WO2002012484A1 - Marqueur destine a detecter un polymorphisme dans un genome vegetal et son procede de construction - Google Patents

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nucleic acid
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Toshiyuki Komori
Naoto Nitta
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Japan Tobacco Inc.
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a marker for detecting a plant genome polymorphism using a transposable element and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a marker for detecting a plant genome polymorphism and a method for producing the same.
  • This application is a priority claim application based on Japanese Patent Application No. 2000-234557 filed on Aug. 2, 2000. The entire contents of the Japanese patent application are incorporated herein by reference. Background art
  • polymorphism A state in which there is diversity in a certain trait or morphology between normal individuals in the same species is called "polymorphism" (polymorphism).
  • polymorphism A state in which there is diversity in a certain trait or morphology between normal individuals in the same species is called "polymorphism” (polymorphism).
  • genetic polymorphism genetic polymorphism
  • a striking example of a genetic polymorphism is the polymorphism in the wing sheath mottle of Namittoto containing at least four multiple alleles.
  • chromosomal polymorphisms chromomosomepo1ymorpism
  • DNA polymorphism DNA po 1 ymo rphism
  • DNA polymorphisms have also been detected in plant genomes (eg, monocotyledonous plants such as rice, wheat, and corn, arabidopsis, dicotyledonous plants such as 'tobacco', and woody plants such as pear and cedar).
  • plant genomes eg, monocotyledonous plants such as rice, wheat, and corn, arabidopsis, dicotyledonous plants such as 'tobacco', and woody plants such as pear and cedar.
  • a linkage map has been created using markers using DNA polymorphisms, and is used for genetic analysis and breeding selection (Harush imaetal. Ge netics 148: p. 479-494, January 1998).
  • DNA polymorphisms have been detected by examining restriction fragment length polymorphisms (restriction fragment length polymorphism; RFLP), by directly determining nucleotide sequences, or by genomic DNA. After cleaving with a base recognition restriction enzyme, the ends are radioactively labeled, cleaved with a 6-base or 4-base recognition restriction enzyme, and developed by two-dimensional electrophoresis (RLGS method, restriction lan drama rk geneome). S cannning) has been adopted. In addition, AFL P (amplified fragment length pol ymo rphi sm; P. Vos, et al., Nucleic Acids Res. Vol. 23, p. 4407 -4414 (1995)) Analysis has also been developed. However, each method has problems, and a method for more efficiently detecting polymorphisms has been desired.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • a method of detecting RFLP using PCR amplification as described below (using the RFLP marker as a PCR marker), and detecting a microsatellite polymorphism using PCR amplification
  • the method microsatellite machine
  • RFLP marker probe sequence (“: RFLP” is a polymorphism observed when Southern analysis is performed using a certain DNA fragment as a probe.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment used in the probe is referred to as "RFLP marker After performing genomic PCR using the primers designed for), use one of the following two methods.
  • the second is to search for polymorphisms by comparing the nucleotide sequences of the products between varieties, This is a method for making a PCR marker using the polymorphism.
  • the frequency of occurrence of polymorphisms between cultivars is low, and when PCR products of about lbp are compared, not only RFLP is not obtained, but also varieties can be compared by nucleotide sequence. In many cases, no polymorphism was found at all. In some cases, comparisons can be made in a longer area, but this requires more labor.
  • the RF LP-causing site (restriction enzyme recognition site possessed by only one of the two varieties to be compared) present in or around the RF LP marker probe sequence (usually within several kb), it is converted into a PCR marker. is there.
  • Microsatellite is a repetitive sequence of about 2 to 4 bases such as (CA) n, and is present in a large number in the genome. When there are polymorphisms between varieties in the number of repetitions, when PCR is performed using primers designed in adjacent regions, polymorphism is observed in the length of the PCR product and DNA polymorphism can be detected. Polymorphism detection markers using microsatellites are called microsatellite markers.
  • a “transposable element” is also called a “transposable genetic element”, “mobile genetic element” or “mobile element”, and is a DNA unit having a defined structure that can be transferred from one site on DNA to another site.
  • Both ends usually have an inverted sequence of about 10 to 50 base pairs, and internally contain a sequence that encodes an enzyme transposase that normally recognizes this terminal inverted sequence and controls the transfer reaction.
  • simple insertion / exclusion causes gene inactivation and alteration of gene structure, it also involves deletion, inversion, duplication, and replicon fusion due to transposition reactions, and is involved in genome rearrangement.
  • transposable elements The presence of transposable elements was demonstrated by B. McClintock in the maize genetic system. In prokaryotes, there are lysogenic phages such as transposons (Tn) and Mu that carry insertion sequences (IS), antibiotic resistance genes, and so on. Among eukaryotes, the Ac and S pm of maize, the Tam of Snapdragon, the P-factor of Drosophila and the Tc1 of nematodes are well known.
  • the recombination reaction by transposition duplicates a few base pair sequences of the target site, which is characterized in that cDNA produced by reverse transcription from retroviral retro (trans) poson RNA in eukaryotes is It is also commonly observed in reactions integrated by the action of the integrase enzyme (integrase, IN protein), and therefore these factors are also broadly included in transposable elements.
  • Gene manipulation such as transposon labeling using the transposability of transposable elements has been applied to various biological systems. (Iwanami Biological Dictionary, 4th Edition, pp. 966-page 967, published March 21, 1996, Iwanami Shoten Co., Ltd.).
  • Transposable elements in general, or transposable elements that carry marker genes such as drug resistance genes found in prokaryotic chromosomal plasmids are called "transposons" (Iwanami Biological Dictionary, 4th edition) Pp. 101, supra). Transposons are classified as Tn1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ ⁇ ⁇ according to the origin and the type of marker gene. Structural features can be divided into those with insertion sequences or related sequences at both ends, and those with only inverted repeats. Examples of the former include Tn5 and Tn9, and examples of the latter include Tn3.
  • Tn5 is approximately 5.8 kilobase pairs (bp) in length, has a 1,533 bp insertion sequence (IS50) in opposite directions at each end, and has kanamycin resistance inside. There is a gene. Tn9 has the same orientation of the import sequence (Is1) on both ends, and inside it is the corolamphenicol resistance gene. In the case of these Tn, the transposase enzyme required for transposition is supplied from each inserted sequence. Tn3 differs from these in that it has a 38 bp inverted repeat at each end and encodes its own transposase and ampicillin resistance gene inside.
  • transposable element integration when a transposable element is inserted into DNA, the nucleotide sequence targeted for insertion overlaps outside the transposable element, and the number of duplicated bases (generally, about 3 to 12 base pairs) is increased by the transposase. It is considered to be specified by type. Such duplication of target sites is characteristic of transposable element integration.
  • transposon may also broadly refer to transposable elements in general, including reticular transposons in eukaryotes described below.
  • DNA When information (DNA) at one position in the genome is once transcribed into RNA, and the RNA is transferred to a complementary DNA by the action of reverse transcriptase and re-introduced to another position in the genome, such DNA is collectively called "retroposon". In contrast, when DNA is transferred as DNA without passing through an intermediate, DNA is defined in a narrow sense. Say J. Most of the scattered repetitive sequences are retroposons (Iwanami Biological Dictionary, 4th edition, p. 1500, supra).
  • Retroposons are roughly divided into the following two groups.
  • Virus group Includes retrovirus and Drosophila copier factor, which encodes reverse transcriptase by itself, yeast Ty factor, human L1 factor, and the like. Of the group of viruses, those excluding retroviruses are collectively called retrotransposons (retrotransrans), and the phenomenon of their translocation is called retrotransposition (retrotransposition).
  • Non-virus group pseudogenes generated by reverse transcription from mRNA transcribed from a gene encoding a protein by shakuhachi polymerase 1 I, small nuclear molecule R
  • SINE pseudogenes of NA and dispersed short repeats collectively referred to as SINEs, which are transcribed by RNA polymerase III.
  • SINE is known to include A1u family present in human genomics and many other examples originating from tRNA (PL Deininger (1 989), SINEs: Short interspersed repeata ted). DNA el ementsinhi gh ereucaryotes. In: Mobi 1 e DNA (eds.: D.E.Berg and d MM Howe), p p. 6 19-636 American Society for Microbiology, Washington, DC ). In a narrow sense, only the non-viral group of retroposons may be referred to as retroposons. In most cases, retroposons have no function and are thought to be parasitic. However, rarely, there have been cases in which retroposons have gained function and in which new genes have been created by retroposition.
  • Plant Transposable Factors It has been reported that many transposable factors exist in plants. Here, according to the classification of Ohtsubo (Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series, 5 Plant Genome Sciences, No. 102, No. 113, No. 113, Published October 1, 1996, Shujunsha Co., Ltd.) Classify transposable elements into class I and class II. Class I is a retroposon that translocates via an RNA intermediate and includes retrotransposons, LI NE and SINE. Class II transposes as DNA without intermediates Lanspozones are known, Ac / Ds, En / Spm and Mu. A new transposon, MITE (Miniature Inverted Repeat Transfer Element), recently discovered in the plant genome, has also been classified as Class II for convenience, but its translocation mechanism is still elucidated. Not.
  • MITE Minimum Inverted Repeat Transfer Element
  • MITE The structural characteristics of MITE are relatively short (about 400 bp at the longest), do not encode a gene, have inverted repeats at both ends, can take the secondary structure of DNA, each MITE element
  • the specificity of the target sequence is as follows (SR Wess 1 eI ", et al., Currrent O inion in Genetics & Development 1999, Vol. 5, p. 814-821). It is estimated that a large number of MITE factors are present in the whole plant genome, for example, Tn r 1 belonging to Stowaw ay is present in about 3500 copies in the rice genome (T. Tenzen et al., Mol Gen Ge net (1 994) Vo l. 245: p. 441 -448) In addition, factors B2 and Hbr found in corn belonging to Technology are estimated to be more than 10,000 copies each.
  • Plant transposable elements have been found in rice, corn, tobacco and the like. Particularly in rice, the retrotransposon Tos (H. Hirochika et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) Vol. 93, pp. 7783-7788), RI RE 1 (K. Noma et al., Genes Genet. Syst. (1997) Vol. 72 p. 131-140), RI RE 2 (H. Ohtsubo et al., Genes Genet. Syst. (1 999) Vo l. 74 p. 83-91) and SINE p-SINE 1 (K. Mo chizuki et al., Jpn. J. Ge net.
  • Tos H. Hirochika et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) Vol. 93, pp. 7783-7788
  • RI RE 1 K. Noma et al., Genes Genet. Syst
  • MITEs are Ga ijin, Cast away, D itto, Wanderer, Ex lorer (above, T. Bu reau et al., Proc. Nat 1. Ac a d. S ci. USA, Vol. 93 Pp. 8524-8529, Au gust 1 996), To urist (TE Bureau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) Vol. 91, p. p. 141 1-1415), Stowaway (T. E. Bureau et al., The Plan Cell (1994) Vol. 6, p. 907-916), Amy / LTP (N. Huang et al., Gene (1 992) Vol. Ill, p p. 223-228, F.
  • the transposable element of the present invention is not limited to the known transposable elements listed here.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a marker for detecting a polymorphism in a plant genome.
  • the method of the present invention is characterized in that it includes preparing a primer for nucleic acid amplification using a base sequence of a transposable element in a plant genome and / or a region adjacent thereto.
  • the method of the present invention comprises:
  • ii) performing a nucleic acid amplification reaction using the genomic DNA of the target plant species as type III; and iii) preparing a marker for detecting a polymorphism in the plant genome based on the polymorphism found in the nucleic acid amplification product.
  • Another object of the present invention is to provide a marker for detecting a polymorphism in a plant genome, which is created by the method of the present invention.
  • FIG. 1 shows the sequence of a primer for amplifying the Gaijin region.
  • FIG. 2 shows a comparison between varieties of the Gaijin1 region nucleotide sequence.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Gaijin-Os1 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • FIG. 3 shows a comparison between varieties of the Gaijin2 region nucleotide sequence.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Gaijin-Os2 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • the polymorphisms used to create the PCR marker are indicated by double underlining.
  • FIG. 4 shows a comparison of the base sequence of the Gaijin 3 region between cultivars.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Gaijin-Os3 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • Polymorphisms used for PCR marker construction are indicated by double underlining.
  • FIG. 5 shows a primer sequence as a polymorphism detection (PCR) marker in the Gaijin region.
  • FIG. 6 shows the sequence of a primer for amplifying a wand de er region.
  • FIG. 7 shows a comparison between the varieties of the nucleotide sequence of the Wanderderl region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Wand err—Os1 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • PCR The polymorphism used to create the car is indicated by a double underline.
  • FIG. 8 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of the wand de er r 2 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Wand err—Os2 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • FIG. 9 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of the Wanderde3 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Wand err—Os3 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • the polymorphisms used in the creation of the PCR Ichiichi Ichi are indicated by double underlining.
  • FIG. 10 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of the Wand de er r 4 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Wand er er—O s 4 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • the polymorphisms used in the creation of the PCR Ichiichi Ichi are indicated by double underlining.
  • FIG. 11 shows a primer sequence as a marker for detecting a polymorphism (PCR) in the Wand er er region.
  • FIG. 12 shows the sequence of a primer for amplifying the Castaway region.
  • FIG. 13 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of Cast away 1 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Cassaway—Os1 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • PCR The polymorphism used to create the car is indicated by a double underline.
  • FIG. 14 shows a comparison between varieties of the Castaway 2 region nucleotide sequence.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Castaway—Os2 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • PC CR The polymorphisms used to create each force are indicated by double underlining. The capital letter in the latter half is another transposition factor Ex p 1 orer— ⁇ s 2.
  • FIG. 15 shows a primer sequence as a marker for detecting a polymorphism (PCR) in the Castaway region.
  • FIG. 16 shows the sequence of the primer for amplifying the Ditto region.
  • FIG. 17 shows a comparison between the varieties of the nucleotide sequence of the Diito1 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Ditto-Os1 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • the polymorphisms used to create the PCR markers are indicated by double underlining.
  • the capital letter in the second half is another transposable element, Ex p 1 o r er — O s l.
  • FIG. 18 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of the Diito2 region.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the Ditto-Os2 sequence and its adjacent sequences, respectively.
  • Open letters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • FIG. 19 shows a comparison between p_SINE-r1 region nucleotide sequences among cultivars.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the p-SINE-r1 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • a single underline indicates a forward repeat sequence.
  • FIG. 20 shows a comparison between varieties of p-SINE-r2 region nucleotide sequences.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the p_SINE-r2 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • a single underline indicates a forward repeat sequence.
  • FIG. 21 shows a comparison between varieties of the p-SINE-r3 region nucleotide sequence.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the p-SINE-r3 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Single underline indicates forward repeat.
  • FIG. 22 shows a comparison between cultivars of the base sequence of the p—SINE—r4 region. Uppercase and lowercase letters indicate the p—SINE—r4 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence. A single underline indicates a forward repeat sequence. The polymorphisms used to create the PCR markers are indicated by double underlining.
  • FIG. 23 shows a comparison between varieties of the nucleotide sequence of the P—SINE—r5 region. Uppercase and lowercase letters indicate the p-SINE-r5 sequence and its adjacent sequence, respectively. Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence. A single underline indicates a forward repeat sequence.
  • FIG. 24 shows a comparison between p-SINE-r6 region nucleotide sequences among cultivars.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the p-SINE-r6 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • a single underline indicates a forward repeat sequence.
  • FIG. 25 shows a comparison between varieties of p-SINE-r7 region nucleotide sequences.
  • Uppercase and lowercase letters indicate the ⁇ -SINE-r7 sequence and its adjacent sequence, respectively.
  • Open characters indicate polymorphic sites that differ from the Asominori sequence.
  • a single underline indicates a forward repeat sequence.
  • the polymorphisms used to create the PCR markers are indicated by double underlining.
  • FIG. 26 shows a primer sequence as a primer for detecting a polymorphism (PCR) in the p_SINE region.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that genetic polymorphisms in plant genomes are (very) frequently found inside or near transposable elements. Discovered and corresponded to the present invention.
  • the present invention relates to a method for producing a marker for detecting a polymorphism in a plant genome, and to a method for producing a primer for nucleic acid amplification using a transposable element in a plant genome and a base sequence of Z or a region adjacent thereto. It is characterized by including.
  • the method of the invention comprises:
  • ii) performing a nucleic acid amplification reaction using the genomic DNA of the target plant species as type III; and iii) preparing a marker for detecting a polymorphism in the plant genome based on the polymorphism found in the nucleic acid amplification product.
  • the plant species targeted by the present invention is not particularly limited. Preferred are monocotyledonous plants, and more preferred are rice, corn, rye and the like. Particularly preferred is rice.
