquisición que enviará alternativamente imágenes a varios (el número determinará en buena medida los tiempos globales finales) para su procesamiento; los resultados serán integrados en otro para la presentación de resultados.
La aplicación desarrollada está mucho más orientada a facilitar la evaluación del sistema de adquisición y procesamiento, que para soportar un entorno real de HTS (high throughput screening). Aunque consideramos que la estructura de la base datos experimento->serie->placa->pocillo, seguiría siendo válida, es obvio que toda la parte de presentación de resultados (lARs codificados en colores) puede ser muy mejorable y objeto de mayor estudio.
CONCLUSIÓN
El prototipo actual descrito en este trabajo ha contribuido a alcanzar en un experimento de angiogénesis "in vitro" miniaturizado: - objetividad en la valoración del grado de angiogénesis (IA) mediante los métodos diseñados para la cuantificación, permitiendo establecer criterios y protocolos unificados. - reproducibilidad de los experimentos permitiendo procesamiento digital de las imágenes para diferentes tipos de microplacas. Sobre estas bases en un próximo futuro se desarrollará una plataforma que soporte los requerimientos de un HTS (high throughput screening environment).

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala que comprende:
a.- depositar en los pocilios de una microplaca de alta densidad una solución biológicamente activa,
b.- depositar en dichos pocilios el reactivo a evaluar,
c- incubar la microplaca en las condiciones adecuadas y el tiempo necesario, para que el proceso fisiológico o patológico que se pretende modular ocurra,
c- adquisición y caracterización de las imágenes,
d.- procesamiento de las imágenes,
e-.- síntesis de los parámetros obtenidos,
f.- almacenamiento, gestión y presentación de los datos de resultados obtenidos.
2.- Método para evaluar ¡n vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 1a caracterizado porque en la solución biológicamente activa están presentes todos los elementos que forman el contexto o microambiente en el cual dicho proceso fisiológico o patológico ocurre, tales como células normales y/o patológicas, matriz extracelular, factores de crecimiento y agentes patógenos de origen biológico (virus, bacterias, hongos, etc.) o no biológico (agentes químicos, etc.).
3.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 1a caracterizado porque el concepto de actividad biológica comprende la modulación tanto en sentido negativo (inhibición) como en sentido positivo (estimulación) del proceso biológico (fisiológico o patológico) evaluado.
4.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según reivindicación 1a caracterizado porque cualquier proceso biológicamente complejo de base morfogenética y dependiente del microambiente, cuya evolución puede ser controlada para que ocurra en condiciones fisiológicas o patológicas, mediante la adición en la mezcla biológicamente activa de agentes patogénicos o elementos anormales según la reivindicación 2a, puede ser evaluado. Comprende procesos como:
a.- Desarrollo de estructuras capilares a partir de células endoteliales de origen microvascular y/o macrovascular. Utilidad en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para bloquear el crecimiento y/o la progresión de tumores sólidos de cualquier origen. Utilidad en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para inducir la formación de vasos sanguíneos y tratar procesos isquémicos de cualquier origen.
b.- Desarrollo de prolongaciones neuronales a partir de células nerviosas de diferentes orígenes (sistema nervioso central y/o periférico.
Utilidad en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para inducir y/o acelerar los procesos de regeneración neuronal y/o para inhibir la progresión de tumores de origen nervioso.
c- Formación de estructuras glandulares (acinos y ductos) a partir de células epiteliales de diferentes orígenes (próstata, glándula mamaria, páncreas, etc.). Implicación en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para inducir y/o acelerar los procesos de regeneración orgánica después de daños tisulares de origen diverso (patológico, quirúrgico, etc.) y/o inhibir la progresión y/o el desarrollo de tumores de origen epitelial.
d.- Formación de estructuras alveolares a partir de células pulmonares. Implicación en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para inducir y/o acelerar los procesos de regeneración orgánica después de daños tisulares de origen diverso (patológico, quirúrgico, etc.) y/o inhibir la progresión y/o el desarrollo de tumores de origen epitelial.
e.- Formación de cordones testiculares a partir de células de Sertoli y/o células de Leydig. Implicación en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para inducir y/o acelerar los procesos de regeneración orgánica después de daños tisulares de origen diverso (patológico, quirúrgico, etc.) y/o inhibir la progresión y/o el desarrollo de tumores testiculares.
f.- Formación de estructura tisulares complejas, como las mencionadas, a partir de células pluripotenciales de diferentes orígenes. Implicación en el desarrollo de agentes inductores de diferenciación específicos de linaje celular.
