WO2003005032A2 - Procede de criblage de molecules aptes a se lier a la proteine gp120 du virus de l'immunodeficience - Google Patents

Procede de criblage de molecules aptes a se lier a la proteine gp120 du virus de l'immunodeficience Download PDF

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WO2003005032A2
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protein
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Claudio Vita
Catherine Royer
Vivian Pogenberg
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Commissariat A L'energie Atomique
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening for molecules capable of binding to the gpl20 protein of the immunodeficiency virus or to its analogues. It uses a fluorescence anisotropy technique and a particular family of peptides with high affinity and specificity for the viral protein gpl20.
  • immunodeficiency viruses comprising a gpl20 viral envelope protein or a protein analogous thereto.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • VIS simian immunodeficiency virus
  • VISNA ovine immunodeficiency virus
  • VIB bovine immunodeficiency virus
  • VF Feline Immunodeficiency Virus
  • Some of the peptides of the present invention are capable of binding to the viral protein gpl20 or its analogs, of inhibiting the binding of the viral protein gpl20 to the CD4 receptor, with IC 50 values between 0.1 and 400 nM in according to their sequence. Some of these molecules are capable of inhibiting the infection of T lymphocytes by the AIDS virus with, for example, an ED 50 (Effective Dose 50%) of 100 to 900 nM. In addition, the binding of these molecules to the recombinant viral protein gpl20 induces a variation conformity in it which unmasks new epitopes, with the same efficiency as the soluble CD4 molecule.
  • the screening method of the present invention is a powerful research tool for selecting new molecules useful for the manufacture of new anti-AIDS drugs.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the structural elements of CD4 critical for its binding to the viral glycoprotein gpl20 include the amino acids Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43, Thr45, which are included in region 36-47, and CD4 arginine-59.
  • the CD4 region 36-47 has been assimilated to the CDR2 region of the immunoglobulins and has a pin-like structure hair.
  • This structure is formed by a ⁇ (C) strand, corresponding to the sequence 36-40, followed by an elbow corresponding to the 40-43 sequence which allows a second ⁇ (C ") strand, corresponding to the sequence 43 -47, to form with the first an antiparallel ⁇ structure.
  • This structure is stabilized by hydrogen bonds between the amide nitrogen of the residues
  • This hairpin structure plays a central role in the interaction of CD4 with the viral protein gpl20 and performs a dual function: first, it allows the amino acids Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43 and Thr45 to form a molecular surface complementary to the interaction surface of the viral protein gpl20 and, in particular, allows the side chain of Phe43 to be inserted at the entry of a hydrophobic cavity into the molecular surface of the viral protein gpl20; secondly, it allows a ⁇ -sheet type interaction between the polypeptide skeletons of the ⁇ C "strand of CD4 and the ⁇ 15 strand
  • Arginine 59 also plays a critical role in the CD4-gpl20 interaction, since the guanidinium group of its side chain forms a double hydrogen bridge with the side chain of the Asp368 residue of the viral protein gpl20, allowing the stabilization of the interaction of the ⁇ structure type between the C "strands of CD4 and ⁇ 15 of the viral protein gpl20. Site-directed mutagenesis experiments have demonstrated that all of these CD4 residues play a critical role in the interaction with the viral protein gpl20 [2], [3].
  • CD4 interacts with a broad depression of the molecular surface (800 A 2 ) of the viral protein gpl20, using a large molecular surface (742 A 2 ), which is centered around the region which has been assimilated to the CDR2 region of immunoglobulins.
  • a narrow and deep cavity opens, the "Phe43 cavity", in which the side chain of Phe43, at the top of the CDR2 region of CD4, occupies the entrance.
  • the resolution of this structure confirms the previous mutagenesis data, which indicate the residue Phe43 and the entire CDR2 loop as functionally very important, and proposes the latter as a possible target for the inhibition of the attachment of HIV-1 virions to cells.
  • the gpl20-CD4 interaction allows the virus to bind to the membrane of target cells and represents the first protein-protein interaction in the mechanism of infection.
  • other co-receptors are necessary for efficient entry of the AIDS virus into cells. These are CXCR-4 [5], [6], which is involved in the entry of lymphotropic viral strains (X4) and CCR-5 [7], [8], which is involved in the entry M-tropic strains (R5) and most primary isolates.
  • the crystallographic structure of the viral protein gpl20 complexed with CD4 has made it possible to elucidate one of the mechanisms used by the AIDS virus to escape the immune response.
  • the gpl20 envelope protein had hypervariable and highly glycosylated regions.
  • the crystallographic structure has in fact demonstrated that the hypervariable regions and the highly glycosylated regions form the exposed molecular surface of the viral protein gpl20, which also corresponds to the accessible surface of the virions. Only a few regions of the molecular surface of the viral protein gpl20 are conserved and can be the target of antibodies. These regions are not normally accessible and are probably protected by hypervariable loops
  • V1-V2-V3 which in the crystallized protein have been deleted, and are therefore invisible.
  • One of these regions is a surface close to the interaction site for the chemokine receptors, and accessible to CD4i antibodies, after binding of the envelope to CD4.
  • the CD4 binding site is another exposed and conserved surface: however, this surface is present in a cavity of the viral protein gpl20 and is therefore not accessible to antibodies, but can accommodate CD4 which has a single domain- d immunoglobulin unlike antibodies that use two domains for molecular recognition.
  • Peptide constructs derived from CD4 have been proposed as inhibitors of viral infection: it is a structural mimic peptide of the CDR2 loop of CD4 which incorporates a phenyl group mimicking Phe43 [14] and a cyclic peptide corresponding to the CDR3 loop of CD4 and incorporating additional aromatic residues [15].
  • these constructions have a weak antiviral activity limited to a laboratory isolate and, even if they were initially designed as CD4 structural mimetics, they are not active in the entry stage [16].
  • a bis-azo dye FP21399 [18] identified by a combinatorial approach, phosphorothioate oligonucleotide zintevir (AR177) [19], a polymer based on naphthalene sulfonate, PRO2000 [20] and d a starch derivative, dextrin 2-sulfate (D2S) [21], which inhibit HIV-1 chemical isolates in cell cultures, but require high concentrations.
  • entry inhibitors there is also SPC3 [22], a multi-branched synthetic peptide construct, which, originally proposed as an inhibitor of the CD4-gpl20 interaction, is then shown to be active in a next step attachment of virions to cells.
  • Other small molecules have been proposed as entry inhibitors: bicycla AMD3100 [23], NSC651016 [24],
  • T140 [26] and TAK779 [27].
  • These molecules are viral entry inhibitors, active on the CXCR4 and CCR5 entry co-receptors, but have no activity in the CD4-gpl20 interaction.
  • Peptides derived from the sequence of the C-terminal region of the gp41 glycoprotein, the peptide T20 (or DP178) [28] and its most recent improved version DT1249 [29] are other inhibitors of infection which target a transient phase of entry, after the attachment of the viral envelope to CD4 and before the fusion of virus cell membranes: these peptides are inactive in the gpl20-CD4 interaction.
  • Most of these products are currently in phase I / II clinical trials, but their therapeutic efficacy • remains to be verified.
  • the anti-AIDS therapeutic regime currently used in clinics, tritherapy includes a combination of three inhibitors that target two viral enzymes, reverse transcriptase and protease. Even if triple therapy has succeeded in significantly reducing the viral load of many patients, it is not capable even in the most favorable cases of eradicating the disease, because dormant reservoirs of infection still persist [30].
  • the partial success of tritherapy on the one hand and the impossibility of stopping AIDS infection with current therapeutic protocols on the other hand have increased the demand for new drugs which can be active at the level of other viral targets and increase the repertoire and efficacy of current clinical drugs.
  • the libraries of molecules currently available and potentially active in inhibiting entry and infection by the AIDS virus are enormous.
  • the object of the present invention is precisely to provide a method for screening for molecules capable of binding with a determined affinity to the gpl20 protein of the AIDS virus, in particular of human immunodeficiency (HIV).
  • HIV human immunodeficiency
  • the screening method of the present invention includes at least one screening cycle comprising the following steps: a) covalent labeling with a fluorescent probe of a peptide having said determined affinity for the gpl20 protein, said peptide comprising the sequence (A) defined below, b) bringing the labeled peptide into contact with the gpl20 protein, at a concentration of gpl20 which allows between 20 and 50% of binding of the labeled peptide, so as to form a reversible complex [labeled peptide-gpl20], c ) standard measurement of the fluorescence polarization of the complex [labeled peptide-gpl20], d) screening test by placing in competition the complex [labeled peptide-gpl20] formed with at least one candidate molecule capable of binding to the protein gpl20 to a determined concentration of said molecule (s) and under physicochemical conditions making it possible for competition between said molecule and the labeled peptide to form e possibly
  • the molecules sought by means of the screening method of the present invention are therefore those which compete with the peptide of the present invention.
  • the method of the present invention is characterized in particular in that it uses a family of particular peptides which mimic CD4 and overcome the aforementioned drawbacks of the prior art. Indeed, it uses a stable peptide, having a very strong affinity for the envelope of the AIDS virus, in particular for the protein gpl20.
  • the peptide of the present invention is characterized in that it comprises the following sequence (A):
  • the peptide of the present, invention is characterized in that it comprises the Sequence (I):
  • Xaa j Cys - Thr or Ala -Cys - Xaa k ⁇ -NH 2 , 25 in which TPA represents thiopropionic acid, Xaa a , Xaa b , Xaa c , Xaa, Xaa e , Xaa f , Xaa 9 , Xaa h , and Xaa 1 , are amino acids, natural or unnatural, identical or different, Xaa? represents Nal, Phe or Bip, and Xaa k represents Gly, Val or Ile.
  • Asp represents the optical isomer D of aspartic acid
  • Nal represents ⁇ -naphthylalanine
  • Bip represents bi-phenylalanine.
  • (I) comprising a thiopropionic acid at the position 1 of the sequence, a Phe, Nal, or Bip residue in position 23 of the sequence (Xaa j ), and a Gly, Val or Ile residue in position 27 of the sequence (Xaa) has a high affinity and a high specificity for binding for the gpl20 protein of the viral envelope of the immunodeficiency virus.
  • This peptide has only 27 or 28 residues, and has a hairpin structure consisting of two antiparallel ⁇ strands connected by a ⁇ elbow of four residues.
  • the two antiparallel strands being at a distance which can give interactions with intramolecular hydrogen bridges, stabilize the structure.
  • the distance between the amide nitrogen and carbonyl oxygen atoms of the peptide bond is from 2.5 to 3.6 A. This well defined and stable structure reproduces structural elements of CD4 critical for its binding to the gpl20 glycoprotein.
  • the side chain of Xaa J 23 points to the hairpin pattern in a conformation similar to that of the Phe 43 of CD4 to be inserted at the entrance of a hydrophobic cavity of the viral protein gpl20, thus strengthening the link with gpl20.
  • Arg and Lys at positions 9 and 18 are topologically equivalent to the Arg59 and Lys35 residues of the CD4 protein.
  • the hairpin structural motif has a surface accessible to the solvent and / or to a larger molecule such as a protein, which can favor its interaction with the protein of the viral envelope.
  • the amino acid side chains of the surface accessible to the solvent of this motif are close in space and form a continuous molecular surface which reproduces the structure of several residues important for the CD4-gpl20 bond.
  • the structural platform which contains the hairpin structural motif also contains other structural regions capable of accommodating additional chemical functionalities in a well-defined spatial position relative to the structural hairpin motif, which can thus reinforce its biological function. and / or present labeling groups.
  • a biotin group or a fluorescein group has been incorporated at the side chain of lysine 11, without causing loss of the biological activity of the derivative.
  • the incorporation of these groups allowed the use of these derivatives in tests for interaction with the envelope protein, as described below.
  • the sequence (A), for example the sequence, (I) can also comprise a proline residue linked to the residue Xaa k .
  • a proline residue added in position 28 stabilizes the C-terminal end and makes the ⁇ C-terminal strand of the hairpin structural motif less flexible.
  • Xaa 1 in the sequence (I), can be Gly.
  • the peptide of the present invention can comprise a sequence chosen from the sequences ID no. 4, ID no. 5, ID no. 6, ID no. 7, ID no. 8, ID no. 9, ID no. 10, ID # ll, ID # 12, ID # 13, ID # 14, ID # 15, ID # 16, ID # 17, ID # 18, ID # 19 and ID # 20 of the attached sequence list.
  • the peptide of the present invention can be obtained by chemical synthesis in solid phase or by genetic recombination.
  • the chemical synthesis can be carried out for example with an automatic peptide synthesizer of the Applied Biosystems type, mod.433A (trademark). It can be carried out, for example, in Fmoc chemistry which uses the fluoromethyloxycarbonyl group for the temporary protection of the ⁇ -amino function of amino acids.
  • the peptide of the invention can also be manufactured by means of a method comprising the following steps: a) integration of a nucleic acid sequence into an expression vector, said nucleic acid sequence coding for the peptide of the present invention, b) introduction of the expression vector comprising said nucleic acid sequence into a host cell, c) culture of the host cell comprising said nucleic acid under culture conditions allowing the synthesis of said peptide, d) recovery of the peptide synthesized, and e) grafting the TPA in the N-terminal position.
  • the grafting of a TPA in the C-terminal position of the peptide can be carried out by means of a conventional organic chemistry method applicable to a peptide.
  • the inventors have synthesized a family of peptides reproducing part of the structure of the CD4 region resembling the CDR2 region of immunoglobulins, which, as demonstrated by mutagenesis and crystallographic analysis results, are among the critical regions of the CD4 binding to the viral protein gpl20.
  • the peptides of the present invention are capable of binding to the region of the gpl20 glycoprotein which interacts with CD4, the main receptor for the entry of the AIDS virus, in particular HIV-1, into CD4 target cells.
  • These peptides constitute a family of inhibitors whose affinity for the viral glycoprotein gpl20 monomeric recombinant, varies between IC 50 values ranging from 0.1 nM to 400 nM. They are specific and potent inhibitors of the CD4-gpl20 interaction based on the structure of CD4.
  • the binding with the recombinant viral protein gpl20 is in competition with the soluble CD4 and is specific for the well-structured form
  • they can be labeled, for example with a fluorescent probe, without the protein binding affinity of the gpl20 viral envelope being altered.
  • peptides can therefore be used as tracers in the screening method using a fluorescence anisotropy technique according to the present invention.
  • This method uses the fluorescence polarization of said peptide covalently labeled by a fluorescent probe.
  • the peptide used is that which has an affinity in the range of that of the molecules sought. For example, if one seeks to screen for molecules having an affinity greater than or equal to 10 s M "1 , one will use a labeled peptide having an affinity of 10 6 M " 1 . Also, for example, if one seeks to screen for molecules having a higher affinity, for example 10 9 M ⁇ 1, a peptide exhibiting a similar affinity will be used.
  • the screening method of the present invention can be granted according to the desired affinity by choosing the peptide used.
  • the affinity for the viral protein Gpl20 of the molecules detected by the screening method of the present invention can be determined from that of the peptide according to the invention chosen for the screening.
  • the fluorescent probe should preferably have a high quantum yield and fluorescence in the visible for a high detection sensitivity.
  • Other fluorescent probes exhibiting the properties specified above can of course be used.
  • the fluorescence polarization is calculated from two measurements, the emission intensity of the fluorescence polarized in parallel and perpendicular, with an excitation in parallel.
  • parallel polarization is defined in the z direction of the laboratory axis.
  • Ao / A-1 ⁇ / ⁇ c (4), in which Ao is the limit anisotropy of the fluorophore, a physical constant determined by the angle between the absorption and emission dipoles, ⁇ is the lifetime fluorescence, and ⁇ c is the rotational correlation time.
  • V h the hydrated volume of the molecule or molecular complex according to the relation (5):
  • ⁇ c ⁇ V h / RT (5), in which ⁇ is the viscosity of the solution, R is the constant of gas and T, the temperature in Kelvin.
  • any molecule capable of inhibiting the interaction between a peptide of the present invention and a viral protein gpl20 can represent an inhibitor of the CD4-gpl20 interaction, and therefore an inhibitor of the viral infection. It is therefore possible, thanks to the peptides of the present invention to screen in a library of molecules any molecule capable of interacting with the protein gpl20 or a protein analogous to gpl20, in particular molecules with antiviral activity or molecules useful for the manufacture. of medicine.
  • the screening method of the present invention operates by competition.
  • the peptide of the present invention, chosen and labeled, is brought into the presence of gpl20 at a concentration which allows between 20 and 50% of fixation.
  • the amount of gpl20 should not be saturated, otherwise, a large amount of molecules to be screened should be used to allow competition.
  • the complex [labeled peptide-gpl20] formed must be reversible to allow competition.
  • concentration of the candidate molecules in the screening assays of the process of the present invention are determined in the same way as in the conventional tests of competition of molecules for a receptor used in molecular biology.
  • concentration of the candidate molecule (s) is preferably 10 to 100 times higher at the concentration of the labeled peptide of the present invention.
  • the method of the present invention is a method which is both rapid, in particular because it uses the fluorescence anisotropy techniques, and precise because it uses the peptides of the present invention. In addition, it requires very small quantities of reagents as shown in the examples below, which reduces the costs incurred in the search for molecules capable of being used for the manufacture of drugs intended for the treatment of AIDS compared to the methods of prior art.
  • the screening method of the present invention is quite suitable for screening libraries of molecules currently available and potentially active in inhibiting the entry and infection of the AIDS virus. It therefore constitutes a rapid and efficient search tool for molecules that are effectively active in order to inhibit the gpl20-CD4 interaction necessary for effective infection by the AIDS virus.
  • a single candidate molecule is tested in a screening cycle.
  • the candidate molecule tested will be considered as a molecule capable of binding to the viral protein Gpl20.
  • the fluorescence polarization measurement of step e) is unchanged compared to the standard measurement of step c)
  • the candidate molecule tested will not be considered to be able to bind to the viral protein Gpl20.
  • the cycles will have to follow each other as many times as there are different candidate molecules to be tested, at the rate of one molecule per cycle.
  • a sample comprising several different candidate molecules can be tested in a single screening cycle.
  • the fluorescence polarization measurement of step e) is less than the standard measurement of step c)
  • the sample will be considered as comprising at least one molecule capable of binding to the viral protein gpl20.
  • the fluorescence polarization measurement of step e) is unchanged compared to the standard measurement of step c)
  • the sample will not be considered as comprising at least one molecule capable of binding to the viral protein Gpl20 .
  • a single cycle makes it possible to test a sample comprising several different candidate molecules. If for one of the samples the fluorescence polarization measurement of step e) is less than the standard measurement of step c), then at least one of the candidate molecules of said sample will be considered as capable of binding to the viral protein gpl20.
  • the screening can then be refined on the molecules of said sample according to the first embodiment of the present invention to identify the molecule or molecules of the sample capable of binding to the viral protein Gpl20.
