WO2002089762A1 - Emulsion e/h concentree - Google Patents

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WO2002089762A1
WO2002089762A1 PCT/FR2002/001171 FR0201171W WO02089762A1 WO 2002089762 A1 WO2002089762 A1 WO 2002089762A1 FR 0201171 W FR0201171 W FR 0201171W WO 02089762 A1 WO02089762 A1 WO 02089762A1
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fatty
fatty acids
polyols
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PCT/FR2002/001171
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Inventor
Laurent Dupuis
Original Assignee
Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques Seppic
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    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • the present invention relates to new adjuvants for vaccine compositions as well as compositions comprising at least one antigen, in particular an antigen of viral, bacterial or parasitic origin and at least one adjuvant.
  • the development of vaccines inactivated or containing purified antigens is becoming increasingly important, as it makes it possible to avoid undesirable side effects.
  • improving the quality of antigens comes at the expense of their immunogenic character. It is for this reason that they are associated with immunity adjuvants.
  • Immunity adjuvants are products that increase the reactions of the immune system when administered in the presence of antigens of viral, bacterial or synthetic origin. They cause the massive appearance of macrophages at the injection site, then in the lymphatic nodules, increase the production of specific immunoglobulins, antibodies, and stimulate many cells involved in the mechanisms of immune defense. These adjuvants are of various natures. They can for example consist of liposomes or emulsions.
  • Very effective Freund's adjuvants result from the association of a mineral oil and a mannitol ester containing or not containing a killed mycobacterium.
  • the vaccines produced by mixing in equal parts a Freund's adjuvant with an aqueous antigenic medium still remain the benchmarks worldwide for laboratory studies. They are in the form of water in oil emulsions (W / O), that is to say emulsions in which the continuous phase is oil.
  • W / O oil in oil emulsions
  • the active ingredient is generally located in the aqueous phase, which is often a buffered saline solution. This phase is in the form of drops separated from each other by an oily film. This formulation makes it possible to obtain amplified and prolonged biological responses over time.
  • emulsions of this type are generally very viscous and are therefore difficult to inject. They often require the use of syringes with a large needle diameter and are the cause of pain during the injection and trauma at the injection site.
  • the aqueous phase content of the injectable W / O emulsions is around 30
  • a W / O type emulsion will be called fluid, if its viscosity is less than 4 times that of this reference emulsion, that is to say less than 500 mPa.s at 25 ° C (BROOKFIELD LVT M 2 V 30 ).
  • fluid emulsions are generally less stable than more viscous emulsions, since phase shifts are observed only a few days after their preparation.
  • the Applicant has therefore sought to develop emulsions of the water-in-oil type (W / O), concentrated in the aqueous phase which do not have the drawbacks set out above, that is to say which are fluid and stable. over time.
  • the stability criterion of the emulsion being considered satisfied if it does not present any major defect after 1 month at the following three temperatures: 4 ° C, 25 ° C and 37 ° C.
  • the subject of the invention is a composition comprising a fatty phase H and an aqueous phase E, in the form of an emulsion of the water-in-oil type and characterized in that the weight ratio W / O is greater than 1.
  • the weight ratio E is a composition comprising a fatty phase H and an aqueous phase E, in the form of an emulsion of the water-in-oil type and characterized in that the weight ratio W / O is greater than 1.
  • the fatty phase constituting the composition which is the subject of the present invention generally comprises one or more compounds chosen from oils of mineral, vegetable or animal origin, the alkyl esters of said oils, the alkyl esters of fatty acids or the alkyl ethers of fatty acids, esters of fatty acids and polyols or ethers of fatty alcohols and polyols.
  • oils of mineral origin there are oils of petroleum origin, such as white mineral oils such as MARCOL TM 52 or DRAKEOL TM 6 VR.
  • vegetable oils there are peanut oil, olive oil, sesame oil, soybean oil, wheat germ oil, oil grape seed, sunflower oil, castor oil, linseed oil, soybean oil, corn oil, copra oil, palm oil, oil nuts, hazelnut oil, rapeseed oil or squalane or olive squalene.
  • oils of animal origin are spermaceti oil, tallow oil, squalane or squalene extracted from fish livers.
  • alkyl esters of oils are the ethyl, linear or branched propyl or butyl, linear or branched methyl esters of said oils.
  • fatty acids suitable for the preparation of the esters mentioned above there are more particularly, those containing from 12 to 22 carbon atoms, such as for example, myristic acid, palmitic acid, oleic acid, ricinoleic acid or isostearic acid and advantageously a fatty acid liquid at 20 ° C.
  • fatty acid esters or fatty acid ethers are the alkyl esters of fatty acids, such as, ethyl oleate, methyl oleate, isopropyl myristate or octyl palmitate, esters of fatty acids and polyols or ethers of fatty alcohols and polyols, such as fatty acid monoglycerides, fatty acid diglycerides, fatty acid triglycerides, fatty acid esters with a polyglycerol or fatty acid esters of propylene glycol, and more particularly fatty acid esters with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol, fatty acid esters with a hexol anhydride, such as sorbitan or mannitane.
  • alkyl esters of fatty acids such as, ethyl oleate, methyl oleate, isopropyl myristate or octyl
  • the fatty phase may comprise only one of the compounds mentioned above or else a mixture of several of the compounds mentioned above.
  • the fatty phase constituting the composition which is the subject of the present invention, also comprises one or more surfactants having an overall HLB number of between 5 and 8.
  • the fatty phase comprises approximately between 1% and 15% by weight, preferably between 3 % and 10% by weight of surfactants.
  • the HLB of the mixture is the weighted sum of the HLBs of each surfactant.
  • a more particular subject of the invention is a composition as defined above in which the surfactant or the mixture of surfactants has an overall HLB number is greater than or equal to 6 and less than 8.
  • the weight ratio aqueous phase on fatty phase W / O is greater than 3/2.
  • the surfactants used are generally chosen from modified fatty substances.
  • modified fatty substances used in the context of the present invention can be of vegetable or animal mineral origin.
  • modified fats of mineral origin there are oils of petroleum origin.
  • modified fatty substances of vegetable origin there are modified vegetable oils, for example, modified oils of peanut, olive, sesame, soy, wheat germ, sunflower grape seeds, castor, flax, soy, corn, copra, palm, nuts, hazelnuts or rapeseed.
  • modified fatty substances of animal origin are modified squalane, modified squalene, modified spermaceti oil or modified tallow oil.
  • modified fatty substances denotes in particular the alkoxylated derivatives of fatty substances and more particularly the alkoxylated derivatives of oils or the alkoxylated derivatives of alkyl esters of oils and more particularly, the ethoxylated and / or propoxylated derivatives of oils or the ethoxy and / or propoxylated derivatives of the methyl, ethyl, linear or branched propyl or butyl, linear or branched esters of said oils.
