WO2002088386A2 - Nasba-based detection of fungi - Google Patents

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Abstract

The invention relates to a nucleic acid molecule, a kit containing the nucleic acid molecule, the use of the nucleic acid molecule for detection of fungi, a method of detection of fungi in clinical material, a method for detection of fungi of the species Aspergillus in clinical material and kits for carrying out said method.

Description

NASBA-basierender Nachweis von Pilzen NASBA-based detection of fungi
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsauremolekul, ein Kit, das das Nukleinsauremolekul enthält, die Verwendung des Nukleinsäuremoleküls zum Nachweis von Pilzen, ein Verfahren zum Nachweis von Pilzen in klinischem Material, ein Verfahren zum Nachweis von Pilzen der Gattung Aspergillus in klinischem Material sowie Kits zur Durchführung dieser Verfahren.The present invention relates to a nucleic acid molecule, a kit which contains the nucleic acid molecule, the use of the nucleic acid molecule for the detection of fungi, a method for the detection of fungi in clinical material, a method for the detection of fungi of the genus Aspergillus in clinical material and also kits for carrying them out of these procedures.
Nukleinsäuremoleküle, die zum Nachweis von Pilzen verwendet werden, sowie Verfahren zum Nachweis von Pilzen in klinischem Material sind aus verschiedenen Veröffentlichungen bekannt. Die Problematik der Pilzinfektion hat in den letzten zwanzig Jahren ein beträchtliches Ausmaß angenommen. Dies ist vor allem auf die Zunahme von Patienten mit geschwächter Immunabwehr, intensiven immunsuppressiven Chemotherapien, die zunehmende Verwendung von Breitspektrumantibiotika und zentralvenöser Katheter zurückzuführen. Wichtige Mykosen, d.h. durch Pilze verursachte Infektionskrankheiten, sind z.B. die Candida-Mykose, die Aspergillus-Mykose oder die Mucor-Mykose.Nucleic acid molecules which are used for the detection of fungi and methods for the detection of fungi in clinical material are known from various publications. The problem of fungal infection has grown considerably over the past twenty years. This is primarily due to the increase in patients with weakened immune systems, intensive immunosuppressive chemotherapy, the increasing use of broad-spectrum antibiotics and central venous catheters. Important mycoses, ie infectious diseases caused by fungi, are, for example, Candida mycosis, Aspergillus mycosis or Mucor mycosis.
Bei der Aspergillus-Mykose oder auch Aspergillose handelt es sich um eine opportunistische Infektion des ' stark abwehrgeschwächten Organismus, hervorgerufen durch Pilze der Gattung Aspergillus. Dabei kommt es sehr häufig zum Befall der Lunge, des Zentralen Nervensystems ( ZNS) oder des Magen-Darm-Traktes , seltener von Herz, Leber und Haut. Das Vorkommen der invasiven Aspergillose hat innerhalb der letzten Jahrzehnte ständig zugenommen. Neben den oben genannten Ursachen liegt dies auch an der gehäuften Durchführung von Knochenmarks- und Organtransplantationen und dem verbesserten Überleben bei einer Aids- Erkrankung. In Patienten mit akuter Leukämie wird das Vorkommen der Aspergillose auf bis zu 25 % und die damit verbundene Mortalität auf bis zu 90 % geschätzt. Siehe hierzu "Denning, D.W., 1998, Invasive aspergillosis . Clin. Infect. Dis. 26, 781-805".Aspergillus mycosis or aspergillosis is an opportunistic infection of the ' severely weakened organism, caused by fungi of the Aspergillus genus. The lungs, the central nervous system (CNS) or the gastrointestinal tract are very often affected, less often the heart, liver and skin. The incidence of invasive aspergillosis has increased steadily over the past few decades. In addition to the causes mentioned above, this is also due to the increased number of bone marrow and organ transplants and improved survival in the case of AIDS. In patients with acute leukemia, the incidence of aspergillosis is estimated to be up to 25% and the mortality associated with it up to 90%. See "Denning, DW, 1998, Invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26, 781-805".
Vor diesem Hintergrund wurden frühzeitig Anstrengungen unternommen, zuverlässige Nachweisverfahren für Pilze, insbesondere in klinischem Material, zu entwickeln. Dabei wurden während der letzten zehn Jahre Kultivierungs- und histopathologische Verfahren aufgrund ihrer begrenzten Sensitivität und Spezifität zunehmend durch molekularbiologische Nachweisverfahren ersetzt. Besonders etabliert hat sich von diesen Methoden ein Poly- merasase-Kettenreaktion( CR) -gestützter Nachweis von Pilznukleinsäuren.Against this background, efforts were made at an early stage to develop reliable detection methods for fungi, especially in clinical material. Due to their limited sensitivity and specificity, cultivation and histopathological methods have been increasingly replaced by molecular biological detection methods over the past ten years. Of these methods, polymerase chain reaction (CR) -based detection of fungal nucleic acids has become particularly well established.
Aus den DE 195 30 332 C2, DE 195 30 333 C2 und DE 195 30 336 C2 sind verschiedene Nukleinsäuren bekannt, mittels derer ein PCR- gestützter Nachweis von Pilz-DNA verschiedener Pilzspezies gelingt.Various nucleic acids are known from DE 195 30 332 C2, DE 195 30 333 C2 and DE 195 30 336 C2, by means of which PCR-supported detection of fungal DNA of different fungal species is possible.
In "Einsele et. al., 1997, Detection and identification of fun- gal pathogenes in blood by using molecular probes, J. Clin. Microbiol. 35, 135-1360" wird ebenfalls ein PCR-Primerpaar beschrieben, welches an das im Pilzreich hochkonservierte 18S- rRNA-Gen bindet. Unter Verwendung dieses Primerpaars gelingt den Autoren die Erfassung verschiedener Pilzspezies in Patientenblutproben."Einsele et. Al., 1997, Detection and identification of functional pathogens in blood by using molecular probes, J. Clin. Microbiol. 35, 135-1360" also describes a pair of PCR primers which is compatible with that in the fungal kingdom highly conserved 18S rRNA gene binds. Using this pair of primers, the authors succeeded in detecting various fungal species in patient blood samples.
"Van Burik et al., 1989, Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens, J. Clin. Microbiol. 36, 1169-1175" beschreiben ebenfalls ein an das 18S-rRNA-Gen bindendes PCR-Primerpaar, über das in Patientenvollblut der Nachweis von verschiedenen Pilzspezies gelingt."Van Burik et al., 1989, Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens, J. Clin. Microbiol. 36, 1169-1175" also describe a pair of PCR primers that bind to the 18S rRNA gene that different fungal species can be detected in whole blood.
Nachteilig ist bei sämtlichen vorstehend genannten Nuklein- säuremolekülen bzw. Primern, daß diese im Rahmen einer PCR eingesetzt werden müssen.A disadvantage of all of the nucleic acid molecules or primers mentioned above is that they have to be used in the context of a PCR.
Mittels einer PCR kann ein DNA-Fragment, das innerhalb einer längeren DNA-Matrize liegt, spezifisch amplifiziert werden. Eine PCR läuft in mehreren Zyklen ab, deren einzelne Reaktionsschritte bei jeweils unterschiedlichen Inkubationstemperaturen durchgeführt werden müssen. Im ersten Schritt erfolgt bei einer Inkubationstemperatur von 95 °C die Denaturierung der DNA- Matrize. Nach der Trennung der Stränge wird die DNA in Gegenwart eines großen Überschusses von zwei PCR-Primern, die jeweils zu einem Strang der DNA-Matrize an den entgegengesetzten Enden komplementär sind, auf ca. 50 °C abgekühlt. Dabei können die Primer an ihre komplementären Sequenzen in den beiden DNA- Strängen hybridisieren.A DNA fragment that lies within a longer DNA template can be specifically amplified by means of a PCR. A PCR runs in several cycles, the individual reaction steps of which have to be carried out at different incubation temperatures. In the first step, the DNA template is denatured at an incubation temperature of 95 ° C. After the strands have been separated, the DNA is cooled to about 50 ° C. in the presence of a large excess of two PCR primers, each of which is complementary to a strand of the DNA template at the opposite ends. The primers can hybridize to their complementary sequences in the two DNA strands.
Im darauffolgenden Schritt erfolgt dann durch die Aktion der DNA-Polymerase und den vier Desoxyribonukleosidtriphosphaten, die sich ebenfalls im Ansatz befinden, eine Verlängerung der Primer, entsprechend komplementär zu der einzelsträngigen DNA- Matrize. Dieser Polymerisierungsschritt wird bei einer Inkubationstemperatur von ca. 72 °C durchgeführt.In the subsequent step, the primer is extended by the action of the DNA polymerase and the four deoxyribonucleoside triphosphates, which are also in the beginning, correspondingly complementary to the single-stranded DNA template. This polymerization step is carried out at an incubation temperature of approx. 72 ° C.
Die nun vorliegende doppelsträngige DNA dient nun selbst als DNA-Matrize, von der ausgehend eine erneute Amplifizierung stattfindet. Im Anschluß beginnt folglich der nächste Zyklus wieder von vorn, d.h. mit dem Erhitzen, um die neu synthetisierten DNA-Stränge zu trennen. Nach 20 bis 30 Zyklen kann dann eine ursprünglich sehr geringe Menge DNA aufgrund der exponen- tiellen Anreicherung nachgewiesen werden.The double-stranded DNA now used itself serves as a DNA template, from which a new amplification takes place. Subsequently, the next cycle starts again, i.e. with heating to separate the newly synthesized strands of DNA. After 20 to 30 cycles, an originally very small amount of DNA can then be detected due to the exponential enrichment.
Die Durchführung einer PCR erfordert also das Durchlaufen eines sich periodisch wechselnden Inkubationstemperatur- und -zeiten- profils . Eine PCR wird üblicherweise in sogenannten Ther o- cyclern durchgeführt, in denen gewährleistet ist, daß z.B. die Denaturierungstemperatur innerhalb von wenigen Sekunden auf die Hybridisierungstemperatur erniedrigt wird. Dies erfordert eine aufwendige und kostenintensive technische Konstruktion, wodurch wiederum bei den Anwendern der PCR hohe Anschaffungskosten, z.B. für einen Thermocycler, verursacht werden.Carrying out a PCR therefore requires going through a periodically changing incubation temperature and time profile. A PCR is usually carried out in so-called thermocyclers, in which it is ensured that, for example, the denaturation temperature drops to within a few seconds Hybridization temperature is lowered. This requires a complex and cost-intensive technical construction, which in turn causes high costs for the users of the PCR, for example for a thermal cycler.
Gleichermaßen ist die Durchführung einer PCR mit relativ hohem Zeitaufwand verbunden, was besonders bei Routineuntersuchungen in klinischen Laboratorien zur Belastung des Personals führt. PCR-basierende Assays gefolgt von spezifisichen Hybridisie- rungsreaktionen erfordern nicht selten einen Zeitaufwand von mehr als 9 h.At the same time, carrying out a PCR is relatively time-consuming, which leads to strain on the personnel, particularly in the case of routine examinations in clinical laboratories. PCR-based assays followed by specific hybridization reactions often require more than 9 hours.