  • This second mode of embodiment of the present invention allows very rapid screening of candidate molecules.
  • first and second embodiments of the present invention can be carried out on known candidate molecules currently available and potentially active in inhibiting entry and infection by the AIDS virus.
  • the method of the present invention can be applied to unpurified biological liquids such as urine, cell extracts, bacteria, etc.
  • this extract can be analyzed by the traditional methods of analysis in chemistry to identify the molecules which it contains.
  • a more precise screening can then be carried out to highlight, among all the molecules identified in the extract, the molecule (s) capable (s) of binding to the viral protein Gpl20.
  • the process of the present invention therefore constitutes a powerful screening tool, rapid, reproducible, sensitive and tunable to a wide range of affinity. It is practiced in solution and does not require separating the complexes from the free molecules.
  • the screening method of the present invention has many advantages that those skilled in the art can readily identify.
  • Another advantage is that the labeling of the peptide of the present invention can be carried out with different compounds such as Rhodamine green, fluorescein, etc.
  • compounds such as fluorophores which absorption and emission properties in the visible can be particularly advantageous for the detection of molecules in non-purified extracts such as urine, cellular extracts, bacteria, etc.
  • this method makes it possible to use little viral protein gpl20, since it can take place in the presence of a concentration of unsaturated gpl20, or even preferably at a concentration which allows 20 to 50% of binding.
  • the method of the present invention using the peptides and the anisotropy measurements defined above makes it possible to carry out measurements entirely in solution.
  • the method of the present invention can be adapted to very small volumes of a few microliters, and thus measures microwells. It also allows very quick measurements, one or two minutes for competitions.
  • Another advantage of the process of the present invention lies in the reproducibility of the results.
  • the anisotropy value for a labeled peptide of the present invention for example under the conditions defined in the examples below, is always the same.
  • Another advantage of the process of the present invention lies in the fact that the temperature and solution conditions can easily be modified and controlled.
  • Yet another advantage lies in the fact that the signal / noise ratio being very high, the method of the present invention makes it possible to detect very low rates of fixation.
  • sequence ID no.1 sequence sCD4.
  • sequence ID No. 2 sequence of scyllatoxin (ScTx).
  • CD4M9 sequence peptide derived from scyllatoxin, not having TPA in position 1 of the sequence.
  • sequences ID n ° 4-16 and 19 and 20 sequences named CD4M9T, CD4M26, CD4M27, CD4M27A, CD4M27B, CD4M27C, CD4M30, CD4M31, CD4M32, CD4M33, CD4M35, K15, K16 and CD4M9BIP and CD4M9V respectively of the present invention.
  • sequence ID No. 17 sequence named CD4M3 derived from scyllatoxin not having TPA in position 1 of the sequence.
  • sequence ID No. 18 sequence called CD4MO derived from charybdotoxin.
  • Figure 1 Curves of inhibition of the binding of CD4 to the viral protein gpl20, by peptides of the present invention, obtained by competitive ELISA.
  • the peptides tested are: CD4M9, CD4M9T, CD4M27, CD4M32, CD4M33 and CD4M35.
  • the experimental data are reported as a percentage of binding (% F) as a function of the concentration of the peptides.
  • Figure 2 Curve of inhibition of the binding of CD4 to the viral protein gpl20, by the peptide labeled CD4M33-fluorescein, CD4M33-F, obtained by competitive ELISA.
  • the curves of the peptides CD4M9 (sequence ID n ° 3), CD4M33 (sequence ID n ° 13) and CD4M35 (sequence ID n ° 14) are also shown for comparison.
  • the experimental data are reported as a percentage of binding (% F) as a function of the concentration of the peptides.
  • Figure 3 Interaction curves of the recombinant viral protein gpl20-HXB2 with the peptide CD4M33 (sequence ID No. 13) attached to the surface of a chip of a surface plasmon resonance instrument, The association curves ( 0-300 s) and dissociation (300-800 s) were recorded after injection of the viral protein gpl20 at concentrations 13.2 (1), 19.8 (2), 29.6 (3), 44.4 (4), 66.6 ( 5) and 100 (6) nM. The data are reported in resonance units (RU) as a function of time (t) in seconds.
  • RU resonance units
  • the data are represented as a percentage inhibition (% I) of reverse transcriptase (TI) activity in the culture supernatants as a function of the nM concentration of the peptides.
  • the association (0-180 s) and dissociation (180-400, 180-450 s) curves are reported for the viral protein gpl20 alone and the viral protein gpl20 in the presence of CD4M27 (1.5 equivalent, sequence ID n ° 6), CD4M9 (1.5 equivalent), the inactive mutant (Ala23) CD4M9 (1.5 equivalent) and soluble CD4 (1.5 equivalent).
  • the data are reported in resonance units (RU) as a function of time (t) in seconds.
  • FIG. 7 Examples of peptide sequences of the present invention shown with the letter codes of the amino acid residues.
  • TPA and B represent thio-propionic acid and bi-phenylalanine respectively and "d" the optical form D of aspartic acid.
  • FIGS. 8 a), b) and c) curves illustrating fluorescence anisotropy measurements (An), expressed in millianisotropy (mA), of the peptide K16 of the present invention labeled with rhodamine green, in solution at a concentration of 2 nM, and placed in the presence of viral protein gpl20 of strain HXB2 at different concentrations [GP120] nanomolar (nM).
  • FIGS. 9 and 10 curves illustrating fluorescence anisotropy measurements (An), expressed as millianisotropy (mA), respectively of the peptides CD4M33 and K15 of the present invention labeled with rhodamine green, in solution at a concentration of 2 nM, and placed in the presence of viral protein gpl20 of strain HXB2 at different concentrations [GP120] nanomolar (nM).
  • FIG. 9 curves illustrating fluorescence anisotropy measurements (An), expressed as millianisotropy (mA), respectively of the peptides CD4M33 and K15 of the present invention labeled with rhodamine green, in solution at a concentration of 2 nM, and placed in the presence of viral protein gpl20 of strain HXB2 at different concentrations [GP120] nanomolar (nM).
  • FIGS. 12a) and 12b) curves illustrating fluorescence anisotropy measurements (An), expressed in millianisotropy (mA), of the peptide CD4M33 of the present invention labeled with rhodamine green, in solution at a concentration of 6 nM, and put in the presence of viral protein gpl20 respectively of strains HXB2 and SF2 at different concentrations [HXB2] and [SF2] nanomolar (nM).
  • Figure 13 Theoretical curves illustrating theoretical values of fluorescence anisotropy (An), expressed in millianisotropy (mA), of a competition between a labeled CD4M33 peptide and an unlabeled CD4M33 peptide, as a function of the nanomolar concentration
  • Kd 14nM of CD4M33 determined by direct titration.
  • the peptides of the present invention were produced in this example by solid phase chemical synthesis with an automatic peptide synthesizer Applied Biosystems, mod. 433A, and in chemistry Fmoc, which uses the group Fluorenylmethyloxycarbonyle (Fmoc) for the temporary protection of the ⁇ -amino function of amino acids.
  • the protective groups used to prevent side reactions of the amino acid side chains, in this Fmoc strategy, were tert-butyl ether (tBu) for the residues Ser, Thr and Tyr; tert-butyl ester (OtBu) for Asp, Glu; trityl (Trt) for Gin, Asn, Cys, His; tert-butyloxycarbonyl (Boc) for Lys and 2, 2, 5, 7, 8-pentametylchromane-6-sulfonyl (Pmc) for Arg.
  • tBu tert-butyl ether
  • OtBu tert-butyl ester
  • Trt trityl
  • Pmc tert-butyloxycarbonyl
  • the coupling reaction takes place with an excess of 10 equivalents of amino acids (1 mmol) relative to the resin (0.1 mmol).
  • the protected amino acid is dissolved in 1 ml of N-methylpyrollidone (NMP) and 1 ml of a 1M solution of 1N-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) in NMP solvent.
  • 1 ml of a 1M solution of N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) is then added.
  • the active ester formed is transferred to the reactor which contains resin.
  • the resin is deprotected from its Fmoc group by a solution of 20% piperidine in NMP. The excess piperidine is removed by washing with NMP after approximately 5 to 10 minutes.
  • the detection of the dibenzofulven-piperidine adducts at 305 nm makes it possible to follow the good progress of the synthesis. Indeed, the quantification of the adduct makes it possible to estimate the efficiency of the deprotection of the Fmoc group and as a result of the coupling of the last incorporated amino acid.
  • a fluorescent probe and a biotin group were coupled to two of the peptides studied of the present invention, CD4M9T (sequence ID no. 4) and CD4M33 (sequence ID no. 13). The incorporation into these two compounds was carried out on the lysine 11 residue, at a face opposite the binding site of the viral protein gpl20.
  • This choice of a lysine was conditioned by its possibilities of protecting its side chain with a protective group, said to be orthogonal, such as the group of (1- (4, 4-dimethyl-2, 6-dioxo-cyclohexylidene) ethyl) (or Dde group).
  • a protective group said to be orthogonal, such as the group of (1- (4, 4-dimethyl-2, 6-dioxo-cyclohexylidene) ethyl) (or Dde group).
  • a protective group such as the group of (1- (4, 4-dimethyl-2, 6-dioxo-cyclohexylidene) ethyl) (or Dde group).
  • a protective group such as the group of (1- (4, 4-dimethyl-2, 6-dioxo-cyclohexylidene) ethyl) (or Dde group).
  • the fluorescent group was introduced on the side chain of lysine 11 of the peptide of the present invention CD4M33 and of lysine 15 or 16 of peptides K15 (sequence ID no. 15) or K16 (sequence sequence no. 16), respectively, of the present invention.
  • the Dde group was therefore used for the protection of the lysine side chain during the synthesis of the peptide, and then released by two treatments of 5 min with 2% hydrazine in dimethylformamide (DMF).
  • the fluorescein molecule was coupled directly to the synthesized peptide. The coupling of the probe was carried out using the fluorescein- (5- (6) -N-hydroxysuccinimidylcarboxylate ester.
  • the CD4M9 peptide is synthesized according to the procedure described above with Lysine in position 11 having, as a protective group for the side chain, a Dde group. After synthesis of the peptide, the peptide-resin is treated 5 times with a solution of 2% hydrazine in DMF. The coupling of a link arm is carried out for one hour at room temperature in DMF with 10 equivalents of Fmoc-8-amino-3, 6-dioxaoctanoic using the reagent HBTU in the presence of diisopropylethylamine. The Fmoc group is then deprotected with 20% piperidine in DMF.
  • the peptide-resin is therefore treated with 10 equivalents of Traut's reagent (2-iminothiolane hydrochloride (Sigma) in the presence of DIEA.
  • the peptide is finally released and deprotected as described below. FINAL DEPROTECTION OF THE RESIN.
  • the cleavage of the resin and of the protective groups present on the side chains were carried out simultaneously by treatment of the peptide linked to the resin with trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the reagent used during the cleavage is an acid mixture containing 81.5% of TFA and the trappers phenol (5%), thioanisole (5%), water (5%), ethanedithiol (2.5%) and tri-isopropylsilane ( 1%).
  • the resin was treated with this mixture for three hours with stirring and room temperature, at a rate of 100 ml of solution per gram of resin.
  • the free peptide in solution was recovered by filtration.
  • the peptide was then precipitated and washed cold in diisopropyl ether then dissolved in 20% acetic acid and lyophilized.
  • the peptide recovered after lyophilization, the crude synthesis, is in reduced form, that is to say that the intrachain disulfide bridges are not formed.
  • the formation of these covalent bonds was carried out using the redox cystamine / cysteamine pair.
  • the crude synthesis was taken up in water added with 0.1% TFA (v / v) and guanidinium chloride 6M to facilitate its dissolution, at a rate of 2.0 g.ml "1. This solution then was added dropwise, diluted to 0.2 mg / ml ⁇ 1 , to the reduction buffer, composed of 100 mM Tris / HCl, pH 7.8, and 5 mM cysteamine.
  • the 0.5 mM cystamine (oxidant) was finally added after 45 minutes of reaction at room temperature. The medium is brought to pH 3.0 after 30 minutes.
  • Cysteamine makes it possible to reduce the thiol groups present on the peptide. In the open air, it oxidizes and allows the oxidation of cysteines and therefore the folding of the peptide by formation of intrachain disulfide bridges. The cystamine added at the end of handling makes it possible to perfect the folding. The good progress of the oxidation is verified by analytical chromatography by comparing the times of retention of raw and oxidized products, more important for the former.
  • the reactional folding medium composed of a 20 mM phosphate buffer, 200 mM NaCl, adjusted to pH 7.8 is degassed for a long time with argon and then added with 5 mM of cysteamine, 5 mM cytamine.
  • the peptide comprising seven free SH functions is then added and the oxidation reaction is stopped by adding acid after only 10 minutes, sufficient time for folding and the formation of the three natural disulfide bridges and short enough to limit the formation of product. secondary corresponding to higher oxidation states.
  • the peptides of the present invention were purified by reverse phase high performance liquid chromatography on a Vydac C18 preparative column.
  • the inhibition of the rgpl20-CD4 interaction was measured by indirect ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). 50 ng per well of anti-gpl20 antibody, D7324, were immobilized on a 96-well plate (Maxisorb, Nunc) overnight at 4 ° C. After passivation with Bovine Serum Albumin and three washes with the washing buffer (10 mM Tris, pH 7.8, 0.05% Tween 20), 15 ng of rgpl20 HXB2 per well were added. Different concentrations of competitors were then added, after three washes, as well as 0.4 ng of soluble CD4 per well. 100% controls containing only soluble CD4 are carried out. After overnight at 4 ° C.
  • the tests were conducted in duplicates and the results expressed as the average of experimental duplicates.
  • the biological activities of the CD4MO peptide (sequence ID no. 18) derived from charybdotoxin and of the CD4M3 peptide (sequence sequence No. 17), derived from scyllatoxin (sequence sequence No. 2) were tested in the indirect ELISA test.
  • FIG. 1 groups together the results obtained in this example with the peptides of the present invention.
  • % F percentage of fixation
  • C (M) molar concentration
  • CD4M9 (sequence ID No. 3) was tested in ELISA by competition. It has the capacity to inhibit the soluble rgpl20 LA ⁇ -CD4 interaction with a 50% inhibition concentration (or IC 50 ) of 4.10 "7 M (Table I), ie an increase in the inhibition capacity by a factor of 50 compared to the peptide of the present invention CD4M3 (sequence ID No. 17).
  • the peptide of the present invention CD4M9 in competitive ELISA test, is also capable of inhibiting the interaction of CD4 with other recombinant gpl20 proteins, originating from T- and M-tropic viruses: HIV-1n IB , HIV-IMH, HIV-1 Ba -L, HIV-1 JR . FL , HIV-1 W61D , with a 50% inhibition concentration (IC 50 ) between 0.1 and 1.0 x 10 "6 M [4].
  • This peptide inhibits the interaction gpl20 ⁇ x soluble B2 -CD4 at an IC 50 of 9 x 10 "8 M ( Figure 1, Table I).
  • a CD4M9V mutant comprising the substitution of the C-terminal Gly-Pro sequence of CD4M9 by Val, has an IC 5 o of 3.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M in the inhibition of the gpl20 A i-CD4 interaction (Table 1) , which represents a slight increase in inhibitory capacity.
  • the mutant CD4M9Bip has the substitution Phe23Bip compared to CD4M9; this peptide has an IC 50 of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M in the inhibition of the interaction g l20 LA i- CD4 (Table 1), which represents a further increase in inhibitory capacity.
  • the mutant CD4M9T (sequence ID No.
  • the peptide of the present invention CD4M27 (sequence ID No. 6) contains the Arg5Phe mutations (to remove a non-essential arginine and protect the disulfide bridge 6-24), Gly27Val and the deletion of the C-terminal proline residue (to better stabilize the ⁇ structure). It has an increase in the capacity to inhibit the CD4 - gpl20 ⁇ B2 CI 5 o binding by 7.10 "9 M, (FIG. 1, Table I).
  • the peptides CD4M27 A, B and C are obtained respectively by a Gly21Ser mutation ( a), Ser22His (b) and Ser22Asn (c) from the CD4M27 peptide They have an inhibition capacity comparable to that of the CD4M27 peptide.
  • the peptide of the present invention CD4M32 (sequence ID No. 12), compared to CD4M9T, comprises the deletion of the C-terminal proline residue, the Gly27Val mutation and the mutation of Phe23 to biphenylalanine (Bip): the Phe23Bip mutation adds an extension hydrophobic to the side chain of Phe23, to increase the interaction with the hydrophobic cavity of the viral protein gpl20.
  • CD4M32 shows an increase in the inhibition of CD4-gpl20 ⁇ B2 binding (IC 50 of 8.10 "10 M, FIG. 1).
  • the mutant CD4M30 (sequence ID No. 10), compared to CD4M32, contains the mutation Arg5Phe
  • This peptide of the present invention has an IC 50 of 3.0 nM, in the tests for inhibition of the CD4-gpl20 LA i interaction.
  • the mutant CD4M33 (sequence ID No. 13) groups together the mutations present in the two preceding peptides, in particular CyslTPA, Arg5Phe, Phe23Bip, Gly27Val, the deletion of a residue in the C-terminal position and in addition the Ala4His mutation (to increase the solubility of the molecule).
  • Two other peptides K15 (sequence ID No. 15) and K16 (sequence ID No. 16) have been synthesized: they contain the substitutions Gln7Val, Leu8Gln, LysllHis, relative to the CD4M33 peptide of the present invention, and a Lys residue in position 15 or 16, respectively.
  • a fluorescent fluorescein group was then covalently attached to the side chain of this lysine residue, according to the protocol described in Example 1.
  • the fluorescent peptides K15 and K16 have an IC 50 of 5, 0.10 ⁇ 8 M and 6.0.10 "9 M in the inhibition of the interaction gpl20 LAI -CD4, whose affinity for the viral protein gpl20 is not modified by labeling.
  • the present invention provides a family of peptides which represent potent inhibitors of the CD4-gpl20 interaction.
  • Table 1
  • IC 50 50% inhibition concentration (IC 50 ) of CD4 mimetic peptides in the interaction of soluble recombinant CD4 for the viral envelope protein gpl20 LAI and gpl20 ⁇ B2-
  • IC 50 50% inhibition concentration of CD4 mimetic peptides in the interaction of soluble recombinant CD4 for the viral envelope protein gpl20 LAI and gpl20 ⁇ B2-
  • the standard deviation for each value is less than 30%.
  • Streptavidin was immobilized on the chip as follows: the surface of the chip was first activated by the injection of 50 ⁇ L of coupling agent provided by the manufacturer and which can form amide bonds: N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), 50/50; then 20 ⁇ L of streptavidin, 0.2 mg.mL "1 in 10 mM sodium acetate, pH 4.5, were injected at 5 ⁇ L.min " 1 , followed by neutralization of the carboxylic groups activated by 2 x 20 ⁇ L of 1.0 M ethanolamine, pH 8.5.
