WO2002094980A2 - Phytocystatine - Google Patents

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WO2002094980A2
WO2002094980A2 PCT/FR2002/001680 FR0201680W WO02094980A2 WO 2002094980 A2 WO2002094980 A2 WO 2002094980A2 FR 0201680 W FR0201680 W FR 0201680W WO 02094980 A2 WO02094980 A2 WO 02094980A2
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nucleic
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Inventor
Zuily-Fodil
Monique Gareil
Original Assignee
Universite Paris 7 - Denis Diderot
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a new cystatin from Vigna unguiculata (Cystavine), as well as to its applications in pharmacy, cosmetics and agronomy, in particular for plant transgenesis, for the production of plants resistant to certain stresses, including Drought.
  • Cystatin is used to refer to inhibitors of cysteine proteinases. Cystatins are very potent and reversible inhibitors of proteinases from the class of cysteine proteinases ("papain-like"). These endoproteases are characterized by the presence of a cysteine residue at the active site.
  • Cysteine proteinases include papain, cathepsins B, H, L, hepatitis viral proteinase A, cysteine proteinases (some caspases) involved in programmed cell death: apoptosis, and cysteine proteinases from plants, some of which are also involved in apoptosis.
  • cystatins Their inhibitors, cystatins, constitute a superfamily which includes several families: stefines, cystatines, kininogens, cathelines (cat L) and phytocystatins (Turk and Bode, 1991).
  • Stefines are made up of a simple chain whose molecular mass is around 11 kDa, they do not have disulforated bridges and are not glycosylated.
  • the cystatins proper are characterized by the presence of two disulforated bridges at the C terminal, a size of approximately 110 - 115 amino acids and a molecular mass of approximately 13 kDa. Mention is made, for example, of human cystatin C and egg white cystatin.
  • Kininogens have a molecular mass between 68 and 120 kDa in a single protein chain. They strongly inhibit papain and Cat L and weakly inhibit Cat B and H. Their papain inhibitory properties make them multi-functional inhibitors. they contain several (often three) "cystatin-like" domains with different substrates. Their sequence has regions sensitive to proteases and in particular to aspartic proteinase (cathepsin D).
  • cystatinogens would come from cystatins by triplication of the gene. Because of their protease inhibiting potential, cystatins are potentially very interesting for various applications involving proteases, and in particular for therapeutic applications in the field of diseases linked to inflammatory phenomena. Certain cosmetic applications can also be envisaged for these proteins.
  • the present invention relates to a new cystatin, from the species Vigna inguiculata, as well as the corresponding recombinant protein.
  • This new cystatin appears to be a double stefin.
  • the isolation of this protein was carried out using a model of resistance to water stress in this plant species. Obtaining a new cystatin therefore proves to be advantageous for pharmaceutical and cosmetic applications.
  • the mode of isolation of the protein makes it possible to predict applications of this protein in plant transgenesis, in order to improve the resistance of plants to drought.
  • cystatins can also be useful in the fight against viruses and insects by the transgenic plants containing them.
  • the subject of the present invention is a purified or isolated nucleic acid, characterized in that it comprises a nucleic sequence chosen from the group of following sequences: a) SEQ ID No. 1; b) the sequence of a fragment of at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID No. 1; c) a nucleic sequence having an identity percentage of at least 80%, after optimal alignment with a sequence defined in a) or b); d) a nucleic sequence hybridizing under conditions of high stringency with a nucleic sequence defined in a) or b); e) the complementary sequence or the RNA sequence corresponding to a sequence as defined in a), b), c) or d).
  • a nucleic sequence chosen from the group of following sequences: a) SEQ ID No. 1; b) the sequence of a fragment of at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID No. 1; c) a nucleic sequence having an identity percentage of at least 80%, after optimal alignment with
  • the nucleic acid sequence according to the invention defined in c) has a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b) above, preferably 90%, more preferably 95%, most preferably 98%, or 99%.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • the nucleic acid sequences according to the invention also include PNA (Peptid Nucleic Acid), or the like.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment that is to say in the natural state.
  • sequences which have been isolated and / or purified that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified.
  • This also means the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
  • sequences according to the invention code for a protein or a polypeptide having an activity of inhibiting papain, and / or caspases, in particular caspase 3, and or calpain, and / or any other cysteine vegetable proteinase.
  • the fragment according to the invention contains at least 15, 25, 50, 75, 100, 150,
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" for identify and compare local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be carried out, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and aterman (1981), by means of the local homology algorithm of Neddleman and unsch (1970). , using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group , 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared can include additions or deletions by compared to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, more preferably 98%, after optimal alignment with a reference sequence is meant the nucleic acid sequences having, with respect to the sequence reference nucleic acid, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular point, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably 90%, more preferred 98%, of identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the sequences SEQ ID No. 1 of the invention.
  • the specific hybridization conditions or high stringency will be such that they provide at least 80%, preferably 90%, of more preferably 98% identity after optimal alignment between one of the two sequences and the complementary sequence of the other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization overnight at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C., for a probe of size> 100 nucleotides) possibly followed by non-stringent washes and 2 stringent washes of 15 minutes at 42 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the conditions of high stringency hybridization described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according
  • variant nucleic sequences are also preferred. of SEQ ID N ° 1, or of its fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequence SEQ ID N ° 1.
  • SEQ ID N ° 1 or of its fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequence SEQ ID N ° 1.
  • the present invention relates to the variant nucleic acid sequences in which the mutations lead to a modification of the amino acid sequence of the polypeptide, or of its fragments, encoded by the normal sequence of SEQ ID No. 1. It is also intended to denote by variant nucleic sequence any RNA or cDNA resulting from a mutation and / or variation of a splicing site of the genomic nucleic sequence of which the cDNA has the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention preferably relates to a purified or isolated nucleic acid according to the present invention, characterized in that it comprises or consists of the sequence SEQ ID No. 1, its complementary sequence or the sequence of the RNA corresponding to SEQ ID N ° 1.
  • the invention also relates to a purified or isolated nucleic acid characterized in that it codes for a polypeptide having a continuous fragment of at least 50, 75, more preferably 100, 150, most preferably 175 amino acids of the protein SEQ ID No. 2, and having an activity of inhibiting papain, and / or caspases, in particular caspase 3, and / or calpain and / or any other vegetable cysteine proteinase.
  • the fragments of SEQ ID N ° 1 which prefer the active sites located at amino acids 53 to 57 or 148 to 152 of SEQ ID N ° 2 are preferred.
  • a putative site of cleavage by an aspartic proteinase has also been identified. amino acids 91 to 94 of SEQ ID No 2.
  • certain preferred polypeptides in the present invention consist of polypeptides 1-90, or 95-195 of SEQ ID No 2. These two fragments indeed contain an active site of inhibition of cysteine proteinases. The existence of these two sites, and of two polypeptide fragments in Cystavine therefore makes it possible to define this protein as a double stefine.
  • the primers or probes characterized in that they comprise a sequence of a nucleic acid according to the invention, also form part of the invention.
  • the present invention also relates to the primers or probes according to the invention which can make it possible in particular to demonstrate or discriminate the variant nucleic sequences, or to identify the genomic sequence of genes whose cDNA is represented by SEQ ID No. 1, using in particular an amplification method such as the PCR method, or a related method.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention as probe or primer, for the detection, identification, assay or amplification of nucleic acid sequence.
  • the polynucleotides which can be used as a probe or as a primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence have a minimum size of 15 bases, preferably 20 bases, or better from 25 to 30 bases.
  • the probes and primers according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe or primer.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens , dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (Rolfs et al., 1991).
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, and then sequenced.
  • the specificity of the amplification can be controlled by using as primers the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention and as templates, plasmids containing these sequences or even the amplification products derived from them.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a sample biological, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as an alternative to PCR (PCR-like) using pairs of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • PCR-like is meant to denote all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • the target polynucleotide to be detected is an mRNA
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • the probe hybridization technique can be performed in various ways (Matthews et al., 1988).
  • the most general method is to immobilize the acid nucleic acid extracted from cells of different tissues or from cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and to incubate, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • the antisense oligonucleotides that is to say those whose structure ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product.
  • Such oligonucleotides can be used as therapeutic products and medicaments to regulate the phenomena of inflammation and tumor repression.
  • the use of its sense or antisense sequences can also be implemented in vitro, to define new means of model and study of resistance to stress, in particular water resistance.
  • the present invention also relates to an isolated polypeptide characterized in that it comprises a polypeptide chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2; b) a fragment of at least 5 consecutive amino acids of a polypeptide defined in a); c) a biologically active fragment of a polypeptide defined in a); d) a polypeptide comprising at least 80% identity with the polypeptide of a), b) or c).
  • polypeptide is meant, within the meaning of the present invention, denote proteins or peptides.
