WO2002080670A1 - Vorrichtung zur vorbereitung von zellen für die kryokonservierung - Google Patents

Vorrichtung zur vorbereitung von zellen für die kryokonservierung Download PDF

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WO2002080670A1
WO2002080670A1 PCT/EP2002/003865 EP0203865W WO02080670A1 WO 2002080670 A1 WO2002080670 A1 WO 2002080670A1 EP 0203865 W EP0203865 W EP 0203865W WO 02080670 A1 WO02080670 A1 WO 02080670A1
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additional solution
receptacle
fluid
storage container
containers
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Application number
PCT/EP2002/003865
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Winkemann
Original Assignee
Medizintechnik Promedt Gmbh
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
    • A01N1/0252—Temperature controlling refrigerating apparatus, i.e. devices used to actively control the temperature of a designated internal volume, e.g. refrigerators, freeze-drying apparatus or liquid nitrogen baths
    • A01N1/0257—Stationary or portable vessels generating cryogenic temperatures

Definitions

  • the invention relates to a device for preparing cells, in particular stem cells, for cryopreservation and the use thereof.
  • cryopreservation The deep freezing of living cell substance is generally referred to as cryopreservation.
  • Cryopreservation of blood components, for example, is generally known.
  • Peripheral blood stem cells are required for special therapeutic procedures in medicine, which are taken from the blood of patients or healthy donors with the help of a cell separator. After removal, the stem cells must be prepared in the laboratory for cryopreservation.
  • cryopreservation As a spatial requirement for cryopreservation, e.g. a sterile workbench is required within a clean room. To prepare the cells for cryopreservation, it is necessary to measure the volume of the
  • Stem cell transplantation is currently a common procedure in the therapy of certain malignant diseases. It is now used as a routine procedure at larger hemato-oncology centers.
  • an arrangement which comprises a stem cell bag, a bag for holding a cryoprotectant (DMSO) and a storage bag.
  • the bags are connected to one another via hose lines so that the freeze protection solution can be transferred to the stem cell bag and the mixture of stem cell concentrate and anti-freeze solution can be transferred to the storage bag.
  • DMSO cryoprotectant
  • the invention has for its object to provide a device through which The risk of contamination in the preparation of cells for cryopreservation is reduced. Furthermore, it is an object of the invention to increase the safety when preparing the cells. For this purpose, the device should make it possible to standardize the preparation procedure and ultimately thereby shorten it. Finally, the device is intended to make this method feasible outside of a clean room in order to save the considerable costs for setting up and maintaining such a room.
  • the device according to the invention for the preparation of cells, in particular stem cells, for cryopreservation has a receiving container for receiving cell transplant, in particular stem cell transplant.
  • the device according to the invention has means for providing at least one additional solution to be mixed with the cell transplant.
  • This can be a freezer protection solution and / or a washing solution that is generally used in cryopreservation.
  • at least one storage container is provided for receiving the mixture of cell graft and additional solution to be preserved. The mixture filled into the storage container is then deep-frozen, preferably snap-frozen, for preservation.
  • At least two storage containers are preferably provided. By providing a plurality of storage containers it is ensured that in case of damage or contamination of a storage container nevertheless a sufficient number of cell transplant, in particular Stammzelltran ⁇ Plantat is present.
  • the device according to the invention has fluid elements for fluid connection between the receptacle, the means for providing additional liquid and the storage container.
  • the device according to the invention is characterized in that the receptacle for the cell transplant, the means for the additional solution, the storage container for the mixture to be preserved and the fluid elements as a whole are designed as a closed sterile system that can be connected to a cell separator or the like and its operation is at least partially automated.
  • the device according to the invention thus represents an easy-to-use system with which cells, in particular stem cells, can be prepared in a standardized method for cryopreservation together with a cell separator.
  • the cells can be prepared with only a few manual interventions and partial automation or also fully automatically,
  • the cell transplant taken from the blood of patients or healthy donors with the aid of a cell separator is collected in the receptacle.
  • the cell concentrate is preferably transferred directly from the cell separator into the receptacle.
  • the cell separator is connected using a connection line that leads to the receptacle.
  • the closed system significantly reduces or completely eliminates the risk of contamination. Furthermore, the device makes the provision of clean room conditions superfluous, which can save considerable costs.
  • the device can also comprise a plurality of receptacles which are connected to one another. This makes it possible to centrifuge off the cells intended for the transplantation and to reduce the volume.
  • a first fluid element is preferably connected to the receptacle and the means for providing the additional solution.
  • a second fluid element is connected on the one hand at a branch point to the first fluid element and on the other hand to the storage container. It is thus possible to supply additional solution to the receptacle through the first fluid element.
  • the second fluid element in connection with the section of the first fluid element, which is arranged between the receptacle and the branch point, it is possible to supply liquid from the receptacle to the storage container. This has the advantage that part of the first fluid element is used for different fluid transport. This reduces the cost of the device.
  • a device is optional
  • this device can be controlled, so that the fluid connection can be established automatically or by an appropriate control command.
  • the device for establishing the fluid connection preferably has a first valve, which is arranged between the means for providing the additional solution and the above branch point, and a second valve, which is arranged between the branch point and the storage container, with the second valve closed and When the first valve is open, there is a fluid connection between the means for providing the additional solution and the receptacle. When the first valve is closed and the second valve is open, there is a fluid connection between the receptacle and the storage container.
  • valves are preferably not operated manually, but rather electromagnetically or pneumatically.
  • hose clamps they can be operated via a corresponding control device.
  • a conveying means connected to the first fluid element is arranged between the receiving container and the above branch point.
  • Execution orm is the transfer of additional solution into the receptacle on the one hand and after the mixture the transfer of additional solution and graft into the storage container on the other hand with only one funding, such as a preferably volatile pump, possible is arranged in the Leltungseab ⁇ hnitt of the first fluid element between the receptacle and the branch point of the second fluid element.
  • the pumping direction of the pump is reversed to convey the additional solution or the mixture.
  • smart clamps on the first or second fluid element ensure that the liquids flow in the correct directions.
  • Hose clamps or reusable valves or the like can be used. be provided.
  • the volume of the mixture of transplant and additional solution to be filled into the storage container can also be easily determined or specified with the volumetric pump.
  • the volume of the graft is specified by the ZeilSeparator. This can be entered into the device manually or read directly from the cell separator.
  • the number of cells is preferably determined using a sample.
  • a test container connected to the receptacle is preferably provided, in which a sufficient amount of stem cell concentrate for the sample is collected.
  • the test container is preferably a film bag connected to the receiving container, which is welded to remove the sample.
  • the additive solution is preferably provided in multiple containers that hold separate liquids from which the additive solution is mixed.
  • the additional solution can, for example, be a freeze protection solution or a mixture of DMSO and HES and autologous plasma a wash solution mixed from NfaCl, RPMI, HA and ACD.
  • the autologous plasma for mixing the anti-freeze solution can be obtained with the cell separator and fed to the device like the cell transplant continuously or at intervals.
  • the containers for holding DMSO, HES and / or NaCl, RPMI, HA and ACD are advantageously foil bags filled with the respective liquids, which can contain volume data for measuring the liquid quantities.
  • plastic bags large-volume syringes or glass containers are also conceivable, which are operated manually or inserted into the known perfusors.