  • a more specific subject of the invention is a composition as defined above, in which the modified fatty substance is chosen from ethoxylated derivatives of oils having a number of EOs, between 1 and 10.
  • modified fatty substances also denotes esters of fatty acids and of polyols or ethers of fatty alcohols and of polyols, and more particularly, esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or esters of fatty acids with a hexol anhydride, such as sorbitan or mannitane, alkoxylated derivatives of fatty acid esters and of polyols or alkoxylated derivatives of fatty alcohol ethers and of polyols, like the triglycerides of alkoxylated fatty acids, the alkoxylated esters of polygly- fatty acid cerol, and more particularly the alkoxylated esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or the alkoxylated esters of fatty acids with a hexol anhydride, such as sorbitan
  • esters of fatty acids and polyols is meant in the context of the present invention, monoesters of fatty acids and polyols or polyesters of fatty acids and polyol such as for example diesters of fatty acids and polyols or triesters of fatty acids and polyols. It is the same for the polyalkoxylated derivatives of said esters.
  • ethers of fatty acids and polyols is meant in the context of the present invention, monoethers of fatty acids and polyols or polyethers of fatty acids and polyol such as for example acid diethers fatty acids and polyols or triethers of fatty acids and polyols. It is the same for the polyalkoxylated derivatives of said ethers.
  • a more particular subject of the invention is a composition as defined above, in which the modified fatty substances are chosen from the ethoxy derivatives of fatty acid esters and of polyols or the ethoxy derivatives of ethers of fatty alcohols and of polyols, and more particularly, the ethoxyl esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or the ethoxyl esters of fatty acids with a hexol anhydride, such as sorbitan or mannitane having a number of EOs, between 5 and 10.
  • the modified fatty substances are chosen from the ethoxy derivatives of fatty acid esters and of polyols or the ethoxy derivatives of ethers of fatty alcohols and of polyols, and more particularly, the ethoxyl esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or the
  • fatty acids suitable for the preparation of the modified fatty substances described above there are those containing on average from 12 to 22 carbon atoms, such as for example, those comprising 16 to 18 carbon atoms, such as oleic acid, ricinoleic acid or isostearic acid and advantageously fatty acids which are liquid at 20 ° C.
  • the surfactant or the mixture of surfactants present in the fatty phase essentially consists of one or more esters chosen from mannitane esters, sorbitan esters, mannitane esters alkoxylated or alkoxylated sorbitan esters.
  • the surfactant present in the fatty phase consists of a mixture of mannitane oleate and polyethoxylated mannitane oleate, a mixture of sorbitan oleate and polyethoxylated sorbitan oleate, a mixture of sorbitan oleate and polyethoxylated mannitane oleate or a mixture of mannitane oleate and polyethoxylated sorbitan oleate, said mixtures having an overall HLB number is greater than or equal to 6 and less than 8.
  • composition according to the invention can also include one or more conventional immune stimulating agents, such as Avridine TM, N, N-dioctadecyl-N ', N'-bis (2-hydroxyethyl) propanediamine, derivatives of MDP ( muramyl dipeptide), in particular threonyl-MDP, mycolic acid derivatives or lipid A derivatives.
  • the composition according to the invention optionally comprises one or more organic salts of water-soluble metal cations, such as, for example, gluconate of calcium, manganese gluconate aluminum salicylate or soluble aluminum acetate.
  • the adjuvant composition according to the invention comprises a pharmaceutically acceptable salt
  • the latter is at a concentration of 0.02 to 3000 mg / cm 3 , preferably 0.1 to 1000 mg / cm 3 , more preferably from 0.1 to 150 mg / cm 3 .
  • composition according to the invention may also comprise one or more insoluble salts generally used as immunity adjuvants, such as aluminum hydroxide or calcium phosphate.
  • compositions as defined above further comprising, at least one antigen or at least one in vivo generator of a compound comprising an amino acid sequence and a non-zero amount of a composition as defined above.
  • the term “antigen or at least one in vivo generator of a compound comprising an amino acid sequence” denotes either killed microorganisms, such as viruses, bacteria or parasites, or purified fractions of these microorganisms. , or living microorganisms whose pathogenic power has been reduced.
  • viruses which can constitute an antigen according to the present invention there is the rabies virus, herpes viruses, such as Aujeszky's disease virus, orthomixoviruses such as Influenzae, picornaviruses such as the FMD virus or retroviruses such as HIV.
  • viruses which can constitute an antigen according to the present invention there is the rabies virus, herpes viruses, such as Aujeszky's disease virus, orthomixoviruses such as Influenzae, picornaviruses such as the FMD virus or retroviruses such as HIV.
  • E a microorganism of the bacterial type which can constitute an antigen according to the present invention.
  • Coli and those of the genera Pasteurella, Furonculosis, Vibriosis, Staphylococcus and Streptococcus.
  • parasites are those of the genera Trypanosoma, Plasmodium and Leishmania.
  • Mention may also be made of recombinant viruses, in particular non-enveloped viruses, such as adenoviruses, vaccinia virus, Canarypox virus, herpes viruses or baculoviruses.
  • a non-enveloped living viral recombinant vector is also designated, the genome of which contains, preferably inserted into a part which is not essential for the replication of the corresponding enveloped virus, a sequence coding for an antigenic subunit inducing antibody synthesis and / or a protective effect against the above enveloped virus or pathogenic microorganism; these antigenic subunits can be, for example, a protein, a glycoprotein, a peptide or a peptide fraction and / or protective against infection by a living microorganism such as an enveloped virus, bacteria or parasite.
  • the exogenous gene inserted into the microorganism can, for example, be derived from an Aujeszky or HIV virus.
  • the aim of this last nucleotide sequence is to allow the expression of a compound comprising an amino acid sequence, this compound itself having the aim of triggering an immune reaction in a host organism.
  • the term “in vivo” generator of a compound comprising an amino acid sequence means a whole biological product capable of expressing said compound in the host organism into which said generator has been introduced in vivo.
  • the compound comprising the amino acid sequence can be a protein, a peptide or a glycoprotein.
  • generators in vivo are generally obtained by methods resulting from genetic engineering. More particularly, they can consist of living microorganisms, generally a virus, playing the role of recombinant vector, into which is inserted a nucleotide sequence, in particular an exogenous gene. These compounds are known as such and used in particular as a recombinant unitary vaccine. In this regard, reference may be made to the article by M. ELOIT et al., Journal of virology (1990) 71, 2925-2431 and to the international patent applications published under the numbers WO-A-91/00107 and WO -A-94/16681.
  • the in vivo generators according to the invention can also consist of a recombinant plasmid comprising an exogenous nucleotide sequence, capable of expressing in a host organism a compound comprising an amino acid sequence.
