WO2002009680A2 - Pharmakologisch wirksame substanz zur behandlung kardiovaskulärer erkrankungen - Google Patents

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Definitions

  • Cardiovascular diseases in the form of heart attacks, strokes and peripheral vascular occlusions are among the main causes of death in industrialized countries.
  • the arteriosclerosis underlying these diseases i.e.
  • the increasing vasoconstriction is a multi-factorial process in which the deposition of cholesterol in vascular wall cells plays a central role.
  • high blood pressure and increased LDL (low-density lipoprotein) cholesterol concentrations, reduced HDL (high-density lipoprotein) cholesterol concentrations are among the factors favoring arteriosclerosis (D Gordon & BM Rifkind, ( 1989), New England Journal of Medicine 321: 1311-1315).
  • apolipoprotein Al the main structural protein of HDL
  • concentration of apolipoprotein Al (Apo Al) is an indicator of the risk of developing cardiovascular diseases (JJ Maciejko, et al., (1983), New England Journal of Medicine, 309: 385-9 ; P Puchois, et al., (1987) Atherosclerosis, 68: 35-40).
  • Low Apo Al concentrations indicate an increased risk
  • high Apo AI concentrations indicate a rather low risk.
  • LDL and HDL play an inverse role in the deposition of cholesterol in vascular wall cells. While high LDL concentrations lead to an increased deposition of cholesterol in vascular wall cells by transporting cholesterol to the peripheral cells and thus favoring atherosclerosis, high HDL concentrations exert a protective, ie anti-arteriosclerotic, effect.
  • the anti-arteriosclerotic effect of HDL is attributed to the so-called reverse cholesterol transport (RCT; S Eisenberg, (1984), Journal of Lipid Research 25: 1017-1058), in which cholesterol is mobilized from peripheral cells via HDL mediation, in order to subsequently Liver transported and converted there into bile acids and excreted in the bile.
  • RCT reverse cholesterol transport
  • Cholesterol uptake occurs either via a diffusion-like process, which can also be induced by other cholesterol acceptors circulating in the blood, such as albumin, or via an HDL-specific, receptor-dependent process (WJ Johnson et al., (1991) , Biochimica Biophysica Acta 1085: 273-298; GH Rothblat et al., (1999), Journal of Lipid Research 40: 781-796; JF Oram & S Yokoyama, (1997), Journal of Lipid Research 37: 2473-2482) , The mediation of the receptor interactions and the subsequent activation of cellular signal cascades takes place through the Apo A-1.
  • the known therapy concepts for the treatment and prevention of arteriosclerosis essentially aim to reduce LDL and its precursor VLDL (very low density lipoproteins).
  • VLDL very low density lipoproteins
  • fibrates or nicotinic acid derivatives which reduce the concentration of plasma glycerides and plasma cholesterol by reducing the synthesis and by increasing the breakdown of potentially antherogenic VLDL.
  • the application of these substances only has a side effect of an increase in the HDL concentration, which may can be attributed to the fact that lipolysis generates the triglyceride-rich VLDL and HDL precursors.
  • RCT Joint Photographic Component, asenofibstructive fibroblasts, and others.
  • Fibrates may also induce Apo Al synthesis (ML Kashyap, (1998), American Journal of Cardiology 82: 42U-48U).
  • HMG-CoA reductase inhibitors also tries to inhibit HMG-CoA reductase, the key enzyme of choleristin biosynthesis, and to increase the expression of the LDL receptors in the liver to achieve a reduction in the LDL concentration.
  • statins can achieve a reduction in the potentially antherogenic LDL cholesterol by up to 60% (D Waters, et al., (1996), American Journal of Medicine 101: 4A34S-38S; The Lancet, (1996), 348 : 1339-1342; Cullen & G Assmann, (1997) American Journal of Cardiology 15: 1287-1294).
  • the HDL concentration is not modulated by the application of statins, or the application of these substances merely has a (slight) increase in the HDL concentration as a side effect.
  • Probucol is applied as a lipid-lowering agent. Probucol with its antioxidant effect counteracts a chemical modification of lipoproteins and thus lowers their atherogenic potential. However, this is accompanied by a visible reduction in the positive HDL concentration.
  • ACAT acyl: CoA cholesterol acyltransferase
  • the object of the invention is to provide substance for the production of a medicament and a therapeutic concept which enables improved therapy and prevention of arteriosclerosis and the cardiovascular diseases caused thereby, in particular heart attack, stroke and peripheral vascular occlusions.
  • This object is achieved by the use of serine / threonine protein phosphatase inhibitors for the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of arteriosclerosis and cardiovascular diseases.
  • the invention is based on the idea of regulating the activity of these phosphatases and thus stimulating the RCT by applying serine / threonine-specific protein phosphatase inhibitors.
  • the stimulation of the RCT by serine / threonine-specific protein phosphatase inhibitors is based on the following mechanism:
  • Cholesterol mobilization via the RCT presupposes that HDL-associated or free Apo Al bind to a G protein-coupled receptor and thus can activate membrane-bound lipases, for example the phospholipases C and D and adenyl cyclases.
  • DAG diacylglycerol
  • PA phosphatidic acid
  • cAMP protein kinases
  • serine / threonine-specific protein kinase C which can subsequently induce the phosphorylation of at least five different phosphoproteins, including the ATP cassette transporter ABC-1.
  • the phosphorylation of these proteins activates the transport of intracellularly stored cholesterol rins to the cell surface, from where the cholesterol can be taken up by free Apo Al or non-specific cholesterol acceptors, such as albumin, and transported to the liver.
  • serine / threonine-specific protein phosphatases can regulate this signal cascade by dephosphorylating the serine / threonine amino acid residues and thus controlling the activity of the corresponding enzymes (D Barford, (1996), Trends in Biochemical Science 21: 407-412).
  • the essence of the invention is now to inhibit these serine / threonine-specific protein phosphatases, and thus to increase the transport of the cholesterol out of the cell.
  • the use according to the invention of the serine / threonine-specific protein phosphatase inhibitors can significantly increase the net cholesterol efflux. This increase can be, for example, 6 to 8 times the efflux of untreated cells. It has been shown that the application of Ser / Thr-PP inhibitors in cultured human fibroblasts within a 2-hour incubation period can lead to a mobilization of up to 30% of the total cellular cholesterol, which - compared to the Efflux exclusively in Presence of albumin - a 6-fold increase. An 8-fold increase in the mobilization of intracellularly stored cholesterol in medium containing albumin can be demonstrated by pulse-chase incubation with 14 C-mevalonolactone or 14 C-acetate.
  • the serine / threonine-specific protein phosphatase inhibitors can have a concentration-dependent effect which is in the nanomolar to micromolar range, so that pharmacological use is possible.
  • An important advantage of the use according to the invention is that the Ser / Thr-PP inhibitors correspond in their specificity and effectiveness to the activity of apolipoprotein-I and can even exceed its effectiveness. This has the further advantage that the signal cascade inducing the specific cholesterol efflux can be modulated by the Ser / Thr-PP inhibitors. In cultured cells, the application of Ser / Thr-PP inhibitors can achieve hyperphosphorylation of the same proteins that are also phosphorylated by apolipoprotein-I.
  • These can be, for example, 5 phosphoproteins, each with 14, 18, 65, 71 or 250 kD, of which the 250 kD protein has been identified as an ATP cassette transporter. Furthermore, the effect of Apo Al and also of Ser / Thr-PP inhibitors can be inhibited by Ser / Thr kinase inhibitors.
