WO2001091799A2 - Medicament for the treatment of immune reactions in the eye - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
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    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to a medicament for the gene therapy treatment of corneal diseases of the human or animal eye to suppress transplant rejection.
  • Immune response in which the graft recipient's immune system recognizes the transferred tissue as foreign and develops defense mechanisms that cause the destruction of the transplanted foreign tissue.
  • patients are divided into those with a good prognosis and those with a poor prognosis. 10% of patients with a good prognosis develop an immune reaction and 50% of patients with a poor prognosis develop have an immune response. The consequence of the immune reaction is the clouding of the transplanted cornea and thus renewed blindness.
  • immunosuppressive drugs are used according to the current state of the art.
  • the most important drugs to avoid an immune reaction after corneal transmission are corticosteroids, which are used locally as eye drops on the eye.
  • corticosteroids are used locally as eye drops on the eye.
  • these side effects prevent a higher dosage and thus possibly an improved success rate. For this reason, other options are sought to modulate or prevent the immune response.
  • Cyclosporin A could only have a very slight effect after corneal transfer, but significant side effects could be demonstrated, so that they are used clinically only in exceptional cases.
  • the ratio of effect to possible side effect when using monoclonal antibodies is correspondingly unfavorable.
  • the course of the immune response is partially known.
  • the activity of the immune system can be mediated through several populations of helper and effector cells.
  • the reactions inhibit each other within certain limits and are characterized by the release of response-type-specific cytokines.
  • the immune response after organ transplantation is an essentially cell-mediated (cytotoxic) response of the Th1 type and is accompanied by the expression of the Th1 cytokines IL-2 and IFN-gamma.
  • the predominance of Th2 over Th1 cytokine expression is important for tolerance formation.
  • the Th1 response is important for intracellular pathogens, graft rejection and autoimmune diseases, the Th2 response for intestinal nematodes, graft tolerance and graft versus host response (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).
  • the induction of a Th2 immune reaction and the suppression of a Th1 reaction are advantageous. Since the Th1 and Th2 responses mutually inhibit one another, the induction of a Th2 response leads to an inhibition of the Th1 response and vice versa.
  • T cell-dependent immune responses are initiated by an interaction of T lymphocytes with a suitable T cell receptor (TcR) with antigen-presenting cells (APC), which present an antigen peptide to the TcR with the MHC molecule.
  • TcR T cell receptor
  • APC antigen-presenting cells
  • TcR and MHC peptide are insufficient for complete T cell activation, and a second, "costimulatory" signal must result from an adequate pairing of accessory molecules on both cells involved in the interaction.
  • the co-stimulation system is well defined, in which cell surface protein B7 (B7.1, B7.2) molecules expressed by the antigen presenting cell interact with CD28 molecules which are expressed by the activated T cell (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Ine); this B7-CD28 interaction leads to the expression of CTLA-4 by the T lymphocytes, which due to its particularly high affinity for B7 further increases the sensitivity of the T cell to stimulation by B7 and finally the transduction of an adequate co-stimulatory signal allows.
  • B7 cell surface protein B7
  • Such co-stimulation can be prevented, for example, by expressing soluble ligands for B7 which "saturate" the CD28 molecule and prevent the detection of the common signal presence of TcR and CD28.
  • a CTLA4-Ig fusion protein was produced in which the extracellular part of the murine CTLA4 molecule and the constant region of human immunoglobulin are gammal fused, mCTL4-4 gammal, which behaves functionally like a monoclonal antibody against B7 (Lane et al. Immunology 1993 Sep.
  • the co-stimulatory signals B7 / CD28 are of great importance for the activation of Th1 cells.
  • the allograph reaction is characterized by an invasion of macrophages and CD4 + cells into the graft and a Th1 reaction.
  • monocyte invasion is reduced and expression of IL-4 and IL-
  • soluble ligands of the surface molecules involved in signal transmission between APC and T cell can be used. These molecules can be administered to the patient systemically or locally as proteins, but it is also conceivable to administer suitable expression constructs made of DNA, which contain the information necessary for the production of such inhibitors and which, after being introduced into the body's own cells, are used to produce the inhibitors cause.
  • herpes virus-induced autoimmune reaction (Herpetic Stromal Keratitis) could be suppressed in mice by the application of CTLA4lg fusion protein. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).
  • Nonviral reporter gene transfer based on a peptide-based system has been published in various species, including humans (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).
  • a number of methods for introducing targets into target cells are known, for example transfection, lipofection, injection, “ballistic transfer” (see WO 91/07487 and DE 44 16 784), viral vectors or electroporation. It is known, for example, that corneal epithelial cells are found Have electroporation transfected with reporter genes (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).
  • Dumbbell-shaped expression constructs are described in WO 98/21322.
  • the object of the invention described here to provide a suitable means for the postoperative suppression. the rejection reaction and thus a permanent tolerance of the graft. Furthermore, it is an object of the invention to enable the transfer of therapeutically active nucleic acid constructs into the eye tissue, in particular the cornea, in particular in a form in which the transferred nucleic acid constructs are operationally active, ie can be read off.
  • this object is achieved in that so-called expression constructs, ie DNA polymers, in particular those which carry a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal, into the tissue of the cornea or other tissue associations surrounding the eye are introduced in such a way that these expression constructs lead to the synthesis of the immunomodulatory protein or peptide, or a plurality thereof.
  • expression constructs ie DNA polymers, in particular those which carry a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal
  • Preferred expression constructs for the suppression of transplant rejection or virus-induced keratitis are those which contain the cytokines IL-4, IL-10, the extracellular part of CTLA4 (CD 152) or inhibitors of other stimulatory signals, in particular non-signal-inducing protein ligands CD-40 or CD-40-ugand, or B7.1, B-7.2 or CD-28, including in particular antibodies against CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B-7.2 or CD-28 for Bring expression.
  • Preferred promoters are the immediate early promoter of the cytomegalovirus as well as other viral promoters (SV40) and tissue-specific
  • Promoters especially keratin gene promoters specific for corneal cells of the eye.
  • soluble CTLA-4 is a ligand for B7 and can suppress the costimulation of the immune response: For the effective initiation of a cytotoxic immune response against the graft, which the
  • CTLA-4 cytotoxic T-cell antigen 4
  • the organic The pathway of costimulation with soluble, extracellular CTLA-4 immunoglobulin fusion protein can prevent transplant rejection in the mouse model (Paul, ibid. Chapter 36, p. 1212 and citations 644 to 647).
  • the use of the extracellular domain of the CTLA-4 stabilized by immunoglobulin infusion is usually described.
  • the term “immunomodulatory” means the influencing of the immune response by mediators, which either lead to immune stimulation or immune suppression, or also result in a shift in the immune response from a cellular Th1 to a humoral Th2 response.
  • So-called minimalistic dumbbell constructs are preferred as expression constructs, i.e. dumbbell-shaped, linear double-stranded, covalently closed nucleic acid molecules, as described, for example, in DE 196 48 625. These have the advantage that they do not contain any sequences that do not serve the immediate purpose of the treatment and are therefore smaller and also more reliable with regard to the character of the immune response induced by the DNA itself.
  • the main problem here is that unmethylated sequences of the general base sequence NNCGNN (with N: any base, C: cytosine; G: guanine) occurring in bacterial DNA can have a strong immunostimulatory effect, and above all the cytotoxic, ie graft - Strengthen rejection-mediating arm of the immune response.