  • a fragment according to the invention preferably has at least 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50 consecutive amino acids of SEQ ID No. 2.
  • biologically active fragment is meant a fragment having the same biological activity as the peptide fragment from which it is deduced, preferably in the same order of magnitude (to within a factor of 10). It preferably has at least 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50 consecutive amino acids of SEQ ID No. 2. In particular, the fragments containing the active sites 53-57 and / or are thus noted.
  • a protein or a polypeptide according to the invention has an activity of inhibiting papain, and / or caspases, in particular caspase 3, and / or calpain and / or any other vegetable cysteine proteinase.
  • a polypeptide according to the invention is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 2 (corresponding to the protein encoded by the Cystavine gene) or of a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2 after optimal alignment.
  • the sequence of the polypeptide has a percentage identity of at least
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, more preferably 98%, after optimal alignment with a reference sequence, is intended to denote the polypeptides having certain modifications with respect to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • the variant polypeptides encoded by the variant nucleic sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose sequence of amino acids has at least one mutation corresponding in particular to a truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one amino acid residue with respect to the sequence SEQ ID No. 2 or with one of its fragments .
  • the invention also includes glycosylated polypeptides.
  • the present invention also relates to the cloning and / or expression vectors comprising a nucleic acid or coding for a polypeptide according to the invention.
  • a vector can also contain the elements necessary for the expression and optionally for the secretion of the polypeptide in a host cell.
  • Such a host cell is also an object of the invention.
  • Such a vector can be replicative or integrative in the host cell.
  • Said vectors preferably comprise a promoter, translation initiation and termination signals, as well as suitable regions for regulating transcription. They must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have specific signals specifying the location and / or the secretion of the translated protein.
  • control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • plasmid or viral type systems are preferably used depending on the host cell, the viral vectors possibly being in particular adenoviruses (Perricaudet et al., 1992), retroviruses, lentiviruses, poxvirus or herpesvirus (Epstein et al.,
  • naked polynucleotides such as naked AD ⁇ or naked AR ⁇ are preferred according to the technique developed by the company VICAL, artificial bacteria chromosomes (BAC, bacterial artificial chromosome), artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, human artificial chromosome ) for expression in human cells.
  • VICAL artificial bacteria chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • MAC mouse artificial chromosomes
  • HAC human artificial chromosome
  • Such vectors are prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example lipofection, electroporation, heat shock, transformation after chemical permeabilization of the membrane, cell fusion.
  • the invention furthermore includes host cells, in particular eukaryotic and prokaryotic cells, transformed by the vectors according to the invention as well as transgenic plants and animals, preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to l 'invention.
  • host cells in particular eukaryotic and prokaryotic cells
  • transgenic plants and animals preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to l 'invention.
  • These animals can be used as models, for the study of the etiology of inflammatory and / or immune diseases, or for the study of cancers.
  • bacterial cells Olins and Lee, 1993
  • yeast cells which can be used within the meaning of the present invention, mention may be made of bacterial cells (Olins and Lee, 1993), but also yeast cells
  • a plant cell of interest is also an algae cell, in particular a microscopic algae cell.
  • mammals according to the invention animals such as rodents, in particular mice, rats or rabbits, which express a polypeptide according to the invention, are preferred.
  • animals such as mice, rats or rabbits are also preferred, characterized in that the gene coding for the protein with sequence SEQ ID No. 2, or whose sequence is coded by homologous gene in these animals, is not functional, is invalidated or has at least one mutation.
  • transgenic animals are obtained for example by homologous recombination on embryonic stem cells, transfer of these stem cells to embryos, selection of the affected chimeras at the level of the reproductive lines, and growth of said chimeras.
  • transgenic animals according to the invention can thus overexpress the gene coding for the protein according to the invention, or express said gene into which a mutation is introduced.
  • transgenic animals can also over-express, under-express the homologous intrinsic gene corresponding to Cystavine. It is even possible that this homologous gene is silenced by a mutation in the genome of these transgenic animals.
  • transgenic animals in particular mice, are obtained for example by transfection of a copy of this gene under the control of a strong promoter of ubiquitous nature, or selective for a type of tissue, or after viral transcription.
  • transgenic animals according to the invention can be made deficient for the gene coding for the polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1
  • the invention also relates to a plant, characterized in that it contains one (or more) recombinant nucleotide sequence (s) according to the invention, integrated (s) stably in its genome, said plant being chosen in particular from rapeseed, tobacco, corn, peas, tomatoes, carrots, wheat, barley, potatoes, soybeans, beans, sunflowers, lettuce, rice, alfalfa, beetroot, vine, cotton, cabbage, or any other gymnosperm or mono or dicotyledone angiosperm.
  • rapeseed tobacco, corn, peas, tomatoes, carrots, wheat, barley, potatoes, soybeans, beans, sunflowers, lettuce, rice, alfalfa, beetroot, vine, cotton, cabbage, or any other gymnosperm or mono or dicotyledone angiosperm.
  • the invention also relates to a plant extract or part of a plant, in particular leaves and / or fruits and / or seeds and / or plant cells, genetically transformed, derived from said plant according to the invention.
  • said nucleotide sequence according to the invention is stably integrated into the genome of said plant, at a locus which is not the natural locus.
  • the recombinant nucleotide sequences according to the invention contain one (or more) sequence (s) coding for a peptide responsible for the addressing of the recombinant polypeptides in a determined compartment of the plant cell, in particular in the endoplasmic reticulum, the apparatus of Golgi, mitochondria, chloroplasts or in storage vacuoles or lysosomal vacuoles, or even outside the cell, in the pectocellulosic wall or in the extracellular space also called apoplasm.
  • the transcription terminators which may be used for the transformation of plant cells in the context of the present invention, there may be mentioned the cauliflower mosaic virus (CaMV) polyA 35S terminator, or the polyA terminator NOS , which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens nopaline strain.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • NOS polyA terminator NOS
  • the transcription promoters capable of being used for the transformation of plant cells in the context of the present invention there may be mentioned - the 35S promoter (P35S), or advantageously the 35S double constitutive promoter (Pd35S) of CaMV, these promoters allowing the expression of the recombinant polypeptides of the invention throughout the plant obtained from cells transformed according to the invention, and are described in the article by Kay et al., (1987, Science, 236, 1299-1302), the PCRU promoter of the radish cruciferin gene allowing the expression of the recombinant polypeptides of the invention only in the seeds (or seeds) of the plant obtained from cells transformed according to the invention, and described in the article by Depigny-This and al., (1992, Plant.
  • the chimeric promoter PSP super-promoter (Ni M et al., 1995) , consisting of the fosion of a triple repetition of a transcriptional activating element of the promoter of the octopine synthase gene of Agrobacterium tumefaciens, of a transcriptional activating element of the promoter of the mannopine synthase gene and of the mannopine synthase promoter of Agrobacterium tumefaciens, - the rice actin promoter followed by the rice actin intron (PAR-IAR) contained in the plasmid pActl-F4 described by McElroy et al.
  • PAR-IAR rice actin intron
  • sequences coding for an addressing peptide used in the context of the present invention can be of plant, human or animal origin, and there may be mentioned: the nucleotide sequence of 69 nucleotides coding for the prepeptide (signal peptide) of 23 amino acids of sporamine A in sweet potatoes, this signal peptide allowing the entry of the recombinant polypeptides of the invention into the secretion system of plant cells transformed according to the invention (namely mainly in the endoplasmic reticulum), the sequence nucleotide of 42 nucleotides coding for the N-terminal propeptide for vacuolar addressing of 14 amino acids of sporamine A in sweet potato, allowing the accumulation of the recombinant polypeptides of the invention in the vacuoles of plant cells transformed according to the invention , or the nucleotide sequence of 111 nucleotides coding for the prepropeptide of 37 amino acids of sporamine A con from the N-terminal part to the C-terminal
  • the cells, plants and mammals according to the invention can be used in a method for producing a polypeptide according to the invention, as described below, and can also serve as an analytical model.
  • the transformed cells, plants or mammals as described above can also be used as models in order to study the interactions between the polypeptides according to the invention, and the chemical or protein compounds, involved directly or indirectly in the activities of the polypeptides according to the invention, this in order to study the different mechanisms and interactions involved.
  • polypeptides according to the invention can in particular be used for the selection of products interacting with the polypeptides according to the invention, in particular the protein of sequence SEQ ID No. 2 or its variants according to the invention, as cofactor, or inhibitor, in particular competitive , or also having an agonist or antagonist activity of the activity of the polypeptides according to the invention.
  • the invention also relates to the use of a cell, a plant, a mammal or a polypeptide according to the invention for the screening of chemical or biochemical compounds which can interact directly or indirectly with the polypeptides according to invention, and / or capable of modulating the expression or activity of these polypeptides.