  • coupling agent provided by the manufacturer and which can form amide bonds: N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), 50/50; then 20 ⁇ L of streptavidin, 0.2
  • the biotinylated molecules were then injected (10 ⁇ L.min “1 in 10 mM Hepes buffer, 0.3 M NaCl, pH 7.4) on three of the four tracks of the chip.
  • CD4M9 (10 "7 M) has been immobilized up to a value RU (resonance unit) 100; the second runway was left blank (witness); the third track was covered with soluble CD4 (10 "7 M) up to a value of 450 RU; on the fourth track, the CD4M33 (10 ⁇ 7 M) was immobilized at a value of 100 RU.
  • CMSP peripheral blood mononuclear cells
  • Medium A is composed of RPMI 1640 cell culture medium (Life Technologies) supplemented with 10% fetal calf serum (SVF, Roche Product) decomplemented by heat at + 56 ° C for 30 min, with 2 mM L- Glutamine (Roche Product), and a 100 ⁇ g / ml solution of three antibiotics (penicillin, streptomycin, neomycin; PSN, Life Technologies).
  • Medium B consists of medium A supplemented with 20 IU / ml of recombinant human IL-2 (Roche Product). Isolation and activation of PBMCs
  • the PBMCs are separated from the other figured elements of the blood by centrifugation in a ficoll gradient (MSL 2000, Eurobio): 30 ml of blood, from a healthy donor, diluted by a third are placed on a cushion of 20 ml of ficoll. After 20 min of centrifugation at 850 g, the ring of. CMSP is removed and then washed twice using RPMI 1640, after 10 min of centrifugation at 750 g and 5 min at 400 g. The PBMCs are then activated for 48 h with 1 ⁇ g / ml of phytohemagglutinin-P (PHA-P; Difco Laboratories).
  • PHA-P phytohemagglutinin-P
  • the CMSP are cultivated at + 37 ° C., in an atmosphere saturated with humidity, under 5% of CO 2. At the end of the 48 hours of mitogenic activation, they are cultured in medium B. Throughout the culture, the culture supernatants are removed, and the culture media are renewed all three. or four days. At each renewal of the culture media, the cell viability is evaluated by microscopic observation.
  • the compounds of the present invention CD4M30, CD4M33 and CD4M35 were solubilized in sterile ppi water (Aguettant), aliquoted then stored at -20 ° C.
  • the compound SAH-CD4 soluble CD4 coupled to human albumin serum supplied by Aventis (Vitry-sur-Seine) was stored at -80 ° C. until its use. The solutions and dilutions were then carried out extemporaneously in medium A.
  • the PBMCs were pretreated with the compounds for 1 hour and then infected with the reference isol t with lymphocytic tropism HIV-I LM or with the clinical isolate HIV-1 LEN -
  • the biological characteristics of this isolate are: rapid / high, scyncitia inducing (SI), X4: it is therefore preferably capable of infecting lymphocytes.
  • the viral stock was constituted by amplifying this strain in vitro using mononuclear cord blood cells (CMSO) activated beforehand by 1 ⁇ g / ml PHA-P and cultured in medium B.
  • CMSO mononuclear cord blood cells
  • TCID 50 50% Tissue Culture Infectious Dose was calculated using Kârber's formula.
  • Viral replication was measured, on day 7 of the culture, by assaying the reverse transcriptase activity in the culture supernatants using the RetroSys assay kit (registered trademark) according to the recommendations of the company Innovagen. Analysis of results and determination "of 50% effective doses
  • the 50% effective doses (ED 50 ) are calculated using the "Dose-effects analysis ith microcomputers" software developed by J. Chou & TC Chou.
  • the fragment encoding the viral protein gpl20 (amino acid V12 to R481) was amplified by PCR in the plasmid HIVIIIB / HXB2R, using two primers making it possible to generate a fragment containing the BamHI sites (upstream of the Kpnl site of the gpl20 viral protein) and PstI (downstream of the stop codon added to the end of the gpl20 viral protein sequence).
  • the BamHI / PstI fragment thus obtained was cloned into the Bluescript vector (pBS, Stratagene), leading to the plasmid pBSml.
  • the BamHI-PstI fragment from pBSm2 was then inserted between the BglII-PstI sites of the baculovirus P10 transfer vector pl19P.
  • Sf9 insect cells were cotransfected with the purified viral DNA of the modified baculovirus AcSLP10 and the DNA of the recombinant vector pl19P gpl20. Recombinant viruses are purified by a standard method.
  • the Sf9 scia cells (line adapted to growth without serum, deposited in the collection of the Institut Pasteur) are maintained in a spinner in a serum-free medium.
  • These cells (5.10 5 cells / ml) are then infected with the recombinant viruses at a multiplicity of infection of 1 PFU (Beach-forming Unit) per cell and incubated at 28 ° C. After six days of infection, the cells are centrifuged (500 g), and the wild-type gpl20 viral protein is concentrated and directly purified from the culture supernatant by affinity chromatography on a column of Sepharose-bromacetyle coupled to the antibody anti-gpl20 D7324.
  • PFU Beach-forming Unit
  • sequence ID No. 13 was labeled with biotin and with the fluorescein fluorescent probe as described in example 1, at the level of Lys-11 positioned on the opposite surface of the active surface of the peptide of the present invention CD4M33. Its activity remains unchanged in ELISA tests ( Figure 2).
  • Figure 2 combines the results obtained in this example. These are curves showing the evolution of the percentage of attachment (% F) of peptides of the present invention to the viral protein gpl20 ⁇ B2 as a function of the molar concentration of these peptides
  • CD4M33 for the viral protein gpl20
  • an analysis of biospecific interactions (described in example 3), based on detection by surface plasmon resonance, has been used.
  • the CD4M33 peptide of the present biotinylated invention (prepared as in Example 1) was specifically fixed on the carboxylated dextran matrix of a chip which has been pre-grafted with streptavidin. Solutions of different gpl20 recombinant proteins
  • FIG. 3 shows the evolution of the plasmon resonance signal as a function of time, after interaction of the gpl 0 ⁇ B2 protein (at different concentrations) with the CD4M33 peptide of the present invention.
  • FIG. 4 shows that the presence of the CD4M33 peptide is essential for the interaction of the viral envelope with the 48d and CG10 antibodies, specific for the viral envelope, and that HIV-1 does not bind to the antibodies in its absence. : this is an indirect demonstration of the binding of the CD4M33 peptide to the HIV-1 viral envelope.
  • the inventors carried out infection experiments, with the HIV-I LAI virus and with the chemical isolate HIV-1 LEK / of primary cultures of blood mononucleosis cells peripheral (CMSP) human. In all experiments, the effects of the new molecules were compared to those of AZT.
  • the HIV-I LAI virus was added at different viral doses (10-100 TCID 50 , Table 2) in the presence of varying concentrations of CD4M30, CD4M33, CD4M35 and SAH-CD4.
  • the HIV-1 LEN virus was added to TCID 50 (Table 4) in the presence of CD4M33.
  • CD4 mimetic toxicity tests were also carried out on the same cells.
  • the HIV-I A strain replicates at high level in PHA-P activated PBMCs. The peak of viral replication is on day 7 of the culture, and the effects of the peptides CD4M30, CD4M33 and CD4M35 were quantified at this post-infection time.
  • C. ANTIRETROVIRAL ACTIVITY OF THE CD4M33 COMPOUND TOWARDS HIV-1 LEN CLINICAL ISOLATE cl. Effects of AZT on the replication of the HIV-ILEN isolate in PBMCs.
  • AZT strongly inhibits the replication of the HIV-1 LEN strain in the PBPAs activated by PHA-P and infected with the HIV-1 LEN / isolate with an ED 50 equal to 2.2 nM (Table 4). The degree of inhibition is identical to that observed with respect to the reference strain with lymphocytic tropism HIV-ILAI-c2. Effects of the CD4M33 mimetic on the replication of the HIV-1 LEN clinical isolate in PBMCs. The retroviral activity of the mimetic CD4M33 vis-à-vis the PBMCs activated by PHA-P and infected with the isolate HIV-1 LEN results in a dose-dependent decrease in viral replication and an ED 50 equal to 367 nM ( table 4). The mimetic CD4M33 therefore retains a significant anti-HIV-1 activity, even if it turns out to be slightly weaker compared to that observed with the HIV-I LAI strain.
  • CD4M33 peptide has an antiretroviral activity greater than 1 base 10 logarithm than that observed with another derivative of CD4 receptor, SAH-CD4, and above all showed significant anti-HIV activity vis-à-vis a clinical isolate (Table 4).
  • the peptide of the present invention CD4M33 which is capable of binding to the recombinant viral protein gpl20 with a Kd of 2.4-8.0 nM (surface plasmon resonance experiments) and of inhibiting the interaction between the recombinant proteins CD4-gpl20 in ELISA, with an IC 50 of 120-250 pM, also has the capacity to inhibit this interaction in primary cultures of human cells, to inhibit the initial step of entry and therefore to block the even an HIV-1 clinical isolate infection.
  • CMSP phytohemoagglutinin-P
  • PHA-P The cells were infected with 50 TCID50 viruses:
  • EXAMPLE 8 EXPOSURE OF ANTIGENIC SITES OF THE ENVELOPE.
  • CD4M33 When CD4M33 is added to the viral protein gpl20 ⁇ B2 / with a molar excess of 1.5 and 20 times, the viral protein shows a strong interaction with the antibodies ( Figures 6a-b); on the other hand, in its absence (and in the absence of soluble CD4) the envelope protein interacts with the antibodies very weakly (Fig. 6a-b).
  • the effect of adding CD4M33 on the increase in the interaction affinity of the viral protein gpl20 for antibodies is comparable to that obtained by adding equivalent amounts of soluble CD4.
  • FIG. 4 shows the results obtained in these experiments and demonstrates the evolution of the plasmon resonance signal as a function of time after interaction of a suspension of HIV-1 HXB2 viral particles with a chip presenting the immobilized 48d and CG10 antibodies: HIV-1 interacts with the antibodies only after incubation with the CD4M33 peptide of the present invention and, on the other hand, in its absence or in the presence of the peptide [ Ala23] CD4M9 inactive, the interaction is practically zero.
  • the surface plasmon resonance technique has therefore made it possible to demonstrate that the binding of CD4M33 to the envelope protein gpl20 is capable of inducing a modification of the viral protein, which, consequently, preferentially exposes certain molecular surfaces to neutralizing antibodies (17b, CG10), isolated from people affected by HIV-1 [11], [12], [13].
  • CD4M33 has the property of unmasking epitopes of the viral protein gpl20, as does soluble CD4, with the advantage that it will not be able to induce an immune response against CD4 and that, from more, because of its small size, it will allow an even more favorable access to the epitopes exposed of the viral protein gpl20.
  • Peptides of the present invention labeled or unlabeled, in the form of 50 ⁇ g lyophilized (powder) were solubilized by adding in an Eppendorf (trademark) containing the powder, 50 ⁇ l of a potassium phosphate buffer, 10 mM , 100 mM KC1, pH 7.0 in order to obtain a concentrated solution at between 300 and 750 ⁇ M.
  • the labeling is carried out with fluorescein (F) or with rhodamine green (R).
  • the gpl20 viral proteins were prepared in the form of solutions at a concentration of -1 mg / ml.
  • the titrations were carried out in the "reverse" direction.
  • 4 ml of a peptide solution of the present invention, labeled and at a concentration of 6 nM in the phosphate buffer cited above was prepared.
  • 200 ⁇ m of a solution containing 10 ⁇ l of gpl20 at a concentration of 0.421 ⁇ M, 4 ⁇ l of peptide of the present invention labeled with fluorescein and at a concentration of 6 nM, and 186 ⁇ l of buffer was prepared.
  • the anisotropy of 200 ⁇ l of the labeled peptide solution alone was first tested. Depending on the probe used on the peptide and the settings of the apparatus, in particular the gain, the anisotropy of the peptide of the present invention labeled alone varies between 80 and 110 units of millianisotropy. Then, the anisotropy of the tube containing the labeled peptide and the gp120 at 410 nM was measured.
  • the value of the labeled peptide in the presence of this high concentration of gpl20 was of the order of 200 millianisotropy.
  • the titration was carried out by taking 40 ⁇ l of the solution and then adding 40 ⁇ l of the labeled peptide solution alone at 6 nM. In this way, gpl20 was diluted, by a value of 0.1 log unit per dilution, while keeping the concentration of labeled peptide constant.
  • This reverse titration protocol uses as little gpl20 as possible.
  • the labeled peptides have shown a tendency to stick to the walls of the containers.
  • Several dilution solutions have therefore been made in order to avoid a gradual decrease in the concentration of labeled peptide.
  • the competition was then carried out between 10 and 100 nM of unlabeled CD4M33 peptide.
  • the competitions were carried out experimentally by adding to 200 ⁇ l of a 6 nM solution of CD4M33-F peptide and 20 nM gpl20 aliquots of 1 ⁇ l of unlabeled competitor CD4M33 peptide in the above phosphate buffer in order to cover concentrations between 10 and 100 nM. The anisotropy values were then measured after each addition.
  • a third preparation was therefore carried out (III K16 / GP120).
  • the measurements carried out on this preparation are shown in Figure 8c).
  • the affinity (Kd) measured is 97nM.
  • Their affinity for the viral protein gpl20 was 14 nM, 195 nM, and 323 nM, respectively. 2) AFFINITY MEASUREMENTS TAKEN WITH A PEPTIDE OF THE PRESENT INVENTION FOR DIFFERENT GP120 VIRAL PROTEINS
  • the 8nM affinity for gpl20 HXB2 is very close to the value determined from the results shown in FIG. 9, ie 14 nM.
  • a displacement of a labeled peptide having a determined affinity, represented by the CD4M33 peptide, by an unlabeled CD4M33 peptide was carried out to simulate screening according to the method of the present invention.
  • the results of this example are represented in FIG. 13. These results show that a concentration of 20 nM of gpl20 allows a fixation approaching 50%, and therefore a relatively high starting anisotropy of approximately 180 millianisotropy.
  • the affinity of the labeled CD4M33 for gpl20 HXB2 was 11 + 3 nM.
  • this screening test can demonstrate any molecule, whatever its chemical structure, which would bind to gpl20 competitively with this peptide.
  • the peptides of the present invention therefore represent in vitro inhibitors of infection by the AIDS virus, in particular HIV-I.
  • the screening method of the present invention which uses fluorescence anisotropy of a peptide
  • the present invention therefore, constitutes a new tool for screening candidate molecules for the manufacture of drugs for treating AIDS.
  • Retroviruses. 11, 533-539 [18] Ono, M., Wada, Y., Wu, Y., Nemori, R., Jinbo, Y.,

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de criblage de molécules aptes à se lier à la protéine gp120 du virus de l'immunodéficience.Le procédé de la présente invention utilise la technique d'anisotropie de fluorescence et le peptide de formule (I) suivante : TPA- Xaaa- Xaab- Ala ou Gln ou His - Arg ou Phe - Cys - Xaac- Xaad- Arg - Cys - Lys - Xaae- Xaaf- Xaag- Xaah- Leu ou Lys - Xaai - Lys - Cys - Ala ou Gln - Gly ou (D)Asp ou Ser - Ser ou His ou Asn - Xaaj- Cys - Thr ou Ala - Cys - Xaak-NH2, (I) dans laquelle TPA représente l'acide thiopropionique, Xaaa, Xaab, Xaac, Xaad, Xaae, Xaaf, Xaag, Xaah, et Xaai, sont des acides aminés, naturels ou non naturels, identiques ou différents, Xaaj représente la b-naphtylalanine ou la phénylalanine ou la bi-phénylalanine, et Xaak représente Gly ou Val ou Ile.

Description

PROCEDE DE CRIBLAGE DE MOLECULES APTES A SE LIER A LA PROTEINE GP120 DU VIRUS DE L' IMMUNODEFICIENCE
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de criblage de molécules aptes à se lier à la protéine gpl20 du virus de l' immunodéficience ou à ses analogues. Elle utilise une technique d'anisotropie de fluorescence et une famille particulière de peptides présentant une affinité et une spécificité élevées pour la protéine virale gpl20.
Il existe de nombreux virus de l' immunodéficience comportant une protéine d'enveloppe virale gpl20 ou une protéine analogue à celle-ci. Parmi ceux-ci on peut citer le virus de l' immunodéficience humaine (VIH) , le virus de l' immunodéficience simienne (VIS), le virus de 1' immunodéficience des ovidés (VISNA) , le virus de 1' immunodéficience bovine (VIB) , et le virus de 1' immunodéficience des félins (VIF).
Certains des peptides de la présente invention sont capables de se fixer à la protéine virale gpl20 ou à ses analogues, d'inhiber la fixation de la protéine virale gpl20 au récepteur CD4, avec des valeurs de CI50 entre 0,1 et 400 nM en fonction de leur séquence. Certaines de ces molécules sont capables d'inhiber l'infection de lymphocytes T par le virus du sida avec par exemple une DE50 (Dose Effective 50%) de 100 à 900 nM. En outre, la fixation de ces molécules à la protéine virale gpl20 recombinante induit une variation conformâtionnelie dans celle-ci qui démasque de nouveaux épitopes, avec la même efficacité que la molécule CD4 soluble.
Le procédé de criblage de la présente invention est un outil puissant de recherche permettant de sélectionner de nouvelles molécules utiles pour la fabrication de nouveaux médicaments anti-SIDA.
Il trouve donc une application évidente dans le développement de nouvelles thérapies et de nouveaux moyens de diagnostic permettant de luter contre le SIDA.
Art antérieur
De nombreuses recherches sont menées pour trouver des traitements et des moyens de prévention efficaces de l'infection par le virus de l' immunodéficience et notamment de l' immunodéficience humaine (VIH) . Ceci est dû en particulier à la variabilité du virus, à la difficulté de compréhension du mécanisme de son entrée dans les cellules cibles et de la réponse immunitaire nécessaire pour la protection de l'infection par le virus .