Ebenfalls nachteilig bei einem PCR-basierenden Verfahren ist, daß nur DNA-Abschnitte direkt amplifiziert werden können. Zum Nachweis von RNA-Abschnitten über PCR muß die RNA zuvor mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in eine DNA umkopiert werden, was zusätzlichen Arbeitsaufwand erfordert. Eine schnelle Möglichkeit der direkten Amplifizierung von RNA ist jedoch besonders bedeutend, da davon ausgegangen wird, daß ein Nachweis bspw. eines Pilzes über seine RNA in der Regel spezifischer ist als ein Nachweis über seine DNA. Es besteht folglich ein verstärktes Interesse an einem Nachweis von z.B. humanpathogenen Erregern über deren RNA.Another disadvantage of a PCR-based method is that only DNA sections can be amplified directly. To detect RNA sections using PCR, the RNA must first be copied into DNA using an RNA-dependent DNA polymerase, which requires additional work. A quick way of direct amplification of RNA is particularly important, however, since it is assumed that detection of a fungus, for example, via its RNA is generally more specific than detection via its DNA. There is therefore an increased interest in the detection of e.g. human pathogens via their RNA.
Ein weiterer Nachteil bei PCR-basierenden Nachweisverfahren ist, daß als Ausgangsmaterial, d.h. als zu untersuchende Probe, relativ viel Material bereitgestellt werden muß. So ist z.B. für einen effizienten PCR-basierenden Nachweis einer Pilzinfektion ein Blutprobenvolumen von ca. 5 ml erforderlich. Wie die Erfinder in eigenen Studien feststellen konnten, sind kommerziell erhältliche PCR-Puffer außerdem häufig mit DNA aus Saccharomyces cerevisiae und Acremonium spp . kontaminiert. Bei einer PCR kann es aufgrund der auf DNA-Matrizen ausgerichteten Amplifizierungsreaktion deshalb zur Verfälschung der Testergebnisse kommen, was wiederum falsch positive Ergebnisse produzieren kann. Auch aus diesem Grund wird angestrebt, auf eine möglichst schnelle und effiziente Art und Weise den Nachweis der entsprechenden Pathogene direkt über deren RNA, nicht DNA zu führe .Another disadvantage of PCR-based detection methods is that a relatively large amount of material has to be provided as the starting material, ie as the sample to be examined. For example, a blood sample volume of approximately 5 ml is required for efficient PCR-based detection of a fungal infection. As the inventors have been able to determine in their own studies, commercially available PCR buffers are also frequently containing DNA from Saccharomyces cerevisiae and Acremonium spp. contaminated. A PCR can therefore lead to falsification of the test results due to the amplification reaction aimed at DNA matrices, which in turn can produce false positive results. For this reason too, the aim is to carry out the detection of the relevant pathogens directly via their RNA, not DNA, in the fastest and most efficient way possible.
Ebenfalls nachteilig bei einer PCR ist, daß der sogenannte positive Vorhersagewert (ppv), also die Wahrscheinlichkeit, bei einem positiven Testergebnis an einer bestimmten Krankheit zu leiden, relativ niedrig ist.Another disadvantage of a PCR is that the so-called positive predictive value (ppv), that is, the probability of suffering from a certain disease if the test result is positive, is relatively low.
Von "Widjojoatmodjo et al., 1999, Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) detection of medically important candida species, J. Microbiol. Methods 38, 81-90" wurden zwei Nuklein- säuremoleküle beschrieben, die in einem Verfahren, das auf der Amplifizierung einer rRNA-Sequenz basiert (NASBA-Verfahren) , eingesetzt werden können. Die Verwendung der dort beschriebenen Nukleinsäuremoleküle erfordert keine Durchführung einer PCR. Den Autoren gelingt mit diesen beiden Nukleinsäuremolekülen der allgemeine Nachweis von Pilzen der Gattung Candida, wobei zwischen C. glabrata , C. krusei und C. lusitaniae unterschieden werden kann. Von Nachteil ist hier, daß kein gattungsspezifischer Nachweis der, wie eingangs aufgeführt, besonders bedeutenden humanpathogenen Aspergillus-Pilze möglich ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, mindestens ein weiteres Nukleinsauremolekul bereitzustellen, mit dem ein PCR-unabhängiger Nachweis von Pilzen gelingt und mit dem insbesondere auch erstmals ein PCR-unabhängiger Nachweis von Pilzen der Gattung Aspergillus möglich wird."Widjojoatmodjo et al., 1999, Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) detection of medically important candida species, J. Microbiol. Methods 38, 81-90" described two nucleic acid molecules which were used in a method based on based on the amplification of an rRNA sequence (NASBA method), can be used. The use of the nucleic acid molecules described there does not require a PCR to be carried out. With these two nucleic acid molecules, the authors succeed in the general detection of fungi of the genus Candida, a distinction being made between C. glabrata, C. krusei and C. lusitaniae. It is disadvantageous here that no genus-specific detection of the Aspergillus fungi which are particularly important as pathogenic to humans, as mentioned at the beginning, is possible. The object of the present invention is therefore to provide at least one further nucleic acid molecule with which PCR-independent detection of fungi is possible and with which PCR-independent detection of fungi of the genus Aspergillus in particular is also possible for the first time.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Nukleinsauremolekul bereitgestellt wird, das eine der folgenden Nukleotidsequenzen um aßt:This object is achieved in that a nucleic acid molecule is provided which has one of the following nucleotide sequences:
SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz, die an eine Sequenz bindet, an die auch eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 bindet.SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence that binds to a sequence to which one of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 binds.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollständig gelöst. Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß mit den vorstehend genannten Nukleotidsequenzen einerseits Pilze aus dem gesamten Pilzreich erfaßt werden und andererseits ein spezifischer Nachweis von Pilzen der Gattung Aspergillus gelingt.The object underlying the invention is hereby completely achieved. The inventors have recognized that fungi from the entire fungus kingdom are detected on the one hand with the nucleotide sequences mentioned above and on the other hand that fungi of the genus Aspergillus can be specifically detected.
Die zugrunde liegende Aufgabe wird erfindungsgemäß nicht nur durch ein Nukleinsauremolekul mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll gelöst, sondern auch durch ein solches Nukleinsauremolekul, das an dieselben Sequenzen bindet, an die auch, das Nukleinsauremolekul mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 3 bindet. Hiermit werden insbesondere solche Nukleinsäuremoleküle erfaßt, bei denen die im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen ein Bestandteil einer längeren Sequenz sind. Selbst wenn bei den im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen einzelne Nukleotid- austausche vorgenommen werden, behalten diese Moleküle i.d.R. ihre hochselektive Affinität, so daß auch ein derart charakterisiertes Nukleinsauremolekul ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.The underlying object is achieved not only by a nucleic acid molecule with one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing, but also by such a nucleic acid molecule that binds to the same sequences to which also Nucleic acid molecule with one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 3 binds. In particular, nucleic acid molecules are hereby recorded in which the sequences listed in the sequence listing are part of a longer sequence. Even if individual nucleotide exchanges are carried out in the sequences listed in the sequence listing, these molecules generally retain their highly selective affinity, so that a nucleic acid molecule characterized in this way is also the subject of the present invention.
Das vorstehend Gesagte gilt für sämtliche erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleotidsequenzen aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll, für ihre erfindungsgemäße Verwendung sowie für ihren Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren.The above applies to all nucleic acid molecules or nucleotide sequences according to the invention from the enclosed sequence listing, to their use according to the invention and to their use in the method according to the invention.
Ein Nukleinsauremolekul mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2 eignet sich besonders zum Nachweis einer allgemeinen Pilzinfektion. Dieses Nukleinsauremolekul bindet nämlich an die im Reich der Pilze hochkonservierte 18S-rRNA-Sequenz, so daß mittels des vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküls der Nachweis von Pilzen aus dem gesamten Pilzreich gelingt. Damit wird sichergestellt, daß selbst bisher relativ unbedeutende oder außergewöhnliche Pilzspezies erfaßt werden.A nucleic acid molecule with the sequence SEQ ID No. 1 and / or SEQ ID No. 2 is particularly suitable for the detection of a general fungal infection. This nucleic acid molecule binds to the 18S rRNA sequence that is highly conserved in the realm of fungi, so that the above-mentioned nucleic acid molecule enables the detection of fungi from the entire fungus realm. This ensures that even previously insignificant or unusual mushroom species are recorded.
Mit dem Nukleinsauremolekul mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2 kann selektiv Pilz-RNA PCR-unabhängig amplifiziert werden, wobei Pilz-DNA nicht amplifiziert wird. Dadurch werden die eingangs genannten Nachteile, die sich aus der PCR ergeben, vermieden.With the nucleic acid molecule with the sequence SEQ ID No. 1 and / or SEQ ID No. 2, fungal RNA can be amplified selectively independently of the PCR, wherein fungal DNA is not amplified. This avoids the disadvantages mentioned at the outset, which result from the PCR.
Ein Nukleinsauremolekul, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 umfaßt, eignet sich besonders als Hybridisierungssonde, z.B. im Rahmen einer spezifischen Analyse auf das Vorhandensein von Pilzen der Gattung Aspergillus. Die Erfinder konnten nachweisen, daß mittels dieses Nukleinsäuremoleküls die wichtigsten humanpathogenen Aspergillus-Pilze bzw. deren Nukleinsäuren erkannt werden. Dabei war die Kreuzreaktivität mit anderen Nicht- Aspergillus-Pilzen oder auch Viren vernachlässigbar gering.A nucleic acid molecule which comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 is particularly suitable as a hybridization probe, for example in the As part of a specific analysis for the presence of fungi of the genus Aspergillus. The inventors were able to demonstrate that the most important human-pathogenic Aspergillus fungi or their nucleic acids are recognized by means of this nucleic acid molecule. The cross-reactivity with other non-Aspergillus fungi or viruses was negligible.
Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls hat somit den besonderen Vorteil, daß hiermit ein weiteres Werkzeug für einen PCR-unabhängigen Nachweis von Pilzen vorhanden ist, insbesondere erstmals PCR-unabhängig Pilz-RNA der Gattung Aspergillus spezifisch nachgewiesen werden kann.The provision of the nucleic acid molecule according to the invention thus has the particular advantage that a further tool for PCR-independent detection of fungi is present, in particular for the first time PCR-independent fungus RNA of the genus Aspergillus can be specifically detected.