  • Another advantage of the use of the Ser / Thr-PP inhibitors according to the invention is their antiproliferative effect. This can be used particularly positively if the antiproliferative effect of the Ser / Thr-PP inhibitors can compensate for the mitogenic effect of the HDL. This effect can be used particularly in influencing the pathogenesis of arteriosclerosis development, since growth processes play an important role in this. Since the Ser / Thr-PP inhibitors show an even stronger antiproliferative effect than Apo A-1 and e.g. can inhibit the bromdeoxyuridine incorporation in replicating DNA at least 2-3 times more effectively than Apo A-1, the use according to the invention can also be advantageous in the treatment of other proliferative processes, e.g. of malignant tumors and benign tumors.
  • the use according to the invention can not only be used advantageously in the prevention of arteriosclerotic changes and thus for the prevention of cardiovascular events, but can also be used on the basis of: Their principle of action also includes the breakdown of already existing changes in the vessel walls and arteriosclerotic piaques and other pathological lipid accumulations, for example in the context of
  • composition according to the invention can be used for the production of a medicament for the treatment of Tangier disease.
  • Tangier disease is based on a cellular defect in Apo Al-mediated cholesterol mobilization and HDL formation, which is associated with a disruption in Apo Al-mediated signal transmission (M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications 205: 850-856; Francis, et al., (1995), Journal of Clinical Investigation 96: 78-87; M. Walter et. Al. (1996), Journal of Clinical Investigation 98: 2315-2323). This may be due to an ABC-1 deficiency caused by a stop codon mutation, for example. For example in Tangier patients who still have residual activities in specific cholesterol efflux, e.g.
  • Ser / Thr-PP inhibitors can open up considerable therapeutic improvements. Since Ser / Thr-PP inhibitors can still have considerable residual activity in cholesterol reflux enhancement of at least 60% even with complete ABC-1 deficiency, therapy of homozygous Tangier patients is also possible.
  • the Ser / Thr-PP inhibitors are combined with other pharmacologically active substances, for example with ACAT inhibitors, since the resulting synergy effects can considerably improve the therapy of arteriosclerotic diseases.
  • ACAT inhibitors these are based on the increased availability of cellular cholesterol, which can subsequently be removed from the cell by the application of the Ser / Thr-PP inhibitors.
  • statins can also lead to a significant improvement in therapy. As already stated, statins lower the proportion of "harmful" cholesterol, while hardly influencing the HDL concentration.
  • Ser / Thr-PP inhibitors can also be used advantageously in other HDL deficiency syndromes, such as e.g. Apo A-1 synthesis defects, Apo A-I mutations with reduced HDL cholesterol, LCAT (lecithin: cholesterol acyltransferase) deficiency in fish eye disease, lipoprotein lipase deficiency or other HDL deficiency syndromes.
  • Apo A-1 synthesis defects Apo A-I mutations with reduced HDL cholesterol
  • LCAT lecithin: cholesterol acyltransferase
  • Ser / Thr-PP inhibitors can be used for the production of a medicament for the treatment of diabetes mellitus.
  • Ser / Thr-PP inhibitors can also be frequently used here Diabetes patients observed that HDL cholesterol concentrations were reduced and counteracted and thus positively influence the associated premature development of arteriosclerosis.
  • Ser / Thr-PP inhibitors can thus also advantageously be used in the therapy of other symptoms of diabetes, for example in the case of a pathogenesis of non-insulin-dependent diabetes due to an increased activity of Ser / Thr-specific protein phosphatases and an increased glycogen incorporation including the associated excess weight (RN Margolis (1987), Life Sciences 41: 2615-1622).
  • Ser / Thr-PP inhibitors according to the invention is their hyperphosphorylation of the ATRP cassette transporters, in particular the ABC-1 inducing effect.
  • Ser / Thr-PP inhibitors can therefore advantageously be used in therapeutic approaches for treating treatment of cystic fibrosis, adrenoleukodystrophy, retinitis pigmentosa, sideroblast anemia, ataxia, Stargardt disease and other inherited intrahepatic cholestases.
  • Ser / Thr-PP inhibitors are selected from the group of the following substances: cantharidine, calyculin, okadic acid, endothall and their derivatives, for example norcantaridin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles Medium
  • fibroblast basal medium Bio Whittacker
  • mevalonolactone 1 mg / ml bovine serum albumin
  • antibiotics / antifungals 1% antibiotics / antifungals. Solution (Sigma).
  • Apo Al is prepared by HPLC as described in A by Eckardstein et al., (1990), Journal of Biological Chemistry 265: 8610-8617.
  • the cells After loading the cells with the cholesterol precursor molecule mevalonolactone, the cells are washed with PBS-albumin (PBS with 1 mg / ml albumin) and for 2 h at 37 ° C. in bicarbonate-free DMEM-Hepes, 1 mg / ml albumin with different concentrations HDL, Apo Al or corresponding phosphatase inhibitor incubated. After the two-hour incubation period, the efflux media are collected, the cell layers are washed with 1 ml PBS albumin and the washing solution is combined with the efflux media. The cholesterol mass in the efflux media is measured by gas chromatography according to P Cullen et al., (1997), Analytical Biochemistry, 251: 39-44.
  • 5 ⁇ g 5b-cholestan-3a-ol is added to the efflux media as an internal standard.
  • the cholesterol measurement is carried out with a Dani 8521 gas chromatograph (Monza, Italy), equipped with a programmable injector (PTV), a CP-Wax 57CB silica capillary column (25 mx 0.32 mm ID, 0.2 ⁇ m film thickness, Chromspec, Bridgewater , NJ), a flame ionization detector and a chromatogram data pro processor MT2 (Kontron, Neufahm).
  • the cellular free and esterified cholesterol is separated according to P Cullen et al., (1997), Journal of Lipid Research, 38: 401-409 in the HPLC method, using a Kontron system (Neufahrn, Germany) and a 3 ⁇ m Spherisorb ODS2 250 x 4 mm column (Phase Separations, Queensferry, UK) is used.
  • the mobilization of intracellularly stored cholesterol is carried out after separation of the cholesterol derivatives in efflux medium and cell extracts and evaluation using a phosphoimager, after the cells have been previously marked with 10 ⁇ Ci 14 C-acetate or 14 C-mevalonolactone using the pulse-chase technique, as in M Walter et al., (1994) Biochemical, Biophysical Research Communications, 205: 850-856.
  • Calyculin, cantharidin, okadaic acid, tyrphostin A25 or vanadate can be obtained from Calbiochem (Bad Soden, Germany). All radionuclides can be supplied by Amersham (Braunschweig, Germany). All other reagents are available from Sigma (Deisenhofen, Germany) in the highest possible purity.
  • the cells are washed twice in phosphate-free solution (Na + Hepes buffer), consisting of 132 mM NaCl, 4.8 mM KCI, 1.2 mM MgCl 2 , 10 mM glucose, 10 mM Hepes and 2.5 mM sodium pyruvate, pH 7.4, at 37 ° C washed and incubated with 5mCi 32 P-labeled orthophosphate for 2 h at 37 ° C.
  • Na + Hepes buffer consisting of 132 mM NaCl, 4.8 mM KCI, 1.2 mM MgCl 2 , 10 mM glucose, 10 mM Hepes and 2.5 mM sodium pyruvate, pH 7.4, at 37 ° C washed and incubated with 5mCi 32 P-labeled orthophosphate for 2 h at 37 ° C.
  • the gels are made after the run dried, and the radioactivity incorporated into the respective phosphoproteins is quantified with a phosphoimager and evaluated with the ImageQuant software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) (J Neumann et al., (1993), American Journal of Physiology 265: H257-266) , ABC-1 is identified in 32 P- and 33 P-labeled cell extracts using an antipeptide antibody by immunoprecipitation and subsequent electrophoretic separation.