Comme le démontre l'analyse de la structure tridimensionnelle du complexe CD4-gpl20 [1] (voir références annexées) , les éléments structuraux du CD4 critiques pour sa liaison à la glycoprotéine virale gpl20 incluent les acides aminés Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43, Thr45, qui sont compris dans la région 36-47, et l'arginine-59 du CD4. La région 36-47 du CD4 a été assimilée à la région CDR2 des immunoglobulines et présente une structure ordonnée en épingle à cheveux. Cette structure est formée d'un brin β (C ) , correspondant à la séquence 36-40, suivie d'un coude correspondant à la séquence 40-43 qui permet à un deuxième brin β (C") , correspondant à la séquence 43-47, de former avec le premier une structure β antiparallèle. Cette structure est stabilisée par des liaisons hydrogêne entre l'azote amidique des résidus
Gly38, Gln40, Phe43, Thr45, Gly47 du premier brin β et l'oxygène carbonylique des résidus, respectivement, Thr45, Phe43, Gln40, Gly38, Ile36 du deuxième brin β. Cette structure en épingle à cheveux a un rôle central dans l'interaction du CD4 avec la protéine virale gpl20 et accomplit une double fonction: premièrement, elle permet aux acides aminés Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43 et Thr45 de former une surface moléculaire complémentaire à la surface d' interaction de la protéine virale gpl20 et, en particulier, permet à la chaîne latérale de la Phe43 de s'insérer à l'entrée d'une cavité hydrophobe dans la surface moléculaire de la protéine virale gpl20 ; deuxièmement, elle permet une interaction de type feuillet β entre les squelettes polypeptidiques du brin β C" du CD4 et le brin βl5
(résidus 365-368) de la protéine virale gpl20.
L'arginine 59 (Arg59) a aussi un rôle critique dans l'interaction CD4-gpl20, puisque le groupement guanidinium de sa chaîne latérale forme un double pont hydrogène avec la chaîne latérale du résidu Asp368 de la protéine virale gpl20, permettant la stabilisation de l'interaction de type structure β entre les brins C" du CD4 et βl5 de la protéine virale gpl20. Des expériences de mutagenèse dirigée ont démontré que tous ces résidus du CD4 jouent un rôle critique dans l'interaction avec la protéine virale gpl20 [2], [3].
La reproduction de cette structure ordonnée en épingle à cheveux et de la conformation des chaînes latérales de ses résidus est critique dans une molécule qui doit se fixer sur la protéine virale gpl20 au site d'interaction du CD4. Le fait que des constructions peptidiques simples, comme un peptide linéaire correspondant à la séquence 37-53 et un peptide cyclique correspondant à la séquence 37-46 du CD4 , ne possèdent pas une affinité mesurable pour la protéine virale gpl20, en est une démonstration [4].
L'infection des cellules CD4 par le virus du sida est médiée par une interaction de haute affinité entre 1 ' enveloppe virale et le CD4. Des expériences de mutagenèses et de compétition avec des anticorps ont permis de localiser dans le domaine Dl du CD4, la surface de contact avec la protéine gpl20 de l'enveloppe virale. La structure tridimensionnelle d'une forme recombinante fonctionnelle de la glycoprotéine gpl20, mais délétée des boucles V1-V2-V3 et des régions N- et C-terminales, en complexe avec les domaines D1D2 du CD4 et avec le fragment Fab d'un anticorps monoclonal, a été résolue récemment par cristallographie [1]. Dans cette structure, le CD4 interagit avec une large dépression de la surface o moléculaire (800 A2) de la protéine virale gpl20, en o utilisant une large surface moléculaire (742 A2 ) , qui est centrée autour de la région qui a été assimilée à la région CDR2 des immunoglobulines . Au cœur de la dépression moléculaire de la protéine virale gpl20 s'ouvre une cavité étroite et profonde, la "cavité Phe43", dans laquelle la chaîne latérale de la Phe43, au sommet de la région CDR2 du CD4 , occupe l'entrée. La résolution de cette structure confirme les données précédentes de mutagenèses, qui indiquent le résidu Phe43 et toute la boucle CDR2 comme fonctionnellement très importants, et propose cette dernière comme cible possible pour l'inhibition de l'attachement des virions VIH-1 aux cellules. L'interaction gpl20-CD4 permet la fixation du virus à la membrane des cellules cibles et représente la première interaction protéine-protéine dans le mécanisme de l'infection. Néanmoins, d'autres co-récepteurs sont nécessaires pour une entrée efficace du virus du sida dans les cellules. Il s'agit du CXCR-4 [5], [6], qui est impliqué dans l'entrée des souches virales lymphotropiques (X4) et du CCR-5 [7], [8], qui est impliqué dans l'entrée des souches M-tropiques (R5) et de la plupart des isolats primaires. Plusieurs preuves indiquent que la fixation de la protéine virale gpl20 sur le CD4 produirait des variations conformationnelles dans la glycoprotéine de l'enveloppe, qui exposeraient de nouveaux sites, détectables par des anticorps spécifiques, dénommés CD4i, et augmenteraient l'affinité de l'enveloppe pour les récepteurs des chemokines [9], [10], les co- récepteurs de l'entrée. Après fixation du CD4 et du co-rêcepteur par la protéine virale gpl20, d'autres variations conformationnelles conduiraient à une réorganisation structurale de la gp41, qui aboutirait à l'exposition de son peptide fusogène, puis à la fusion des membranes virales et cellulaires et enfin à l'entrée de la charge virale dans la cellule.
La structure cristallographique de la protéine virale gpl20 complexée au CD4 a permis d'élucider un des mécanismes qu'utilise le virus du sida pour échapper à la réponse immune. On savait déjà que la protéine de l'enveloppe gpl20 possédait des régions hypervariables et fortement glycosylêes. La structure cristallographique a démontré en fait que les régions hypervariables et les régions hautement glycosylêes forment la surface moléculaire exposée de la protéine virale gpl20, qui correspond aussi à la surface accessible des virions. Seules quelques régions de la surface moléculaire de la protéine virale gpl20 sont conservées et peuvent être la cible des anticorps. Ces régions ne sont pas normalement accessibles et sont probablement protégées par les boucles hypervariables
(V1-V2-V3) qui dans la protéine cristallisée ont été délétées, et sont donc invisibles. Une de ces régions est une surface proche du site d'interaction pour les récepteurs des chemokines, et accessibles aux anticorps CD4i, après fixation de l'enveloppe au CD4. Le site de liaison au CD4 est une autre surface exposée et conservée : cependant, cette surface est présente dans une cavité de la protéine virale gpl20 et n'est donc pas accessible aux anticorps, mais peut accommoder le CD4 qui présente un seul domaine- d' immunoglobuline à la différence des anticorps qui utilisent deux domaines pour la reconnaissance moléculaire. L'inhibition de l'interaction de la protéine virale gpl20 avec le récepteur principal de l'entrée, le CD4, par un CD4 recombinant soluble et/ou par des chimères d' immunoglobulines contenant des domaines du CD4, a été l'une des premières approches thérapeutiques suggérées et expérimentées pour 1 ' inhibition de l'infection par VTH-1. Ces molécules sont efficaces in vitro dans l'inhibition de l'infection virale seulement dans le cas de souches adaptées au laboratoire, mais sont inefficaces dans le cas de nombreux isolats primaires . La dégradation rapide in vivo de ces constructions dérivées du CD4 et leur affinité plus faible pour l'enveloppe virale des isolats primaires ont été proposées comme causes principales de leur inefficacité. Cependant, des études ont démontré que l'affinité, pour le CD4, des gpl20 recombinantes monomériques de certains isolats primaires n'est pas significativement différente de celle de gpl20 issues de souches de laboratoire. La nature oligomérique de la protéine virale gpl20 à la surface du virus, la densité et la structure du CD4 à la surface des cellules permissives et peut être la présente d'autres interactions moléculaires non encore clairement élucidées ou d'autres molécules accessoires d'entrée pourraient jouer un rôle important dans le mécanisme de l'entrée et représenter d'autres causes de 1 ' inefficacité des protéines CD4 solubles comme antagonistes de l'entrée. Le développement d'agents antiviraux qui ciblent la protéine virale gpl20 présente un challenge majeur, à cause de la grande variabilité génétique de la protéine de l'enveloppe, facteur qui peut expliquer l'inefficacité de beaucoup d'inhibiteurs de la protéine virale gpl20. Néanmoins, le fait que les résidus qui contribuent à former le coeur du site de liaison de la protéine virale gpl20 pour le CD4 sont formés par des résidus très conservés suggère que des inhibiteurs de la protéine virale gpl20 peuvent être efficaces contre un large spectre d' isolats VIH-1.
Des constructions peptidiques dérivées du CD4 ont été proposées comme inhibiteurs de l'infection virale : il s'agit d'un peptide mimétique structural de la boucle CDR2 du CD4 qui incorpore un groupement phényl mimant la Phe43 [14] et un peptide cyclique correspondant à la boucle CDR3 du CD4 et incorporant des résidus aromatiques additionnels [15]. Cependant, ces constructions présentent une activité antivirale faible limitée à un isolât de laboratoire et, même si elles ont été conçues au départ comme mimétiques structuraux du CD4, elles ne sont pas actives dans l'étape d'entrée [16].
Actuellement, un certain nombre d'inhibiteurs de l'interaction gpl20-CD4 ont été proposés et présentent une application clinique. Il s'agit par exemple d'une protéine recombinante de grosse taille, formée par la fusion génétique des domaines DID2 du CD4 avec les domaines constants d'une immunoglobuline IgG2 [17]. Cette construction PR0542 est en phase clinique I/II. Cette large protéine recombinante semble être bien tolérée par l'organisme humain, mais son efficacité dépend d'une dose circulante élevée difficile à atteindre. Des molécules de plus petites tailles ont été proposées comme inhibiteurs de 1 ' interaction CD4-gpl20 et sont en phase de test clinique. Il s'agit : d'un colorant bis-azo FP21399 [18], identifié par une approche combinatoire, du phosphorothioate oligonucléotide zintevir (AR177) [19], d'un polymère à base de naphtalène sulfonate, PRO2000 [20] et d'un dérivé d'amidon, le dextrin 2-sulfate (D2S) [21], qui inhibent des isolats chimiques VIH-1 dans des cultures cellulaires, mais exigent des concentrations élevées. Parmi les inhibiteurs de l'entrée, il y a aussi le SPC3 [22], une construction peptidique synthétique multibranchée, qui, proposée à l'origine comme un inhibiteur de l'interaction CD4-gpl20, est ensuite révélée active dans une étape suivant l'attachement des virions aux cellules. D'autres molécules de petite taille ont été proposées comme inhibiteurs de l'entrée : le bicycla AMD3100 [23], le NSC651016 [24],
• le peptide T22 [25] et sa version plus récente T134 ou
T140 [26] et le TAK779 [27]. Ces molécules sont des inhibiteurs de l'entrée virale, actifs sur les co- récepteurs de l'entrée CXCR4 et CCR5 , mais n'ont aucune activité dans l'interaction CD4-gpl20. Des peptides dérivés de la séquence de la région C-terminale de la glycoprotéine gp41, le peptide T20 (ou DP178) [28] et sa plus récente version améliorée DT1249 [29], sont d'autres inhibiteurs de l'infection qui ciblent une phase transitoire de l'entrée, postérieure à l'attachement de l'enveloppe virale au CD4 et précédant la fusion des membranes virus cellule : ces peptides sont inactifs dans l'interaction gpl20-CD4. La plupart de ces produits sont actuellement en test clinique de phase I/II, mais leur efficacité thérapeutique • reste encore à vérifier.
Le régime thérapeutique anti-SIDA actuellement utilisé en clinique, la tritherapie, comporte une combinaison de trois inhibiteurs qui ciblent deux enzymes virales, la transcriptase inverse et la protease. Même si la tritherapie est arrivée à réduire significativement la charge virale de beaucoup de malades, elle n'est pas capable même dans les cas les plus favorables d'éradiquer la maladie, car des réservoirs dormants d'infection persistent toujours [30]. Le succès partiel de la tritherapie d'une part et l'impossibilité de stopper l'infection SIDA avec les protocoles thérapeutiques actuels d'autre part, ont augmenté la demande de nouveaux médicaments pouvant être actifs au niveau d'autres cibles virales et augmenter le répertoire et l'efficacité des médicaments cliniques actuels. Les banques de molécules disponibles actuellement et potentiellement actives dans l'inhibition de l'entrée et de l'infection par le virus du sida sont énormes. Cependant, un outil de recherche rapide et efficace de molécules effectivement actives pour inhiber l'interaction gpl20-CD4 nécessaire pour une infection efficace par le virus du sida fait défaut. Les procédés actuels de criblage sont lents, peu précis et nécessitent des quantités de réactifs souvent importantes. En outre, les coûts engendrés par ces recherches sont élevés. Expose de l'invention
La présente invention a précisément pour but de fournir un procédé de criblage de molécules capables de se lier avec une affinité déterminée à la protéine gpl20 du virus du sida, notamment de 1 ' immunodéficience humaine (VIH) .
Le procédé de criblage de la présente invention inclut au moins un cycle de criblage comprenant les étapes suivantes : a) marquage covalent avec une sonde fluorescente d'un peptide ayant ladite affinité déterminée pour la protéine gpl20, ledit peptide comprenant la séquence (A) définie ci-dessous, b) mise en présence du peptide marqué avec la protéine gpl20, à une concentration de gpl20 qui permet entre 20 et 50% de fixation du peptide marqué, de manière à former un complexe réversible [peptide marqué-gpl20] , c) mesure étalon de la polarisation de fluorescence du complexe [peptide marqué-gpl20] , d) essai de criblage par mise en compétition du complexe [peptide marqué-gpl20] formé avec au moins une molécule candidate susceptible de se lier à la protéine gpl20 à une concentration déterminée de ladite ou desdites molécule (s) et dans des conditions physicochimiques rendant possible la compétition entre ladite molécule et le peptide marqué pour former éventuellement un complexe avec la protéine gpl20, e) mesure de la polarisation de fluorescence émise par l'essai de criblage, et f) comparaison de la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) avec la mesure étalon de l'étape c) la ou une des molécule (s) candidate (s) étant considérée comme une molécule capable de se lier à la protéine Gpl20 lorsque la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) est inférieure à la mesure étalon de 1' étape c) .
Les molécules recherchées au moyen du procédé de criblage de la présente invention sont donc celles qui entrent en compétition avec le peptide de la présente invention.
En effet, le procédé de la présente invention se caractérise notamment en ce qu'il utilise une famille de peptides particuliers qui miment le CD4 et pallient les inconvénients précités de l'art antérieur. En effet, il utilise un peptide stable, présentant une très forte affinité pour l'enveloppe du virus du SIDA, en particulier pour la protéine gpl20. Le peptide de la présente invention se caractérise en ce qu'il comprend la séquence (A) suivante :
TPA - P1- Cys - P2 - Cys - P3 - Cys - Ala ou Gin - Gly ou (D)Asp ou Ser - Ser ou His ou Asn - XaaJ - Cys - Thr ou Ala - Cys- Xaak - NH2 dans laquelle TPA représente l'acide thiopropionique, XaaJ représente la β-napthylalanine, la phenylalanine ou la bi-phenylalanine, Xaa représente Gly, Val ou lieu, P1 représente 3 à 6 acides aminés, P2 représente 2 à 4 acides aminés et P3 représente 6 à 10 acides aminés, les acides aminés dans P1, P2 et P3 étant naturels ou non naturels, identiques ou différents et P1, P2 et P3 ayant ou non une séquence commune, ledit peptide présentant une conformation en épingle à cheveux β dont le coude β est formé par les résidus acides aminés Ala ou Gin - Gly ou DAsp ou Ser-Ser ou His ou Asn- Xaaj de sa séquence (A) .
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide de la présente, invention est caractérisé en ce qu'il comprend la' séquence (I) suivante :
TPA- Xaaa- Xaa - Ala ou Gin ou His - Arg ou Phe
1 5
Cys - Xaac- Xaad- Arg - Cys - Lys - Xaae- Xaaf-
10 Xaa9- Xaah- Leu ou Lys - Xaa1 - Lys - Cys - Ala
15 ou Gin -Gly ou (D)Asp ou Ser - Ser ou His ou Asn - 20
Xaaj- Cys - Thr ou Ala -Cys - Xaak^-NH2, 25 dans laquelle TPA représente l'acide thiopropionique , Xaaa, Xaab, Xaac, Xaa , Xaae, Xaaf, Xaa9, Xaah, et Xaa1, sont des acides aminés, naturels ou non naturels, identiques ou différents, Xaa? représente Nal, Phe ou Bip, et Xaak représente Gly, Val ou Ile.
Le résidu (D)Asp représente l'isomère optique D de l'acide aspartique, Nal représente la β-naphtylalanine, et Bip représente la bi-phenylalanine.
Les inventeurs ont mis en évidence que ce peptide définit par la séquence (A) , en particulier la séquence
(I) , comportant un acide thiopropionique à la position 1 de la séquence, un résidu Phe, Nal, ou Bip en position 23 de la séquence (Xaaj) , et un résidu Gly, Val ou Ile en position 27 de la séquence (Xaa) présente une forte affinité et une grande spécificité de liaison pour la protéine gpl20 de l'enveloppe virale du virus de l' immunodéficience.
Ce peptide comporte 27 ou 28 résidus seulement, et présente une structure en épingle à cheveux constituée de deux brins β antiparallèles reliés par un coude β de quatre résidus. Les deux brins antiparallèles, étant à une distance pouvant donner des interactions à ponts hydrogène intramoléculaires, stabilisent la structure. Notamment, la distance entre les atomes azote amidique et oxygène carbonylique de la liaison peptidique est de o 2,5 à 3,6 A. Cette structure bien définie et stable reproduit des éléments structuraux du CD4 critiques pour sa liaison à la glycoprotéine gpl20.
La structure tridimensionnelle de ce peptide a été résolue expérimentalement par résonance magnétique nucléaire (RMN) . Cette analyse démontre que son organisation tridimensionnelle reproduit le squelette peptidique de la structure en épingle à cheveux du CD4, et la région 37-46 de ce peptide peut être superposée à la région 36-37 du CD4 avec une déviation rms de seulement 1,05 Â. En outre, les chaînes latérales des résidus Ala ou Gin 20, Ser 22, XaaJ 23 (Nal, Phe ou Bip) , et Thr ou Ala 25 ont une orientation comparable à celle des résidus correspondants du CD4 , à savoir Gin 40, Ser 42, Phe 43, et Thr 45. En particulier, la chaîne latérale de XaaJ 23 pointe du motif en épingle à cheveux dans une conformation semblable à celle de la Phe 43 du CD4 pour s'insérer à l'entrée d'une cavité hydrophobe de la protéine virale gpl20, renforçant ainsi le lien avec gpl20. Arg et Lys aux positions 9 et 18 sont topologiquement équivalents aux résidus Arg59 et Lys35 de la protéine CD4.