Aufgrund des vorstehend Gesagten ist es besonders bevorzugt, das erfindungsgemäße Nukleinsauremolekul zum Nachweis von Pilzen, vorzugsweise in klinischem Material, mittels "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification" (NASBA) zu verwenden, wobei als erster Primer ein Nukleinsauremolekul verwendet wird, das neben einer geeigneten Promotorsequenz die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 1 bindet, und als zweiter Primer ein Nukleinsauremolekul verwendet wird, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 2 bindet.Based on the above, it is particularly preferred to use the nucleic acid molecule according to the invention for the detection of fungi, preferably in clinical material, by means of "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification" (NASBA), a nucleic acid molecule being used as the first primer which, in addition to a suitable one Promoter sequence comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 from the enclosed sequence listing or a sequence that binds to such a sequence to which SEQ ID No. 1 also binds, and a nucleic acid molecule that uses the nucleotide sequence SEQ ID No. is used as the second primer. 2 from the enclosed sequence listing or a sequence which binds to such a sequence to which SEQ ID No. 2 also binds.
Die erfindungsgemäße Verwendung hat den besonderen Vorteil, eine effiziente Amplifikation pilzspezifischer RNA und damit einen besonders spezifischen Nachweis von Pilzen zu ermöglichen, wobei es keiner PCR bedarf. Bei NASBA handelt es sich um eine Primer-abhängige Technologie für die kontinuierliche Amplifizierung von Nukleinsäuren, insbesondere RNA. Sie kann in einem einzelnen Reaktionsansatz bei konstanter Temperatur durchgeführt werden. Ein Überblick über die Technologie ist in "Compton, 1991, Nucleic acid sequence- based amplification, Nature 350, 91-92" dargestellt. Die wichtigsten Schritte der NASBA-Amplifizierung sind unten im Beispiel 2 unter Bezugnahme auf Fig. 1 erläutert. Als Vorteil sei hier lediglich erwähnt, daß zur Durchführung von NASBA keine SpezialVorrichtungen, wie etwa ein Thermocycler, erforderlich sind.The use according to the invention has the particular advantage of enabling an efficient amplification of mushroom-specific RNA and thus a particularly specific detection of fungi, with no PCR being required. NASBA is a primer-dependent technology for the continuous amplification of nucleic acids, especially RNA. It can be carried out in a single reaction batch at constant temperature. An overview of the technology is presented in "Compton, 1991, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature 350, 91-92". The main steps of NASBA amplification are explained below in Example 2 with reference to FIG. 1. The only advantage to be mentioned here is that no special devices such as a thermal cycler are required to carry out NASBA.
Besonders überraschend war, daß die erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 als NASBA-Primer zu einer hochselektiven Amplifikation von Pilz-RNA führt, wobei bereits geringe Mengen an Templates ausreichen. Dies war nicht zu erwarten, da die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen keinerlei Homologien zu den von Widjo- joatmodjo entwickelten (a.a.O.) aufweisen.It was particularly surprising that the use according to the invention of the nucleic acid molecules with the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 as NASBA primers leads to a highly selective amplification of fungal RNA, with even small amounts of templates being sufficient. This was not to be expected, since the nucleotide sequences according to the invention have no homologies with those developed by Widjojoatmodjo (cited above).
Die Erfinder konnten zeigen, daß das Nukleinsauremolekul mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 eine besonders hohe Affinität zur 18S-rRNA-Sequenz der Pilze aufweist, wobei das Nukleinsauremolekul mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 wiederum eine besonders hohe Affinität für die während der nicht-zyklischen Phase des NASBA-Prozesses gebildete cDNA-Kopie und für die während der zyklischen Phase (s.u.) transkribierte RNA aufweist.The inventors were able to show that the nucleic acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 has a particularly high affinity for the 18S rRNA sequence of the fungi, the nucleic acid molecule with the sequence SEQ ID No. 2 in turn having a particularly high affinity for the during the non-cyclic phase of the NASBA process formed cDNA copy and for the RNA transcribed during the cyclic phase (see below).
Die Erfinder gehen davon aus, daß der Einsatz des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in einem NASBA-basierenden Nachweisverfahren zu einem deutlich erhöhten positiven Vorhersage- wert (ppv) im Vergleich zum Einsatz entsprechender Nuklein- säuremoleküle in PCR-basierenden Verfahren führt.The inventors assume that the use of the nucleic acid molecule according to the invention in a NASBA-based detection method leads to a significantly increased positive prediction. value (ppv) compared to the use of appropriate nucleic acid molecules in PCR-based methods.
In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung umfaßt die obengenannte geeignete Promotorsequenz die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll.In a preferred development of the invention, the above-mentioned suitable promoter sequence comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 4 from the enclosed sequence listing.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß damit eine Promotorsequenz bereitgestellt wird, die einen effizienten NASBA-basierenden Nachweis von Pilzen mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul ermöglicht. In vorteilhafter Art und Weise werden somit die technischen Voraussetzungen für den Einsatz des Nukleinsäuremoleküls in einem NASBA-Assay geschaffen. Bei der Sequenz SEQ ID Nr. 4 handelt es sich um eine solche Sequenz, die durch die T7-RNA-Polymerase spezifisch erkannt wird. Bei Vorliegen eines transkriptionsaktiven doppelsträngigen T7-spezifisσhen Promotors wird somit die Synthese der entsprechenden RNA ermöglicht.This has the particular advantage that it provides a promoter sequence which enables an efficient NASBA-based detection of fungi with the nucleic acid molecule according to the invention. The technical requirements for the use of the nucleic acid molecule in a NASBA assay are thus advantageously created. Sequence SEQ ID No. 4 is such a sequence that is specifically recognized by the T7 RNA polymerase. If a transcription-active double-stranded T7-specific promoter is present, the synthesis of the corresponding RNA is thus made possible.
Eine bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung ist es, wenn zum Nachweis von Aspergillus Pilz-RNA mit einem Nukleinsauremolekul hybridisiert wird, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 3 bindet.A preferred embodiment of the use according to the invention is for the detection of Aspergillus fungal RNA to be hybridized with a nucleic acid molecule which comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence which binds to such a sequence to which SEQ ID No. 3 binds.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß im Anschluß an den Nachweis einer allgemeinen Pilzinfektion abgeklärt wird, ob die Infektion durch die Gattung Aspergillus hervorgerufen wurde. Nur durch eine zuverlässige Diagnose kann nämlich eine spezifisch gegen Aspergillus gerichtete Therapie erfolgen. Besonders vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang, daß das Nukleinsäure- molekül mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 selbst unter stringenten Bedingungen eine spezifische Affinität zu den klinisch am meisten relevanten Aspergillus-Spezies hat. So gelingt den Erfindern die Detektion von RNA der Aspergillus-Spezies A . fυmigatus, A . flavus, A . niger, A . versicolor und A . gla cus .This has the particular advantage that, following the detection of a general fungal infection, it is clarified whether the infection was caused by the Aspergillus genus. Only with a reliable diagnosis can therapy specifically target Aspergillus. In this context, it is particularly advantageous that the nucleic acid Molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 has a specific affinity for the clinically most relevant Aspergillus species even under stringent conditions. This is how the inventors succeeded in detecting RNA from Aspergillus species A. fυmigatus, A. flavus, A. niger, A. versicolor and A. gla cus.
RNA weiterer Pilze, wie z.B. Candida albicans , Acremonium cry- sogenum, Rhizopus oryzae, Fusarium solani , Absidia corymbxferaf Curvularia inaequalis oder auch Scropulariopsis brevicaulis kreuzreagiert mit dem erfindungsgemäßen Molekül mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 nicht. Auch die Nukleinsäuren von Cytomegalovirύs oder von menschlichen Fibroblasten werden nicht erfaßt. Diese besondere Spezifität macht das vorstehend genannte Nukleinsauremolekul als Hybridisierungssonde für den Nachweis von Aspergillus besonders geeignet«,RNA of other fungi such as Candida albicans, Acremonium cry-sogum, Rhizopus oryzae, Fusarium solani, Absidia corymbxfera f Curvularia inaequalis or Scropulariopsis brevicaulis does not cross-react with the molecule according to the invention with the sequence SEQ ID No. 3. The nucleic acids of cytomegaloviruses or of human fibroblasts are also not detected. This particular specificity makes the above-mentioned nucleic acid molecule particularly suitable as a hybridization probe for the detection of Aspergillus «,
Aufgrund dieser Spezifität ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder einer Sequenz, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 3 bindet, oder mit einer zu den vorstehenden Sequenzen komplementären Sequenz, zum Nachweisen von Aspergillus.Because of this specificity, the present invention also relates to the use of a nucleic acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence that binds to such a sequence to which SEQ ID No. 3 also binds, or to one the above sequences complementary sequence for the detection of Aspergillus.
Weiter bevorzugt ist es, wenn das zum Hybridisieren verwendete Nukleinsauremolekul an eine Trägermatrix gebunden ist.It is further preferred if the nucleic acid molecule used for the hybridization is bound to a carrier matrix.
Als Trägermatrix eignen sich z.B. Separose oder paramagnetisσhe Kugeln. In letzterem Fall wird durch die Ankopplung der in Rede stehenden Nukleinsäure an die paramagnetischen Kugeln eine spezifische Analyse der Pilz-RNA besonders erleichtert. Durch An- legen eines Magnetfeldes an den Reaktionsansatz können nach Ausbildung der Hybride die angekoppelte Hybridisierungssonde bzw. die Hybride abgetrennt werden. Außerdem kann so auf einfache Art sichergestellt werden, daß während der mit Puffer durchzuführenden Waschschritte verhindert wird, daß Hybride entfernt werden und diese anschließend nicht vermessen werden.Separose or paramagnetic spheres are suitable as carrier matrix. In the latter case, a specific analysis of the fungal RNA is particularly facilitated by the coupling of the nucleic acid in question to the paramagnetic spheres. By arrival Applying a magnetic field to the reaction batch, the coupled hybridization probe or the hybrids can be separated after the formation of the hybrids. In addition, it can thus be ensured in a simple manner that during the washing steps to be carried out with buffer it is prevented that hybrids are removed and these are not subsequently measured.
In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist das zum Hybridisieren verwendete Nukleinsauremolekul direkt oder indirekt mit einer Peroxidase gekoppelt.In a preferred development of the invention, the nucleic acid molecule used for hybridization is coupled directly or indirectly to a peroxidase.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß somit eine Hybridisierungssonde bereitgestellt wird, die in gängigen Detektions- verfahren einsetzbar ist. Dieses Enzym setzt in Gegenwart von H202 ein spezifisches chromogenes Substrat um, wobei dann die resultierende Farbreaktion photometrisch vermessen werden kann.This has the particular advantage that it provides a hybridization probe that can be used in common detection methods. In the presence of H 2 0 2, this enzyme converts a specific chromogenic substrate, in which case the resulting color reaction can then be measured photometrically.
