WO2002051797A1

WO2002051797A1 - Nouveau monomere d'acide nucleique peptidique fonctionnel et procede de production correspondant

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Publication number: WO2002051797A1
Application number: PCT/JP2001/008120
Authority: WO
Inventors: Hisafumi Ikeda; Isao Saito; Fumihiko Kitagawa
Original assignee: Applied Biosystems Japan Ltd; Hisafumi Ikeda; Isao Saito; Fumihiko Kitagawa
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2002-07-04
Also published as: EP1357112A1; US20080138817A1; US7282575B2; JPWO2002051797A1; US20040101839A1; EP1357112A4

Description

明細書新規な機能性べプチド核酸モノマーとその製法技術分野

本発明は、新規な構造を有する機能性べプチド核酸モノマ一およびその製造方法に関する。背景技術

核酸は生物の遺伝情報を司る DNAおよび RNAである。これに対して、ぺプチド核酸（PNA) とは、核酸の糖リン酸骨格を N— (2-アミノエチル)グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図 1) 。 DNA/RNAの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、 PN Aの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのため PN Aは従来の核酸と比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらに P NAは生体内ヌクレア一ゼ ·プロテア一ゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。

従来の DN Aを媒体にしていた技術を PNA化することにより、これまで克服できなかった DNAの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「DNAマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しい DN Aを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。

一方 PN Aは酵素に対し完全な耐性を持つので、 DN Aマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいて PN Aを DN Aに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。

DNAマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にも PN A化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいては PNAの効率的な機能化、すなわち P N Aモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規な P N Aモノマ一の設計が必要である。

PN Aオリゴマーの合成方法には通常の固相べプチド合成法を用いるので、 P NAモノマ一ュニヅトを PNAの背骨構造によって分類すると、 Fmo c型 PN Aモノマ一ュニヅトと t B 0 c型 PNAモノマーュニッ卜の 2種類が含まれる（図 2) 。

Fmo c型 PNAモノマーュニヅトの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的な DN A自動合成機によって可能であるため、下記のルート

(Xはグァニン、チミン、シ卜シンまたはアデニンを表す）

によって、少量スケ一ルでの合成が可能となっている。

当初 PNAには下記のような t B 0 c型 PNAモノマ一ュニヅト

- 2 - 差替え用紙（規則 26) Michael Egholm, Ole Buchardt, Peter E.

Nielsen, and Rolf H. Berg

J- Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1895-1897.

が採用され、その後より効率のよい合成方法

Kim L. Dueholm, Mchael Egholm, et. al,

J. Org. Chem. 1994, 59, 5767-5773.

が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易な F m o c型が開発されたため、 t B o c型の使用頻度は減少している。

しかし、グァニン 'チミン 'シトシン ·アデ二ン 4種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアル力リ条件に不安定な場合が多いので、アル力リ条件を使用しない t B o c 型 P N A背骨構造の有用性は高い。「t一ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願 2 0 0 0 - 2 6 8 6 3 8として既に特許出願中である。

これ以外にも、光機能性オリゴ； P N Aのモノマ一ュニヅ卜の合成例は過去に 5 例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（Peter E. Nielsen, Gerald Haa

- 3 - 差替え用紙（規則 26) iman, Anne B. Eldrap PCT Int. Appl. (1998) WO 985295 Al 19981126, T. A. Tran, R.-H. Mattern, B. A. Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145, Jesper Lohse et al. (1

997) Bioconjugate Chem.， 8, 503-509, Hans-georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen, et al. Pet Int. Appl. (1998) WO 9837232 A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch, et al. (1998) Nucleic Acid Res" 26, 715-720, Hans-georg Bate, Henrik Frydenlund H ansen, et al.) 。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルート A

ς -

c

0ZT80/T0df/13d .6.IS0/30 OAV

では効率良く合成できないと予想される。

そのため、例えば光機能性 PNAモノマーのような機能性 PNAモノマーの開発とともに、 PNAモノマーを効率的に機能化する技術の確立が強く望まれている o 発明の開示

したがって、本発明は、上記の問題を解消した新規な機能性 P N Aモノマーおよびその効率的な合成方法の提供を目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記ルート B

に示すように、 Ρ Ν Α背骨構造に t一ブトキシカルボニルアミノエチルァミン誘導体 6を用いて 1のペン夕フルォロフ二ル基を含む活性エステル体 5と縮合してほぼ定量的に光機能性 P N Aモノマ一 4を合成することに成功した。

さらに本発明者らは、下記ルート C

ルート C

8

に示すように、 P N A背骨構造に ω—アミノ酸誘導体 8を用いて 1のペン夕フルォロフヱ二ル基を含む活性エステル体 7と縮合してほぼ定量的に光機能性 P N A モノマー 4を合成することにも成功した。

上記ルート Bおよび Cにより、本発明者らは、上記課題を解決することを見出し本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、下記一般式（I )

(式中、 Aは

であり、 Bは

であり、 Rは H、 N0₂、 NH₂、 NHCbz；、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1〜4の整数である。ただし、 Aが

- 9 - 差替え用紙（規則 26)

である場合、 Bは

である）で表される化合物に関する。

また、本発明は、 t -ブトキシカルボニルァミノェチルァミンを機會¾性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を P NAモノマーに導入することよりなる機能性 P N Aモノマ一の製造方法であつて、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方法に関する。

さらに、本発明は、活性エステルが、下記一般式（I I )

(式中、 Aは

であり、 Rは H、 N0₂、 NH₂、 NHCbz、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1〜4の整数である）

で表される基を、エステル結合を形成するカルボニル炭素に有することを特徴とする、前記製造方法に関する。

また、本発明は、活性エステルが、ペン夕フルオロフヱノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、前記製造方法に関する。

さらに、本発明は、活性エステルを製造する方法であって、機能性分子のカルボン酸誘導体と、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンィミドォキシ基を有する化合物との反応を含むことを特徴とする、前記方法に関する。

また、本発明は、機能性分子のカルボン酸誘導体を製造する方法であって、機能性分子の誘導体と脂肪族カルボン酸との反応を含むことを特徴とする、前記方法に関する。

またさらに、本発明は、機能性分子から該機能性分子の誘導体を製造し、該機能性分子の誘導体から機能性分子の力ルポン酸誘導体を製造し、該機能性分子のカルボン酸誘導体から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 P N A モノマーを製造することを含む、機能性分子から機能性 P N Aモノマーを製造する方法において、下記 a ) 〜c ) ：

a ) 前記機能性分子のカルボン酸誘導体の製造において、機能性分子の誘導体と脂肪族カルボン酸とを反応させること；

b ) 前記活性エステルの製造において、機能性分子のカルボン酸誘導体とペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンィミドォキシ基を有する化合物とを反応させること；および、

c ) 前記機能性 P N Aモノマーの製造において、 t —ブトキシカルボニルァミノェチルァミンを、活性エステルである機能性分子の誘導体と反応させること；の 1または 2以上を含むことを特徴とする、前記方法に関する。

さらにまた、本発明は、下記一般式（I I I )

(in)

(式中、 R ¹は水素原子または炭素数 1〜 5の直鎖若しくは分枝鎖状のアルキル基、 mは 1〜 1 1の整数を表す）

で表される ω—アミノ酸誘導体を機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を P N Αモノマーに導入することよりなる機能性 P N Αモノマーの製造方法であつて、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方法に関する。そして、本発明は、活性エステルが、下記一般式（I I )

(式中、 Aは

であり、 Rは H、 N〇₂、 NH₂、 NHCbz、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1〜4の整数である）