TPA et les 5 cys du peptide forment des ponts disulfures qui présentent un appariement de type 1-3, 2-4 et 3-6 et stabilisent la structure en épingle à cheveux. Le motif structural en épingle à cheveux a une surface accessible au solvant et/ ou à une molécule de plus grosse taille telle qu'une protéine, ce qui peut favoriser son interaction avec la protéine de l'enveloppe virale. Les chaînes latérales des acides aminés de la surface accessible au solvant de ce motif sont proches dans l'espace et forment une surface moléculaire continue qui reproduit la structure de plusieurs résidus importants pour la liaison CD4-gpl20. La plate-forme structurale qui contient le motif structural en épingle à cheveux contient aussi d'autres régions structurales capables d'accueillir des fonctionnalités chimiques additionnelles dans une position spatiale bien définie par rapport au motif structural en épingle à cheveux pouvant ainsi renforcer sa fonction biologique de liaison et/ou présenter des groupement de marquage. Par exemple, un groupement de biotine ou un groupement de fluorescéine a été incorporé au niveau de la chaîne latérale de la lysine 11, sans provoquer de perte de l'activité biologique du dérivé. L'incorporation de ces groupements a permis l'utilisation de ces dérivés dans des tests d'interaction avec la protéine de l'enveloppe, comme décrit ci-dessous.
Selon l'invention, la séquence (A), par exemple la séquence, (I) peut comprendre en outre un résidu proline lié au résidu Xaak. Un résidu proline ajouté en position 28 stabilise l'extrémité C-terminale et rend moins flexible le brin β C-terminal du motif structural en épingle à cheveux. Selon l'invention, dans la séquence (I), Xaa1 peut être Gly.
Par exemple, le peptide de la présente invention peut comprendre une séquence choisie parmi les séquences ID n°4, ID n°5, ID n°6, ID n°7, ID n°8, ID n°9, ID n° 10, ID n°ll, ID n°12, ID n°13, ID n°14, ID n°15, ID n°16, ID n°17, ID n°18, ID n°19 et ID n°20 de la liste de séquences annexée.
Le peptide de la présente invention peut être obtenu par synthèse chimique en phase solide ou par recombinaison génétique. La synthèse chimique peut être réalisée par exemple avec un synthétiseur automatique de peptide du type Applied Biosystems, mod.433A (marque de commerce) . Elle peut être réalisée par exemple en chimie Fmoc qui utilise le groupement fluorométhyloxycarbonyle pour la protection temporaire de la fonction α-aminique des acides aminés.
Le peptide de l'invention peut aussi être fabriqué au moyen d'un procédé comprenant les étapes suivantes : a) intégration d'une séquence d'acide nucléique dans un vecteur d'expression, ladite séquence d'acide nucléique codant pour le peptide de la présente invention, b) introduction du vecteur d'expression comprenant ladite séquence d'acide nucléique dans une cellule hôte, c) culture de la cellule hôte comprenant ledit acide nucléique dans des conditions de culture permettant la synthèse dudit peptide, d) récupération du peptide synthétisé, et e) greffage du TPA en position N-terminale.
Les éléments techniques pour la réalisation de ce procédé de synthèse peptidique sont connus de l'homme du métier. Ils sont décrits par exemple dans l'ouvrage de Sombrook, Fritsch et Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2n édition.
Le greffage d'un TPA en position C-terminale du peptide peut être réalisé au moyen d'un procédé classique de chimie organique applicable à un peptide.
Les inventeurs ont synthétisé une famille de peptides reproduisant une partie de la structure de la région du CD4 ressemblant à la région CDR2 des immunoglobulines, qui, comme l'ont démontré des résultats mutagenèse et d'analyse cristallographique, sont parmi les régions critiques de la liaison CD4 à la protéine virale gpl20. Les peptides de la présente invention sont capables de se fixer sur la région de la glycoprotéine gpl20 qui interagit avec le CD4, le récepteur principal de l'entrée du virus du sida, notamment du VIH-1, dans les cellules cibles CD4. Ces peptides constituent une famille d'inhibiteurs dont l'affinité pour la glycoprotéine virale gpl20 recombinante monomérique, varie entre des valeurs de CI50 allant de 0,1 nM à 400 nM. Ils constituent des inhibiteurs spécifiques et puissants de l'interaction CD4-gpl20 basés sur la structure du CD4. La liaison avec la protéine virale gpl20 recombinante se fait en compétition avec le CD4 soluble et est spécifique de la forme bien structurée .
En outre, ils peuvent être marqués, par exemple avec une sonde fluorescente, sans que l'affinité de liaison à la protéine de l'enveloppe virale gpl20 soit altérée.
Ces peptides peuvent donc être utilisés en tant que traceurs dans le procédé de criblage utilisant une technique d' anisotropie de fluorescence conforme à la présente invention.
Ce procédé utilise la polarisation de fluorescence dudit peptide marqué de façon covalente par une sonde fluorescente .
Le peptide utilisé est celui qui présente une affinité dans la gamme de celle des molécules recherchées. Par exemple, si l'on cherche à cribler des molécules présentant une affinité plus grande ou égale à 10s M"1, on utilisera un peptide marqué présentant une affinité de 106 M"1. Par exemple aussi, si on cherche à cribler des molécules présentant une plus forte affinité, par exemple 109 M"1 on utilisera un peptide présentant une affinité similaire.
Ainsi, le procédé de criblage de la présente invention peut être accordé suivant l'affinité recherchée en choisissant le peptide utilisé. En outre, l'affinité pour la protéine virale Gpl20 des molécules détectées par le procédé de criblage de la présente invention peut être déterminée à partir de celle du peptide selon l'invention choisi pour le criblage.
Les méthodes et appareils utilisables pour la mise en œuvre du procédé de la présente invention sont ceux qui sont accessibles à l'homme du métier dans la littérature qui se rapporte à l'étude des interactions moléculaires, par exemple dans les documents [37] ,
[38], [39], et [40] et dans le brevet US 5,756,292. Les analyses et les simulations peuvent être effectuées en utilisant le programme « BIOEQS » décrit dans les documents [41], [42] et [43] ou d'autres programmes , d'analyse d'interactions.
La sonde fluorescente doit de préférence présenter un rendement quantique élevé et une fluorescence dans le visible pour une sensibilité de détection élevée. Nous avons testé la rhodamine green, la fluoresceine et l'Alexa488 (marque de commerce), D'autres sondes fluorescentes présentant les propriétés spécifiées ci- dessus peuvent bien entendu être utilisés.
La polarisation de fluorescence est calculée à partir de deux mesures, l'intensité d'émission de la fluorescence polarisée en parallèle et en perpendiculaire, avec une excitation en parallèle. Ici, la polarisation en parallèle est définie selon la direction z de l'axe du laboratoire. La polarisation se calcule ainsi : P = (In - Ii) /(lu + II) (1) On peut aussi exprimer le résultat en terme d'anisotropie de fluorescence, calculée comme :
A = (lu - Iχ) /(In + 2Ii) (2), la relation entre polarisation et anisotropie étant la suivante :
A = 2/3(l/P-l/3)~1 (3) .
La valeur de 1 ' anisotropie ou polarisation de fluorescence est liée à la vitesse de diffusion rotationnelle de la molécule en solution par la relation (4) suivante :
Ao/A-1 = τ/τc (4) , dans laquelle Ao est 1 ' anisotropie limite du fluorophore, une constante physique déterminée par l'angle entre les dipôles d'absorption et d'émission, τ est la durée de vie de fluorescence, et τc est le temps de corrélation rotationnelle. Ce dernier dépend du volume hydraté (Vh) de la molécule ou du complexe moléculaire suivant la relation (5) : τc = ηVh/RT (5), dans laquelle η est la viscosité de la solution, R est la constante de gaz et T, la température en Kelvin.
Ainsi, lorsque le peptide marqué est seul en solution, sa vitesse de diffusion rotationnelle est rapide et donc l 'anisotropie de fluorescence- du fluorophore lié de façon covalente reste relativement basse. Par contre lorsque le peptide marqué interagit avec le gpl20 1 'anisotropie de fluorescence de la sonde augmente considérablement puisque la protéine virale gpl20 a un poids moléculaire de 120000 daltons, et donc la taille du complexe peptide de la présente invention- gpl20 est nettement plus élevée que celle du peptide seul. Donc la vitesse de diffusion rotationnelle diminue, et 1 ' anisotropie augmente.
Dans le procédé de criblage de la présente invention, toute molécule capable d'inhiber l'interaction entre un peptide de la présente invention et une protéine virale gpl20 peut représenter un inhibiteur de l'interaction CD4-gpl20, et donc un inhibiteur de l'infection virale. Il est donc possible, grâce aux peptides de la présente invention de cribler dans une banque de molécules toute molécule capable d' interagir avec la protéine gpl20 ou une protéine analogue à la gpl20 en particulier des molécules à activité antivirale ou des molécules utiles pour la fabrication de médicament. Le procédé de criblage de la présente invention fonctionne par compétition. Le peptide de la présente invention, choisi et marqué, est mis en présence de gpl20 à une concentration qui permet entre 20 et 50% de fixation. La quantité de gpl20 ne doit pas être saturante, sinon, il faudrait utiliser une grande quantité de molécules à cribler pour permettre la compétition. En outre, le complexe [peptide marqué- gpl20] formé doit être réversible pour permettre la compétition. Les conditions de concentration des molécules candidates dans les essais de criblage du procédé de la présente invention sont déterminées de la même manière que dans les essais classiques de compétition de molécules pour un récepteur utilisés en biologie moléculaire. La concentration de la ou des molécule (s) candidate (s) est de préférence 10 à 100 fois supérieure à la concentration du peptide marqué de la présente invention.
Le procédé de la présente invention est un procédé à la fois rapide, notamment du fait qu'il utilise les techniques d' anisotropie de fluorescence, et précis car il utilise les peptides de la présente invention. De plus, il nécessite de très petites quantités de réactifs comme le montrent les exemples ci-dessous ce qui diminue les coûts engendrés dans la recherche de molécules susceptibles d'être utilisées pour la fabrication de médicaments destinés au traitement du SIDA par rapport aux procédés de l'art antérieur.
En outre, le procédé de criblage de la présente invention est tout à fait adapté au criblage des banques de molécules disponibles actuellement et potentiellement actives dans l'inhibition de l'entrée et de l'infection du virus du sida. Il constitue donc un outil de recherche rapide et efficace de molécules effectivement actives pour inhiber l'interaction gpl20-CD4 nécessaire pour une infection efficace par le virus du sida.
Par exemple, selon un premier mode de réalisation de la présente invention, une seule molécule candidate est testée dans un cycle de criblage. Dans ce cas, si la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) est inférieure à la mesure étalon de l'étape c) , alors la molécule candidate testée sera considérée comme une molécule capable de se lier à la protéine virale Gpl20. Si la mesure de polarisation fluorescence de l'étape e) est inchangée par rapport à la mesure étalon de l'étape c) , alors la molécule candidate testée ne sera pas considérée comme étant capable de se lier à la protéine virale Gpl20. Ainsi, selon ce mode de réalisation, les cycles devront se succéder autant de fois qu'il y a de molécules candidates différentes à tester, à raison d'une molécule par cycle.
Par exemple, selon un second mode de réalisation de la présente invention, un échantillon comprenant plusieurs molécules candidates différentes peut être testé dans un seul cycle de criblage. Dans ce cas, si la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) est inférieure à la mesure étalon de l'étape c) , alors l'échantillon sera considéré comme comprenant au moins une molécule capable de se lier à la protéine virale Gpl20. Si la mesure de polarisation fluorescence de l'étape e) est inchangée par rapport à la mesure étalon de l'étape c) , alors l'échantillon ne sera pas considéré comme comprenant au moins une molécule capable de se lier à la protéine virale Gpl20.
Ainsi, suivant ce second mode de réalisation, un seul cycle permet de tester un échantillon comprenant plusieurs molécules candidates différentes. Si pour un des échantillons la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) est inférieure à la mesure étalon de l'étape c) , alors au moins une des molécules candidates dudit échantillon sera considérée comme capable de se lier à la protéine virale Gpl20. Le criblage peut ensuite être affiné sur les molécules dudit échantillon suivant le premier mode de réalisation de la présente invention pour identifier la ou les molécules de l'échantillon capable (s) de se lier à la protéine virale Gpl20. Ce second mode de réalisation de la présente invention permet un criblage très rapide de molécules candidates .
Ces premier et deuxième modes de réalisation de la présente invention peuvent être réalisés sur des molécules candidates connues disponibles actuellement et potentiellement actives dans l'inhibition de l'entrée et de l'infection par le virus du sida.
Suivant un troisième mode de réalisation, le procédé de la présente invention peut être appliqué sur des liquides biologiques non purifiés tels que de l'urine, des extraits cellulaires, bactériens, etc.
Lorsque le procédé de l'invention permet de considérer qu'un tel extrait comprend au moins une molécule capable de se lier à la protéine virale Gpl20, cet extrait peut être analysé par les procédés traditionnels d'analyse en chimie pour identifier les molécules qu'il contient. Un criblage plus précis, suivant le premier mode de réalisation de la présente invention, peut ensuite être réalisé pour mettre en évidence, parmi toutes les molécules identifiées dans l'extrait, la ou les molécule (s) capable (s) de se lier à la protéine virale Gpl20.
Le procédé de la présente invention constitue donc un puissant outil de criblage, rapide, reproductible, sensible et accordable à une large gamme d'affinité II se pratique en solution et ne nécessite pas de séparer les complexes des molécules libres.
Le procédé de criblage de la présente invention présente de nombreux avantages que l'homme du métier peut facilement identifier.
Parmi ces avantages, on peut citer la capacité du procédé de pouvoir sélectionner des molécules ayant une affinité prédéterminée. En effet, si les conditions de la réaction de compétition permettent de garder constant le Kd entre le peptide marqué de la présente invention et la protéine virale gpl20, l'affinité de la molécule sélectionnée après l'étape de compétition sera au moins égale à celle du peptide marqué
Un autre avantage est que le marquage du peptide de la présente invention peut être réalisé avec différents composés tels que la Rhodamine green, la fluoresceine, etc. De plus, l'utilisation de composés tels que les fluorophores, qui des propriétés d'absorption et d'émission dans le visible peut être particulièrement avantageuse pour la détection de molécules dans des extraits non purifiés tels que l'urine, des extraits cellulaires, bactériens, etc.
En outre, ce procédé permet d'utiliser peu de protéine virale gpl20 , puisse qu'il peut se dérouler en présence d'une concentration de gpl20 non saturante, voire de préférence à une concentration qui permet 20 à 50% de fixation.
Au contraire des tests Elisa couramment pratiqués dans les laboratoires pour mettre en évidence une compétition entre molécules données, le procédé de la présente invention utilisant les peptides et les mesures d' anisotropie définies ci-dessus permet d'effectuer des mesures entièrement en solution. En outre, ' le procédé de la présente invention peut être adapté à des volumes très petits, de quelques microlitres, et donc à des mesures en micropuits. Il permet aussi d'effectuer des mesures très rapides, en une ou deux minutes pour les compétitions.
Un autre avantage du procédé de la présente invention réside dans la reproductibilité des résultats. En effet, la valeur d' anisotropie pour un peptide marqué de la présente invention, par exemple dans les conditions définies dans les exemples ci- dessous, est toujours la même.
Un autre avantage du procédé de la présente invention réside dans le fait que les conditions de température et de solution peuvent facilement être modifiées et contrôlées.
Un autre avantage encore réside dans le fait que le rapport signal/bruit étant très élevé, le procédé de la présente invention permet de détecter de très faibles taux de fixation.
D'autres avantages encore apparaîtront à l'homme du métier à la lecture des exemples suivants en référence à la liste de séquences et aux figures annexées .
Brève description de la liste des séquences
La liste des séquences annexée fournit les séquences peptidiques suivantes :
- séquence ID n°l : séquence sCD4. - séquence ID n°2 : séquence de la scyllatoxine (ScTx) .
- séquence ID n°3 : séquence CD4M9 : peptide issu de la scyllatoxine, ne présentant pas de TPA en position 1 de la séquence. - séquences ID n°4-16 et 19 et 20 : séquences nommées CD4M9T, CD4M26, CD4M27, CD4M27A, CD4M27B, CD4M27C, CD4M30, CD4M31, CD4M32, CD4M33, CD4M35, K15, K16 et CD4M9BIP et CD4M9V respectivement de la présente invention.
- séquence ID n°17 : séquence nommée CD4M3 issue de la scyllatoxine ne présentant pas de TPA en position 1 de la séquence.
- séquence ID n°18 : séquence nommée CD4MO issue de la charybdotoxine .
Brève description des figures
Figure 1 : Courbes d'inhibition de la liaison du CD4 à la protéine virale gpl20, par des peptides de la présente invention, obtenues par ELISA en compétition. Les peptides testés sont : CD4M9, CD4M9T, CD4M27, CD4M32, CD4M33 et CD4M35. Les données expérimentales sont reportées en pourcentage de liaison (%F) en fonction de la concentration des peptides.
Figure 2 : Courbe d' inhibition de la liaison du CD4 à la protéine virale gpl20, par le peptide marqué CD4M33-fluoresceine, CD4M33-F, obtenue par ELISA en compétition. Les courbes des peptides CD4M9 (séquence ID n°3), CD4M33 (séquence ID n°13) et CD4M35 (séquence ID n°14) sont aussi représentées pour comparaison. Les données expérimentales sont reportées en pourcentage de liaison (%F) en fonction de la concentration des peptides.
Figure 3 : courbes d' interaction de la protéine virale recombinante gpl20-HXB2 avec le peptide CD4M33 (séquence ID n°13) fixé à la surface d'une puce d'un instrument de résonance plasmonique de surface, Les courbes d'association (0-300 s) et de dissociation (300-800 s) ont été enregistrées après injection de la protéine virale gpl20 aux concentrations 13,2(1), 19,8(2), 29,6(3), 44,4(4), 66,6(5) et 100(6) nM. Les données sont reportées en unités de résonance (RU) en fonction du temps (t) en seconde.
Figure 4 (a) et (b) : courbe d'interaction du
VIH-1, inactivé par AT-2 [34], avec l'anticorps 48d [11]
(a) et CG10 [35], (b) , fixés à la surface d'une puce d'un instrument de résonance plasmonique de surface en présence du peptide CD4M33 (10 μg/ml) , d'un peptide inactif (Ala23) CD4M9 (Phe23 remplacé par Ala dans la séquence peptidique de CD4M9) (10 μg/ml) et en absence de peptide. Les courbes d'association (0-180 s) et de dissociation (180-600 s) ont été enregistrées après injection du VIH-1, qui a été pré-incubé avec les peptides à 20°C pendant lh. Les données sont reportées en unité de résonance (RU) en fonction du temps (t) en seconde .
Figures 5(A)-(C) : effets des peptides CD4M30 (séquence ID n°10) (figure 4A) , CD4M33 (séquence ID n°13) (figure 4B) , CD4M35 (séquence ID n°14) (figure 4C) sur la réplication de la souche VIH-1LAI dans les CMSP activées par la PHA-P. Les données sont représentées en pourcentage d'inhibition (%I) de l'activité Transcriptase Inverse (TI) dans les surnageants de culture en fonction de la concentration en nM des peptides.