  • the receptacle and the storage container are also preferably foil bags which are connected to one another by hose lines as fluid elements. In this way, all parts of the device that come into contact with the graft can be provided as a single-use disposable item,
  • a control device which specifies the volume of additional solution.
  • the mixing ratio of cell graft and additional solution depends on the number of cells and the volume of the graft.
  • the control device preferably has a storage unit for storing the graft volume and number of cells and a computing unit which determines from these two quantities the amount of additional solution required for mixing with the graft.
  • the storage container After filling the storage container, this container must be carefully vented so that sudden thawing in volume does not cause the container to burst when thawed. Therefore, the storage container preferably has a hydrophobic bacterial filter. the vent filter is closed. If the storage container is placed in a plasma extractor with the bacteria filter facing upwards, the ventilation can be carried out without any problems.
  • a hose provided with markings is preferably arranged at the ventilation opening of the storage container.
  • the markings serve to remove certain sample volumes.
  • the hose can be welded to the markings. This enables automatic sampling, which does not affect the sterility of the system.
  • the coolants for the receptacle preferably comprise a pivoting device which sets the receptacle in motion in order to cool the liquid uniformly, as a result of which a mixing takes place at the same time.
  • the device according to the invention can be assembled from its individual parts at the manufacturer and brought to its later use in a sterile state. However, it is also possible to bring the individual parts to the desired location separately in a sterile state and to connect them to one another in a sterile manner only immediately before the device is used. If this connection occurs under normal environmental conditions, i.e. in a non-sterile one In the surrounding area, the fluid elements can have internal sterilizing means which, after the connection, eliminate microbiological contamination within the closed system of the device.
  • An example of such a sterilizing agent are sterilizing filters installed in the fluid elements in the direction of flow.
  • FIG. 1 shows a simplified schematic representation of a first exemplary embodiment of the device for preparing stem cells for cryopreservation
  • FIG. 2 shows the coolant for the receptacle of the device from FIG. 1 in a simplified schematic representation
  • Fig. 3 shows a second embodiment of the device.
  • the device for processing peripheral blood stem cells for cryopreservation comprises e.g. various components for controlling the process sequence and a tube tube set with foil bags designed as a disposable object,
  • the hose line set has a foil bag 1 for receiving the cell graft.
  • the receptacle 1 has a first connector la, to which a hose line 2 is connected, which with the outlet 3a of the Zellsapa.rs.tars 3 for the Stem cell concentrate is connected.
  • a second connection piece 1b of the receptacle 1 is connected via a hose line 4 ⁇ to a smaller test bag 4, which has a hose attachment 4b closed with a pierceable membrane 4a for the sampling.
  • a third connector l ⁇ of the bag 1 is connected via a hose 5 to the connector 6c of a film bag 6, which is filled as a freeze protection solution, for example with DMSO and / or another cryoprotective HES.
  • DMSO is able to penetrate cells and lowers the temperature at which ice forms.
  • HES is a macromolecular cryoprotective.
  • a film bag 7 for auto plasma has a connection piece 7a, which is connected to the hose line 5 via a hose line 8.
  • the plasma bag 7 is filled via a hose line 9, which leads to the outlet 3b of the cell separator 3 for the plasma.
  • the connecting pieces 6c, 7a of the two bags 6, 7 are closed with generally known break-off parts.
  • a volu etrlsche roller pump 10 is provided on the hose line 8 for conveying the plasma.
  • the two bags 6, 7 and the pump 10 form the means 11 for providing an additional solution to be mixed from the DMSO and PHS and autologous plasma.
  • a hose line 12 branches off from the hose line 5, which leads to a three-way valve 12c, from which two line branches 12a, 12b branch, each of which is connected to a storage container 13, 14.
  • Each storage container 13, 14 is a foil bag welded to the hose line branches 12a, 12b and has a vent opening 13d, 14a.
  • a hose line piece 13b, 14b is connected, which is closed with a hydrophobic bacterial filter 13c, 14c, which is permeable to air but impermeable to liquids. To prevent contamination, the filter must have a high level of tightness against bacteria and viruses.
  • the hose line piece 13b, 14b contains markings which ensure that reference samples of certain volumes are obtained by welding.
  • a volumetric roller pump 15 is provided to convey the additional solution into the receiving container 1 on the one hand and the mixture of additional solution and stem cell concentrate on the other hand into one of the two storage bags 13, 14.
  • a first hose clamp 16 is provided on the line section between the means 11 ′ for providing the additional solution and the branch point 5a of the hose line 12, and a second hose clamp 17 is provided on the hose line 12 leading to the storage bags 13, 14.
  • the two hose cleats 16, 17 together with the branch point 5a form a device 160 for fixing the fluid connection.
  • the device has a first cooling device 18 for cooling the suspension located in the receiving container 1 and a second cooling device 20 for cooling the additional solution to be transferred into the receiving container 1.
  • All hose lines are firmly connected to the foil bags, preferably welded, so that the device is sterile and self-contained
  • Hose set forms. Furthermore, the hose line 2, which connects the cell separator to the receptacle, is firmly connected to the receptacle 1.
  • this is a self-contained sterile system made of fluid blends and Containers, Alternatively, it is also possible to produce the closed sterile system from on-site connections and containers by connecting the fluid elements and / or containers to one another under sterile conditions,
  • FIG. 2 shows a simplified schematic representation of the first cooling device 18 for the receptacle 1 in the rare view.
  • the cooling device 18 has a swivel device 19 with an oscillating metal plate 19a, which is swiveled continuously by a drive, not shown.
  • the plate 19a there are coolant rings, not shown, through which coolant flows.
  • the receptacle 1 lies flat on the cooling plate and is moved continuously for uniform cooling of the liquid. As a result, the heating o additional solution and cell transplant, which is caused by the exothermic reaction, is reduced, so that damage to the cells is avoided.
  • the movement of the cooling device 19 has a swivel device 19 with an oscillating metal plate 19a, which is swiveled continuously by a drive, not shown.
  • coolant rings not shown
  • the receptacle also serves to better mix the cell graft and the additional solution. In addition to the swiveling movement, a shaking or rotating movement can therefore also be advantageous.
  • All valves 12c, 16, 17 of the device can be actuated electromagnetically.
  • the device is controlled by a control device 21, which comprises a computing unit 21a and a storage unit 21b and an input unit 21 ⁇ .
  • Control lines 13a, 16a, 17a lead from the control device 21 to the valves 12c, 16, 17 and control lines 10a, 15a to the pumps 10, 15.
  • a data line 22 connects the data output of the cell separator 3 to the control device 21.
  • the device for processing stem cells works as follows:
  • the cell separator 3 is equipped with the apheresis system, which is connected to the hose lines 2 and 9.
  • the control line 22 is connected to the cell separator 3.
  • the cell separator 3 is then put into operation.
  • the receptacle 1 is now filled with graft, the volume of which is determined by the cell separator 3.
  • the controller reads this value, which is stored in the storage unit 21b.
  • the test bag 4 is filled manually in order to separate a small volume with a representative number of cells.
  • the test bag 4 is then welded off by severing and welding the hose line 4c on the same side. Appropriate tools for this belong to the state of the art. Alternatively, the line can also be clamped with a hose glue.
  • a sample for determining the number of cells and the number of stem cells in the transplant is now taken from the test bag 4.
  • the number of cells and stem cells is input into the input unit 21c of the control device 21 and also stored in the storage unit 21b. From the graft volume and the number of cells, the computing unit 21a of the control device 21 then calculates the mixing ratio of additional solution and cell graft.