  • the method of the present invention for producing a marker for detecting a DNA polymorphism in a plant genome first, Southern hybridization of a genomic library is performed based on sequence information of a known transposable element. The elucidation of the transposable element present in the genome of the target plant species and the base sequence of the flanking region thereof by means of screening and gene sequencing or database search, etc.
  • Transposable elements increase the copy number by repeating transposition during the evolution of organisms, and each copy also accumulates mutations in its internal sequence. Therefore, if the homology of the base sequence is high, it may be regarded as the same type of transposable element, but even if the homology is low, it may be regarded as the same type as long as it has the characteristics of the transposable element.
  • MITE is characterized by inverted sequences at both ends, target sequence, putative secondary structure and full length (TE Bureau et al., The Plant Cell, Vol. 6, 907 -1991, 1994, T. ⁇ . Bureau et al., Proc. Natl. Accad, Sci. USA Vol. 91, pp. 141 1 -141 5, 199 4).
  • the genomic library of a plant species can be obtained by known means, for example, by the method described in Maniatis, Molecular Cloning: AL aboratory Man ua 1, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, 1989). It can be created. Alternatively, a commercially available plant genome library may be used (for example, a rice genome library manufactured by CL ONTECH, a maize genome library manufactured by STRATAGENE, etc.).
  • the database contains numerous plant genome sequences and transposable element sequences, and those skilled in the art can search these databases to find available transposable elements for polymorphism detection. Is possible. Although not limited, Available databases include, for example, GenBank and EMBL.
  • transposable element refers to a DNA unit having a defined structure that can be transferred from one site on DNA to another site, and is used as a meaning commonly used by those skilled in the art.
  • ⁇ transposable elements '' are retrotransposons, retrotransposons that translocate via RNA intermediates, LINE, SINE, transposons that translocate as DNA without intermediates, and more recently become known in plants.
  • MITE micro-inverted repeat transposable element
  • the present invention utilizes a transposable element present in a plant genome for detecting a polymorphism in the plant genome.
  • transposable elements in the plant genome include, but are not limited to, MITE (Miniature Inverted-repeat Transposable Elemntnts; or SINE (Short Scattered Nuclei).
  • MITE Minimum Inverted-repeat Transposable Elemntnts
  • SINE Short Scattered Nuclei
  • Factors The transposable elements belonging to Short Interspersed Nucl e1Elemnts have a relatively short structure and are easy to use.
  • transposable elements classified as MITE include rice transposable elements, Gaijin, Castaway, Ditto, Wanderer, Explorer, Stowaway, Technology, and Tnr2. ing.
  • Gaijin Gaijin—Os1,2,3)
  • Castaway Castaway— ⁇ si, 2)
  • Ditto Ditto For 1, 2
  • Waderer Wanderer—Os1, 2, 3, 4
  • primers were designed for each adjacent region
  • Asinori total DNA of IR24 and Kasa 1 ath was subjected to PCR amplification.
  • Comparison of the base sequences of the amplification products among the cultivars showed that polymorphisms existed very frequently in each transposable element sequence and its adjacent region. Since each MITE element is considered to be present in large numbers throughout the rice genome, these markers can be used to create many markers throughout the rice genome.
  • transposable element classified as SINE for example, rice p-SINE1 (K. Mochizukiki et al., Described above) is known.
  • p—SINE 1 p—SINE l_rl, r2, r3, r4, r5, r6, r7
  • p_SINE1 An experiment similar to the above-mentioned MITE was performed using primers used by Mo chizukieta 1. (1992) to amplify the sequence and its surrounding region. As a result, it was shown that the frequency of polymorphisms among varieties differs among p-SINE1 factors, and there were some factors that did not show polymorphisms between varieties. It was suggested that the polymorphism was richer than the region.
  • SINE is also found in tobacco and cruciferous plants. Therefore, it is inferred that SINE is rich in polymorphism not only in rice but also in other plants.
  • Transposons classified into Class II other than MITE include Ac / Ds, En / Spm and Mil, and are found in many plants. For example, in rice, Tn r 3 belonging to En / S pm is known, and recently, new factors Krispie, Sna, Rackle, Pop and Truncator have also been discovered (W. — Y. Song Et al., MoI Ge n Ge net (1998) V 0 1.2 5 8: 4 4 9—4 5 6). In addition, retroposons classified into Class I other than SINE have also been found in many plants. For example, in rice, RIRE 1 and RERE 3 are known. These may encode a gene in their internal sequence, but may be rich in DNA polymorphism in non-coding regions, similar to MITE and SINE. Since the structure is relatively long, it is not as easy as MITE to create a marker using them, but there is a possibility that it can be turned into a marker as in the case of W Martinez- ⁇ s3 in Example 2 described later. is there.
  • the frequency of occurrence of polymorphism among varieties varies depending on the type of transposable element. Therefore, by appropriately selecting a transposable element to be used, it is possible to more efficiently create a PCR marker.
  • the “adjacent region” of a transposable element is not particularly limited, and may vary depending on the length of the transposable element region, the type of nucleic acid amplification reaction to be used, and the like.
  • a primer pair for nucleic acid amplification is prepared and used as a marker for polymorphism detection.
  • the primer pair must be capable of amplifying a nucleic acid containing the transposable element or both the transposable element and its adjacent region. Therefore, it is preferable that the distance between the pair of primers is within a range in which nucleic acid amplification is possible, depending on the type of nucleic acid amplification reaction to be used.
  • the term "adjacent region" of a transposable element means that the region containing the transposable element or both the transposable element and the adjacent region is preferably within a range where such nucleic acid amplification is possible. I do.
  • the region containing both the transposable element and its flanking region is preferably from about 50 bases to about 300 bases, more preferably from about 50 bases to about 200 bases. It is in the range of 0 bases, more preferably about 100 bases to about 1000 bases.
  • the ⁇ -contact region is preferably about 0 bases to about 300 bases on the 5 or 3 side of the transposable element, more preferably about 0 bases to about 200 bases. It is in the range of 0 bases, more preferably about 0 bases to about 1000 bases.
  • the transposable element, or both the transposable element and the contiguous region are amplified based on the base sequence of the transposed element present in the genome of the target plant species and the adjacent region thereof.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed using the genomic DNA of the target plant species as type III.
  • the nucleic acid amplification reaction is the replication chain reaction (PCR) (Saiki et al., 1985, Science 23, p. 135-135-134).
  • PCR replication chain reaction
  • a primer pair for nucleic acid amplification can be prepared by a known method based on the base sequence of a transposable element and its adjacent region. Specifically, for example, but not limited to, the following conditions based on the base sequences of the transposable element and the or its adjacent region:
  • each primer is 15-30 bases;
  • the length of the nucleic acid amplification product amplified by the primer pair is 50-300 bases, preferably 100-200 bases;
  • a single-stranded DNA having the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence of the transposable element or the region adjacent thereto or a nucleotide sequence complementary to the above region is produced, or if necessary, the transposable element or the adjacent region.
  • a pair of primers can be created by a method including:
  • the primer pair is designed in the region adjacent to the transposable element containing the polymorphism.
  • primers may be designed in the region of the transposable element.
  • the transposable element region is long, and primers can be designed only outside the transposable element.
  • the polymorphism exists only inside the transposable element, and a mismatch primer for polymorphism detection is designed using the polymorphism.
  • a primer can be designed in the region of the transposable element, and the polymorphism can be detected by a nucleic acid amplification reaction.
  • the target site of one of the primers was a 100% transfer sequence (FIG. 9). The reaction was performed, and it was possible to make a marker.
  • the procedure and conditions for the nucleic acid amplification reaction are not particularly limited, and are well known to those skilled in the art. Those skilled in the art can appropriately employ conditions depending on various factors such as the base sequence of the transposable element or the region adjacent thereto, the base sequence and length of the primer pair, and the like. In general, the longer the primer pair length, the higher the G + C ratio, the smaller the bias in the distribution of A, T, G and C, or the higher the copy number of the transposable element in the genome, Nucleic acid amplification reactions can be performed under more stringent conditions (higher temperature annealing reactions and nucleic acid extension reactions, fewer cycles). The use of more stringent conditions enables highly specific amplification reactions.
  • the amplification reaction is preferably, but not limited to, a denaturation reaction at 90 ° C to 95 for 30 seconds to 2 minutes, and an annealing reaction at 55 to 65 ° C for 30 seconds.
  • the elongation reaction is performed at 70 ° C to 75 for 30 seconds to 2 minutes, and this is repeated for 25 to 40 cycles. More preferably, the denaturation reaction is performed at 94 ° C for 1 minute, the annealing reaction is performed at 58 ° C for 1 minute, and the elongation reaction is performed at 72 ° C for 2 minutes, and 30 cycles are performed.
  • polymorphisms that can be detected in the amplification product include the following.
  • a primer for nucleic acid amplification a pair is prepared so as to sandwich the deletion region on both sides of the deletion region. Markers for type detection. Creation of primer pairs is based on the polymorphism It can be carried out as in the preliminary step i) for detection. The primer pair used in step i) can be used as it is as a marker for detecting a polymorphism. When the size of the deletion region is sufficient, polymorphism can be detected due to a difference in electrophoresis by, for example, agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis of the amplification product.
  • polymorphism is detected by performing hybridization on nucleic acid amplification products using an oligonucleotide or DNA fragment having a sequence complementary to the base sequence outside the deletion region as an analysis probe. can do.
  • the polymorphism may be confirmed by determining the nucleotide sequence of the amplification product.
  • Known methods can be used for electrophoresis of nucleic acids, hybridization, determination of base sequence, and the like, and those skilled in the art can appropriately employ them.
  • a marker for detecting a polymorphism using the difference is referred to as an ALP (ampliconengtghtpo1ymorphism) marker.
  • the G aij inn-O s 1 region of the first embodiment, the Wa d er er—O s 2 region of the second embodiment, and the D i t o —O s 2 region of the fourth embodiment correspond to such a case.
  • the amplification primer pair used in step i) was directly used as a marker for detecting a polymorphism.
  • a pair of primers for nucleic acid amplification is prepared so as to sandwich the substitution site on both sides of the base substitution site, and used as a marker for detecting a polymorphism.
  • the primer pair can be prepared in the same manner as in the preliminary step i) for detecting a polymorphism described above.
  • the primer pair used in step i) can be used as it is as a marker for detecting a polymorphism.
  • the obtained amplification product is treated with a restriction enzyme, and electrophoresed on, for example, an agarose gel, etc., and the polymorphism is detected based on the difference in the migration degree. It is possible. If necessary, the polymorphism may be confirmed by determining the base sequence of the amplification product.
  • a marker for detecting the polymorphism using this is used as a marker for PCR—RFLP (PCR-retrictionfra gme ntlengthpol ymo rphism) Or CAP S (cleaved amp 1 ifiedpol ymo rphicse quences) Marker (A.
  • the polymorphism may be more easily detected by using restriction enzyme treatment in combination. For example, this corresponds to the Wand de er er—O s 2 region of the second embodiment.
  • a mismatch-introducing primer pair containing the base substitution site, and changing the region containing the base substitution site to a base sequence that causes a difference in restriction enzyme recognition in the nucleic acid amplification product is prepared.
  • This is a marker for detecting polymorphism.
  • primer pairs is a preliminary step for detecting polymorphisms as described above.
  • the primer pair used in step i) generates a polymorphism in the nucleic acid amplification product but does not cause a difference in restriction enzyme recognition. Therefore, a mismatch is introduced into one or both primers, and the base substitution site (polymorphism) ) Containing Is changed to a nucleotide sequence which causes a difference in restriction enzyme recognition in the nucleic acid amplification product.
  • the base substitution site polymorphism
  • Amplification products using the above-mentioned mismatch-introduced primers as markers for detecting polymorphisms have a difference in recognition of restriction enzymes at the sites where mismatches are introduced, so that nucleic acid amplification products are cleaved by one or more specific restriction enzymes. There are things that are not done. Therefore, it is possible to treat the amplification product obtained in the same manner as in b) above by restriction enzyme treatment, electrophorese on, for example, an agarose gel, and detect the polymorphism based on the difference in electrophoresis. .
  • mismatch does not impair the binding of the primer to the target plant genome and must not alter the base substitution that is causing the polymorphism.
  • a mismatch is introduced in the vicinity thereof so that a difference in restriction enzyme recognition is caused by a combination of both the base substitution and the mismatch.
  • Methods for introducing such mismatches are known to those skilled in the art, and are described, for example, in Michaels, S.D.and Am Amino, RM (1998), Neff, MM, Neff, J.D., C hory, J. and Pepper, AE (19998), etc.
  • the marker in such a case is an improvement of the above-mentioned b) CAPS marker, and is referred to as a dCAPS (derivedCAPS) marker.
  • a dCAPS derivedCAPS
  • the G aijin—O s 2 region of Example 1 described later, the Wan derer—O s 3 region of Example 2, the Cast away— ⁇ sl region of Example 3, and the ⁇ —SI NE 1—r 4 of Example 5 The region corresponds to such a case.
  • the present invention further provides a marker for detecting a polymorphism in a plant genome, prepared by the above method.
  • the method of the present invention makes it possible to widely prepare a marker for detecting a polymorphism in a plant genome. Therefore, the marker provided by the method of the present invention is not particularly limited.
  • a PCR marker can be created by using a transposable element.
  • a PCR marker can be more efficiently created.
  • the polymorphism detection method using the marker obtained by the present invention has a remarkable advantage as compared with the conventional polymorphism detection method. Specifically, for example, the frequency of occurrence of base sequence polymorphisms between cultivars is higher than that of a method in which a polymorphism in a genomic region corresponding to an RFLP probe is used as a PCR marker. Therefore, the frequency with which markers can be created increases, and efficient marker creation becomes possible. Also, compared to the method of identifying the site of RFLP and converting it into a PCR marker, a large number of transposable elements are registered in the database, and if these are used, screening of genomic libraries, isolated clones, etc.
  • G aijin _0 s 1, 2 and 3 are the genes OS 4 CL (X 52623), RI CCBP 3 (D 1 098 5) and RI CAP (D 32 1) registered in the database (Gen Bank), respectively.
  • 65) is a Gaijin-Os transposable element existing inside (Bureaueta 1.1996).
  • Primer pairs for amplifying each Gaijin- ⁇ s sequence and its adjacent region were designed as shown in FIG. 1 (SEQ ID NOS: 16). Using these primer pairs, Asominori, Kasa 1 ath and IR 24 genomic DNA were transformed into type I PCR (94t: 1 minute, 58 ° C 1 minute, 72 minutes 2 cycles, 30 cycles, 30 cycles ). The PCR product was subjected to electrophoresis, and the target DNA fragment was recovered using QIAEXII (QIAGEN).
  • FIGS. 2 to 4 The results of comparing the nucleotide sequences of the PCR products of each variety are shown in FIGS. 2 to 4 and SEQ ID NOS: 7 to 15.
  • Figure 2 (SEQ ID NOS: 7-9) shows the Gaijin—Os1 region
  • Figure 3 (SEQ ID NOs: 10-12) shows the Gaijin—Os2 region
  • Figure 4 (SEQ ID NOs: 13) -15) shows the Ga ijin— ⁇ s 3 region.
  • the sequence of each 5, primer and 3 'primer is located on the 5' and 3 'side of the sequence shown in FIGS. 2-4, respectively.
  • PCR product length polymorphism was observed between Asominori and Kasaa1 ath and IR24. Specifically, as shown in Fig. 2, the PCR product length was 434 base pairs (excluding the primer portion) in Asominori, while 278 base pairs in each of Kasa 1 ath and IR 24. And 277 base pairs. This indicates that the absence of Gaijin-Os1 in Asominori in Kasa1 ath and IR24 is the cause of the polymorphism.
  • the polymorphism based on the difference in the length of this PCR product is used as an ALP (Amplicon Length Polymorphism) marker, and is mapped using Asominori-IR24 RIL (recombinant inbred strain) 71 individuals. It was revealed that the OS 4 CL (Gaijin—O s 1) locus was located on chromosome 8.
  • ALP Amplicon Length Polymorphism
  • dCAP S derivedcleaved amp lifiedpol ymo r ph icsequence; using the polymorphism between Asominori and Ka sa 1 ath and IR 24 (Michaels and Am Asino 1998; N effeta 1.1 998) to prepare markers for polymorphism detection.
  • the base number 136 of the Asinominori Ga ij 11— ⁇ 32 region is “Cj, whereas the equivalent of Ka sa 1 ath and IR 24 is (Hereinafter, in this example, the nucleotide sequence number used in this example is the nucleotide sequence number of Asinori unless otherwise specified.) Therefore, as a marker for detecting a polymorphism, FIG.