Figures 6 (A) et (B) : effet de la présence du CD4 soluble et des peptides de la présente invention sur l'interaction de la protéine virale recombinante g l20HB2 avec les anticorps CG10 (A) et 48d (B) , fixés à la surface d'une puce d'un instrument de résonance plasmonique de surface. Les courbes d'association (0-180 s) et de dissociation (180-400, 180-450 s) sont reportés pour la protéine virale gpl20 seule et la protéine virale gpl20 en présence du CD4M27 (1,5 équivalent, séquence ID n° 6 ) , du CD4M9 (1,5 équivalent), du mutant inactif (Ala23)CD4M9 (1,5 équivalent) et du CD4 soluble (1,5 équivalent). Les données sont reportées en unité de résonance (RU) en fonction du temps (t) en seconde.
Figure 7 : exemples de séquences peptidiques de la présente invention représentées avec les codes à une lettre des résidus acides aminés. TPA et B représentent l'acide thio-propionique et la bi- phenylalanine respectivement et "d" la forme optique D de l'acide aspartique.
Figures 8 a), b) et c) : courbes illustrant des mesures d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , du peptide K16 de la présente invention marqué à la rhodamine green, en solution à une concentration de 2 nM, et mis en présence de protéine virale gpl20 de souche HXB2 à différentes concentrations [GP120] nanomolaires (nM) .
Figures 9 et 10 : courbes illustrant des mesures d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , respectivement des peptides CD4M33 et K15 de la présente invention marqués à la rhodamine green, en solution à une concentration de 2 nM, et mis en présence de protéine virale gpl20 de souche HXB2 à différentes concentrations [GP120] nanomolaires (nM) . Figure 11 : courbe illustrant des mesures d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , du peptide CD4M9 de la présente invention marqué à la fluoresceine, en solution à une concentration de 6 nM, et mis' en présence de protéine virale gpl20 de souche HXB2 à différentes concentrations [GP120] nanomolaires (nM) .
Figures 12a) et 12b) : courbes illustrant des mesures d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , du peptide CD4M33 de la présente invention marqué à la rhodamine green, en solution à une concentration de 6 nM, et mis en présence de protéine virale gpl20 respectivement de souches HXB2 et SF2 à différentes concentrations [HXB2] et [SF2] nanomolaires (nM) .
Figure 13 : courbes théoriques illustrant des valeurs théoriques d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , d'une compétition entre un peptide CD4M33 marqué et un peptide CD4M33 non marqué, en fonction de la concentration nanomolaire
(nM) du peptide CD4M33 non marqué, pour différentes concentrations nanomolaires (nM) d'une protéine virale gpl20 (HXB2) Ces courbes ont été calculées à partir du
Kd=14nM du CD4M33 déterminé par titrage directe. - Figures 14 a) a i) : courbes illustrant des mesures d' anisotropie de fluorescence (An), exprimées en millianisotropie (mA) , d'une compétition entre un peptide CD4M33 marqué à la fluoresceine et différents peptides non marqués (respectivement CD4M33, CD4M35, CD4M32, sCD4, CD4M27, CD4M9 , CD4M97M, CD4M24 et CD4M9BIP) , en fonction de la concentration nanomolaire (nM) du peptide non marqué.
Exemples EXEMPLE 1 ; SYNTHESE DES PEPTIDES DE LA PRESENTE INVENTION.
Les peptides de la présente invention ont été fabriqués dans cet exemple par synthèse chimique en phase solide avec un synthétiseur automatique de peptides Applied Biosystems, mod. 433A, et en chimie Fmoc, qui utilise le groupement Fluorenylmethyloxycarbonyle (Fmoc) pour la protection temporaire de la fonction α-aminique des acides aminés. Les groupements protecteurs utilisés pour prévenir les réactions secondaires des chaînes latérales des acides aminés, dans cette stratégie Fmoc, ont été le tertio-butyle éther (tBu) pour les résidus Ser, Thr et Tyr ; tertio-butyle ester (OtBu) pour Asp, Glu ; trityle (Trt) pour Gin, Asn, Cys, His ; tertio-butyloxycarbonyle (Boc) pour Lys et 2, 2, 5, 7, 8-pentametylchromane-6-sulfonyle (Pmc) pour Arg.
La réaction de couplage se déroule avec un excès de 10 équivalents d'acides aminés (1 mmol) par rapport à la résine (0,lmmol) . L'acide aminé protégé est dissous dans 1 ml de N-méthylpyrollidone (NMP) et 1 ml d'une solution de l-N-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) 1M dans le solvant NMP. 1 ml d'une solution de N,N' -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 1M est alors ajouté. Après 40 à 50 minutes d' activation, l'ester actif formé est transféré dans le réacteur qui contient la résine. Avant cette étape de transfert puis de couplage, la résine est déprotégée de son groupement Fmoc par une solution de 20 % de pipéridine dans le NMP. L'excès de pipéridine est enlevé par lavage à la NMP après 5 à 10 minutes environ.
Pendant la déprotection, la détection des adduits dibenzofulvène-pipéridine à 305 nm permet de suivre le bon déroulement de la synthèse. En effet, la quantification de l'adduit permet d'estimer l'efficacité de la déprotection du groupement Fmoc et par suite du couplage du dernier acide aminé incorporé.
MODIFICATIONS CHIMIQUES APPORTEES AUX PEPTIDES DE LA PRESENTE INVENTION. Une sonde fluorescente ainsi qu'un groupement biotine ont été couplés sur deux des peptides étudiés de la présente invention, le CD4M9T (séquence ID n°4) et le CD4M33 (séquence ID n°13) . L'incorporation sur ces deux composés s'est faite sur le résidu lysine 11, au niveau d'une face opposée au site de liaison de la protéine virale gpl20. Ce choix d'une lysine a été conditionné par ses possibilités de protection de sa chaîne latérale avec un groupement protecteur, dit orthogonal, comme le groupement de (1- (4 ,4-diméthyl- 2, 6-dioxo-cyclohexylidène) éthyle) (ou groupement Dde). Un tel groupement est en effet stable au traitement à 20 % de pipéridine utilisé pour la déprotection du groupement Fmoc, mais est clivé de façon spécifique par traitement avec une solution d'hydrazine à 2 %. Une fois le groupement Dde retiré, la fluoresceine ainsi que la biotine ont pu être couplées. INTRODUCTION DE LA FLUORESCEINE.
Le groupement fluorescent a été introduit sur la chaîne latérale de la lysine 11 du peptide de la présente invention CD4M33 et de la lysine 15 ou 16 des peptides K15 (séquence ID n°15) ou K16 (séquence ID n°16) , respectivement, de la présente invention. Le groupement Dde a donc été utilisé pour la protection de la chaîne latérale de la lysine pendant la synthèse du peptide, et ensuite libéré par deux traitements de 5 min avec 2 % d'hydrazine dans la diméthylformamide (DMF) . La molécule de fluoresceine a été couplée directement sur le peptide synthétisé. Le couplage de la sonde a été réalisé à l'aide de l'ester fluoresceine- (5- (6) -carboxylate de N- hydroxysuccinimidyle. Pour cela, à un équivalent de résine sont ajoutés 4 équivalents d'ester activé de fluoresceine en présence de 14 équivalents de diisopropylethylamine (DIEA) . La réaction se déroule dans le solvant NMP pendant une nuit. La déprotection finale est enfin réalisée. INTRODUCTION DE LA BIOTINE.
Un bras espaceur 8-amino-3 , 6dioxaoctanoïque a été ajouté dans un premier temps sur la lysine 11 préalablement déprotégé du groupement Dde. La réaction est similaire à celle décrite dans le -paragraphe précédent. La biotine est ensuite incorporée sous la forme d'un ester biotinamidocaproate de N-hydrosuccinimidyle : à un équivalent de résine sont ainsi ajoutés 4 équivalents d'ester activé de biotine en présence de 14 équivalents de diisopropylethylamine (DIEA) . La réaction se poursuit pendant une nuit à température ambiante. La résine est ensuite lavée avant d'être traitée par la solution de déprotection finale. INTRODUCTION D'UN GROUPEMENT THIOL.
Le peptide CD4M9 est synthétisé selon la procédure décrite ci-dessus avec la Lysine en position 11 présentant comme groupement protecteur de la chaîne latérale un groupement Dde. Après synthèse du peptide, le peptide-résine est traité à 5 reprises avec une solution de 2% d'hydrazine dans la DMF. Le couplage d'un bras de liaison est réalisé pendant une heure à température ambiante dans la DMF avec 10 équivalents d'acide Fmoc-8-amino-3, 6-dioxaoctanoïque utilisant le réactif HBTU en présence de diisopropylethylamine. Le groupement Fmoc est ensuite déprotégé avec 20% de pipéridine dans la DMF. Le peptide-résine est dès lors traité avec 10 équivalents de réactif de Traut (hydrochlorure de 2-iminothiolane (Sigma) en présence de DIEA. Le peptide est enfin libéré et déprotégé comme décrit ci-dessous. DEPROTECTION FINALE DE LA RESINE.
Le clivage de la résine et des groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales ont été réalisés simultanément par traitement du peptide lié à la résine par de l'acide trifluoroacêtique (TFA) . Avant d'effectuer le clivage, la résine a été lavée plusieurs fois au dichlorométhane (DCM) et enfin séchée. Le réactif utilisé lors du clivage est un mélange acide contenant 81,5 % de TFA et les piégeurs phénol (5 %) , thioanisole (5 %) , eau (5 %) , éthanedithiol (2,5 %) et tri-isopropylsilane (1 %) . La résine a été traitée avec ce mélange pendant trois heures sous agitation et à température ambiante, à raison de 100 ml de solution par gramme de résine. Le peptide libre en solution a été récupéré par filtration. Le peptide a été ensuite précipité et lavé à froid dans l'éther de diisopropyle puis dissous dans de l'acide acétique à 20 % et lyophilisée.
REPLIEMENT DES PEPTIDES DE LA PRESENTE INVENTION PAR FORMATION DE PONTS DISULFURES
Le peptide récupéré après lyophilisation, le brut de synthèse, se trouve sous forme réduite, c'est-à-dire que les ponts disulfures intrachaînes ne sont pas formés. La formation de ces liaisons covalentes a été réalisée en utilisant le couple redox cystamine/cystéamine. Le brut de synthèse a été repris dans l'eau ajoutée de TFA 0,1 % (v/v) et de chlorure de guanidinium 6M pour faciliter sa dissolution, à raison de 2,0 g.ml"1. Cette solution a ensuite été ajoutée au goutte-à-goutte, diluée à 0,2 mg/ml"1, au tampon de réduction, composé de Tris/HCl lOOmM, pH 7,8, et de cystéamine 5 mM. La cystaminé (oxydant) 0,5 mM en final, a été ajoutée après 45 minutes de réaction à température ambiante. Le milieu est amené à pH 3,0 après 30 minutes.
La cystéamine permet de réduire les groupements thiols présents sur le peptide. A l'air libre, elle s'oxyde et permet l'oxydation de cystéines et donc le repliement du peptide par formation de ponts disulfures intrachaînes. La cystamine ajoutée en fin de manipulation permet de parfaire le repliement. Le bon déroulement de l'oxydation est vérifié par chromatographie analytique en comparant les temps de rétention des produits brut et oxydé, plus importants pour le premier.
L'oxydation du peptide CD4M9, présentant un groupement thiol en position 11, diffère quelque peu de celle décrite dans le paragraphe plus haut. Le milieu de repliement rêactionnel, composé d'un tampon 20 mM phosphate, 200 mM NaCl, ajusté à pH 7,8 est longuement dëgazé par de l'argon et ensuite additionné de 5 mM de cystéamine, 5 mM cytamine. Le peptide comprenant sept fonctions SH libres est ensuite ajouté et la réaction d'oxydation est stoppée par ajout d'acide après seulement 10 minutes, temps suffisant au repliement et à la formation des trois ponts disulfures naturels et suffisamment court pour limiter la formation de produit secondaire correspondant à des états d'oxydation supérieurs . PURIFICATION DES PEPTIDES DE LA PRESENTE INVENTION
Les peptides de la présente invention ont été purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse sur une colonne préparâtive Vydac C18
(marque de commerce) (1,0 x 25,0 cm). On a utilisé un gradient linéaire 0-60 % d'acétonitrile dans une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,1 % pendant 90 minutes. Les fractions du pic majeur ont été analysées par HPLC analytique; les fractions ne présentant qu'un seul pic ont été rassemblées et lyophilisées. Le produit ainsi obtenu a été analysé par spectrométrie de masse. EXEMPLE 2 : TESTS DE COMPETITION PAR ELISA INDIRECTE.
L'inhibition de l'interaction rgpl20-CD4 a été mesurée par ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) indirecte. 50 ng par puits d'anticorps anti-gpl20, D7324, ont été immobilisés sur une plaque 96 puits (Maxisorb, Nunc) pendant une nuit à 4°C. Après passivation par la Sêrumalbumine Bovine et trois lavages avec le tampon de lavage (Tris 10 mM, pH 7,8, Tween 20 0,05 %) , 15 ng de rgpl20HXB2 par puits ont été ajoutés. Différentes concentrations de compétiteurs ont ensuite été ajoutées, après trois lavages, ainsi que 0,4 ng de CD4 soluble par puits. Des témoins 100 % ne contenant que du CD4 soluble sont effectués. Après une nuit à 4°C et trois lavages, 5 ng d'anticorps de souris anti-CD4 L120.3 ont été ajoutés par puits, puis un anticorps de chèvre anti-IgG de souris couplé à la peroxydase (GAMPO) . La révélation a été effectuée par ajout de 3 , 3 ' , 5, 5' -tétraméthylbenzidine, substrat fluorescent de la peroxydase. La réaction a été arrêtée après 30 minutes par ajout d'acide sulfurique 2M. L'inhibition de l'interaction rgpl20-CD4 a été calculée par lecture de l'absorbance A à 450 nm. Des témoins sans compétiteur ont permis de déterminer l'absorbance Aιoo% (absorbance en absence de compétiteur) . Le pourcentage d' inhibition pour chaque concentration de peptide de la présente invention a été calculé par la formule : pourcentage d'inhibition = 100 x (Aι00%-A) /Aχoo%. Les tests ont été conduits en duplicats et les résultats exprimés comme la moyenne de doublons expérimentaux. Les activités biologiques du peptide CD4MO (séquence ID n°18) issu de la charybdotoxine et du peptide CD4M3 (séquence I.D. n°17) , issu de la scyllatoxine (séquence I.D. n°2) ont été testées en test ELISA indirecte. Ces peptides présentent une capacité à inhiber l'interaction rgpl20τJAi_CD4 soluble, avec une concentration d'inhibition à 50% (ou CIΞ0) de 4,0 x 10"5 M et de 2,0 x 10"5 M, respectivement (Tableau I) [4]. Ces valeurs sont 10 000 fois plus élevées que la CI50 présentée par le CD4 soluble (CI50 = 4,0 x 10"9 M)
[4].
La figure 1 annexée regroupe les résultats obtenus dans cet exemple avec les peptides de la présente invention. II s'agit de représentations du pourcentage de fixation (%F) de la protéine virale gpl20κxB2-CD4 en fonction de la concentration molaire (C(M)) en compétiteur, c'est-à-dire en peptide de la présente invention. Cette figure montre l'inhibition de l'interaction CD4-gpl20κxB2-
Le CD4M9 (séquence ID n°3) a été testé en ELISA par compétition. Il présente la capacité d'inhiber l'interaction rgpl20LAι-CD4 soluble avec une concentration d'inhibition à 50% (ou CI50) de 4,10"7 M (Tableau I) soit une augmentation de la capacité d'inhibition d'un facteur 50 par rapport au peptide de la présente invention CD4M3 (séquence ID n°17) . Le peptide de la présente invention CD4M9, en test ELISA par compétition, est également capable d'inhiber l'interaction du CD4 avec d'autres protéines gpl20 recombinantes, provenant de virus T- et M-tropique : VIH-lnIB, VIH-IMH, VIH-lBa-L, VIH-1JR.FL, VIH-1W61D, avec une concentration d'inhibition à 50% (CI50) entre 0,1 et 1,0 x 10"6 M [4].
Ce peptide inhibe l'interaction gpl20κxB2-CD4 soluble à une CI50 de 9 x 10"8M (figure 1, tableau I) .
Un mutant CD4M9V, comportant la substitution de la séquence C-terminale Gly-Pro du CD4M9 par Val, présente une CI5o de 3,0.10"7 M dans l'inhibition de l'interaction gpl20Ai-CD4 (tableau 1), ce qui représente une légère augmentation de la capacité inhibitrice. Le mutant CD4M9Bip comporte la substitution Phe23Bip par rapport au CD4M9 ; ce peptide présente une CI50 de 1,0.10"7 M dans l'inhibition de l'interaction g l20LAi-CD4 (tableau 1), ce qui représente une augmentation supplémentaire de la capacité inhibitrice. Le mutant CD4M9T (séquence ID n°4) , comportant un acide thio-propionique en substitution de l'acide aminé Cys C-terminal, présente une CI50 de 3,0.10"8 M dans l'inhibition de l'interaction gpl20LAi-CD4 (figure 1 ; la CI50 dans l'interaction gpl20HχB2 est de 1,1.10"8 M, tableau 1), ce qui représente une augmentation de la capacité d'inhibition d'un facteur proche de 10 par rapport à CD4M9. Les mutants suivants présentent tout un résidu thio-propionique (TPA) et valine (Val ou Ile) en position N- et C-terminale, respectivement, et ont tous été testés avec la gpl20, issue des virus T tropiques VIH-1HXB2 et VIH-IIAJ. Le peptide de la présente invention CD4M27 (séquence I.D. n°6) comporte les mutations Arg5Phe (pour enlever une arginine non essentielle et protéger le pont disulfure 6-24) , Gly27Val et la délétion du résidu C-terminal proline (pour mieux stabiliser la structure β) . Il présente une augmentation de la capacité d'inhibition de la liaison CD4 - gpl20κχB2 CI5o de 7.10"9 M, (Fig. 1, Tableau I). Les peptides CD4M27 A, B et C sont obtenus respectivement par une mutation Gly21Ser(a), Ser22His(b) et Ser22Asn(c) à partir du peptide CD4M27. Ils présentent une capacité d'inhibition comparable à celle du peptide CD4M27.