  • the controller 21 now constitutes volu etris ⁇ he roller pump 15 in motion, the additive solution from the bags 6, 7 via the S chlauchtechnisch conveyed into the receptacle 1. 5
  • the additional solution is a mixture of DMSO and HES as well as autologous plasma.
  • a freeze protection solution can also be supplied without the addition of autologous plasma, so that the plasma bag 7 can be omitted.
  • the control device 21 simultaneously starts the roller pump 10. The control device sets the revolutions of the pumps as a function of the calculated mixing ratio.
  • the addition of the additional solution is time-controlled at a rate of preferably 10 ml / min, since the anti-freeze solution is otically active and too rapid an infusion could therefore damage the cells.
  • the first hose clamp 16 is open and the second hose clamp 17 is closed. Since heat is generated during the mixing process of DMSO and HES and autologous plasma, the additional solution flowing in is cooled with the second cooling device 20.
  • the mixture of transplant and additional solution is continuously cooled with the first cooling device 18, with mixing by means of the swivel device 19 (FIG. 2) taking place at the same time.
  • the control device 21 then stops the pumps 10 and 15 and reverses the delivery direction of the pump 15, the first hose clamp 16 being closed and the second hose clamp 17 being opened.
  • the mixture to be preserved now flows via the hose line 12 into the first storage bag 13. After the bag 13 is filled, the control device switches
  • the control device then switches off all units.
  • the storage bags are welded one after the other by severing and welding the line sections 12a, 12b.
  • the bags are placed in a plasma extractor so that the bacteria filter points upwards.
  • microbiological diagnostics and graft analysis several samples can be taken by separating and welding the cuffs 13b, 14b of the bags 13, 14 at the markings provided for them. Finally, the bags are frozen.
  • a plurality of receptacles connected to one another via hose lines can also be provided. This makes it possible to centrifuge the cells and reduce the volume, particularly in the case of large-volume aphereses. If the other bags are not also centrifuged during the centrifugation, corresponding guides for the hose lines must be provided, which make it possible to store the other bags outside the centrifuge.
  • FIG. 3 shows a second exemplary embodiment of the device for processing stem cells, which differs from the embodiment described with reference to FIGS. 1 and 2 only by the means 11 ′ for providing additional solution.
  • Fig. 3 therefore, only the varying area of the device, i.e. the means 11 ', is shown.
  • the means 11 ′ for providing additional solution comprise four further foil bags 23 to 26, which are filled with NaCl, RPMI medium, HA and ACD to produce a washing solution.
  • NaCl as an electrolyte-containing carrier solution can be used to dilute the solutions or to achieve certain ones Final concentrations of eg protein solutions are used
  • RPMI is an electrolyte and carbohydrate-containing solution with a balanced pH value and the addition of amino acids / proteins.
  • Human albumin (HA) can replace autologous plasma.
  • ACD sodium citrate
  • heparin prevents the cell graft from clotting and the formation of coagulum.
  • the film bags are connected via hose lines 27 to 31 to the hose line 5 leading to the receptacle 1.
  • P ⁇ mp 32 to 35 are provided, which are controlled accordingly by the control device 21.
  • the control device 21 controls the pumps in such a way that a washing solution is first prepared and conveyed into the receptacle 1 as the first additional solution.
  • the anti-freeze solution is then prepared as a second additional solution and conveyed into bag 1.
  • the mixture of stem cell concentrate, anti-freeze and wash solution is then transferred to the individual storage bags.
  • the mixing ratio of the two additional solutions and the stem cell concentrate is again calculated by the control device and via the
  • the control device can set a certain number of cells in each storage bag and distribute the concentrates over the storage bags.

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Abstract

Eine Vorrichtung zur Vorbereitung von peripheren Blutstammzellen für die Kryokonservierung stellt ein geschlossenes steriles System dar, das ein zur einmaligen Verwendung bestimmtes Schlauchleitungsset mit verschiedenen Folienbeuteln sein kann. Die Vorrichtung erlaubt die Aufarbeitung der Stammzellen in einem standardisierten Verfahren, wobei das Risiko des Auftretens von Fehlern und bakteriellen Kontaminationen verringert wird. Das dem Blut entnommene Zellentransplantat wird in einem Aufnahmebehältnis (1) gesammelt. Aus einem oder mehreren Beuteln werden dem Zellentransplantat eine oder mehrere Zusatzlösungen zugemischt. Die Mischung aus Transplantat und Zusatzlösung wird anschliessend in einen oder mehrere Lagerbeutel (13, 14) überführt.

Description

Beschreibung
Vorrichtung zur Vorbereitung von Zellen für die Kryokonservierung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Vorbereitung von Zellen, insbesondere Stammzellen, für die Kryokonservierung und die Verwendung derselben.
Das Tiefgefrieren von lebender Zellsubstanz wird im allgemeinen als Kryokonservierung bezeichnet. Die Kryokonservierung beispielsweise von Blutbestandteilen ist allgemein bekannt .
Für spezielle Therapieverfahren in der Medizin werden periphere Blutstammzellen benötigt, die dem Blut von Patienten oder gesunden Spendern mit Hilfe eines Zellseparators entnommen werden. Nach der Entnahme müssen die Stammzellen im Labor für die Kryokonservierung vorbereitet werden.
Als räumliche Voraussetzung für die Kryokonservierung ist z.B. eine sterile Werkbank innerhalb eines Reinraums erforderlich. Zur Vorbereitung der Zellen für die Kryokonservierung ist es erforderlich, das Volumen des
Transplantats zu ermitteln und eine vorher a B mehreren Lösungen hergestellte Gefrierschutzlösung zuzu ischen sowie entsprechende Proben des Transplantats für die Laboruntersuchungen zu entnehmen. Hierzu uss das Transplantat von Hand mittels Spritzen und Schlauchleitungen mehrfach umgefüllt werden. Die Vorbereitung der Zellen für die Kryokonservierung wird meist durch entsprechend ausgebildete medizinischtechnische Assistenten durchgeführt.
Die Stammzellentransplantation ist zur Zeit ein gängiges Verfahren in der Therapie bestimmter bösartiger Erkrankungen. Sie wird an größeren hämatoonkologisehen Zentren inzwischen als Routineverfahren durchgeführt.
Die Bereitstellung von Reinräumen in den Transplantationszentren setzt hohe Investitionen voraus, zusätzlich zu dem sehr aufwendigen unterhalt. Da die Vorbereitung der Stammzellen nicht standardisiert ist, besteht das Risiko des Auftretens von Fehlern beim Mischen der Flüssigkeiten oder bakteriellen Kontaminationen. Diese können für die Patienten erhebliche Konsequenzen haben. Ferner ist die Vorbereitung der Stammzellen für die Kryokonservierung relativ zeit- und kostenintensiv.
In einem Artikel von M. Körbling, T. M. Fliedner, E. Rüber und H. Pflieger, Transfusion May-June 1980, Volume 20, No. 3, S. 293 ff wird eine Anordnung beschrieben, die einen Stammzellenbeutel, einen Beutel zur Aufnahme eines Kryoprσtektivums (DMSO) und einen Lagerbeutel umfasst. Die Beutel sind über Schlauchleitungen miteinander verbunden, so dass die Gefriersσhutzlösung in den Stammzellenbeutel und die Mischung aus Stammzellenkonzentrat und Gefrierschutzlσsung in den Lagerbeutel überführt werden können.