  • the said minimalist dumbbell constructs minimize the number of immunostimulatory sequence elements they contain and thus the strength of the DNA-induced cytotoxic stimulus.
  • any method that can express DNA in cells in particular lipofection, peptide-mediated methods, electroporation or ballistic transfer, as described, for example, in EP 0 686 697, can be used as the transfection method.
  • the last-mentioned method the transfer by bombarding the tissue to be transfected with strongly accelerated particles, is generally very effective since the DNA is transported directly into the nucleus of the cells to be transfected. All other non-viral methods suffer from the low efficiency of this core transport.
  • the nature of the ballistic transfer method also means that part of the tissue is treated is damaged, and that particles are deposited in the transfected tissue.
  • mice The results obtained from mice are also generally transferable to humans:
  • the MHC locus (Major Histocompatibility Complex) got its name because of its function in tissue intolerance.
  • MHC compatibility HLA compatibility in humans.
  • two mouse models (donor C3H, recipient BALB / c) with completely different MHC characteristics were chosen in order to get a violent and fast immune response with the greatest possible probability and thereby provoking a graft rejection.
  • the HLA components are matched as closely as possible, so that it can be assumed that those of the expression vectors used, which lead to a significant reduction in graft rejection in mice, are even more suitable for the same task in humans. This ensures qualitative transferability. Furthermore, it is a long tradition of immunological research to investigate basic relationships in the mouse model, because the generation of knock-out mutants with relatively simple means in particular allows deep insights into regulatory relationships. The strong correlation found between murine and human immunological relationships means that therapeutic approaches found in mice can be transferred to humans. This is also generally the case for the field of transplant rejection.
  • the invention is also suitable for the treatment of stem cells or stem cell transplants, in particular the limbus epithelium.
  • Stem cells can be found wherever cells have to be continuously renewed. They are the reserve cells for cell proliferation and divide whenever there is a need for cell renewal. The task of cell renewal is to keep the number of cells constant so that on the one hand not too many cells are formed and on the other hand a sudden cell loss can be compensated for. If necessary, individual stem cells can become division cells.
  • the epithelium of the corneal surface is subject to a constant process of cell renewal, in which exfoliated cells have to be replaced by new ones. Only the lowest cell layer contains cells that can divide. This creates a vertical migration movement. At the same time, there is a horizontal cell migration movement from the limbus to the center. Stem cells are only found in the basal limbus epithelium. The regeneration of the surface of the eye, for example after burns, is significantly influenced by the integrity of the limbus epithelium. A loss of all stem cells leads to severe wound healing disorders. Drug therapy for limbus insufficiency is not possible. Only a limbus transplant improves the situation and leads to wound healing. However, allogeneic grafts offer little chance of success, since vessels grow into the transplanted tissue and an immune response follows very likely. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96 (5): 709-22).
  • the invention is also suitable for the treatment of virus-induced keratitis.
  • Experimental studies have shown that the lymphocytic infiltrate in the cornea primarily contains Th1 cells, which produce IL2 and IFN-gamma, during the development phase of herpes simplex keratitis, while IL4-producing Th2 cells are involved in the healing process (Niemialtowski 1992, J Immu- nol 148: 1864-70).
  • the aim of therapy is to specifically suppress the immune system without promoting the infection. This has already been achieved in animal experiments.
  • the systemic and intracomeal administration of IL10 before the HSV infection significantly reduced the inflammation of the cornea without the To weaken the immune system (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Inflammation could also be reduced by administration of anti-interferon-gamma and anti-IL2, although the immune system was weakened (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).
  • a major advantage of the invention is that the expression of the biologically active proteins by the cells of the tissue in which they are supposed to act eliminates the need for stabilization by fusion with foreign peptides, as is e.g. for which CTLA-4 is used by fusion with immunoglobulin peptides. As a result, the expressed bioactive proteins become smaller and can diffuse more easily in the tissue. This is a major advantage of using expression vectors for proteins and peptides over the use of recombinant proteins and peptides.
  • Expression vector for murine CTAL4 10 mg plasmid pG mCTLA4 were mixed with restriction enzyme EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhof Berlin Weg 11 Germany, 10829) analogous to that in DE 196
  • Expression vector for murine interleukin 4 10 mg plasmid pG mlL4 were mixed with restriction enzyme EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg Germany 11-12), 10829 analogous to that in DE 196
  • the reporter gene luciferase (for the methodology, see the manual from Promega Corp. 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 53711-5399, USA, at http://www.promeaa.com/tbs/tm033/tm033.html) was used as a marker used to to prove the successful treatment of corneal cells by means of ballistic transfer and thus the successful implementation of the invention.
  • Expression vector for luciferase 10 mg of plasmid pMOL Lux were mixed with restriction enzyme Eco311 (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG and
  • GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg 11-12, 10829 Berlin, Germany) implemented in analogy to the regulation contained in DE 198 26 758 for barbell constructions.
  • the transfection of the cornea is carried out on day 11 using a commercially available apparatus for ballistic transfer (model "Helios", Bio-Rad, Kunststoff).
  • a commercially available apparatus for ballistic transfer model "Helios", Bio-Rad, Kunststoff.
  • 0.1 - 0.5 mg gold 1.6 ⁇ m; Bio-Rad, California
  • the efficiency of transfection can be increased by using smaller gold particles, since this does not put as much strain on the sensitive eye to be treated (due to the large particles). For this reason, if small gold particles are used, the ballistic transfer can take place immediately after the operation of the eye.
  • gold particles with a size or with a diameter of ⁇ 1 ⁇ g and a quantity of gold ⁇ 0.3 mg per shot.
  • the loading of the gold particles with minimalistic gene expression vectors is preferably between 1 and 2 ⁇ g. Choosing these parameters with suitable times for treatment has a surprisingly positive effect on the nature of the graft and its survival.
  • luciferase To measure the expression of transgenes, minimalistic expression vectors coding for luciferase were introduced into the native corneas of mice using the same methodology as described above for CTLA4 and IL-4. The corneas were removed at the time of the measurement, snap-frozen in liquid nitrogen, homogenized and examined for the expression of luciferase by known methods (see above: catalog from Promega Ine, Madison, Wisconsin, USA). The results of the measurements are shown in Fig. 1. From this, a maximum of expression can be seen after only 24 hours. The measured values shown are mean values from three measurements.
  • Expression vectors for IL-4 and IL-10 were also introduced into mouse corneae. The results of the expression, determined using a commercial ELISA for the gene products in question, are shown in FIG. 2. Corneae were transfected using the ballistic method as described. Gold particles of the size 1 ⁇ m coated with expression vectors were used for the designated genes, and mouse eyes were treated analogously with uncoated gold as a control. One can see an expression of the transfected cytokine gene increased by two orders of magnitude from a low basal level in the case of the IL-4, as well as a significantly increased expression of the IL-10. In the latter attempt, however - presumably caused by the transfection method - the basal level was increased. The measured values shown are mean values from three measurements.
  • IL 10 used at this early stage has a clear immunosuppressive effect, which is shown by the delay in the rejection reaction.
  • FIGS. 3 and 4 show the results of the graft survival examination.
  • 3 shows the number of days past until the clinically manifest rejection of the transplant on the Y axis over the various groups; 4 on the X axis.

Abstract

The invention relates to an agent and a method for the gene therapy treatment of corneal diseases of the human or animal eye, for the inhibition of transplant rejection. The above comprises an expressed construct, with a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal.