Le peptide de la présente invention CD4M32 (séquence ID n°12) , comparée au CD4M9T, comporte la délétion du résidu proline C-terminal, la mutation Gly27Val et la mutation de la Phe23 en biphénylalanine (Bip) : la mutation Phe23Bip ajoute une extension hydrophobe à la chaîne latérale de la Phe23, pour augmenter l'interaction avec la cavité hydrophobe de la protéine virale gpl20. CD4M32 présente une augmentation de l'inhibition de la liaison CD4-gpl20κχB2 (CI50 de 8.10"10 M, Fig. 1). Le mutant CD4M30 (séquence ID n°10) , par rapport au CD4M32, comporte la mutation Arg5Phe
(déjà introduite dans le CD4M27) et Ala4Gln pour augmenter la solubilité de la molécule. Ce peptide de la présente invention présente un CI50 de 3,0 nM, dans les tests d'inhibition de l'interaction CD4 - gpl20LAi. Le mutant CD4M33 (séquence ID n°13) regroupe les mutations présentes dans les deux peptides précédents, notamment CyslTPA, Arg5Phe, Phe23Bip, Gly27Val, la délétion d'un résidu en position C-terminale et en plus la mutation Ala4His (pour augmenter la solubilité de la molécule) . Ces mutations ont un effet additif et permettent au peptide de la présente invention CD4M33 d'inhiber l'interaction CD4 - gpl20HχB2 et CD4-gpl20LA1 avec une CI50 de 1,2 x 10"10 M et de 2,5 x 10"10 M (Fig. 1 et Tableau 1) soit une augmentation de la capacité d'inhibition de la liaison CD4 - gpl20 d'un facteur 1000 par rapport au CD4M9. Un peptide supplémentaire, CD4M35 (séquence ID n°14) , a été synthétisé avec, par rapport au peptide CD4M33 de la présente invention, les mutations Val27Ile et Gly21(D)Asp. Ces mutations permettent au peptide de la présente invention d'inhiber l'interaction CD4-gpl20κχB2 avec un CI50 de 7.0 10"11 M (Fig. 1, Tableau 1) .
Deux autres peptides K15 (séquence ID n°15) et K16 (séquence ID n°16) ont été synthétisés : ils comportent les substitutions Gln7Val, Leu8Gln, LysllHis, par rapport au peptide CD4M33 de la présente invention, et un résidu Lys en position 15 ou 16, respectivement. Un groupement fluorescent de fluoresceine a ensuite été fixé, d'une façon covalente, au niveau de la chaîne latérale de ce résidu lysine, selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Les peptides fluorescents K15 et K16 présentent une CI50 de 5,0.10~8 M et 6,0.10"9 M dans l'inhibition de l'interaction gpl20LAI-CD4 , dont l'affinité pour la protéine virale gpl20 n'est pas modifiée par un marquage.
En conclusion, la présente invention fournit une famille de peptides qui représentent de puissants inhibiteurs de l'interaction CD4-gpl20. Tableau 1
Concentration d'inhibition 50% (CI50) des peptides mimétiques du CD4 dans l'interaction du CD4 recombinant soluble pour la protéine de l'enveloppe virale gpl20LAI et gpl20κB2- L'écart type pour chaque valeur est inférieur à 30%.
Figure imgf000043_0001
Exemple 3 ; Expériences de résonance plasmonique de surface
Les expériences de résonance plasmonique de surface ont été réalisées avec un système Biacore 2000 (Biacore, Uppsala, Suède) . Les peptides à tester ont été couplés à la biotine (comme décrit auparavant) puis immobilisées sur une puce sur laquelle de la streptavidine a été préalablement fixée.
La streptavidine a été immobilisée sur la puce comme suit : la surface de la puce a été d'abord activée par l'injection de 50 μL d'agent de couplage prévu par le constructeur et pouvant former des liaisons amidiques : N-éthyl-N' - (diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) /N-hydroxysuccinimide (NHS) , 50/50 ; ensuite, 20 μL de streptavidine, 0,2 mg.mL"1 dans l'acétate de sodium 10 mM, pH 4,5, ont été injectés à 5 μL.min"1, suivis d'une neutralisation des groupements carboxyliques activés par 2 x 20 μL d' éthanolaminé 1,0 M, pH 8,5. Les molécules biotinylées ont été ensuite injectées (10 μL.min"1 dans un tampon Hepes 10 mM, NaCl 0,3 M, pH 7,4) sur trois des quatre pistes de la puce. Sur la première piste, le CD4M9 (10"7 M) a été immobilisé jusqu'à une valeur RU (unité de résonance) 100 ; la deuxième piste a été laissée vierge (témoin) ; la troisième piste a été recouverte avec du CD4 soluble (10"7 M) jusqu'à une valeur de 450 RU ; sur la quatrième piste, le CD4M33 (10~7 M) a été immobilisé à une valeur de 100 RU. Pour chaque analyse, plusieurs concentrations de différentes gpl20 (souches HXB2, BAL, JRFL) ont été injectées, à une vitesse de 50 μL.min"1 à 25°C, pour un temps d'association de 4 min. La puce est ensuite rincée avec un tampon de course, 10 mM Hepes, 150 mM NaCl , 3 , 4 mM EDTA et 0,05 % P20, pH 7,4, pour analyser la phase de dissociation. Après chaque expérience, la puce est régénérée avec 25 μL d'acide formique 1,0 M. Les constantes de dissociation sont calculées à partir des constantes cinétiques déterminées par le logiciel Bia-evaluation 3,0.
Exemple 4 ; Activité antivirale des mimétiques CD4.
Les manipulations du matériel infectieux ont été réalisées dans un laboratoire de haute sécurité de type L3. De façon à être le plus proche des conditions physiopathologiques, l'étude a été menée à l'aide de cultures primaires de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) humaines. Dans toutes les expériences, les effets des nouvelles molécules ont été comparés à ceux de l'AZT. ISOLEMENT, CULTURE ET ACTIVATION DES CELLULES Milieux de culture
Le milieu A est composé de milieu de culture cellulaire RPMI 1640 (Life Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Roche Product) décomplémenté par la chaleur à +56°C pendant 30 min, de 2 mM de L-Glutamine (Roche Product), et d'une solution à 100 μg/ml de trois antibiotiques (pénicilline, streptomycine, néomycine ; PSN, Life Technologies) . Le milieu B est constitué de milieu A supplémenté par 20 Ul/ml d'IL-2 humaine recombinante (Roche Product). Isolement et activâtion des CMSP
Les CMSP sont séparées des autres éléments figurés du sang par centrifugation en gradient de ficoll (MSL 2000, Eurobio) : 30 ml- de sang, d'un donneur sain, dilués au tiers sont déposés sur un coussin de 20 ml de ficoll. Après 20 min de centrifugation à 850 g, l'anneau de. CMSP est prélevé puis lavé deux fois à l'aide de RPMI 1640, après 10 min de centrifugation à 750 g et 5 min à 400 g. Les CMSP sont alors activées pendant 48 h par 1 μg/ml de phytohémagglutinine-P (PHA-P ; Difco Laboratories) . Les CMSP sont cultivées à +37°C, en atmosphère saturée en humidité, sous 5% de C02. Au terme des 48 heures d' activâtion mitogénique, elles sont cultivées en milieu B. Tout au long de la culture, les surnageants de culture sont prélevés, et les milieux de culture sont renouvelés tous les trois ou quatre jours. A chaque renouvellement des milieux de culture, la viabilité cellulaire est évaluée par une observation microscopique.
EVALUATION DE L'ACTIVITE ANTIRETROVIRALE DES MOLECULES Les composés de la présente invention CD4M30, CD4M33 et CD4M35 ont été solubilisés dans de l'eau ppi stérile (Aguettant) , aliquotés puis conservés à -20°C. Le composé SAH-CD4 (CD4 soluble couplé à la sérum albumine humaine fournit par Aventis (Vitry-sur-Seine) a été conservé à -80°C jusqu'à son utilisation. Les solutions et les dilutions ont ensuite été réalisées extemporanément dans du milieu A. Les CMSP ont été prétraitées avec les composés pendant 1 heure puis infectées par l'isol t de référence à tropisme lymphocytaire VIH-ILM ou par l'isolât clinique VIH-1LEN- Les caractéristiques biologiques de cet isolât sont : rapid/high, scyncitia inducing (SI) , X4 : il est donc prêferentiellement apte à infecter les lymphocytes. Le stock viral a été constitué en amplifiant in vitro cette souche à l'aide de cellules mononucléées du sang ombilical (CMSO) activées préalablement par 1 μg/ml de PHA-P et cultivées dans du milieu B. Afin d'éliminer les facteurs solubles tels que les cytokines, les surnageants de culture ont été ultracentrifugés à 360 000 g pendant 5 min, et les culots ont été resuspendus dans du RPMI 1640. Le stock viral ainsi constitué a été ensuite titré à l'aide de CMSP activées par la PHA-P. La TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) a été calculée en utilisant la formule de Kârber. Les CMSP ont été infectées avec différentes doses virales 10-100 TCID50 de la souche VIH-IAI et par 50 TCID50 de la souche VIH-1LEN (multiplicité d'infection m.o.i . = 0, 001) .
DOSAGE DE LA REPLICATION VIRALE DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURE. La réplication virale a été mesurée, au jour 7 de la culture, en dosant l'activité Transcriptase Inverse dans les surnageants de culture à l'aide de la trousse de dosage RetroSys (marque déposée) selon les recommandations de la société Innovagen. Analyse des résultats et détermination "des doses effectrices 50%
Les doses effectrices 50% (DE50) sont calculées en utilisant le logiciel "Dose-effects analysis ith microcomputers" mis au point par J. Chou & T.C. Chou.
EXEMPLE 5 ; PROTOCOLE DE PRODUCTION DE LA PROTEINE VIRALE GP120 RECOMBINANTE.
Le fragment codant la protéine virale gpl20 (acide aminé V12 à R481) a été amplifié par PCR dans le plasmide HIVIIIB/HXB2R, à l'aide de deux amorces permettant de générer un fragment contenant les sites BamHI (en amont du site Kpnl de la protéine virale gpl20) et PstI (en aval du codon stop ajouté à l'extrémité de la séquence de la protéine virale gpl20) . Le fragment BamHI/PstI ainsi obtenu a été clone dans le vecteur Bluescript (pBS, Stratagene) , conduisant au plasmide pBSml . La séquence codant l'extrémité N-terminale de la protéine virale gpl20 (Tl à Gll) , ainsi que celle codant le peptide signal de l'ecdystéroïde glycosyltransférase du baculovirus d'Autographa californica, ont été insérées entre les sites BamHI et Kpnl de pBSml, conduisant à pBSm2.
Le fragment BamHI-PstI de pBSm2 a ensuite été inséré entre les sites BglII-PstI du vecteur de transfert pll9P du baculovirus P10. Des cellules d'insectes Sf9 ont été cotransfectées avec l'ADN viral purifié du baculovirus modifié AcSLPlO et l'ADN du vecteur recombinant pll9P gpl20. Les virus recombinants sont purifiés par une méthode standard. Les cellules Sf9 scia (lignée adaptée à la croissance sans sérum, déposée à la collection de l'Institut Pasteur) sont entretenues en spinner en milieu sans sérum. Ces cellules (5.105 cellules/mL) sont ensuite infectées par les virus recombinants à une multiplicité d' infection de 1 UFP (Unité Formant Plage) par cellule et incubées à 28°C. Après six jours d'infection, les cellules sont centrifugées (500 g), et la protéine virale gpl20 sauvage est concentrée et directement purifiée à partir du surnageant de culture par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose-bromacétylëe couplée à l'anticorps anti-gpl20 D7324.
EXEMPLE 6 ; FIXATION DE L'ENVELOPPE VIRALE. Afin de mieux caractériser son activité biologique, le peptide de la présente invention CD4M33
(séquence ID n°13) a été marqué avec la biotine et avec la sonde fluorescente fluoresceine comme décrit dans l'exemple 1, au niveau de la Lys-11 positionnée sur la surface opposée de la surface active du peptide de la présente invention CD4M33. Son activité demeure inchangée dans des tests ELISA (Figure 2) .
La figure 2 regroupe les résultats obtenus dans cet exemple. Il s'agit de courbes montrant l'évolution du pourcentage de fixation (%F) de peptides de la présente invention à la protéine virale gpl20κB2 en fonction de la concentration molaire de ces peptides
(C(M)) .
Ces résultats montrent que le peptide CD4M33 peut incorporer un groupement de marquage sans que son activité biologique soit altérée.
Afin d'obtenir une première évaluation de l'affinité du peptide de la présente invention CD4M33 pour la protéine virale gpl20, une analyse d'interactions biospécifiques (décrite dans l'exemple 3) , basée sur la détection par résonance plasmonique de surface, a été utilisée. Dans cette technique, le peptide CD4M33 de la présente invention biotinylé (préparé comme dans l'exemple 1) a été fixé de façon spécifique sur la matrice de dextran carboxylé d'une puce qui a été prégreffée avec de la streptavidine. Des solutions de différentes protéines recombinantes gpl20
(gpl20κxB2/ gpl20BA et gpl20JRFL) ont été ensuite injectées sur cette matrice et un signal indiquant une association spécifique et de haute affinité a été alors détecté. La figure 3 montre l'évolution du signal de résonance plasmonique en fonction du temps, après interaction de la protéine gpl 0κχB2 (à des concentrations différentes) avec le peptide CD4M33 de la présente invention. Après régression non-linéaire des courbes d'association et de dissociation obtenues, on obtient une constante de dissociation KD de 2.4.10"9 M pour la protéine virale gpl20κxB2 de 7.4.10"9 M pour la protéine virale gpl20BA et de 8.5.10"9 M pour la protéine virale gpl20RF - Ces valeurs sont comparables à la valeur de KD=l,9xlO"8 M, reportée dans la littérature [34] pour l'interaction CD4-gpl20. La même technique basée sur la détection par résonance plasmonique de surface a été aussi utilisée pour vérifier si le peptide de la présente invention CD4M33 pouvait fixer l'enveloppe virale dans sa forme native. Pour ce faire, une suspension de particules virales inactivées par l'adrithiol-2 [35] a été injectée sur la même puce, greffé avec les anticorps 48d et CG10. Un signal d'interaction spécifique et de haute affinité a été alors clairement détecté, dans le cas où la suspension était incubée avec le peptide de la présente invention CD4M33, mais pas dans le cas où la suspension virale était incubée avec le peptide CD4M9, beaucoup moins actif, ou en absence du peptide (figure 4) .
La figure 4 montre que la présence du peptide CD4M33 est essentielle pour l'interaction de l'enveloppe virale avec les anticorps 48d et CG10, spécifiques de l'enveloppe virale, et que le VIH-1 ne se fixe pas aux anticorps en son absence : il s'agit d'une démonstration indirecte de la fixation du peptide CD4M33 à l'enveloppe virale du VIH-1.
Ces expériences démontrent que le peptide de la présente invention CD4M33 marqué ou non possède une capacité à fixer l'enveloppe virale VIH tant dans sa forme recombinante isolée et purifiée que dans sa forme native présente à la surface du virus .
EXEMPLE 7 ; INHIBITION DE L'INFECTION PAR LE VIRUS DU SIDA
Afin d'évaluer la capacité antivirale des peptides de la présente invention, les inventeurs ont conduit des expériences d'infection, par le virus VIH-ILAI et par l'isolât chimique VIH-1LEK/ de cultures primaires de cellules mononucléoses du sang périphérique (CMSP) humaines. Dans toutes les expériences, les effets des nouvelles molécules ont été comparés à ceux de l'AZT. Le virus VIH-ILAI a été ajouté à des différentes doses virales (10-100 TCID50, Tableau 2) en présence de concentrations variables de CD4M30, CD4M33, CD4M35 et du SAH-CD4. Le virus VIH-1LEN a été ajouté à TCID50 (tableau 4) en présence de CD4M33. Des tests de toxicité de mimétiques du CD4 ont été aussi effectués sur les mêmes cellules.
A. TOXICITE DES MIMETIQUES CD4. Aux doses testées, aucun des composés, AZT, SAH-CD4 ou mimétiques anti- CD4, n'a diminué la viabilité des CMSP activées par la PHA-P.
B. ACTIVITE ANTI-VIH-lLAι DES MIMETIQUES CD4. b.l. Réplication de la souche VIH-I AI dans les CMSP. La souche VIH-I A réplique à haut niveau dans les CMSP activées par la PHA-P. Le pic de réplication virale est au jour 7 de la culture, et les effets des peptides CD4M30, CD4M33 et CD4M35 ont été quantifiés à ce temps post-infection. b.2. Effets de l'AZT sur la réplication de la souche VIH-ILAI dans les CMSP. L'AZT inhibe fortement la réplication de la souche VIH-ILAI dans les CMSP activées par la PHA-P (Tableau 2) . La DE50 est égale à 3-14 nM. b.3. Effets du composé SAH-CD4 sur la réplication de la souche VIH-ILAI dans les CMSP. L'activité antirétrovirale du composé SAH-CD4 vis-à-vis des CMSP activées par la PHA-P et infectées par la souche VIH-ILAI se traduit par une inhibition de 85+15% de la réplication virale à la concentration de 2,5 μM. b.4. Effets des mimétiques CD4 sur la réplication de la souche VIH-ILAI dans les CMSP. Les peptides de la présente invention CD4M30, CD4M33 et CD4M35 ont démontré une activité anti-rétrovirale (Tableau 3) dans les cultures de CMSP activées par la PHA-P et infectées par la souche VIH-ILAI. Le composé CD4M33 est le plus antiviral des trois aux différentes doses virales testées. Son activité est plus faible de celle de l'AZT : DE50 = 100-500 nM vs . AZT : DE50 = 3 nM (tableau 3 ci-dessous), mais elle est supérieure d'au moins 1 logarithme de base 10 à celle du dérivé du récepteur CD4, SAH-CD4. Les figures 5A-C regroupent les résultats obtenus : pourcentage d'inhibition (%I) en fonction de la concentration en peptide en nM. C. ACTIVITE ANTIRETROVIRALE DU COMPOSE CD4M33 VIS-A-VIS DE L'ISOLAT CLINIQUE VIH-1LEN cl. Effets de l'AZT sur la réplication de l'isolât VIH- ILEN dans les CMSP. L'AZT inhibe fortement la réplication de la souche VIH-1LEN dans les CMSP activées par la PHA-P et infectées par l'isolât VIH-1LEN/ avec une DE50 égale à 2 , 2 nM (tableau 4) . Le degré d'inhibition est identique à celui observé vis-à-vis de la souche de référence à tropisme lymphocytaire VIH- ILAI- c2. Effets du mimétique CD4M33 sur la réplication de l'isolât clinique VIH-1LEN dans les CMSP. L'activité rétrovirale du mimétique CD4M33 vis-à-vis des CMSP activées par la PHA-P et infectées par l'isolât VIH-1LEN se traduit par une diminution dose dépendante de la réplication virale et une DE50 égale à 367 nM (tableau 4) . Le mimétique CD4M33 conserve donc une activité anti-VIH-1 significative, même si elle s'avère légèrement plus faible par rapport à celle observée avec la souche VIH-ILAI.
Ces expériences démontrent que ces peptides de la présente invention sont capables d'inhiber l'infection des cellules, même à des doses virales élevées, avec des valeurs de DE50 de 900-35 nM (Tableau 3 ci-dessous) . Le peptide de la présente invention CD4M33 est le plus antiviral et son DE50 est d'environ 100 nM pour les doses virales standards d'infection (Fig. 4 a-c, Tableau 3 ci-dessous) .