  • the invention relates to a method of screening for compounds capable of binding to a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, characterized in that it comprises the steps of bringing a polypeptide, of a cell, mammal, plant according to the invention, with a candidate compound and detecting the formation of a complex between said candidate compound and said polypeptide.
  • the invention also relates to screening methods allowing the identification of compounds decreasing or inhibiting the capacity of a polypeptide according to the invention to inhibit the cyteine proteinase activities, and in particular of calpain, of caspases (in particular caspase 3 ) or papain, in which an experimental protocol is used allowing the demonstration of the above-mentioned inhibitory activity, and said activity is examined in the presence or in the absence of the test compound.
  • the invention also relates to a method for screening for compounds capable of interacting in vitro or in vivo with a nucleic acid according to the invention, using a nucleic acid, a cell, a plant or a mammal according to the invention. invention, and by detecting the formation of a complex between the candidate compounds and the nucleic acid according to the invention.
  • the compounds thus selected are also objects of the invention.
  • Such a compound according to the invention can be a compound having a chemical structure (of the small organic molecule type), a lipid, a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid, protein-sugar, peptide-lipid compound, or peptide-sugar, a protein or peptide to which chemical branches have been added.
  • a chemical structure of the small organic molecule type
  • the invention also relates to the use of a compound interacting with a polypeptide or a nucleic acid according to the invention, for the preparation of a medicament intended in particular for the treatment of cancer or of an inflammatory disease, characterized in that it is identified by a method according to the invention.
  • the invention also relates to the use of a compound which decreases or inhibits the ability of Cystavine to inhibit cytein proteinase activities, and in particular calpain, caspases (in particular caspase 3) or papain, for the preparation of a medicament intended in particular for the treatment of cancer or of an inflammatory disease, characterized in that it is identified by a method according to the invention.
  • the medicines envisaged can also be used for the treatment of other diseases, such as those mentioned below.
  • the compounds according to the invention can also be used for the preparation of compositions for cosmetic use.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention for the synthesis of recombinant polypeptides.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form, itself included in the present invention is characterized in that the transformed cells, in particular the cells or plants of the present invention, are cultivated in conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • a most preferred method is the use of E. coli for the production of the recombinant protein.
  • Recombinant polypeptides characterized in that they are capable of being obtained by said production method, also form part of the invention.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • the sequences of the recombinant polypeptides can also be modified in order to improve their solubility, in particular in aqueous solvents.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art. In this case, the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires having a vector and a host cell according to the invention.
  • These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the methods used for the purification of a recombinant polypeptide are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from cell lysates and extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using '' specific monoclonal or polyclonal antibodies, His-Tag, etc.
  • polypeptides according to the present invention can also be obtained by chemical synthesis using one of the many known peptide syntheses, for example the techniques using solid phases (see in particular
  • polypeptides obtained by chemical synthesis and which may contain corresponding unnatural amino acids are also included in the invention.
  • Specific polyclonal antibodies can be obtained from a serum of an animal immunized against the polypeptides according to the invention, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures.
  • Mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are capable of specifically recognizing the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 are particularly preferred.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kohler and Milstein (1975).
  • the antibodies according to the invention are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the invention also relates to methods for the detection and / or purification of a polypeptide according to the invention, characterized in that they use an antibody according to the invention.
  • the invention further comprises purified polypeptides, characterized in that they are obtained by a method according to the invention.
  • the antibodies of the invention in particular monoclonal antibodies, can also be used for the detection of these polypeptides in a biological sample (in particular for ELISA tests or the like).
  • polypeptides according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or one of its variants, for example by immunofluorescence, labeling with 'gold, enzyme immuno-conjugates.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention, normal or mutated, must be observed.
  • Antibodies can be obtained directly from human serum, or from animals immunized with polypeptides according to the invention, then “humanized”.
  • a method of detecting a polypeptide according to the invention in a biological sample comprising the steps of bringing the biological sample into contact with an antibody according to the invention and of demonstrating the antigen-antibody complex formed is also an object of the invention, as well as a kit for implementing such a method.
  • a kit contains in particular: a) a monoclonal or polyclonal antibody according to the invention; b) optionally reagents for the constitution of a medium suitable for the immunological reaction; c) reagents for the detection of the antigen-antibody complex produced during the immunological reaction.
  • the polypeptides or antibodies according to the invention can be used in the treatment of inflammatory diseases, cancers, or to combat the effects of aging in a mammal, in particular in humans.
  • glomerular proteinuria glomerular proteinuria
  • bone resorption metastasis metabolism
  • tumor invasion myocardial infarction (especially tissue damage)
  • Duchenne disease any inflammatory disease or involving inflammatory phenomena (for example ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, granulomatous inflammatory disease, such as Blau syndrome or Crohn's disease), muscular dystrophy, Alzeimer's disease, multiple sclerosis, viral diseases including ocular), degenerative diseases.
  • the polypeptides or antibodies according to the invention can be used as such or in the preparation of a medicament intended for the treatment of the abovementioned diseases.
  • the analysis can be carried out by sequence of all or part of the gene, or by other methods known to those skilled in the art. In particular, methods based on PCR can be used, for example PCR-SSCP which makes it possible to detect point mutations.
  • the invention also relates to a DNA chip containing a sequence according to the invention. Such a chip can be used to perform the analysis of the presence and / or expression of the nucleic acid according to the invention by fixing a probe according to the invention corresponding to one of the sequences SEQ ID N ° 1 on a DNA chip and hybridization on these microplates.
  • a protein chip containing an amino acid sequence according to the invention is also an object of the invention.
  • a protein chip allows the study of interactions between the polypeptides according to the invention and other proteins or chemical compounds, and can thus be useful for the screening of compounds interacting with the polypeptides according to the invention. It is also possible to use the protein chips according to the invention to detect the presence of antibodies directed against the polypetides according to the invention in the serum of patients. It is also possible to use a protein chip containing an antibody according to the invention.
  • the invention also relates to the use of plants, plant extracts or parts of plants according to the invention, and / or polypeptides according to the invention, for the preparation of pharmaceutical, medical, odontological, cosmetic or biotechnological compositions, as well as '' a pharmaceutical, medical, odontological, cosmetic or biotechnological composition, characterized in that it comprises plants, plant extracts, parts of plants or polypeptides according to the invention
  • the invention also relates to a method for detecting and / or assaying and / or isolating a nucleic acid according to the invention in a biological sample, comprising the following steps of bringing a probe into contact with the invention with a biological sample and for detection and / or assay and / or isolation of the hybrid formed between said polynucleotide and the nucleic acid of the biological sample.
  • the agent capable of specifically detecting a nucleic acid coding for the protein Cystavine is advantageously a probe for oligonucleotides according to the invention, which can be formed from DNA, RNA, PNA, modified or not. The modifications may include radioactive or fluorescent labeling, or be due to modifications in the bonds between the bases (phosphorothioates, or methylphosphonates for example). Those skilled in the art know the protocols for isolating a specific DNA sequence.
  • a reagent kit comprising: a) a polynucleotide according to the invention, used as a probe; b) the reagents necessary for the implementation of a hybridization reaction between said probe and the nucleic acid of the biological sample; c) the reagents necessary for the detection and / or the assay of the hybrid formed between said probe and the nucleic acid of the biological sample; which is also an object of the invention.
  • kit can also contain positive or negative controls to ensure the quality of the results obtained.
  • positive or negative controls to ensure the quality of the results obtained.
  • those skilled in the art can also carry out an amplification step using primers chosen from the sequences according to the invention.
  • the invention also relates to a compound characterized in that it is chosen from a) a nucleic acid according to the invention; b) a polypeptide according to the invention; c) a vector according to the invention; d) a cell according to the invention; e) an antibody according to the invention; f) a compound according to the invention, as a medicament, as well as to one of these compounds for the prevention and / or treatment of an inflammatory disease, of cancer, or for combating the effects of aging in a mammal, especially in humans.
  • nucleic acid according to the invention for the production of a transgenic plant having improved properties of resistance to abiotic stresses, in particular water stress, and to biotic stresses such as those induced by viruses and insects, compared to the non-transgenic plant. It is also possible to use the nucleic acid according to the invention to produce transgenic plants which are more resistant to frost, or to extreme conditions of salinity.
  • the nucleic acids according to the invention can also be used to fight against cellular senescence.
  • the nucleic acid according to the invention can be introduced into the plant, either by means of a replicative vector in the cells, or by means of an integrative vector in the genome of the cell.
  • the transgenic plants are as described above.
  • the cystatin according to the invention will be expressed in the leaves of the plant thus transformed.
  • the work of the present invention indicates for the first time that the gene according to the invention is strongly involved in the adaptive response of plants to drought: resistant plants stimulate the expression of the gene coding for cystatin Cystavine which does not this is not the case for sensitive plants.