  • American Type Culture Collection THP-1 monocytes are cholesterol-loaded with acetyl-LDL (100 ⁇ g / ml; 24 h). The cells are labeled with 100 ⁇ Ci / ml 33 P for 4 h, washed and incubated with the phosphatase inhibitors for 30 min. The reaction is stopped by adding 0.05 M NaOH.
  • the influence of Apo A-1, HDL and phosphatase inhibitors on the growth of the cells is followed by measuring the DNA synthesis.
  • the bromdeoxyuridine (BrdU) incorporation in DNA is quantified using an ELI SA test kit (Röche, Mannheim).
  • Fibroblasts are sown in the ELISA wells and incubated in DMEM, 10% FCS for 6 h. After washing the cells and incubation in DMEM, 1 mg / ml albumin for 20 h, a further 20 h incubation in the presence of HDL, 10% FCS, Apo A-1 or albumin (control) is connected.
  • the peroxidase-coupled antibody is added for 2 h.
  • the installation rate is measured using immunofluorescence with a Dynatech MR600 device at 450 nm.
  • Phosphorylase-phosphatase activity is measured by releasing 32 P from phoshorylase a in fibroblast homogenates in the absence and presence of various inhibitor concentrations, according to an established methodology (J. Neumann et al., (1993), American Journal of Phy- siology 265: H257-266).
  • the incubation mixture contains 0.1 mM E DTA, 5mM caffeine, 20 mM Tris HCl (pH 7.0 at 37 ° C) and 0.1% ß-mercaptoethanol.
  • the reaction is started by adding homogenate and stopped by adding 50% trichloroacetic acid.
  • the precipitated protein is centrifuged off (14000 g, 4 ° C., 5 min) and the radioactivity is measured in TriCarb (Ganbesra-Packard).
  • the net cholesterol outflow from human fibroblasts is shown 4 hours after the addition of Apo A-1 or Ser / Thr-PP inhibitors in the presence of 1 mg / ml albumin.
  • the total cholesterol mass in the cell culture supernatant is measured by gas chromatography.
  • the cholesterol outflow in the presence of albumin alone is defined as a 100% value.
  • the 100% value is 1.7 ⁇ g cholesterol per mg cell protein.
  • Fibroblast cultures are grown to pre-confluence in 60 mm cell culture plates and loaded with the cholesterol precursor mevalonolactone. The cultures were incubated in DMEM, either without addition or with 1 mg / ml bovine albumin plus the stated concentrations HDL, Apo Al, Calculin A, cantharidin, okadaic acid for 4 h at 37 ° C. After incubation, free cholesterol (FC) and esterified cholesterol (VC) were measured using the HPLC methodology described above. The total cholestrin (GC) is formed from the sum of FC and VC mass. The cholesterol mass is given as ⁇ g cholesterol per mg cell protein.
  • the results are mean values ⁇ SD of three culture plates.
  • the change in cholesterol mass ( ⁇ ) is calculated as the difference between cholesterol-loaded cells, each with and without an additive (the relative changes are given in% in brackets). * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, compared to cholesterol-loaded cells with no additive.
  • the outflow of de novo synthesized intracellular cholesterol from human fibroblasts is shown 4 hours after the addition of Apo Al or Ser / Thr-PP inhibitors in the presence of 1 mg / ml albumin.
  • the intracellular cholesterol is marked with [ 14 C] -MevaIonolacton.
  • the cholesterol outflow in the presence of albumin alone is defined as 100%, measured in dpm.
  • Cell growth is measured using an ELISA kit by BrdU incorporation in replicating DNA.
  • the incorporation rate is determined by quantifying the immunofluorescence of a peroxidase labeled anti-BrdU antibody determined (at 450 nm). The 100% value corresponds to the incorporation rate in the presence of albumin.
  • FIG. 1a shows the influence of Ser / Thr-PP inhibitors on the degree of phosphorylation of Apo A-1-sensitive phosphoproteins (that is, of proteins which are phosphorylated by Apo A-1).
  • the degree of phosphorylation is measured after a 30-minute incubation in the presence of calyculin A (A), okadaic acid ( ⁇ ) or cantharidin (O).
  • the basal level of phosphorylation in the presence of albumin is defined as 100%.
  • FIG. 1b shows the influence of cantharidin (CANT) on Apo Al-sensitive Phosphoproteins in fibroblasts of a healthy control person and a homozygous Tangier patient with complete ABC1 deficiency in unloaded and cholesterol-loaded (CHOL +) cells.
  • CBD cantharidin
  • cantharidin induces an increased phosphorylation of the Apo Al-sensitive phosphoproteins and behaves like Apo Al in this respect.
  • ABC-1 phosphorylation is completely eliminated in this patient due to complete ABC1 deficiency.
  • the other Apo Al-sensitive phosphoproteins are also at least partially phosphorylated in Tangier cells. These proteins have so far not been identified and are therefore indicated with their estimated molecular weight.
  • FIG. 2 shows the influence of calyculin A (a), okadaic acid (b) and cantharidin (c) on the phosphorylase phosphatase activity in cell homogenates of human skin fibroblasts.
  • the phosphorylase phosphatase activity was measured as described in the text section and stated as% of the control (DMSO).

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmakologisch wirksame Substanz zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen, insbesondere zur Prävention und Therapie von Arteriosklerose.

Description

"Pharmakoloqisch wirksame Substanz zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen"
Kardiovaskuläre Erkrankungen in Form von Herzinfarkt, Schlaganfall und peripheren Gefäßverschlüssen zählen in den Industrienationen zu den Haupttodesursachen. Die diesen Erkrankungen zugrundeliegende Arterios- klerose, d.h. die zunehmende Gefäßeinengung, ist ein multifaktoriell über Jahrzehnte ablaufender Prozess, bei dem die Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen eine zentrale Rolle spielt. Neben Rauchen, Bluthochdruck und erhöhten LDL-(Low-Density-Lipoprotein)-Cholesterin-Konzentrationen zählen erniedrigte HDL-(High-Density-Lipoprotein)-Cholesterin-Kon- zentrationen zu den die Arteriosklerose begünstigenden Faktoren (D Gordon & BM Rifkind, (1989), New England Journal of Medicine 321 :1311-1315).
Die Konzentration des Apolipoproteins A-l (Apo A-l), des Hauptstrukturproteins der HDL stellt einen Indikator für das Risiko der Entwicklung kardio- vaskulärer Erkrankungen dar (JJ Maciejko, et al., (1983), New England Journal of Medicine, 309:385-9; P Puchois, et al., (1987) Atherosclerosis, 68:35-40). Dabei deuten niedrige Apo A-l Konzentrationen auf ein erhöhtes Risiko hin, während hohe Apo A-I-Konzentrationen auf ein eher niedriges Risiko schließen lassen. LDL und HDL spielen bei der Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen eine inverse Rolle. Während hohe LDL-Konzentrationen zu einer vermehrten Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen führen, indem sie Cholesterin zu den peripheren Zellen transportieren und damit die Arte- riosklerose begünstigen, üben hohe HDL-Konzentrationen eine protektive d. h. antiarteriosklerotische Wirkung aus.
Die antiarteriosklerotische Wirkung der HDL wird auf den sogenannten reversen Cholesterintransport (RCT; S Eisenberg, (1984), Journal of Lipid Research 25:1017-1058) zurückgeführt, bei dem Cholesterin über eine HDL- Vermittlung aus peripheren Zellen mobilisiert wird, um anschließend zur Leber transportiert und dort zu Gallensäuren umgewandelt und über die Gallenflüssigkeit ausgeschieden zu werden.