Description

Arzneimittel zur Behandlung von Immunreaktionen am Auge Medicines used to treat immune reactions in the eye
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur gentherapeutischen Behandlung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges zur Unterdrückung der Transplantationsabstoßung.The invention relates to a medicament for the gene therapy treatment of corneal diseases of the human or animal eye to suppress transplant rejection.
Bei manchen Erkrankungen am Auge ist es notwendig, Fremdgewebe zu transplan- tieren, welches meist von anderen, verstorbenen Menschen oder von Tieren stammt. Dieses übertragene oder transplantierte Fremdgewebe übernimmt die Funktion des ursprünglichen erkrankten oder zerstörten Gewebes. Das wichtigste und älteste Transplantationsverfahren am Auge stellt die Hornhautübertragung dar. Bei dieser Operation wird die getrübte Hornhaut eines menschlichen Auges entfernt und durch die klare Hornhaut eines Verstorbenen ersetzt. Auf diese Weise kann ein vorher blindes Auge wieder eine normale Sehschärfe erlangen. Von chirurgischer Seite ist dieses Operationsverfahren heute weitgehend optimiert und zu einem kaum noch verbesserungsfähigen Routineverfahren geworden. So werden jährlich in Deutschland ca. 5.000 und in den USA ca. 50.000 Patienten operiert.With some diseases of the eye, it is necessary to transplant foreign tissue, which mostly comes from other, deceased people or from animals. This transferred or transplanted foreign tissue takes over the function of the original diseased or destroyed tissue. The most important and oldest transplantation procedure on the eye is the corneal transfer. This operation removes the clouded cornea from a human eye and replaces it with the clear cornea of a deceased person. In this way, a previously blind eye can regain normal visual acuity. On the surgical side, this surgical procedure has been largely optimized today and has become a routine procedure that can hardly be improved. Around 5,000 patients are operated on each year in Germany and around 50,000 in the United States.
Das wichtigste, bisher ungelöste Problem dieser Fremdgewebsübertragung ist dieThe most important, as yet unsolved problem of this foreign tissue transfer is
Immunreaktion, bei der das Immunsystems des Transplantatempfängers das übertragene Gewebe als fremd erkennt und Abwehrmechanismen entwickelt, die die Zerstörung des transplantierten Fremdgewebes bewirken.Immune response, in which the graft recipient's immune system recognizes the transferred tissue as foreign and develops defense mechanisms that cause the destruction of the transplanted foreign tissue.
Je nach der Wahrscheinlichkeit eines Dauererfolges der Hornhautübertragung un- terteilt man die Patienten in solche mit einer guten Prognose und solche mit einer schlechten Prognose. 10 % der Patienten mit einer guten Prognose erkranken an einer Immunreaktion und 50 % der Patienten mit einer schlechten Prognose erkran- ken an einer Immunreaktion. Folge der Immunreaktion ist die Eintrübung der trans- plantierten Hornhaut und damit die erneute Erblindung.Depending on the likelihood of long-term success in corneal transmission, patients are divided into those with a good prognosis and those with a poor prognosis. 10% of patients with a good prognosis develop an immune reaction and 50% of patients with a poor prognosis develop have an immune response. The consequence of the immune reaction is the clouding of the transplanted cornea and thus renewed blindness.
Zur Unterdrückung einer Immunantwort nach der Transplantation werden nach heutigem Stand der Technik immunsuppressive Medikamente eingesetzt. Die ichtigs- ten Medikamente zur Vermeidung einer Immunreaktion nach Hornhautübertragung sind Corticosteroide, die am Auge lokal als Augentropfen eingesetzt werden. Neben einer erheblichen Mißerfolgsrate dieser Behandlung gibt es gefährliche Folgen dieser Therapieform, nämlich Infektionen der Hornhaut, Entstehung des grünen Stars (Glaukom) und eine Trübung der Linse. Diese Nebenwirkungen verhindern eine höhere Dosierung und damit möglicherweise eine verbesserte Erfolgsrate. Aus diesem Grunde wird nach anderen Möglichkeiten gesucht, die Immunantwort zu modulieren oder zu verhindern.To suppress an immune response after the transplantation, immunosuppressive drugs are used according to the current state of the art. The most important drugs to avoid an immune reaction after corneal transmission are corticosteroids, which are used locally as eye drops on the eye. In addition to a significant failure rate of this treatment, there are dangerous consequences of this form of therapy, namely infections of the cornea, the development of glaucoma and a clouding of the lens. These side effects prevent a higher dosage and thus possibly an improved success rate. For this reason, other options are sought to modulate or prevent the immune response.
Für einige wichtige immunsuppressive Mittel wie z.B. Cyclosporin A konnte nach Hornhautübertragung nur ein sehr geringer Effekt, dabei aber erhebliche Nebenwir- kungen nachgewiesen werden, so dass sie klinisch nur in Ausnahmefällen eingesetzt werden. Entsprechend ungünstig ist das Verhältnis von Wirkung zu möglicher Nebenwirkung bei dem Einsatz monoklonaler Antikörper.For some important immunosuppressive agents such as Cyclosporin A could only have a very slight effect after corneal transfer, but significant side effects could be demonstrated, so that they are used clinically only in exceptional cases. The ratio of effect to possible side effect when using monoclonal antibodies is correspondingly unfavorable.
Der Ablauf der Immunantwort ist teilweise bekannt. Die Aktivität des Immunsystems kann über mehrere Populationen von Helfer- und Effektorzellen vermittelt werden, man unterscheidet danach als Typen der Immunantwort eine zellvermittelte (zytoto- xische) Typ 1 (Th1) bzw. eine durch lösliche Effektormoleküle vermittelte Typ 2- Reaktion (Th2). Die Reaktionen hemmen sich in bestimmten Grenzen gegenseitig und sind gekennzeichnet durch die Ausschüttung antworttypspezifischer Zytokine. Die Immunreaktion nach Organtransplantationen ist eine im wesentlichen zellvermit- telte (zytotoxische) Antwort vom Typ Th1 und ist von der Expression der Th1- Zytokine IL-2 und IFN-gamma begleitet. Für die Toleranzbildung ist das Überwiegen der Th2- über die Th1-Zytokinexpression von Bedeutung. In der frühen Phase nach einer Organtransplantation kommt es zu einer verstärkten Expression des IL-2- Rezeptors (CD25), sowie der Zytokine IL-2, IFN-gamma, IL-4 und IL-10 . Bei der anti-CD4 (RIB 5/2) induzierten, MHC spezifischen Transplantattoleranz geht IFN- gamma schnell zurück, während IL-4 persistiert. Es besteht ein Th1/Th2 shift. Die Th1 Antwort wird blockiert (Lehmann 1997, Transplantation 64, 1181-7). Verschiedene Faktoren spielen bei der Polarisierung des Th1- oder Th2-Weges eine Rolle, so z.B. das Zytokinprofil der natürlichen Immunität, die Natur des Antigens sowie die Aktivität ko-stimulatorischer Moleküle und örtlich sezernierter Hormone vor dem jeweiligen genetischen Hintergrund. Die Th1 -Antwort ist gegenüber intrazellulären Pathogenen, bei der Transplantatabstoßung und bei Autoimmunkrankheiten, die Th2-Antwort gegenüber intestinalen Nematoden, der Transplantattoleranz und der graft versus host Reaktion von Bedeutung (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).The course of the immune response is partially known. The activity of the immune system can be mediated through several populations of helper and effector cells. A distinction is then made between the types of immune response as a cell-mediated (cytotoxic) type 1 (Th1) or a type 2 reaction (Th2) mediated by soluble effector molecules. The reactions inhibit each other within certain limits and are characterized by the release of response-type-specific cytokines. The immune response after organ transplantation is an essentially cell-mediated (cytotoxic) response of the Th1 type and is accompanied by the expression of the Th1 cytokines IL-2 and IFN-gamma. The predominance of Th2 over Th1 cytokine expression is important for tolerance formation. In the early phase after an organ transplant, there is an increased expression of the IL-2 receptor (CD25), as well as the cytokines IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10. With the anti-CD4 (RIB 5/2) induced, MHC-specific graft tolerance, IFN-gamma decreases rapidly, while IL-4 persists. There is a Th1 / Th2 shift. The Th1 response is blocked (Lehmann 1997, Transplantation 64, 1181-7). Various factors play a role in the polarization of the Th1 or Th2 path, for example the cytokine profile of natural immunity, the nature of the antigen and the activity of co-stimulatory molecules and locally secreted hormones against the respective genetic background. The Th1 response is important for intracellular pathogens, graft rejection and autoimmune diseases, the Th2 response for intestinal nematodes, graft tolerance and graft versus host response (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).