  • a recombinant plasmid comprising an exogenous nucleotide sequence, capable of expressing in a host organism a compound comprising an amino acid sequence.
  • Such recombinant plasmids and their mode of administration in a host organism were described in 1990, by LIN et al., Circulation 82: 2217,2221; COX et al., J. of VIROL, Sept. 1993, 67, 9, 5664-5667 and in the international application published under the number WO 95/25542.
  • the compound comprising the amino acid sequence which is expressed within the host organism can: (i) be an antigen, and allow the triggering of a immune reaction,
  • (ii) have a curative action vis-à-vis a disease, essentially a functional disease, which is triggered in the host organism.
  • the in vivo generator allows treatment of the host, of the gene therapy type.
  • such a curative action may consist in a synthesis by the in vivo generator of cytokines, such as interleukins, in particular interleukin 2.
  • cytokines such as interleukins, in particular interleukin 2.
  • Cel- these allow the triggering or strengthening of an immune reaction aimed at the selective elimination of cancer cells.
  • the vaccine composition as defined above comprises a concentration of antigen which depends on the nature of this antigen and on the nature of the subject treated. It is however particularly remarkable that an adjuvant according to the invention makes it possible to significantly reduce the usual dose of antigen required.
  • the appropriate concentration of antigen can be determined conventionally by those skilled in the art. Generally, this dose is of the order of 0.1 ⁇ g I cm 3 to 1 g / cm 3 more generally between 1 ⁇ g / cm 3 and 100 mg / cm 3 .
  • the concentration of said generator in vivo in the composition according to the invention depends, in particular, on the nature of said generator and on the host in which it is administered. This concentration can be easily determined by a person skilled in the art, on the basis of routine experience.
  • the in vivo generator when the in vivo generator is a recombinant microorganism, its concentration in the composition according to the invention generally between 10 2 and 10 15 microorganisms / cm 3 and preferably between 10 5 and 10 12 microorganisms / cm 3 .
  • the generator in vivo when the generator in vivo is a recombinant plasmid, its concentration in the composition according to the invention can be between 0.01 g / dm 3 and 100 g / dm 3 .
  • the vaccine as defined above, is prepared by mixing the adjuvant phase and the antigenic phase, optionally adding water or a pharmaceutically acceptable diluent medium.
  • the invention preferably relates to W / O type emulsions as defined above, which are fluid.
  • fluid emulsion we mean emulsions whose viscosity, measured at 25 ° C with a BROOKFIELD LVT viscometer with rotating mobile (2 speed mobile 30 rpm) is less than 500 mPa.s (BROOKFIELD LVT M 2 V 30).
  • the vaccine composition as described above can be used as a preventive or curative medicine.
  • a composition according to the invention can be administered to fish, crustaceans such as shrimps, poultry, in particular, geese, turkeys, pigeons and chickens, canines such as dogs, felines such as cats, pigs, primates, bovines, ovids and horses.
  • the composition according to the invention can also be administered to humans.
  • the administration of the composition can be carried out in a conventional manner by the parenteral route, in particular by subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal injection. It can also be done orally or nasally.
  • the subject of the invention is a composition essentially consisting of 1% and 15% by weight, and preferably 3% and 10% by weight, of surfactants having an HLB number overall between 5 and 8, and from 85% to 99 %, and preferably from 90% to 97% by weight, of one or more compounds chosen from oils of mineral, vegetable or animal origin, the alkyl esters of said oils, the alkyl esters of fatty acids or the alkyl ethers fatty acid esters of fatty acids and polyols or ethers of fatty alcohols and polyols.
  • the oil is more particularly chosen from white mineral oils.
  • the surfactant or the mixture of surfactants preferably has an overall HLB number greater than or equal to 6 and less than 8.
  • the surfactant or the mixture of surfactants are chosen from modified fatty substances.
  • modified fatty substance denotes in particular the alkoxylated derivatives of oils or the alkoxylated derivatives of alkyl esters of oils and more particularly, the ethoxylated and / or propoxylated derivatives of oils or the ethoxylated and / or propoxylated derivatives of methyl esters , ethyl, linear or branched propyl or butyl, linear or branched, of said oils and more particularly from the ethoxy derivatives of oils having a number of EOs, between 1 and 20, preferably between 5 and 10.
  • modified fatty substance also denotes esters of fatty acids and of polyols or ethers of fatty alcohols and of polyols, and more particularly, esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or esters of fatty acids with a hexol anhydride, such as sorbitan or mannitane, alkoxylated derivatives of fatty acid esters and of polyols or alkoxylated derivatives of fatty alcohol ethers and of polyols, and more particularly, the alkoxylated esters of fatty acids with a hexol, such as for example sorbitol or mannitol or the alkoxylated esters of fatty acids with a hexol anhydride, such as sorbitan or mannitane having a number EO, between 1 and 20, more particularly, the ethoxyl derivatives of fatty acid esters and of
  • the fatty acids suitable for the preparation of modified fatty substances preferably contain on average from 12 to 22 carbon atoms and more particularly 16 to 18 carbon atoms.
  • the surfactant or the mixture of surfactants are derivatives of oleic acid.
  • the surfactant or surfactants are chosen from mannitane esters, sorbitan esters, alkoxylated mannitane esters or esters of alkoxylated sorbitan.
  • the oily composition as defined above contains as surfactant system, a mixture of mannitane oleate and ethoxylated mannitane oleate having a number of EOs, between 5 and 10.
  • its subject is a process for the preparation of a water-in-oil type vaccine emulsion, as defined above; comprising the addition in an W / O weight ratio greater than 1, of an aqueous medium containing at least one antigen or at least one in vivo generator of a compound comprising a sequence of amino acids to the oily composition as defined above, as well as the use of said oily composition as an adjuvant in injectable compositions such as vaccines.
  • the process as defined above can be carried out cold, that is to say at a temperature between 0 ° C and 30 ° C.
  • An emulsion is prepared according to the invention, by pouring an aqueous phase consisting of a saline solution of physiological saline, onto a fatty phase, with stirring with a high shear mixer (SILVERSON L4RT). 200 g of emulsion are prepared for each test, the aqueous phase representing 65% of the weight of the emulsion.
  • the fatty phase consists of:
  • the viscosity of the emulsion is checked after 24 hours of stabilization at 25 ° C (BROOKFIELD LVT M 2 V 30). It is equal to 430 mPa.s.
  • the sample obtained is divided into three bottles for evaluation of the stabilities at the following three temperatures: 4 ° C, 25 ° C and 37 ° C. It is found that this emulsion is stable at the three temperatures tested. After 1 month of storage, the emulsion is not broken and the oil release is less than 5%.