で表'される基を、直接または脂肪鎖あるいはペプチド鎖を介して、エステル結合を形成するカルボニル基に有することを特徴とする、前記製造方法に関する。

- 13 - 差替え用紙（規則 26) そしてまた、本発明は、活性エステルが、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、前記製造方法に関する。

そしてさらに本発明は、機能性分子から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 P N Aモノマ一を製造すること含む、機能性分子から機能性 P N A モノマ一を製造する方法において、前記機能性分子からの活性エステルの製造が、 m—メチルレツドとスクシンィミドォキシ基を含む化合物とを反応させること、および/または前記活性エステルから機能性 P NAモノマーの製造が、一般式 ( I I I ) で表されるベンジルォキシカルボ二ルー ω—アミノ酸誘導体を、活性エステルである機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を Ρ Ν Αモノマーに導入すること、を含むこと特徴とする、前記方法に関する。

ここで、本発明による方法と従来の方法とを比較することによって本発明の特徴を詳細に説明する。

t B o c型 P NAモノマ一ュニヅト 4の合成は通常下記のルート Aが用いられる o

ル-ト A

■

=アルカリ条件に不安定な分子

ルート B

即ち、 1と 2を脱水縮合して 3を合成した後、 3をアルカリ加水分解することにより 4を得る方法である。グァニン ·チミン ·シトシン ·アデニン 4種類の核酸塩基を導入する場合もこの方法を用いる。これ以外の機能性分子（表 1に挙げる既知化合物のこと）を導入する際にも、ルート Aが用いられている。ところが、一般に光機能性分子はアル力リ条件に不安定な場合が多いので、ル一ト Aを用いると収率良く 4を得ることができない。そこで従来の P N A背骨構造 2を用いて縮合するのではなく、 2を先に加水分解した 6を用いることにした。 6は 1と同様な遊離カルボン酸基を内包しており分子内脱水縮合反応が引き起こる可能性があるため、 DCCなどの縮合剤による直接的な脱水縮合反応は利用できない。そこで 1をぺン夕フルオロフエノ一ルにて活性エステル体 5に変換した後、 6と反応させることにより 6の遊離カルボン酸基と 2級ァミノ基が分子内縮合しないように工夫した（ルート B) 。これにより 4が定量的に得られるようになった。このように、光機能性分子を活性エステル化して 6と反応させ 4を合成する方法は前例がなく、今後の多種多様な光機能性 P N Aモノマーの合成に不可欠な手段であるといえる。また、ルート Cに用いる、下記一般式（I I I )

NH₂

( ° o

へ

BocHN 人 (III

丫人 )

OH 、 '

R¹

(式中、 R ¹は水素原子または炭素数 1〜 5の直鎖若しくは分枝鎖状のアルキル基、 mは 1〜1 1の整数を表す）

で表されるベンジルォキシカルボニル— ω—アミノ酸誘導体には予めリンカー（カルボキシルアミノ酸）が結合しているため、当該誘導体は汎用性に富んでおり、活性エステル体を当該誘導体と反応させることによって、 1工程で目的とする機能性 Ρ Ν Αモノマ一ユニットが得られる。しかも、ベンジルォキシカルボニル一 ω—アミノ酸誘導体も、多くの市販品を用いることができる。したがって、当該ル一ト Cは、比較的高価な光機能性分子を対象とする場合に特に有効である。一方、スルホン酸クロリド系および立体障害が大きいメチルレッド等の光機能性分子の Ρ Ν Αモノマ一化は、ルート Βによってより好適に行われる。

したがって、本発明のルート Bおよびル一ト Cによる合成法を適宜選択することによって、多種多様な機能性 P N Aモノマーを合成することができる。

本発明によれば、例えば、 Naphthalimide型、 Flavin型、 Dabcyl型、 Biotin型、 FAM型、 Rhodamine型、 TA M型、 R0X型、 HABA型、 Pyrene型、 Coumarin型のような光機能性モノマーユニットが得られる。また、これら以外の光機能性モノマーュニヅトおよび光機能性モノマーュニット以外の機能性モノマーュニヅトを得ることも可能である。図面の簡単な説明

図 1は、 D N Aと P NAの構造および荷電の状況の違いを表す図である。図 2は、 2種類の P N Aモノマ一ュニヅトの構造を表す図である。発明を実施するための形態

光機能性モノマーュニヅ卜の合成に関しては、例えば化合物 4aの合成、

ルート A

において従来は機能性分子のカルボン酸誘導体 laと P N A背骨構造 2aを脱水縮合して 3aを合成したあとで、アルカリ加水分解して目的の 4aを得ていた（ルート A ) 。ところが laのフラビン骨格は酸には安定であるがアルカリ性条件で容易に分解し 6,7-dimethylquinoxalinedion^lなってしまうので、例え 3aが合成できても 4a を効率よく得ることは不可能である。そこで laを活性エステル体 5aに変換して 6a と反応させたところ、 4aは 85%の収率でほぼ定量的に反応が進行するようになった (ルート B) 。

また、化合物 4 bの合成

ルート A

において、ナフ夕ルイミド誘導体 3bも該当する lbと 2bから 44%の収率で得られたが、次のアル力リ加水分解により得られる 4 bはわずか 4%であった（ルート A ) 。そこで lbを活性エステル体 5bに変換して 6bと反応させたところ、 4 bは 75% の収率で反応が進行するようになった（ルート B) 。カルボン酸誘導体である 1 aおよび l bの製造には、脂肪族カルボン酸、好ましくは直鎖の脂肪族カルボン酸を用いる。

また、 P NAのァミノ基末端に導入するモノマーの製造には、スクシンイミド基を有する活性エステルが好適に用いられる。

なお、ルート Cに用いる一般式（I I I ) の ω—アミノ酸誘導体として、そのアミノ酸部分におけるカルボニル炭素上の炭素鎖の長さが炭素数 1〜 1 1のものが用いられるが、一般に Ρ ΝΑは D N Aとのハイプリヅドを期待しているので、立体的に D N Αに類似している誘導化が望ましい。この点を考慮すると、カルボキシルァミノ酸をリンカ一として利用する場合、ァミノ酸部分が Z -グリシンであるものが最適である。

光機能性オリゴ P N Aの合成方法としては、 F m o c法と tB o c法が用いられる。 F m o c法はアルカリ性試薬による脱保護過程を含んでおり、光機能性ォリゴ P NAの設計には不適切である。一方、 tB o c法はその合成過程にアル力リ条件を使用しないので光機能性オリゴ P N Aの合成方法として適している。したがって、本発明による P NAモノマーを t B o c法に適用すれば、光機能性ォリゴ P N Aの合成が効率的に行えるようになる。実施例

以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。

(実施例 1 )

2,3，4，5,6-ペン夕フルオロフェニル 2-(5,7，8-トリメチル -1,3-ジォキソ -2，5-ジヒドロ -2,4-ジァザフエナジン- 2-ィル)ァセテ一ト (5a)の合成

4a (100 mg, 318 ^mol ) と PfpOH (70.2 mg, 381 ^iol ) の DMF溶液（10 mL ) に EDC (73.2 mg, 382 mol ) を 0 。 C で加え、この反応液を 0 ° Cで 1時間室温で 12 時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、残渣を水■クロ口ホルム系で分酉由出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮したあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2.5% MeOH/CHCL) により精製し 5a ( 130 mg， 85%) を得た。 ¾ NMR (CDCL) δ 8.07 (s, 1 H), 7.44 (s, 1 H), 5.21 (s, 2 H TRANSLATION IN JP

INTERNATION SEARCH REPORT

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 差替え用紙（規則 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26 ISA/JP) 差替え用紙（規則 26 ISA/JP)

AMENDED SHEET (ARTICLE 19) 補正された用紙（条約第 19条）

STATEMENT UNDER ARTICLE 19 (1) 条約第 19条（1) に基づく説明書

RECTIFIED SHEET (RULE 91) 訂正された用紙（規則 91)

RECTIFIED SHEET (RULE 91 ISA/JP) 訂正された用紙（規則 91 ISA/JP)

RECTIFIED SHEET (RULE 91 RO/JP) 訂正された用紙（規則 91 RO/JP) )， .14 (s, 3 H), 2.55 (s， 3 H), 2.45 (s， 3 H); H MS (FAB⁺， NBA/CH2CI C HnO s [(M+H) の計算値は 481.0934, 実測値は 481.0950; UV 入 max (酵) 390, 460 (nm).