5.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según reivindicación 1a caracterizado porque en la fase de adquisición y caracterización de las imágenes interviene un microscopio y una cámara digital mediante los cuales las imágenes son automática y secuencialmente adquiridas y posteriormente almacenadas de manera ordenada.
6.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según reivindicación 1a caracterizado la fase de procesamiento de la imagen del pocilio consiste en la caracterización, extracción y cuantificación de las estructuras a nivel morfológico y topológico existentes en la imagen, en el cual a su vez intervienen las siguientes fases:
determinación del área de trabajo (H1 ),
segmentación (H2),y
caracterización de parámetros (H3)
7 '.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según reivindicación 1a caracterizado porque la fase de síntesis de los parámetros obtenidos consiste en,
la síntesis de un primer parámetro denominado índice de Angiogénesis
(IA) el cual cuantifica en términos absolutos la actividad angiogénica en cada pocilio (control e incógnita), sintetizándose un índice de angiogénesis (IA) obtenido a partir de parámetros morfológicos y topológicos extraídos de la imagen, y
en la síntesis de un segundo parámetro denominado índice de Angiogénesis Relativo (IAR) que cuantifica la actividad angiogénica en términos relativos, comparando los lAs de los pocilios incógnita respecto al promedio de los lAs de los pocilios control de la placa a la que pertenece, obteniéndose para cada pocilio incógnita un índice de angiogénesis relativo (IAR).
8.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 5a caracterizado, porque en la fase de determinación del área de trabajo (H1 ), inicialmente se aplica a la imagen un filtro para suavizar las estructuras interiores y realzar el halo sobreiluminado sin degradar sus bordes,
posteriormente y una vez bien delimitado el artefacto se trazan las dos diagonales de la imagen con el objetivo de determinar los puntos de intersección de estas diagonales con el círculo interior del anillo de interferencia,
para lo cual se extraen los perfiles respectivos y se calculan las derivadas mediante un filtrado bidireccional con la función de transferencia
G{z) = 1 - z-4 ,
para posteriormente obtener cuatro puntos mediante los que se trazan cuatro circunferencias determinando de cada una de ellas su centro y radio, de modo que el centro y el radio de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo es la que tiene como centro el promedio de los centros y como radio el mínimo de los radios,
construyéndose con el centro y radio de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo, una matriz de máscara wi que aplicada a la imagen original X, devuelve como resultado la imagen de trabajo Xo.
9.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 6a caracterizado porque en la fase de segmentación (H2) se obtiene una imagen en la que es factible la detección de los canales y nodos existentes en la superficie de trabajo, siguiendo para ello un camino indirecto en el que se detecta lo que no es una estructura angiogénica, es decir correspondiente a la matriz, y por complementariedad, se determina las zonas que sí lo son, acondicionando la imagen resultante de forma que se pueda realizar la extracción de los parámetros de interés, para lo cual inicialmente se aplica a la imagen de trabajo X0 el operador de Sobel para detección de bordes en direcciones ortogonales, y a partir de la imagen obtenida, Xd, extraer la imagen magnitud de bordes \Xd\ y la imagen fase de bordes §Xd.