Für die Unterdrückung der Abstoßungsreaktion nach Transplantation ist die Indukti- on einer Th2-lmmunreaktion sowie die Unterdrückung einer Th1 -Reaktion vorteilhaft. Da sich die Th1 bzw. Th2-Antworten gegenseitig hemmend beeinflussen, führt die Induktion einer Th2-Antwort zu einer Hemmung der Th1 -Antwort, und umgekehrt.For the suppression of the rejection reaction after transplantation, the induction of a Th2 immune reaction and the suppression of a Th1 reaction are advantageous. Since the Th1 and Th2 responses mutually inhibit one another, the induction of a Th2 response leads to an inhibition of the Th1 response and vice versa.
T-Zell-abhängige Immunantworten werden durch eine Interaktion von T- Lymphozyten mit passendem T-Zellrezeptor (TcR) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) eingeleitet, die dem TcR ein Antigenpeptid mit dem MHC-Molekül präsentieren. Zur vollständigen T-Zellaktivierung ist diese Interaktion von TcR und MHC- Peptid aber unzureichend, und ein zweites, "kostimulatorisches" Signal muß sich aus einer adäquaten Paarung von akzessorischen Molekülen auf beiden an der In- teraktion beteiligten Zellen ergeben. Gut definiert ist das Ko-Stimulationssystem, bei dem von der antigenpräsentierenden Zelle exprimierte Zell-Oberflächenprotein B7 (B7.1 , B7.2)-Moleküle mit CD28-Molekülen interagieren, die von der aktivierten T- Zelle exprimiert werden (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Ine); diese B7-CD28-lnteraktion führt zur Expression von CTLA-4 durch die T- Lymphozyten, das wegen seiner besonders hohen Affinität für B7 die Empfindlichkeit der T-Zelle für eine Stimulation durch B7 weiter erhöht und schließlich die Transduktion eines adäquaten co-stimulatorischen Signals ermöglicht. Die Prävention der Ko-Stimulation induziert eine spezifische T-Zell-Anergie in vitro und inhibiert Autoimmun- und Alloimmunantworten in vivo (Janeway 1994, Current Biology Ltd, Garland Publishing Ine; Linsley 1992, Science 257: 792-795; Lin 1994,TransplantT cell-dependent immune responses are initiated by an interaction of T lymphocytes with a suitable T cell receptor (TcR) with antigen-presenting cells (APC), which present an antigen peptide to the TcR with the MHC molecule. However, this interaction of TcR and MHC peptide is insufficient for complete T cell activation, and a second, "costimulatory" signal must result from an adequate pairing of accessory molecules on both cells involved in the interaction. The co-stimulation system is well defined, in which cell surface protein B7 (B7.1, B7.2) molecules expressed by the antigen presenting cell interact with CD28 molecules which are expressed by the activated T cell (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Ine); this B7-CD28 interaction leads to the expression of CTLA-4 by the T lymphocytes, which due to its particularly high affinity for B7 further increases the sensitivity of the T cell to stimulation by B7 and finally the transduction of an adequate co-stimulatory signal allows. Prevention of co-stimulation induces specific T cell anergy in vitro and inhibits autoimmune and alloimmune responses in vivo (Janeway 1994, Current Biology Ltd, Garland Publishing Ine; Linsley 1992, Science 257: 792-795; Lin 1994, Transplant
Proc. 26: 3200-3201 ; Wallace 1994, Transplantation 58: 602-610; Baliga 1994, Transplantation 58: 1082-1090). Die Prävention solcher Ko-Stimulation kann z.B. durch Expression löslicher Liganden für B7 erfolgen, die das CD28-Molekül „sättigen" und das Erkennen der gemeinsamen Signalpräsenz von TcR und CD28 verhindern. So wurde ein CTLA4-Ig Fusionsprotein produziert, bei dem der extrazelluläre Teil des murinen CTLA4- Moleküls und die konstante Region von menschlichem Immunglobulin gammal miteinander fusioniert sind, mCTL4-4 gammal , das sich funktioneil wie ein monoklona- ler Antikörper gegen B7 verhält (Lane et al. Immunology 1993 Sep. 80(1):56-61). Die Blockade des CD28-B7 T-Zell-Co-Stimulationsweges durch das Fusionsprotein CTLA4-Ig induziert Toleranz gegenüber Nieren- , Lungen- und Herzallotransplanta- ten bei Ratten und Pankreas-Allotransplantaten bei Mäusen und Ratten und eine deutliche Verlängerung des Hornhauttransplantatüberlebens bei der Maus (LinProc. 26: 3200-3201; Wallace 1994, Transplantation 58: 602-610; Baliga 1994, Transplantation 58: 1082-1090). Such co-stimulation can be prevented, for example, by expressing soluble ligands for B7 which "saturate" the CD28 molecule and prevent the detection of the common signal presence of TcR and CD28. A CTLA4-Ig fusion protein was produced in which the extracellular part of the murine CTLA4 molecule and the constant region of human immunoglobulin are gammal fused, mCTL4-4 gammal, which behaves functionally like a monoclonal antibody against B7 (Lane et al. Immunology 1993 Sep. 80 (1): 56- The blockade of the CD28-B7 T-cell co-stimulation pathway by the fusion protein CTLA4-Ig induces tolerance to kidney, lung and cardiac allograft in rats and pancreatic allograft in mice and rats and a significant extension of corneal transplant survival at the mouse (Lin
1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201 ; Lenschow 1992, Science 257: 789-792; Yin1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Lenschow 1992, Science 257: 789-792; Yin
1995, J Immunol 155: 1655-1659; Chahine 1995, Transplantation 59: 1313-1318; Matsumura 1995, Transplantation 59: 551-558; Finck 1992, PNAS 89: 102-106; Hoffmann 1997, Graefe^s Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 535-540).1995, J Immunol 155: 1655-1659; Chahine 1995, Transplantation 59: 1313-1318; Matsumura 1995, Transplantation 59: 551-558; Finck 1992, PNAS 89: 102-106; Hoffmann 1997, Graefe ^ s Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 535-540).