  • the primers shown in Nos. 16 and 17) were prepared and PCR was performed (PCR conditions: 94 ° C for 30 seconds, 58X: 30 seconds, 72 ° ⁇ 30 seconds per cycle, 35 cycles).
  • sequences of SEQ ID NOs: 16 and 17 correspond to the base numbers minus 10—16 and 138—161 of the Asinominori sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 10), respectively.
  • the 3'-primer having a base sequence of 17 replaces the base corresponding to the sequence "ta” with base numbers 143-144 with "gt” Designed to be.
  • minus 10-161 of the sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NOs: 10-12) is amplified, respectively.
  • sequence of Asomi Nori becomes “CACNNNNGTG”
  • sequences of Kasa 1 ath and IR 24 become “TACNNNNGTG”.
  • This nucleotide sequence "CACNNNN GTG” is recognized by the restriction enzyme Ms1I. Therefore, when the amplification product was treated with the restriction enzyme, only the Gaijin-Os2 region amplification product derived from Asominori was cleaved, and the amplification products of Kasalainth and IR24 were not cleaved. This can be used to detect polymorphisms.
  • a marker for polymorphism detection was created using the usual CAPS method. Specifically, as shown in FIG. 4, nucleotide numbers 355-358 of the G aijin-Os 3 region of Asinominori are ⁇ TJ1AA '', whereas the corresponding Kasa 1 ath and IR24 The base at the corresponding position is “TAA.” Therefore, as a marker for detecting a polymorphism, the primers shown in FIG. 5 (SEQ ID NOS: 18 and 19) were prepared, and PCR (PCR conditions were 94 30 cycles of 30 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 30 seconds at 72 ° C) (35 cycles).
  • And 19 correspond to base numbers 211-235 and 416-439, respectively, of the Asinominori sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 13), and these polymorphism detection markers
  • 212 to 439 of the sequences shown in FIG. 4 are amplified.
  • the sequence “TTAA” at nucleotide positions 355-358 of Asominori is recognized by the restriction enzyme MseI.
  • the sequence corresponding to the nucleotide sequence 401-404 of Asominori is "TTAA" in all of Asominori, Ka salath and IR24.
  • the GaijinOs 3 region amplification product derived from Asominori was cleaved at two sites (both 355-358 and 401-404), and Kasa 1 ath and The IR 24 amplification product was cut in only one place (401-404 only).
  • Wa nderer— ⁇ sl, 2, 3 and 4 are the genes RIC 3H3M (L 28995), RIC 3H3M (L 28995) and RI CGLUTE (D 00584) registered in the database (Gen Bank), respectively.
  • a pair of primers for amplifying each of the Wand der er_ ⁇ s sequences and the adjacent region was designed as shown in FIG. 6 (SEQ ID NOS: 20 to 27).
  • genomic DNA of Asominori, Kas a1 ath and IR24 was type III, PCR was performed in the same manner as in the Gaijin region of Example 1, and the nucleotide sequence was decoded.
  • FIGS. 7 to 10 The results of comparing the nucleotide sequences of the PCR products of each variety are shown in FIGS. 7 to 10 and SEQ ID NOS: 28 to 39.
  • Fig. 7 (SEQ ID NOs: 28-30) is the Wan derer- Osl region
  • Fig. 8 (SEQ ID NOs: 31-33) is the Wan derer- Os2 region
  • Fig. 9 (SEQ ID NOs: 34-36) is the Waderer_O The s3 region
  • FIG. 10 (SEQ ID NOS: 37-39) shows the Wanderer_0s4 region.
  • PCR product length polymorphism was observed between Asominori, Kas a1 ath and IR24. Specifically, as shown in Figure 8, the PCR product length was 320 base pairs (excluding the portion of the primer) in Asominori, while 298 base pairs in Kasa 1 ath. In IR 24, it was 297 base pairs. Deletion of a part of Wa d e r er — O s 2 in K a s a a a t h and I R 24 was shown to be the cause of the polymorphism.
  • RIC 3H3M (Wan derer) by mapping a polymorphism based on the difference in the length of the PCR product of Os 2 as an ALP marker using one RIL 7 individual of Aso Minoriichi IR24. — The O s 2) locus was found to be located on chromosome 2.
  • a marker for detecting a polymorphism was created using the usual CAPS method. Specifically, as shown in FIG. 7, the nucleotide numbers 226 to 23 1 of the Waderer-Os 1 region of Asominori are ⁇ TTIAAA A '', whereas the Kasa 1 ath and IR 24 The base at the position corresponding to is “TT AAA.” Therefore, a primer shown in FIG. 11A (SEQ ID NOS: 40 and 41) was prepared as a polymorphism detection marker, and the PCR was performed in the same manner as in Example 1.
  • sequences of SEQ ID NOs: 40 and 41 correspond to base numbers 42 to 65 and 300 to 323 of the Asinominori sequence shown in FIG. 7 (SEQ ID NO: 28), respectively, and these polymorphism detection markers Is used as a primer to amplify 42-323 of the sequence shown in Figure 7 (SEQ ID NOs: 28-30), respectively. Recognized by the restriction enzyme DraI.
  • sequence of the portion corresponding to the nucleotide sequence 197_202 of Asominori is “TTT AA ⁇ ” in all of Asominori, Kasa 1 ath and IR24.
  • the Asndori-derived Wander-1 region amplification product is cleaved at two places (both 226-231 and 1972-202), and Kasa 1 ath And the amplified product of IR24 was cleaved at only one site (197-20.2 only).
  • the polymorphism between Asominori and Kasa1 ath and IR24 is used to obtain the dCAPS
  • a marker for polymorphism detection was created using the method.
  • the nucleotide number 206 in the Asominori Wanderer- ⁇ s3 region is “A”
  • the nucleotide at the corresponding position in Ka salath and IR 24 is “A”.
  • the primers shown in 11 B (SEQ ID NOs: 42 and 43) were prepared and subjected to PCR in the same manner as described above.
  • the sequences of SEQ ID NOs: 42 and 43 correspond to nucleotide numbers 1 77 to 205 and 269 to 292 of the Asinominori sequence described in FIG. 9 (SEQ ID NO: 34), respectively, but have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42.
  • the 5'-primer is designed to replace "A" in base number 203 with "T".
  • 177-292 of the sequence shown in FIG. 9 (SEQ ID NOs: 34-36) are amplified, respectively.
  • bases 203 to 206 in the sequence of Sominori are “ ⁇ ”
  • sequences of Kasa 1 ath and IR 24 are "TTAT”.
  • This nucleotide sequence “TT ⁇ ” is recognized by the restriction enzyme MseI.
  • “T” at base number 185 was further replaced with “ ⁇ ”
  • “ ⁇ ” at 192 was replaced with “ ⁇ ”.
  • SEQ ID NO: 37 correspond to base numbers 52-75 and 348-371 of the Asinominori sequence described in FIG. 10, respectively, by using these polymorphism detection markers as primers. 52-371 of the sequence described in SEQ ID NOs: 37-39) is amplified. Sequence at nucleotide number 284-294 of Asominori Gc tctgtgtg "c" is recognized by the restriction enzyme Mwo I (recognizing fGCNNNNNNNGCj). In addition, the sequence of the portion corresponding to the nucleotide sequence 235-245 of Asominori is "GCTC GTT TTGCJ" in all of Asominori, Ka salath and IR24.
  • Noriichi Asomi By mapping using one RIL7 of IR24, RIC 3H3M (Wan derer -O sl) locus, RI CGLUTE (Wander er -O s 3) locus and ⁇ SAL AM The (Wanderer-O s 4) locus was found to be located on chromosome 2, chromosome 10, and chromosome 2, respectively.
  • C ast awa y— O sl and 2 are the Cs present in the genes OS SALT (Z 2581 1) and RI CRTH (D 26547) registered in the database (Gen Bank), respectively. ast away -O s transposable element (Bu au eta 1.1996).
  • a primer pair for amplifying each of the C a s t aw ay—O s sequence and its adjacent region was designed as shown in FIG. Using a pair of these primers, the genomic DNA of Asominori, Kas a1 ath and IR24 was type III, PCR was carried out in the same manner as in Example 1, and the nucleotide sequence was decoded.
  • FIGS. 13 to 14 The results of comparing the nucleotide sequences of the PCR products of each variety are shown in FIGS. 13 to 14 and SEQ ID NOS: 50 to 55.
  • Fig. 13 (SEQ ID NOS: 50-52) shows the C a s tawa y-O s 1 region
  • Fig. 14 (SEQ ID NOs: 53-55) shows the C a s st away_O s 2 region.
  • a polymorphism detection marker was created using the dCAPS technique, utilizing the polymorphism between Asominori and IR24.
  • Asominori and the base number 205 in the Castaway—Os1 region of Kasasa 1 ath are “A”, whereas IR 24 The base at the corresponding position is "C”. Therefore, a primer shown in FIG. 15A (SEQ ID NOs: 56 and 57) was prepared as a marker for detecting a polymorphism, and PCR was performed in the same manner as described above.
  • the sequences of SEQ ID NOS: 56 and 57 correspond to base numbers 102-125 and 209-234 of the Asinominori sequence shown in FIG.
  • sequence corresponding to the base sequence 121-131 of Asominori is "agggcttg gj" in all of Asominori, Kasasa 1 ath and IR24.
  • the Castaway- ⁇ s1 region amplification product derived from IR24 was cleaved at two sites (both 204-214 and 121-131), and Asominori and K The amplified product of asa 1 ath was cut at only one place (only 12 1—13 1).
  • the nucleotide sequence "CCTTTGCT TGG" of Kasa 1 ath and IR 24 corresponding to base number 355-365 of Asominori is recognized by restriction enzyme Bs1I (recognizing rc CNNNNNNNGGJ). Therefore, when the amplification product was treated with the restriction enzyme, the Astaminori-derived Castaway-Os2 region amplification product was not cleaved, and the Kasa1 ath and IR24 amplification products were cleaved.
  • Embodiment 4 Marker Development Using Pitto
  • D itto—O s 1 and 2 are located inside the genes RI CHS EA (M 80938) and RI COSH 1 (D 16 507) registered in the database (Gen Bank), respectively.
  • a pair of primers for amplifying each Ditto- ⁇ s sequence and its adjacent region was designed as shown in FIG. 16 (SEQ ID NOS: 58-61). Using these primer pairs, genomic DNA of Asominori, Kasa1 ath and IR24 was type III, PCR was carried out in the same manner as in Example 1, and the nucleotide sequence was decoded.
  • FIGS. 17 to 18 The results of comparing the nucleotide sequences of the PCR products of each variety are shown in FIGS. 17 to 18 and SEQ ID NOs: 62 to 67.
  • Figure 17 SEQ ID NOs: 62-614 shows the D itto-Osl region
  • Figure 18 SEQ ID NOs: 65-67 shows the D itto-Os2 region.
  • PCR product length polymorphism was observed among the three varieties. Specifically, as shown in FIG. 18, the PCR product length was 267 base pairs for Asomori, 246 base pairs for Kasa1 ath, and 312 base pairs for IR24. This indicates that the polymorphism is caused by a deletion in the Ditto_ ⁇ s2 sequence at one position in Asominori and at two positions in Kasa1ath.
  • the frequency of occurrence of polymorphisms in the 0s sequence and its surrounding region tends to be higher than that of the genomic sequence corresponding to the normal RFLP marker, suggesting that the region adjacent to the transposable element may be rich in variation between cultivars. .
  • a marker for polymorphism detection was created using the normal CAPS method. Specifically, as shown in Fig. 17, D
  • the nucleotide numbers 206 to 209 of the 1 tto_ ⁇ s1 region are “GCT”, whereas the nucleotides at the corresponding positions of Kasaa 1 ath and IR24 are “ ⁇ GCT”.
  • Asominori is “agc”
  • the base at the corresponding position of Kasa 1 ath and IR 24 is "agc ⁇ ”. Therefore, PCR was carried out in the same manner as in Example 1, except that the amplification primer shown in FIG. 16A (SEQ ID NOs: 58 and 59) was used as a polymorphism detection marker.
  • Nucleotide sequences of Kasa 1 ath and IR 24 corresponding to base numbers 206-209 and 273-276 of Asominori "AGCT” is restriction enzyme A1 u Recognized by I.
  • the sequence corresponding to the base sequence 29-32 and 39_42 of Asominori is "AGCT” in all of Asominori, Kasa 1 ath and IR24. Therefore, when the amplification product was treated with the restriction enzyme A1uI, the Asitori-derived Ditto-Os1 region amplification product was cleaved at two places (29-32 and 39-42), and the Kasa1
  • the amplified products of ath and IR 24 were truncated in four places (206-209 and 273-276, and 29-32 and 39-42).
  • Asinominori Mapping using RIL71 individuals of IR24 revealed that the RICHSEA (Ditto-Osl) locus is located on chromosome 1.
  • p—SINE l—r l to r 7 are transposable elements described in Moch hizuki et al. (1992, supra). Based on the literature of Mo chizuki et al., A pair of primers for amplifying each p-SINE1 sequence (p-SINE1-r1 or r1-r7) and its surrounding region were synthesized (p_SINE1l). — SEQ ID NOs: 68-73 for r4, r5 and r7). Using a pair of these primers, Asominori, Kasa1 ath and the genomic DNA of IR24 were type III, PCR was performed as in Example 1, and the nucleotide sequence was decoded.
  • FIG. 19 (SEQ ID NOs: 74-76) is:-SI NE 1-rl region
  • Fig. 20 (SEQ ID NOs: 77-79) is p-SI NE 1-r2 region
  • Fig. 21 (SEQ ID NOs: 80-82) ) Is the p-SINE1-r3 region
  • Figure 22 (SEQ ID NO: 83-85) is the p-SINEl-r4 region
  • Figure 23 (SEQ ID NO: 86-88) is the p—SINE1-r Five regions
  • FIG. 24 (SEQ ID NOs: 89—91) show the p—SINE 1—r6 region
  • FIG. 25 (SEQ ID NOs: 92—94) shows the p_SINE 1—r7 region.
  • a polymorphism detection marker was created using the dCAPS method, utilizing the polymorphisms between Asominori, Kasalanat and IR24.
  • the base numbers 82 to 85 in the p—SINE 1—r 4 region of Asinominori are “GGGTj, whereas they correspond to K asa 1 ath.
  • the base at the position is “AAT” and the base at the corresponding position in IR 24 is “G GT”. Therefore, a primer shown in FIG. 26A (SEQ ID NOS: 95 and 96) was prepared as a polymorphism detection primer, and PCR was performed in the same manner as described above.
  • the sequences of SEQ ID NOS: 95 and 96 correspond to nucleotide numbers 60 to 86 and 223 to 246 of the Asinominori sequence described in FIG.
  • each of the sequences shown in FIG. 22 (SEQ ID NO: 83), respectively, but have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 95. '— Primer is designed to replace “a” at base number 84 with “c”.
  • each of the sequences shown in FIG. 22 (SEQ ID NOS: 83-85) is amplified by 60-246.
  • bases 84-94 of the Asominori sequence are rc CGCTC AGGGGJ
  • the sequences of Ka salath and IR 24 are rc CGCTCAGAAJ and “C CGCTCAGGGJ, respectively.
  • a marker for polymorphism detection was prepared using the usual CAPS method. Specifically, as shown in FIG. 23, nucleotides 85-88 of Asinominori's pSINE1-r5 region are “ITAG”, whereas Kasa 1 ath and IR 24 The base at the position corresponding to is “TAG”. Therefore, primers shown in FIG. 26B (SEQ ID NOs: 97 and 98) were prepared as markers for detecting polymorphism, and PCR was performed in the same manner as in Example 1. The sequences of SEQ ID NOs: 97 and 98 correspond to base numbers 3 to 26 and 168 to 190 of the Asinominori sequence shown in FIG.
  • the p-SINE1-r5 region amplification products derived from the Kas a 1 ath and IR 24 regions were obtained in two places (both 85-88 and 64-67). ) was cut, and only one place (85-88) of Asinominori amplification product was cut.
  • a polymorphism detection tool was created using the normal CAPS method. Specifically, as shown in FIG. 25, the nucleotide numbers 65 to 69 of the 124-SINE 1-r7 region are “cttag”, whereas Asomi Nori and Kasa 1 ath The base at the position corresponding to “Agtaggatta gj contains 7 extra bases. Therefore, as a marker for detecting a polymorphism, a primer shown in FIG. 26C (SEQ ID NOS: 99 and 100) was created. PCR was performed in the same manner as in Example 1.