Die Cholesterinaufnahme erfolgt entweder über einen diffusionsähnlichen Prozeß, der auch von anderen im Blut zirkulierenden Cholesterinakzepto- ren, wie beispielsweise Albumin, induziert werden kann, oder aber über einen HDL-spezifischen, rezeptor-abhängigen Prozeß (WJ Johnson et al., (1991), Biochimica Biophysica Acta 1085:273-298; GH Rothblat et al., (1999), Journal of Lipid Research 40:781-796; JF Oram & S Yokoyama, (1997), Journal of Lipid Research 37:2473-2482). Dabei erfolgt die Vermittlung der Rezeptorinteraktionen und die nachfolgende Aktivierung zellulärer Signalkaskaden durch das Apo A-l.
Die bekannten Therapiekonzepte zur Behandlung und zur Prävention von Arteriosklerose streben im wesentlichen die Reduktion der LDL und ihrer Vorläufer VLDL (Very-Low-Density-Lipoproteine) an. Dazu ist es beispielsweise bekannt, Fibrate oder Nikotinsäurederivate einzusetzen, die durch eine Verminderung der Synthese und durch einen verstärkten Abbau poten- tiell antherogener VLDL die Konzentration von Plasmatnglyzeriden und Plasmacholesterin senken. Die Applikation dieser Substanzen weist lediglich als Nebeneffekt eine Steigerung der HDL-Konzentration auf, die mögli- cherweise darauf zurückzuführen ist, daß bei der Lipolyse der triglyzeridrei- chen VLDL- und HDL-Vorstufen generiert werden. Diese nehmen nachfolgend auch am RCT teil (J Shepherd, (1993), Postgraduate Medical Journal 69 Suppl 1 : S34-41 ). Möglicherweise induzieren Fibrate zudem die Apo A-l Synthese (ML Kashyap, (1998), American Journal of Cardiology 82: 42U-48U).
Ebenso ist es bekannt, durch die Applikation von lonenaustauscherharzen die Konzentration der potentiell antherogenen LDL zu senken. Dieser Effekt beruht im wesentlichen darauf, daß die lonenaustauscherharze im Darm Gallensäuren binden, die damit dem enterohepatischen Kreislauf entzogen und vermehrt mit dem Stuhl ausgeschieden werden. Der somit erhöhte Entzug von Cholesterin induziert eine Steigerung der LDL-Rezeptorexpres- sion in der Leber, was eine Konzentrationssenkung der LDL zur Folge hat. Aus nicht geklärten Ursachen wird bei diesem Therapieansatz auch die Apo A-l Synthese geringfügig induziert (J Sheperd, (1989), Cardiology 76 Suppl 1 : 65-71 ).
In einem weiteren therapeutischen Ansatz wird durch die Applikation von sogenannten HMG-CoA-Reduktase-lnhibitoren ebenso versucht, über eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase, des Schlüsselenzyms der Choleristin Biosynthese, und über eine Steigerung der Expression der LDL-Rezeptoren in der Leber eine Senkung der LDL-Konzentration zu erreichen. Diese auch als Statine bezeichneten Substanzen können eine Reduktion des potentiell antherogenen LDL-Cholesterins bis zu 60 % erzielen (D Waters, et al., (1996), American Journal of Medicine 101 :4A34S-38S; The Lancet, (1996), 348:1339-1342; Cullen & G Assmann, (1997), American Journal of Cardiology 15:1287-1294). Eine Modulation der HDL-Konzentration durch die Applikation von Statinen erfolgt dagegen nicht, oder die Applikation dieser Substanzen weist lediglich als Nebeneffekt eine (geringgradige) Steigerung der HDL-Konzentration auf. In einem weiteren Ansatz wird Probucol als Lipidsenker appliziert. Probucol mit seiner antioxidativen Wirkung wirkt einer chemischen Modifikation von Lipoproteinen entgegen und senkt damit ihr atherogenes Potential. Damit geht jedoch eine sichtbare Senkung der positiven HDL-Konzentration ein- her.
Diese bekannten therapeutischen Konzepte greifen übereinstimmend an der Senkung der LDL-Konzentration, d. h. des "schädlichen" Cholesterins bzw. der Vorläuferlipoproteine VLDL, an. Eine Steigerung der HDL, d.h. des "nützlichen" Cholesterins, erfolgt dabei bestenfalls in geringem Umfange als unbeabsichtigter Nebeneffekt oder aber es wird einer HDL-Steigerung sogar entgegengewirkt, wie beispielsweise durch die Applikation von Probucol. Eine gezielte Modulation des HDL ist nicht möglich und wird auch nicht angestrebt.
Alternative Strategien versuchen, einer Arteriosklerose-Entwicklung durch den Eingriff in den HDL-vermittelten reversen Cholesterintransport zu begegnen. Dazu wird beispielsweise rekombinant hergestelltes Apo A-l verwandt, das eine vermehrte Cholesterinausscheidung mit dem Stuhl bewirkt (M Eriksson et al., (1999), Circulation 100:594-598). Dazu muß das rekombinante Apolipoprotein in kurzen Abständen intravenös infundiert werden, so daß die Therapie schwierig ist.
Ebenso ist es bekannt, den RCT durch Erhöhung der zellulären Verfügbar- keit von freiem Cholesterin durch Inhibition des Enzyms ACAT (Acyl: CoA- Cholesterin-Acyltransferase) zu erhöhen. ACAT verestert freies Cholesterin in der Zelle und reduziert damit sein atherogenes Potential. Die Inhibition von ACAT beinhaltet somit einen potentiell positiven und einen potentiell negativen Aspekt. Der positive Effekt kommt dann zum Tragen, wenn das vermehrt anflalende freie Cholesterin auch quantitativ die Zelle verlassen kann. Die ACAT-lnhibition könnte jedoch insbesondere bei hohen LDL- Konzentrationen oder nicht ausreichender Effluxkapazität zu einer Schaumzellbildung führen und damit die Arterioskleroseentwicklung sogar begünstigen.
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels und ein therapeutisches Konzept bereitzustellen, das eine verbesserte Therapie und Prävention von Arteriosklerose und die dadurch verursachten kardiovaskulären Erkrankungen, insbesondere Herzinfarkt, Schlaganfall und peripheren Gefäßverschlüssen, ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Serin/Threonin-Pro- tein-Phosphatase-lnhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention von Arteriosklerose und kardiovaskulären Erkrankungen.
Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, durch die Applikation von Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren die Aktivität dieser Phosphatasen zu regulieren und damit den RCT zu stimulieren.
Die Stimulation des RCT durch Serin/Threonin-spezifische Protein-Phos- phatase-lnhibitoren beruht dabei auf folgendem Mechanismus:
Die Cholesterinmobilisierung über den RCT setzt voraus, daß HDL-assozi- iertes oder freies Apo A-l an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor binden und damit membranständige Lipasen, beispielsweise die Phospholipasen C und D sowie Adenylzyklasen aktivieren kann. Dadurch entstehen Second- Messanger wie Diacylglycerin (DAG), Phosphatidsäure (PA) und cAMP. Diese aktivieren anschließend Proteinkinasen, beispielsweise die Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase C, die anschließend die Phospho- rylierung mindestens fünf verschiedener Phosphoproteine induzieren kann, u.a. auch des ATP-Kassettentransporters ABC-1. Die Phosphorylierung dieser Proteine aktiviert den Transport intrazellulär gespeicherten Choleste- rins zur Zelloberfläche, von wo das Cholesterin von freiem Apo A-l oder unspezifischen Cholesterinakzeptoren, wie beispielsweise Albumin aufgenommen und zur Leber transportiert werden kann.
Eine andere Gruppe von Enzymen, die sogenannten Serin/Threonin-spezifi- schen Protein-Phosphatasen (Ser/Thr-PPs) können diese Signalkaskade regulieren, indem sie die Serin/Threonin-Aminosäurereste dephosphospho- rylieren und somit die entsprechenden Enzyme in ihrer Aktivität kontrollieren (D Barford, (1996), Trends in Biochemical Science 21 :407-412).