(実施例 2 )

2 - (N- (2-((t-ブトキシ）カルボニルァミノ）ェチル））-2-(5，7,8-トリメチル - 1,3 - ジォキソ（2,5-ジヒドロ- 2,4-ジァザフエナジン- 2-ィノレ）ァセチルァミノ）酢酸（4 a)の合成

5a (100 mg, 208 /zmol) と 6a (45.4 mg, 208 〃mol) の DMF溶液（10 mL)にジイソプロビルェチルァミン（36.3 ul, 208 umol) を加え、室温で 1 5時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（10-50% MeOH/ CHCL) により精製し 4a (130 mg, 85%) を得た。 Ή腿 (C請）6 7.94 (s) 及び 7.86 (s) (1 H)， 7.80 (s) 及び 7.75 (s) (1 H)， 5.03 (s) 及び 4.88 (s) (2 H), 4.17 (s) 及び 4.13 (s) (3 H)， 3.64及び 3.52 (2 H), 3.38及び 3.2 6 (2 H)， 2.58 (s) 及び 2.56 (s) (3 H), 2.46 (s) 及び 2.44 (s) (3 H), 1.4 6 (s) 及び 1.41 (s) (9 H); HRMS (FAB NBA/CH₂C1₂) C₂₄H₃

算値は 515.2252, 実測値は 515.2273; UV 人 max (DMF) 390， 460 (nm).

(実施例 3 )

N- (4-ジメチルアミノアゾベンゼン- 2， -カルボニル）グリシン（lc)の合成

メチルレツド（1.35 g, 5 腿 ol)と t-ブチルグリシン塩酸塩（880 mg, 5.25顧 0 1)の DMF溶液（10 mL)にトリエチルァミン（732 ul, 5.25 匪 ol)を加えたあと、水冷下 DCC(1.13g, 5.5醒 ol)を加え 30分、さらに室温で 15時間攪袢した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-10% ァセトン/ CH₂C1₂) により精製し、橙色針状晶として lcの t-ブチルエステル誘導体 (1. 05 g, 55%)を得た。これ (765 mg, 2腿 ol) に蟻酸 (50 mL)を加え室温で 2日攪拌し、減圧濃縮し蟻酸を除いたあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% A cetone/CH₂Cl₂) により精製し、赤色針状晶として lc(549 mg, 84%) を得た.。 Ή 腿 (CDCL) δ 9.99 (brt， 1H)₃ 8.40 (d, J = 8 Hz, 1 H)， 7.89 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.84 (d， J = 8 Hz， 1H)₃ 7.56 (t, J = 8 Hz, 1 H)， 7.49 (t， J = 8 Hz, 1 H), 6.75 (d， J = 9 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 5 Hz, 2 H), 3.10 (s， 6 H); ¹³

-22- 訂正された用紙（規則 91) C NMR (CDCla) d 167.61, 153.39, 150.86, 143.30, 132.49, 131.47, 129.38， 127.69, 126.28, 116.24,111.63, 43.20, 40.24.

(実施例 4)

2, 3, 4,5, 6-ペン夕フルォロフェニル N-(4-ジメチルァミノァゾベンゼン- 2' -カルボニル）グリシネート（5c)の合成

lc(326 mg, 1 画 ol)と PfpOH(276 mg, 1.5 腿 ol)の DMF溶液（10 mL)に DCC(308 m g, 1.5纖₀1)を氷冷下加ぇ、この反応液を室温で： 15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% アセトン/ CH₂C1₂ ) により精製し橙色粉末として 5c(449 mg, 91%) を得た。 Ή NMR (CDCL) d 10. 14 (brt, 1 H),8.37 (d, J = 8 Hz, 1 H)， 7.78 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.76 (d,

J = 8 Hz, 1 H),7.57 (t, J = 8 Hz, 1 H)₅ 7.50 (t， J = 8 Hz, 1 H), 6.74 ( d, J = 9 Hz, 2 H),4.68 (d, J = 5 Hz, 2 H)， 3.06 (s, 6 H).

(実施例 5 )

2- (N- (2- ((t-ブトキシ）カルボニルァミノ）ェチル）-2-(4-ジメチルアミノアゾベンゼン -2⁵ -カルボニルァミノ）ァセチルァミノ）酢酸（4c)の合成

5c (246 mg, 0.5 腿 ol)と 6(109 mg, 0.5 蘭 ol)の DMF溶液（5 mL)にジイソプロピルェチルァミン（85 μΐ, 0.5 腿 ol) を加え、室温で 1 5時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-30% MeOH/ CH2CI2) により精製し 4c(225 mg, 72%)を得た。 Ή NMR (CDCL) δ 9.99 (s) 及び 9.85 (s) (1 H) ,8.3-7.6 (m,4 H), 7.4-7.2 (m,2 H)， 6.67 (s) 及び 6.59 (s) (2 H)， 5.62 (s )及び 5.27 (s) (1 H), 4.35 (s) 及び 4.20 (s) (2 H)， 3.99 及び 3.90 (2 H) , 3.5(brs) 及び 3.3 (brs) (2 H), 3.2 (brs) 及び 3.0 (brs) (2 H), 2.99 (s ) 及び 2.87(s) (6 H), 1.25 (brs, 9 H).

1 cから 4 cに至るルートは下記の通りであった。

- 23

0ZT80/I0df/X3d .6.TS0/Z0 OAV (実施例 6 )

N-(4-ヒドロキシァゾベンゼン- 2， -カルボニル）グリシン（Id)の合成

HABA(1.21 g, 5删 ol)と t-ブチルグリシン塩酸塩 (880 mg, 5.25画 ol)の DMF溶液（lOmL)に卜リエチルァミン（732 jul, 5.25 蘭 ol)を加えたあと、氷冷下 DCC(1. 13 g, 5.5顧 ol)を加え 30分、さらに室温で 15時間攪拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% アセトン/ CH₂C1₂) により'精製し、橙色粉末として Idの t-プチルエステル誘導体 (1.73 g₅ 97%)を得た。これ（1.07 g， 3雇 ol)に蟻酸 (50 mL)を加え室温で 2日攪拌し、減圧濃縮し蟻酸を除いたあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% アセトン/ CH₂C1 により精製し、橙色粉末として ld(0.89 g， 99%)を得た。 Ή ΝΜΙί (CDCL) δ 10.4 5 (brt, 1 H), 8.88 (brt， J =5 Hz, 1 H), 7.91 (d， J = 9 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 8 Hz, 1 H)， 7.70 (d, J = 8Hz, 1 H), 7.60 (t, J = 8 Hz, 1 H)， 7.5 7 (t， J = 8 Hz, 1 H), 6.94 (d, J = 9Hz, 2 H)， 4.05 (d， J = 5 Hz, 2 H); ¹³ C N R (CDCL) ό¹ 171.18, 166.44, 161.54,149.13, 145.34, 133.20, 131.09, 130.18, 129.61, 125.86, 116.00, 115.88,41.60.