  • sequences of SEQ ID NOS: 99 and 100 were Each corresponds to the base number minus 17 to 7 and 73 to 96 of the Asinominori sequence shown in FIG. 25 (SEQ ID NO: 92), and by using these polymorphism detection markers as primers, The minus 17-96 of the sequence described in FIG. 25 (SEQ ID NOs: 92-94) is amplified.
  • the sequence “cttag” at base positions 65-69 of IR 24 is recognized by the restriction enzyme Ddel (recognizing “CTNAG”).
  • the amplified product when the amplified product was treated with the restriction enzyme, the amplified product of the p-SINE11-r7 region derived from IR24 was cleaved, but the amplification products of Asominori and Kasa1ath were not cleaved.

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Description

明細書
転移因子を利用した植物ゲノム多型検出用マ一カーおよびその作成方法 技術分野
本発明は、 植物ゲノム多型検出用マーカーおよびその作成方法に関する。 本出願は、 2000年 8月 2日に提出された日本特許出願 特願 2000— 2 345 57号を基礎とする優先権主張出願である。 当該日本特許出願の内容は全 て本明細書に援用される。 背景技術
遺伝的多型 '
同一種内の正常な個体間で、 ある形質や形態について多様性が存在する状態を 「多型性」 （p o l ymo r p h i sm) という。 特に、 多型が遺伝的差異によ つて生じる場合を遺伝的多型性 （g e n e t i c p o l ymo r p h i sm) という。 細胞遺伝学的に検出できる染色体の構造や形態に関する多型性、 特定の 遺伝子座の対立遺伝子に関する多型性など、 自然集団には多くの遺伝的変異が保 有されていることが明らかとなってきた （生化学辞典 第 3版 第 835頁、 1 998年 1 0月 8日発行、 株式会社 東京化学同人） 。
遺伝的多型の著しい例としては、 少なくとも 4つの複対立遺伝子を含むナミテ ントウの翅鞘斑紋の多型が挙げられる。 また、 逆位その他の染色体変異が多型の 状態で種内に保有される染色体多型 （c h r omo s ome p o 1 ymo r p i s m) はショウジヨウバエの各種でよく研究されている。 遺伝的多型のうち 特に、 「DNA多型 （DNA p o 1 ymo r p h i s m) 」 は、 一つのァミノ 酸座位やヌクレオチド座位でみられる変異をいう （岩波 生物学辞典 第 4版， 第 8 1頁， 1 996年 3月 2 1日発行， 株式会社 岩波書店） 。
植物ゲノムにおいても多くの DN A多型が検出されている （例えば、 イネ、 コ ムギ、 トウモロコシ等の単子葉植物、 ァラビドプシス、 'タバコ等の双子葉植物、 ナシ、 スギ等の木本植物） 。 例えばイネでは、 DN A多型を利用したマーカーに より連鎖地図が作成され、 遺伝解析や育種選抜に活用されている （Ha r u s h i m a e t a l . Ge n e t i c s 148 : p. 479 -494, J an u a r y 1998) 。
従来、 DNA多型の検出のためには、 制限酵素断片長の多型 （r e s t r i c t i o n f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r p h i sm ; RF LP) を調べたり、 塩基配列の決定により直接的に決定する方法、 ゲノム DNA を 8塩基認識制限酵素で切断後、 末端を放射能標識し、 さらに、 6塩基および 4 塩基認識制限酵素で切断し、 2次元電気泳動で展開する方法 （RLGS法、 R e s t r i c t i o n L an dma r k Ge n ome S c a nn i n g) 等 が採用されてきた。 さらに、 RFLPをポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) によつ て増幅 ·検出する AFL P (amp l i f i e d f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r p h i sm ; P. Vo s， ら、 Nu c l e i c Ac i d s R e s . Vo l . 23, p. 4407 -4414 (1 99 5) ) 分析も開発されている。 しかしながら、 各方法においていずれも問題点が あり、 より効率よく多型を検出する方法が希求されていた。
より具体的には、 例えば、 以下に例示するような RFLPを P CR増幅を用い て検出する方法 （RFL Pマーカーの P CRマーカー化） 、 マイクロサテライト の多型を P CR増幅を用いて検出する方法 (マイクロサテライトマ一力一) が採 用されてきた。
(1) RF L Pマーカーの P CRマーカー化
A. RFLPプローブ対応ゲノム領域の多型を利用して PC Rマーカー化す る方法 （D. E. Ha r r y， B. Teme s g e n, D. B. N e a 1 e ； C o d om i n an t PCR— b a s e d ma r k e r s f o r P i n u s t a e d a d e v e l o p e d f r om ma p p e d c DNA c 1 o n e s , Th e o r. Ap p l . Ge n e t. ( 1 998) 9 7 : p. 327 - 336 )
RF L Pマーカープローブ配列 （ 「： RFLP」 は、 ある DNA断片をプローブ に用いてサザン解析を行つた場合に観察される多型である。 プローブに用いた D NA断片の塩基配列を 「RF LPマーカープローブ配列」 と呼ぶ。 ) に対して設 計したプライマーを用いてゲノム PCRを行った後、 次の二方法のいずれかによ り P CRマーカー化できる。 第 1は、 産物を一連の制限酵素で処理し、 断片長多 型を生じる制限酵素を探索する手法であり、 第 2は、 産物の塩基配列を品種間比 較して多型を探索し、 その多型を利用して P CRマーカー化する方法である。
しかしながら、 前記方法には、 品種間多型の出現頻度が低く、 l O O O b p程 度の P CR産物を比較した場合、 RFL Pが得られないばかりでなく、 塩基配列 で比較しても品種間多型が全く見出されないことも多い、 という問題があった。 また、 より長い領域での比較が可能な場合もあるが、 それだけ労力も必要とな る。
B. RFLP原因部位を同定して P CRマーカー化する方法
RF L Pマーカープローブ配列内あるいはその周辺 （通常数 k b以内） に存在 する RF LP原因部位 （比較する 2品種の一方のみが持つ制限酵素認識部位） を 同定することにより、 P CRマーカー化する方法である。
しかしながら、 前記方法において RF LP原因部位同定のためには、 RF LP マーカープローブ対応ゲノム領域およびその周辺領域を包含するゲノムクローン を単離 ·解析する必要があり、 非常に多くの時間 ·労力を必要とする、 という問 題を伴う。 具体的には、 ゲノムライブラリーのスクリーニング （ハイブリダィゼ ーシヨン） 、 陽性クローンの増幅および単離、 単離したクローンの制限酵素地図 作成、 多型の原因となる制限酵素部位の同定、 適当なプライマーの設計および多 型確認といった一連の実験が必要で、 順調に進埗した場合でも約 1ヶ月を要す る。
(2) マイクロサテライトマーカー
マイクロサテライトとは、 （CA) nのような 2ないし 4塩基程度の繰り返し 配列であり、 ゲノム中に多数存在している。 繰り返し数に品種間多型がある場 合、 隣接領域に設計したプライマーを用いて P CRを行うと、 P CR産物長に多 型が観察され、 DNA多型を検出することが可能となる。 マイクロサテライトを 利用した多型検出マーカーは、 マイクロサテライトマ一力一と呼ばれている
(O. P a r n a u d, X. Ch e n, S . R. Mc C o u c h, D e v e l o p m e n t o f m i c r o s a t e l l i t e ma r k e r s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f s i mp l e s e qu e n c e l e n g t h p o l ymo r p h i sm (S SLP) i n r i c e (O r y z a s a t i v a L. ) , Mo l . Ge n. Ge n e t . (1 996) 252 : p. 5 97 - 607) 。
しかしながら、 当該方法は、 任意に選んだマイクロサテライトが多型を示さな いことも多い、 という問題を伴う。 さらに、 多くのマイクロサテライトマーカー は、 アクリルアミドゲルで分析しないと多型が明瞭に観察できないが、 アクリル アミドゲルでの分析は、 通常のァガロースゲルでの分析と比較して、 非常に煩雑 である。
以上、 DNA多型の検出のための種々の方法が研究されているが、 より効率よ く多型を検出するためのマーカ一及び方法が希求されている。
転移因子
「転移因子」 は、 「転移性遺伝因子」 、 「可動遺伝因子」 又は 「可動性因子」 とも呼称され、 DN A上のある部位から他の部位へ移転可能な、 定まった構造を 有する DNA単位を言う。 両端に通常、 約 10塩基ないし 50塩基対の逆向き配 列を有し、 内部には通常この末端逆向き配列を認識し転移反応をつかさどる酵素 トランスポゼースをコ一ドする配列を含む。 単純揷入ゃ切り出しにより遺伝子の 不活性化、 遺伝子構造の改変を引き起こすが、 転移反応により欠失，逆位 ·重 複 · レブリコン融合をも引き起こすためゲノム再編に関わる。
転移因子の存在は、 トウモロコシの遺伝系で B. マクリントックにより示され た。 原核生物には、 挿入配列 （ I S) 、 抗生物質耐性遺伝子などを運ぶトランス ポゾン （Tn) 、 Muなどの溶原性ファージが存在する。 真核生物ではトウモロ コシの Acや S pmなど、 キンギヨソゥの Tam、 ショウジヨウバエの P因子、 線虫の T c 1がよく知られている。
転移による組換え反応は、 標的部位の数塩基対配列を重複させるが、 この特徵 は、 真核生物に存在するレトロウイルス · レトロ （トランス） ポゾンの RNAか ら逆転写によって生じた cDN Aが、 組込み酵素インテグラ一ゼ （ i n t e g r a s e、 I Nタンパク質） の働きにより組み込まれる反応にも共通して観察さ れ、 従って、 これらの因子も広義には転移因子に含まれる。 転移因子の転移能力 を利用したトランスポゾン標識法などの遺伝子操作が、 様々な生物系で応用され ている （岩波 生物学辞典 第 4版、 第 966頁一第 967頁、 199 6年 3月 2 1日発行、 株式会社 岩波書店） 。
(1) トランスポゾン
転移因子一般を総称して、 あるいは転移因子のうち特に原核生物の染色体ゃプ ラスミドに見出される薬剤耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子を運ぶものを 「ト ランスポゾン」 と言う （岩波 生物学辞典 第 4版、 第 1 0 1 1頁、 上述） 。 トランスポゾンは由来やマーカー遺伝子の種類により Tn 1、 Τη 2、 Τη 3、 · · · というように分類される。 構造上の特徴から、 両端に挿入配列または それに関連した配列をもつものと、 逆位繰返し配列だけをもつものに分けられ る。 前者の例として Tn 5や Tn 9が、 後者の例として T n 3が挙げられる。 T n 5は約 5. 8キロ塩基対 （b p) の長さで、 両端には互いに逆向きの方向をし た 1 533 b pの揷入配列 （ I S 50) が存在し、 内側にはカナマイシン耐性遺 伝子がある。 Tn 9は両端に同じ方向を向いた揷入配列 （ I S 1) をもち、 内側 にはコロラムフエ二コール耐性遺伝子がある。 これらの Tnの場合、 転移に必要 な酵素トランスポゼースは各々の挿入配列から供給される。 Tn 3はこれらと異 なり、 両端には 38 b pの逆位繰返し配列があり、 内側に自身のトランスポゼー スとアンピシリン耐性遺伝子をコードしている。
一般に、 転移因子が DNA上に挿入されると、 挿入の標的となった塩基配列が 転移因子の外側に重複し、 重複される塩基数 （一般には、 約 3ないし 1 2塩基 対） はトランスポゼースの種類により規定されると考えられている。 このような 標的部位の重複は、 転移因子組込みの特徴である。
「トランスポゾン」 という用語は、 広義には、 後述する真核生物におけるレト 口トランスポゾンも含めた転移因子一般を意味する場合もある。
(2) レトロポゾン
ゲノム中のある位置における情報 （DNA) が一旦 RNAに転写され、 RNA が逆転写酵素の働きで相補的 DN Aに写しかえられてゲノム中の他の位置に再揷 入される場合、 そのような DNAを総称して 「レトロポゾン」 と言う。 これに対 し、 中間体を経ずに DNAとして転移する場合の DNAを狭義の 「 ン J と言う。 散在性の反復配列はほとんどがレトロポゾンである （岩波 生物学 辞典 第 4版、 第 1 500頁、 上述） 。
レトロポゾンは、 以下の 2群に大別される。
(1) ウィルス群： レトロウイルス及び自身で逆転写酵素をコードしているシ ョウジヨウバエのコピア因子、 酵母の Ty因子、 ヒトの L 1因子等を含む。 ウイ ルス群のうち、 レトロウイルスを除くものを総称してレトロトランスポゾン （r e t r o t r a n s p o s o n) といい、 その転移の現象をレト口トランスポジ シヨン (r e t r o t r a n s p o s i t i o n) とよぶ。
(2) 非ウィルス群： 尺 八ポリメラ一ゼ1 Iによりタンパク質をコードして いる遺伝子から転写された mRNAから逆転写で生じた偽遺伝子、 核内低分子 R
N Aの偽遺伝子や、 RNAポリメラーゼ I I Iにより転写される S I NE (サイ ン） と総称されている分散型の短い反復配列を含む。 S I NEには、 ヒトのゲノ ム中に存在する A 1 uフアミリーや、 その他 t RNAを起原とする多くの例が知 られている （P. L. D e i n i n g e r ( 1 989) , S I N E s ： S h o r t i n t e r s p e r s e d r e p e a t e d D N A e l eme n t s i n h i gh e r e u c a r y o t e s . I n : M o b i 1 e D N A ( e d s . ： D. E . B e r g an d M. M. Howe) , p p. 6 1 9— 636 Am e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y, Wa s h i n g t o n, D. C. ) 。 狭義には、 非ウィルス群のレトロポゾ ンだけをレトロポゾンと呼称することもある。 レトロポゾンは多くの場合機能を もたず、 寄生性の存在であると考えられるが、 まれにレトロポゾンが機能を獲得 した例や、 レトロポジションによって新たに遺伝子が創製された例が知られてい る。
植物の転移因子植物にも多くの転移因子が存在することが報告されている。 こ こでは大坪 （細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 5 植物のゲノムサイェン ス、 第 102貢一第 1 1 3貢、 1 996年 10月 1日発行、 株式会社秀潤社） の 分類に従って、' 植物の転移因子をクラス Iとクラス I Iに分類する。 クラス Iは RNA中間体を経て転移するレトロポゾンであってレトロトランスポゾン、 L I NE及び S I NEを含む。 クラス I Iは中間体を経ずに DN Aとして転移するト ランスポゾンであって、 Ac/D s、 E n/S pmおよび Muが知られている。 最近植物ゲノムから発見された新規トランスポゾン M I TE (微小逆向反復転移 因子； M i n i a t u r e I nv e r t e d R e e a t Tr a n s p o s a b l e E l eme n t s) も便宜上クラス I Iに分類されているが、 その 転移機構は未だに解明されていない。
M I TEの構造的な特徴は比較的短い （長くとも 400 b p程度） 、 遺伝子を コードしていない、 両末端に逆向き反復配列を持つ、 DNAの 2次構造をとり得 る、 M I TE因子毎に標的配列に特異性がある、 である （S. R. We s s 1 e I "ら、 Cu r r e n t O i n i o n i n Ge n e t i c s &D e v e l o pme n t 1 99 5， Vo l . 5， p. 8 14— 82 1 ) 。 各 M I T E 因子は植物ゲノム全体に多数存在すると推定されている。 例えば、 S t owaw a yに属する Tn r 1はイネゲノム中に約 3500コピー存在する （T. T e n z e nら、 Mo l Ge n Ge n e t ( 1 994) Vo l . 245 : p. 441 -448) 。 また、 To u r i s tに属するトウモロコシで見出され た因子 B 2と Hb rはそれぞれ 10, 000コピー以上と見積もられている
(S. R. We s s l e rら、 Cu r r e n t Op i n i o n i n Ge n e t i c s &D e v e l o pme n t 199 5, Vo l . 5 , p. 8 14 - 82 1) 。
植物の転移因子はイネ、 トウモロコシ、 タバコ等に見出されている。 特にイネ においては、 レトロトランスポゾン To s (H. H i r o c h i k aら、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA ( 1 996) Vo l . 93, p p. 7783— 7 788) 、 R I RE 1 (K. Nomaら， Ge n e s G e n e t . S y s t . (1 997) Vo l . 72 p. 13 1— 140) 、 R I RE 2 (H. Oh t s u b oら， Ge n e s Ge n e t . S y s t . ( 1 999 ) Vo l . 74 p. 83— 9 1 ) 等や S I N Eである p— S I N E 1 (K. Mo c h i z u k i ら、 J p n. J. Ge n e t . ( 1 992 ) 5 7, p p. 1 5 5 - 1 66) が知られている。 また、 クラス I Iでは EnZS p mに属する Tn r 3 (R. Mo t oh a s h i ら、 Mo l Ge n Ge n e t ( 1996 ) Vo l . 250, p. 148 - 1 52) と M I TEが知られて いる。 また、 W. — Y. S on gら （Mo l Ge n Ge n e t (1 9 9 8) Vo l . 2 58 : 449一 456) は最近クラス I Iに属する新規因子 Kr i s p i e、 S n a p、 C r a c k l es P o pおよび T r un c a t o r を発見している。