  • resistant plants stimulate the expression of the gene coding for cystatin Cystavine which does not this is not the case for sensitive plants.
  • Cystavine is therefore involved in cell protection during stress via the modulation of the activity of leaf cysteine proteinases. Consequently, a transgenesis strategy aiming to induce or overexpress the transgene according to the invention via a promoter inducible by stress and specific for the leaves can lead to obtaining plants more resistant to the water stress induced by drought, high temperatures. , frost, salinity, cell senescence, resistance to insects and / or viruses.
  • the studies reported by the present invention show that Cystavine inhibits the activity of caspase.
  • Members of the caspase family are cysteine proteases which exhibit a specific cleavage of aspartate. They play a significant role both in inflammation (Leung et al, 2000, J.
  • Caspase inhibitors are very important tools because they inhibit the induction of apoptosis in various tumor cells (Schlegel et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 1841) and in normal cells (Zaks and al., 1999, J Immunol. 162: 3273-9).
  • the cDNA was characterized after screening for an expression bank of cowpea bean leaf (Vigna unguiculata Vu, Cowpea).
  • the DNA probe necessary for screening was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification using degenerate oligonucleotide primers deduced from two consensus sequences determined by alignment of three published plant cystatin sequences (BLAST) via Infobiogen (SEQ ID N ° 3 and SEQ ID N ° 4).
  • the cDNA was prepared from 2 mg of Vu leaf mRNA (Amersham kit) and then purified (phenol, chloroform, Oncor Appligene). Amplification of the probe was carried out by PCR using the purified cDNA as template, the degenerate primers, the DNA polymerase "Goldstar Red” (Eurogenetec), the corresponding reaction buffer (Eurogenetec), dNTPs (5 mM, Master Mix, Eurogentec). DNA amplification was carried out using a thermocycler (Mastercycler 5330, Eppendorf).
  • the amplified DNAs were separated by electrophoresis (Mupid, Eurogentec) on 1% agarose gel (Promega).
  • a 160 bp probe was amplified, excised from the gel and then purified (QuiaexII, Quiagen).
  • the DNA was cloned into phagemid pBluscriptIISK (Stratagene). Competent bacteria (Epicurian coli XL1 blue, Stratagene) were transformed by the recombinant plasmids. 12 clones were selected on the basis of the size of the insert and then according to the efficiency of their amplification by PCR.
  • the plasmid corresponding to the selected clone was purified (Quia Prep Spin Miniprep kit, Quiagen) and the insert was sequenced.
  • the sequence obtained was found to be characteristic of a portion of vegetable cystatin. After excision of the insert of the plasmid, the probe is therefore available which makes it possible to screen a bank of Vu leaf cDNAs produced in phagemid ⁇ Zip Lox (Gibco BRL), in the laboratory.
  • the probe was labeled with 32 P (Kit Megaprime, Amersham), purified by chromatography (Nick columns, Pharmacia), incubated with the imprints which were autoradiographed (film X OMAT, Kodak). Screening of the library made it possible to select a clone from which (lysis range) the recombinant phage DNA was amplified and introduced into E. coli DH 10B bacteria (Gibco BRL) capable in the recombinant state of transforming ( circularization) phages into plasmids.
  • the recombinant plasmid DNA was extracted from the bacteria and purified (Wizard Plus Midiprep kit, Quiagen) and then sequenced (ESGS).
  • the nucleotide sequence obtained is that of a new cystatin (SEQ ID No. 1). Under these conditions, it was decided to try to obtain the protein in vitro by expression in a heterologous system.
  • Cystavine SEQ ID N ° 2: MATATVTLGGITDVPGAANSVEIANLARFAVDDHNKK QNGVLEFVRVISAKQQVVSGILYYITLEAKDGETKKV YKTKVWVREWLNPKEVQEFNLNTDSAIGTKDGGWVKEKFKFKUKFKQFKYFKUK Q ID H H H
  • the cystatin cDNA was prepared by PCR so as to eliminate the ORF start codon and to insert on both sides two restriction sites, BamHI and
  • the vector is prepared (cut by Sali and BamHI, dephosphorylation by
  • CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Promega and purification
  • T4 DNA ligase USB
  • the recombinant plasmid obtained is subcloned in order to conserve the construction in E. coli (Xll-Blue (Subcloning-Grade competent Cells, Stratagene).
  • the recombinant vector pQE30 is used (after extraction of the Xll Blue bacteria, purification and assay) to transform the E. coli M15 bacteria (QIA expressionist kit, Quiagen).
  • the bacteria are grown in liquid medium (LB medium, ampicillin) and the induction of the expression of cystatin is initiated by adding IPTG (ImM).
  • the bacteria are then collected by centrifugation (JE-21ME, Bekman), the proteins are extracted and analyzed by automatic electrophoresis on acrylamide gel, under denaturing conditions (SDS-PAGE, Phast system, Pharmacia). A very large band was obtained, whose molecular mass corresponds to the mass deduced from the cDNA sequence of putative cystatin.
  • VuCystl cDNA is a candidate transgene for the improvement of plants by transgenesis by a strategy for resistance to drought. Knowing that most of the other abiotic stresses: freezing, salinity, floading, high temperatures, induce water stress at the cellular level, VuCystl is a transgene candidate for the improvement of plants for resistance to these stresses too.
  • this anti-cysteine proteinase must block the hydrolysis reaction which occurs between a vegetable cysteine proteinase, papain (Sigma) and its substrate, azocasein.
  • the reaction medium is as follows: Tris X5 buffer 200 ⁇ l (Tris 0.5M, ⁇ mercaptoethanol 25mM, pH 6.0), azocasein 1% (Sigma), papain 250ng per ⁇ l, (Sigma), purified VuCYSTl 1.17 ⁇ g / ⁇ l, H 2 O qs 500 ⁇ l.
  • the reaction develops at 37 ° C for 15 min then the proteins are precipitated by treatment with 10% trichloroacetic acid for 30 min at 5 ° C.
  • the determination of the released amino acids is carried out by spectrophotometry by measuring the absorbance (A) at ⁇ 34 o nm - The results obtained are as follows:
  • cystatin of Vigna unguiculata Cystavine produced by expression of the cDNA in E. coli is well functional.
  • the test was carried out using the "Caspase-3 Assay Kit colorimetric (Sigma) kit.
  • the substrate used is" Ac-DEVD-pNa "(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp o-pnitrosanilide). Cystavin is used for 24 mg / ml.
  • Cystavine is a caspase inhibitor.
  • the effectiveness of the inhibition depends on the cystatin concentration and on a preincubation between the cysteine proteinase (Caspase) and the inhibitor before the addition of the enzyme substrate.
  • a development is in progress in order to determine the parameters of the inhibition in order to optimize the test

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Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle cystatine issue de Vigna unguiculata (cystavine), ainsi qu'à ses applications dans la pharmacie, la cosmétique et l'agronomie, notamment pour la transgenése végétale, pour la production de plantes résistantes à certains stress dont la sécheresse.

Description

PHYTOCYSTATINE
La présente invention se rapporte à une nouvelle cystatine issue de Vigna unguiculata (Cystavine), ainsi qu'à ses applications dans la pharmacie, la cosmétique et l'agronomie, notamment pour la transgenèse végétale, pour la production de plantes résistantes à certains stress dont la sécheresse.
Le terme générique « Cystatine » est utilisé pour désigner les inhibiteurs des cystéines protéinases. Les cystatines sont des inhibiteurs très puissants et réversibles des protéinases de la classe des cystéines protéinases (« papaïne-like »). Ces endoprotéases sont caractérisées par la présence d'un résidu cystéine au site actif.
Les cystéines protéinases regroupent la papaïne, les cathepsines B, H, L, la protéinase A virale de l'hépatite, les cystéines protéinases (certaines caspases) impliquées dans la mort cellulaire programmée : apoptose, et les cystéines protéinases des plantes dont certaines sont également impliquées dans l' apoptose.
Leurs inhibiteurs, les cystatines, constituent une super-famille qui comprend plusieurs familles : les stefines, les cystatines, les kininogènes, les cathelines (cat L) et les phytocystatines (Turk et Bode, 1991).
Les Stefines sont constituées d'une chaîne simple dont la masse moléculaire est d'environ 11 kDa, elles ne présentent pas de ponts disulfores et ne sont pas glycosylées. On peut nommer les stefine A et B humaine, cystatines α et β de rat, orycystatine I et II de riz.