Das Mischen und Abfüllen des Transplantats m ß von Hand durchgeführt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu schaffen, durch die das Kontaminationsrieiko bei der Vorbereitung von Zellen für die Kryokonservierung verringert is . Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die Sicherheit beim Vorbereiten der Zellen zu erhöhen. Zu diesem Zweck soll es die Vorrichtung ermöglichen, das Vorbereitungsverfahren zu standardisieren und letztlich dadurch auch zu verkürzen. Schließlich soll die Vorrichtung dieses Verfahrens außerhalb eines Reinraums durchführbar machen, um die erheblichen Kosten für die Einrichtung und den Unterhalt eines solchen Raumes einzusparen.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß mit den im Patentanspruch 1 angegebenen Merkmalen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Vorbereitung von Zellen, insbesondere Stammzellen, für die Kryokonservierung, weist ein Aufnahmebehältnis zur Aufnahme von Zelltransplantat, insbesondere Stammselltransplantat, auf.
Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung Mittel zur Bereitstellung mindestens einer mit dem Zelltransplantat zu mischenden Zusatzlösung auf. Hierbei kann es sich um eine bei der Kryokonservierung allgemein gebräuchliche Gefrlersσhutzlösung und/oder eine Waschlösung handeln. Ferner ist mindestens ein Lagerbehältnis zur Aufnahme der zu konservierenden Mischung von Zelltransplantat und Zusatzlösung vorgesehen. Die in das Lagerbehältnis abgefüllte Mischung wird sodann zur Konservierung tiefgefroren, vorzugsweise schockgefroren. Vorzugsweise sind mindestens zwei Lagerbehältnisse vorgesehen. Durch das Vorsehen mehrerer Lagerbehältnisse ist sichergestellt, dass bei Beschädigung oder Kontaminierung eines Lagerbehältnisses dennoch eine ausreichende Anzahl an Zelltransplantat , insbesondere Stammzelltranβplantat, vorhanden ist. Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung Fluidelemente zur Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Au ahmebehältnis, den Mitteln zur Bereitstellung von Zusatzflüssigkeit und dem Lagerbehältnis auf.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Au nahmebehältnis für das Zelltransplantat, die Mittel für die Zusatzlösung, das Lagerbehältnis für die zu konservierende Mischung und die Fluidelemente insgesamt als ein geschlossenes steriles System ausgebildet sind, das an einen Zellseparator oder dergleichen anschließbar und dessen Betrieb mindestens teilweise automatisiert ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung stellt somit ein einfach zu handhabendes System dar, mit dem Zellen, insbesondere Stammzellen, in einem standardisierten Verfahren für die Kryokonservierung zusammen mit einem Zellseparator vorbereitet werden können. Die Vorbereitung der Zellen kann je nach Ausbaustufe der Vorrichtung grundsätzlich mit nur wenigen manuellen Eingriffen und teilweiser Automatisierung oder auch vollautomatisch erfolgen,
in dem Aufnahmebehältnis wird das dem Blut von Patienten oder gesunden Spendern mit Hilfe eines Zellseparators entnommene Zellentransplantat gesammelt. Das Zellenkonzentrat wird vorzugsweise aus dem Zellseparator direkt in das Aufnahmebehältnis überführt. Der Anschluss des Zellseparators erfolgt mit einer Anschlussleitung, die in das Auf ahmebehältnis führt.
Da die Vorrichtung den Ablauf der einzelnen
Verfahrensschritte vorgibt, ist das Verfahren zur Aufbereitung der Stammzellen standardisiert. Das Risiko des Auftretens von Fehlern wird somit minimiert . Auch können die einzelnen Verfahrensschritte für die Kryokonservierung in relativ kurzer Zeit und ohne Transport des Transplantats durchgeführt werden.
Durch das geschlossene System ist die Kontaminationsgefahr erheblich verringert bzw. vollständig ausgeschlossen. Ferner macht die Vorrichtung die Bereitstellung von Reinraumbedingungen überflüssig, wodurch erhebliche Kosten eingespart werden können.
Die Vorrichtung kann prinzipiell auch mehrere Aufnahmebehältnisse umfassen, die miteinander verbunden sind. Dadurch ist ein Abzεntrifugieren der für die Transplantation vorgesehenen Zellen und eine Verringerung des Volumens möglich.
Vorzugsweise ist ein erstes Fluidele ent mit dem Aufnahmebehältnis und den Mitteln zur Bereitstellung der Zusatzlösung verbunden. Ein zweites Fluidelement ist einerseits an einem Abzweigungspunkt mit dem ersten Fluidelement und andererseits mit dem Lagerbehältnis verbunden. Es ist somit möglich, durch das erste Fluidelement dem Aufnahmebehältnis Zusatzlösung zuzuführen. Für das zweite Fluidelement ist es in Verbindung mit dem Teilstück des ersten Fluidelemen s, das zwischen dem Aufnahmebehältnis und dem Abzweigungspunkt angeordnet ist, möglich, Flüssigkeit aus dem Aufnahmebehältnis dem Lagerbehältnis zuzuführen. Dies hat den Vorteil, daß ein Teil des ersten Fluidele ents für unterschiedlichen Fluidtransport genutzt wird. Dies verringert die Kosten der Vorrichtung.
Vorzugsweise ist eine Einrichtung zur wahlweisen
Festlegung der Fluidverbindung vorgesehen. Diese Einrichtung ist, wie vorstehend beschrieben, steuerbar, so daß die Fluidverbindung automatisch oder durch einen entsprechenden Steuerbefehl festgelegt werden kann.
Vorzugsweise weist die Einrichtung zur Festlegung der Fluidverbindung ein erstes Ventil, das zwischen den Mitteln zur Bereitstellung der Zusatzlösung und dem obigen A zweigungspunkt angeordnet ist, und ein zweites Ventil, das zwischen dem Abzweigungspunkt und dem Lagerbehältnis angeordnet ist, auf- Bei geschlossenem zweiten Ventil und geöffnetem ersten Ventil besteht somit eine Fluidverbindung zwischen den Mitteln zur Bereitstellung der Zusatzlösung und dem Aufnahmebehältnis. Wenn das erste Ventil geschlossen und das zweite Ventil geöffnet ist, besteht eine Fluidverbindung zwischen dem Aufnahmebehältnis und dem Lagerbehältnis .
Zur weiteren Automatisierung sind die Ventile vorzugsweise nicht manuell, sondern elektromagnetisch oder pneumatisch betätigbar. Als Schlauchklemmen können sie über eine entsprechende Steuereinrichtung betätigt werden .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist zwischen dem Aufnahmebehältnis und dem obigen Abzweigungspunkt ein mit dem ersten Fluidelement verbundenes Fördermittel angeordne . Die Anordnung des Fördermittels an dieser
Stelle hat den Vorteil, daß in Zusammenwirkung mit der
Einrichtung zur Festlegung der Fluidverbindung zur Fluidförderung im ersten und zweiten Fluidelement nur eine einzige Pumpe erforderlich ist. Bei dieser
Ausführungs orm ist die Überführung von Zusatzlösung in das Aufnahmebehältnis einerseits und nach der Mischung die Überführung von Zusatzlösung und Transplantat in das Lagerbehältnis andererseits mit nur einem Fördermittel, wie einer vorzugsweise volu etrischen Pumpe, möglich, die in dem Leltungsabsσhnitt des ersten Fluidelements zwischen dem Au nahmebehältnis und dem Abzweigungspunkt des zweiten Fluidelements angeordnet ist. Zum Fördern der Zusatzlösung bzw. der Mischung wird die Förderrichtung der Pumpe jeweils umgekehrt. Dabei gewährleisten vorzugsweise Schlauσhklemmen an, dem ersten oder zweiten Fluidelement, daß die Flüssigkeiten in die richtigen Richtungen fließen. Es können Schlauchklemmen oder Mehrwegventile oder dgl . vorgesehen sein.