10.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala según la reivindicación 6a caracterizado porque para la determinación de las zonas correspondientes a la matriz de la imagen se establecen los siguientes criterios:
- criterio de magnitud asociado a la imagen de magnitud de bordes |Xd| que tiene como objetivo caracterizar el rango de amplitudes de los bordes en las zonas de la matriz, dividiéndose la imagen \Xd\ en un mosaico sin solapamiento de celdas de tamaño 5% del total; determinándose para cada una de ellas la media de la amplitud resultando la imagen xd- y se establece un umbral de amplitud km fijado en el 10% del máximo obtenido,
- criterio de varianza asociado a la imagen de magnitud de bordes |Xd| que tiene como objetivo caracterizar la rugosidad de las zonas de matriz, dividiéndose la imagen de forma similar (celdas 5% del total), y calculándose la varianza de la amplitud resultando la imagen σxd y se establece un umbral de varianza kσ fijado también en el 10% del máximo obtenido,
- criterio de linealidad asociado a la imagen de fase de bordes φχd para un pixel dado, que se cumplirá si en su proximidad de 3x3, al menos 5 pixeles tienen la dirección (ambos sentidos) respecto al pixel ±10°, obteniéndose como resultado de la aplicación de este criterio a la imagen φχd la imagen φXdι
consistiendo la detección de la matriz en la aplicación secuencial a cada pixel de Xo de los tres criterios, magnitud, varianza y linealidad, para construir una máscara, w2, en la que los elementos con valor 1 corresponden a estructuras angiogénicas, y los elementos con valor 0 indican matriz según el siguiente algoritmo:
para cada píxel de la superficie X0 se extrae su vecindario de 3x3 (z), y se comprueban los criterios de la siguiente forma:
- si la amplitud media y varianza del vecindario son superiores a los umbrales establecidos (km y kσ) se trata de un píxel no-matriz y por lo tanto se le asigna un valor 1 en w2 matriz de máscara,
- si no supera ninguno de los dos umbrales se trata de un píxel matriz y se le asigna un 0 en w2 matriz de máscara,
- si solo uno de los umbrales es superado (p.ej canales muy estrechos), y en la imagen φXd su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad positiva, se trata de un píxel no-matriz,
- si solo uno de los umbrales es superado, y en la imagen φXd su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad negativa, se trata de un píxel matriz,
aplicándose la máscara w2 una vez construida a la imagen X0, para dar como resultado una imagen X0w en la que se ha eliminado la matriz, quedando visibles las zonas en torno a los canales de interconexión, nodos, grumos de células y células aisladas, realizándose posteriormente un acondicionamiento de la imagen X0w que consiste en una binarización seguida de una operación de vecindad 3x3, finalizando con una skeletonization que da lugar a una imagen Y0 .
11.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 1a caracterizado porque en la fase de Caracterización de Parámetros (H3), las matrices iniciales de trabajo son la imagen Y0 y la máscara w-j área de trabajo, efectuándose las siguientes caracterizaciones:
- caracterización de nodos, en la que en un primer paso se marcan en la matriz Y0 los pixeles candidatos a nodos, identificados como aquellos en cuya vecindad inmediata (vecindad 3x3) existen al menos otros 3 pixeles iguales a 1 , en un segundo paso, se marcan en la matriz Y0 como nodos los candidatos aislado, y en un tercer paso se agrupan candidatos adyacentes marcándose en la matriz Y0 como nodos únicos,
- caracterización de canales que parten de los nodos, para lo cual se toma cada uno de los pixeles que componen un nodo y se investiga su vecindad para encontrar en Y0, los pixeles distintos de cero y que no hayan sido marcados en la fase anterior como nodos, siendo estos puntos el inicio de un canal, pixeles que tras ser marcados en Y0 como tales, se comprueba si en su vecindad hay pixeles distintos de cero en Y0 hasta que se llega al final del mismo:
- todos los pixeles alrededor del último encontrado son cero (canal no conectado)
- alguno de esos pixeles pertenece a un nodo distinto del nodo de partida (canal conectado)
- alguno de esos pixeles está en el borde del área de trabajo -en wi es distinto de cero- (canal de escape),
i y de modo que a continuación se calcula la longitud del canal y se comprueba si ésta supera o no un umbral (U) predeterminado, para finalmente generar una nueva matriz en la que cada pixel se codifica con un color dependiendo de su naturaleza, nueva matriz que se puede superponer a la imagen original X0 para tener un resultado gráfico del proceso, imagen Y.
12.- Método para evaluar in vitro en condiciones fisiológicas o patológicas relevantes la actividad biológica de compuestos a gran escala, según la reivindicación 1a caracterizado porque en la fase de almacenamiento, gestión y presentación de la información de resultados, cada experimento es organizado jerárquicamente del modo: experimento, serie, placa, pocilio.