Die ko-stimulatorischen Signale B7/CD28 sind für die Aktivierung von Th1 Zellen von großer Bedeutung. Nach Lebertransplantation an der Ratte ist die Allograftreak- tion durch eine Invasion von Makrophagen und CD4+ Zellen in das Transplantat und eine Th1 Reaktion charakterisiert. Nach Behandlung mit CTLA4 Fusionsprotein ist die Monozyteninvasion reduziert, und es kommt zur Expression von IL-4 und IL-The co-stimulatory signals B7 / CD28 are of great importance for the activation of Th1 cells. After liver transplantation on the rat, the allograph reaction is characterized by an invasion of macrophages and CD4 + cells into the graft and a Th1 reaction. After treatment with CTLA4 fusion protein, monocyte invasion is reduced and expression of IL-4 and IL-
10 (Mark 1997, Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 114: 299-302). Die CD28/B7 Blockade mit CTLA4lg behindert die Th1-, nicht aber die Th2- Zytokinsynthese (Akalin 1996, Transplantation 62: 1942-1945). Sie führt nach Nierentransplantation an der Ratte im Transplantat unter anderem zur Expression der Th2-Zytokine IL-4 und IL-10, bei unbehandelten Kontrollen dagegen zur Expression der Th1 -Zytokine IL-2 und IFN-gamma (Sayegh 1995, J Exp Med 181 : 1869-1874).10 (Mark 1997, Langenbeck's Arch Chir Suppl Kongressbd 114: 299-302). The CD28 / B7 blockade with CTLA4lg hinders Th1 but not Th2 cytokine synthesis (Akalin 1996, Transplantation 62: 1942-1945). After kidney transplantation on the rat, it leads to the expression of the Th2 cytokines IL-4 and IL-10 in the transplant, in the case of untreated controls, however, to the expression of the Th1 cytokines IL-2 and IFN-gamma (Sayegh 1995, J Exp Med 181 : 1869-1874).
Die Inhibition ko-stimulatorischer Signale, die zur T-Zell-Aktivierung essentiell sind, hat sich im Tierversuch insofern als besonders effektiv zur Verhinderung der Trans- plantatabstoßung erwiesen, als sie zur Induktion von anergen T-Lymphozyten führt. Diese erkennen das betreffende Alloantigen zwar, reagieren darauf aber nicht mehrThe inhibition of co-stimulatory signals, which are essential for T cell activation, has proven to be particularly effective in animal experiments in preventing graft rejection in that it leads to the induction of anergic T lymphocytes. These recognize the alloantigen in question, but no longer react to it
(Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Ine). Eine solche Strategie hat gegenüber der Behandlung mit Immunsuppresiva den Vorteil, nur für einen relativ kurzen Zeitraum, nämlich während der Initialphase der Exposition des Empfän- ger-lmmunsystems gegenüber den Transplantat-Alloantigenen, appliziert werden zu müssen.(Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Ine). Such a strategy has the advantage over treatment with immunosuppresives only for a relatively short period of time, namely during the initial phase of exposure of the recipient. ger immune systems to the transplant alloantigens, to have to be applied.
Es können zur Unterdrückung der Kostimulation also lösliche Liganden der an der Signalvermittlung zwischen APC und T-Zelle beteiligten Oberflächenmoleküle ein- gesetzt werden. Dabei können diese Moleküle dem Patienten als Proteine systemisch oder lokal verabreicht werden, denkbar ist allerdings auch die Verabreichung geeigneter Expressionskonstrukte aus DNA, auf denen die für die Herstellung solcher Inhibitoren notwendige Informationen enthalten ist, und die nach Einschleusung in körpereigene Zellen diese zur Herstellung der Inhibitoren veranlassen.In order to suppress costimulation, soluble ligands of the surface molecules involved in signal transmission between APC and T cell can be used. These molecules can be administered to the patient systemically or locally as proteins, but it is also conceivable to administer suitable expression constructs made of DNA, which contain the information necessary for the production of such inhibitors and which, after being introduced into the body's own cells, are used to produce the inhibitors cause.
Der Transport und die Expression von genetischer Information in Zellen ist weithin bekannt und beschrieben. Es werden dabei zum einen Systeme biologischer Herkunft, wie attenuierte oder modifizierte virale oder bakterielle Vektoren verwendet, die in ihrem genetischen „Inhalt" so verändert worden sind, dass sie eine bestimmte, erwünschte Information in der infizierten Zelle zur Expression bringen. Neben Si- cherheitsbedenken hinsichtlich Rückmutation oder -Rekombination zu pathogenen Stämmen haben solche Vektoren den Nachteil, dass sie dem Immunsystem eine Vielzahl potentieller Erkennungsstrukturen liefern, was ihre Verwendbarkeit in therapeutischen Ansätzen einschränkt. Zum anderen bedient man sich zum Gentransfer physikalischer oder chemischer Methoden, wie z.B. der Lipofektion oder dem spannungsinduzierten Transfer (Elektroporation).The transport and expression of genetic information in cells is well known and described. On the one hand, systems of biological origin, such as attenuated or modified viral or bacterial vectors, are used which have been changed in their genetic “content” in such a way that they express certain, desired information in the infected cell. In addition to safety concerns With regard to back mutation or recombination to pathogenic strains, such vectors have the disadvantage that they provide the immune system with a large number of potential recognition structures, which limits their usefulness in therapeutic approaches. On the other hand, physical or chemical methods such as lipofection or the like are used for gene transfer voltage-induced transfer (electroporation).
Bereits 1994 beschrieben Mashour et al. (Mashour et al. 1994, Gene Ther 1 : 122- 126) die Expression von Reportergenen in Mäusen nach Transfektion mit adenoviralen Vekoren. Ähnliches berichten Budenz et al. (Budenz et al. 1995, Invest. Ophtalmol Vis Sei 36: 2211-2215). Auch ist die Transfektion von Endothelzellen der Hornhaut von Kaninchen mittels adenoviraler Vektoren bekannt, dabei wurde die Expression des Reportergens lacZ beobachtet (Larkin 1996, Transplantation 61 : 363-370). Ebenfalls wurde die Reportergenexpression an menschlichen Hornhaut-Endothelzellen nach adenoviralem Transfer sowie die Expression von CTLA4lg in vitro beobachtet (Oral et al. 1997, Gene Ther 4: 639- 647). Eine Variation der Methode, die sich der sog. Lipoadenofektion bedient, wurde ebenfalls publiziert (Aranchibia-Carcamo et al. 1998, Transplatation 65: 62-67). Eine Reihe weiterer Transfektionsversuche ist beschrieben. So verhindert der Ep- stein-Barr-Virus-vermittelte Transfer von IL-10-Expressionsvektoren die Allograft- Abstoßung bei der Transplantation von Herzmuskelgewebe in Kaninchen (Brauner et al. 1997, J Thorac Cardiovasc Surg 114: 923-933).Mashour et al. (Mashour et al. 1994, Gene Ther 1: 122-126) the expression of reporter genes in mice after transfection with adenoviral vectors. Budenz et al. (Budenz et al. 1995, Invest. Ophtalmol Vis Sei 36: 2211-2215). The transfection of endothelial cells of the cornea in rabbits by means of adenoviral vectors is also known, the expression of the reporter gene lacZ was observed (Larkin 1996, Transplantation 61: 363-370). Reporter gene expression on human corneal endothelial cells after adenoviral transfer and the expression of CTLA4lg in vitro were also observed (Oral et al. 1997, Gene Ther 4: 639-647). A variation of the method using the so-called lipoadenofection has also been published (Aranchibia-Carcamo et al. 1998, Transplatation 65: 62-67). A number of other transfection attempts are described. For example, the Epstein-Barr virus-mediated transfer of IL-10 expression vectors prevents allograft rejection in the transplantation of cardiac muscle tissue in rabbits (Brauner et al. 1997, J Thorac Cardiovasc Surg 114: 923-933).