En outre, le peptide CD4M33 est doté d'une activité antirétrovirale supérieure à 1 logarithme de base 10 à celle observée avec un autre dérivé du récepteur CD4, le SAH-CD4, et surtout a montré une activité anti-VIH significative vis-à-vis d'un isolât clinique (tableau 4) .
En conclusion, le peptide de la présente invention CD4M33, qui est capable de se fixer sur la protéine virale gpl20 recombinante avec une Kd de 2.4-8.0 nM (expériences de résonance plasmonique de surface) et d'inhiber l'interaction entre les protéines recombinantes CD4-gpl20 en ELISA, avec une CI50 de 120-250 pM, présente aussi la capacité d'inhiber cette interaction dans des cultures primaires de cellules humaines, d'inhiber l'étape initiale de l'entrée et donc de bloquer l'infection même d'un isolât clinique VIH-1.
Tableau 2
Effet de l'AZT sur la réplication de la souche VIH-ILAI dans les CMSP activées par la PHA-P. Les résultats sont exprimés en pourcentages d'inhibition + écart-type :
Figure imgf000054_0001
Tableau 3
Doses effectives 50% (DE50) des peptides de la présente invention et de l'AZT dans des cultures de cellules mononucléoses du sang périphérique (CMSP) humaines, activées par la phytohémagglutinine-P (PHA-P) et infectées par la souche VIH-ILAI à des différentes doses infectieuses (TCID50) : 50% Tissue Culture Infectious
Dose) :
Figure imgf000055_0001
Tableau 4
Effet de l'AZT et du mimétique CD4M33 sur la réplication de l'isolât clinique VIH-1LEN dans les cultures de cellules mononucléoses du sang périphérique
(CMSP) humaines, activées par la phytohémoagglutinine-P
(PHA-P) . Les cellules ont été infectées par 50 TCID50 de virus :
Figure imgf000055_0002
EXEMPLE 8 : EXPOSITION DE SITES ANTIGENIQUES DE L'ENVELOPPE.
Afin d'évaluer la capacité du peptide de la présente " invention CD4M33 à induire des variations conformationnelles dans la protéine gpl20, caractérisée par l'exposition d'épitopes sensibles à des anticorps neutralisants, l'interaction de tels anticorps humains 48d et CG10 avec l'enveloppe VIH en présence du CD4M33 et, par comparaison, du CD4 recombinant, a été entreprise, en utilisant la technique de résonance plasmonique de surface. Les anticorps 48d et CG10 ont été fixés covalement à la surface des puces (bio-chip) , puis des solutions de gpl20, en absence de CD4 et en présence d'un excès de CD4 et de CD4M33 ont été injectées. Lorsque le CD4M33 est ajouté à la protéine virale gpl20κB2/ avec un excès molaire de 1.5 et 20 fois, la protéine virale manifeste une forte interaction avec les anticorps (Figures 6a-b) ; par contre, en son absence (et en absence de CD4 soluble) la protéine de l'enveloppe interagit avec les anticorps très faiblement (Fig. 6a-b) . En outre, l'effet de l'ajout de CD4M33 sur l'augmentation de l'affinité d'interaction de la protéine virale gpl20 pour les anticorps est comparable à celui qui est obtenu par ajout de quantités équivalentes de CD4 soluble.
Les inventeurs ont conduit aussi des expériences similaires de résonance plasmonique en utilisant directement le VIH-1, souche HXB2. La figure 4 montre les résultats obtenus dans ces expériences et démontre l'évolution du signal de résonance plasmonique en fonction du temps après interaction d'une suspension de particules virales VIH-1HXB2 avec une puce présentant les anticorps 48d et CG10 immobilisés : le VIH-1 interagit avec les anticorps seulement après incubation avec le peptide CD4M33 de la présente invention et, par contre, en son absence ou en présence du peptide [Ala23]CD4M9 inactif, l'interaction est pratiquement nulle.
La technique de résonance plasmonique de surface a donc permis de démontrer que la liaison du CD4M33 à la protéine de l'enveloppe gpl20 est capable d'induire une modification de la protéine virale, qui, par suite, expose de façon préférentielle certaines surfaces moléculaires aux anticorps neutralisants (17b, CG10) , isolés chez des personnes affectées par le VIH-1 [11], [12], [13].
L'exposition de ces épitopes cryptiques, induite par le peptide CD4M33 de la présente invention, est efficace tant dans la protéine de l'enveloppe sous forme recombinante que dans l'enveloppe des virions. De plus, aux vues des expériences récentes qui montrent que la protéine gpl20 complexée au CD4 peut être une forme moléculaire capable d'induire la formation d'anticorps neutralisants [31, 32, 33] le complexe CD4M33-gpl20 représente donc un candidat très intéressant en tant qu' immunogène pour l'induction d'anticorps neutralisants, notamment dans une application vaccinale.
Le CD4M33 possède la propriété de démasquer des épitopes de la protéine virale gpl20, comme le fait le CD4 soluble, avec l'avantage qu'il ne pourra pas induire de réponse immune contre le CD4 et que, de plus, en raison de sa petite taille, il permettra un accès encore plus favorable aux épitopes démasqués de la protéine virale gpl20.
EXEMPLE 9 ; CRIBLAGE
A) MATERIEL ET METHODES. LE MATERIEL
Le matériel utilisé pour les mesures est celui décrit dans les documents référencés [41] , [42] et [43], ainsi que dans le brevet US 5,756,292.
LES PEPTIDES
Des peptides de la présente invention, marqués ou non-marqués, sous forme de 50 μg lyophilisé (poudre) ont été solubilisés en ajoutant dans un Eppendorf (marque de commerce) contenant la poudre, 50 μl d'un tampon potassium phosphate, 10 mM, 100 mM KC1, pH 7,0 afin d'obtenir une solution concentrée à entre 300 et 750 μM. Le marquage est réalisé avec de la fluoresceine (F) ou avec de la rhodamine green (R) .
Deux autres solutions, des dilutions 1:10 et 1:100 des solutions précitées, ont été préparées avec le même tampon. Ces peptides marqués sont utilisés d'abord dans des expériences de liaison à la Gpl20 pour déterminer leur affinité et ensuite sont utilisés en tant que traceurs, dans des expériences de criblage par compétition de l'interaction de ces peptides avec la protéine virale gpl20. Le sCD4 (CD4 soluble) utilisé est une protéine recombinante produite dans le système d'expression
Baculovirus par Intracell (marque de commerce) commercialisé en France par Neosystem Laboratoire (Strasbourg, France) .
LES PROTEINES VIRALES GP120
Les protéines virales gpl20 ont été préparées sous forme de solutions à une concentration -1 mg/ml .
LES TITRAGES DIRECTS
Les titrages ont été réalisés en sens "inverse" . D'abord, 4 ml d'une solution de peptide de la présente invention, marqué et à une concentration de 6 nM dans le tampon phosphate cité ci-dessus a été préparée. Ensuite, 200 μm d'une solution contenant 10 μl de gpl20 à une concentration de 0,421 μM, 4 μl de peptide de la présente invention marqué à la fluoresceine et à une concentration de 6 nM, et 186 μl de tampon a été préparée.
Toutes les mesures d' anisotropie ont été effectuées à l'aide d'un Beacon 2000 polarimeter
(marque de commerce) (Société Panvera Corp., Madison I) avec le jeu de filtres correspondant à la fluoresceine.
L' anisotropie de 200 μl de la solution de peptide marqué seul a d 'abord été testée. Suivant la sonde utilisée sur le peptide et les réglages de l'appareil, en particulier le gain, 1 ' anisotropie du peptide de la présente invention marqué seul varie entre 80 et 110 unités de millianisotropie. Ensuite, 1 ' anisotropie du tube contenant le peptide marqué et le gpl20 à 410 nM a été mesurée.
Généralement, la valeur du peptide marqué en présence de cette forte concentration de gpl20 était de l'ordre de 200 millianisotropie.
Le titrage a été effectué en faisant des prélèvements de 40 μl de la solution et ensuite des additions de 40 μl de la solution de peptide marqué seul à 6 nM. De cette façon, le gpl20 a été dilué, par une valeur de 0,1 unité log par dilution, tout en gardant constante la concentration de peptide marqué. Ce protocole de titrage à l'envers utilise le moins de gpl20 possible.
Les mesures d' anisotropie ont été enregistrées jusqu'à la stabilisation du signal. Dans le cas de cette interaction, la stabilisation est relativement longue, puisqu'elle dure plus de 20 minutes pour le premier point, mais ensuite les points de dilution s'équilibrent plus vite, en 2 à 4 minutes. Tous les titrages ont été effectués à 21°C, dans un porte-échantillon thermostaté du Beacon 2000 (marque de commerce) .
Les peptides marqués ont montré une tendance à se coller aux parois des récipients. Plusieurs solutions de dilution ont donc été réalisées afin d'éviter une diminution progressive de la concentration de peptide marqué .
LES COMPETITIONS Pour les tests de compétition, des simulations de la compétition du peptide CD4M33 marqué avec de la fluoresceine (CD4M33-F) avec le peptide CD4M33 non- marqué ont été réalisées. Les résultats de ces simulations sont présentés sur la figure 13 annexée.
Ces simulations ont montré que les conditions idéales pour la compétition seraient 20mM de Gpl20 et 6 nM de peptide marqué.
La compétition a alors été effectuée entre 10 et 100 nM de peptide CD4M33 non-marqué.
Les compétitions ont été effectuées expérimentalement en ajoutant à 200 μl d'une solution 6 nM de peptide CD4M33-F et 20 nM gpl20 des aliquotes de 1 μl de peptide CD4M33 compétiteur non marqué dans le tampon phosphate ci-dessus afin de couvrir des concentrations entre 10 et 100 nM. Les valeurs d' anisotropies ont ensuite été mesurées après chaque addition.
Les courbes résultantes de ces compétitions ont été analysées pour déterminer le Kd de 1 ' interaction entre le compétiteur et le gpl20 en gardant fixé le Kd entre le peptide CD4M33-F et le gpl20.
Les analyses et les simulations ont été effectuées en utilisant le programme « BIOESQ » décrit dans les documents [41] , [42] et [43] .
B) RESULTATS.
1) MESURES D'AFFINITES AVEC DIFFERENTS PEPTIDES DE LA PRESENTE INVENTION POUR UNE PROTEINE GP120
Le principe du criblage par le procédé de la présente invention est démontré sur les Figures 8a) , 8b) et 8c) annexées. Pour obtenir les résultats exposés sur ces figures, un peptide de la présente invention marqué par la rhodamine green, dénommé K16-R, en solution à une concentration de 6 nM a été titré par une solution de gpl20 de souche HXB2.
Sur la figure 8a), la préparation de gpl20 s'est avérée un peu moins active que celle utilisée sur la Figure 8b) . En effet, dans le premier cas (I K16/GP120) ) , l'affinité (Kd) extraite de l'analyse des données selon un modèle de fixation simple, c'est à dire une molécule de gpl20 fixant une molécule de peptide de la présente invention marqué, était de 176 nM, alors que dans le deuxième cas (II K16/GP120) , représenté sur la Figure 8b), l'affinité était de 46 nM.
Une troisième préparation a donc été réalisée (III K16/GP120) . Les mesures effectuées sur cette préparation sont représentées sur la Figure 8c) . Dans ce cas l'affinité (Kd) mesurée est de 97nM. Trois autres peptides marqués, le CD4M33, le CD4K15 et le CD4M9, ont été testés pour leur interaction avec le gpl20 HXB2. Les résultats de ces tests sont représentés sur les figures 9, 10 et 11. Leur affinité pour la protéine virale gpl20 était respectivement de 14 nM, 195 nM, et 323 nM. 2) MESURES D'AFFINITES EFFECTUEES AVEC UN PEPTIDE DE LA PRESENTE INVENTION POUR DIFFERENTES PROTEINES VIRALES GP120
Les affinités du peptide CD4M33 pour des protéines gpl20 issues de différentes souches du virus : HXB2 et SF2, ont également été déterminées.
Elles sont représentées sur les figures 12 a) et 12b) .
L'affinité de 8nM pour le gpl20 HXB2 est très proche de la valeur déterminée à partir des résultats exposés sur la Figure 9, c'est à dire 14 nM.
En revanche, la préparation de gpl20 SF2 présentait une affinité plus forte pour le peptide CD4M33, de l'ordre de 1 nM.
3) DEPLACEMENT D'UN PEPTIDE MARQUE DE LA PRESENTE INVENTION FIXE A LA PROTEINE VIRALE gpl20 PAR UN PEPTIDE NON MARQUE
Un déplacement d'un peptide marqué ayant une affinité déterminée, représenté par le peptide CD4M33, par un peptide CD4M33 non marqué a été réalisé pour simuler un criblage selon le procédé de la présente invention. Les résultats de cet exemple sont représentés sur la figure 13. Ces résultats montrent qu'une concentration de 20 nM de gpl20 permet une fixation avoisinant 50%, et donc une anisotropie de départ relativement élevée d'environ 180 millianisotropie.
Il est à noter que le grand changement d' anisotropie observé lors de la fixation des peptides de la présente invention marqués par le gpl20, ΔA -180 millianisotropie, confère une grande gamme dynamique à cette mesure, et permet un rapport signal bruit très élevé. Ainsi, avec une déviation standard de 2 unités de millianisotropie dans les mesures, il est possible de détecter des changements de 2% dans la quantité fixée.
En conséquence, une compétition avec une molécule d'une même affinité que le CD4M33 résulte en 100% de déplacement avec une concentration du compétiteur avoisinant 100 nM.
Les inventeurs ont donc utilisé la compétition du CD4M33 marqué avec d'autres peptides de la présente invention non-marqués afin de déterminer l'affinité de ces derniers pour le gpl20 HXB2. Les résultats de ces compétitions sont regroupés sur les Figures 14a) a i)
Une compétition du CD4M33 marqué avec un CD4M33 non marqué a d'abord été réalisée pour déterminer si le marquage perturbe l'affinité pour le gpl20. En fixation directe, représentée sur les figures
10 et 11, l'affinité du CD4M33 marqué pour le gpl20 HXB2 était de 11+3 nM.
L'analyse des données de compétition a été réalisée en fixant la valeur de l'affinité du CD4M33 marqué à sa valeur de 11 nM et en laissant évoluer la valeur de l'affinité du compétiteur, en l'occurrence le peptide CD4M33 non marqué. La valeur de l'affinité correspondante à la ligne traversant les points dans la Figure 14a) était de 14 nM. Il a donc été conclu que le marquage du CD4m33 n'affecte pas son affinité pour le gpl20. Ensuite sept autres peptides non marqués de la présente invention ainsi que le domaine soluble du CD4 humain (sCD4) ont été testés. Les résultats de ces tests sont représentés sur les Figures 14b) à 14i) . Leur affinité diffère par un facteur 40. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 5 ci-dessous.
Il est à noter que l'affinité du peptide CD4M9 pour la protéine virale gpl20 obtenue par compétition,
Kd=359 nM, est la même, en tenant compte des erreurs de mesure estimées à ~10%, que celle trouvée par titrage directe du CD4M9 marqué (Kd=323 nM) .
Etant donné que les molécules criblées ne sont pas observées directement, mais en compétition avec le peptide marqué de la présente invention, ce test de criblage peut mettre en évidence n'importe quelle molécule, quelque soit sa structure chimique, qui se fixerait sur le gpl20 de façon compétitive avec ce peptide.
Tableau I :
Figure imgf000066_0001
Les peptides de la présente invention représentent donc des inhibiteurs in vitro de l'infection par le virus du sida, notamment le VIH-I.
Le procédé de criblage de la présente invention qui utilise l' anisotropie de fluorescence d'un peptide marqué de la présente invention, constitue en conséquence un nouvel outil de criblage de molécules candidates pour la fabrication de médicaments pour traiter le SIDA.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de criblage de molécules capables de se lier avec une affinité déterminée à la protéine gpl20 du virus de 1 ' immunodéficience, ledit procédé incluant au moins un cycle de criblage comprenant les étapes suivantes : a) marquage covalent avec une sonde fluorescente d'un peptide ayant ladite affinité déterminée pour la protéine gpl20, ledit peptide comprenant la séquence (A) suivante :
TPA - P1- Cys - P2 - Cys - P3 - Cys - Ala ou Gin - Gly ou (D)Asp ou Ser - Ser ou His ou Asn - XaaJ - Cys - Thr ou Ala - Cys- Xaak - NH2 dans laquelle TPA représente l'acide thiopropionique, XaaJ représente la β-napthylalanine, la phenylalanine ou la bi-phenylalanine, Xaa représente Gly, Val ou lieu, P1 représente 3 à 6 acides aminés, P2 représente 2 à 4 acides aminés et P3 représente 6 à 10 acides aminés, les acides aminés dans P1., P2 et P3 étant naturels ou non naturels, identiques ou différents et P1, P2 et P3 ayant ou non une séquence commune, ledit peptide présentant une conformation en épingle à cheveux β dont le coude β est formé par les résidus acides aminés Ala ou Gin - Gly ou DAsp ou Ser-Ser ou His ou Asn- Xaaj de sa séquence (A) , b) mise en présence du peptide marqué avec la protéine gpl20, à une concentration de gpl20 qui permet entre 20 et 50% de fixation du peptide marqué, de manière à former un complexe réversible [peptide marqué-gpl20] , c) mesure étalon de la polarisation de fluorescence du complexe [peptide marqué-gpl20] , d) essai de criblage par mise en compétition du complexe [peptide marqué-gpl20] formé avec au moins une molécule candidate, susceptible de se lier à la protéine gpl20, à une concentration déterminée de ladite ou desdites molécule (s) et dans des conditions physicochimiques rendant possible la compétition entre ladite molécule et le peptide marqué pour former éventuellement un complexe avec la protéine gpl20, e) mesure de la polarisation de fluorescence émise par l'essai de criblage, et f) comparaison de la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) avec la mesure étalon de l'étape c) , la ou une des molécule (s) candidate (s) étant considérée comme une molécule capable de se lier à la protéine Gpl20 lorsque la mesure de polarisation de fluorescence de l'étape e) est inférieure à la mesure étalon de l'étape c) .
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séquence (A) peut comprendre en outre un résidu proline lié au résidu Xaak.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séquence est choisie parmi les séquences ID n°4, ID n°5, ID n°6, ID n°7, ID n°8, ID n°9, ID n° 10, ID n°ll, ID n°12, ID n°13, ID n°14, ID n°15, ID n°16, ID n°17, ID n°18, ID n°19 et ID n°20 de la liste de séquence annexée .
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la sonde fluorescente est un fluorophore ayant des propriétés d'absorption dans le visible.
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