(実施例 7 )

2，3,4,5，6-ぺン夕フルォロフェニル N- (4-ヒドロキシァゾベンゼン _2^? -カルボニル）グリシネート（5d)の合成

ld(299 mg， 1 腿 ol)と PfpOH(276 mg, 1.5顧 ol)の MF溶液（10 mL)に DCC(308 m S, 1.5匪 ol)を氷冷下加え、この反応液を室温で 15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% アセトン/ CH₂C 1 により精製し橙色粉末として 5d(46 mg, 10%)を得た。 Ή NMR (CDC1₃) δ 9.6 7 (brs, 1 H),9.02 (brt, 1 H), 7.8-7.7 (m, 3 H)， 7.6-7.5 (m, 2 H)， 7.23 (d， J = 9 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 9 Hz, 2 H), 4.67 (d, J = 5 Hz, 2 H).

(実施例 8 )

2- (N- (2-((t-ブトキシ）カルボニルァミノ）ェチル）- 2-(4-ヒドロキシァゾベンゼン -2， -カルボニルァミノ）ァセチルァミノ）酢酸（4d)の合成

5d(37 mg, 80 〃inol)と 6(18 mg, 80 〃mol)の DMF溶液（5 mL)にジイソプロピルェチルァミン（14 l, 80 jLL ol) を加え、室温で 15時間撹拌した。これを減圧

-25- 訂正された用紙（規則 91) 濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-30% MeOH/ CH₂C1₂) により精製し

4d(13 mg, 33%)を得た。 Ή NMR (CDCL)^ 9.77 (s) 及び 9.59 (s) (1 H), 8.26 (s) 及び 8.14 (s) (2H)， 7.9-7.6 (m， 2 H), 7.6-7.3 (m， 2 H)， 7.0-6.6 (m， 2 H)， 5.35 (s) 及び 5.05(s) (1 H)， 4.40 (s) 及び 4.24 (s) (2 H)， 3.98 ( s, 2 H), 3.6-3.3 (m, 2 H),3.21 (s) 及び 3.02 (s) (2 H)， 1.28 (s) 及び 1.

18 (s) (9 H).

1 dから 4 dに至るルートは下記の通りであった。

26 LZ一

0ZT80/I0df/X3d .6.TS0/Z0 OAV (実施例 9 )

FAM-Gly-^B。。PNA-OHの合成

Gly-^BocPNA-OH (30.3 mg, 0. 10 雇 ol) の dimethylformamide溶液（5 mL) に 5, 6-FAM -hydroxysucc inimide ester (50 mg, 0. 11 腿 ol) と triethylamine (250 L, 2.0 雇 ol) を順番に加え、室温で 1 5時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー（0-25% MeOH/dichloromethane) に付し、黄色粉末として FAM-Gly -， NA- 0H (69.8 mg, 100%) を得た。 FABMS m/z

634 [ (M+H)⁺j ; 丽 (FAB calcd for C 0"Ν₃ [ ( +Η)⁺] 634. 1959, observed 634.2034.

(実施例 1 0 )

TAMRA-Gly-^BeePNA- 0Ηの合成

Gly -， NA - OH (5.8 mg, 21 1) の dimethylformamide溶液 (5 mL) に 5，6- TAMRA -hydroxysucc inimide ester (5 mg, 9.5 jumol ) と triethylamine (20 ju I, 140 jumol) を順番に加え、室温で 1 5時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（0-30% MeOH/dichloromethane) に付し、赤紫色粉末として TAMRA- Gly -， NA-0H (6mg, 100%) を得た。 FABMS m/z

688 [ (M+H)つ; 匪 S (FAB+) calcd for C₃₆Hu0₉N_s [ (M+H)⁺] 688.2904, observed 6 88.2993.

(実施例 1 1 )

R0X- Gly- ^B。TNA- OHの合成

Gly-^BocPNA-OH (4.9 mg, 18 〃mol) の dimethylformamide溶液（5 mL) に 5, 6 - 腿■/Hiydroxysucc inimide ester (5 mg, 8 mol) と triethylamine (20 μ.1, 1 40 mol) を順番に加え、室温で 1 5時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残澄をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (0-30% MeOH/dichloromethane) に付し、紫色粉末として R0X- Gly-^B。。PNA- OH (6mg， 100%) を得た。 FABMS M/Z 792 [ (M +H) ; 画 S (FAB⁺) calcd for C"i ₅ [(M+H)+] 792.3530, observed 792.3615.

(実施例 1 2 )

2， 3， 4, 5 , 6-Pentaf luoropheny 1 N- ( -D imethy 1 aminoazobenzene-2⁵ -carbonyl )gl ycinate o~MR-Gly-0Pfpの合成

- 28 - α-MR-Gly-OH (326 mg, 1 匪 ol)と PfpOH (276 mg, 1.5腿 ol)の DMF溶液（10 mL) に DCC (308 mg, 1.5 顏 ol)を氷冷下加え、この反応液を室温で 15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% A cetone/CHzC ) により精製し橙色粉末として o~MR- Gly- OPfp (449 mg, 91%) を得た。 Ή腿 (CDC ) d 10.14 (brt, 1 H), 8.37 (d, J= 8 Hz, 1 H)， 7.78 (d， J= 9 Hz, 2 H), 7.76 (d， J: 8 Hz, 1 H)， 7.57 (t， J= 8 Hz, 1 H), 7. 50 (t, J= 8 Hz, 1 H), 6.74 (d， J= 9 Hz, 2 H), 4.68 (d， «/= 5 Hz, 2 H), 3.06 (s, 6 H).

(実施例 13 )

2-(N-(2-{, { tert- utoxy ) carbonylamino ) ethyl ) -2- ( -dimethyIaminoazobenzene-2' -carbonylamino ) acetylamino ) acetic acid o-MR-Gly-^BocPNA-OHの合成

i>- R-Gly-0Pfp (246 mg, 0.5腿 ol)と⁸" PNA- OH (109 mg, 0.5 麵 ol)の DMF溶液 (5 mL)に diisopropylethylamine (85 jul, 0.5翻 ol) を加え、室温で 1 5時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0- 30% MeOH/ CHzCh) により精製し观- Gly -⁸。 TNA-0H (225 mg, 72%)を得た。 Ή薩 (CDCh) δ 9.99 (s) and 9.85 (s) (1 H), 8.3-7.6 (m) (4 H), 7.4-7.2 (m) (2 H),6. 67 (s) and 6.59 (s) (2 H), 5.62 (s) and 5.27 (s) (I E), 4.35 <s) and 4.2 0 (s) (2 H)， 3.99 and 3.90 (2 H)， 3.5 (brs) and 3.3 (brs) (2 H)， 3.2 (br s) and 3.0 (brs) (2 H)， 2.99 (s) and 2.87 (s) (6 H), 1.25 (brs, 9 H).