Der Einsatz einer volumetrisσhen _ Pumpe zum Fördern der
Flüssigkeiten hat den Vorteil, dasε sich das Volumen der
Zusatzlösung auf einfache Weise aus der Anzahl der
Umdrehungen der Pumpe bestimmen bzw. mit der Anzahl der Umdrehungen vorgeben lässt. Auch das Volumen der in das Lagerbehältnis abzufüllenden Mischung aus Transplantat und Zusatzlösung kann mit der volumetrischen Pumpe auf einfache Weise bestimmt bzw. vorgegeben werden,
Das Volumen des Transplantats wird von dem ZeilSeparator vorgegeben. Dieses kann in die Vorrichtung manuell eingegeben oder direkt aus dem Zellseparator ausgelesen werden. Die Bestimmung der Zellenzahl erfolgt vorzugsweise mittels einer Probe. Hierzu ist vorzugsweise ein mit dem AufnahmebehAltnis verbundenes Testbehältnis vorgesehen, in dem eine für die Probe ausreichende Menge an Stammzellenkonzentrat gesammelt wird. Das Testbehältnis ist vorzugsweise ein mit dem Aufnahmebehältnis verbundener Folienbeutel, der zur Entnahme der Probe abgeschweißt wird.
Die Zusatzlösung wird vorzugsweise in mehreren Behältnissen bereitgestellt, die getrennte Flüssigkeiten aufnehmen, aus denen die Zusatzlösung gemischt wird. Die Zusatzlösung kann beispielsweise eine aus DMSO und HES und autologe Plasma gemischte Gefriersσhutzlösung oder eine aus NfaCl, RPMI, HA und ACD gemischte Waschlösung sein. Das autologe Plasma zur Mischung der Gefrierschutzlösung kann mit dem Zellseparator gewonnen und der Vorrichtung wie das Zellentransplantat kontinuierlich oder in Intervallen zugeführt werden.
Die Behältnisse zur Aufnahme von DMSO, HES und/oder NaCl, RPMI, HA sowie ACD sind vorteilhafterweise mit den jeweiligen Flüssigkeiten gefüllte Folienbeutel, die zur Bemessung der Flüssigkeitsmengen Volumenangaben enthalten können. Anstelle von Folienbeuteln sind auch großvolu ige Spritzen oder Glasbehältnisse denkbar, die manuell bedient oder In die bekannten Perfusoren eingelegt werden. Auch das Aufnahme- und das Lagerbehältnis sind vorzugsweise Folienbeutel, die mit Schlauchleitungen als Fluidelemente miteinander verbunden sind. Damit können alle mit dem Transplantat in Verbindung kommenden Teile der Vorrichtung als ein nur zur einmaligen Verwendung bestimmter Wegwerfgegenstand bereitgestellt werden,
In einer bevorzugten Ausführungs orm der Vorrichtung ist eine Steuereinrichtung vorgesehen, die das Volumen an Zusatzlösung vorgibt. Das Mischungsverhältnis von Zellentransplantat und Zusatzlösung ist von der Zellenzahl und dem Volumen des Transplantats abhängig. Die Steuereinrichtung weist vorzugsweise eine Speiσhereinheit zum Speichern von Transplantatvolumen und Zellenzahl sowie eine Recheneinheit auf, die aus diesen beiden Größen die zum Mischen mit dem Transplantat er orderliche Menge an Zusatslösung bestimmt.
Nach dem Füllen des Lagerbehältnisses muss dieses Behältnis sorgfältig entlüftet werden, damit beim Auftauen plötzliche Volumenschwankungen das Behältnis nicht zum Platzen bringen. Daher weist das Lagerbehältnis vorzugsweise eine mit einem hydrophoben Bakterienfil- ter/Virenfilter verschlossene Entlüftungsöffnung auf. Wenn das Lagerbehältnis mit dem Bakterienfilter nach oben zeigend in einen plasmaextraktor eingesetzt wird, lässt sich die Entlüftung problemlos durchführen.
Vorzugsweise ist an der Entlüftungsöffnung des Lagerbehältnisses ein mit Markierungen versehener Schlauch angeordnet, Die Markierungen dienen zum Abnehmen bestimmter Probenvolumina. Beispielsweise kann der Schlauch an den Markierungen verschweißt werden. Hierdurch ist eine automatische Probenentnahme möglich, durch die die Sterilität des Systems nicht beeinflusst wird.
Da es sich bei der Mischung von Gefrierschutzlösung und Transplantat um eine exotherme Reaktion handelt, deren Wärmeentwicklung das Transplantat schädigen könnte, sind vorzugsweise Mittel zur Kühlung des Aufnahmebehάltnieses vorgesehen. Zusätzlich können auch Mittel zum Kühlen der in das Aufnahmebehältnis zu überführenden Zusatzlösung vorgesehen sein, da auch die Mischung von z.B. DMSO und HES eine exotherme Reaktion darstellt , Die Kühlmittel für das Aufnahmebehältnis umfassen vorzugsweise eine das Behältnis in Bewegung versetzende Schwenkeinrichtung, um die Flüssigkeit gleichmäßig zu kühlen, wodurch gleichzeitig eine Durσhmischung stattfindet.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann bereits beim Hersteller aus ihren Einzelteilen zusammengesetzt und in sterilem Zustand an den Ort ihres späteren Gebrauchs gebracht werden. Es ist aber auch möglich, die Einzelteile getrennt in sterilem Zustand an den gewünschten Ort zu bringen und sie erst dort unmittelbar vor dem Gebrauch der Vorrichtung steril miteinander zu verbinden. Wenn dieses Verbinden unter normalen Umgebungsbedingungen, also in einer nicht sterilen Umgebung, erfolgt, können die Fluidelemente in ihrem inneren sterilisierende Mittel aufweisen, die nach dem Verbinden eine mikrobiologische Verunreinigung innerhalb des geschlossenen Systems der Vorrichtung beseitigen. Ein Beispiel für ein solches sterilisierendes Mittel sind in die Fluidelemente in Fließrichtung eingebaute sterilisierende Filter.
Im folgenden werden zwei bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine vereinfachte schematische Darstellung eines ersten Ausfύhrungsbeispiels der Vorrichtung zur Vorbereitung von Stammzellen für die Kryokonservierung,
Fig. 2 das Kühlmittel für das Aufnahmebehältnis der Vorrichtung von Figur 1 in vereinfachter schemat!sche Darstellung, und
Fig. 3 ein zweites Ausführungsbeispiel der Vorrichtung.