13.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado caracterizado porque comprende:
a.- adquisición y caracterización de las imágenes,
b.- procesamiento de las imágenes,
c-.- síntesis de los parámetros obtenidos,
d.- almacenamiento, gestión y presentación de los datos de resultados obtenidos.
14.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado según la reivindicación 13a caracterizado porque en la fase de adquisición y caracterización de las imágenes interviene un microscopio y una cámara digital mediante los cuales las imágenes son automática y secuencialmente adquiridas y posteriormente almacenadas de manera ordenada.
15.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "¡n vitro" miniaturizado según reivindicación 13a caracterizado la fase de procesamiento de la imagen del pocilio consiste en la caracterización, extracción y cuantificación de las estructuras a nivel morfológico y topológico existentes en la imagen, en el cual a su vez intervienen las siguientes fases:
determinación del área de trabajo (H1 ),
segmentación (H2),y
caracterización de parámetros (H3)
16.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado según reivindicación 13a caracterizado porque la fase de síntesis de los parámetros obtenidos consiste en,
la síntesis de un primer parámetro denominado índice de Angiogénesis
(IA) el cual cuantifica en términos absolutos la actividad angiogénica en cada pocilio (control e incógnita), sintetizándose un índice de angiogénesis (IA) obtenido a partir de parámetros morfológicos y topológicos extraídos de la imagen, y
en la síntesis de un segundo parámetro denominado índice de Angiogénesis Relativo (IAR) que cuantifica la actividad angiogénica en términos relativos, comparando los lAs de los pocilios incógnita respecto al promedio de los lAs de los pocilios control de la placa a la que pertenece, obteniéndose para cada pocilio incógnita un índice de angiogénesis relativo (IAR).
17.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado, según la reivindicación 15a caracterizado, porque en la fase de determinación del área de trabajo (H1 ),
inicialmente se aplica a la imagen un filtro para suavizar las estructuras interiores y realzar el halo sobreiluminado sin degradar sus bordes,
posteriormente y una vez bien delimitado el artefacto se trazan las dos diagonales de la imagen con el objetivo de determinar los puntos de intersección de estas diagonales con el círculo interior del anillo de interferencia,
para lo cual se extraen los perfiles respectivos y se calculan las derivadas mediante un filtrado bidireccional con la función de transferencia
G(z) = l - z"
para posteriormente obtener cuatro puntos mediante los que se trazan cuatro circunferencias determinando de cada una de ellas su centro y radio, de modo que el centro y el radio de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo es la que tiene como centro el promedio de los centros y como radio el mínimo de los radios,
construyéndose con el centro y radio de la circunferencia que delimita la superficie de trabajo, una matriz de máscara w1 que aplicada a la imagen original X, devuelve como resultado la imagen de trabajo Xo.
18.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado, según la reivindicación 15a caracterizado porque en la fase de segmentación (H2) se obtiene una imagen en la que es factible la detección de los canales y nodos existentes en la superficie de trabajo, siguiendo para ello un camino indirecto en el que se detecta lo que no es una estructura angiogénica, es decir correspondiente a la matriz, y por complementariedad, se determina las zonas que sí lo son, acondicionando la imagen resultante de forma que se pueda realizar la extracción de los parámetros de interés, para lo cual inicialmente se aplica a la imagen de trabajo Xo el operador de Sobel para detección de bordes en direcciones ortogonales, y a partir de la imagen obtenida, Xd, extraer la imagen magnitud de bordes |X<*| y la imagen fase de bordes φχd.