既知の M I TEは Ga i j i n、 C a s t away, D i t t o, Wa n d e r e r、 Ex l o r e r (以上、 T. Bu r e a uら、 P r o c. Na t 1. Ac a d. S c i . USA, Vo l . 93， p p. 8524- 852 9， Au g u s t 1 996) 、 To u r i s t (T. E. Bu r e auら， P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA ( 1 994) Vo l . 9 1, p p. 141 1— 1415) 、 S t owaway (T. E . Bu r e au ら， Th e P l an t C e l l ( 1 994) Vo l . 6， p p. 9 07 - 9 16) 、 Amy/LTP (N. Hu a n gら， Ge n e (1 9 9 2) Vo l . I l l, p p. 223— 228、 F. V i gn o l sら， G e n e ( 19 94) Vo l . 142, p p. 265 - 270, T. B u r e auら、 P r o c . N a t l . Ac a d. S c i . USA, Vo l . 9 3， p p. 8 524- 8529, Au g u s t 1 996) , Tn r 2 (K. Mo c h i z uk i ら、 J p n. J. Ge n e t . ( 1 993 ) V o 1. 68， p p. 205 _ 2 17) 等である。
なお、 本発明の転移因子はここに掲げた既知の転移因子に限られるものではな い。
上記 K. Mo c h i z u k i ら， J p n. J . Ge n t . ( 1 992 ) 5 7， p. 1 55— 1 66の論文は、 p— S I NE 1において突然変異による塩基置 換がユニーク配列と比較して反復配列中で生じやすいことを示唆している。 しか しながら、 転移因子と多型との関係について具体的に検討しておらず、 まして、 転移因子が多型検出用マーカーとして利用しうることについても言及していな い。 発明の開示 本発明は、 植物ゲノム中の多型検出用マーカーの作成方法を提供することを目 的とする。 本発明の作成方法は、 植物ゲノム中の転移因子および/またはその隣 接領域の塩基配列を利用して核酸増幅用プライマーを作成すること含むことを特 徵とする。
本発明の方法は、 その一態様において、
i ) 標的植物種のゲノム中に存在する転移因子およびその隣接領域の塩基配列 に基づいて上記転移因子、 または転移因子と隣接領域の双方を増幅するようにプ ライマー対を作成し；
i i ) 標的植物種のゲノム D N Aを铸型として核酸増幅反応を行い；そして i i i ) 前記核酸増幅産物に見出された多型に基づいて、 植物ゲノム中の多型 検出のためのマーカーを作成する
ことを含む。
本発明は、 また、 本発明の方法によって作成された、 植物ゲノム中の多型検出 用マーカ一を提供することを目的とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 G a i j i n領域増幅用プライマーの配列を示す。
図 2は、 G a i j i n 1領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および小文 字は、 それぞれ、 G a i j i n - O s 1配列およびその隣接配列を示す。 白抜き 文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。
図 3は、 G a i j i n 2領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および小文 字は、 それぞれ、 G a i j i n— O s 2配列およびその隣接配列を示す。 白抜き 文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P C Rマーカ一作成 に利用した多型を二重下線で示した。
図 4は、 G a i j i n 3領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および小文 字は、 それぞれ、 G a i j i n— O s 3配列およびその隣接配列を示す。 白抜き 文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P C Rマーカー作成 に利用した多型を二重下線で示した。 図 5は、 Ga i j i n領域の多型検出用 （PCR) マーカーとしてのプライマ 一配列を示す。
図 6は、 Wa n d e r e r領域増幅用プライマーの配列を示す。
図 7は、 Wa n d e r e r 1領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および 小文字は、 それぞれ、 Wand e r e r— O s 1配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマ —カー作成に利用した多型を二重下線で示した。
図 8は、 Wa n d e r e r 2領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および 小文字は、 それぞれ、 Wand e r e r— O s 2配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。
図 9は、 Wa n d e r e r 3領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および 小文字は、 それぞれ、 Wand e r e r— O s 3配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマ 一力一作成に利用した多型を二重下線で示した。
図 1 0は、 Wa n d e r e r 4領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 Wan d e r e r— O s 4配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマ 一力一作成に利用した多型を二重下線で示した。
図 1 1は、 Wa nd e r e r領域の多型検出用 （P CR) マーカ一としてのプ ライマー配列を示す。
図 12は、 C a s t a wa y領域増幅用プライマーの配列を示す。
図 13は、 C a s t away 1領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 C a s t awa y— O s 1配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマ —カー作成に利用した多型を二重下線で示した。
図 14は、 C a s t awa y 2領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 C a s t awa y— O s 2配列およびその隣接配列を示 す。 白抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマ 一力一作成に利用した多型を二重下線で示した。 後半の大文字部分は別の転移因 子 Ex p 1 o r e r—〇 s 2である。
図 1 5は、 C a s t awa y領域の多型検出用 （P CR) マーカーとしてのプ ライマー配列を示す。
図 1 6は、 D i t t o領域増幅用プライマーの配列を示す。
図 1 7は、 D i i t o 1領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および小文 字は、 それぞれ、 D i t t o— O s 1配列およびその隣接配列を示す。 白抜き文 字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 P CRマーカ一作成に 利用した多型を二重下線で示した。 後半の大文字部分は別の転移因子 Ex p 1 o r e r— O s lである。
図 1 8は、 D i i t o 2領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字および小文 字は、 それぞれ、 D i t t o— O s 2配列およびその隣接配列を示す。 白抜き文 字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。
図 1 9は、 p_S I NE— r 1領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p— S I NE— r 1配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。
図 20は、 p— S I NE— r 2領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p _ S I NE— r 2配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。
図 2 1は、 p— S I NE— r 3領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p— S I NE— r 3配列およびその隣接配列を示す。 一 重下線は順方向反復配列を示す。
図 22は、 p— S I NE— r 4領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p— S I NE— r 4配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。 P CRマ一カー作成に利用した多型を二重下線で示した。 図 2 3は、 P— S I N E— r 5領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p— S I N E— r 5配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。 P C Rマーカー作成に利用した多型を二重下線で示した。 図 2 4は、 p— S I N E— r 6領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 p— S I N E— r 6配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。
図 2 5は、 p— S I N E— r 7領域塩基配列の品種間比較を示す。 大文字およ び小文字は、 それぞれ、 ρ— S I N E— r 7配列およびその隣接配列を示す。 白 抜き文字はあそみのり配列と異なる多型部位であることを示す。 一重下線は順方 向反復配列を示す。 P C Rマーカー作成に利用した多型を二重下線で示した。 図 2 6は、 p _ S I N E領域の多型検出用 （P C R ) マ一力一としてのプライ マー配列を示す。 発明の詳細な説明
本発明者らは、 上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、 植物ゲノム中の遺 伝的多型が、 転移因子内部またはその近傍領域で （極めて） 高頻度で見出されて いることを発見し、 本発明を相当した。
よって、 本発明は、 植物ゲノム中の多型検出用マーカ一の作成方法に関し、 植 物ゲノム中の転移因子および Zまたはその隣接領域の塩基配列を利用して核酸増 幅用プライマーを作成することを含む、 ことを特徴とする。 好ましくは、 本発明 の方法は、
i ) 標的植物種のゲノム中に存在する転移因子およびその隣接領域の塩基配列 に基づいて上記転移因子、 または転移因子と隣接領域の双方を増幅するようにプ ライマー対を作成し；
i i ) 標的植物種のゲノム D N Aを铸型として核酸増幅反応を行い；そして i i i ) 前記核酸増幅産物に見出された多型に基づいて、 植物ゲノム中の多型 検出のためのマーカーを作成する ことを含む。
本発明の対象となる植物種は特に限定されない。 好ましくは単子葉植物、 より 好ましくは、 イネ、 トウモロコシ、 ォォムギ等である。 特に好ましくはイネであ る。
転移因子
本発明の植物ゲノム中の DN A多型検出のためのマーカーを作成する方法にお いては、，まず、 既知の転移因子の配列情報をもとに、 ゲノムライブラリーのサザ ンハイブリダィゼーションによるスクリーニング及び遺伝子配列決定、 又はデー ターベースの検索等の手段により、 標的植物種のゲノム中に存在する転移因子お よびその隣接領域の塩基配列を解明する。
転移因子は生物の進化の過程で転移を繰り返すことによってコピー数を増やす とともに、 それぞれのコピーではその内部配列に塩基配列の変異も集積してい る。 したがって、 塩基配列の相同性が高ければ同種の転移因子と見なして良い が、 相同性が低い場合であっても、 転移因子の特徴を備えていれば同種と見なし 得ることがある。 例えば、 M I TEにおいては、 両末端の逆向き配列、 標的配 列、 推定される 2次構造および全長等が特徴となる （T. E. B u r e a uら、 Th e P l a n t C e l l , Vo l . 6 , 907 - 9 1 6 1 994、 T. Ε. Bu r e a uら、 P r o c. Na t l . Ac a d, S c i . USA Vo l . 91， p p. 141 1 - 141 5, 1 9 94) 。
植物種のゲノムライブラリ一は公知の手段により、 例えば、 Ma n i a t i s, Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Man u a 1 , Co l d S p r i n g Ha r o r L a b o r a t o r y, 2 n d Ed i t i o n, 1 989 ) に記載の方法により作成することが可能であ る。 あるいは、 市販の植物ゲノムライブラリーを利用してもよい （例えば、 CL ONTECH社製のイネ ゲノムライブラリー、 S TRATAGENE社製のト ゥモロコシ ゲノムライブラリ一等） 。
データ—ベースには、 数多くの植物ゲノムの配列および転移因子配列が登録さ れており、 当業者はこれらのデータベースの検索により多型検出のために利用可 能な転移因子を検索 '選択することが可能である。 限定されるわけではないが、 利用可能なデータベースとしては、 例えば、 Ge nB a n k、 EMBL等があ る。
本明細書において、 「転移因子」 は DN A上のある部位から他の部位へ転移可 能な、 定まった構造を有する DNA単位を意味し、 当業者に通常使用される意義 として用いられる。 したがって、 「転移因子」 は RNA中間体を経て転移するレ トロポゾンであるレトロトランスポゾン、 L I NE、 S I NEや中間体を経ずに DN Aとして転移するトランスポゾン、 さらに最近植物で知られるようになった 新規トランスポゾンである M I TE (微小逆向反復転移因子） も含む。
本発明は植物ゲノムの多型検出のため、 植物ゲノム中に存在する転移因子を利 用するものである。 限定されるわけではないが、 植物ゲノム中の転移因子として は、 例えば、 M I TE (微小逆向反復転移因子： M i n i a t u r e I n v e r t e d— r e p e a t T r an s p o s a b l e E l eme n t s; 又は S I NE (短散在核因子： S h o r t I n t e r s p e r s e d Nu c 1 e a r E l eme n t s) に属する転移因子は構造が比較的短いため、 その利用 が容易である。
M I TEに分類される転移因子としては、 例えば、 イネの転移因子、 Ga i j i n、 C a s t awa y、 D i t t o、 Wan d e r e r、 Ex p l o r e r、 S t owawa y, To u r i s tおよび Tn r 2等が知られている。 本明細書 の後述する実施例においては、 これらのうち、 Ga i j i n (G a i j i n— O s 1 , 2, 3) 、 C a s t away (C a s t awa y—〇 s i, 2) 、 D i t t o (D i t t o— 1、 2) および Wa n d e r e r (Wan d e r e r— O s 1， 2, 3， 4) について、 それぞれの隣接領域に対してプライマーを設計し、 あそみのり、 I R 24および K a s a 1 a t hのトータル D N Aを铸型にして P CR増幅を行った。 増幅産物の塩基配列を品種間比較した結果、 各転移因子配列 およびその隣接領域において極めて高頻度で多型が存在することが示された。 各 M I TE因子はイネゲノム全体に多数存在すると考えられることから、 これらを 利用してイネゲノム全体に多くのマーカーを作成できる。
なお、 これらの転移因子のうち、 C a s t awa yはトウモロコシにも見出さ れており （T. Bu r e a uら、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, Vo l . 93， p . 8524- 8529, Au gu s t 1 9 96) 、 また T o u r i s tはトウモロコシ、 ソルガム、 大麦からも見出されて おり （T. E. Bu r e auら， P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA (1 9 94) Vo l . 91, p p. 141 1— 1415) 、 さらに S t owawa yはイネ科植物のみならず双子葉植物からも見出されている (T. E. Bu r e auら， Th e P l an t C e l l (1 994) Vo l . 6， p p. 907— 916) 。 したがって、 M I TEはイネのみなら ず他の植物でも高頻度で多型を示すことが容易に推察される。
S I NEに分類される転移因子としては、 例えばイネの p— S I NE 1 (K. Mo c h i z u k i ら， 上述） が知られている。 本明細書の実施例においては、 イネ転移因子 p— S I NE 1 (p— S I NE l _ r l、 r 2、 r 3、 r 4、 r 5、 r 6、 r 7) について、 p _ S I N E 1配列およびその周辺領域を増幅させ るために Mo c h i z u k i e t a 1. ( 1 992 ) が用いたプライマーに より、 上記 M I TEと同様の実験を行った。 その結果、 品種間多型の出現頻度は p— S I NE 1因子間で異なり、 品種間多型が見られない因子もあることが示さ れたが、 全体的には、 RFL Pマーカープローブ対応ゲノム領域よりは多型に富 むことが示唆された。
イネゲノム全体には P— S I NE 1が約 4500コピーも存在することから (大坪、 細胞工学 別冊 植物細胞工学シリーズ 5 植物のゲノムサイエンス、 第 102貢—第 1 1 3貢、 1 996年 1 0月 1日発行、 株式会社秀潤社） 、 これ を利用してイネゲノム全体に多くのマ一カーを作成できると考えられる。
G e n B a n kデータベースによれば、 S I N Eはタバコやアブラナ科植物で も見出されている。 したがって、 S I NEはイネのみならず他の植物でも多型に 富むことが推察される。
M I TE以外のクラス I Iに分類されるトランスポゾンには A c /D s、 En /S pmおよび Milがあり、 多くの植物から見出されている。 例えばイネでは E n/S pmに属する Tn r 3が知られており、 最近では新規因子 K r i s p i e、 S n a , C r a c k l e, P o pおよび T r u n c a t o rも発見されて いる （W. — Y. S o n gら、 Mo l Ge n Ge n e t ( 1998) V 0 1 . 2 5 8 : 4 4 9— 4 5 6 ) 。 また、 S I N E以外のクラス Iに分類され るレトロポゾンもまた多くの植物から見出されている。 例えばイネでは R I R E 1や R E R E 3等が知られている。 これらはその内部配列に遺伝子をコードして いる場合もあるが、 非コード領域においては M I T Eや S I N Eと同様に D N A 多型に富む可能性がある。 構造が比較的長いため、 これらを利用してマーカ一を 作成することは M I T Eほどには容易でないが、 後述する実施例 2の W a n d e r e r—〇 s 3の場合のようにマーカー化できる可能性はある。