  • Example 2 An emulsion according to the invention is prepared as described in Example 1, in which the aqueous phase represents 65% by weight thereof, and in which the fatty phase consists of
  • the viscosity of the emulsion is checked after 24 hours of stabilization at 25 ° C. It is equal to 134mPa.s. (BROOKFIELD LVT M 2 V 30). The sample obtained is divided into three bottles for evaluation of the stabilities at the three temperatures (4 ° C / 25 ° C / 37 ° C).
  • Example 1 An emulsion according to the invention is prepared as described in Example 1, in which the aqueous phase represents 65% by weight thereof, and in which the fatty phase consists of:
  • the viscosity of the emulsion is checked after 24 hours of stabilization at 25 ° C. It is equal to 360 mPa.s. (BROOKFIELD LVT M 2 V 30).
  • the sample obtained is divided into three bottles for evaluation of the stabilities at the three temperatures (4 ° C / 25 ° C / 37 ° C).
  • this emulsion is stable at the three temperatures tested. After one month of storage, the emulsion is not broken and the oil release is less than 5%.

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Abstract

Composition sous forme d'une émulsion de type eau - dans - huile, comprenant une phase grasse H et une phase aqueuse E, caractérisée en ce que le rapport pondéral E/H est supérieur à 1. Composition huileuse. Utilisation comme adjuvant de vaccins et procédé de préparation de vaccins.

Description

EMULSION E/H CONCENTREE La présente invention concerne de nouveaux adjuvants pour compositions vaccinales ainsi que des compositions comprenant au moins un antigène, notamment un antigène d'origine virale, bactérienne ou parasitaire et au moins un adjuvant. Le développement de vaccins inactivés ou contenant des antigènes purifiés est de plus en plus important, car il permet d'éviter les effets secondaires indésirables. Cependant, l'amélioration de la qualité des antigènes se fait au détriment de leur caractère im- munogène. C'est pour cette raison qu'ils sont associés à des adjuvants d'immunité.
Les adjuvants d'immunité sont des produits qui augmentent les réactions du sys- tème immunitaire, lorsqu'ils sont administrés en présence d'antigènes d'origine virale, bactérienne ou synthétique. Ils provoquent l'apparition massive de macrophages au site d'injection, puis dans les nodules lymphatiques, accroissent la production d'immunoglobu- lines spécifiques, les anticorps, et stimulent de nombreuses cellules impliquées dans les mécanismes de la défense immunitaire. Ces adjuvants sont de natures diverses. Ils peuvent par exemple consister en des liposomes ou des émulsions.
Les adjuvants de Freund très efficaces ; ils résultent de l'association d'une huile minérale et d'un ester de mannitol contenant ou non une mycobactérie tuée. Les vaccins réalisés par mélange en parts égales d'un adjuvant de Freund avec un milieu antigénique aqueux, restent encore les références dans le monde entier pour les études en laboratoire. Ils se présentent sous forme d'émulsions eau dans huile (E / H), c'est à dire d'émul- sions dans lesquelles la phase continue est l'huile. Le principe actif est généralement localisé dans la phase aqueuse qui est souvent une solution saline tamponnée. Cette phase est sous forme de gouttes séparées entre elles par un film huileux. Cette formula- tion permet d'obtenir des réponses biologiques amplifiées et prolongées dans le temps.
Cependant les émulsions de ce type (E / H) sont généralement très visqueuses et sont donc difficilement injectables. Elles nécessitent souvent l'utilisation de seringues à diamètre d'aiguille important et sont la cause de douleurs lors de l'injection et de trauma- tismes au site de l'injection. La teneur en phase aqueuse les émulsions E / H injectables se situe autour de 30
% à 40 % en poids. Le maximum rencontré est 50 %. Or cette limite constitue un frein notamment au développement de vaccins polyvalents, dans lesquels sont associés plusieurs antigènes et pour lesquels il serait préférable d'obtenir des émulsions E / H ayant des teneurs en phase aqueuse supérieures à 50 %. Or, dans une emulsion E / H à faible teneur en phase aqueuse, jusqu'environ 20 % en poids, la viscosité de l'émulsion est très proche de la viscosité de l'huile. L'augmentation de la proportion en phase aqueuse augmente sa viscosité. C'est ainsi qu'une emulsion à 20 % en poids d'eau ayant une viscosité de 100 mPa.s, se transforme en une crème très difficilement injectable lorsqu'on augmente la teneur en eau jusqu'à 50 % en poids. Certains adjuvants huileux commerciaux comme le MONTANIDE™ ISA 70 permettent d'obtenir des émulsions injectables E / H contenant environ 30 % en poids, de phase aqueuse, 70 % en poids de phase huileuse et ayant des viscosités de l'ordre de 50 à 100 mPa.s. D'autres adjuvants, comme le MONTANIDE™ ISA 50, permettent d'obtenir des émulsions injectables E / H contenant environ 50 % en poids de phase aqueuse, 50 % en poids de phase huileuse et ayant des viscosités inférieures à 250 mPa.s.
La demande internationale de brevet publiée sous le numéro W0 99/20305 divulgue l'utilisation de tensioactifs sur oléate de mannitol avec des huiles minérales comme le MARCOL™ 52 pour faire des émulsions, dites fluides, de viscosités de l'ordre de 500 mPa..s. La notion d'émulsion fluide dépend largement du domaine d'application. Pour les émulsions injectables, la limite supérieure de viscosité pour une emulsion fluide est définie par rapport à la viscosité d'une emulsion de type E / H de référence, qui contient 50 % en poids de phase aqueuse et 50 % en poids d'adjuvant incomplet de Freund (IFA) ; cette viscosité est de l'ordre d'environ 2 000 mPa.s. Cette emulsion est considérée comme très visqueuse.
Une emulsion de type E / H sera dite fluide, si sa viscosité est inférieure à 4 fois celle de cette emulsion de référence, c'est-à-dire inférieure à 500 mPa.s à 25°C (BROOKFIELD LVT M 2 V 30).
Cependant les émulsions fluides sont en général moins stables que les émulsions plus visqueuses, puisque des déphasages sont observés quelques jours seulement, après leur préparation.
La demanderesse a donc cherché à mettre au point des émulsions de type eau - dans - huile (E / H), concentrées en phase aqueuse qui n'aient pas les inconvénients exposés ci-dessus, c'est à dire qui soient fluides et stables au cours du temps. Le critère de stabilité de l'émulsion étant jugé satisfait si elle ne présente aucun défaut majeur après 1 mois aux trois températures suivantes : 4 °C, 25 °C et 37 °C.
L'invention a pour objet, une composition comprenant une phase grasse H et une phase aqueuse E, sous forme d'une emulsion de type eau - dans - huile et caractérisée en ce que le rapport pondéral E / H est supérieur à 1. Selon un premier aspect particulier de la présente invention, le rapport pondéral E
/ H est inférieur ou égal à 3. La phase grasse constitutive de la composition objet de la présente invention, comprend généralement un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols.