Les cystatines proprement dites sont caractérisées par la présence de deux ponts disulfores en C terminal, une taille d'environ 110 - 115 acides aminés et une masse moléculaire d'environ 13 kDa. On cite par exemple la Cystatine C humaine et la cystatine de blanc d'oeuf. les Kininogènes ont une masse moléculaire comprise entre 68 et 120 kDa en une seule chaîne protéique. Elles inhibent fortement la papaïne et la Cat L et faiblement les Cat B et H. leur propriété inhibitrice de la papaïne en font des inhibiteurs multi-fonctionnels. ils contiennent plusieurs domaines (souvent trois) « cystatin-like » dont les substrats diffèrent. Leur séquence possède des régions sensibles aux protéases et en particulier à l'aspartic protéinase (cathepsine D). Les kininogènes proviendraient des cystatines par triplication du gène. Du fait de leur potentiel inhibiteur de protéases, les cystatines sont potentiellement très intéressantes pour des applications variées impliquant les protéases, et notamment pour des applications thérapeutiques dans le domaine des maladies liées aux phénomènes inflammatoires. Certaines applications cosmétiques sont également envisageables pour ces protéines.
La présente invention a pour objet une nouvelle cystatine, issue de l'espèce Vigna inguiculata, ainsi que la protéine recombinante correspondante. Cette nouvelle cystatine semble être une stefïne double. L'isolement de cette protéine a été effectué à partir d'un modèle de résistance au stress hydrique chez cette espèce végétale. L'obtention d'une nouvelle cystatine s'avère donc intéressante pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques. De plus, le mode d'isolement de la protéine permet de prévoir des applications de cette protéine dans la transgenèse végétale, afin d'améliorer la résistance de plantes à la sécheresse. Enfin, les cystatines peuvent aussi être utiles dans la lutte contre les virus et insectes par les plantes transgéniques les contenant.
Ainsi, la présente invention a pour objet un acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes : a) SEQ ID N° 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de SEQ ID N° 1 ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ou b) ; e) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d). La séquence d'acides nucléiques selon l'invention définie en c) présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ci-dessus, de préférence 90 %, de façon plus préférée 95 %, de façon la plus préférée 98 %, ou 99 %. Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. II doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
De préférence, les séquences selon l'invention codent pour une protéine ou un polypeptide ayant une activité d'inhibition de la papaïne, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et ou de la calpaïne, et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale. Le fragment selon l'invention contient au moins 15, 25, 50, 75, 100, 150,
200, 300, 500 nucléotides consécutifs de SEQ ID N° 1.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et aterman (1981), au moyen de Palgorith e d'homologie locale de Neddleman et unsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID N° 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre d'illustration, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant une nuit à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie éventuellement de lavages non stringents et de 2 lavages stringents de 15 minutes à 42°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, ou 99 % après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de SEQ ID N° 1, ou de ses fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est- à-dire des variations individuelles de la séquence SEQ ID N° 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie, comme par exemple une dégénérescence cellulaire. De préférence, la présente invention concerne les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence d'acides aminés du polypeptide, ou de ses fragments, codés par la séquence normale de SEQ ID N° 1. On entend également désigner par séquence nucléique variante tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de la séquence nucléique génomique dont l' ADNc a pour séquence SEQ ID N° 1.
L'invention concerne de préférence un acide nucléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID N° 1, de sa séquence complémentaire ou de la séquence de l'ARN correspondant à SEQ ID N° 1.
L'invention concerne également un acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d'au moins 50, 75, de façon plus préférée 100, 150, de façon la plus préférée 175 acides aminés de la protéine SEQ ID N° 2, et présentant une activité d'inhibition de la papaïne, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et/ou de la calpaïne et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale.
De préférence, on préfère les fragments de SEQ ID N° 1 qui comprennent les sites actifs situés aux acides aminés 53 à 57 ou 148 à 152 de SEQ ID N° 2. Un site putatif de coupure par une aspartic protéinase a également été identifié aux acides aminés 91 à 94 de SEQ ID N° 2. Ainsi, certains polypeptides préférés dans la présente invention consistent dans les polypeptides 1-90, ou 95-195 de SEQ ID N° 2. Ces deux fragments contiennent en effet un site actif d'inhibition des cystéine protéinases. L'existence de ces deux sites, et de deux fragments polypeptidiques dans Cystavine permet donc de définir cette protéine comme une stefine double.
Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention. Ainsi, la présente invention concerne également les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique des gènes dont l'ADNc est représenté par SEQ ID N° 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique. Selon l'invention, les polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présentent une taille minimale de 15 bases, de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases. Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le P, le P, le S, le H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en œuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. De tels oligonucléotides peuvent être utilisés en tant que produits thérapeutiques et médicaments pour réguler les phénomènes d'inflammation et de répression tumorale. L'utilisation de ses séquences sens ou antisens peut également être mise en œuvre in vitro, pour définir de nouveaux moyens de modèle et d'étude de la résistance au stress, notamment hydrique.
La présente invention concerne également un polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 ; b) un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a) ; c) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a) ; d) un polypeptide comportant au moins 80 % d'identité avec le polypeptide de a), b) ou c). Par « polypeptide », on entend, au sens de la présente invention, désigner des protéines ou des peptides.
Un fragment selon l'invention présente de préférence au moins 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50 acides aminés consécutifs de SEQ ID N° 2. Par « fragment biologiquement actif », on entend un fragment possédant la même activité biologique que le fragment peptidique dont il est déduit, de préférence dans le même ordre de grandeur (à un facteur 10 près). Il présente de préférence au moins 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50 acides aminés consécutifs de SEQ ID N° 2. On note ainsi notamment les fragments contenant les sites actifs 53-57 et/ou
148-152 de SEQ ID N° 2, ainsi que les fragments contenant les acides aminés 1-90 ou 95-195 de SEQ ID N° 2.
De préférence une protéine ou un polypeptide selon l'invention présente une activité d'inhibition de la papaïne, et/ou des caspases, notamment la caspase 3, et/ou de la calpaïne et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale.
De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 2 (correspondant à la protéine codée par le gène Cystavine) ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N° 2 après alignement optimal. La séquence du polypeptide présente un pourcentage d'identité d'au moins
80 % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N° 2 ou les acides aminés 1-90 ou 95-195 de SEQ ID N° 2, de préférence 90 ou 95 %, de façon plus préférée 98 %, ou 99 %, et a de préférence une activité d'inhibition de la papaïne, et/ou de la caspase 3, et/ou de la calpaïne et/ou de toute autre cystéine protéinase végétale.
Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.
Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2 ou avec l'un de ses fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport à la séquence SEQ ID N° 2 ou avec l'un de ses fragments. L'invention comprend aussi les polypeptides glycosylés.
La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou codant pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion du polypeptide dans une cellule hôte.
Une telle cellule hôte est également un objet de l'invention. Un tel vecteur peut être réplicatif ou intégratif dans la cellule hôte. Les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence de promoteur et/ou de régulateur selon l'invention, font également partie de l'invention.
Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la localisation et/ou la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al.,
1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes. Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAN (Carter, 1993). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADΝ nu ou l'ARΝ nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les végétaux et animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de maladies inflammatoires et/ou immunes, ou pour l'étude de cancers. Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais aussi les cellules de levure
(Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en œuvre des baculovirus (Luckow, 1993). On cite aussi, et de manière préférée, les cellules végétales, notamment les cellules de végétaux monocotylédones ou dycotylédones
(angiospermes) ou gymnospermes. On peut notamment citer les cellules de tabac, bananes, riz, luzerne, alfalfa, manioc, blé, coton, soja, haricot, chou, tomate, mais, pomme de terre, betterave... Il est toutefois plus intéressant de produire la protéine à partir de la plante complète transgénique régénérée à partir de ces cellules végétales. Une cellule végétale présentant un intérêt est aussi une cellule d'algue, notamment d'algue microscopique.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère également des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, caractérisés en ce que le gène codant pour la protéine de séquence SEQ ID N° 2, ou dont la séquence est codée par le gène homologue chez ces animaux, n'est pas fonctionnel, est invalidé ou présente au moins une mutation.
Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent ainsi surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques peuvent aussi surexprimer, sous-exprimer le gène intrinsèque homologue correspondant à Cystavine. Il est même possible que ce gène homologue soit rendu silencieux par une mutation dans le génome de ces animaux transgéniques.
Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.