(実施例 14)

2-(N-(2-( ( ieri-Butox ) carbonylamino ) ethyl) -2-( 4-dimethylaminoazobenzene-4' -carbonylamino) acethylamino) acetic acid Dabcyl-Gly-^BooPNA-OH (p-MR-Gly-^B∞PNA-OH) の合成

Gly-^B。。PNA- OH (100 mg， 0.39讓 ol) の dimethyl formamide溶液（10 mL) に da bcyl THiyd皿 ysuccinimide ester (145 mg, 0.40藤 1) と triethylamine (600 M , 4.5腿 ol) を順番に加え、室温で 15時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリ力ゲルカラムクロマトグラフィ一（0-4% MeOH/dichloromethane) に付し、赤褐色粉末として Dabcyl- Gly-^B PNA- 0H (184 mg, 90%) を得た。 ¾腿 (DMSO- め δ 8.18 (d, J = 7 Hz, 2 H)， 7.91 (d, J = 7 Hz, 2 H), 7.88 (d,

-29- 訂正された用紙（規則 91) J = 7 Hz， 2 H)， 6.77 (d₃ J = 7 Hz, 2 H), 5.76 (s) and 5.30 (s) (2 H), 4. 22 (brs) and 4.05 (brs) (2 H), 3.73 (brs) and 3.49 (brs) (2 H), 3.47 (br s) and 3.29 (brs) (2 H)， 1.26 (s, 9 H); FABMS m/z 527 [(M+H) +].

(実施例 15 )

N-(4-Hydroxyazobenzene-2' -carbonyl)glycine HABA-Gly -OHの合成

HABA (1.21 , 5腿 ol)と i-ブチルグリシン塩酸塩（880 mg， 5.25腿 ol)の DMF 溶液（10 mL)にトリエチルァミン（732 JLLL, 5.25醒 ol)を加えたあと、氷冷下 DCC

(1.13 g, 5.5腿 ol)を加え 30分、さらに室温で 15時間攪拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% Acetone/CH₂Cl ₂) により精製し、橙色粉末として HABA-Gfly- 0Hの ί -プチルエステル誘導体 (1.73 g, 97%)を得た。これ（1.07 g, 3腿 ol)に蟻酸 (50 mL)を加え室温で 2日攪拌し、減圧濃縮し蟻酸を除いたあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% Acetone /CILCI により精製し、橙色粉末として HABA-Gly- 0H (0.89 g, 99%)を得た。 Ή

NMR (CDCb) δ 10.45 (brt, 1 H), 8.88 (brt, = 5 Hz， 1 H), 7.91 (d， J = 9 Hz, 2 H), 7.85 (d, J= 8 Hz, 1 H), 7.70 (d， J= 8 Hz, 1 H)， 7.60 (t,

J= 8 Hz, 1 H), 7.57 (t, J= 8 Hz, 1 H)， 6.94 (d, J= 9 Hz, 2 H)₅ 4.05 (d, J= 5 Hz, 2 H); ¹³C NMR (CDCL) δ 171.18, 166.44, 161.54, 149.13, 14 5.34, 133.20, 131.09, 130.18, 129.61, 125.86, 116.00, 115.88, 41.60.

(実施例 16 )

2,3,4,5,6-Pentafluorophenyl N-(4-Hydroxyazobenzene-2' -carbonyl)glycinate HA

BA-Gly-OPfpの合成

HABA-Gly- OH (299 mg₃ 1 腿 ol)と PfpOH (276 mg， 1.5顧 ol)の DMF溶液（10 mL) に DCC (308 mg, 1.5 腿 ol)を氷冷下加え、この反応液を室温で 15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-5% A cetone/CH₂Cl₂) により精製し橙色粉末として HABA-Gly- OPfp (46 mg, 10%)を得た。 'Η NMR (CDCls) ό" 9.67 (brs, 1 Η)， 9.02 (brt, 1 Η), 7.8-7.7 (m, 3 Η)， 7.6-7.5 (m, 2 Η)₅ 7.23 (d, J= 9 Hz, 1 H), 6.86 (d, J: 9 Hz, 2 H), 4.67

(d, J= 5 Hz, 2 H).

(実施例 17 )

- 30 - 2-(N-(2-((ieri-Butoxy)carbonylamino)ethyI)-2-(4-hydroxyazobenzene-2' -carbonyla mino)acethylamino)acetic acid HABA-Gly-^B。^cPNA-OHの合成

HABA-Gly-OPfp (37 mg, 80 〃mol)と， M-OH (18 mg, 80 〃mol)の DMF溶液（5 mL)に diisopropylethylamine (14 mL, 80 〃mol) を加え、室温で 15時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-30% MeOH/ CH₂C 1₂) により精製し HABA- Gly- ^B。TM- OH (13 mg, 33 )を得た。 ¾腿 (CDCl₃)d 9. 77 (s) and 9.59 (s) (1 H), 8.26 (s) and 8.14 (s) (2 H), 7.9-7.6 (m, 2 H) , 7.6-7.3 (m, 2 H), 7.0-6.6 (m, 2 H), 5.35 (s) and 5.05 (s) (1 H)₅ 4.40 (s) and 4.24 (s) (2 H), 3.98 (s， 2 H), 3.6-3.3 (m, 2 H)， 3.21 (s) and 3. 02 (s) (2 H)， 1.28 (s) and 1.18 (s) (9 H).

(実施例 18 )

2,3,4,5,6-Pentafluorophenyl 2-(5,7,8-trimethyl-l,3-dioxo-2,5-dihydro-2,4-diazaphe nazin-2-yl)acetate Flavin-OPfp©合成

Flavin (100 mg, 318 zmol) と PfpOH (70.2 mg, 381 ol) の DMF溶液（1 0 mL) に EDC (73.2 mg, 382 mol) を 0 ° C で加え、この反応液を 0 ° C で 1時間室温で 12 時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、残渣を水 'クロ口ホルム系で分配抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮したあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2.5% MeOH/CHCL) により精製し Flavin- 0 Pfp (130 mg, 85%) を得た。 ¾腿 (CDCb) δ 8.07 (s, 1 H), 7.44 (s， 1 H) , 5.21 (s, 2 H), 4.14 (s, 3 H), 2.55 (s, 3 H), 2.45 (s, 3 H); HRMS (FAB+ , ΝΒΑ/CftCL·) calcd for C21H14O4M5 [(M+H)⁺] 481.0934, observed 481.0950; U V Amax (DMF) 390， 460 (nm).

(実施例 1 9 )

2-(N-(2-((ieri-Butoxy)carbonyIamino)ethyl)-2-(5,7,8-trimethyl-l,3-dioxo(2,5-dihydro -2,4-di- azaphenazin-2-yl)acethylamino)acetic acid Flavin-^B∞PNA-OHの合成

Flavin-OPfp (100 mg, 208 〃mol) と ^B。。PNA-0H (45.4 mg, 208 juml) の DM F溶液（10 mL)に diisopropylethylamine (36.3 /il, 208 〃mol) を加え、室温で 15時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（10-5 0% MeOH/CHCL) により精製し Flavin- ^B°。PNA-0H (130 mg, 85%) を得た。 Ή NMR

- 31 - (CD₃0D)d 7.94 (s) and 7.86 (s) (1 H), 7.80 (s) and 7.75 (s) (1 H)， 5.03 (s) and 4.88 (s) (2 H), 4.17 (s) and 4.13 (s) (3 H), 3.64 and 3.52 (2 H ), 3.38 and 3.26 (2 H), 2.58 (s) and 2.56 (s) (3 H)， 2.46 (s) and 2.44 ( s) (3 H), 1.46 (s) and 1.41 (s) (9 H); HRMS (FAB÷₃ NBA/CH₂CL) calcd for C24H31O7N6 [(M+H) +] 515.2252, observed 515.2273; UV A ax (DMF) 390, 460 ( nm).

(実施例 2 0 )

2，，3，，4，，5，，6， -Pentafluorophenyl l,3-Dioxo-lH-benz[de]isoquinoline-2(3H)-a cetate NI-OPfpの合成

NI-0H (192 mg, 0.75 藤 ol)と PfpOH (152 mg, 0.83 腿 ol)の DMF溶液（5 mL)に D CC (155 mg, 0.75 腿 ol)を氷冷下加え、この反応液を室温で 15時間撹拌した。反応液を濾過し濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（CH₂C1₂) により精製し赤色粉末として NI- OPfp (277 mg, 87%)を得た。 Ή NMR (CDCla) δ 8.64 (d₃ J = 8 Hz, 2 H), 8.25 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.78 (t₅ J = 8 Hz, 2 H ), 5.29 (s, 2 H).