Der Kern der Erfindung liegt nun darin, diese Serin/Threonin-spezifischen Proteinphosphatasen zu inhibieren, und somit den Transport des Cholesterins aus der Zelle zu erhöhen.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Serin/Threonin-spezifischen Pro- tein-Phosphatase-lnhibitoren (nachfolgend auch Ser/Thr-PP-lnhibitoren) kann den Cholesterin-Netto-Efflux deutlich erhöhen. Diese Erhöhung kann beispielsweise das 6- bis 8-fache des Effluxes von unbehandelten Zellen betragen. So konnte gezeigt werden, daß die Applikation von Ser/Thr-PP- Inhibitoren in kultivierten menschlichen Fibroblasten innerhalb einer nur 2- stündigen Inkubationszeit zu einer Mobilisierung von bis zu 30 % des gesamten zellulären Cholesterins führen kann, was - verglichen mit dem Efflux ausschließlich in Anwesenheit von Albumin - einer 6-fachen Steigerung gleichkommt. Eine 8-fache Steigerung der Mobilisierung intrazellulär gespeicherten Cholesterins in Albumin-haltiges Medium kann durch Pulse- Chase-Inkubation mit 14C-Mevalonolacton oder 14C-Acetat nachgewiesen werden.
Unterhalb eines Sättigungsbereiches können die Serin/Threonin-spezifi- sehen Protein-Phosphatase-Inhibitoren eine konzentrationsabhängige Wirkung zeigen, die im nanomolaren bis mikromolaren Bereich liegt, so daß eine pharmakologische Nutzung möglich ist. Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung liegt darin, daß die Ser/Thr-PP-lnhibitoren in der Spezifität und Effektivität ihrer Wirkung dem Apolipoprotein-I entsprechen und sogar es in seiner Effektivität über- treffen können. Daraus ergibt sich der weitere Vorteil, daß eine Modulation der den spezifischen Cholesterin-Efflux induzierenden Signalkaskade durch die Ser/Thr-PP-lnhibitoren möglich sein kann. So kann in kultivierten Zellen durch die Applikation von Ser/Thr-PP-lnhibitoren eine Hyperphosphorylie- rung derselben Proteine erreicht werden, die auch durch Apolipoprotein-I phosphoryliert werden. Dabei kann es sich beispielsweise um 5 Phosphoproteine mit jeweils 14, 18, 65, 71 oder 250 kD handeln, von denen das 250 kD Protein als ATP-Kassettentransporter identifiziert wurde. Des weiteren kann durch Ser/Thr-Kinase-Inhibitoren swohl die Wirkung von Apo A-l als auch von Ser/Thr-PP-lnhibitoren inhibiert werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP- lnhibitoren besteht in ihrer antiproliferativen Wirkung. Dies kann insbesondere dann positiv genutzt werden, wenn die antiproliferative Wirkung der Ser/Thr-PP-lnhibitoren die mitogene Wirkung des HDL ausgleichen kann. Dieser Effekt kann gerade bei der Beeinflussung der Pathogenese von Arterioskleroseentwicklung nutzbringend eingesetzt werden, da Wachstumsprozesse dabei eine wesentliche Rolle spielen. Da die Ser/Thr-PP-lnhibitoren eine noch weitaus stärkere antiproliferative Wirkung als Apo A-l zeigen und z.B. den Bromdeoxyuridin-Einbau in replizierende DNA noch min- destens 2-3-fach effektiver hemmen können als Apo A-l, kann die erfindungsgemäße Verwendung darüber hinaus vorteilhaft in der Behandlung anderer proliferativer Prozene, also z.B. von malignen Tumoren und gutartigen Geschwülsten, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann nicht nur vorteilhaft in der Prävention arteriosklerotischer Veränderungen und damit zur Prävention von kardiovaskulären Ereignissen eingesetzt werden, sondern kann aufgrund ihres Wirkprinzips auch dem Abbau bereits bestehender Gefäßwandveränderungen und arteriosklerotischer PIaques und von anderen pathologischen Lipidansammlungen, beispielsweise im Rahmen von
Lipidspeichererkrankungen, dienen.
Des weiteren kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Tangier-Krankheit verwendet werden. Der Tangier-Krankheit liegt ein zellulärer Defekt der Apo A-l- vermittelten Cholesterinmobilisierung und der HDL-Bildung zugrunde, womit eine Störung der Apo A-l-vermittelten Signalübertragung verbunden ist (M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications 205:850-856; Francis, et al., (1995), Journal of Clinical Investigation 96:78- 87; M. Walter et. al. (1996), Journal of Clinical Investigation 98:2315-2323). Dies kann beispielsweise auf eine durch eine Stop-Kodon-Mutation verur- sachte ABC-1-Defizienz zurückgehen. Beispielsweise bei Tangier-Patienten, die noch Restaktivitäten im spezifischen Cholesterin-Efflux aufweisen, wie z.B. Patienten mit heterozygoten Mutationen ober bei Mutationen, die nicht mit einer kompletten Funktionseinbuße des ABC-1 einhergehen, kann die Applikation von Ser/Thr-PP-lnhibitoren erhebliche therapeutische Ver- besserungen eröffnen. Da Ser/Thr-PP-lnhibitoren auch bei komplettem ABC- 1 -Mangel noch eine erhebliche Restaktivität bei der Cholesteri- neffluxverstärkung von mind. 60 % aufweisen können, ist darüber hinaus auch die Therapie von homozygoten Tangier-Patienten möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Ser/Thr-PP-lnhibitoren mit weiteren pharmakologisch wirksamen Substanzen kombiniert, beispielsweise mit ACAT-Inhibitoren, da die daraus resultierenden Synergieeffekte die Therapie arteriosklerotischer Erkrankungen erheblich verbessern können. Diese beruhen im Falle der ACAT-Inhibitoren auf der erhöhten Ver- fügbarkeit des zellulären Cholesterins, das durch die Applikation der Ser/Thr-PP-lnhibitoren anschließend verstärkt aus der Zelle abtransportiert werden kann. Auch die Kombination mit Statinen kann zu einer deutlichen Verbesserung der Therapie führen. Statine nämlich, wie bereits ausgeführt, senken den Anteil des "schädlichen" Cholesterins, während sie die HDL-Konzentration kaum beeinflussen. Da die Ser/Thr-PP-lnhibitoren ihrerseits, wie das Apo A- I, den spezifischen Cholesterin-Efflux induzieren, wird durch die simultane Applikation von Ser/Thr-PP-lnhibitoren und Statinen der für die Ausprägung arteriosklerotischer Erkrankungen wesentliche Quotient aus LDL-Cholesterin und HDL-Cholesterin positiv beeinflußt. Er kann in besonders vorteilhafter Weise zur Abschätzung des Erkrankungsrisikos herangezogen werden.
Besonders vorteilhaft kann die Kombination eines oder mehrere Ser/Thr-PP- lnhibitoren mit Medikamenten sein, die als (unerwünschte) Nebenwirkung eine HDL-Konzentrationserniedrigung aufweisen, wie z.B. der Lipidsenker Probucol, aber auch andere Medikamente bzw. Hormone, wie Gestagene, Androgene, Kortikoide, ß-Blocker und Thiaziddiuretika, da eine niedrige HDL-Konzentration und Ser/Thr-PP-lnhibitoren synergistische Effekte zeigen können. Diese können konzentrationsabhängig variieren, und sind beispielsweise bei niedrigen Konzentrationen der Inhibitoren stärker aus- geprägt als bei hohen Konzentrationen.