Die Vorrichtung zur Aufarbeitung peripherer BlutStammzellen für die Kryokonservierung umfasst z.B. verschiedene Komponenten zur Steuerung des Verfahrensablaufs und ein als Wegwer gegenstand ausgebildetes Sohlauchleitungsset mit Folienbeuteln,
Das Schlauchleitungsset weist einen Folienbeutel l zur Aufnahme des Zellentransplantats auf. Das Aufnahmebehältnis 1 weist ein erstes Anschlußstück la auf, an dem eine Schlauchleitung 2 angeschlossen ist, die mit dem Auslass 3a des Zellsapa.rs.tars 3 für das Stammzellenkonzentrat verbunden ist. Ein zweites Anschlussstück lb des Aufnahmebehältnisses 1 ist über eine Schlauchleitung 4σ mit einem kleineren Testbeutel 4 verbunden, der einen mit einer durσhstechbaren Membran 4a verschlossenen Schlauchansatz 4b für die Probenentnahme aufweist. Ein drittes Anschlussstück lσ des Beutels 1 ist über eine Schlauchleitung 5 mit dem Anschlussstück 6c eines Folienbeutels 6 verbunden, der als Gefrie schutzlösung z.B. mit DMSO und/oder einem anderen Kryoprotektivum HES befüllt ist. DMSO ist in der Lage, in Zellen einzudringen und senkt die Temperatur ab, bei der es zu einer Eisbildung kommt. HES gehört zu den makromolekularen Kryoprotektive .
Ein Folienbeutel 7 für autolσges Plasma weist ein Anschlussstück 7a auf, das über eine Schlauchleitung 8 mit der Schlauchleitung 5 verbunden ist. Der Plasmabeutel 7 wird über eine Schlauchleitung 9 befüllt, die zu dem Auslass 3b des Zellseparators 3 für das Plasma führt. Die Anschlussstücke 6c, 7a der beiden Beutel 6, 7 sind mit allgemein bekannten Abbrechteilen verschlossen. Zum Fördern des Plasmas ist eine volu etrlsche Rollenpumpe 10 an der Schlauchleitung 8 vorgesehen. Die beiden Beutel 6, 7 und die Pumpe 10 bilden die Mittel 11 zur Bereitstellung einer aus dem DMSO und PHS sowie autologem Plasma zu mischenden Zusatzlösung.
Von der Schlauchleitung 5 zweigt an einem Abzweigungspunkt 5a eine Schlauchleitung 12 ab, die zu einem Dreiwege-Ventil 12c führt, von dem zwei Leitungszweige 12a, 12b abgehen, die mit jeweils einem Lagerbehältnis 13, 14 verbunden sind. Jedes Lagerbehältnis 13, 14 ist ein mit den Schlauchleitungszweigen 12a, 12b verschweißter Folienbeutel, der eine Entlüftungsöffnung 13d, 14a aufweist. An der Entlüftungsöffnung jedes Lagerbeutels ist ein Schlauchleitungsstück 13b, 14b angeschlossen, das mit einem hydrophoben Bakterienfilter 13c, 14c verschlossen ist, der für Luft durchlässig, aber für Flüssigkeiten undurchlässig ist. Damit Kontaminationen ausgeschlossen sind, muss der Filter eine hohe Dichtigkeit gegenüber Bakterien und Viren haben. Das Schlauchleitungsstück 13b, 14b enthält Markierungen, die die Gewinnung von Referenzproben bestimmter Volumina durch Abschweißen gewährleisten.
Zum Fördern der Zusatzlösung in das Au ahmebehältnis 1 einerseits und der Mischung aus Zusatzlösung und Stammzellenkonzentrat andererseits in einen der beiden Lagerbeutel 13, 14 ist eine volumetrische Rollenpumpe 15 vorgesehen. An dem Leitungsabschnitt zwischen den Mitteln 11 ' zur Bereitstellung der Zusatzlösung und dem Abzweigungspunkt 5a der Schlauchleitung 12 ist eine erste Sσhl uchklem e 16 und an der zu den Lagerbeuteln 13, 14 führenden Schlauchleitung 12 eine zweite Schlauchklemme 17 vorgesehen. Die beiden Sσhlauchkle men 16, 17 bilden zusammen mit dem Abzweigungspunkt 5a eine Einrichtung 160 zur Festlegung der Fluidverbindung. Ferner weist die Vorrichtung eine erste Kühleinriσhtung 18 zum Kühlen der in dem Auf ahmebehältnis 1 befindlichen Suspension und eine zweite Kühleinrichtung 20 zum Kühlen der in das Aufnahmebehältnis 1 zu überführenden 2usatzlösung auf .
Sämtliche Schlauchleitungen sind mit den Folienbeuteln fest verbunden, vorzugsweise verschweißt, so dass die Vorrichtung ein steriles in sich geschlossenes
Sσhlauchset bildet. Ferner ist die Schlauchleitung 2, die den Zellseparator mit dem Aufnahmebehältnis verbindet, mit dem Aufnahmebehältnis 1 fest verbunden.
Erfindungsgemäß handelt es sich hierbei um ein in sich geschlossenes steriles System aus Fluidverblndungen und Behältnissen, Alternativ ist es auch möglich, das geschlossene sterile System aus Fluldverbindungen und Behältern vor Ort herzustellen, indem die Fluidelemente und/oder Behältnisse unter sterilen Bedingungen miteinander verbunden werden,
Figur 2 zeigt eine vereinfachte schematische Darstellung der ersten Kühleinrichtung 18 für das Aufnahmebehältnis 1 in der Seltenansicht. Die Kühleinrichtung 18 weist eine Schwenkeinrichtung 19 mit einer pendelnd gelagerten Metallplatte 19a auf, die von einem nicht dargestellten Antrieb kontinuierlich geschwenkt wird. In der Platte 19a befinden sich nicht dargestellte Kühlmittelεσhleifen, die von Kühlmittel durchströmt werden. Das Aufnahmebehältnis 1 liegt flach auf der Kühlplatte auf und wird zur gleichmäßigen Kühlung der Flüssigkeit kontinuierlich bewegt . Hierdurch wird die Erwärmung o Zusatzlösung und Zelltransplantat, die durch die exotherme Reaktion hervorgerufen wird, verringert, so dass ein Beschädigen der Zellen vermieden wird. Die Bewegung des
Aufnahmebehältnisses dient gleichzeitig der besseren Durchmischung von Zellentransplantat und Zusatzlösung. Neben der Schwenkbewegung kann daher auch eine Schütteloder Rotationsbewegung vorteilhaft sein.
Sämtliche Ventile 12c, 16, 17 der Vorrichtung sind elektromagnetisch betätigbar. Die Steuerung der Vorrichtung übernimmt eine Steuereinrichtung 21, die eine Recheneinheit 21a und eine Speichereinheit 21b sowie eine Eingabeeinheit 21σ umfasst. Von der Steuereinrichtung 21 führen Steuerleitungen 13a, 16a, 17a zu den Ventilen 12c, 16, 17 und Steuerleitungen 10a, 15a zu den Pumpen 10, 15. Eine Datenleitung 22 verbindet den Datenausgang des Zellseparators 3 mit der Steuereinrichtung 21. Die Vorrichtung zur Aufarbeitung von Stammzellen arbeitet wie folgt:
Der Zellseparator 3 wird mit dem Apheresensystem bestückt, das mit den Schlauchleitungen 2 und 9 verbunden ist. Die Steuerleitung 22 ist an dem Zellseparator 3 angeschlossen. Anschließend wird der Zellseparator 3 in Betrieb gesetzt. Das Aufnahmebehältnis 1 füllt sich nun mit Transplantat, dessen Volumen von dem Zellseparator 3 bestimmt wird. Die Steuereinrichtung liest diesen Wert, der in der Speichereinheit 21b gespeichert wird.