In diesem Zusammenhang ist insbesondere an die Detektion mittels Enhanced Chemilumineszenz/Elektrochemilumineszenz(ECL)- Technologie gedacht. Hier oxidiert die gekoppelte Peroxidase in Gegenwart eines chemischen Enhancers und H202 am Ort ihrer Lokalisation Luminol. Dies führt zur Emission von Licht (= Lumineszenz), das z.B. über die Schwärzung eines Autoradiographie- films oder mittels einer Photozelle sichtbar gemacht werden kann, was wiederum das Vorhandensein von Pilz-RNA in der Probe anzeigt.In this context, detection by means of enhanced chemiluminescence / electrochemiluminescence (ECL) technology is particularly intended. Here the coupled peroxidase oxidizes luminol in the presence of a chemical enhancer and H 2 0 2 at the location of its location. This leads to the emission of light (= luminescence), which can be made visible, for example, by blackening an autoradiography film or by means of a photo cell, which in turn indicates the presence of fungal RNA in the sample.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von Pilzen in klinischem Material, mit den Schritten: a) Bereitstellung von Pilz-RNA aus klinischem Material, undThe present invention also relates to a method for the detection of fungi in clinical material, comprising the steps: a) provision of fungal RNA from clinical material, and
b) Nachweis der Pilz-RNA unter Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls.b) Detection of the fungal RNA using the nucleic acid molecule according to the invention.
Vor dem Hintergrund des vorstehend Gesagten wird vorzugsweise das Nukleinsauremolekul mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 zur Amplifizierung der Pilz-RNA verwendet. Das Amplifikat kann dann z.B. mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt werden und mit Ethidiumbromid angefärbt werden. Das Amplifikat kann außerdem über eine Hybridisierungsreaktion einer spezies- oder gattungsspezifischen Analyse unterzogen werden. Für eine Analyse auf Aspergillus-spezifische RNA eignet sich besonders eine Sonde, die die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 umfaßt.Against the background of the above, the nucleic acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 is preferably used for the amplification of the fungal RNA. The amplificate can then e.g. be separated by SDS gel electrophoresis and stained with ethidium bromide. The amplificate can also be subjected to a species- or genus-specific analysis via a hybridization reaction. A probe comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 according to the invention is particularly suitable for analysis for Aspergillus-specific RNA.
In einer bevorzugten Weiterbildung wird in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Schockgefrieren des klinischen Materials, vorzugsweise in flüssigem Stickstoff durchgeführt, anschließend erfolgt eine Hitzebehandlung des klinischen Materials, vorzugsweise für 1 bis 5 min bei 50 bis 70 °C.In a preferred development, in step a) of the method according to the invention, the clinical material is shock-frozen, preferably in liquid nitrogen, followed by heat treatment of the clinical material, preferably for 1 to 5 minutes at 50 to 70 ° C.
Die Erfinder haben erkannt, daß diese Vorgehensweise gewährleistet, daß sämtliche Pilzzellen aufgebrochen werden und die Template-RNA vollständig freigesetzt wird. Damit wird verhindert, daß die Zellwand der Pilzzellen aufgrund ihrer Komplexität intakt bleibt, so daß dann das nachzuweisende Template nicht amplifiziert werden kann und somit ein falsch-negatives Ergebnis erzielt wird. Das Erfordernis dieses Vorgehens, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, war deshalb besonders überraschend, da in dem von Widjojoatmodjo et al. beschriebenen Verfahren (a.a.O.) gleichermaßen Pilzzellen in klinischem Material nachgewiesen werden sollen, sich jedoch keinerlei Hinweise darauf finden lassen, daß solch eine Behandlung des Materials für ein effizientes Erfassen von Pilz-RNA notwendig ist. In dem bekannten Verfahren werden die mit Konidien versehenen vorbehandelten Blutproben lediglich mit Detergenz inkubiert, wodurch nicht sichergestellt ist, daß sämtliche Pilzzellen tatsächlich aufgeschlossen werden.The inventors have recognized that this procedure ensures that all fungal cells are broken open and the template RNA is released completely. This prevents the cell wall of the fungal cells from remaining intact due to their complexity, so that the template to be detected cannot then be amplified and a false negative result is thus achieved. The requirement of this procedure in order to obtain reliable results was particularly surprising, since in the Widjojoatmodjo et al. described methods (loc. cit.) are to be detected equally in clinical material, but no evidence can be found that such a treatment of the material is necessary for an efficient detection of fungal RNA. In the known method, the pretreated blood samples provided with conidia are only incubated with detergent, which does not ensure that all fungal cells are actually disrupted.
Die vorstehend genannte Vorgehensweise ist besonders vorteilhaft, wenn Pilze der Gattung Aspergillus in klinischem Material erfaßt bzw. nachgewiesen werden sollen. Diese Pilze zeichnen sich nämlich durch eine besonders komplex aufgebaute und stabile Zellwand aus .The above-mentioned procedure is particularly advantageous if fungi of the Aspergillus genus are to be recorded or detected in clinical material. These fungi are characterized by a particularly complex and stable cell wall.
Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweis von Pilzen der Gattung Aspergillus in klinischem Material, mit den Schritten:Against this background, the subject of the present invention is also a method for the detection of fungi of the genus Aspergillus in clinical material, with the steps:
a) Bereitstellung von Aspergillus-Nukleinsäure aus klinischem Material; unda) provision of Aspergillus nucleic acid from clinical material; and
b) Nachweis der Aspergillus-Nukleinsäure, bei dem in Schritt a) das klinische Material vorzugsweise in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend einer Hitzebehandlung, vorzugsweise für 1 bis 5 min bei 50 bis 70 °C, unterzogen wird. In diesem Verfahren kann für den Nachweis der Aspergillus- Nukleinsäure jedes Verfahren, d.h. beispielsweise Elektrophorese/Ethidiumbromidfärbung, PCR, RT-PCR, NASBA etc., verwendet werden, das die Detektion von Aspergillus-spezifischer Nuklein- säure ermöglicht.b) Detection of the Aspergillus nucleic acid, in which in step a) the clinical material is preferably snap frozen in liquid nitrogen and then subjected to a heat treatment, preferably for 1 to 5 minutes at 50 to 70 ° C. In this method, any method, for example electrophoresis / ethidium bromide staining, PCR, RT-PCR, NASBA etc., can be used for the detection of the Aspergillus nucleic acid, which enables the detection of Aspergillus-specific nucleic acid.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Kit, das ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul enthält und ein Kit zur Durchführung der vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren.The invention further relates to a kit which contains a nucleic acid molecule according to the invention and a kit for carrying out the above methods according to the invention.
Die Bereitstellung solcher Kits hat den Vorteil, daß durch die Zusammenstellung sämtlicher Reagenzien und/oder Nukleinsäure- moleküle, Reaktionsbehältnisse bzw. Teilen davon, einer detaillierten Benutzeranweisung etc. mögliche Fehler in der Durchführung der Verfahren bzw. der erfindungsgemäßen Verwendung des beanspruchten Nukleinsäuremoleküls vermieden werden. Dadurch wird insbesondere der Situation in Kliniken Rechnung getragen, in denen häufig angelerntes Personal mit der Durchführung solcher Verfahren betraut wird.The provision of such kits has the advantage that possible errors in the implementation of the methods or the use according to the invention of the claimed nucleic acid molecule are avoided by compiling all the reagents and / or nucleic acid molecules, reaction containers or parts thereof, detailed user instructions, etc. This takes into account in particular the situation in clinics in which frequently trained personnel are entrusted with the implementation of such procedures.
Es versteht sich, daß die vorstehend erwähnten Merkmale nicht nur in angegebener Kombination, sondern auch einzeln oder in anderer Kombination verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the features mentioned above can be used not only in the specified combination, but also individually or in another combination, without departing from the scope of the present invention.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen und Abbildungen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben.The invention is explained below with the aid of examples and illustrations, from which further features and advantages result.
Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Darstellung des NASBA-Assays; undShow it: 1 is a schematic representation of the NASBA assay; and
Fig. 2 den Einfluß der Zeit zwischen Probennahme auf die Menge der nachzuweisenden RNA.Fig. 2 shows the influence of the time between sampling on the amount of RNA to be detected.
Beispiel 1: Bereitstellung von Pilz-RNAExample 1: Provision of fungal RNA
Patienten, die auf eine Pilzinfektion untersucht werden sollen, wird eine Blutprobe von mindestens 100 μl entnommen. Zur Verhinderung der Koagulation wird standardmäßig EDTA hinzugefügt. Anschließend werden dem Blut 300 μl RLT-Lysepuffer (Qiagen, Hilden, Deutschland) zugesetzt. Der Ansatz wird für eine Dauer von 15 s in flüssigen Stickstoff eingebracht. Darauf folgt eine dreiminütige Inkubation des Ansatzes bei 60 °C. Durch diese Schritte wird das Aufbrechen der Pilzzellwand und das Freisetzen der Pilznukleinsäure gewährleistet.A blood sample of at least 100 μl is taken from patients who are to be examined for a fungal infection. EDTA is added by default to prevent coagulation. Then 300 μl RLT lysis buffer (Qiagen, Hilden, Germany) are added to the blood. The batch is introduced into liquid nitrogen for a period of 15 s. This is followed by a three-minute incubation of the mixture at 60 ° C. These steps ensure that the fungal cell wall is broken open and the fungal nucleic acid is released.
Dem Ansatz werden 18 μl RNA Secure (Ambion, Austin, USA) zugesetzt. Der Ansatz wird für 20 min bei 60 °C inkubiert. Anschließend werden 660 μl RLT-Lysepuffer zugesetzt. Der Ansatz wird auf eine QiaShredder-Säule (Qiagen, Hilden, Deutschland) gegeben und für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifu- giert.18 μl RNA Secure (Ambion, Austin, USA) are added to the mixture. The mixture is incubated at 60 ° C. for 20 min. Then 660 ul RLT lysis buffer are added. The batch is placed on a QiaShredder column (Qiagen, Hilden, Germany) and centrifuged for 2 min at maximum speed.
Der Durchfluß mit der Gesamt-Nukleinsäure wird in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Dem Ansatz werden daraufhin 330 μl Ethanol (96 bis 100 %) zugefügt. Der Ansatz wird dann auf eine Spin-Säule (Qiagen, Hilden, Deutschland) gegeben, an die die Gesamt-Nukleinsäure bindet, und die beladene Säule für 15 s bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluß wird verworfen. Es folgen zwei Waschschritte: Zuerst werden 700 μl RWl-Wasch- puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland) zugegeben, die Säule für 15 s bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Daraufhin werden 500 μl RPE-Waschpuffer (Qiagen, Hilden, Deutschland) zugegeben, die Säule für 15 s bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Durchfluß verworfen.The flow with the total nucleic acid is transferred to a fresh reaction vessel. Then 330 μl of ethanol (96 to 100%) are added to the batch. The mixture is then placed on a spin column (Qiagen, Hilden, Germany), to which the total nucleic acid binds, and the loaded column is centrifuged for 15 s at 10,000 rpm. The flow is discarded. Two washing steps follow: First, 700 μl of RWI wash buffer (Qiagen, Hilden, Germany) are added, the column is centrifuged for 15 s at 10,000 rpm and the flow is discarded. Then 500 μl of RPE wash buffer (Qiagen, Hilden, Germany) are added, the column is centrifuged for 15 s at 10,000 rpm and the flow is discarded.
Die Säule wird dann nochmals mit 500 μl RPE-Waschpuffer gewaschen und für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Durchfluß wird verworfen.The column is then washed again with 500 μl of RPE wash buffer and centrifuged for 2 min at maximum speed. The flow is discarded.