Comme exemples d'huile d'origine minérale, il y a les huiles d'origine pétrolière, comme les huiles blanches minérales telles que le MARCOL™ 52 ou le DRAKEOL™ 6 VR. Comme exemples d'huiles d'origine végétale, il y a l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame, l'huile de soja, l'huile de germes de blé, l'huile de pépins de raisin, l'huile de tournesol, l'huile de ricin, l'huile de lin, l'huile de soja, l'huile de maïs, l'huile de coprah, l'huile de palme, l'huile de noix, l'huile de noisette, l'huile de colza ou encore le squalane ou le squalène d'olive. Comme exemples d'huiles d'origine animale, il y a l'huile de spermaceti, l'huile de suif, le squalane ou le squalène extraits des foies de poissons.
Comme exemples d'esters alkyliques d'huiles, il y a les esters méthyliques éthyli- ques, propyliques linéaires ou ramifiés ou butyliques, linéaires ou ramifiés, desdites huiles.
Comme acides gras appropriés à la préparation des esters cités ci-dessus, il y a plus particulièrement, ceux comportant de 12 à 22 atomes de carbone, tels que par exemple, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide ricinoléique ou l'acide isostéarique et avantageusement un acide gras liquide à 20°C.
Comme exemples d'esters d'acides gras ou d'éthers d'acides gras, il y a les esters alkyliques d'acides gras, tels que, l'oléate d'éthyle, l'oléate de méthyle, le myristate d'isopropyle ou le palmitate d'octyle, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, tels que les monoglycérides d'acides gras, les diglycérides d'acides gras, les triglycérides d'acides gras, les esters d'acides gras avec un polyglycérol ou les esters d'acides gras et de propylèneglycol, et plus particulièrement les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol, les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane.
Dans le cadre de la présente invention, la phase grasse peut comprendre un seul des composés cités ci-dessus ou bien un mélange de plusieurs des composés cités ci- dessus.
La phase grasse, constitutive de la composition objet de la présente invention, comprend aussi un ou plusieurs agents tensioactifs ayant un nombre HLB global compris entre 5 et 8. La phase grasse comprend environ entre 1 % et 15 % en poids, de préférence entre 3 % et 10% en poids d'agents tensioactifs. Au sens de la présente invention, le nombre HLB d'un tensioactif est calculé par la formule HLB = 20 (l-I ). dans laquelle ls représente l'indice de saponification et la, l'indice d'acide dudit tensioactif. Dans le cas d'un mélange de tensioactifs, le HLB du mélange est la somme pondérée des HLB de chaque tensioactif. Ces deux indices, de sapo- nification et d'acide, sont déterminés par des méthodes décrites dans la Pharmacopée européenne.
L'invention a plus particulièrement pour objet, une composition telle que définie précédemment dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs a un nombre HLB global est supérieur ou égal à 6 et inférieur à 8. Selon un autre aspect particulier de la composition objet de la présente invention, le rapport pondéral phase aqueuse sur phase grasse E / H est supérieur à 3/2.
Les agents tensioactifs mis en œuvre sont généralement choisis parmi les corps gras modifiés.
Les corps gras modifiés utilisés dans le cadre de la présente invention, peuvent être d'origine minérale végétale ou animale. Comme corps gras modifiés d'origine minérale, il y a les huiles d'origine pétrolière.
Comme corps gras modifiés d'origine végétale, il y a les huiles végétales modifiées, par exemple, les huiles modifiées d'arachide, d'olive, de sésame, de soja, de germes de blé, de pépins de raisin de tournesol, de ricin, de lin, de soja, de maïs, de coprah, de palme, de noix, de noisettes ou de colza.
Comme corps gras modifiés d'origine animale, il y a par exemple le squalane modifié, le squalène modifié, l'huile modifiée de spermaceti ou l'huile modifiée de suif.
Par corps gras modifiés, on désigne notamment les dérivés alcoxylés de corps gras et plus particulièrement les dérivés alcoxylés d'huiles ou les dérivés alcoxylés d'es- ters alkyliques d'huiles et plus particulièrement, les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés d'huiles ou les dérivés éthoxyles et ou propoxylés des esters méthyliques, éthyliques, propyliques linéaires ou ramifiés ou butyliques, linéaires ou ramifiés, desdites huiles. L'invention a plus spécifiquement pour objet une composition telle que définie précédemment, dans laquelle le corps gras modifié est choisi parmi les dérivés éthoxyles d'huiles ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 10.
Par corps gras modifiés on désigne aussi, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane, les dérivés alcoxylés d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés alcoxylés d'éthers d'alcools gras et de polyols, comme les triglycérides d'acides gras alcoxylés, les esters alcoxylés de polygly- cérol d'acides gras, et plus particulièrement les esters alcoxylés d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters alcoxylés d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20. Par esters d'acides gras et de polyols, on désigne dans le cadre de le présente invention, les monoesters d'acides gras et de polyols ou les polyesters d'acides gras et de polyol tels que par exemple les diesters d'acides gras et de polyols ou les triesters d'acides gras et de polyols. Il en est de même pour les dérivés polyalcoxylés desdits esters.
Par éthers d'acides gras et de polyols, on désigne dans le cadre de le présente in- vention, les monoéthers d'acides gras et de polyols ou les polyethers d'acides gras et de polyol tels que par exemple les diéthers d'acides gras et de polyols ou les triéthers d'acides gras et de polyols. Il en est de même pour les dérivés polyalcoxylés desdits éthers.
L'invention a plus particulièrement pour objet, une composition telle que définie précédemment, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les dérivés éthoxyles d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés éthoxyles d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters éthoxyles d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters éthoxyles d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10. Comme acides gras appropriés à la préparation des corps gras modifiés décrits ci- dessus, il y a ceux comportant en moyenne de 12 à 22 atomes de carbone, tels que par exemple, ceux comportant de 16 à 18 atomes de carbone, comme l'acide oléique, l'acide ricinoléique ou l'acide isostéarique et avantageusement les acides gras liquides à 20 °C. La composition, telle que définie ci-dessus, contient plus particulièrement un ou plusieurs corps gras modifiés tels que décrits ci-dessus, dérivés de l'acide oléique.