Nach Beendigung der Stammzellenapherese und nach Durchmischung des Transplantats wird der Testbeutel 4 manuell gefüllt, um ein kleines Volumen mit repräsentativer Zellenzahl abzutrennen. Anschließend wird der Testbeutel 4 abgesσhweißt, indem die Schlauchleitung 4c gleichseitig durchtrennt und verschweißt wird. Entsprechende Werkzeuge hierfür gehören zum Stand der Technik. Alternativ kann die Leitung aber auch mit einer Sσhlauchkle me abgeklemmt werden. Dem Teεtbeutel 4 wird nun eine Probe zur Bestimmung der Anzahl der Zellen und der Anzahl der Stammzellen in dem Transplantat entnommen. Die Anzahl der Zellen und der Stammzellen wird in die Eingabeeinheit 21c der Steuereinrichtung 21 eingegeben und ebenfalls in der Speiσhereinheit 21b gespeichert. Aus dem Transplantatvolumen und der Anzahl der Zellen berechnet die Recheneinheit 21a der Steuereinrichtung 21 dann das Mischungsverhältnis von Zusatzlösung und Zellentransplantat.
Daraufhin werden die Abbrechteile der Anschlussstüσke 6a, 7a der Beutel 6, 7 abgebrochen. Die Steuereinrichtung 21 setzt nun die volu etrisσhe Rollenpumpe 15 in Gang, die Zusatzlösung wird aus den Beuteln 6, 7 über die Schlauchleitung 5 in das Aufnahmebehältnis 1 befördert. Die Zusatzlösung ist eine Mischung aus DMSO und HES sowie autologem Plasma. Es kann aber auch eine Gefrie schutzlösung ohne die Zugabe autologen Plasmas zugeführt werden, so dass der Plasmabeutel 7 entfallen kann. Zum Fördern des Plasmas setzt die Steuereinrichtung 21 gleichzeitig die Rollenpumpe 10 in Gang. Die Umdrehungen der Pumpen stellt die Steuereinrichtung in Abhängigkeit von dem berechneten Mischungsverhältnis ein. Die Zugabe der Zusatzlösung erfolgt zeitgesteuert mit einer Rate von vorzugsweise 10 ml/Min, da die Gefrierschutzlösung os otisch aktiv ist und eine zu schnelle Infusion daher eine ZeilSchädigung zur Folge haben könnte. Während beide Pumpen 10, 15 in Betrieb sind, ist die erste Schlauσhklem e 16 geöffnet und die zweite Schlauchklemme 17 geschlossen. Da bei dem Mischvorgang von DMSO und HES sowie autologem Plasma Wärme entsteht, wird die zufließende Zusatzlösung mit der zweiten Kühleinrichtung 20 gekühlt. Die Mischung aus Transplantat und Zusatzlösung wird mit der ersten Kühleinriσhtung 18 fortlaufend gekühlt, wobei gleichzeitig eine Durchmischung mittels der Schwenkeinrichtung 19 (Fig. 2) stattfindet.
Anschließend hält die Steuereinrichtung 21 die Pumpen 10 und 15 an und kehrt die Förderrichtung der Pumpe 15 um, wobei die erste Sσhlauchklemme 16 geschlossen und die zweite Sσhlauchklemme 17 geöffnet wird. Die zu konservierende Mischung strömt nun über die Schlauchleitung 12 in den ersten Lagerbeutel 13. Nachdem der Beutel 13 gefüllt ist, schaltet die Steuereinrichtung
21 das Dreiweg -Ventil um, so dass der zweite Beutel 14 befüllt wird. Es können noch weitere Beutel vorgesehen sein, die nacheinander befüllt werden. Danach schaltet die Steuereinrichtung sämtliche Aggregate ab. Die Lagerbeutel werden nacheinander abgeschwei t, indem die Leitungsabschnitte 12a, 12b durchtrennt und verschweißt werden. Zur Entlüftung werden die Beutel in einen Plasmaextraktor so eingelegt, dass die Bakterienfilter nach oben zeigen. Für die mikrobiologische Diagnostik und die Transplantatanalyse können durch Abtrennen und Verschweißen der Schlauσhleitungsstüσke 13b, 14b der Beutel 13, 14 an dafür vorgesehenen Markierungen mehrere Proben entnommen werden. Zum Schluss werden die Beutel tiefgefroren.
Anstelle eines Aufnahmebehältnisses können auch mehrere über Schlauchleitungen miteinander verbundene Aufnahmebehältnisse vorgesehen sein. Dadurch ist insbesondere bei großvolu igen Apheresen ein Abzentrifugieren der Ze len und eine Verringerung des Volumens möglich. Wenn bei der Zentrifugation nicht auch die anderen Beutel mitzentrifugiert werden, müssen entsprechende Führungen für die Schlauchleitungen vorgesehen werden, die es ermöglichen, die anderen Beutel außerhalb der Zentrifuge zu lagern.
Figur 3 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der Vorrichtung zur Aufarbeitung von Stammzellen, die sich von der unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 2 beschriebenen Ausführungsform nur durch die Mittel 11' zur Bereitstellung von Zusatzlösung unterscheidet. In Fig. 3 ist daher nur der variierende Bereich der Vorrichtung, d.h., das Mittel 11' dargestellt.
Die Mittel 11' zur Bereitstellung von Zusatzlösung umfassen bei dieser Aueführungsform vier weitere Folienbeutel 23 bis 26, die mit NaCl, RPMI-Medium, HA und ACD zur Herstellung einer Waschlösung gefüllt sind. NaCl als elektrolythaltige Trägerlösung kann zur Verdünnung der Lösungen oder zum Erreichen bestimmter Endkonzentrationen von z.B. Proteinlösungen eingesetzt werden, RPMI ist eine elektrolyt- und kohlenhydrathaltige Lösung mit balanciertem pH-Wert und Zusatz von Aminosäuren/Proteinen. Humanalbumin (HA) kann das autologene Plasma ersetzen. Durch die Zugabe von Natriumeitrat (ACD) oder Heparin wird eine Gerinnung des Zellentransplantats und die Bildung von Koageln verhindert .
Die Folienbeutel sind über Schlauchleitungen 27 bis 31 mit der zu dem Aufnahmebehältnis 1 führenden Schlauchleitung 5 verbunden. Zum Fördern der Reagenzien sind Pμmpen 32 bis 35 vorgesehen, die von der Steuereinrichtung 21 entsprechend angesteuert werden.