また、 本発明において発見されたように、 転移因子の種類により品種間多型の 出現頻度が異なる。 よって、 用いる転移因子を適宜選定することにより、 より効 率的に P C Rマーカーを作成することが可能である。
本発明において、 転移因子の 「隣接領域」 とは、 特に限定されず、'転移因子領 域の長さ、 利用する核酸増幅反応の種類等によって変化しうる。 本発明において は、 植物ゲノム中の転移因子の周辺に D N A多型が多く存在するという発見に基 づき、 核酸増幅用プライマー対を作成して多型検出用のマーカーとするが、 作成 された前記プライマー対によって転移因子又は転移因子とその隣接領域の双方を 含む核酸が増幅可能でなければならない。 よって、 プライマ一対の距離は、 利用 される核酸増幅反応の種類に応じて、 核酸増幅が可能な長さの範囲内であること が好ましい。
本発明において、 転移因子の 「隣接領域」 とは、 転移因子又は転移因子とその 隣接領域の双方を含む領域が、 好ましくは、 このような核酸増幅が可能な距離の 範囲内にあることを意味する。 限定されるわけではないが、 好ましくは転移因子 とその隣接領域の双方を含む領域が、 好ましくは約 5 0塩基ないし約 3 0 0 0塩 基、 より好ましくは約 5 0塩基ないし約 2 0 0 0塩基、 より好ましくは約 1 0 0 塩基ないし約 1 0 0 0塩基の範囲内にある。 限定されるわけではないが、 瞵接領 域は、 転移因子の 5 ， 側または 3， 側に好ましくは約 0塩基ないし約 3 0 0 0塩 基、 より好ましくは約 0塩基ないし約 2 0 0 0塩基、 より好ましくは約 0塩基な いし約 1 0 0 0塩基の範囲内にある。
酸増幅 本発明では、 好ましくは、 解明された標的植物種のゲノム中に存在する転移因 子およびその隣接領域の塩基配列に基づいて、 上記転移因子、 又は転移因子と隣 接領域の双方を増幅するように、 プライマ一対を作成する。 そして、 上記プライ マー対を用いて、 標的植物種のゲノム D N Aを铸型に核酸増幅反応を行う。
核酸増幅反応は、 複製連鎖反応 （P C R ) (サイキら、 1 9 8 5 , S c i e n c e 2 3 0 , p . 1 3 5 0— 1 3 5 4 ) である。
核酸増幅のためのプライマー対は、 転移因子およびその隣接領域の塩基配列に 基づき公知の方法により作成することが可能である。 具体的には、 限定されるわ けではないが、 例えば、 転移因子およびノまたはその隣接領域の塩基配列に基づ き、 以下の条件：
1 ) 各プライマーの長さが 1 5— 3 0塩基であること；
2 ) 各プライマーの塩基配列中の G + Cの割合が 3 0 - 7 0 %であること；
3 ) 各プライマーの塩基配列中の A、 T、 Gおよび Cの分布が部分的に大き く偏らないこと ；
4 ) プライマー対によって増幅される核酸増幅産物の長さが 5 0— 3 0 0 0 塩基、 好ましくは 1 0 0 — 2 0 0 0塩基であること；そして
5 ) 各プライマー自身の塩基配列中、 又はプライマー同士の塩基配列間に相 補的な配列部分が存在しないこと
を満たすように、 転移因子またはその隣接領域の塩基配列と同じ塩基配列若しく は上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖 D N Aを製造し、 または、 必要で あれば転移因子またはその隣接領域の塩基配列に対する結合特異性を失わないよ うに修飾した上記一本鎖 D N Aを製造する
ことを含む方法により、 プライマ一対を作成できる。
転移因子のゲノム中のコピー数は各転移因子により異なるが、 一般に、 ゲノム 中に多数コピー存在するものが多い。 転移因子の内部にプライマ一対を設計する と、 多型と無関係の期待しない増幅産物が生じやすいと考えられる。 そのため、 好ましくは、 プライマ一対は多型を含む転移因子の隣接領域に設計される。
しかしながら、 場合によっては転移因子の領域にプライマーを設計してもよ い。 例えば、 転移因子領域が長く、 転移因子の外部のみにプライマーを設計でき ない場合、 核酸増幅を効率よく行えない場合、 多型が転移因子内部のみに存在 し、 その多型を利用して多型検出用ミスマッチプライマーを設計する場合等が該 当する。 このような場合でも、 必要に応じ、 転移因子の領域にプライマーを設計 し、 核酸増幅反応により多型を検出することが可能である。 例えば、 後述する実 施例 2の W a n d e r e r— O s 3の場合、 一方のプライマー （配列番号 4 2 ) の標的部位が 1 0 0 %転移配列であった （図 9 ) が、 問題なく核酸増幅反応を行 い、 マーカー化をすることが可能であった。
核酸増幅反応の手順及び条件は特に限定されず、 当業者に周知である。 当業者 は、 転移因子若しくはその隣接領域の塩基配列、 プライマー対の塩基配列および 長さ等の種々の要因に応じて適宜、 条件を採用することが可能である。 一般に は、 プライマー対の長さが長い程、 G + Cの割合が高いほど、 A、 T、 Gおよび Cの分布の偏りが小さい程、 あるいは、 ゲノム中の転移因子のコピー数が多い 程、 よりストリンジェントな条件 （より高温度でのアニーリング反応および核酸 伸長反応、 より少ないサイクル数） で核酸増幅反応を行うことが可能である。 よ りストリンジェントな条件の採用により、 特異性の高い増幅反応が可能となる。 増幅反応は、 限定されるわけではないが、 好ましくは変性反応を 9 0 °Cないし 9 5 で 3 0秒ないし 2分、 ァニ一リング反応を 5 5でないし 6 5 °Cで 3 0秒な いし 2分、 そして、 伸長反応を 7 0 °Cないし 7 5 で 3 0秒ないし 2分を 1サイ クルとし、 これを 2 5サイクルないし 4 0サイクル行う。 より好ましくは、 変性 反応を 9 4 °Cで 1分、 アニーリング反応を 5 8 °Cで 1分、 そして、 伸長反応を 7 2 °Cで 2分を 1サイクルとし、 3 0サイクル行う。
多型検出用マーカーの作成
上記プライマー対を用いた核酸増幅反応により、 増幅産物に多型が検出される か否かを調査し、 見出された多型に基づいて多型検出用マ一カーを作成する。 限 定されるわけではないが、 増幅産物に検出されうる多型としては以下のようなも のがある。
a ) 前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合 このような場合、 欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマ —対を作成し、 多型検出用マーカーとする。 プライマー対の作成は、 前述の多型 検出のための予備的な工程 i ) と同様に行うことができる。 工程 i ) に使用した プライマー対をそのまま多型検出用マーカーとして使用することも可能である。 欠失領域の大きさが十分な場合、 例えば増幅産物をァガロースゲル電気泳動又 はァクリルァミドゲル電気泳動等することにより、 泳動度の差により多型の検出 が可能である。 例えば、 ァガロースゲル電気泳動の場合には塩基対数に約 5 %以 上の差がある場合、 シーケンス用アクリルアミドゲル電気泳動の場合には約 1塩 基以上長さに差がある場合検出可能である。 または、 欠失領域外の塩基配列に相 補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくは D N A断片を解析用プローブと して、 核酸増幅産物に対してハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 多型を 検出することができる。 あるいは、 必要に応じ、 増幅産物の塩基配列を決定して 多型を確認してもよい。 核酸の電気泳動、 ハイブリダィゼーシヨン、 塩基配列の 決定等は公知の方法を使用でき、 当業者は適宜採用可能である。
このような場合は、 増幅産物の長さの相違が直接多型を生じるので、 これを利 用した多型検出用マーカ一を AL P (amp l i c o n l e n g t h p o 1 ymo r p h i s m) マーカ一と言う。 後述する実施例 1の G a i j i n— O s 1領域、 実施例 2の Wa n d e r e r— O s 2領域、 実施例 4の D i t t o— O s 2領域がこのような場合に相当する。 いずれの場合も工程 i ) に使用した増幅 用プライマー対をそのまま多型検出用マーカーとして使用した。
b) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存 在する場合
このような場合、 当該塩基置換部位の両側に置換部位を挟むように核酸増幅用 プライマ一対を作成し、 多型検出用マーカーとする。 プライマー対の作成は、 前 述の多型検出のための予備的な工程 i) と同様に行うことができる。 工程 i) に 使用したプライマー対をそのまま多型検出用マーカ一として使用することも可能 である。
このような場合、 核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置 換が存在する、 即ち、 核酸増幅産物中に、 特定の 1または複数の制限酵素で切断 されるものとされないものが存在する。 よって、 得られた増幅産物を制限酵素処 理し、 例えばァガロースゲル等で電気泳動し、 泳動度の差により多型を検出する ことが可能である。 必要に応じ、 増幅産物の塩基配列を決定して多型を確認して もよい。
このような場合、 P CR等による増幅産物の制限酵素断片の長さの相違が多型 を生じるので、 これを利用した多型検出用マーカーを PCR— RFLP (PCR - r e t r i c t i o n f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r p h i s m) マーカー、 または CAP S (c l e a v e d amp 1 i f i e d p o l ymo r p h i c s e qu e n c e s) マーカ一とレ う (A. K o n i e c z n y , F . M. A u s u b e 1 , A p r o c e d u r e f o r ma P p i n g Ar a b i d o p s i s mu t a t i o n s u s i n g c o -d om i n an t e c o t yp e— s p e c i f i c PCR— b a s e d ma r k e r s, (1 993) , P l a n t J . 4 (2) p. 403 -41
0) 。 後述する実施例 1の G a i j i n-0 s 3領域、 実施例 2の Wand e r e r -O s 1領域及び一 O s 4領域、 実施例 3の C a s t awa y— O s 2領 域、 実施例 4の D i t t o— O s 1領域、 並びに実施例 5の p— S I NE 1— r 5領域及び一 r 7領域がこのような場合に相当する。 このうち、 実施例 4の D i t t o— O s 1領域では、 工程 i) に使用した増幅用プライマー対をそのまま多 型検出用マーカ一として使用した。
なお、 前記 a) の核酸増幅産物の長さで多型を検出可能な場合であっても制限 酵素処理を併用することにより、 多型がより検出しやすくなる場合がある。 例え ば、 実施例 2の Wa n d e r e r— O s 2領域が該当する。
c) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が 存在する場合
このような場合、 当該塩基置換部位を含み、 そして、 当該塩基置換部位を含む 領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更する ようなミスマッチ導入プライマー対を作成し、 多型検出用マーカーとする。
具体的には、 プライマー対の作成は、 前述の多型検出のための予備的な工程
1) と同様に行うことができる。 但し、 工程 i) に使用したプライマー対では核 酸増幅産物に多型を生じるが制限酵素認識に差異を生じないため、 片方のまたは 双方のプライマーにミスマッチを導入し、 当該塩基置換部位 （多型） を含む領域 を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更する。 例 えば、 P CR法を用いた部位特異的変異の導入による特定ヌクレオチドの置換、 欠失又は付加の一般的な技術は、 例えば M i k a e 1 i a nら、 Nu c 1. Ac i d s . Re s . 20 : 376. 1992に記載された方法を用いることができ る。 上記ミスマッチ導入プライマーを多型検出用マーカーとして用いた増幅産物 では、 ミスマッチ導入部位において制限酵素認識に差異を有するため、 核酸増幅 産物中に、 特定の 1または複数の制限酵素で切断されるものとされないものが存 在する。 よって、 上述の b) の場合と同様に得られた増幅産物を制限酵素処理 し、 例えばァガ口一スゲル等で電気泳動し、 泳動度の差により多型を検出するこ とが可能である。
ミスマッチの導入は、 プライマーの標的植物ゲノムへの結合性を失わせず、 ま た、 多型を生じている塩基置換を変化させるものであってもならない。 多型を生 じている塩基置換を利用してその近傍にミスマッチを導入して、 塩基置換とミス マツチの双方の組み合わせにより制限酵素認識に差異が生じるようにする。 この ようなミスマッチの導入法は当業者に公知であり、 例えば、 M i c h a e l s , S . D. · an d Am a s i n o, R. M. ( 1 998) 、 Ne f f , M. M. , Ne f f , J . D. , C h o r y , J . a n d P e p p e r, A. E. ( 1 9 98) 等に詳述されている。
このような場合のマーカ一は、 前述の b) の CAP Sマーカーの改良であり、 d CAP S (d e r i v e d C AP S) マーカ一という。 後述する実施例 1の G a i j i n— O s 2領域、 実施例 2の Wan d e r e r— O s 3領域、 実施例 3の C a s t away—〇 s l領域および実施例 5の ρ— S I NE 1— r 4領域 がこのような場合に相当する。
なお、 上記の b) または c) の場合において、 品種間の多型とは無関係の余分 な制限酵素部位が多く存在すると、 多型に基づく制限酵素部位認識の相違が識別 しにくくなる場合がある。 このような場合、 必要に応じプライマーにミスマッチ を導入し、 不必要な制限酵素部位をつぶしてもよい。 例えば、 実施例 2の Wa n d e r e r -O s 3領域では 5 ' 一プライマーにミスマッチを導入して多型と無 関係な Ms e I部位をつぶしている。 多型検出用マーカー
本発明はさらに、 上記の方法によって作成された、 植物ゲノム中の多型検出用 マーカーを提供する。 本発明の方法は、 広く植物ゲノム中の多型検出用マーカー の作成を可能にするものである。 よって、 本発明の方法によって提供されるマー カーは特に限定されない。
限定されるわけではないが、 後述の実施例では、 イネの M I T E又は S I N E に属する複数の転移因子について多型が極めて多く見出された。 よって、 これら の転移因子を利用したイネの多型検出用マーカ一は本発明の範囲に含まれる。 本 明細書中の配列表の配列番号 1一 2、 1 6— 1 9、 2 2— 2 3、 4 0— 4 5、 4 8— 4 9、 5 6— 5 7、 5 8— 6 1および 9 5— 1 0 0に具体的な配列が開示さ れたプライマーは、 実施例においてイネの多型検出用マーカーとして利用可能で あることが実際に確認されたものであり、 これらは、 非限定的に、 本発明の範囲 に含まれる。 以上、 本発明により一般的に、 転移因子を利用することにより、 効率的に多型 を見出し P C Rマーカーを作成できることが示された。 また、 転移因子の種類に より品種間多型の出現頻度が異なることから、 用いる転移因子を選定することに より、 より効率的に P C Rマーカーを作成できる。
本発明によって得られたマーカーを利用した多型検出方法は、 従来多型検出法 と比較して、 著しい利点を有する。 具体的には、 例えば、 R F L Pプローブ対応 ゲノム領域の多型を利用して P C Rマーカー化する方法と比較して、 品種間塩基 配列多型の出現頻度が高い。 よって、 マーカ一を作成できる頻度が高くなり、 効 率的マーカー作成が可能となる。 また、 R F L P原因部位を同定して P C Rマー カー化する方法と比較しても、 データベースには数多くの転移因子が登録されて おり、 それらを利用すれば、 ゲノミックライブラリーのスクリーニング、 単離し たクローンの解析といった煩雑な過程を経る必要がない。 よって、 マ一力一開発 に要する時間 ·労力は著しく軽減できる （順調に進埗した場合で約 1週間） た め、 効率的マ一カー作成が可能となる。 さらに、 マイクロサテライトマーカーと 比較しても、 作成した P C Rマーカ一の多型検出がアクリルアミド電気泳動より も容易なァガロースゲル電気泳動で行え、 また品種間塩基配列多型の出現頻度も 高い。 よって、 ァガロースゲルで多型検出可能な利用しやすい P CRマーカーを 作成でき、 さらに、 マーカーを作成できる頻度が高くなり、 効率的マーカー作成 が可能となる。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の技術的 範囲を限定するためのものではない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に 本発明に修飾 ·変更を加えることができ、 それらは本発明の技術的範囲に含まれ る。
実施例 1 Ga i j i nを利用したマーカー開発
材料および方法
G a i j i n _0 s 1、 2および 3は、 それぞれ、 データベース （G e n B a n k) に登録されている遺伝子 OS 4 CL (X 52623) 、 R I CCBP 3 (D 1 098 5) および R I CAP (D 32 1 65) の内部に存在する G a i j i n— O s転移因子である （B u r e a u e t a 1. 1 996 ) 。
各 Ga i j i n—〇 s配列およびその隣接領域を増幅するためのプライマー対 を図 1に示すように各々設計した （配列番号 1一 6) 。 これらのプライマー対を 用い、 あそみのり、 K a s a 1 a t hおよび I R 24のゲノム DNAを铸型に P CR (94t: 1分、 58°C 1分、 72で 2分を 1サイクルとし、 30サイクル) を行った。 PCR産物を電気泳動し、 目的とする DNA断片を Q I AEX I I (Q I AGEN社） を用いて回収した。 回収した DNAをテンプレートに dRh o d am i n e Te rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g F S R e a dy Re a c t i o n K i t (AB I社） でシークェンス反応 を行い、 AB I Mo d e l 31 0により塩基配列を解読した。
結果および考察
各品種の P CR産物の塩基配列を比較した結果を図 2—図 4および配列番号 7 - 1 5に示す。 図 2 (配列番号 7— 9) は G a i j i n— O s 1領域、 図 3 (配 列番号 1 0— 12) は Ga i j i n— O s 2領域、 そして、 図 4 (配列番号 1 3 - 1 5) は Ga i j i n—〇 s 3領域を示す。 図 2—図 4の各々において、 各 5， プライマーおよび 3 ' プライマーの配列は図 2—図 4に示した配列のそれぞ れ 5 ' 側および 3 ' 側に位置する。 以下、 他の実施例における各増幅用プライマ 一についても同様である。
1) G a i j i n-O s l領域