Aufgrund des vorgenannten Synergieeffektes bei niedrigen HDL- und Inhibitor-Konzentrationen können Ser/Thr-PP-lnhibitoren auch vorteilhaft bei anderen HDL-Mangel-Syndromen eingesetzt werden, wie z.B. Apo A-l- Synthesedefekten, Apo A-I-Mutationen mit herabgesetztem HDL-Cholesterin, LCAT (Lecithin: Cholesterin-Acyltransferase)-Mangel der Fish-Eye- Erkrankung, einem Lipoproteinlipase-Mangel oder anderen HDL-Mangel- Syndromen.
In einer weiteren vorteilhaften Verwendung können Ser/Thr-PP-lnhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Diabetes mellitus verwendet werden. Auch hier können Ser/Thr-PP-lnhibitoren der häufig bei Diabetes-Patienten beobachteten stark erniedrigten HDL-Cholesterin-Kon- zentration entgegenwirken und so die damit einhergehende vorzeitige Arterioskleroseentwicklung positiv beeinflussen.
Diese Wirkung kann darauf zurückgeführt werden, daß die Ser/Thr-PP-lnhibitoren in menschilchen Fibrolasten, die Phosphorylase-Phosphatase, als wichtiges Regulatorenzym des Gluctosestoffwechsels konzentrationsabhängig verstärken. Hinsichtlich der Effektivität weisen einzelne Inhibitoren Unterschiede auf, d.h. so ist Calyculin effektiver als Okadsäure, und das wiederum effektiver als Cantharidin. Es kann daraus abgeleitet werden, daß Ser/Thr-PP-lnhibitoren in menschlichen Haut-Fibrolasten nicht nur die zelluläre Cholesterinhomöostase, sondern auch die Glucosehomöostase beeinflussen, und daß die Beeinflussung der Glucosehomöostase über dieselben Signalwege vermittelt werden, über die auch das Apo A-l einen Chole- sterinefflux induziert.
Vorteilhafterweise können Ser/Thr-PP-lnhibitoren somit auch nutzbringend in der Therapie anderer Symptome des Diabetes eingesetzt werden, beispielsweise bei einer auf eine erhöhte Aktivität Ser/Thr-spezifischer Protein- phosphatasen zurückgehenden Pathogenese des nicht-insulin-abhängigen Diabetes und einer vermehrten Glykogeneinlagerung einschließlich des damit verbundenen Übergewichts (RN Margolis (1987), Life Sciences 41 :2615-1622).
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP-lnhibitoren besteht in ihrer eine Hyperphosphorylierung der ATRP-Kassettentransportern, insbesondere des ABC-1 induzierenden Wirkung.
Erkrankungen, die im wesentlichen auf einen Defekt eines ATP abhängigen Transports zurückzuführen sind, genutzt werden. Erfindungsgemäß können daher Ser/Thr-PP-lnhibitoren vorteilhaft in therapeutischen Ansätzen zur Be- handlung der Cystischen Fibröse, der Adrenoleukodystrophie, der Retinitis pigmentosa, der Sideroblastenanämie, der Ataxie, Stargardt-Krankheit und anderer erblicher intrahepatischer Cholestasen verwendet werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Krankheitsbildern und Defekten in ATP- Kassettentransportern ist in der Literatur beschrieben: T Hoof, et al., Journal of Biological Chemistry 269:20575-20583; V Feigenbaum, et al., (1996), Am J Hum Genet 58:1135-1144; DG Birch, (1999), Mol Genet Metab 66:356- 366; R Allikments, et al., (1999), Hum Mol Genet 8.743-749; R Lewis et al., (1999), Am J Hum Genet 64:422-434; SS Strautnieks, et al., (1998), Nat Genet 20:233-238; M Wada, et al., Hum Mol Genet 7:203-207.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Ser/Thr-PP-lnhibitoren aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt: Cantharidin, Calyculin, Oka- dasäure, Endothall sowie deren Derivate, beispielsweise das Norcanthari- din.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, denen folgende Methodik zugrundeliegt:
1. Verwendete Zellen:
Menschliche Fibroblasten gesunder Kontrollpersonen und zweier homozy- goter Tangierpatienten, sowie Makrophagen der Zellinie THP-1 für die Immunpräzipitation von ABC-1 und Cholesterineffluxmessungen, werden mit üblichen Verfahren gewonnen. Die Gewinnung und Präparation der Fibroblasten ist in verschiedenen Publikationen beschrieben, z.B. M Walter et al., (1995), Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15:1975- 1986; M Walter et al., (1996), Journal of Clinical Investigation 98:2315-2323; M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications, 205:850-856. Die Cholesterinbeladung der etwa 90 % konfluenten Zellen erfolgt 48 h bei 37°C in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) in Anwesenheit von Fibroblasten Basalmedium (Bio Whittacker), 0.5 mM Mevalonolacton, 1 mg/ml bovinem Serumalbumin und 1 % Antibiotika/Antimykotika-Lösung (Sigma).
2. Präparation der Lipoproteine und des Apolipoprotein A-l:
HDL3, die Apo A-l-haltige Hauptfraktion der HDL, wird mittels differentieller Ultrazentrifugation (d=1.125-1.210 g/ml) aus frischem menschlichen Plasma isoliert und gegen 0.3 mM Tris-HCI Puffer (pH 6.8), 0.15 M NaCI, dialysiert. Apo A-l wird mittels HPLC präpariert, wie in A von Eckardstein et al., (1990), Journal of Biological Chemistry 265:8610-8617 beschrieben.
3. Cholesterineffluxmessungen:
Nach Cholesterinbeladung der Zellen mit dem Cholesterinvorläufernnolekül Mevalonolacton werden die Zellen mit PBS-Albumin (PBS mit 1 mg/ml Albumin) gewaschen und für 2 h bei 37°C in bikarbonatfreiem DMEM- Hepes, 1 mg/ml Albumin mit unterschiedlichen Konzentrationen HDL, Apo A-l oder entsprechendem Phosphatase-Inhibitor inkubiert. Nach der zweistündigen Inkubationszeit werden die Effluxmedien gesammelt, die Zelllayer werden mit 1 ml PBS-Albumin gewaschen und die Waschlösung jeweils mit den Effluxmedien vereinigt. Die Cholesterinmasse in den Effluxmedien wird mit Gaschromatographie nach P Cullen et al., (1997), Analytical Biochemi- stry, 251 :39-44 gemessen. 5 μg 5b-cholestan-3a-ol wird zu den Effluxmedien als interner Standard addiert. Nach Derivatisierung mit Trimethylsilylether wird die Cholesterinmessung mit einem Dani 8521 Gaschromathographen (Monza, Italien) vorgenommen, ausgestattet mit einem programmierbaren Injektor (PTV), einer CP-Wax 57CB Silikakapillar- säule (25 m x 0.32 mm ID, 0.2 μm Filmdicke, Chromspec, Bridgewater, NJ), einem Flammenionisationsdetektor und einem Chromatogramm Datenpro- zessor MT2 (Kontron, Neufahm). Das zelluläre freie und veresterte Cholesterin wird nach P Cullen et al., (1997), Journal of Lipid Research, 38:401-409 in der HPLC-Methodik getrennt, wobei eine Kontron Anlage (Neufahrn, Deutschland) und eine 3 μm Spherisorb ODS2 250 x 4 mm Säule (Phase Separations, Queensferry, UK) eingesetzt wird. Die Mobilisierung intrazellulär gespeicherten Cholesterins wird nach dünnschichtgro- matographischer Auftrennung der Cholesterinderivate in Effluxmedium und Zellextrakten und Auswertung mittels Phosphoimager vorgenommen, nachdem die Zellen zuvor mit 10 μCi 14C-Acetat oder 14C-Mevalonolacton mittels Pulse-Chase-Technik markiert werden, wie in M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications, 205:850-856 beschrieben.