Die Herpesvirus-induzierte Autoimmunreaktion (Herpetic Stromal Keratitis) konnte bei Mäusen durch die Applikation von CTLA4lg Fusionsprotein unterdrückt werden. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).The herpes virus-induced autoimmune reaction (Herpetic Stromal Keratitis) could be suppressed in mice by the application of CTLA4lg fusion protein. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).
Der nichtvirale Reportergentransfer auf der Basis eines peptidbasierten Systems wurde bei verschiedenen Spezies, darunter Mensch, publiziert (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).Nonviral reporter gene transfer based on a peptide-based system has been published in various species, including humans (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).
Es sind etliche Verfahren zum Einbringen von Targets in Zielzellen bekannt, beispielsweise Transfektion, Lipofektion, Injektion, „ballistischer Transfer" (siehe WO 91/07487 und DE 44 16 784), virale Vektoren oder Elektroporation. So ist es bekannt, dass sich Hornhautepithelzellen durch Elektroporation mit Reportergenen transfizieren lassen (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).A number of methods for introducing targets into target cells are known, for example transfection, lipofection, injection, “ballistic transfer” (see WO 91/07487 and DE 44 16 784), viral vectors or electroporation. It is known, for example, that corneal epithelial cells are found Have electroporation transfected with reporter genes (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).
Hanteiförmige Expressionskonstrukte sind in WO 98/21322 beschrieben.Dumbbell-shaped expression constructs are described in WO 98/21322.
Aus der WO 98/56417, sowie der WO 96/31229 und EP 0 682 039 ist bekannt, dass sich die Abstoßungsreaktion durch Inhibition kostimulatorischer Signale unterdrücken lässt.It is known from WO 98/56417, WO 96/31229 and EP 0 682 039 that the rejection reaction can be suppressed by inhibiting costimulatory signals.
Bislang ist die Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion nach Hornhauttransplantation durch die Expression geeigneter Gene nach Kenntnis der Anmelderin bisher nicht beschrieben worden. Die bisherigen Erkenntnisse zur Entstehung der Immunreaktion weisen daraufhin, dass es zur Unterdrückung einer Immunantwort wichtig ist, innerhalb des transplantierten Gewebes möglichst frühzeitig eine Expression der Th2 Zytokine IL4 und/oder der extrazellulären Domäne des CTLA4-Liganden oder anderer Hemmer der ko-stimulatorischen Signale zu ermöglichen.To date, the suppression of a rejection reaction after corneal transplantation by the expression of suitable genes to the knowledge of the applicant has not been described. The previous findings on the development of the immune response indicate that it is important to suppress an immune response to express the Th2 cytokines IL4 and / or the extracellular domain of the CTLA4 ligand or other inhibitors of the co-stimulatory signals within the transplanted tissue as early as possible enable.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung, ein geeignetes Mittel bereitzustellen, um die postoperative Unterdrü- ckung der Abstoßungsreaktion und somit eine dauerhafte Toleranz des Transplantats zu ermöglichen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, den Transfer von therapeutisch wirksamen Nukleinsäurekonstrukten ins Augengewebe, insbesondere die Hornhaut, zu ermöglichen, insbesondere in einer Form, in der die transferierten Nukleinsäurekonstrukte operational aktiv sind, d.h. abgelesen werden können.Starting from this prior art, it is the object of the invention described here to provide a suitable means for the postoperative suppression. the rejection reaction and thus a permanent tolerance of the graft. Furthermore, it is an object of the invention to enable the transfer of therapeutically active nucleic acid constructs into the eye tissue, in particular the cornea, in particular in a form in which the transferred nucleic acid constructs are operationally active, ie can be read off.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass sog. Expressionskon- strukte, also DNA-Polymere, insbesondere solche, welche eine für ein immunmodu- latorisches Protein oder Polypeptid kodierende Sequenz unter Kontrolle eines funktionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadenylierungssignals tragen, in das Gewebe der Hornhaut oder andere das Auge umgebende Gewebeverbände so eingebracht werden, dass diese Expressionskonstrukte zur Synthese des immun- modulatorischen Proteins oder Peptides, oder einer Mehrzahl derselben, führen.According to the invention, this object is achieved in that so-called expression constructs, ie DNA polymers, in particular those which carry a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal, into the tissue of the cornea or other tissue associations surrounding the eye are introduced in such a way that these expression constructs lead to the synthesis of the immunomodulatory protein or peptide, or a plurality thereof.
Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte für die Unterdrückung der Transplantationsabstoßung bzw. der virusinduzierten Keratitis solche, die die Cytokine IL-4, IL-10, den extrazellulären Teil von CTLA4 (CD 152) oder Inhibitoren anderer ko- stimulatorischer Signale, insbesondere nicht-signalinduzierende Proteinliganden von CD-40 oder CD-40-ügand, oder B7.1 , B-7.2 oder CD-28, darunter insbesondere Antikörper gegen CD-40 oder CD-40-Ligand, oder B7.1 , B-7.2 oder CD-28 zur Expression bringen. Bevorzugte Promotoren sind der Immediate-Early-Promotor des Cytomegalievirus sowie andere virale Promotoren (SV40) und gewebespezifischePreferred expression constructs for the suppression of transplant rejection or virus-induced keratitis are those which contain the cytokines IL-4, IL-10, the extracellular part of CTLA4 (CD 152) or inhibitors of other stimulatory signals, in particular non-signal-inducing protein ligands CD-40 or CD-40-ugand, or B7.1, B-7.2 or CD-28, including in particular antibodies against CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B-7.2 or CD-28 for Bring expression. Preferred promoters are the immediate early promoter of the cytomegalovirus as well as other viral promoters (SV40) and tissue-specific
Promotoren, insbesondere für Hornhautzellen des Auges spezifische Keratin- genpromotoren.Promoters, especially keratin gene promoters specific for corneal cells of the eye.