Ga i j i n—〇 s 1用プライマ一 （配列番号 1および 2) を用いた場合に は、 あそみのりと Ka s a 1 a t hおよび I R 24との間で P C R産物長多型が 観察された。 具体的には、 図 2に示されるようにあそみのりでは PC R産物長が 434塩基対 （プライマー部分を除く） であったのに対し、 K a s a 1 a t hお よび I R 24ではそれぞれ 278塩基対及び 277塩基対であった。 これは、 あ そみのりに存在する G a i j i n— O s 1が K a s a 1 a t hおよび I R 24に は存在しないことが、 多型の原因であることが示された。 この P C R産物の長さ の差に基づく多型を AL P (Amp l i c o n L e n g t h P o l ymo r p h i s m) マーカーとして、 あそみのり— I R 24の R I L (組換え近交系） 7 1個体を用いてマッピングを行うことにより、 OS 4 CL (G a i j i n— O s 1) 座が第 8染色体に座乗することが明らかになった。
G a i j i n - 0 s 2および G a i j i n—〇 s 3用プライマー （各々配列番 号 3— 4およびは 5— 6) を用いた場合には、 P CR産物長多型は観察されなか つたが、 塩基配列レベルでは多型があることが示された。 多型の出現頻度を Ga i j i n— O s配列内と隣接領域とで比較すると、 前者において高い傾向が認め られた。 一方、 Ga i j i n— O s隣接領域における多型出現頻度も、 通常の R F L Pマーカ一対応ゲノム配列のそれより高い傾向にあり、 転移因子の隣接領域 は品種間変異に富んでいる可能性が示唆された。
2 ) Ga i j i n - 0 s 2領域
G a i j i n -O s 2領域については、 あそみのりと Ka s a 1 a t hおよび I R 24との間の多型を利用して、 dCAP S (d e r i v e d c l e a v e d amp l i f i e d p o l ymo r ph i c s e q u e n c e; の手法 (M i c h a e l s an d Am a s i n o 1998 ; N e f f e t a 1. 1 998) を用いて多型検出用マーカーを作成した。
具体的には、 図 3に示されるように、 あそみのりの Ga i j 1 11—〇 3 2領域 の塩基番号 1 36位は 「Cj であるのに対し、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24 の相当する位置の塩基は 「T] である （以下、 本実施例において、 塩基配列番号 は特に言及しない限りあそみのりの塩基配列番号を用いる） 。 そこで、 多型検出 用マーカーとして、 図 5Α (配列番号 1 6および 17) に示したプライマーを作 成し、 P CR (P CR条件は 94°C 30秒、 58 X： 30秒、 72°〇30秒を 1サ ィクルとし 35サイクル） を行った。 配列番号 16および 1 7の配列は、 各々図 3 (配列番号 10) に記載のあそみのりの配列の塩基番号マイナス 10— 1 6お よび 1 38— 1 6 1に相当するが、 配列番号 1 7の塩基配列を有する 3 ' —ブラ イマ一は、 塩基番号 143— 144の配列 「 t a」 に相当する塩基を 「g t」 に 置換するように設計されている。 これらの多型検出用マ一カーをプライマーとし て用いることにより、 各々図 3 (配列番号 1 0— 12) に記載の配列のマイナス 1 0— 1 6 1が増幅されるが、 3， 一プライマーによる上記置換により、 あそみ のりの配列のみ 「CACNNNNGTG」 となり、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の配列は 「TACNNNNGTG」 となる。 この塩基配列 「CACNNNN GTG」 は、 制限酵素 Ms 1 Iによって認識される。 よって、 増幅産物を当該制 限酵素で処理すると、 あそみのり由来の Ga i j i n— O s 2領域増幅産物のみ 切断され、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産物は切断されなかった。 こ れを用いて、 多型の検出が可能である。
3) Ga i j i n - O s 3領域
G a i j i n— O s 3領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多型検 出用マーカーを作成した。 具体的には、 図 4に示されるように、 あそみのりの G a i j i n - O s 3領域の塩基番号 355— 358位は 「TJ1AA」 であるのに 対し、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「T AA] で ある。 そこで、 多型検出用マ一カーとして、 図 5 Β (配列番号 1 8および 1 9) に示したプライマーを作成し、 PCR (P CR条件は 94°C 30秒、 58 °C 30 秒、 7 2°C30秒を 1サイクルとし 35サイクル） を行った。 配列番号 1 8およ び 1 9の配列は、 各々図 4 (配列番号 1 3) に記載のあそみのりの配列の塩基番 号 2 1 2— 235および 41 6 - 43 9に相当し、 これらの多型検出用マーカー をプライマーとして用いることにより、 各々図 4 (配列番号 13— 1 5) に記載 の配列の 21 2 - 439が増幅される。 あそみのりの塩基番号 3 55— 358位 の配列 「TTAA」 は、 制限酵素 Ms e Iによって認識される。 また、 あそみの りの塩基配列 40 1— 404に相当する部分の配列は、 あそみのり、 Ka s a l a t hおよび I R 24の全てにおいて、 「TTAA」 である。 よって、 増幅産物 を当該制限酵素で処理すると、 あそみのり由来の G a i j i n-O s 3領域増幅 産物は 2力所 （355— 358および 40 1—404の双方） が切断され、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産物は 1力所のみ （40 1— 404のみ） 切 断された。
あそみのり— I R 24の R I L 7 1個体を用いてマツピングを行うことによ り、 R I CCBP 3 ( G a i j i n—〇 s 2) 座および R I C A P ( G a i j i n-O s 3) 座が、 それぞれ、 第 2染色体および第 5染色体に座乗することが明 らかになつた。
実施例 2 Wa n d e r e rを利用したマーカー開発
材料および方法
Wa n d e r e r—〇 s l、 2、 3および 4は、 それぞれ、 データベース （G e n B a n k) に登録されている遺伝子 R I C 3H3M (L 28 99 5) 、 R I C 3H3M (L 28995) 、 R I CGLUTE (D 00584) および〇SA LAM (X 16509 S 50948) の内部に存在する W a n d e r e r— O s転移因子である （Bu r e au e t a 1. 1 996) 。
各 Wa n d e r e r _〇 s配列およびその隣接領域を増幅するためのプライマ 一対を図 6に示すように各々設計した （配列番号 20— 27) 。 これらのプライ マー対を用い、 あそみのり、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24のゲノム DNAを 鎊型とし、 実施例 1の Ga i j i n領域の場合と同様に P CRを行い、 塩基配列 を解読した。
結果および考察 各品種の P CR産物の塩基配列を比較した結果を図 7—図 1 0および配列番号 28 - 3 9に示す。 図 7 (配列番号 28— 30) は Wan d e r e r— O s l領 域、 図 8 (配列番号 3 1— 33) は Wan d e r e r— O s 2領域、 図 9 (配列 番号 34— 36) は Wa n d e r e r _O s 3領域、 図 10 (配列番号 37— 3 9 ) は Wa n d e r e r _0 s 4領域を示す。
1) Wan d e r e r—〇 s 2領域
Wa n d e r e r -O s 2用プライマーを用いた場合には、 あそみのりと Ka s a 1 a t hおよび I R 24との間で PC R産物長多型が観察された。 具体的に は、 図 8に示されるように、 あそみのりでは P CR産物長が 320塩基対 （ブラ イマ一部分を除く） であったのに対し、 Ka s a 1 a t hでは 2 98塩基対そし て I R 24では 297塩基対であった。 Wa n d e r e r— O s 2の一部が K a s a 1 a t hおよび I R 24では欠失していることが、 多型の原因であることが 示された。 なお、 Wa n d e r e r _O s 2の場合、 P C R産物の長さの差のみ でも多型の検出可能であるが、 制限酵素処理を併用することにより、 多型の検出 がより容易となる （CAP S) 。 具体的には、 Ka s a 1 a t hの塩基番号 1 1 4— 1 99および相当する I R 24の塩基番号 1 1 3— 1 1 8の配列は、 「TT ΤΑΑΑ」 であり、 これは制限酵素 D r a Iで切断される。 一方、 相当するあそ みのりの配列 （塩基番号 136— 141) は、 「TGAAAA」 であり、 D r a Iで切断されない。 よって、 Wa n d e r e r— O s 2領域の P CR産物を D r a I処理した場合、 K a s a 1 a t hおよび I R 24のみ切断されて、 あそみの りは切断されなかった。
Wa n d e r e r— O s 2の P C R産物の長さの差に基づく多型を A L Pマー 力一として、 あそみのり一 I R 24の R I L 7 1個体を用いてマツピングを行う ことにより、 R I C 3H3M (Wan d e r e r— O s 2) 座が第 2染色体に座 乗することが明らかになった。
Wa n d e r e r— O s l、 Wan d e r e r— O s 3および W a n d e r e r一〇 s 4用プライマーを用いた場合には、 P CR産物長多型は観察されなかつ たが、 塩基配列レベルでは多型があることが示された。 多型の出現頻度を Wan d e r e r -O s配列内と隣接領域とで比較すると、 前者において高い傾向が認 められた。 一方、 Wa n d e r e r—〇 s隣接領域における多型出現頻度も、 通 常の RFL Pマーカー対応ゲノム配列のそれより高い傾向にあり、 転移因子の隣 接領域は品種間変異に富んでいる可能性が示唆された。
2) Wan d e r e r -O s l領域
Wa n d e r e r—〇 s 1領域については、 通常の C A P Sの手法を用いて多 型検出用マーカーを作成した。 具体的には、 図 7に示されるように、 あそみのり の Wa n d e r e r -O s 1領域の塩基番号 226 - 23 1位は 「TTIAA A」 であるのに対し、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「TT AAA] である。 そこで、 多型検出用マーカーとして、 図 1 1 A (配列 番号 40および 41) に示したプライマーを作成し、 実施例 1と同様に PC Rを 行った。 配列番号 40および 41の配列は、 各々図 7 (配列番号 28) に記載の あそみのりの配列の塩基番号 42 - 65および 300 - 323に相当し、 これら の多型検出用マーカーをプライマーとして用いることにより、 各々図 7 (配列番 号 28— 30) に記載の配列の 42— 323が増幅される。 あそみのりの塩基番 号 226— 23 1位の配列 「TTTAAA」 は、 制限酵素 D r a Iによって認識 される。 また、 あそみのりの塩基配列 1 97 _ 202に相当する部分の配列は、 あそみのり、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の全てにおいて、 「TTT AA Α」 である。 よって、 増幅産物を当該制限酵素で処理すると、 あそみのり由来の Wa n d e r e r - 1領域増幅産物は 2力所 (226 - 23 1および 1 97— 2 02の双方) が切断され、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産物は 1力所 のみ （ 1 97— 20.2のみ） 切断された。
3) Wan d e r e r -0 s 3領域
Wa n d e r e r— O s 3領域については、 G a i j i n— O s 2領域の場合 と同様に、 あそみのりと Ka s a 1 a t hおよび I R 24との間の多型を利用し て、 d C AP Sの手法を用いて多型検出用マーカ一を作成した。
具体的には、 図 9に示されるように、 あそみのりの Wa n d e r e r—〇 s 3 領域の塩基番号 206位は 「A」 であるのに対し、 Ka s a l a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「T」 である。 そこで多型検出用マーカ一として図 1 1 B (配列番号 42および 43) に示したプライマーを作成し、 上記と同様に PCRを行った。 配列番号 42および 43の配列は、 各々図 9 (配列番号 34) に記載のあそみのりの配列の塩基番号 1 77— 205および 269 - 292に相 当するが、 配列番号 42の塩基配列を有する 5 ' —プライマ一は、 塩基番号 20 3の 「A] を 「T」 に置換するように設計されている。 これらの多型検出用マー カーをプライマーとして用いることにより、 各々図 9 (配列番号 34— 36) に 記載の配列の 1 77— 292が増幅されるが、 5 ' —プライマーによる上記置換 により、 あそみのりの配列の塩基 203— 206のみ 「ΤΤΑΑ」 となり、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の配列は 「TTAT」 となる。 この塩基配列 「TT ΑΑ」 は、 制限酵素 Ms e Iによって認識される。 また、 前記 5 ' -プライマー (配列番号 42) により、 さらに塩基番号 1 85の 「T] が 「Α」 に、 そして、 192の 「Α」 が'「Τ」 に置換された。 これは、 増幅領域内に存在する塩基 20 3— 206以外の余分な 「ΤΤΑΑ」 部位をつぶすための導入されたミスマッチ である。 よって、 増幅産物を制限酵素 M s e Iで処理すると、 あそみのり由来の Wa n d e r e r— O s 3領域増幅産物のみ切断され、 Ka s a l a t hおよび I R 24の増幅産物は切断されなかった。 これを用いて、 多型の検出が可能であ る。
4) Wan d e r e r— O s 4領域
Wan d e r e r— O s 4領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多 型検出用マ一力一を作成した。 具体的には、 図 1 0に示されるように、 あそみの りの Wa n d e r e r -O s 4領域の塩基番号 284 - 294位は t c t g t g t g c」 であるのに対し、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位 置の塩基は 「 c t c t g t g t g c」 である。 そこで、 多型検出用マーカーと して、 図 1 1 C (配列番号 44および 45) に示したプライマーを作成し、 実施 例 1と同様に P C Rを行った。 配列番号 44および 45の配列は、 各々図 1 0
(配列番号 37) に記載のあそみのりの配列の塩基番号 52 - 7 5および 348 - 37 1に相当し、 これらの多型検出用マ一カーをプライマ一として用いること により、 各々図 10 (配列番号 37— 39) に記載の配列の 52— 37 1が増幅 される。 あそみのりの塩基番号 284- 294位の配列 「Gc t c t g t g t g c」 は、 制限酵素 M wo I ( fGCNNNNNNNGCj を認識） によって認識 される。 また、 あそみのりの塩基配列 23 5 - 245に相当する部分の配列は、 あそみのり、 Ka s a l a t hおよび I R 24の全てにおいて 「GCTC GTT TTGCJ である。 よって、 増幅産物を当該制限酵素で処理すると、 あそみのり 由来の Wa n d e r e r—〇 s l領域増幅産物は 2力所 （284— 294および 235 - 245の双方） が切断され、 K a s a 1 a t hおよ 、 I R 24の増幅産 物は 1力所のみ （ 235— 245のみ） 切断された。
あそみのり一 I R 24の R I L 7 1個体を用いてマッピングを行うことによ り、 R I C 3H3M (Wan d e r e r -O s l) 座、 R I CGLUTE (W a nd e r e r -O s 3) 座および〇 SAL AM (Wa n d e r e r— O s 4) 座 が、 それぞれ、 第 2染色体、 第 10染色体および第 2染色体に座乗することが明 らかになった。
実施例 3 C a s t a wa yを利用したマーカー開発
材料および方法
C a s t awa y— O s lおよび 2は、 それぞれ、 データべ一ス （G e n B a n k) に登録されている遺伝子 O S SALT (Z 2581 1 ) および R I CRT H (D 26547 ) の内部に存在する C a s t aw a y -O s転移因子である (Bu r e au e t a 1. 1996) 。
各 C a s t aw a y— O s配列およびその隣接領域を増幅するためのプライマ —対を図 12に示すように各々設計した （配列番号 46— 49) 。 これらのブラ イマ一対を用い、 あそみのり、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24のゲノム DNA を铸型とし、 実施例 1の場合と同様に PCRを行い、 塩基配列を解読した。
結果および考察
各品種の P C R産物の塩基配列を比較した結果を図 13—図 14および配列番 号 50— 55に示す。 図 1 3 (配列番号 50 - 52) は C a s t awa y— O s 1領域、 図 14 (配列番号 53— 55) は C a s t away_O s 2領域を示 す。
C a s t awa y— O s lは、 Ka s a l a t hにのみ存在することが明らか になったが、 周辺領域にはあそみのり一 I R 24間の多型も存在することが示さ れた。 C a s t awa y—〇 s 2用プライマーを用いた場合にも、 P CR産物長 多型は観察されなかったが、 塩基配列レベルでは多型があることが示された。 多 型の出現頻度は、 通常の R FLPマーカー対応ゲノム配列のそれより高い傾向に あり、 転移因子およびその隣接領域は品種間異に富んでいる可能性が示唆され た。
1) C a s t away-O s 1領域
C a s t awa y-O s 1領域については、 あそみのりと I R 24との間の多 型を利用して、 d CAP Sの手法を用いて多型検出用マーカーを作成した。