Die auf der Säule gebundene Pilz-RNA, sofern in der Probe vorhanden, wird durch die Zugabe von 40 μl RNase-freiem Wasser (Qiagen, Hilden, Deutschland) und anschließender Zentrifugation für 1 min bei 10. 000 rpm eluiert. Der Säule wird nochmals 40 μl RNase-freies Wasser zugegeben. Dann wird abermals für 1 min bei 10.000 rpm zentrifugiert bzw. eluiert.The fungal RNA bound to the column, if present in the sample, is eluted by adding 40 μl RNase-free water (Qiagen, Hilden, Germany) and then centrifuging for 1 min at 10,000 rpm. Another 40 μl RNase-free water is added to the column. Then centrifuged or eluted again at 10,000 rpm for 1 min.
Die beiden Eluate werden gepoolt, so daß sich ein Gesamtvolumen von 80 μl ergibt, und bei -80 °C aufbewahrt.The two eluates are pooled to give a total volume of 80 μl and stored at -80 ° C.
Alternativ kann die Extraktion eventuell vorhandener Pilz-RNA durch die Verwendung des Isolationsmoduls durchgeführt werden, das in dem NASBA Basic Kit (Organon Teknika, Boxtel, Niederlande) enthalten ist. Dazu werden zu 100 μl Blutprobe 900 μl Lyse- puffer zugesetzt und in flüssigen Stickstoff für 15 bis 20 s eingebracht, anschließend für 3 min bei 60° inkubiert.Alternatively, extraction of any fungal RNA that may be present can be performed using the isolation module that is included in the NASBA Basic Kit (Organon Teknika, Boxtel, The Netherlands). For this purpose, 900 μl lysis buffer are added to 100 μl blood sample and placed in liquid nitrogen for 15 to 20 s, then incubated for 3 min at 60 °.
Daraufhin werden 50 μl RNA Secure zugegeben und für 20 min bei 60 °C im Thermoblock inkubiert. Unter Verwendung von Silica- Suspension wird die RNA, wie in der Bedienungsanleitung des Kits angegeben, isoliert und gereinigt. Mittels Waschpuffer, Ethanol und Aceton werden Waschschritte durchge ührt. So werden 40 μl Eluat erhalten und bei -80 °C aufbewahrt.Then 50 μl RNA Secure are added and incubated for 20 min at 60 ° C in a thermoblock. Using silica suspension, the RNA as described in the operating instructions of the Kits specified, isolated and cleaned. Washing steps are carried out using washing buffer, ethanol and acetone. 40 μl of eluate are obtained in this way and stored at -80 ° C.
Beispiel 2: NÄSBA-AmplifikationExample 2: NÄSBA amplification
Ein Standard-NASBA-Reaktionsansatz enthält T7-RNA-Polymerase (T7 RNA Pol), RNase H, AMV (avion myeloblastosis virus ) -Reverse Transkriptase (RT) , Nukleosidtriphosphate, zwei spezifische Primer und geeignete Pufferkomponenten (vgl. Fig. 1). Der erste Primer (Primer 1) ist ungefähr 40 bis 50 Basen lang, mit durchschnittlich 20 Basen an seinem 3' -Ende, die komplementär zu dem 3 ' -Bereich der Zielsequenz sind. Das 5 ' -Ende dieses Primers enthält eine Promotorsequenz, die durch die T7-RNA-Polymerase erkannt wird. Der zweite Primer (Primer 2) hat eine ungefähre Länge von 20 bis 30 Basen, die sich von dem gegenüberliegenden (5 ' -Richtung) Bereich der Zielsequenz ableiten.A standard NASBA reaction mixture contains T7 RNA polymerase (T7 RNA Pol), RNase H, AMV (avion myeloblastosis virus) reverse transcriptase (RT), nucleoside triphosphates, two specific primers and suitable buffer components (see FIG. 1). The first primer (Primer 1) is approximately 40 to 50 bases long, with an average of 20 bases at its 3 'end that are complementary to the 3' region of the target sequence. The 5 'end of this primer contains a promoter sequence that is recognized by the T7 RNA polymerase. The second primer (primer 2) has an approximate length of 20 to 30 bases which are derived from the opposite (5 'direction) region of the target sequence.
Eine der Eigenschaften des NASBA-Systems ist dessen Fähigkeit, direkt spezifische Sequenzen einzelsträngiger RNA zu amplifi- zieren. Dazu wird das RNA-Template (+ Strang) dem oben beschriebenen Standard-NASBA-Reaktionsansatz zugegeben. In der sogenannten "nicht-zyklischen" Phase von NASBA, für die in der Fig. 1 schematisch die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle dargestellt sind, lagert sich Primer 1 an die RNA-Zielsequenz . Die AMV-Reverse Transkriptase verwendet die Desoxynukleosid- triphosphate, die ebenfalls im Ansatz sind, um das 3 ' -Ende des Primer 1 zu verlängern, wodurch eine cDNA-Kopie des Templates gebildet wird und sich ein RNA:DNA-Hybrid ausbildet. Die RNase H hydrolisiert die RNA des RNA:DNA-Hybrids. Demzufolge wird die ursprüngliche RNA abgebaut, wodurch eine einzelsträngige DNA (- Strang) zurückbleibt, an die sich Primer 2 anlagert. Die Reverse Transkriptase synthetisiert den zweiten DNA-Strang, was zur Ausbildung einer doppelsträngigen DNA (ds DNA) mit doppel- strängiger Promotorregion führt .One of the properties of the NASBA system is its ability to directly amplify specific sequences of single-stranded RNA. For this, the RNA template (+ strand) is added to the standard NASBA reaction mixture described above. In the so-called "non-cyclical" phase of NASBA, for which the respective nucleic acid molecules are shown schematically in FIG. 1, primer 1 is attached to the RNA target sequence. The AMV reverse transcriptase uses the deoxynucleoside triphosphates, which are also being used to extend the 3 'end of primer 1, which forms a cDNA copy of the template and forms an RNA: DNA hybrid. RNase H hydrolyzes the RNA of the RNA: DNA hybrid. As a result, the original RNA is broken down, creating a single-stranded DNA (- strand) remains, to which primer 2 attaches. The reverse transcriptase synthesizes the second strand of DNA, which leads to the formation of a double-stranded DNA (ds DNA) with a double-stranded promoter region.
Das dritte Enzym im Reaktionsansatz, die T7-RNA-Polymerase, transkribiert nun RNA-Kopien (- Strang) vom jetzt, wie in Fig. 1 angedeutet, transkriptionsaktiven Promotor, wobei der - Strang der DNA als Matrize dient. Dabei werden mehr als 100 Kopien von jedem Template-Molekül hergestellt. Jedes neue RNA- Molekül kann nun als Template für die Reverse Transkriptase in der sogenannten "zyklischen" Phase des NASBA-Prozesses verwendet werden. In dieser zyklischen Phase bindet Primer 2 zuerst an das Template, und die Aktion der Reversen Transkriptase verlängert diesen, wodurch ein RNA:DNA-Hybrid, wie vorher, gebildet wird. Die RNase H hydrolisiert den RNA-Strang, Primer 1 bindet an die resultierende Einzelstrang-DNA, und die Reverse Transkriptase synthetisiert DNA, was wieder zu einem transkriptionsaktiven Promotor führt.The third enzyme in the reaction mixture, the T7 RNA polymerase, now transcribes RNA copies (strand) of the now, as indicated in FIG. 1, transcription-active promoter, the strand of DNA serving as a template. More than 100 copies of each template molecule are made. Each new RNA molecule can now be used as a template for the reverse transcriptase in the so-called "cyclical" phase of the NASBA process. In this cyclical phase, primer 2 first binds to the template, and the action of the reverse transcriptase extends it, thereby forming an RNA: DNA hybrid, as before. RNase H hydrolyzes the RNA strand, primer 1 binds to the resulting single-stranded DNA, and reverse transcriptase synthesizes DNA, which again leads to a transcription-active promoter.
Die so amplifizierte RNA läßt sich dann z.B. über einfache SDS- Gelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung oder auch mittels Hybridisierungssonden nachweisen.The RNA amplified in this way can then be e.g. Detect by simple SDS gel electrophoresis with subsequent ethidium bromide staining or by means of hybridization probes.
Trotz der gesonderten Darstellung des sequentiellen Ablaufs des NASBA-Prozesses finden sämtliche Schritte simultan statt. Besonders von Vorteil ist hier, daß der gesamte Prozeß in einem Reaktionsansatz stattfindet und dieser bei konstanter Temperatur, bspw. 41 °C, durchgeführt wird. Der NASBA-Prozeß kommt, verglichen mit einigen ml bei PCR- gestützten Nachweisen, mit einem geringeren Ausgangsprobenvolumen von einigen μl aus. Auch erfordert der NASBA-Prozeß weniger Zyklen als eine PCR, um die gleiche Sensitivität zu erhalten. Nach bereits 4 oder 5 Zyklen ist mit NASBA die gleiche Amplifi- kation erreicht, wie nach 20 PCR-Zyklen. Aufgrund der geringeren Anzahl an durchzuführenden Amplifizierungszyklen ist der NASBA-Prozeß somit auch mit einem geringeren Fehler behaftet. Gleichermaßen ist der Zeitaufwand eines NASBA-Assays, der für die gesamte Inkubationszeit weniger als 4 h beträgt, gegenüber einem PCR-basierenden Assay drastisch reduziert.Despite the separate presentation of the sequential sequence of the NASBA process, all steps take place simultaneously. It is particularly advantageous here that the entire process takes place in one reaction batch and this is carried out at a constant temperature, for example 41 ° C. The NASBA process requires less initial sample volume of a few μl compared to a few ml for PCR-based detection. Also, the NASBA process requires fewer cycles than a PCR to get the same sensitivity. After 4 or 5 cycles, the same amplification is achieved with NASBA as after 20 PCR cycles. Due to the smaller number of amplification cycles to be carried out, the NASBA process is therefore also associated with a lower error. Similarly, the time required for a NASBA assay, which is less than 4 hours for the entire incubation period, is drastically reduced compared to a PCR-based assay.