Calyculin, Cantharidin, Okadasäure, Tyrphostin A25 oder Vanadat können von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen werden. Alle Radionuklide können von Amersham (Braunschweig, Deutschland) geliefert werden. Alle anderen Reagenzien sind bei Sigma (Deisenhofen, Deutschland) in der höchstmöglichen Reinheit erhältlich.
4. Nachweis der Phosphoproteine:
Die Zellen werden zweimal in phoshatfreier Lösung (Na+-Hepes-Puffer), bestehend aus 132 mM NaCI, 4.8 mM KCI, 1.2 mM MgCI2, 10 mM Glukose, 10 mM Hepes und 2.5 mM Natriumpyruvat, pH 7.4, bei 37°C gewaschen und mit 5mCi 32 P-markiertem Orthophosphat für 2 h bei 37°C inkubiert.
Nach einer 30 minütigen Inkubationsperiode bei 37°C wird die Reaktion mit SDS-Lösung, bestehend aus 62.5 mM Tris, 10 % SDS (w/v), 10 % Glyzerin (v/v), 0,6 % DL-Dithiothreitol (w/v) und Spuren von Bromphenolblau, pH 6.8, gestoppt. Die Proben werden nach kurzer Erhitzung auf 95°C in 100 μl Aliquots (entsprechend 20-30 μg Protein) auf ein 5%-iges, ein 7.5%-iges und ein 10%-iges SDS-Gel aufgetragen. Die Gele werden nach dem Lauf getrocknet, und die in die jeweiligen Phosphoproteine inkorporierte Radioaktivität wird mit einem Phosphoimager quantifiziert und mit der ImageQuant Software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) ausgewertet (J Neumann et al., (1993), American Journal of Physiology 265:H257-266). ABC-1 wird in 32P- und 33P-markierten Zellextrakten mit Hilfe eines Antipeptid Antikörpers durch Immunfällung und anschließender elektrophoretischer Auftrennung identifiziert. THP-1 Monozyten von der American Type Culture Collection werden mit Azetyl-LDL (100 μg/ml; 24 h) cholesterin-beladen. Die Zellen werden mit 100 μCi/ml 33P für 4 h markiert, gewaschen und mit den Phos- phatase-lnhibitoren 30 min inkubiert. Die Reaktion wird durch Zufügen von 0.05 M NaOH gestoppt.
5. Messung des Zellwachstums:
Der Einfluß von Apo A-l, HDL und Phosphatase-Inhibitoren auf das Wachstum der Zellen wird durch Messung der DNA-Synthese verfolgt. Hierzu wird der Bromdeoxyuridin (BrdU) Einbau in DNA mit Hilfe eines ELI SA-Testkits quantifiziert (Röche, Mannheim). Fibroblasten werden in den ELISA Vertiefungen ausgesät und in DMEM, 10 % FCS für 6 h inkubiert. Nach Waschen der Zellen und Inkubation in DMEM, 1 mg/ml Albumin für 20 h wird eine nochmalige 20 h Inkubation in Anwesenheit von HDL, 10% FCS, Apo A-l oder Albumin (Kontrolle) angeschlossen. Entsprechend der Vorschrift des Herstellers wird der Peroxidase-gekoppelte Antikörper für 2 h zugegeben. Die Einbaurate wird mittels Immunfluoreszenz mit einem Dyna- tech MR600 Gerät bei 450 nm gemessen.
6. Messung der Phosphorylase-phosphatase Aktivität:
Die Phosphorylase-phosphatase Aktivität wird durch Freisetzung von 32P aus Phoshorylase a in Fibroblasten-Homogenaten in Ab- und Anwesenheit verschiedener Inhibitor-Konzentrationen gemessen, entsprechend einer etablierten Methodik (J. Neumann et al., (1993), American Journal of Phy- siology 265:H257-266). Das Inkubationsgemisch enhält 0,1 mM E DTA, 5mM Caffein, 20 mM Tris HCI (pH 7.0 bei 37° C) und 0,1 % ß-Mercap- toethanol. Die Reaktion wird durch Zugabe von Homogenat gestartet und durch Zugabe von 50 % Trichloressigsäure gestoppt. Das präzipitierte Protein wird abzentrifugiert (14000 g, 4° C, 5 min) und die Radioaktivität wird in TriCarb (Ganbesra-Packard) gemessen.
Beispiele
Beispiel 1 :
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-l und Ser/Thr-PP-lnhibitoren) auf den Cholesterinefflux aus menschlichen Fibroblasten
Dargestellt ist der Netto-Cholesterinausstrom aus menschlichen Fibroblasten 4 h nach Zugabe von Apo A-l oder Ser/Thr-PP-lnhibitoren in Anwesenheit von 1 mg/ml Albumin. Die gesamte Cholesterinmasse im Zellkultu- rüberstand wird mittels Gaschromatographie gemessen. Der Choleste- rinausstrom in Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert. Der 100% Wert liegen bei 1.7 μg Cholesterin pro mg Zellprotein. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung (n=4).
In Fibroblasten des Tangier-Patienten TD1 mit kompletter ABC1-Defizienz (Patient beschrieben in: S Rust et al., (1999), Nature Genetics 22:352- 355) ist die durch Ser/Thr-PP-lnhibitoren verursachte Cholesterinef- fluxsteigerung abgeschwächt, aber noch vorhanden. In Fibroblasten des Tangier-Patienten TD2 mit inkomplettem Defekt (Patient beschrieben in: M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communica- tions 205:850-856) ist die durch Ser/Thr-PP-lnhibitoren verursachte Cholesterineffluxsteigerung nicht oder nur insignifikant vermindert. Agonist Cholesterinausstrom [%]
Albumin allein Normal-Fibroblasten 100 ±9 Apo A-l, 10 μg/ml Normal-Fibroblasten 141 ±14 Apo A-l, 50 μg/ml Normal-Fibroblasten 159 + 22 Apo A-l, 100 μg/ml Normal-Fibroblasten 183 ±18 Calyculin A, 10 nM Normal-Fibroblasten 130 ±8 Calyculin A, 50 nM Normal-Fibroblasten 226 ± 32 Calyculin A, 100 nM Normal-Fibroblasten 260 ± 27 Cantharidin, 1 μM Normal-Fibroblasten 174 ±6 Cantharidin, 10 μM Normal-Fibroblasten 374 ± 37 Cantharidin, 100 μM Normal-Fibroblasten 429 ± 28 Okadasäure, 1 μM Normal-Fibroblasten 160 ±9 Okadasäure, 10 μM Normal-Fibroblasten 285 ± 37 Okadasäure, 100 μM Normal-Fibroblasten 345 ±17 Endothall, 1 μM Normal-Fibroblasten 125 ±12 Endothall, 10 μM Normal-Fibroblasten 169 + 11 Endothall, 100 μM Normal-Fibroblasten 302 ± 23 Calyculin A, 100 nM Tangier-Fibroblasten, TD1 168 ±11 Cantharidin, 100 μM Tangier-Fibroblasten, TD1 327 ±7 Okadasäure, 100 μM Tangier-Fibroblasten, TD1 210 + 32 Calyculin A, 100 nM Tangier-Fibroblasten, TD2 248 + 28 Cantharidin, 100 μM Tangier-Fibroblasten, TD2 413 ±27 Okadasäure, 100 μM Tangier-Fibroblasten, TD2 298 ± 26
Beispiel 2:
Einfluß von HDL, Apo A-l und Ser/Thr-PP-lnhibitoren auf den zellulären Cholesteringehalt Fibroblastenkulturen werden in 60-mm Zellkulturplatten bis zur Präkonfluenz angezüchtet und mit der Cholesterinvorstufe Mevalonolacton beladen. Die Kulturen wurden in DMEM inkubiert, entweder ohne Zusatz oder mit 1 mg/ml Rinderalbumin plus die angegebenen Konzentrationen HDL, Apo A-l, Caly- culin A, Cantharidin, Okadasäure für 4 h bei 37 °C. Nach der Inkubation wurden freies Cholesterin (FC) und verestertes Cholesterin (VC) mit der oben beschriebenen HPLC-Methodik gemessen. Das Gesamtcholestrin (GC) wird aus der Summe von FC and VC Masse gebildet. Die Choleste- rinmasse wird als μg Cholesterin pro mg Zellprotein angegeben. Die Ergeb- nisse sind Mittelwerte ± S.D. von drei Kulturplatten. Die Veränderung der Cholesterinmasse (Δ) wird als Differenz zwischen Cholesterin-beladenen Zellen, jeweils mit und ohne Additiv berechnet (in Klammern sind die relativen Veränderungen in % angegeben). * p < 0.05, ** p < 0.01 , verglichen mit Cholesterin-beladenen Zellen ohne Additiv.