Selon un autre aspect particulier de la présente invention, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs présent dans la phase grasse, consiste essentiellement en un ou plusieurs esters choisis parmi les esters de mannitane, les esters de sorbitane, les esters de mannitane alcoxylés ou les esters de sorbitane alcoxylés. De façon toute particulière, l'agent tensioactif présent dans la phase grasse consiste en un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de mannitane polyéthoxylé, un mélange d'oléate de sorbitane et d'oléate de sorbitane polyéthoxylé, un mélange d'oléate de sorbitane et d'oléate de mannitane polyéthoxylé ou un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de sorbitane polyéthoxylé, lesdits mélanges ayant un nombre HLB global est supérieur ou égal à 6 et inférieur à 8. La composition selon l'invention, peut aussi comporter un ou plusieurs agents stimulants immunitaires conventionnels, tel l'Avridine™, la N,N-dioctadecyl-N',N'-bis(2- hydroxyéthyl) propanediamine, les dérivés du MDP (muramyl dipeptide), notamment le thréonyl-MDP, les dérivés de l'acide mycolique ou les dérivés du Lipide A. La composition selon l'invention, comprend éventuellement un ou plusieurs sels organiques de cations métalliques hydrosolubles, tel que par exemple le gluconate de calcium, le gluconate de manganèse le salicylate d'aluminium ou l'acétate d'aluminium so- luble. Lorsque la composition adjuvante selon l'invention comprend, un sel pharmaceuti- quement acceptable, celui-ci est à une concentration de 0,02 à 3000 mg/ cm3, de préfé- rence 0,1 à 1000 mg/cm3, plus préférentiellement de 0,1 à 150 mg/cm3.
La composition selon l'invention peut aussi comprendre un ou plusieurs sels insolubles généralement utilisés comme adjuvants d'immunité, tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate de calcium.
Selon un autre aspect de la présente invention, celle a pour objet une composition telle qu définie précédemment comprenant en outre, au moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés et une quantité non nulle d'une composition telle que définie précédemment.
Par antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, on désigne soit des micro-organismes tués, tels que les virus, les bactéries ou les parasites, soit des fractions purifiées de ces micro-organismes, soit des micro-organismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué. A titre d'exemples de virus pouvant constituer un antigène selon la présente invention, il y a le virus de la rage, les herpès virus, tels que le virus de la maladie d'Aujeszky, les orthomixovirus tels que Influenzae, les picornavirus tels que le virus de la fièvre aphteuse ou les rétrovirus tels que les VIH. A titre de micro-organisme du type bactérien pouvant constituer un antigène selon la présente invention, on peut citer E. Coli, et ceux des genres Pasteurella, Furonculosis, Vibriosis, Staphylococcus et Streptococcus. A titre d'exemples de parasites, il y a ceux des genres Trypanosoma, Plasmodium et Leishmania. On peut aussi citer les virus recombinants notamment les virus non enveloppés, tels que les adénovirus, le virus de la vaccine, le virus Canarypox, les herpès virus ou les baculovirus. On désigne aussi un vecteur recombinant viral non enveloppé vivant, dont le génome contient, insérée de préférence dans une partie non essentielle pour la réplication du virus enveloppé correspondant, une séquence codant pour une sous - unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou micro-organisme pathogène ; ces sous - unités antigéniques peuvent être par exemple, une protéine, une glycoprotéine, un peptide ou une fraction peptidique et/ou protectrice contre une infection par un micro-organisme vivant tel un virus enveloppé, une bactérie ou un parasite. Le gène exogène inséré dans le micro-organisme peut être, par exemple, issu d'un virus Au- jeszky ou HIV.
On peut citer notamment un plasmide recombinant constitué d'une séquence de nucléotides, dans laquelle est insérée une séquence nucléotidique exogène, provenant d'un micro-organisme ou d'un virus pathogène. Cette dernière séquence nucléotidique a pour but de permettre l'expression d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, ce composé ayant lui-même pour but de déclencher une réaction immune dans un organisme hôte. Par générateur "in vivo" d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, on désigne tout un produit biologique capable d'exprimer ledit composé dans l'organisme hôte dans lequel on a introduit ledit générateur in vivo. Le composé comprenant la séquence d'acides aminés, peut être une protéine, un peptide ou une glycoprotéine. Ces générateurs in vivo sont généralement obtenus par des procédés issus du génie généti- que. Plus particulièrement, ils peuvent consister en des micro-organismes vivants, généralement un virus, jouant le rôle de vecteur recombinant, dans lequel est insérée une séquence nucléotidique, notamment un gène exogène. Ces composés sont connus en tant que tels et utilisés notamment comme vaccin sous unitaire recombinant. A cet égard, on peut se référer à l'article de M. ELOIT et al., Journal of virology (1990) 71, 2925-2431 et aux demandes internationales de brevet publiées sous les numéros WO-A-91/00107 et WO-A-94/16681. Les générateurs in vivo selon l'invention peuvent aussi consister en un plasmide recombinant comprenant une séquence nucléotidique exogène, capable d'exprimer dans un organisme hôte un composé comprenant une séquence d'acides aminés. De tels plasmides recombinants et leur mode d'administration dans un organisme hôte ont été décrits en 1990, par LIN et al., Circulation 82:2217,2221 ; COX et al., J. of VIROL, Sept. 1993, 67, 9, 5664-5667 et dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 95/25542. Selon la nature de la séquence nucléotidique comprise dans le générateur in vivo, le composé comprenant la séquence d'acides aminés qui est exprimé au sein de l'organisme hôte, peut : (i) être un antigène, et permettre le déclenchement d'une réaction immune,
(ii) avoir une action curative vis-à-vis d'une maladie, essentiellement une maladie d'ordre fonctionnel, qui s'est déclenchée chez l'organisme hôte. Dans ce cas, le générateur in vivo permet un traitement de l'hôte, du type thérapie génique.
A titre d'exemple, une telle action curative peut consister en une synthèse par le générateur in vivo de cytokines, comme les interleukines, notamment l'interleukine 2. Cel- les-ci permettent le déclenchement ou le renforcement d'une réaction immune visant à l'élimination sélective des cellules cancéreuses.
La composition vaccinale telle que définie ci-dessus, comprend une concentration en antigène qui dépend de la nature de cet antigène et de la nature du sujet traité. Il est toutefois particulièrement remarquable qu'un adjuvant selon l'invention, permette de diminuer notablement la dose habituelle d'antigène requise. La concentration adéquate d'antigène peut être déterminée de manière classique par l'homme du métier. Généralement, cette dose est de l'ordre de 0,1 μg I cm3 à 1 g / cm3 plus généralement comprise entre 1 μg / cm3 et 100 mg / cm3. La concentration dudit générateur in vivo dans la composition selon l'invention dépend, là encore, notamment de la nature dudit générateur et de l'hôte dans lequel il est administré. Cette concentration peut être aisément déterminée par l'homme du métier, sur la base d'expérience de routine. A titre indicatif, lorsque le générateur in vivo est un micro-organisme recombinant, sa concentration dans la composition selon l'invention en général comprise entre 102 et 1015 microorganismes / cm3 et de préfé- rence entre 105 et 1012 microorganismes / cm3. Lorsque le générateur in vivo est un plasmide recombinant, sa concentration dans la composition selon l'invention peut être comprise entre 0,01 g / dm3 et 100 g / dm3. Le vaccin, tel que défini précédemment, est préparé en mélangeant la phase adjuvante et la phase antigénique, en ajoutant éventuellement de l'eau ou un milieu diluant pharmaceutiquement acceptable. L'invention a de préférence pour objet les émulsions de type E /H telles que définies précédemment, qui sont fluides.