Zur Durchführung der NASBA-Amplifizierung der aus Beispiel 1 bereitgestellten RNA wird ein Reaktionsansatz mit 5 μl des Eluats aus Beispiel 1 angesetzt, in dem gegebenenfalls die zu amplifizierende Ziel-RNA enthalten ist. Die Primer 1 (5'- AATTCΓAAΪΆCGACTCACΪΆΪΆGGG-GAGCAAAGGCCTGCTTTGAACA, die T7-Promotorregion ist kursiv gedruckt und durch einen Bindestrich abgeteilt) und Primer 2 (5' -GCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATA) sind gemäß Protokoll des Basic Kit Amplification Moduls (Organon Teknika, Boxtel, Niederlande) zu jeweils 0,5 iriM im Ansatz enthalten. Der Reaktionsansatz wird bei 65 °C für 5 min und anschließend bei 41 °C für weitere 5 min inkubiert. Danach werden 5 μl Enzym- lösung (AMV-RT, RNase H, T7-RNA-Polymerase, BSA und Sorbitol) zugegeben, und der Reaktionsmix wird für 90 min bei 41 °C zur isothermalen Amplifizierung der Pilz-RNA inkubiert.To carry out the NASBA amplification of the RNA provided from Example 1, a reaction mixture with 5 μl of the eluate from Example 1 is set up, which may contain the target RNA to be amplified. The primer 1 (5'- AATTCΓAAΪΆCGACTCACΪΆΪΆGGG-GAGCAAAGGCCTGCTTTGAACA, the T7 promoter region is printed in italics and separated by a hyphen) and primer 2 (5 '-GCCGCGGATTCAGCTCCAATA) are according to the protocol of the Basic Kit Amplification Module, Organon Tek Module, Organon Tek each contain 0.5 iriM in the approach. The reaction mixture is incubated at 65 ° C for 5 min and then at 41 ° C for a further 5 min. 5 μl of enzyme solution (AMV-RT, RNase H, T7-RNA polymerase, BSA and sorbitol) are then added, and the reaction mix is incubated for 90 min at 41 ° C. for isothermal amplification of the fungal RNA.
Beispiel 3: Detektion der amplifizierten Asperαillus-RNAExample 3: Detection of the amplified Asperαillus RNA
Zum Nachweis des Amplifizierungsproduktes aus Beispiel 2 werden die Detektionsreagenzien wie folgt präpariert: Das Nuklein- säuremolekül mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll, d.h. die Sonde, wird biotinyliert und an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kugeln gekoppelt. Die Kugel-Sonden-Suspension wird gevortext, bis sich eine dunkle Lösung ausbildet. Diese Suspension wird mit einer gene- rischen Ruthenium-markierten ECL(Enhanced Chemilumineszenz)- Sonde aus dem Basic Kit Amplification Modul vermischt.To detect the amplification product from Example 2, the detection reagents are prepared as follows: Acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 4 from the enclosed sequence listing, ie the probe, is biotinylated and coupled to streptavidin-coated paramagnetic spheres. The ball probe suspension is vortexed until a dark solution forms. This suspension is mixed with a generic ruthenium-labeled ECL (Enhanced Chemiluminescence) probe from the Basic Kit Amplification Module.
Zu 20 μl dieser Kugel-Sonden-Mischung werden 5 μl des aus Beispiel 2 erhaltenen verdünnten Amplifizierungsproduktes (1:10) zugegeben und für 30 min bei 41 °C inkubiert. Anschließend werden diesem Hybridisierungsansatz 300 μl des Assay-Puffers (Organon Teknika, Boxtel, Niederlande) zugesetzt, und es wird eine ECL-Reaktion im NucliSens Reader durchgeführt, wie in "Gudibande, S.R., J.H. Kenten, J. Link, K. Friedman, R.J. Mas- sey, 1992, Rapid, non-separation electrochemiluminscent DNA hy- bridization assays for PCR products, using 3 ' -labeled oligo- nucleotide probes, Mol. Cell. Probe, 6, 495-503", beschrieben. Der NucliSens Reader separiert automatisch Sonden, die mit der nachzuweisenden RNA Hybride ausgebildet haben, von freien Sonden, die nicht reagiert haben, und führt eine ECL-Reaktion durch. Die Intensität der gemessenen Lumineszenz ist hierbei proportional zur vorhandenen Aspergillus-RNA im Reaktionsansatz und ermöglicht den qualitativen und u.U. sogar quantitativen Nachweis von Aspergillus in der untersuchten Blutprobe.5 μl of the diluted amplification product (1:10) obtained from Example 2 are added to 20 μl of this ball-probe mixture and incubated at 41 ° C. for 30 min. 300 μl of the assay buffer (Organon Teknika, Boxtel, Netherlands) are then added to this hybridization batch, and an ECL reaction is carried out in the NucliSens Reader, as described in "Gudibande, SR, JH Kenten, J. Link, K. Friedman, RJ Massey, 1992, Rapid, non-separation electrochemiluminscent DNA hybridization assays for PCR products, using 3 '-labeled oligonucleotide probes, Mol. Cell. Probe, 6, 495-503 ". The NucliSens Reader automatically separates probes that have formed hybrids with the RNA to be detected from free probes that have not reacted and carries out an ECL reaction. The intensity of the measured luminescence is proportional to the Aspergillus RNA present in the reaction mixture and enables the qualitative and possibly even quantitative detection of Aspergillus in the blood sample examined.
Beispiel 4: Sensitivität und Selektivität der NASBA-Primer und der SondeExample 4: Sensitivity and selectivity of the NASBA primer and the probe
Zur Bestimmung der Sensitivität und Spezifität der neuen Nu- kleinsäuremoleküle bzw. Nukleotidsequenzen wird Blut aus gesunden Probanden mit A . fumigatus-Konidien versetzt. Die A . fumigatus-Kulturen (DSM 790) können bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) bezogen werden. Die Kulturen werden für 72 h bei 30 °C auf Sabouraud-Glucose-Agar kultiviert. Mit steriler Kochsalzlösung werden serielle Verdünnungen der Konidien hergestellt, bis die Suspension eine Dichte von 0,5 nach McFarland-Standard (ÄIO6 CFU (colony forming units, koloniebildende Einheiten) / ml), hat.To determine the sensitivity and specificity of the new nucleic acid molecules or nucleotide sequences, blood from healthy volunteers is labeled with A. fumigatus conidia offset. The A. fumigatus cultures (DSM 790) can be obtained from the German Collection for Microorganisms (DSM). The cultures are cultivated on Sabouraud glucose agar for 72 h at 30 ° C. Serial dilutions of the conidia are made with sterile saline until the suspension has a density of 0.5 according to the McFarland standard (EIO 6 CFU (colony forming units) / ml).
Zusätzlich werden Kulturen von Aspergillus flavus , Aspergillus niger, Candida albicans, Scopulariopsis brevicaulis , Curvularia inaequalis, Absidia corymbifera , Fusarium solani, Rhizopus ory- zae , Acremonium chrysogenum, Penicilliu brevicompactum, Peni- cillium chrysogenum, Alternaria alternata sowie von Cytomegalo- virus und menschlichen Fibroblasten angelegt.In addition, cultures of Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Candida albicans, Scopulariopsis brevicaulis, Curvularia inaequalis, Absidia corymbifera, Fusarium solani, Rhizopus oryzee, Acremonium chrysogenum, Penicilliu brevicompactumata, as well as Peni- cillium chrismogen alternate, and Peni- cillium chrysomalium alternate, Peni- cillium chrysomalium alternate, and Peni- cillium chrumo- genum alternate, as well as Peni- cillium alterna- mum, as well as Peni- cillium alternaria, and Peni- cillium alternata, as well as Peni- cillium alterna- mum, as well as Peni- cillium alterna- mum Fibroblasts applied.
Gesunden Probanden wird Blut entnommen, mit EDTA und den verdünnten A . fu igatus-Konidien bzw. den Zellen von den vorstehend genannten anderen Spezies versetzt. Die Konzentrationen der Konidien in Blut entsprechen je nach Verdünnung 106-101 CFU/ml, die der (Pilz-) Zellen aus den anderen Spezies ca. 106 Zellen/ml. Die RNA wird dann wie in Beispiel 1 beschrieben aus jeweils 100 μl Blut isoliert und gereinigt. D.h. im Fall der A . fumigatus-Ansätze wird die absolute Menge an RNA aus 105 bis 1 CFU isoliert. Von jedem Ansatz wird die RNA, gelöst in 5 μl H20, in die NASBA-Reaktion, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingesetzt. Die Detektion der amplifizierten RNA erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben.Blood is drawn from healthy subjects using EDTA and the diluted A. fu igatus conidia or the cells of the other species mentioned above. Depending on the dilution, the concentrations of the conidia in blood correspond to 10 6 -10 1 CFU / ml, those of the (fungal) cells from the other species approx. 10 6 cells / ml. The RNA is then isolated from 100 μl blood and purified as described in Example 1. Ie in the case of A. fumigatus approaches the absolute amount of RNA is isolated from 10 5 to 1 CFU. The RNA from each batch, dissolved in 5 μl of H 2 O, is used in the NASBA reaction as described in Example 2. The amplified RNA is detected as described in Example 3.
Um die Ergebnisse des NASBA-basierenden Verfahrens mit denen einer konventionellen PCR vergleichen zu können, wird parallel mit einigen der obigen Ansätze auch eine quantitative Light- Cycler-PCR (LC-PCR) durchgeführt. Die nachzuweisende DNA wird aus 100 μl Blut extrahiert, wie beschrieben in "Loeffler, J., H. Hebart, R. Bialek, L. Hagmeyer, D. Schmidt, F. Serey, M. Hartmann, J. Eucker und H. Einsele, 1999, Contaminations oσcu- ring in fungal PCR assay, J. Blin. Microbiol. 37, 1200-1202", unter Verwendung der rekombinanten Lyticase (SIGMA, Deissen- hofen, Deutschland) und dem QIAmp Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Ansätze werden standardmäßig RNase-behandelt .In order to be able to compare the results of the NASBA-based method with those of a conventional PCR, a quantitative light- Cycler-PCR (LC-PCR) performed. The DNA to be detected is extracted from 100 μl blood, as described in "Loeffler, J., H. Hebart, R. Bialek, L. Hagmeyer, D. Schmidt, F. Serey, M. Hartmann, J. Eucker and H. Einsele , 1999, Contaminations oσcuring in fungal PCR assay, J. Blin. Microbiol. 37, 1200-1202 ", using the recombinant Lyticase (SIGMA, Deissenhofen, Germany) and the QIAmp Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany ). The approaches are treated RNase by default.
Die DNA-Amplifikation wird mit Primern (5' -ATT GGA GGG CAA GTC TGG TG, 5'-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG, Roth, Karlsruhe, Deutschland) durchgeführt, die an konservierte Bereiche des Pilz 18S-rRNA-Gens binden. Die PCR wird als Real-time-PCR im Light-Cycler-Gerät durchgeführt. Dies ist beschrieben in "Loeffler, J., N. Henke, H. Hebart, D. Schmidt, L. Hagmeyer, U. Schumacher und H. Einsele, 2000, Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the Light Cycler system, J. Clin. Microbiol., 38, 586-590".DNA amplification is carried out with primers (5'-ATT GGA GGG CAA GTC TGG TG, 5'-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG, Roth, Karlsruhe, Germany) which bind to conserved regions of the fungus 18S rRNA gene , The PCR is carried out as real-time PCR in the light cycler device. This is described in "Loeffler, J., N. Henke, H. Hebart, D. Schmidt, L. Hagmeyer, U. Schumacher and H. Einsele, 2000, Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the Light Cycler system, J. Clin. Microbiol., 38, 586-590 ".