Cholesterin- - Zugabe GC FC VC GC FC VC
Beladung μg/mg Zellprotein Δ μg/mg Zellprotein
Nein PBS 28.2 26.1 ± 1.3 2.1 ±0.3
Ja PBS 36.9 32.6 ± 1.2 4.3 ± 0.5
Ja 20 μg/ml HDL 33.6 29.7 + 0.6* 3.9 ± 0.5 -3.3 (-9) -2.9 (-9) -0.4 (-9
Ja 10 μg/ml Apo A-l 34.2 30.1 ± 1.3* 4.1 ± 0.3 -2.7 (-7) -2.5 (-8) -0.2 (-5
Ja 100 nM Calyculin 25.0 22.7 ± 1.4** 2.3 ± 1.1* -11.9 (-30) -9.9 (-30) -2.0 (-4
Ja 10 μM Okadasäure 29.2 26.6 ± 2.0** 2.6 + 0.6* -7.7 (-21) -6.0 (-18) -1.7 (-4
Ja 100 μM Cantharidin 26.8 24.7 + 2.6** 2.1 ± 0.9* -10.1 (-27) -7.9 (-24) -2.2 (-5
Beispiel 3:
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-l und Ser/Thr-PP-lnhibito- ren) auf die Mobilisierung intrazellulären Cholesterins.
Dargestellt ist der Ausstrom von de novo synthetisiertem intrazellulärem Cholesterin aus menschlichen Fibroblasten 4 h nach Zugabe von Apo A-l oder Ser/Thr-PP-lnhibitoren in Anwesenheit von 1 mg/ml Albumin. Die Mar- kierung intrazellulären Cholesterins erfolgt mit [14C]-MevaIonolacton. Der Cholesterinausstrom in Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert, gemessen in dpm. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung (n=5).
Agonist Cholesterinausstrom [%]
Albumin allein ^00 ± 11
Apo A-l, 10 μg/ml 762 ± 9
Calyculin A, 470 ± 48
Cantharidin 573 ± 73
Okadasäure 437 ± 36
Endothall 375 ± 97
Beispiel 4:
Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-l und Ser/Thr-PP-lnhibito- ren) auf das Wachstumsverhalten von Fibroblasten
Das Zellwachstum wird mit Hilfe eines ELISA-Kits durch BrdU Einbau in replizierende DNA gemessen. Die Inkorporationrate wird durch Quantifizierung der Immunfluoreszenz eines Peroxidase markierten Anti-BrdU An- tikörpers bestimmt (bei 450 nm). Der 100% Wert entspricht der Inkorporationsrate in Anwesenheit von Albumin.
Agonist BrdU Einbau [%]
Albumin allein 100 ± 3
Apo A-l, 10 μg/ml 96 ± 9
Apo A-l, 50 μg/ml 74 ± 14
Apo A-l, 100 μg/ml 63 ± 8
Calyculin A, 10 nM 30 ± 5
Calyculin A, 50 nM 25 + 2
Calyculin A, 100 nM 32 ± 8
Cantharidin, 1 μM 41 ± 5
Cantharidin, 10 μM 34 ± 6
Cantharidin, 100 μM 26 ± 9
Okadasäure, 1 μM 32 ± 7
Okadasäure, 10 μM 22 ± 4
Okadasäure, 100 μM 17 ± 6
Endothall, 1 μM 84 ± 3
Endothall, 10 μM 74 ± 6
Endothall, 100 μM 58 ± 5
Figur 1
Die Figur 1a zeigt den Einfluß von Ser/Thr-PP-lnhibitoren auf den Phosphorylierungsgrad Apo A-l-sensitiver Phosphoproteine (das heißt von Proteinen, die durch Apo A-l phosphoryliert werden). Der Phosphorylierungsgrad wird nach einer 30-minütigen Inkubation in Anwesenheit von Calyculin A (A ), Okadasäure (■) oder Cantharidin (O) gemessen. Der basale Phosphorylierungsgrad (in Anwesenheit von Albumin) wird als 100% Wert definiert.
Die Figur 1 b zeigt den Einfluß von Cantharidin (CANT) auf Apo A-l-sensitive Phosphoproteine in Fibroblasten einer gesunden Kontrollperson und eines homozygoten Tangierpatienten mit kompletter ABC1-Defizienz in unbela- denen und Cholesterin-beladenen (CHOL +) Zellen. Insbesondere in Cholesterin-beladenen Zellen induziert Cantharidin eine verstärkte Phos- phorylierung der Apo A-l-sensitiven Phosphoproteine und verhält sich in dieser Hinsicht wie Apo A-l. In Tangierzellen ist die ABC-1-Phosphorylierung aufgrund einer kompletten ABC1-Defizienz bei diesem Patienten völlig aufgehoben. Die anderen Apo A-l-sensitiven Phosphoproteine werden auch in Tangierzellen zumindest partiell phosphoryliert. Diese Proteine sind bislang nicht identifiziert und daher mit ihrem geschätzten Molekulargewicht angegeben.
Figur 2
Die Figur 2 zeigt den Einfluß von Calyculin A (a), Okadasäure (b) und Cantharidin (c) auf die Phosphorylase Phosphatase Aktivität in Zellhomo- genaten humaner Hautfibroblasten. Die Phosphorylase Phosphatase Aktivität wurde wie im Textteil beschrieben gemessen und als % der Kontrolle (DMSO) angegeben.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren in einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur thera- peutischen und präventiven Behandlung arteriosklerotischer Erkrankungen.
2. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Serin/Threonin-Pro- teinphosphatase-lnhibitoren aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt sind: Cantharidin, Calyculin, Okadasäure, Endothall, Nor- cantharidin sowie Derivate der vorgenannten Substanzen.
3. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine weitere pharmakologisch wirksame Substanz hinzugesetzt wird.
4. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmakologisch wirk- same Substanz aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt ist:
Statine, ACAT-Inhibitoren, HDL, HMG-CoA-Reduktase-lnhibitoren, Probucol.
5. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven
Behandlung von HDL-Mangel-Syndromen.
6. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe folgender
Erkrankungen: Syndrome verursacht durch Apo A-I-Synthesedefekte oder Apo A-I-Mutationen, LCAT (Lecithin: Cholesterin-Acyltransferase)- Mangel, Fish-Eye-Erkrankung, Lipoproteinlipase-Mangel.
7. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung auf Defekten von ATP-Kassettentransportern beruhender Erkrankungen.
8. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung von Diabetes mellitus.
9. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven
Behandlung gutartiger Geschwulste.
10. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung maligner Tumore.
11. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe folgender Erkrankungen: Cystische Fibröse, Adrenoleukodystrophie, Retinitis pigmentosa, Sideroblastenanämie, Ataxie, Stargardt-Krankheit und erblichen intrahepatischen Cholestasen.
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