Par emulsion fluide, on désigne les émulsions dont la viscosité, mesurée à 25°C avec un viscosimètre BROOKFIELD LVT à mobile tournant (mobile 2 vitesse 30 rpm) est inférieure à 500 mPa.s (BROOKFIELD LVT M 2 V 30). La composition vaccinale telle décrite ci-dessus peut être utilisée comme médicament préventif ou curatif. Selon la nature de l'antigène ou du générateur in vivo, une composition selon l'invention peut être administrée à des poissons, des crustacés tels que les crevettes, des volailles, notamment, des oies, des dindes, des pigeons et des poulets, aux canidés tels le chien, aux félidés tels le chat, aux porcs, aux primates, aux bovidés, aux ovidés et aux chevaux. La composition selon l'invention peut être également administrée à l'homme. L'administration de la composition peut se faire de manière classique par voie parentérale, notamment par injection sous-cutanée, intramusculaire ou intrapérito- néale. Elle peut aussi se faire par voie orale ou nasale.
Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci a pour objet une composition essen- tiellement constituée de 1 % et 15% en poids, et de préférence de 3 % et 10 % en poids, d'agents tensioactifs ayant un nombre HLB global compris entre 5 et 8, et de 85 % à 99 %, et de préférence de 90 % à 97 % en poids, d'un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols. Dans la composition huileuse telle que définie ci-dessus, l'huile est plus particulièrement choisie parmi les huiles blanches minérales.
Dans la composition huileuse telle que définie ci-dessus, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs a de préférence un nombre HLB global supérieur ou égal à 6 et inférieur à 8. Dans la composition huileuse telle que définie ci-dessus, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont choisis parmi les corps gras modifiés.
Par corps gras modifié, on désigne notamment les dérivés alcoxylés d'huiles ou les dérivés alcoxylés d'esters alkyliques d'huiles et plus particulièrement, les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés d'huiles ou les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés des esters méthylique, éthylique, propyliques linéaire ou ramifié ou butyliques, linéaire ou ramifiés, desdites huiles et plus particulièrement parmi les dérivés éthoxyles d'huiles ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20, de préférence entre 5 et10.
Par corps gras modifié, on désigne aussi les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane, les dérivés alcoxylés d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés alcoxylés d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters alcoxylés d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters alcoxylés d'acides gras avec un anhy- dride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20, plus particulièrement, les dérivés éthoxyles d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés éthoxyles d'éthers d'alcools gras et de polyols, et tout particulièrement, les esters éthoxyles d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters éthoxyles d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10.
Dans la définition précédente, les acides gras appropriés à la préparation des corps gras modifiés, comportent de préférence en moyenne de 12 à 22 atomes de carbone et plus particulièrement 16 à 18 atomes de carbone.
Selon un aspect particulier de la présente invention, dans la composition huileuse telle que définie ci-dessus, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont des dérivés de l'acide oléique. Selon un autre aspect particulier de la présente invention, dans la composition huileuse telle que définie ci-dessus, l'agent tensioactif ou les agents tensioactifs sont choisis parmi les esters de mannitane, les esters de sorbitane, les esters de mannitane alcoxylés ou les esters de sorbitane alcoxylés. Selon un aspect très particulier de la présente invention, la composition huileuse telle que définie ci-dessus, contient comme système tensioactif, un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de mannitane éthoxylé ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10.
Selon les derniers aspects de la présente invention, celle-ci a pour objet un procé- dé de préparation d'une emulsion vaccinale de type eau - dans - huile, telle que définie précédemment; comprenant l'addition dans un rapport pondéral E / H supérieur à 1 , d'un milieu aqueux contenant au moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés à la composition huileuse telle que définie ci-dessus, ainsi que l'utilisation de ladite composition huileuse comme adjuvant dans les compositions injectables telles que les vaccins.
Le procédé tel que défini précédemment, peut être mis en œuvre à froid, c'est à dire à une température comprise entre 0 °C et 30 °C.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Préparation des compositions selon l'invention. Exemple 1
On prépare une emulsion selon l'invention, en versant une phase aqueuse constituée, d'une solution saline de sérum physiologique, sur une phase grasse, sous agitation avec un mélangeur à haut cisaillement (SILVERSON L4RT). 200 g d'émulsion sont prépa- rés à chaque essai, la phase aqueuse représentant 65 % du poids de l'émulsion. La phase grasse est constituée de :
90 % en poids de MARCOL™ 52, 3 % en poids de monooléate de mannitane et
7 % en poids de monooléate de mannitane polyéthoxylé (indice d'OE = 8). Le mélange de monooléate de mannitane et de monooléate de mannitane polyéthoxylé (8 OE) a un nombre HLB égal à 6,2.
La viscosité de l'émulsion est contrôlée après 24 heures de stabilisation à 25°C (BROOKFIELD LVT M 2 V 30). Elle est égale à 430 mPa.s.
L'échantillon obtenu est fractionné en trois flacons pour évaluation des stabilités aux trois températures suivantes : 4 °C, 25 °C et 37 °C. On constate que cette emulsion est stable aux trois températures testées. Après 1 mois de stockage, l'émulsion n'est pas cassée et le relargage d'huile est inférieur à 5 %.
Exemple 2 : On prépare une emulsion selon l'invention comme décrit dans l'exemple 1 , dans laquelle la phase aqueuse en représente 65 % en poids, et dans laquelle la phase grasse est constituée de
92 % en poids de MARCOL™ 52, 4,3 % en poids de trioléate de sorbitane et 3,7 % en poids de trioléate de sorbitane polyéthoxylé (indice d'OE = 20).
Le mélange de trioléate de sorbitane et de trioléate de sorbitane polyéthoxylé (indice d'OE = 20) a un nombre HLB égal à 6,1.
La viscosité de l'émulsion est contrôlée après 24 heures de stabilisation à 25 °C. Elle est égale à 134mPa.s. (BROOKFIELD LVT M 2 V 30). L'échantillon obtenu est fractionné en trois flacons pour évaluation des stabilités aux trois températures (4 °C / 25 °C / 37 °C).
On constate que cette emulsion est stable aux trois températures testées Après un mois de stockage, l'émulsion n'est pas cassée et le relargage d'huile est négligeable.