(実施例 2 1 )

2-(N-(2-((ieri-Butoxy)carbonylamino)ethyl)-2-(l,3-dioxo-lH-benz[de]isoquinoIine-2( 3HD)acethyIamino)acetic acid NI-^B°。PNA-OHの合成

NI-0Pfp (211 mg, 0.50 画 ol) と ⁸。雷- OH (120 mg, 0.55 雇 ol) の匿溶液 (10 mL)に diisopropylethylamine (87 μ. , 0.50 腿 ol) を加え、室温で 1 5時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（0-20% MeOH /CHCL) により精製し NI-^B。^ePNA- 0H (130 mg, 85%) を得た。 Ή NMR (DMSO-de) δ

8.47 (m, 4 H)， 7.86 (dd, J= 8.3, 7.3 Hz, 2 H), 4.73 (s, 2 H); ¹³C NMR ( CDCL) d 167.84， 163.59, 134.20, 131.44, 131.39, 128.11， 126.78, 122.00,

61.59, 41.44， 14.29; HRMS (FAB+, ΝΒΑ/CmCL·) calculated for (C_l6H₁₃NO ff 2 84.2933, observed 456.1767; UV Amax (DMF) 333 nm.

(実施例 2 2 )

2' ，3，，4，，5，，o -Pentafluorophenyl l,3-Dioxo-5-nitro-lH-benz[de]isoquinoline- 2(3H)-acetate NI(N0₂)-OPfpの合成

- 32 - NI(N0₂)-0H (100 rag, 318 zmol) と PfpOH (70.2 mg, 381 〃mol) の DMF溶液 (10 mL) に EDC (73.2 mg, 382 j ml) を 0 ° C で加え、この反応液を 0 ° C で 1時間室温で 12 時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、残渣を水 ·クロ口ホルム系で分配抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮したあと、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2.5% MeOH/CHCL) により精製し NI(N 0₂) - OPfp (130 mg, 85%) を得た。 Ή NMR (CDCh) δ 8.07 (s， 1 H)， 7.44 (s, 1 H), 5.21 (s, 2 H)， 4.14 (s, 3 H), 2.55 (s， 3 H)₃ 2.45 (s, 3 H); HRMS ( FAB⁺, NBA/CHzCL) calcd for C21H14O4N4F5 [(M+H) +] 481.0934, observed 481.0950; U V Xmax (DMF) 390, 460 (nm).

(実施例 23)

2-(N-(2-((ieri-Butoxy)carbonylamino)ethyl)-2-(l,3-dioxo-5-nitro-lH-benz[de]isoquin oline-2(3H))acethyIamino)acetic acid NI(N〇₂)-^B。^cPNA-OHの合成

NI(N0₂)-0Pfp (100 mg, 208 mol) と，NA-0H (45.4 mg, 208 輝 1) の DM F溶液 (10 mL)に diisopropylethylamine (36.3 j l, 208 〃mol) を加え、室温で 15時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（10-5 0¾ MeOH/CHCls) により精製し ΝΙ(Ν0₂)-^Β'ΤΝΑ-0Η (130 mg, 85%) を得た。 Ή NMR (C謹） (5 7.94 (s) and 7.86 (s) (1 H)， 7.80 (s) and 7.75 (s) (1 H)， 5.03

(s) and 4.88 (s) (2 H), 4.17 (s) and 4.13 (s) (3 H), 3.64 and 3.52 (2 H ), 3.38 and 3.26 (2 H), 2.58 (s) and 2.56 (s) (3 H), 2.46 (s) and 2.44 ( s) (3 H)₃ 1.46 (s) and 1.41 (s) (9 H); HRMS (FAB+, ΝΒΑ/CftCL·) calcd for C24H31O7N6 [(M+H)⁺3515.2252, observed 515.2273; UV え max (DMF) 390, 460 ( nm).

(実施例 24)

5-Acetylamino-l,3-dioxo-lH-benz[de]isoquinoline-2(3H)-acetic Acid NI(NHAc)-0

Hの合成

NI(NH₂)-0H (100 mg, 0.37讓 ol)を pyridine (3 mL)と Ac₂0 (3 mL)に溶かし、室温で 1 5時間撹拌した。減圧濃縮したあと dichloromethaneで洗い、ろ過 ·乾燥させ NI (腿 c)-0H (103.2 mg, 89%)を得た。 Ή賺 (DMS0-d₆) δ 8.79 (s， 1 H), 8 .61 (s, 1 H)， 8.40 (d, J = 8 Hz, 1 H)， 8.37 (d, J = 8 Hz, 1 H)， 7.82 (t,

- 33 - J = 8 Hz， 1 H), 4.71 (s, 2 H)₃ 2.16 (s, 3 H).

(実施例 2 5 )

2，，3，，4，，5，，6， -Pentafluorophenyl 5-Acetylamino-l,3-dioxo-lH-benz[de]isoqui noline-2(3H)-acetate NI(NHAc)-OPfpの合成

NI(NHAc)-0H (97 mg, 0.31 腿 ol)と PfpOH (63 mg, 0.3 腿 ol) の匿溶液 ( 5 mL) に DCC (71 mg, 0.34腿 ol) を 0 ° C で加え、この反応液を 0 。 C で 1 時間室温で 15 時間撹拌した。この反応液をろ過後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法 (0-20% acetone/CHCls) により精製し NI(NHAc)-0Pfp (140 m g, 95%) を得た。 Ή NMR (CDCL) δ 8.96 (s, 1 H)， 8.53 (d, J = 7.7 Hz, 1 H ), 8.32 (d, J二 1.6 Hz, 1 H), 8.20 (d, J = 7.7 Hz, 1 H)， (t, J = 7.5 Hz , 2 H)， 7.82 (brs, 1 H), 7.74 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H)， 2.28 (s， 3 H).

(実施例 26 )

2-(N-(2-((ieri-Butoxy)carbonylamino)ethyI)-2-(5-acetylamino-l,3-dioxo-lH-benz[de] isoquinoline-2(3H))acethylamino)acetic acid M(NHAc)-^B。。PNA-OHの合成

NI (皿 Ac) - OPfp (140 mg, 0.29腿 ol) と ^B。雷- OH (67 mg, 0.30腿 ol) の DM F溶液 (5 mL)に diisopropylethylamine (54 juh, 0.30腿 ol) を加え、室温で 1

5時間撹拌した。これを減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2-20% MeOH/CHCL) により精製し NI (脆 c) -， NA-0H (117 mg, 85¾) を得た。匿 ( DMSO-de) δ 8.4 - 7.3 (m, 5 H)₃ 5.05 (brs) and 4.90 (brs) (2 H)， 3.76 (b rs) and 3.54 (brs) (2 H)， 3.64 (s) and 3.49 (s) (2 H)， 3.54 (brs) and 3. 41 (brs) (2 H)， 2.15 (s) and 2.04 (s) (3 H), 1.48 (s) and 1.45 (s) (9 H)

(実施例 2 7 )

Succinimidyl i^4-Dimethylaminoazobenzene- 3' -carbonate JB~MR- OSuの合成 m-Methyl Red (iff-MR-0H; 110 mg, 0.41 励 1)と ^Hiydroxysuccinimide (60 mg , 0.52蘭 ol)の DMF溶液（7 mL) に DCC (100 mg, 0.50腿 ol)を 0°Cで加え、この反応液を 30分したあと室温で 15時間撹拌した。この反応液をろ過し、減圧蒸留して、残渣をカラムクロマトグラフィー（CH₂C1₂) に付して、橙色粉末として

- 34 - su (124 mg; 82%) を得た。 Ή腿 (CDCb) δ 8.59 (s, 1 Η), 8.13 (t, J =9.1 Hz, 2 H), 7.90 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 7.61 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.77 (d

, J = 9.1 Hz, 2 H)， 3.11 (s, 6 H)， 2.93 (brs， 4 H).