Die Steuereinrichtung 21 steuert die Pumpen derart an, dass zunächst eine Waschlösung hergestellt und als erste Zusatzlösung in das Aufnahmebehältnis 1 gefördert wird. Anschließend wird als zweite Zusatzlösung die Gefrierschutzlösung hergestellt und in den Beutel 1 gef rdert. Die Mischung aus Stammsellenkonzentrat, Gefrierschutz- und Waschlösung wird dann in die einzelnen Lagerbeutel überführt. Das Mischungsverhältnis der beiden Zusatzlösungen und des Stammzellenkonzentrats wird wieder von der Steuereinrichtung berechnet und über die
Umdrehungen der volumetrisehen Pumpen eingestellt. Durch Vorgabe der Volumina der einzelnen Lösungen kann die Steuereinrichtung eine bestimmte Zellenzahl in jedem Lagerbeutel einstellen und die Konzentrate auf die Lagerbeutel verteilen.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur standardisierten und außerhalb eines Reinraums durchführbaren Vorbereitung von Zellen, insbesondere Stammzellen, für die Kryokonservierung, mit
einem Aufnahmebehältnis (1) zur Aufnahme von Zelltransplantat,
Mitteln (11, 11') zur Bereitstellung mindestens einer mit dem Zelltransplantat zu mischenden Zusatzlösung,
mindestens einem Lagerbehältnis (13, 14) zur Aufnahme dar zu konservierenden Mischung aus Zelltransplantat und Zusatalösung sowie
Fluidelementen (5, 12, 12a, 12b) zu Flüssigkeitsver- bindung zwischen dem Aufnahmebehältnis (l) , den Mitteln (11, 11') zur Bereitstellung von Zusatzlösung und dem Lagerbehältnis (13, 14),
dadurch gekennzeichnet, daß das Aufnahmebehältnis (1) für das Zelltransplantat, die Mittel (11, 11') für die Zusatzlösung, das Lagerbehältnis (13, 14) für die zu konservierende Mischung und die Fluidelemente (5, 12, 12a, 12b) insgesamt als ein geschlossenes steriles System ausgebildet sind, das an einen Zallseparator oder dergleichen anschließbar und dessen Betrieb mindestens teilweise automatisiert ist,
2. Vorrichtung nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Fluidelement (5) mit dem Aufnahmebehältnis (l) und den Mitteln (11, 11') zur Bereitstellung von Zusatzlösung verbunden ist sowie ein zweites Fluidelement (12) einerseits an einem Abzweigungspunkt (5a) mit dem ersten Fluidelement (5) und andererseits mit dem Lagerbehältnis (13, 14) verbunden ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (160) zur wahlweisen Festlegung der Fluidverbindung vorgesehen ist, die derart steuerbar ist, daß entweder eine Fluidverbindung zwischen den Mitteln
(11, 11') zur Bereitstellung von Zusatzlösung und dem
Aufnahmebehältnis (l) oder eine Fluidverbindung zwischen dem Aufnahmebehältnis (i) und dem Lagerbehältnis (13, 14) besteh .
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (160) zur Festlegung der Fluidverbindung ein erstes Ventil (16) , das zwischen den Mitteln (n, 11') zur Bereitstellung der Zusatzlösung und dem Abzweigungspunkt (5a) des zweiten Fluidelements (12) angeordnet ist, und ein zweites Ventil (17), das zwischen dem Abzweigungspunkt (5a) des zweiten Fluidelements (12) und dem Lagerbehältnis (13, 14) angeordnet ist, aufweist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventile (16, 17) elektromagnetisch oder pneumatisch betätigbare Schlauchklemmen sind.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Aufnahmebehältnis (l) und dem Abzweigungspunkt (5a) des zweiten Fluidelements
(12) ein Fördermittel (15) angeordnet ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch s, dadurch gekennzeichnet, daß die Förderrichtung des Fördermittels (15) umkehrbar ist, so daß damit Flüssigkeit entweder in das Aufnahmebehältnis (1) oder aus diesem heraus förderbar ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fördermittel (15) eine volumetrische Pumpe ist.
S>. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei 'Lagerbehältnisse (13, 14) vorgesehen sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluidelemente als Schlauchleitungen (5, 12) und/oder die Behältnisse (1, 13, 14) als mit den Fluldelementen (5, 12) verbundene Folienbeutel (6, 7, 13, 14) ausgebildet sind.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (ll, 11') zur Bereitstellung der Zusatzlösung mehrere Behältnisse (6, 7, 23 bis 26) zur getrennten Aufnahme mehrerer Flüssigkeiten aufweisen, aus denen die Zusatzlösung mischbar ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch ll, dadurch gekennzeichnet, daß die Behältnisse mit den jeweiligen Flüssigkeiten gefüllte Folienbeutel (6, 7, 23 bis 26) und/oder Glasbehältnisse sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß den Behältnissen (6, 7, 23 bis 26) je eine Pumpe (10, 32 bis 35) zugeordnet ist.
1 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, daß mit dem Aufnahmebehältnis (1) ein Testbehältnis (4) zur Aufnahme von Zelltransplantat verbunden ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche i bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine das Fördermittel (15) steuernde Steuereinrichtung (21) vorgesehen ist, , die derart ausge¬ bildet ist, daß ein vorgegebenes Volumen an Zusatzlösung in das Aufnahmebehältnis (l) überführbar ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (21) eine erste Speichereinheit (21b) zum Speichern des Volumens und der Zellenzahl des Zelltransplantats und eine zweite Steuereinrichtung (21b) aufweist, die derart ausgebildet ist, daß aus dem Zelltransplantatvolumen und der Zellenzahl die zum Mischen mit dem Zelltransplantat erforderliche Menge 'an Zueatz- lösung bestimmbar ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (21) mit der Einrichtung (160) zur wahlweisen Festlegung der Fluidverbindung verbunden ist .
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (21) in einem ersten Takt nach dem öffnen des ersten Ventils (16) und dem Schließen des zweiten Ventils (17) das Fördermittel (15) zum Fördern von Zusatzlösung in das Aufnahmebehältnis (1) ansteuert und in einem zweiten Takt nach dem Schließen des ersten Ventils (16) und dem Öffnen des zweiten Ventils (17) sowie dem Umkehren der Förderrichtung des Fördermittels (15) zum Fördern der Mischung aus Zellkonzentrat und Zusatzlösung in das Lagerbehältnis (13, 14) ansteuert.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Lagerbehältnis (13, 14) eine mit einem kleinstporigen Filter (13c, 14c) zur Verhinderung von bakterieller und/oder viraler Kontamination, vorzugsweise mit einem hydrophoben Bakterienfilter (13c, 14c) , verschlossene Entlüftungsöffnung (13d, 14a) aufweist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß an der Entlüftungsöffnung (13d, 14a) des Lagerbehältnisses (13, 14) ein mit Markierungen versehenes Schlauchleitungsstück (13b, 14b) zum Abtrennen von Proben vorgesehen ist .
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (18) zur Kühlung des Auf- nah ebehältnisses (l) vorgesehen sind,
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (18) zur Kühlung des Aufnahmebehältnisses (1) eine das Aufnahmebehältnis (1) in Bewegung versetzende Bewegungseinrichtung (19) aufweist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (20) zur Kühlung der in das Aufnahmebehältnis ( ) zu überführenden Zusatzlösung vorgesehen sind.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, gekennzeichnet durch Fluidelemente (5, 12, 12a, 12b) und/oder Behältnisse (1, 13, 14), die ein gegenseitiges steriles Verbinden erst unmittelbar vor dem Gebrauch der Vorrichtung gestatten.
25. Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluidelemente (5, 12, 12a, 12b) in ihrem Inneren sterilisierende Mittel aufweisen, die nach dem Verbinden der Fluidelemente (5, 12, 12a, 12b) und/oder der Behältnisse (1, 13, 14) unter normalen Umgebungsbedingungen sine mikrobiologische Verunreinigung innerhalb des geschlossenen Systems der Vorrichtung beseitigen.
6. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche l bis 25 zur Vorbereitung von Zellen, insbesondere Stammzellen, für die Kryokonservierung.
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