19.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado según la reivindicación 17a caracterizado porque para la determinación de las zonas correspondientes a la matriz de la imagen se establecen los siguientes criterios:
- criterio de magnitud asociado a la imagen de magnitud de bordes \Xd\ que tiene como objetivo caracterizar el rango de amplitudes de los bordes en las zonas de la matriz, dividiéndose la imagen |Xd| en un mosaico sin solapamiento de celdas de tamaño 5% del total; determinándose para cada una de ellas la media de la amplitud resultando la imagen xd- y se establece un umbral de amplitud km fijado en el 10% del máximo obtenido,
- criterio de varianza asociado a la imagen de magnitud de bordes |Xd| que tiene como objetivo caracterizar la rugosidad de las zonas de matriz, dividiéndose la imagen de forma similar (celdas 5% del total), y calculándose la varianza de la amplitud resultando la imagen σxd y se establece un umbral de varianza kσ fijado también en el 10% del máximo obtenido,
- criterio de linealidad asociado a la imagen de fase de bordes φ d para un pixel dado, que se cumplirá si en su proximidad de 3x3, al menos 5 pixeles tienen la dirección (ambos sentidos) respecto al pixel ±10°, obteniéndose como resultado de la aplicación de este criterio a la imagen φχd la imagen φXd, consistiendo la detección de la matriz en la aplicación secuencial a cada pixel de X0 de los tres criterios, magnitud, varianza y linealidad, para construir una máscara, w2, en la que los elementos con valor 1 corresponden a estructuras angiogénicas, y los elementos con valor 0 indican matriz según el siguiente algoritmo:
para cada píxel de la superficie X0 se extrae su vecindario de 3x3 (z), y se comprueban los criterios de la siguiente forma:
- si la amplitud media y varianza del vecindario son superiores a los umbrales establecidos (km y kσ) se trata de un píxel no-matriz y por lo tanto se le asigna un valor 1 en w2 matriz de máscara,
- si no supera ninguno de los dos umbrales se trata de un píxel matriz y se le asigna un 0 en w2 matriz de máscara, - si solo uno de los umbrales es superado (p.ej canales muy estrechos), y en la imagen φXd su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad positiva, se trata de un píxel no-matriz,
- si solo uno de los umbrales es superado, y en la imagen φXd su pixel homólogo está en zona de criterio de linealidad negativa, se trata de un píxel matriz,
aplicándose la máscara w2 una vez construida a la imagen X0, para dar como resultado una imagen Xow en la que se ha eliminado la matriz, quedando visibles las zonas en torno a los canales de interconexión, nodos, grumos de células y células aisladas, realizándose posteriormente un acondicionamiento de la imagen X0w que consiste en una binarización seguida de una operación de vecindad 3x3, finalizando con una skeletonization que da lugar a una imagen Yo .
20.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado, según la reivindicación 13a caracterizado porque en la fase de Caracterización de Parámetros (H3), las matrices iniciales de trabajo son la imagen Y0 y la máscara wi área de trabajo, efectuándose las siguientes caracterizaciones:
- caracterización de nodos, en la que en un primer paso se marcan en la matriz Y0 los pixeles candidatos a nodos, identificados como aquellos en cuya vecindad inmediata (vecindad 3x3) existen al menos otros 3 pixeles iguales a 1 , en un segundo paso, se marcan en la matriz Y0 como nodos los candidatos aislado, y en un tercer paso se agrupan candidatos adyacentes marcándose en la matriz Y0 como nodos únicos,
- caracterización de canales que parten de los nodos, para lo cual se toma cada uno de los pixeles que componen un nodo y se investiga su vecindad para encontrar en Y0, los pixeles distintos de cero y que no hayan sido marcados en la fase anterior como nodos, siendo estos puntos el inicio de un canal, pixeles que tras ser marcados en Y0 como tales, se comprueba si en su vecindad hay pixeles distintos de cero en Y0 hasta que se llega al final del mismo:
- todos los pixeles alrededor del último encontrado son cero (canal no conectado) - alguno de esos pixeles pertenece a un nodo distinto del nodo de partida (canal conectado)
- alguno de esos pixeles está en el borde del área de trabajo -en wi es distinto de cero- (canal de escape),
y de modo que a continuación se calcula la longitud del canal y se comprueba si ésta supera o no un umbral (U) predeterminado, para finalmente generar una nueva matriz en la que cada pixel se codifica con un color dependiendo de su naturaleza, nueva matriz que se puede superponer a la imagen original X0 para tener un resultado gráfico del proceso, imagen Y.
21.- Método de adquisición y procesamiento de imágenes para la evaluación automática y cuantitativa del grado de inhibición obtenido en un modelo de angiogénesis "in vitro" miniaturizado, según la reivindicación 13a caracterizado porque en la fase de almacenamiento, gestión y presentación de la información de resultados, cada experimento es organizado jerárquicamente del modo: experimento, serie, placa, pocilio.
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