(実施例 28 )

2-(iV-(2-( ( ί er ί-Butox ) carbon l amino ) ethyl )-2- (4-dimethylaminoazobenzene- 3， -carbonylamino)acethylamino)acetic acid MR-Gly- ^B。^ePNA-0Hの合成

Gly-^B。。PNA- OH (50 mg, 0.18臓 ol) の DMF溶液（10 mL) に MR-OSu (73 mg, 0.20腿 ol) と triethylamine (350〃L, 2.7顧 ol) を順番に加え、室温で 1 5時間撹抨した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ ― (0-10% MeOH/dichloromethane) に付し、橙色粉末として MR-Gly-^B°。PNA- 0H ( 95 mg, 100%) を得た。 ¾ NMR (難 0-ίめ δ 8.26 (s, 1 H), 7.92 (d， J = 7.6

Hz, 2 H)₅ 7.83 (d, J = 9.1 Hz, 2 H)， 7.62 (t, J = 7.6 Hz, 1 H)₅ 6.88 (b rt) and 6.74 (brt) (1 H)， 6.85 (d, J = 9.1 Hz, 2 H), 4.22 (d, J = 2.7 Hz , 2 H)， 3.99 (s) and 3.89 (s) (2 H), 3.44 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.4-3.25

(brs, 4 H), 3.07 (s， 6 H), 1.39 (s) and i.37 (s) (9 H).

(実施例 29 )

2-(JV-(2-( ( ί er ί-Butoxy ) c arbonyl amino ) ethyl )-N， -( ( 1-pyrenyl-n-butyl )glycy l))'acetic acid Pyrene-Gly- ^B。TNA- OHの合成

Gly-^B«PNA-0H (25 mg, 0.09腿 ol) の DMF溶液 (5 mL) に Pyrene - OSu (39 mg, 0.10腿 ol) と triethylamine (138 μΐ, 1.0雇 ol) を順番に加え、室温で 15 時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一（0-10% MeOH/dichloromethane) に付し、淡黄色粉末として Pyrene- Gly -， NA-0H (30 mg, 61%) を得た。 HRMS (FAB⁺) calcd for C₃₁H₃₅(M₃Na [(M+Na)⁺] 568. 2526, observed 568.2429.

(実施例 30 )

Z-(N-(Z-( ( ieri-Butoxy ) carbony lamino )ethy 1 )-2-(7-diethylaminocoumarin-3-c arbonyl )glycyl )acetic acid Coumarin- Gly- ^B。。PNA-0Hの合成

Gly-^B0CPNA-0H (12.7 mg, 0.046翻 ol) の MF溶液 (5 mL) に coumarin- OSu (1 5 mg, 0.042腿 ol) と triethylamine (55.5 jul, 0.4腿 ol) を順番に加え、室温

- 35 - で 1 5時間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一（0- 20% MeOH/dichloromethane) に付し、黄色粉末として Coumarin- G ly - ^B。'PNA- OH (23 mg, 100%) を得た。 Ή NMR (顏- め 5 8.68 (s) and 8.66 (s ) (1 H)， 7.70 and 7.69 (each d, J = 9.1 Hz) ( 1 H)， 6.89 (brt) and 6.75 ( brt) ( 1 H)， 6.80 (d, J = 9.1 Hz, 1 H)， 6.62 (s, 1 H), 4.25 (brd) and 4.0 7 (brd) (2 H), 4.13 (m， 1 H)， 3.98 (s) and 3.89 (s) (2 H)， 3.48 (q, J = 6.8 Hz, 4 H) , 3.35 (m， 2 H)， 3.13 (brq) and 3.07 (brq) (2 H) , 1.37 (s) a nd 1.36 (s) (9 H)， 1.14 (t， J = 6.8 Hz, 6 H) . 産業上の利用可能性

本発明による新規な機能性 P N Aモノマ一は、遺伝子治療などに用いられる P NAの構築に用いることができる。また、本発明によれば、機能性 P N Aモノマ —の、互いに相補的な 2つの合成ルート B及び Cによって、機能性分子の P N A への効率的な導入が可能になる。したがって、本発明は、 B o c型モノマ一ュニヅトあるいはベンジルォキシカルボニル一 ω—アミノ酸誘導体を用いた、機能性 P N Αモノマーュニットの工業的合成等の産業において利用することができる。

- 36

Claims

請求の範囲

1 . 下記一般式（ I )

(式中、 Aは

であり、 Bは

- 37 - 差替え用紙（規則 26)

であり、 Rは H、 N0₂、 NH₂、 NHCbz、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1〜4の整数である。ただし、 Aが

である場合、 Bは

である）で表される化合物。

2. t—ブトキシカルボニルアミノエチルァミンを機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を PN Aモノマーに導入することよりなる機能性 PNAモノマーの製造方法であって、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方法。 .

3. 活性エステルが、下記一般式（I I) (II)

(式中、 Aは

38 -

であり、 Rは Η、 NO ΝΗ₂、 NHCbz、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1〜4の整数である）

で表される基を、エステル結合を形成するカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 2に記載の製造方法。

4. 活性エステルが、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 2または 3に記載の製造方法。

5. 請求項 3に記載の活性エステルを製造する方法であって、機能性分子のカル

- 39 - 差替え用紙（規則 26) ボン酸誘導体と、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基を有する化合物との反応を含むことを特徴とする、前記方法。

6 . 請求項 5に記載の機能性分子のカルボン酸誘導体を製造する方法であって、機能性分子の誘導体と脂肪族カルボン酸との反応を含むことを特徴とする、前記方法。

7 . 機能性分子から該機能性分子の誘導体を製造し、該機能性分子の誘導体から機能性分子の力ルボン酸誘導体を製造し、該機能性分子の力ルポン酸誘導体から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 P N Aモノマ一を製造することを含む、機能性分子から機能性 P NAモノマーを製造する方法において、下記 a) ~ c ) ：

c ) 前記機能性 P N Aモノマーの製造において、 t —ブトキシカルボニルァミノェチルァミンを、活性エステルである機能性分子の誘導体と反応させること；の 1または 2以上を含むことを特徴とする、前記方法。

8 . 一般式（I I I )

(III)

で表される ω _アミノ酸誘導体を機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を P N Αモノマーに導入することよりなる機能性 P N Αモノマーの製造方法であつて、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方沄。

40

9. 活性エステルが、下記一般式（I I)

A^X (ID

(式中、 Αは

であり、 Rは H、 NO 2, NH₂、 NHCbz、 Br、 F、 CIまたは S0₃Na₂ であり、 nは 1~4の整数である）

で表される基を、直接または脂肪鎖あるいはペプチド鎖を介して、エステル結合を形成するカルボニル基に有することを特徴とする、請求項 8に記載の製造方法

- 41 - 差替え用紙（規則 26)

10. 活性エステルが、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 8または 9に記載の製造方法。