Alternativement, les animaux transgéniques selon l'invention peuvent être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de la séquence SEQ ID
N° 2, ou son gène homologue, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase (Rohlmann et al., 1996) ou de tout autre système d'inactivation de l'expression de ce gène. L'invention concerne également une plante, caractérisée en ce qu'elle contient une (ou plusieurs) séquence(s) nucléotidique(s) recombinante(s) selon l'invention, intégrée(s) de façon stable dans son génome, ladite plante étant choisies notamment parmi le colza, le tabac, le mais, le pois, la tomate, la carotte, le blé, l'orge, la pomme de terre, le soja, le haricot, le tournesol, la laitue, le riz, la luzerne, la betterave, la vigne, le coton, le chou, ou tout autre gymnosperme ou angiosperme mono ou dicotyledone. L'invention se rapporte également à un extrait de plante ou une partie de plante, notamment feuilles et/ou fruits et/ou semences et/ou cellules de plantes, transformés génétiquement, dérivés de ladite plante selon l'invention. De préférence, ladite séquence nucléotidique selon l'invention est intégrée de façon stable dans le génome de ladite plante, à un locus qui n'est pas le locus naturel.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques recombinantes selon l'invention contiennent une (ou plusieurs) séquence(s) codant pour un peptide responsable de l'adressage des polypeptides recombinants dans un compartiment déterminé de la cellule végétale, notamment dans le réticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, les mitochondries, les chloroplastes ou dans les vacuoles de stockage ou les vacuoles lysosomales, ou bien même à l'extérieur de la cellule, dans la paroi pectocellulosique ou dans l'espace extracellulaire aussi appelé apoplasme.
Parmi les terminateurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.
Parmi les promoteurs de transcription susceptibles d'être utilisés pour la transformation de cellules de plantes dans le cadre de la présente invention, on peut citer - le promoteur 35S (P35S), ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (Pd35S) du CaMV, ces promoteurs permettant l'expression des polypeptides recombinants de l'invention dans l'ensemble de la plante obtenue à partir de cellules transformées selon l'invention, et sont décrits dans l'article de Kay et al., (1987, Science, 236, 1299-1302), le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression des polypeptides recombinants de l'invention uniquement dans les semences (ou graines) de la plante obtenue à partir de cellules transformées selon l'invention, et décrit dans l'article de Depigny-This et al., (1992, Plant. Mol. Biol., 20, 467-479 ), les promoteurs PGEAI et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEAI et GEAI, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993, Mol. Gen. Genêt., 238, 409-418), et permettant une expression spécifique dans les graines, le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995), constitué de la fosion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 décrit par McElroy et al. (1991, Mol Gen Genêt, 231, 150-160), - le promoteur HMGW (High Molecular Weight Glutenine) d'orge (Anderson et al, 1989, T.A.G., 77, 689-700), le promoteur du gène de zéine de mais (Pyzéine) contenu dans le plasmide py63 décrit dans Reina et al. (1990, Nucleic Acid Research, 18, 6426), et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs. L'homme du métier connaît aussi les promoteurs permettant l'expression spécifique des gènes dans les feuilles ou les racines de la plante.
Les séquences codant pour un peptide d'adressage utilisées dans le cadre de la présente invention, peuvent être d'origine végétale, humaine ou animale, et on peut citer: la séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide (peptide signal) de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, ce peptide signal permettant l'entrée des polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées selon l'invention (à savoir principalement dans le réticulum endoplasmique), la séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation des polypeptides recombinants de l'invention dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention, ou la séquence nucléotidique de 111 nucléotides codant pour le prépropeptide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C-terminale des 23 acides aminés du peptide signal susmentionné suivis par les 14 acides aminés du propeptide susmentionné, ce prépropeptide permettant l'entrée de polypeptides recombinants de l'invention dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention (Murakami et al., 1986, Plant Mol. Biol., 7, 343-355 et Matsuoka et al, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838). On peut aussi citer le propeptide carboxyterminal de la lectine d'orge décrit notamment dans les articles de Schroeder et al., 1993 (Plant Physiol., 101, 451- 458), et de Bednarek et al, 1991 (Plant Cell, 3, 1195-1206), et le PRS (Pathogenesis Related Protein, Cornelissen et al. 1986) permettant la sécrétion, ou les séquences codant pour les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL et permettant un adressage dans le réticulum endoplasmique.
Les cellules, plantes et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci- dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.
Les cellules, plantes ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis enjeu.
Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID N° 2 ou ses variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation d'une cellule, d'une plante, d'un mammifère ou d'un polypeptide selon l'invention pour le criblage de composés chimiques ou biochimiques pouvant interagir directement ou indirectement avec les polypeptides selon l'invention, et/ou capable de moduler l'expression ou l'activité de ces polypeptides.
Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un polypeptide, d'une cellule, d'un mammifère, d'une plante selon l'invention, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide.
L'invention se rapporte également aux procédés de criblages permettant l'identification de composés diminuant ou inhibant la capacité d'un polypeptide selon l'invention à inhiber les activités cytéine protéinase, et notamment de la calpaïne, des caspases (en particulier la caspase 3) ou de la papaïne, dans lesquels on met en œuvre un protocole expérimental permettant la mise en évidence de l'activité inhibitrice ci-dessus énoncée, et l'on examine ladite activité en présence ou en absence du composé testé. De la même façon, l'invention concerne aussi un procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'invention, en utilisant un acide nucléique, une cellule, une plante ou un mammifère selon l'invention, et en détectant la formation d'un complexe entre les composés candidats et l'acide nucléique selon l'invention. Les composés ainsi sélectionnés sont également objets de l'invention.
Un tel composé selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique (du type petite molécule organique), un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques.
Parmi les composés chimiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique(s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte
(notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones).
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé interagissant avec un polypeptide ou un acide nucléique selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé diminuant ou inhibant la capacité de la Cystavine à inhiber les activités cytéine protéinase, et notamment de la calpaïne, des caspases (en particulier la caspase 3) ou de la papaïne, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon l'invention. Les médicaments envisagés peuvent aussi servir pour le traitement d'autres maladies, telles celles mentionnées ci-dessous.
On peut aussi utiliser les composés selon l'invention pour la préparation de compositions à usage cosmétique. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention pour la synthèse de polypeptides recombinants.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou plantes de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Une méthode tout à fait préférée consiste en l'utilisation de E. coli pour la production de la protéine recombinante.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle. Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux.
De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles. Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, His-Tag, etc..
Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides (voir notamment
Stewart et al., 1984) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels.
On note notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique certains polypeptides, variants, ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 sont particulièrement préférés. Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (1975).
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab') . Ils peuvent également se présenter sous forme d' immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre un anticorps selon l'invention.
L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique (notamment pour des tests ELISA ou assimilés).
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno- histochimique de l'expression des polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 ou l'un de ses variants, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immuno-conjugués enzymatiques.
Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en œuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit être observée.
Les anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain, ou à partir d'animaux immunisés avec des polypeptides selon l'invention, puis « humanisés ».
Ainsi, un procédé de détection d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention et de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé est également un objet de l'invention, ainsi qu'une trousse permettant de mettre en œuvre un tel procédé. Une telle trousse contient en particulier : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors de la réaction immunologique. Les polypeptides ou les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés dans le traitement des maladies inflammatoires, des cancers, ou pour lutter contre les effets du vieillissement chez un mammifère, en particulier chez l'homme.
On note notamment la protéinurie glomérulaire, la résorption des os, le métabolisme des métastases, l'invasion tumorale, l'infarctus du myocarde (notamment les dommages tissulaires), la maladie de Duchenne, toute maladie inflammatoire ou mettant en jeu des phénomènes inflammatoires (par exemple la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, la polyarthrite rhumatoïde, une maladie inflammatoire granulomateuse, telle le Syndrome de Blau ou la maladie de Crohn), la dystrophie musculaire, la maladie d'Alzeimer, les scléroses multiples, les maladies virales (y compris oculaires), les maladies dégénératives.
Les polypeptides ou les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés tels quels ou dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies précitées. L'analyse peut être effectuée par séquence de tout ou partie du gène, ou par d'autres méthodes connues de l'homme du métier. On peut en particulier utiliser des méthodes basées sur la PCR, par exemple la PCR-SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles. L'invention se rapporte également à une puce à ADN contenant une séquence selon l'invention. On peut utiliser une telle puce pour effectuer l'analyse de la présence et/ou de l'expression de l'acide nucléique selon l'invention par fixation d'une sonde selon l'invention correspondant à l'une des séquences SEQ ID N° 1 sur une puce à ADN et l'hybridation sur ces microplaques. De même, une puce à protéines contenant une séquence d'acides aminés selon l'invention est aussi un objet de l'invention. Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques, et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention. On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypetides selon l'invention dans le sérum de patients. On peut aussi mettre en œuvre une puce à protéines contenant un anticorps selon l'invention. L'invention concerne aussi l'utilisation de plantes, extraits de plantes ou parties de plantes selon l'invention, et/ou de polypeptides selon l'invention, pour la préparation de compositions pharmaceutiques, médicales, odontologiques, cosmétiques ou biotechnologiques, ainsi qu'une composition pharmaceutique, médicale, odontologique, cosmétique ou biotechnologique, caractérisée en ce qu'elle comprend des plantes, extraits de plante, parties de plantes ou des polypeptides selon l'invention
L'invention se rapporte également à un procédé de détection et/ou de dosage et/ou d'isolement d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un échantillon biologique et de détection et/ou dosage et/ou isolement de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique. L'agent capable de détecter spécifiquement un acide nucléique codant pour la protéine Cystavine est avantageusement une sonde d' oligonucléotides selon l'invention, qui peut être formée d'ADN, d'ARN, de PNA, modifiés ou non. Les modifications peuvent inclure un marquage radioactif ou fluorescent, ou être dues à des modifications dans les liaisons entre les bases (phosphorothioates, ou méthylphosphonates par exemple). L'homme du métier connaît les protocoles permettant d'isoler une séquence spécifique d'ADN.