In Bezug auf die Liganden ist hervorzuheben, dass lösliches CTLA-4 ein Ligand für B7 ist und die Kostimulation der Immunreaktion unterdrücken kann: Zur effektiven Einleitung einer zytotoxischen Immunantwort gegen das Transplantat, welche dieRegarding the ligands, it should be emphasized that soluble CTLA-4 is a ligand for B7 and can suppress the costimulation of the immune response: For the effective initiation of a cytotoxic immune response against the graft, which the
Abstossungsreaktion verursacht, ist die Stimulation von zytotoxischen Zellen durch den kostimulatorischen Signalweg über die Interaktion von B7-Molekülen auf anti- genpräsentierenden Zellen (Makrophagen, Dendriten oder Langerhans-Zellen) und CD28 auf den T-Zellen notwendig. Ein anderer natürlicher Ligand von B7 ist das "cytotoxic T-cell Antigen 4" (CTLA-4), welches ein Homolog von CD28 darstellt und eine höhere Affinität für B7 hat (siehe: Paul, Fundamental Immunology, Lippincott- Raven, 4. Auflage 1999, ISBN 0-7817-1412-5 und darin enthaltene Zitate). Die Bio- ckade des Kostimulationsweges mit löslichem, extrazellulären CTLA-4- Immunoglobulin Fusionsprotein kann im Mausmodel die Transplantatabstossung verhindern (Paul, ibid. Kapitel 36, S. 1212 sowie Zitate 644 bis 647). Dabei wird zumeist die Verwendung der durch Immunoglobulinfusion stabilisiertem extrazellulären Domäne des CTLA-4 beschrieben.Rejection reaction, the stimulation of cytotoxic cells by the costimulatory signaling pathway via the interaction of B7 molecules on antigen-presenting cells (macrophages, dendrites or Langerhans cells) and CD28 on the T cells is necessary. Another natural ligand of B7 is the "cytotoxic T-cell antigen 4" (CTLA-4), which is a homologue of CD28 and has a higher affinity for B7 (see: Paul, Fundamental Immunology, Lippincott-Raven, 4th edition 1999, ISBN 0-7817-1412-5 and quotes contained therein). The organic The pathway of costimulation with soluble, extracellular CTLA-4 immunoglobulin fusion protein can prevent transplant rejection in the mouse model (Paul, ibid. Chapter 36, p. 1212 and citations 644 to 647). The use of the extracellular domain of the CTLA-4 stabilized by immunoglobulin infusion is usually described.
Unter dem Begriff „immunmodulatorisch" wird im Sinne der Erfindung die Beeinflussung der Immunantwort durch Mediatoren verstanden, die entweder zu einer Immunstimulation oder Immunsupression führen, oder aber auch in einer Verschiebung der Immunantwort von einer zellulären Th1 zu einer humoralen Th2 Antwort resultieren.In the context of the invention, the term “immunomodulatory” means the influencing of the immune response by mediators, which either lead to immune stimulation or immune suppression, or also result in a shift in the immune response from a cellular Th1 to a humoral Th2 response.
Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte sog. minimalistische Hantelkonstrukte, d.h. hanteiförmige, lineare doppelsträngige kovalent geschlossene Nukleinsäuremo- leküle, eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE 196 48 625 beschrieben sind. Diese bieten den Vorteil, keine Sequenzen zu enthalten, die nicht dem unmittelba- ren Zweck der Behandlung dienen, und sind deswegen kleiner sowie auch hinsichtlich des Charakters der durch die DNA selber induzierten Immunantwort sicherer. Das hierbei wesentliche Problem ist, dass in bakterieller DNA vorkommende un- methylierte Sequenzen der generellen Basenfolge NNCGNN (mit N: jede Base, C: Cytosin; G: Guanin) eine starke immunstimulatorische Wirkung haben können, und dabei vor allem den zytotoxischen, also Transplantat-Abstoßungs-vermittelnden Arm der Immunantwort stärken. Die besagten minimalistischen Hantelkonstrukte minimieren die Anzahl der auf ihnen enthaltenen immunstimulatorischen Sequenzelemente und damit die stärke des DNA-induzierten cytotoxischen Stimulus.So-called minimalistic dumbbell constructs are preferred as expression constructs, i.e. dumbbell-shaped, linear double-stranded, covalently closed nucleic acid molecules, as described, for example, in DE 196 48 625. These have the advantage that they do not contain any sequences that do not serve the immediate purpose of the treatment and are therefore smaller and also more reliable with regard to the character of the immune response induced by the DNA itself. The main problem here is that unmethylated sequences of the general base sequence NNCGNN (with N: any base, C: cytosine; G: guanine) occurring in bacterial DNA can have a strong immunostimulatory effect, and above all the cytotoxic, ie graft - Strengthen rejection-mediating arm of the immune response. The said minimalist dumbbell constructs minimize the number of immunostimulatory sequence elements they contain and thus the strength of the DNA-induced cytotoxic stimulus.
Als Transfektionsmethode kommt prinzipiell jede Methode in Frage, welche DNA in Zellen zur Expression bringen kann, also v.a. Lipofektion, peptidvermittelte Methoden, Elektroporation oder der ballistische Transfer, wie er beispielsweise in der EP 0 686 697 beschrieben ist. Die zuletzt genannte Methode, der Transfer durch Beschüß des zu transfizierenden Gewebes mit stark beschleunigten Partikeln, ist generell sehr effektiv, da die DNA direkt in den Kern der zu transfizierenden Zellen transportiert wird. Alle anderen nicht-viralen Methoden leiden unter einer z.T. geringen Effizienz dieses Kerntransports. Die Natur der ballistischen Transfermethode bringt es allerdings auch mit sich, dass ein Teil des Gewebes durch die Behandlung geschädigt wird, und dass Partikel in dem transfizierten Gewebe abgeladen werden. Es konnte ferner festgestellt werden dass auch die direkte, postoperative Transfektion von Implantaten mittels einer sog. „Gene Gun" (Bio-Rad, München, WO 95/19799) zur deutlichen Verzögerung der Abstoßungsreaktion bei hornhauttrans- plantierten Mäusen führt, und dass in der ophtalmologischen Untersuchung des behandelten Auges keine Schädigungen entdeckt werden konnten, die den Gebrauch der Methode beim Patienten ausschließen würden.In principle, any method that can express DNA in cells, in particular lipofection, peptide-mediated methods, electroporation or ballistic transfer, as described, for example, in EP 0 686 697, can be used as the transfection method. The last-mentioned method, the transfer by bombarding the tissue to be transfected with strongly accelerated particles, is generally very effective since the DNA is transported directly into the nucleus of the cells to be transfected. All other non-viral methods suffer from the low efficiency of this core transport. However, the nature of the ballistic transfer method also means that part of the tissue is treated is damaged, and that particles are deposited in the transfected tissue. It was also found that the direct, postoperative transfection of implants by means of a so-called "gene gun" (Bio-Rad, Munich, WO 95/19799) leads to a significant delay in the rejection reaction in corneal transplant mice, and that in the ophthalmic examination of the treated eye revealed no damage that would rule out the use of the method in the patient.