Das Detektionssyste basiert auf dem Fluoreszenz-Resonanz- Energietransfer (FRET) zwischen zwei verschiedenen spezifischen Sonden. Die Hybridisierungssonde 1 (5'-GTT CCC CCC ACA GCC AGT GAA GGC) ist mit Fluorescein markiert, die Hybridisierungssonde 2 (5'-TGA GGT TCC CCA GAA GGA AAG GTC CAG C) ist mit Light- Cycler-Red 640 markiert. Beide Sonden sind Aspergillus- gattungsspezifisch und können in Kopf-zu-Schwanz-Anordnung hybridisieren, wodurch die beiden fluoreszierenden Farbstoffe in unmittelbare Nähe gebracht werden. Ein Energietransfer zwischen den beiden Sonden resultiert in der Emission eines rot fluoreszierenden Lichts, das durch Photohybride gemessen werden kann. Die nachfolgende Tabelle stellt die Ergebnisse der Messungen mittels des neuen Verfahrens denen mittels konventioneller LC- PCR gegenüber:The detection system is based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two different specific probes. The hybridization probe 1 (5'-GTT CCC CCC ACA GCC AGT GAA GGC) is labeled with fluorescein, the hybridization probe 2 (5'-TGA GGT TCC CCA GAA GGA AAG GTC CAG C) is labeled with LightCycler-Red 640. Both probes are specific to the Aspergillus genus and can hybridize head-to-tail, bringing the two fluorescent dyes in close proximity. An energy transfer between the two probes results in the emission of a red fluorescent light that can be measured by photohybrids. The following table compares the results of the measurements using the new method with those using conventional LC-PCR:
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0001
ECL = Enhanced Chemilumineszenz/Elektrochemiluminszenz CFU = Colony Forming Units/koloniebildende Einheiten n.u. = nicht untersucht Die Tabelle zeigt, daß sich der NASBA-basierende Nachweis unter Verwendung der neuen Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleotidsequenzen gegenüber einer PCR durch seine höhere Sensitivität auszeichnet. Beim NASBA-basierenden Nachweis beträgt die absolute untere Nachweisgrenze für A . fumigatus 1 koloniebildende Einheit (CFU), während die absolute untere Nachweisgrenze der PCR für A . fumigatus bei 10 CFU liegt (siehe 5. und 6. Zeile von oben) .ECL = enhanced chemiluminescence / electrochemiluminescence CFU = colony forming units / colony forming units nu = not investigated The table shows that the NASBA-based detection using the new nucleic acid molecules or nucleotide sequences is distinguished from PCR by its higher sensitivity. With NASBA-based detection, the absolute lower detection limit for A is. fumigatus 1 colony forming unit (CFU), while the absolute lower detection limit of the PCR for A. fumigatus is 10 CFU (see 5th and 6th line from above).
Die Aspergillus-gattungsspezifische Sonde (Nukleinsauremolekul mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3) erkennt NASBA-amplifi- zierte RNA aus Kulturen von Aspergillus f migatus , Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor und Aspergillus glaucus . RNA aus Nicht-Aspergillus-Spezies, wie Scopula- riopsis brevicaulis, Curvularia inaequalis , Absidia corymbife- ra, Fusarium solani , Rhizopus oryzae, Acremonium chrysogenum, Candida albicans sowie aus Cytomegalovirus und menschlichen Fi- broblasten wird mit der neuen Sonde hingegen nicht erkannt. Die hier erhaltenen Signale liegen nur geringfügig über dem Kontrollansatz (ddH20, letzte Zeile) und sind nicht signifikant.The Aspergillus genus-specific probe (nucleic acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3) recognizes NASBA-amplified RNA from cultures of Aspergillus f migatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor and Aspergillus glaucus. However, RNA from non-Aspergillus species such as Scopulariopsis brevicaulis, Curvularia inaequalis, Absidia corymbifera, Fusarium solani, Rhizopus oryzae, Acremonium chrysogenum, Candida albicans as well as from cytomegalovirus and human fibroblasts is not recognized with the new probe. The signals obtained here are only slightly above the control approach (ddH 2 0, last line) and are not significant.
Wie schon bei PCR-gestütztem Nachweis, findet man unter Verwendung der neuen Nukleinsäuremoleküle eine schwache Kreuzreaktivität mit P. brevicompactum und P. chrysogenum sowie eine sehr schwache Kreuzreaktivität mit A . alternata . Im Hinblick auf die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dies wenig problematisch. Die kreuzreaktiven Pilzspezies finden sich nämlich nur verstärkt in Aids-Patienten im fortgeschrittenen Stadium, wobei diese Spezies überhaupt nur im nicht-europäischen Verbreitungsraum zu finden sind. Natürlich besteht die Möglichkeit, im Zweifelsfall über konventionelle Nachweisverfahren eine Gegenkontrolle vorzunehmen.As with PCR-based detection, a weak cross-reactivity with P. brevicompactum and P. chrysogenum and a very weak cross-reactivity with A are found using the new nucleic acid molecules. alternata. With regard to the implementation of the method according to the invention, this is not a problem. The cross-reactive fungal species can only be found increasingly in AIDS patients in the advanced stage, whereby these species can only be found in the non-European distribution area. Of course there is Possibility to carry out a cross-check using conventional detection methods in case of doubt.
Beispiel 5: Einfluß von Koinfektionen auf die Selektivität/Example 5: Influence of co-infections on the selectivity /
Sensitivität der neuen NukleinsäuremoleküleSensitivity of the new nucleic acid molecules
Um bewerten zu können, ob Koinfektionen mit zwei oder mehreren Pilzspezies in einem Patienten die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beeinflussen, werden Blutproben mit Konidien von A. fumigatus und C. inaequalis , einem Pilz, der nicht durch das neue Verfahren detektiert wird, versetzt (jeweils 103 CFU pro ml Blut) .In order to be able to assess whether co-infections with two or more fungal species in a patient influence the implementation of the method according to the invention, conidia of A. fumigatus and C. inaequalis, a fungus that is not detected by the new method, are added to blood samples (each 10 3 CFU per ml blood).
Nach Durchführung solch eines Experimentes zeigte sich, daß es lediglich zu einer minimalen Reduzierung in der ECL-Auszählung (18760 Counts) im Vergleich zu Proben, die allein mit Konidien von A . fumigatus versetzt wurden (29575 Counts), kommt. Bei einer gleichzeitigen Zugabe von A . fumigatus- und A . niger- Konidien (jeweils 103 CFU pro ml Blut) zeigte sich ein Anstieg der ECL-Counts um 15097 im Vergleich zu den Counts, die in einer Probe ausgezählt wurden, die allein mit A . fumigatus- Konidien versetzt wurde.After carrying out such an experiment, it was found that there was only a minimal reduction in the ECL count (18760 counts) compared to samples which had conidia of A. fumigatus (29575 counts). With the simultaneous addition of A. fumigatus and A. niger conidia (10 3 CFU per ml blood) showed an increase in the ECL counts by 15097 compared to the counts counted in a sample that was only with A. fumigatus conidia.
Dieses Ergebnis demonstriert, daß das Vorhandensein von Nicht- Aspergillus-Pilzen in der zu untersuchenden Probe das neue Verfahren praktisch unbeeinflußt läßt. Somit wird auch in Patienten, die sich im fortgeschrittenen Stadium bspw. einer Aids- Erkrankung befinden und von verschiedenen Pilzen infiziert sind, ein zuverlässiger Aspergillus-spezifischer Nachweis möglich. Beispiel 6: Überprüfung PCR-basierender Ergebnisse mit dem erfindungsgemäßen NukleinsauremolekulThis result demonstrates that the presence of non-Aspergillus fungi in the sample to be examined leaves the new method practically unaffected. In this way, reliable Aspergillus-specific detection is also possible in patients who are in an advanced stage, for example of an AIDS disease and are infected by various fungi. Example 6: Review of PCR-based results with the nucleic acid molecule according to the invention
Es wurden 4 Blutproben, die Aspergillus-PCR-positiv waren, und 73 Proben, die Aspergillus-PCR-negativ waren und die aus Patienten nach allogener Knochenmarkstransplantation (n = 20) stammten, einer Gegenkontrolle auf das Vorhandensein von Aspergillus mittels des neuen Verfahrens unterzogen. Die PCR-basierenden Ergebnisse wurden dabei unter Verwendung der neuen NASBA-Primer bzw. der neuen Hybridisierungssonde bestätigt. Sämtliche der 73 PCR-negativen Proben waren ebenfalls NASBA- negativ, und die 4 PCR-positiven Proben waren ebenfalls NASBA- positiv.Four blood samples that were Aspergillus PCR positive and 73 samples that were Aspergillus PCR negative that came from patients after allogeneic bone marrow transplantation (n = 20) were cross-checked for the presence of Aspergillus using the new method , The PCR-based results were confirmed using the new NASBA primer or the new hybridization probe. All of the 73 PCR negative samples were also NASBA negative and the 4 PCR positive samples were also NASBA positive.
Beispiel 7: Stabilität von Aspergillus-RNA in BlutExample 7: Stability of Aspergillus RNA in blood
Um bewerten zu können, wie stabil die nachzuweisende RNA in Blutproben ist bzw. in welchem Umfang eine Degradation dieser RNA stattfindet, werden Blutproben mit A . fumiga us-Konidien (103 CFU/ml Blut) oder direkt mit RNA aus A . fumigatus-Konidien (isoliert aus 103 CFU/ml Blut) versetzt. In Abhängigkeit der Zeit und dem Vorhandensein von RNA-Schutzpuffer (RNA Secure) werden gemäß den Beispielen 1 bis 3 ECL-Counts gemessen, die das Vorhandensein bzw. die Stabilität der RNA repräsentieren. Das Ergebnis solch eines Experimentes ist in Fig. 2 dargestellt.In order to be able to evaluate how stable the RNA to be detected in blood samples or to what extent a degradation of this RNA takes place, blood samples with A. fumiga us conidia (10 3 CFU / ml blood) or directly with RNA from A. fumigatus conidia (isolated from 10 3 CFU / ml blood) added. Depending on the time and the presence of RNA protective buffer (RNA Secure), ECL counts are measured according to Examples 1 to 3, which represent the presence or stability of the RNA. The result of such an experiment is shown in Fig. 2.
Die Blutproben wurden hiernach jeweils 1, 5, 10, 30, 60, 180 und 1440 min nach Zugabe der Konidien bzw. RNA oder nach Inkubation über Nacht mittels der neuen Nukleinsäuremoleküle analysiert. Die gemessenen ECL-Counts für die Blutprobe mit Aspergillus-RNA ohne RNA-Schutzpuffer sind in Fig. 2 durch schwarze Rauten dargestellt, für die Blutprobe mit Aspergillus-RNA und RNA-Schutzpuffer durch graue Quadrate, für die Blutprobe mit Aspergillus- Konidien ohne RNA-Schutzpuffer durch graue Dreiecke.The blood samples were then analyzed in each case 1, 5, 10, 30, 60, 180 and 1440 min after addition of the conidia or RNA or after overnight incubation using the new nucleic acid molecules. The measured ECL counts for the blood sample with Aspergillus RNA without RNA protection buffer are shown in FIG. 2 by black rhombuses, for the blood sample with Aspergillus RNA and RNA protection buffer with gray squares, for the blood sample with Aspergillus conidia without RNA -Protection buffer by gray triangles.