11. 機能性分子から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 PNA モノマ一を製造すること含む、機能性分子から機能性 P N Aモノマ一を製造する方法において、前記機能性分子からの活性エステルの製造が、 m—メチルレヅドとスクシンイミドォキシ基を含む化合物とを反応させること、および/または前記活性エステルから機能性 PN Aモノマーの製造が、一般式（I I I)

(、in)ノ

(式中、 R ¹は水素原子または炭素数 1〜 5の直鎖若しくは分枝鎖状のアルキル基

、 mは 1〜11の整数を表す）

で表される ω—アミノ酸誘導体を、活性エステルである機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を PN Αモノマ一に導入すること、を含むこと特徴とする、刖記方。

42 補正書の請求の範囲

[2002年 4月 26日（26. 04. 02) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 1-11は取り下げられた；新しい請求の範囲 12- 48が加えられた。（13頁） ]

1. (削除）

2. (削除）

3. (削除）

4. (削除）

5. (削除)

6. (削除)

7. (削除）

8. (削除）

9. (削除）

10 (削除）

(削除）

12 (追加）下記一般式（I)

(式中、 Αは

-45- 補正された用紙（条約第 19条）

であり、 Bは

-OH

46

補正された用紙（条約第 19条）であり、 Rは H、 NO2, NH₂、 NHCbz、 B r、 F、 CIまたは S0₃Na であり、 nは 1〜4の整数である。ただし、 Aが

である場合、 Bは

である）で表される化合物。

13. (追加） t一ブトキシカルボニルァミノェチルァミン誘導体を機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を P N Aモノマ一に導入することよりなる機能性 P N Aモノマーの製造方法であって、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方法。

14. (追加)活性エステルが、下記一般式（I)

(式中、 Aは FAM rhodamin^ dansyl psoralen dabcyl chromane pyren naphthalimide. flavin HABA、 coumarinおよび biotirfi^ら選択され、 Bはペン夕フルオロフェニルまたは N—ヒドロキシスクシンィミドであり、そして nは 1

〜4の整数である）で表される光機能性分子の誘導体であり、 t—ブトキシカルポニルァミノェチルァミン誘導体が、下記式

で表され、機能性 PN Aモノマーが、下記一般式（IV)

-47- 補正された用紙（条約第 19条）

(式中、 Aおよび nは前記の意味を表す）で表される、請求項 13に記載の製造方法。

15. (追加)活性エステルが、下記一般式（I I)

(式中、 Aは

48

補正された用紙（条約第 19条）

であり、 Rは H、 N0₂、 NH_2s NHCbz、 B r、 F、 CIまたは S0₃Na であり、 nは 1〜4の整数である）

で表される基を、エステル結合を形成するカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 13に記載の製造方法。

16. (追加）活性エステルが、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 15に記載の製造方法。

49

補正された用紙（条約第 19条）

17. (追加） n= 1であることを特徴とする、請求項 14または 15に記載の製造方法。

18. (追加） Aが flavinであることを特徴とする、請求項 14に記載の製造方法 o

19. (追加） Aが FAMであることを特徴とする、請求項 14に記載の製造方法

20. (追加） Aが rhodamineであることを特徴とする、請求項 14に記載の製造方法。

2 1. (追加） Aが dabcylであり、 Bが N—ヒドロキシスクシンイミドであることを特徴とする、請求項 14に記載の製造方法。

22. (追加）光機能性分子の誘導体が、下記式

で表される構造を有する、請求項 14に記載の方法。

23. (追加）光機能性分子の誘導体が、下記式で表される構造

で表される構造を有する、請求項 14に記載の製造方法 _c

24. (追加)光機能性分子の誘導体が、下記式

50

補正された用紙（条約第 19条）で表される構造を有する、請求項 1 4に記載の製造方法 c

2 5 . (追加)光機能性分子の誘導体が、下記式

で表される構造を有する、請求項 1 4に記載の製造方法。

2 6 . (追加）光機能性分子の誘導体が、下記式

で表される構造を有する、請求項 1 4に記載の製造方法。

2 7 . (追加)光機能性分子の誘導体が、下記式

で表される構造を有する、請求項 1 4に記載の製造方法。

51

補正された用紙（条約第 19条）

2 8 . (追加)光機能性分子の誘導体が、下記式

で表される構造を有する、請求項 1 4に記載の製造方法。

2 9 . (追加)請求項 1 3に記載の活性エステルを製造する方法であって、機能性分子のカルボン酸誘導体と、ベン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基を有する化合物との反応を含むことを特徴とする、前記方法。

3 0 . (追加)請求項 2 9に記載の機能性分子のカルボン酸誘導体を製造する方法であって、機能性分子の誘導体と脂肪族カルボン酸との反応を含むことを特徴とする、前記方法。

3 1 . (追加)機能性分子から該機能性分子の誘導体を製造し、該機能性分子の誘導体から機能性分子のカルボン酸誘導体を製造し、該機能性分子のカルボン酸誘導体から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 P N Aモノマーを製造することを含む、機能性分子から機能性 P N Aモノマーを製造する方法において、下記 a ) 〜c ) ：

b ) 前記活性エステルの製造において、機能性分子のカルボン酸誘導体とペン夕フルオロフヱノキシ基またはスクシンィミドォキシ基を有する化合物とを反応させること；および、

c ) 前記機能性 P N Aモノマ一の製造において、 t—ブトキシカルボニルァミノェチルァミンを、活性エステルである機能性分子の誘導体と反応させること；

- 52 - 補正された用紙（条約第 19条）の 1または 2以上を含むことを特徴とする、前記方法 _c

32. (追加)一般式（I I I)

(式中、： R ¹は水素原子または炭素数 1〜 5の直鎖若しくは分枝鎖状のアルキル基、 mは 1〜1 1の整数を表す）

で表される ω—アミノ酸誘導体を機能性分子の誘導体と反応させ、機能性分子を ΡΝ Αモノマーに導入することよりなる機能性 ΡΝ Αモノマーの製造方法であつて、該機能性分子の誘導体が活性エステルであることを特徴とする、前記製造方法。

33. (追加)活性エステルが、下記一般式（V)

0

II

A-C- B (V)

、式中、 Aは FAM、 rhodamine^ dansvi, psoralen, dabcyl chromane pvrene naphthalimide, flavin HABA、 coumarinおよび biotin¾ ら選択され、 Bはペン夕フルオロフェニルまたは N—ヒドロキシスクシンィミドであり、そして nは 1 〜4の整数である）で表される光機能性分子誘導体であり、機能性 PNAモノマ一が、下記一般式（VI)

(式中、 A、 R¹および mは、前記にの意味を表す）

で表される、請求項 32に記載の製造方法。

53

補正された用紙（条約第 19条）

34. (追加)活性エステルが、下記一般式（I I)

(式中、 Aは

であり、 Rは H、 N0₂、 NH₂、 NHCbz、 B r、 F、 CIまたは S0₃Na であり、 nは 1〜4の整数である）

で表される基を、直接または脂肪鎖あるいはペプチド鎖を介して、エステル結合を形成するカルボニル基に有することを特徴とする、請求項 32に記載の製造方

54

埔正された用紙（条約第 19条）法。

35. (追加）活性エステルが、ペン夕フルオロフエノキシ基またはスクシンイミドォキシ基をカルボニル炭素に有することを特徴とする、請求項 34に記載の製造方法。

36. (追加)機能性分子から活性エステルを製造し、該活性エステルから機能性 PN Aモノマ一を製造すること含む、機能性分子から機能性 PN Aモノマーを製造する方法において、前記機能性分子からの活性エステルの製造が、 m—メチルレッドとスクシンイミドォキシ基を含む化合物とを反応させること、および/または前記活性エステルから機能性 PNAモノマーの製造が、一般式（I I I) ")