Exemple 3 :
On prépare une emulsion selon l'invention comme décrit dans l'exemple 1 , dans laquelle la phase aqueuse en représente 65 % en poids, et dans laquelle la phase grasse est constituée de :
92 % en poids de MARCOL™ 52, 5,4 % en poids de monooléate de sorbitane et
2,6 % en poids de monooléate de mannitane polyéthoxylé (indice d'OE = 8). Le mélange de monooléate de sorbitane et de monooléate de mannitane polyéthoxylé (indice d'OE = 8), a un nombre HLB égal à 7,6.
La viscosité de l'émulsion est contrôlée après 24 heures de stabilisation à 25 °C. Elle est égale à 360 mPa.s. (BROOKFIELD LVT M 2 V 30).
L'échantillon obtenu est fractionné en trois flacons pour évaluation des stabilités aux trois températures (4 °C / 25 °C / 37 °C).
On constate que cette emulsion est stable aux trois températures testées. Après un mois de stockage, l'émulsion n'est pas cassée et le relargage d'huile est inférieur à 5 %.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition sous forme d'une emulsion de type eau - dans - huile, comprenant une phase grasse H et une phase aqueuse E, caractérisée en ce que le rapport pondéral E / H est supérieur à 1.
2. Composition telle que définie à la revendication 1 , dans laquelle le rapport E / H est inférieur ou égal à 3.
3. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle sa phase grasse constitutive comprend un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols.
4. Composition telle que définie à la revendication 2, dans laquelle l'huile est choisie parmi les huiles blanches minérales.
5. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle La phase grasse comprend aussi un ou plusieurs agents tensioactifs ayant un nombre HLB global compris entre 5 et 8 et plus particulièrement supérieur ou égal à 6 et inférieur à 8.
6. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 ou 5, dans laquelle la phase grasse comprend environ entre 1 % et 15% en poids et de préférence entre 3 % et 10 % en poids d'agents tensioactifs.
7. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le rapport pondéral E / H est supérieur à 3/2.
8. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont choisis parmi les corps gras modifiés.
9. Composition telle que définie à la revendication 8, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les dérivés alcoxylés d'huiles ou les dérivés alcoxylés d'esters alkyliques d'huiles et plus particulièrement, les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés d'huiles ou les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés des esters méthylique, éthylique, propy- liques linéaire ou ramifié ou butyliques, linéaire ou ramifiés, desdites huiles et plus particulièrement parmi les dérivés éthoxyles d'huiles ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20, de préférence entre 5 et 10.
10. Composition telle que définie à la revendication 8, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane, les dérivés alcoxylés d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés alcoxylés d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters alcoxylés d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters alcoxylés d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20.
11. Composition telle que définie à la revendication 10, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les dérivés éthoxyles d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés éthoxyles d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters éthoxyles d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters éthoxyles d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10.
12. Composition telle que définie à l'une des revendications 10 ou 11 , dans laquelle les acides gras appropriés à la préparation des corps gras modifiés, comportent en moyenne de 12 à 22 atomes de carbone et plus particulièrement 16 à 18 atomes de carbone.
13. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont des dérivés de l'acide oléique.
14. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 5 à 13, dans laquelle l'agent tensioactif ou les agents tensioactifs sont choisis parmi les esters de mannitane, les esters de sorbitane, les esters de mannitane alcoxylés ou les esters de sorbitane alcoxylés.
15. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 7 à 14, dans laquelle l'agent tensioactif présent dans la phase grasse consiste en un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de mannitane polyéthoxylé, un mélange d'oléate de sorbitane et d'oléate de sorbitane polyéthoxylé, un mélange d'oléate de sorbitane et d'oléate de mannitane polyéthoxylé ou un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de sorbitane polyéthoxylé.
16. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 15, comprenant en outre au moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés.
17. Composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce qu'elle est fluide.
18. Composition essentiellement constituée de 1 % et 15% en poids, et de préférence de 3 % et 10 % en poids, d'agents tensioactifs ayant un nombre HLB global compris entre 5 et 8, et de 85 % à 99 %, et de préférence de 90 % à 97 % en poids, d'un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols.
19. Composition telle que définie à la revendication 18, dans laquelle l'huile est choisie parmi les huiles blanches minérales.
20. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 18 ou
19, dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs a un nombre HLB global supérieur ou égal à 6 et inférieur à 8.
21. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 18 à
20, dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont choisis parmi les corps gras modifiés.
22. Composition telle que définie à la revendication 21, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les dérivés alcoxylés d'huiles ou les dérivés alcoxylés d'esters alkyliques d'huiles et plus particulièrement, les dérivés éthoxyles et/ou propoxylés d'huiles ou les dérivés éthoxyles et ou propoxylés des esters méthylique, éthylique, propy- liques linéaire ou ramifié ou butyliques, linéaire ou ramifiés, desdites huiles et plus particulièrement parmi les dérivés éthoxyles d'huiles ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20, de préférence entre 5 et10.
23. Composition telle que définie à la revendication 21 , dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'al- cools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane, les dérivés alcoxylés d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés alcoxylés d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters alcoxylés d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol ou les esters alcoxylés d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 1 et 20.
24. Composition telle que définie à la revendication 23, dans laquelle les corps gras modifiés sont choisis parmi les dérivés éthoxyles d'esters d'acides gras et de polyols ou les dérivés éthoxyles d'éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les esters éthoxyles d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le manni- toi ou les esters éthoxyles d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbitane ou le mannitane ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10.
25. Composition telle que définie à l'une des revendications 23 ou 24, dans laquelle les acides gras appropriés à la préparation des corps gras modifiés, comportent en moyenne de 12 à 22 atomes de carbone et plus particulièrement 16 à 18 atomes de carbone.
26. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 18 à
25, dans laquelle l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs sont des dérivés de l'acide oléique.
27. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 18 à
26, dans laquelle l'agent tensioactif ou les agents tensioactifs sont choisis parmi les esters de mannitane, les esters de sorbitane, les esters de mannitane alcoxylés ou les esters de sorbitane alcoxylés.
28. Composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 18 à 27, dans laquelle l'agent tensioactif présent dans la phase grasse consiste en un mélange d'oléate de mannitane et d'oléate de mannitane éthoxylé ayant un nombre d'OE, compris entre 5 et 10.
29. Procédé de préparation d'une composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 16 ou 17, comprenant l'addition dans un rapport pondéral E / H supérieur à 1 , d'un milieu aqueux contenant au moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé et comprenant une séquence d'acides aminés à une composition essentiellement constituée de 1 % et 15% en poids, et de préférence de 3 % et 10 % en poids, d'agents tensioactifs ayant un nombre HLB global compris entre 5 et 8, et de 85 % à 99 %, et de préférence de 90 % à 97 % en poids, d'un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, et l'émulsification mélange obtenu.
30. Utilisation de la composition telle que définie à l'une des revendications 18 à 28, comme adjuvant de compositions injectables.
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