具体的には、 図 1 3に示されるように、 あそみのりおよび K a s a 1 a t hの C a s t awa y— O s 1領域の塩基番号 205位は 「A」 であるのに対し、 I R 24の相当する位置の塩基は 「C」 である。 そこで多型検出用マーカーとして 図 1 5A (配列番号 56および 57) に示したプライマ一を作成し、 上記と同様 に PCRを行った。 配列番号 56および 57の配列は、 各々図 1 3 (配列番号 5 0) に記載のあそみのりの配列の塩基番号 1 02— 1 25および 209 - 2 34 に相当するが、 配列番号 42の塩基配列を有する 3 ' —プライマーは、 塩基番号 2 14の 「a] を 「g」 に置換するように設計されている。 これらの多型検出用 マーカーをプライマーとして用いることにより、 各々図 13 (配列番号 50— 5 2) に記載の配列の 102— 234が増幅されるが、 3 ' —プライマーによる上 記置換により、 I R 24の配列の塩基 204— 2 14のみ 「c c c a t g c a t g g」 となり、 あそみのりおよび K a s a 1 a t hの配列は 「c a c a t g c a t gg」 となる。 塩基配列 rcCNNNNNNNGGj は、 制限酵素 B s 1 Iに よって認識される。 また、 あそみのりの塩基配列 12 1 _ 1 31に相当する部分 の配列は、 あそみのり、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の全てにおいて、 「 a g g c t t g gj である。 よって、 増幅産物を制限酵素 B s 1 Iで処理す ると、 I R24由来の C a s t away—〇 s 1領域増幅産物は 2力所 （2 04 -2 14および 121— 1 31の双方） が切断され、 あそみのりおよび K a s a 1 a t hの増幅産物は 1力所のみ （12 1— 1 3 1のみ） 切断された。
2) C a s t away-O s 2領域 C a s t awa y-0 s 2領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多 型検出用マーカーを作成した。 具体的には、 図 14に示されるように、 あそみの りの C a s t awa y-0 s 2領域の塩基番号 355— 365位は 「C_ TTT GCTTGG」 であるのに対し、 Ka s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位 置の塩基は 「C_^TTTGCTTGG」 である。 そこで、 多型検出用マーカーと して、 図 12 B (配列番号 48および 49) に示した増幅用プライマーをそのま ま用いて、 実施例 1と同様に P CRを行った。 あそみのりの塩基番号 35 5— 3 65に相当する K a s a 1 a t hおよび I R 24の塩基配列 「CCTTTGCT TGG」 は制限酵素 B s 1 I ( rc CNNNNNNNGGJ を認識） によって認 識される。 よって、 増幅産物を当該制限酵素で処理すると、 あそみのり由来の C a s t a wa y -O s 2領域増幅産物は切断されず、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産物は切断された。
あそみのり一 I R 24の R I L 7 1個体を用いてマツピングを行うことによ り、 OS SALT (C a s t away— O s l) 座および R I CRTH (C a s t awa y-O s 2) 座が、 それぞれ、 第 1染色体および第 7染色体に座乗する ことが明らかになった。
実施例 4 P i t t oを利用したマーカ一開発
材料および方法
D i t t o— O s 1および 2は、 それぞれ、 データべ一ス （G e n B a n k) に登録されている遺伝子 R I CHS E A (M 80938) および R I COSH 1 (D 1 6 507) の内部に存在する D i t t o— O s転移因子である （B u r e a u e t a 1. 1 996) 。
各 D i t t o—〇 s配列およびその隣接領域を増幅するためのプライマー対図 16に示すように各々設計した （配列番号 58— 61) 。 これらのプライマー対 を用い、 あそみのり、 K a s a 1 a t hおよび I R 24のゲノム DNAを铸型と し、 実施例 1の場合と同様に PCRを行い、 塩基配列を解読した。
結果および考察 各品種の P CR産物の塩基配列を比較した結果を図 17—図 1 8および配列番 号 62— 67に示す。 図 1 7 (配列番号 62— 64) は D i t t o— O s l領 域、 そして図 18 (配列番号 65 - 67) は D i t t o— O s 2領域を示す。
1 ) D i t t o— O s 2領域
D i t t o—〇 s 2用プライマーを用いた場合には、 3品種間で PCR産物長 多型が観察された。 具体的には、 図 1 8に示されるように、 PCR産物長があそ みのりでは 267塩基対、 K a s a 1 a t hでは 246塩基対、 そして I R 24 では 3 1 2塩基対であった。 これは、 D i t t o_〇 s 2配列内に、 あそみのり では 1ケ所、 Ka s a 1 a t hでは 2ケ所の欠失があることが、 多型の原因であ ることが示された。 この P CR産物の長さの差に基づく多型を AL Pマーカーと して、 あそみのり一 I R 24の R I L 7 1個体を用いてマッピングを行うことに より、 R I COSH 1 (D i t t o— O s 2) 座が第 3染色体に座乗することが 明らかになった。
2) D i t t o -0 s 1領域
D i t t o— O s 1用プライマーを用いた場合には、 PCR産物長多型は観察 されなかったが、 塩基配列レベルでは多型があることが示された。 D i t t o—
0 s配列およびその周辺領域での多型出現頻度は、 通常の RFLPマーカ一対応 ゲノム配列のそれより高い傾向にあり、 転移因子の隣接領域は品種間変異に富ん でいる可能性が示唆された。
D i t t o -O s 1領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多型検出 用マーカ一を作成した。 具体的には、 図 17に示されるように、 あそみのりの D
1 t t o _〇 s 1領域の塩基番号 206 - 209位は 「 GCT」 であるのに対 し、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「^GCT」 であ る。 さらに、 塩基番号 273 - 276位についても、 あそみのりは 「a g c であるのに対し、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「a g c丄」 である。 そこで、 多型検出用マーカーとして、 図 16 A (配列番号 58 および 59) に示した増幅用プライマ一をそのまま用いて、 実施例 1と同様に P CRを行った。 あそみのりの塩基番号 206 - 209および 27 3 - 276に相 当する Ka s a 1 a t hおよび I R 24の塩基配列 「AGCT」 は制限酵素 A 1 u Iによって認識される。 また、 あそみのりの塩基配列 29— 3 2および 3 9 _ 42に相当する部分の配列は、 あそみのり、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の 全てにおいて、 「AGCT」 である。 よって、 増幅産物を制限酵素 A 1 u Iで処 理すると、 あそみのり由来の D i t t o— O s 1領域増幅産物は 2力所 （29— 32および 39 - 42) が切断され、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産 物は 4力所 （206— 209および 273— 276、 並びに 29— 32および 3 9 -42) 切断された。
あそみのり— I R 24の R I L 7 1個体を用いてマツピングを行うことによ り、 R I CHS EA (D i t t o—O s l) 座が、 第 1染色体に座乗することが 明らかになった。
実施例 5 p— S I NE 1を利用したマーカー開発
材料および方法
p— S I NE l— r l〜r 7は M o c h i z u k i ら （1 992、 上述） に記 載されている転移因子である。 各 p— S I NE 1配列 （p— S I NE 1— r 1な いし一 r 7) およびその周辺領域を増幅するためのプライマ一対を Mo c h i z u k i らの文献に基づいて各々合成した （p_S I NE l— r 4、 — r 5および r 7について配列番号 68— 73) 。 これらのプライマ一対を用い、 あそみの り、 K a s a 1 a t hおよび I R 24のゲノム DN Aを錡型とし、 実施例 1と同 様に PC Rを行い、 塩基配列を解読した。
結果および考察
各品種の P CR産物の塩基配列を比較した結果を図 1 9一図 2 5および配列番 号 74— 94に示す。 図 19 (配列番号 74— 76) は； — S I NE 1— r l領 域、 図 20 (配列番号 77— 7 9) は p— S I NE 1— r 2領域、 図 2 1 (配列 番号 80— 82) は p— S I NE 1 - r 3領域、 図 22 (配列番号 83— 8 5) は p— S I NE l— r 4領域、 図 23 (配列番号 86— 88) は p— S I NE 1 一 r 5領域、 図 24 (配列番号 89— 9 1) は p— S I NE 1— r 6領域、 そし て図 25 (配列番号 92— 94) は p _ S I NE 1— r 7領域を示す。
p_S I NE 1— r 3領域に関しては、 3品種間での多型は皆無であった。 p — S I NE 1— r l、 -S I NE l - r 2および P— S I NE 1— r 6領域に 関しては、 あそみのり— K a s a 1 a t h間では多型が散在していたが、 あそみ のり一 I R 24間では多型は皆無であった。 p— S I NE l— r 4、 p - S I N E 1— r 5および p— S I NE 1 - r 7領域に関しては、 あそみのり— I R 24 間で多型が観察された。 これらの多型出現頻度は、 既述の M I TE領域と比較す ると低いが、 通常のゲノム配列と比較するとはるかに高いものであった。 このこ とから、 M I TE領域だけでなく、 p— S I NE 1領域も品種間変異に富んでい る可能性が示唆された。
1) p— S I NE l - r 4領域
- S I NE l— r 4領域については、 あそみのりと Ka s a l a t hおよび I R 24との間の多型を利用して、 d CAP Sの手法を用いて多型検出用マーカ —を作成した。
具体的には、 図 22に示されるように、 あそみのりの p— S I NE 1— r 4領 域の塩基番号 82 - 85位は 「GGGTj であるのに対し、 K a s a 1 a t hの 相当する位置の塩基は 「AAT」 であり、 I R 24の相当する位置の塩基は 「G GT」 である。 そこで多型検出用マ一力一として図 26 A (配列番号 95および 96) に示したプライマ一を作成し、 上記と同様に P CRを行った。 配列番号 9 5および 96の配列は、 各々図 22 (配列番号 83) に記載のあそみのりの配列 の塩基番号 60— 86および 223 - 246に相当するが、 配列番号 95の塩基 配列を有する 5' —プライマ一は、 塩基番号 84の 「a] を 「c」 に置換するよ うに設計されている。 これらの多型検出用マーカ一をプライマ一として用いるこ とにより、 各々図 22 (配列番号 83— 85) に記載の配列の 60— 246が増 幅されるが、 3 ' —プライマーによる上記置換により、 あそみのりの配列の塩基 84— 94のみ rc CGCTC AGGGGJ となり、 Ka s a l a t hおよび I R 24の配列は各々 rc CGCTCAGAAJ および 「C CGCTCAGGGJ となる。 あそみのりの塩基配列 84_ 94 fCCGCTCAGGGGj は、 制限 酵素 B s 1 I ( rc CNNNNNNNGGJ を認識） によって認識される。 ま た、 あそみのりの塩基配列 109— 1 19に相当する部分の配列は、 あそみの り、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の全てにおいて、 「CCNNNNNNNG G」 である。 よって、 増幅産物を制限酵素 B s 1 Iで処理すると、 あそみのりの P - S I NE 1 - r 4領域増幅産物は 2力所 （84— 94および 10 9— 1 1 9 の双方） が切断され、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の増幅産物は 1力所のみ (109 - 1 1 9のみ） 切断された。
2) p -S I NE l - r 5領域
p-S I NE l - r 5領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多型検 出用マーカーを作成した。 具体的には、 図 23に示されるように、 あそみのりの p-S I NE 1 - r 5領域の塩基番号 85— 88位は 「ITAG」 であるのに対 し、 K a s a 1 a t hおよび I R 24の相当する位置の塩基は 「 TAG」 であ る。 そこで、 多型検出用マーカーとして、 図 26 B (配列番号 97および 98) に示したプライマ一を作成し、 実施例 1と同様に P CRを行った。 配列番号 97 および 98の配列は、 各々図 23 (配列番号 8 6) に記載のあそみのりの配列の 塩基番号 3 - 26および 168— 190に相当し、 これらの多型検出用マーカ一 をプライマ一として用いることにより、 各々図 23 (配列番号 86— 88) に記 載の配列の 3 - 1 90が増幅される。 Ka 1 a s a t hおよび I R24の塩基番 号 85— 88位の配列 「CATG」 は、 制限酵素 B f a Iによって認識される。 また、 あそみのりの塩基配列 64— 67に相当する部分の配列は、 あそみのり、 Ka s a l a t hおよび I R 24の全てにおいて、 「CTAG」 である。 よつ て、 増幅産物を当該制限酵素で処理すると、 K a s a 1 a t hおよび I R 24由 来の p— S I NE 1— r 5領域増幅産物は 2力所 （8 5— 88および 64— 67 の双方） が切断され、 あそみのりの増幅産物は 1力所のみ （85— 88のみ） 切 断された。
3) p— S I NE 1— r 7領域
p - S I NE 1 - r 7領域については、 通常の CAP Sの手法を用いて多型検 出用マ一力一を作成した。 具体的には、 図 25に示されるように、 1 24の 一 S I NE 1— r 7領域の塩基番号 65— 69位は 「c t t a g」 であるのに対 し、 あそみのりおよび K a s a 1 a t hの相当する位置の塩基は 「 a g t a g g a t t a gj と間に余分な塩基が 7つ入っている。 そこで、 多型検出用マーカ 一として、 図 26 C (配列番号 99および 100) に示したプライマ一を作成 し、 実施例 1と同様に P CRを行った。 配列番号 99および 100の配列は、 各々図 25 (配列番号 92) に記載のあそみのりの配列の塩基番号マイナス 1 7 ないし 7および 7 3 - 96に相当し、 これらの多型検出用マーカ一をプライマ一 として用いることにより、 各々図 25 (配列番号 92— 94) に記載の配列のマ ィナス 1 7— 96が増幅される。 I R 24の塩基番号 65 - 69位の配列 「c t t a g」 は、 制限酵素 Dd e l ( 「CTNAG」 を認識） によって認識される。 よって、 増幅産物を当該制限酵素で処理すると、 I R 24由来の p— S I NE 1 一 r 7領域増幅産物は切断されるが、 あそみのりおよび K a s a 1 a t hの増幅 産物は切断されなかった。
あそみのり一 I R 24の R I L (R i c omb i n an t i nb r e d 1 i n e) 71個体を用いてマッピングを行うことにより、 p— S I NE l— r 4 座、 p— S I NE 1— r 5座および p— S I NE 1— r 7座が、 すべて第 2染色 体に座乗することが明らかになった。 本明細書において、 以下の文献を引用し、 参照する。
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Claims

請求の範囲
1 · 植物ゲノム中の転移因子および/またはその隣接領域の塩基配列を利用 して核酸増幅用プライマ一を作成すること含む、 植物ゲノム中の多型検出用マー カーの作成方法。
2 . i ) 標的植物種のゲノム中に存在する転移因子およびその隣接領域の塩 基配列に基づいて上記転移因子、 または転移因子と隣接領域の双方を増幅するよ うにプライマ一対を作成し；
i i ) 標的植物種のゲノム D N Aを铸型として核酸増幅反応を行い；そして i i i ) 前記核酸増幅産物に見出された多型に基づいて、 植物ゲノム中の多型 検出のためのマーカーを作成する
ことを含む、 請求項 1に記載の多型検出用マーカーの作成方法。
3 . i i i ) のマーカー作成工程において、 以下の：
a ) 前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合、 当該 欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、 多型 検出用マーカーとする ；
b ) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存 在する場合、 当該塩基置換部位の両側に置換部位を挟むように核酸増幅用プライ マー対を作成し、 多型検出用マ一カーとする； または
C ) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が 存在する場合、 当該塩基置換部位を含み、 そして、 当該塩基置換部位を含む領域 を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更するよう なミスマッチ導入用プライマー対を作成し、 多型検出用マーカ一とする ； のいずれかの手段を含む、 請求項 2に記載の多型検出用マーカーの作成方法。
4 . i ) および i i i ) のプライマー対の作成において、 以下の条件 1 ) 一 5 ) ：
1 ) 各プライマーの長さが 1 5— 3 0塩基であること；
2 ) 各プライマ一の塩基配列中の G + Cの割合が 3 0— 7 0 %であること； 3) 各プライマーの塩基配列中の A、 T、 Gおよび Cの分布が部分的に大き く偏らないこと ；
4) プライマー対によって増幅される核酸増幅産物の長さが 50— 2000 塩基であること ；ならびに
5) 各プライマー自身の塩基配列中、 又はプライマー同士の塩基配列間に相 補的な配列部分が存在しないこと
が満たされる、 請求項 2又は 3のいずれか 1項に記載の多型検出用マ一カーの作 成方法。
5. 工程 i i ) における核酸増幅が複製連鎖反応によって行われる、 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の多型検出用マ一力一の作成方法。
6. 標的植物が単子葉植物である、 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載 の多型検出用マーカーの作成方法。
7. 標的植物がイネである、 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の多型 検出用マーカーの作成方法。
8. 転移因子が、 M I TE (微小逆向反復転移因子） 又は S I NE (短散在 核因子） に属する転移因子である、 請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の多 型検出用マ一カーの作成方法。
9. 請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の作成方法によって作成され た、 植物ゲノム中の多型検出用マーカー。
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