Dabei zeigte sich, daß in Gegenwart von RNA-Schutzpuffer die Aspergillus-RNA 1 min, 5 min, 10 min, 30 min, 60 min, 180 min und 1440 min nach Zugabe nachweisbar ist, während ohne Zugabe von Schutzpuffer lediglich Konidien nachgewiesen werden können (bis zu 1440 min nach Zugabe zur Blutprobe). Ohne die Zugabe von RNA-Schutzpuffer lagen die Werte für den Nachweis der Aspergillus-RNA unterhalb der Nachweisgrenze, d.h. des Schwellenwertes ( ), im Bereich der Negativkontrolle. Dies ist auf eine zügige RNA-Degradation zurückzuführen. Daraus läßt sich schließen, daß während des Verfahrens zur Bereitstellung der RNA, gemäß Beispiel 1, darauf geachtet werden sollte, RNA- Schutzpuffer in den Ansatz zu geben.It was found that in the presence of RNA protective buffer, the Aspergillus RNA can be detected 1 min, 5 min, 10 min, 30 min, 60 min, 180 min and 1440 min after addition, while only conidia can be detected without the addition of protective buffer (up to 1440 min after addition to the blood sample). Without the addition of RNA protective buffer, the values for the detection of Aspergillus RNA were below the detection limit, i.e. the threshold (), in the area of the negative control. This is due to the rapid degradation of RNA. From this it can be concluded that during the procedure for providing the RNA, according to Example 1, care should be taken to add RNA protective buffer to the mixture.
Beispiel 8: Kein Nachweis von genomischer Aspergillus-DNA durch das erfindungsgemäße NukleinsauremolekulExample 8: No detection of genomic Aspergillus DNA by the nucleic acid molecule according to the invention
Um bewerten zu können, ob genomische Aspergillus-DNA, die in dem zu untersuchenden Ansatz vorhanden ist, ebenfalls mit den neuen Nukleinsäuremolekülen detektiert werden kann, werden Aliquote von extrahierter Aspergillus-Nukleinsäure mit DNase- freier RNase (Röche Molecular Biochemicals) für 1 h bei 37 °C inkubiert. Diese Aliquote werden dann gemäß Beispiel 2 und 3 analysiert. Solch ein von den Erfindern durchgeführtes Experiment resultierte in ECL-Signalen, die nicht von denen der Negativkontrolle zu unterscheiden waren.In order to be able to evaluate whether genomic Aspergillus DNA, which is present in the approach to be examined, can also be detected with the new nucleic acid molecules, aliquots of extracted Aspergillus nucleic acid with DNase-free RNase (Röche Molecular Biochemicals) are added for 1 h Incubated at 37 ° C. These aliquots are then analyzed according to Examples 2 and 3. Such an experiment carried out by the inventors resulted in ECL signals which were indistinguishable from those of the negative control.
Daraus ergibt sich, daß mittels der neuen Nukleinsäuremoleküle bzw. des neuen Verfahrens hochspezifisch RNA, nicht jedoch DNA amplifiziert wird, so daß das eventuelle Vorhandensein von kontaminierender DNA keinerlei Auswirkung auf das Testergebnis hat. Die neuen Nukleinsäuremoleküle bzw. deren Verwendung als NASBA-Primer eignen sich folglich auch dazu, die Transkriptionsaktivität in Pilzzellen zu untersuchen, da nur RNA, nicht jedoch genomische DNA erfaßt wird. The result of this is that the new nucleic acid molecules or the new method amplify RNA in a highly specific manner, but not DNA, so that the possible presence of contaminating DNA has no effect on the test result. The new nucleic acid molecules and their use as NASBA primers are consequently also suitable for examining the transcription activity in fungal cells, since only RNA but not genomic DNA is detected.

Claims

Patentansprüche claims
1. Nukleinsauremolekul, das eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfaßt:1. nucleic acid molecule which comprises one of the following nucleotide sequences:
SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz, die an eine Sequenz bindet, an die auch eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 bindet.SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence that binds to a sequence to which one of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 binds.
2. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 zum Nachweis von Pilzen, vorzugsweise in klinischem Material, mittels 'Nucleic Acid Sequence-Based Amplification' (NASBA) , bei der als erster Primer ein Nukleinsauremolekul verwendet wird, das neben einer geeigneten Promotorsequenz die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 1 bindet, und als zweiter Primer ein Nukleinsauremolekul verwendet wird, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 2 bindet.2. Use of a nucleic acid molecule according to claim 1 for the detection of fungi, preferably in clinical material, by means of 'Nucleic Acid Sequence-Based Amplification' (NASBA), in which a nucleic acid molecule is used as the first primer which, in addition to a suitable promoter sequence, the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 from the enclosed sequence listing or a sequence which binds to such a sequence to which SEQ ID No. 1 also binds, and a nucleic acid molecule is used as the second primer which contains the nucleotide sequence SEQ ID No. 2 from the enclosed sequence listing or comprises a sequence which binds to a sequence to which SEQ ID No. 2 also binds.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die geeignete Promotorsequenz die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3. Use according to claim 2, characterized in that the suitable promoter sequence the nucleotide sequence SEQ ID No.
4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll umfaßt. 4 from the enclosed sequence listing.
. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zum Nachweis von Aspergillus, bei der Pilz-RNA mit einem Nukleinsauremolekul hybridisiert wird, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine Sequenz umfaßt, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 3 bindet., Use according to claim 2 or 3 for the detection of Aspergillus, in which fungal RNA is hybridized with a nucleic acid molecule which comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence which binds to a sequence to which SEQ ID No. 3 binds.
5. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder einer Sequenz, die an eine solche Sequenz bindet, an die auch SEQ ID Nr. 3 bindet, oder mit einer zu den vorstehenden Sequenzen komplementären Sequenz , zum Nachweisen von Aspergillus.5. Use of a nucleic acid molecule with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 from the enclosed sequence listing or a sequence that binds to a sequence to which SEQ ID No. 3 also binds, or with a sequence complementary to the above sequences, for detection from Aspergillus.
6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Hybridisieren verwendete Nukleinsauremolekul an eine Trägermatrix gebunden ist.6. Use according to claim 4 or 5, characterized in that the nucleic acid molecule used for hybridization is bound to a carrier matrix.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Hybridisierung verwendete Nukleinsauremolekul direkt oder indirekt mit einer Peroxidase gekoppelt ist.7. Use according to one of claims 4 to 6, characterized in that the nucleic acid molecule used for hybridization is coupled directly or indirectly with a peroxidase.
8. Verfahren zum Nachweis von Pilzen in klinischem Material, mit den Schritten: a) Bereitstellung von Pilz-RNA aus klinischem Material; und b) Nachweis der Pilz-RNA unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1. 8. A method for the detection of fungi in clinical material, comprising the steps of: a) providing fungal RNA from clinical material; and b) detection of the fungal RNA using a nucleic acid molecule according to claim 1.
. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) das klinische Material vorzugsweise in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend einer Hitzebehandlung, vorzugsweise für 1 bis 5 min bei 50 bis 70 °C, unterzogen wird., Process according to claim 8, characterized in that in step a) the clinical material is preferably snap frozen in liquid nitrogen and then subjected to a heat treatment, preferably for 1 to 5 minutes at 50 to 70 ° C.
10. Verfahren zum Nachweis von Pilzen der Gattung Aspergillus in klinischem Material, mit den Schritten: a) Bereitstellung von Aspergillus-Nukleinsäure aus klinischem Material; und b) Nachweis der Aspergillus-Nukleinsäure, bei dem in Schritt a) das klinische Material vorzugsweise in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend einer Hitzebehandlung, vorzugsweise für 1 bis 5 min bei 50 bis 70 °C, unterzogen wird.10. A method for the detection of fungi of the Aspergillus genus in clinical material, comprising the steps of: a) providing Aspergillus nucleic acid from clinical material; and b) detection of the Aspergillus nucleic acid, in which in step a) the clinical material is preferably snap frozen in liquid nitrogen and then subjected to a heat treatment, preferably for 1 to 5 minutes at 50 to 70 ° C.
11. Kit, das ein Nukleinsauremolekul nach Anspruch 1 enthält.11. Kit containing a nucleic acid molecule according to claim 1.
12. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 10. 12. Kit for performing a method according to one of claims 8 to 10.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108070675A (en) * 2018-02-10 2018-05-25 杭州缔蓝生物技术有限公司 Primer combination of probe and PCR kit for fluorescence quantitative a kind of while that detect three kinds of aspergillus

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0422869A2 (en) * 1989-10-12 1991-04-17 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts
WO1999050430A2 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 Dow Agrosciences Llc Modification of fatty acid composition in plants by expression of an aspergillus nidulans delta-9 coa desaturase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0422869A2 (en) * 1989-10-12 1991-04-17 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts
WO1999050430A2 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 Dow Agrosciences Llc Modification of fatty acid composition in plants by expression of an aspergillus nidulans delta-9 coa desaturase

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORST A ET AL.: "NASBA-based detection of Candida spp. in blood cultures" ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, US, Bd. 100, Mai 2000 (2000-05), Seite 176 XP008010101 *
DATABASE EMBL [Online] european molecular biology laboratory; 20. Oktober 1998 (1998-10-20) KUPFER D ET AL.: "An Aspergillus nidulans EST database" Database accession no. AI212154 XP002220713 *
GEMEN VAN B ET AL: "A ONE-TUBE QUANTITATIVE HIV-1 RNA NASBA NUCLEIC ACID AMPLIFICATION ASSAY USING ELECTROCHEMILUMINESCENT (ECL) LABELLED PROBES" JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, AMSTERDAM, NL, Bd. 49, 1994, Seiten 157-167, XP000600186 ISSN: 0166-0934 *
HAUGLAND R A ET AL.: "Evaluation of different methods for the extraction of DNA drom fungal coninia by quantitative competitive PCR analysis" JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, Bd. 37, 1999, Seiten 165-176, XP002220712 *
LOEFFLER J ET AL.: "Nucleic acid sequence-based amplification of Aspergillus RNA in blood samples" JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Bd. 39, Nr. 4, 2. April 2001 (2001-04-02), Seiten 1626-1629, XP002220710 *
WIDJOJOATMODJO M N ET AL.: "Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) detection ofmedically important Candida species" JOURNAL OF MICROBOLOGICAL METHODS, Bd. 38, 1999, Seiten 81-90, XP002220711 in der Anmeldung erw{hnt *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108070675A (en) * 2018-02-10 2018-05-25 杭州缔蓝生物技术有限公司 Primer combination of probe and PCR kit for fluorescence quantitative a kind of while that detect three kinds of aspergillus

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002088386A3 (en) 2004-02-26
DE10119179A1 (en) 2002-10-17

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