L'homme du métier sait mettre en œuvre un tel procédé, et peut en particulier utiliser une trousse de réactifs comprenant : a) un polynucléotide selon l'invention, utilisé en tant que sonde ; b) les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; c) les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; qui est également un objet de l'invention.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus. Toutefois, afin de détecter et/ou doser et/ou isoler un acide nucléique selon l'invention, l'homme du métier peut également effectuer une étape d'amplification à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences selon l'invention.
L'invention se rapporte également à un composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un acide nucléique selon l'invention ; b) un polypeptide selon l'invention ; c) un vecteur selon l'invention ; d) une cellule selon l'invention ; e) un anticorps selon l'invention ; f) un composé selon l'invention, à titre de médicament, ainsi qu'à un de ces composés pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie inflammatoire, d'un cancer, ou pour lutter contre les effets du vieillissement chez un mammifère, en particulier chez l'homme.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un acide nucléique selon l'invention pour la production d'une plante transgénique possédant des propriétés améliorées de résistance aux stress abiotiques, notamment le stress hydrique, et aux stress biotiques tels ceux induits par les virus et insectes, par rapport à la plante non transgénique. On peut aussi utiliser l'acide nucléique selon l'invention pour produire des plantes transgéniques plus résistantes au gel, ou à des conditions extrêmes de salinité. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également être utilisés pour lutter contre la sénescence cellulaire. On peut introduire l'acide nucléique selon l'invention dans la plante, soit par l'intermédiaire d'un vecteur réplicatif dans les cellules, soit par l'intermédiaire d'un vecteur intégratif dans le génome de la cellule. Les plantes transgéniques sont telles que décrites précédemment. De préférence, la cystatine selon l'invention sera exprimée dans les feuilles de la plante ainsi transformée. En effet, les travaux de la présente invention indiquent pour la première fois que le gène selon l'invention est fortement impliqué dans la réponse adaptative des plantes à la sécheresse : les plantes résistantes stimulent l'expression du gène codant la cystatine Cystavine ce qui n'est pas le cas des plantes sensibles. Il existe en effet une corrélation entre la régulation du gène et la résistance membranaire et la résistance aux champs des plantes.
Cystavine est donc impliquée dans la protection cellulaire lors du stress via la modulation de l'activité des cystéines protéinases foliaires. En conséquence, une stratégie de transgenèse visant à induire ou surexprimer le transgène selon l'invention via un promoteur inductible par le stress et spécifique des feuilles peut aboutir à l'obtention de plantes plus résistantes au stress hydrique induit par la sécheresse, les fortes températures, le gel, la salinité, la sénescence cellulaire, la résistance aux insectes et/ou virus. Les études rapportées par la présente invention montrent que Cystavine inhibe l'activité de la caspase. Les membres de la famille des caspases sont des cystéine protéases qui présentent un clivage spécifiques de l'aspartate. Elles jouent un rôle significatif à la fois dans l'inflammation ( Leung et al, 2000, J. Médicinal Chem., 43 : 305-341) et l'apoptose. Les inhibiteurs de caspase sont des outils très importants car ils inhibent l'induction de l'apoptose dans des cellules tumorales diverses (Schlegel et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 1841) et dans les cellules normales (Zaks et al., 1999, J Immunol. 162 : 3273-9).
EXEMPLES Exemple 1 : Caractérisation et clonage de PADNc codant une nouvelle cystatine putative
L'ADNc a été caractérisé après criblage d'une banque d'expression de feuille de haricot Niébé (Vigna unguiculata Vu, Cowpea).
La sonde d'ADN nécessaire au criblage a été obtenue par amplification PCR (Polymerase Chain Reaction) au moyen d'amorces oligonucléotidiques dégénérées déduites de deux séquences consensus déterminées par alignement de trois séquences de cystatines végétales publiées (BLAST) via Infobiogen (SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4).
L'ADNc a été préparé à partir de 2mg d'ARNm de feuilles de Vu (kit Amersham) puis purifié (phénol, chloroforme, Appligène Oncor). L'amplification de la sonde a été réalisée par PCR en utilisant l'ADNc purifié comme matrice, les amorces dégénérées, l'ADN polymerase « Goldstar Red » (Eurogenetec), le tampon de réaction correspondant (Eurogenetec), des dNTP (5mM, Master Mix, Eurogentec). L'amplification de l'ADN a été effectuée au moyen d'un thermocycler (Mastercycler 5330, Eppendorf).
Les ADN amplifiés ont été séparés par électrophorèse (Mupid, Eurogentec) sur gel d'agarose à 1% (Promega).
Une sonde de 160 pb a été amplifiée, excisée du gel puis purifiée (QuiaexII, Quiagen). L'ADN a été clone dans le phagemid pBluscriptIISK (Stratagene). Des bactéries compétentes (Epicurian coli XL1 blue, Stratagene) ont été transformées par les plasmides recombinés. 12 clones ont été sélectionnés sur la base de la taille de l'insert puis en fonction de l'efficacité de leur amplification par PCR. Le plasmide correspondant au clone sélectionné a été purifié (kit Quia Prep Spin Miniprep, Quiagen) et l'insert a été séquence.
La séquence obtenue s'est avéré être caractéristique d'un partie de cystatine végétale. Après excision de l'insert du plasmide, on dispose donc de la sonde permettant de cribler une banque d'ADNc de feuilles de Vu réalisée dans le phagemid λ Zip Lox (Gibco BRL), au laboratoire.
Pour ce faire, la sonde a été marquée au 32P (Kit Megaprime, Amersham), purifiée par chromatographie (colonnes Nick, Pharmacia), incubée avec les empreintes lesquelles ont été autoradiographiées (film X OMAT, Kodak). Le criblage de la banque a permis de sélectionner un clone à partir duquel (plage de lyse) l'ADN phagique recombiné a été amplifié et introduit dans des bactéries E. coli DH 10B (Gibco BRL) capables à l'état recombiné de transformer (circularisation) les phages en plasmides.
L'ADN plasmidien recombiné a été extrait des bactéries et purifié (kit Wizard Plus Midiprep, Quiagen) puis séquence (ESGS).
La séquence nucléotidique obtenue est celle d'une nouvelle cystatine (SEQ ID N° 1). Dans ces conditions on a décidé de tenter d'obtenir la protéine in vitro par expression dans un système hétérologue.
Séquence en acides aminés de Cystavine (SEQ ID N° 2) : MATATVTLGGITDVPGAANSVEIANLARFAVDDHNKK QNGVLEFVRVISAKQQVVSGILYYITLEAKDGETKKV YKTKVWVREWLNPKEVQEFNLNTDSAIGTKDGGVGD VPSDTLHIEΝLARFANDQYΝKΝEΝAΝLEFNRNIDAKE QV NEGFIYYITLEAKDGESKΝVYEAKVWERSWLΝSIE LLEFKPVDVAV
Exemple 2 : Expression de la cystatine dans E. coli
2.1 -Construction par PCR E coli a été choisi en raison de l'efficacité de son système d'expression .
L'ADNc de cystatine a été préparé par PCR de façon à éliminer le codon de départ de l'ORF et à insérer de part et d'autre deux sites de restriction, BamHI et
Sali, permettant de l'insérer dans le vecteur plasmidial. Celui-ci, pQE30 (QIA
Expressionist, Quiagen) contient les mêmes sites de restriction, l'ATG d'initiation de la traduction et le codage pour 6 Histidines de l'His-tag.
Le vecteur est préparé (coupure par Sali et BamHI, déphosphorylation par
CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, Promega et purification) et la ligation est effectuée (T4 DNA ligase, USB). Le plasmide recombinant obtenu est subcloné afin de conserver la construction dans E. coli (Xll-Blue (Subcloning-Grade compétent Cells, Stratagene).
2.2- Expression de la cystatine
Le vecteur recombinant pQE30 est utilisé (après extraction de la bactérie Xll Blue, purification et dosage) pour transformer les bactéries E. coli M15 (kit QIA expressionist, Quiagen). Les bactéries sont cultivées en milieu liquide (milieu LB, ampicilline) et l'induction de l'expression de la cystatine est initiée par ajout d'IPTG (ImM). Les bactérie sont ensuite collectées par centrifogation (JE-21ME, Bekman), les protéines sont extraites et analysées par électrophorèse automatique sur gel d'acrylamide, en conditions dénaturantes (SDS-PAGE, Phast system, Pharmacia). Une bande très majoritaire a été obtenue, dont la masse moléculaire correspond à la masse déduite de la séquence de l'ADNc de la cystatine putative.
Exemple 3 : Rôle du gène VuCystl et activité de la cystatine Cystavine 3.1- Expression (transcrits) du gène VuCystl
L'étude de l'expression du gène par Northern blotting ou RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) a été réalisée dans le cas de plantes dont la sensibilité à la sécheresse (expérimentale ou naturelle) diffère. 4 lots de plantes ont été étudiés : plantes témoins bien arrosées (T), plantes soumises à un déficit hydrique contrôlé. Les résultats obtenus montent que le gène n'est pas exprimé chez les plantes témoins, par contre les transcrits s'accumulent en fonction de l'intensité du stress. Cette réaction est, de plus, corrélée au degré de sensibilité de la plante à la sécheresse en champ. Donc Le gène VuCystl (codant pour la Cystavine) s'exprime en réponse à la contrainte hydrique d'autant plus que celle-ci est sévère et d'autant plus que la plante est sensible
Il ressort donc que l'ADNc VuCystl est un transgène candidat pour l'amélioration des plantes par transgenèse par une stratégie pour la résistance à la sécheresse. Sachant que la plupart des autres stress abiotiques : gel, salinité, floading, hautes températures, induisent à l'échelle cellulaire un stress hydrique, VuCystl est un transgène candidat pour l'amélioration des plantes pour la résistance à ces stress également.
3.2- Activité de la cystatine Cystavine L'activité de la protéine recombinante Cystavine a été testée sur trois substrats : la papaïne, la caspase, la calpaïne.
Cystavine, inhibiteur de la papaïne:
Le principe du test d'activité est le suivant : cette anti-cystéine protéinase doit bloquer la réaction d'hydrolyse qui se produit entre une cystéine protéinase végétale, la papaïne (Sigma) et son substrat l'azocaséine.
Le milieu réactionnel est le suivant : tampon Tris X5 200 μl (Tris 0,5M, βmercaptoethanol 25mM, pH 6,0), azocaséine 1% (Sigma), papaïne 250ng par μl, (Sigma), VuCYSTl purifiée 1,17 μg/μl, H2O qsp 500μl. La réaction se développe à 37°C pendant 15 min puis les protéines sont précipitées par traitement à l'acide trichloracétique à 10% pendant 30 min à 5°C. Le dosage des acides aminés libérés est effectué par spectrophotométrie par la mesure de l'absorbance (A) à λ34onm- Les résultats obtenus sont les suivants :
Figure imgf000029_0001
Les résultats obtenus montrent clairement que la cystéine protéinase (papaïne) hydrolyse l'azocaséine (substrat), la libération des acides aminés abouti à l'isolement du groupe chromogène et donc à l'augmentation de l'absorbance.4 pour λ3 onm- En revanche ce phénomène est totalement inhibé en présence de l'inhibiteur Cystavine.
En conclusion, la cystatine de Vigna unguiculata Cystavine produite par expression de l'ADNc dans E. coli est bien fonctionnelle.
Cystavine inhibiteur de la caspase 3
Le test a été réalisé au moyen du kit "Caspase-3 Assay Kit colorimetric (Sigma). Le substrat utilisé est "Ac-DEVD-pNa" (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp o- pnitrosanilide). Cystavine est utilisée à 24 mg/ml.
Figure imgf000029_0002
Ces résultats montrent que Cystavine est un inhibiteur de caspase. L'efficacité de l'inhibition dépend de la concentration en cystatine et d'une préincubation entre la cystéine protéinase (Caspase) et l'inhibiteur avant l'addition du substrat de l'enzyme. Une mise au point est en cours afin de déterminer les paramètres de l'inhibition afin d'optimiser le test
Cystavine inhibiteur de la calpaïne
Des expériences de cinétique d'inhibition enzymatique préliminaires ont été réalisées en utilisant un test adapté aux cystatines animales. Une inhibition par Cystavine de 40% de l'activité calpaïne a été obtenue sans aucune optimisation des paramètres. Dans ces conditions il est vraisemblable que l'optimisation des paramètres permettra d'augmenter l'efficacité de l'inhibition de la calpaïne par Cystavine.

Claims

Revendications
1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes : a) SEQ ID N° 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs de SEQ ID N° l ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ; d) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ; e) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a) ou b).
2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N° 1, la séquence complémentaire de SEQ ID N° 1 et la séquence d'ARN correspondant à SEQ ID N° 1.
3. Acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d'au moins 50 acides aminés de la protéine SEQ ID N° 2.
4. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 ; b) un fragment d'au moins 20 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a) ; c) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a) ; d) un polypeptide comportant au moins 80 % d'identité avec le polypeptide de a).
5. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 ou codant pour un polypeptide selon la revendication 4.
6. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 5.
7. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 6.
8. Plante, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule selon la revendication 6.
9. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 en tant que sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquences d'acide nucléique.
10. Utilisation in vitro d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 comme oligonucléotide sens ou antisens.
11. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production d'un polypeptide recombinant.
12. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon la revendication 6 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
13. Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 12.
14. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il lie sélectivement un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13.
15. Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 4, ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 14 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
16. Trousse de réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 14 ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors de la réaction immunologique.
17. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
18. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13, ou un anticorps selon la revendication 14.
19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, marqué ; b) détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.
20. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification des acides nucléiques dudit échantillon biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 2.
21. Procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13, d'une cellule selon la revendication 6, d'un animal selon la revendication 7, d'une plante selon la revendication 8, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide.
22. Procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, d'une cellule selon la revendication 6, d'un animal selon la revendication 7, d'une plante selon la revendication 8, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit acide nucléique.
23. Procédé de criblage de composés diminuant ou inhibant la capacité d'un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 à inhiber les activités cytéine protéinase, comprenant l'étape d'examen de ladite activité d'inhibition de l'activité cystéine protéinase dudit polypeptide en présence ou en absence du composé testé.
24. Utilisation d'un composé interagissant avec un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon la revendication 21.
25. Utilisation d'un composé interagissant in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon la revendication 22.
26. Utilisation d'un composé diminuant ou inhibant la capacité d'un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 à inhiber les activités cytéine protéinase, pour la préparation d'un médicament destiné notamment au traitement du cancer ou d'une maladie inflammatoire, caractérisé en ce qu'il est identifié par un procédé selon la revendication 23.
27. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 ; b) un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 13 ; c) un vecteur selon la revendication 5 ; d) une cellule selon la revendication 6 ; e) un anticorps selon la revendication 14 ; à titre de médicament.
28. Composé selon la revendication 27, pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie inflammatoire, d'un cancer, ou pour lutter contre les effets du vieillissement chez un mammifère, en particulier chez l'homme.
29. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production d'une plante transgénique possédant des propriétés améliorées de résistance aux stress abiotiques, notamment le stress hydrique, et aux stress biotiques, notamment aux virus et insectes, par rapport à la plante non transgénique.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2216074A1 (fr) * 2009-02-07 2010-08-11 Cognis IP Management GmbH Extrait de dolichos biflorus à utiliser dans un traitement cosmétique de la peau

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997032007A1 (fr) * 1996-02-28 1997-09-04 Purdue Research Foundation Inhibiteurs de cysteine-proteinases du soja nucleotides codant ces agents et procedes pour leur utilisation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997032007A1 (fr) * 1996-02-28 1997-09-04 Purdue Research Foundation Inhibiteurs de cysteine-proteinases du soja nucleotides codant ces agents et procedes pour leur utilisation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDES K V S ET AL: "THE RESISTANCE OF COWPEA SEEDS TO BRUCHID BEETLES IS NOT RELATED TOLEVELS OF CYSTEINE PROTEINASE INHIBITORS" PLANT MOLECULAR BIOLOGY, NIJHOFF PUBLISHERS, DORDRECHT, NL, vol. 23, no. 1, 1993, pages 215-219, XP000981959 ISSN: 0167-4412 *
FLORES VICTOR M Q ET AL: "Temporal and tissue localization of a cowpea (Vigna unguiculata) cystatin." PHYSIOLOGIA PLANTARUM, vol. 112, no. 2, juin 2001 (2001-06), pages 195-199, XP002220148 ISSN: 0031-9317 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468791A (zh) * 2013-07-10 2013-12-25 浙江省农业科学院 分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的pcr引物组
CN103468791B (zh) * 2013-07-10 2015-05-13 浙江省农业科学院 分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的pcr引物组

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