Die an Mäusen gewonnenen Ergebnisse sind auch grundsätzlich auf den Menschen übertragbar: Der MHC-Locus (Major Histocompatibility Complex) hat seinen Namen wegen seiner Funktion bei der Gewebeunverträglichkeit erhalten. Nachuntersuchungen an 150.000 Nieren-transplantierten Patienten und auch an Herz- transplantierten Patienten haben eine deutliche Abhängigkeit des Transplantatüberlebens von der MHC-Kompatibilität (beim Menschen HLA-Kompatibilität) gezeigt. Um die experimentell ermittelten Daten aus den Mausmodellen auf die Anwendung am Menschen übertragbar zu machen, wurden zwei Mausmodelle (Spender C3H, Empfänger BALB/c) mit komplett differentem MHC Charakteristika gewählt, um mit der möglichst größten Wahrscheinlichkeit eine heftige und schnelle Immunreaktion zu erhalten und damit eine Transplantatabstoßung zu provozieren. Bei Transplantationen am Menschen dagegen wird auf eine möglichst große Übereinstimmung der HLA Komponenten geachtet, so dass anzunehmen ist, dass diejenigen der eingesetzten Expressionsvektoren, die zu einer deutlichen Herabsetzung der Transplantatabstoßung bei Mäusen führen, erst recht geeignet sind für die gleiche Aufgabe beim Menschen. Eine qualitative Übertragbarkeit ist damit gegeben. Im übrigen ist es eine lange Tradition der immunologischen Forschung, grundsätzliche Zusam- menhänge im Mausmodell zu untersuchen, weil dort besonders die Erzeugung von knock-out-Mutanten mit relativ einfachen Mitteln tiefe Einblicke in regulatorische Zusammenhänge zulässt. Durch die gefundene starke Korrelation zwischen muri- nen und humanen immunologischen Zusammenhängen lassen sich in der Maus gefundene therapeutische Ansätze auf den Menschen übertragen. Dies ist auch generell für das Feld der Transplantationsabstossung der Fall. So konnte gezeigt werden, dass die oben skizzierten Zusammenhänge auch im Primatenmodell vorliegen (Kirk et al., CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sei U S A 1997 Aug 5;94(16):8789-94). Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung von Stammzellen oder Stammzelltransplantaten, besonders des Limbusepithels. Stammzellen kommen überall dort vor, wo Zellen kontinuierlich erneuert werden müssen. Sie sind die Reservezellen für die Zellproliferation und teilen sich immer dann, wenn ein Bedarf für Zeller- neuerung besteht. Aufgabe der Zellerneuerung ist es, die Anzahl der Zellen konstant zu erhalten, so dass einerseits nicht zu viele Zellen gebildet, und andererseits ein plötzlicher Zellverlust ausgeglichen werden kann. Bei Bedarf können einzelne Stammzellen zu Teilungszellen werden. Das Epithel der Hornhautoberfläche ist einem konstanten Prozeß der Zellerneuerung unterworfen, bei dem abgeschilferte Zellen durch neue ersetzt werden müssen. Nur die unterste Zellschicht enthält Zellen, die sich teilen können. Dadurch entsteht eine vertikale Wanderungsbewegung. Gleichzeitig besteht eine horizontale Zellwanderungsbewegung vom Limbus zum Zentrum. Stammzellen gibt es nur im basalen Limbusepithel. Die Regeneration der Augenoberfläche beispielsweise nach Verätzungen wird maßgeblich von der Integri- tat des Limbusepithels beeinflußt. Ein Verlust aller Stammzellen führt zu schwersten Wundheilungsstörungen. Eine medikamentöse Therapie der Limbusinsuffizienz ist nicht möglich. Lediglich eine Limbustransplantation verbessert die Situation und führt zur Wundheilung. Allogene Transplantate bieten jedoch wenig Aussichten auf Erfolg, da in das transplantierte Gewebe Gefäße einwachsen und sehr wahrschein- lieh eine Immunreaktion folgt. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96(5): 709-22).The results obtained from mice are also generally transferable to humans: The MHC locus (Major Histocompatibility Complex) got its name because of its function in tissue intolerance. Follow-up examinations in 150,000 kidney-transplanted patients and also in heart-transplanted patients have shown a clear dependency of the graft survival on the MHC compatibility (HLA compatibility in humans). In order to make the experimentally determined data from the mouse models transferable to human use, two mouse models (donor C3H, recipient BALB / c) with completely different MHC characteristics were chosen in order to get a violent and fast immune response with the greatest possible probability and thereby provoking a graft rejection. In the case of human transplants, on the other hand, the HLA components are matched as closely as possible, so that it can be assumed that those of the expression vectors used, which lead to a significant reduction in graft rejection in mice, are even more suitable for the same task in humans. This ensures qualitative transferability. Furthermore, it is a long tradition of immunological research to investigate basic relationships in the mouse model, because the generation of knock-out mutants with relatively simple means in particular allows deep insights into regulatory relationships. The strong correlation found between murine and human immunological relationships means that therapeutic approaches found in mice can be transferred to humans. This is also generally the case for the field of transplant rejection. It was shown that the relationships outlined above also exist in the primate model (Kirk et al., CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sei USA 1997 Aug 5; 94 (16): 8789 -94). However, the invention is also suitable for the treatment of stem cells or stem cell transplants, in particular the limbus epithelium. Stem cells can be found wherever cells have to be continuously renewed. They are the reserve cells for cell proliferation and divide whenever there is a need for cell renewal. The task of cell renewal is to keep the number of cells constant so that on the one hand not too many cells are formed and on the other hand a sudden cell loss can be compensated for. If necessary, individual stem cells can become division cells. The epithelium of the corneal surface is subject to a constant process of cell renewal, in which exfoliated cells have to be replaced by new ones. Only the lowest cell layer contains cells that can divide. This creates a vertical migration movement. At the same time, there is a horizontal cell migration movement from the limbus to the center. Stem cells are only found in the basal limbus epithelium. The regeneration of the surface of the eye, for example after burns, is significantly influenced by the integrity of the limbus epithelium. A loss of all stem cells leads to severe wound healing disorders. Drug therapy for limbus insufficiency is not possible. Only a limbus transplant improves the situation and leads to wound healing. However, allogeneic grafts offer little chance of success, since vessels grow into the transplanted tissue and an immune response follows very likely. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96 (5): 709-22).
Der Vorteil der Behandlung von Stammzellen mit dem erfindungsgemäßen Mittel ist daher offensichtlich, wird dadurch doch die auf die Abstoßung des Transplantats gerichtete Immunabwehr gezielt unterdrückt, ohne dass eine Infektionsgefahr gefördert wird.The advantage of treating stem cells with the agent according to the invention is therefore obvious, since it specifically suppresses the immune defense aimed at rejecting the transplant without promoting a risk of infection.
Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung der virusinduzierten Keratitis. So haben experimentelle Untersuchungen gezeigt, dass das lymphozytäre Infiltrat in der Hornhaut während der Entwicklungsphase der Herpes simplex Keratitis vorrangig Th1 Zellen enthält, welche IL2 und IFN-Gamma produzieren, während IL4 produzierende Th2 Zellen an der Abheilung beteiligt sind (Niemialtowski 1992, J Immu- nol 148: 1864-70). Das Ziel einer Therapie besteht darin, die Immunabwehr gezielt zu unterdrücken, ohne die Infektion zu fördern. Im Tierexperiment ist dies bereits gelungen. Durch die systemische und intracomeale Gabe von IL10 vor der HSV- Infektion konnte die Entzündung der Hornhaut erheblich reduziert werden, ohne die Abwehrkraft zu schwächen (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Ebenso konnte die Entzündung durch Gabe von Anti-Interferon-gamma und anti-IL2 bei allerdings geschwächter Abwehrkraft reduziert werden (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).However, the invention is also suitable for the treatment of virus-induced keratitis. Experimental studies have shown that the lymphocytic infiltrate in the cornea primarily contains Th1 cells, which produce IL2 and IFN-gamma, during the development phase of herpes simplex keratitis, while IL4-producing Th2 cells are involved in the healing process (Niemialtowski 1992, J Immu- nol 148: 1864-70). The aim of therapy is to specifically suppress the immune system without promoting the infection. This has already been achieved in animal experiments. The systemic and intracomeal administration of IL10 before the HSV infection significantly reduced the inflammation of the cornea without the To weaken the immune system (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Inflammation could also be reduced by administration of anti-interferon-gamma and anti-IL2, although the immune system was weakened (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist, dass durch die Expression der biologisch aktiven Proteine durch die Zellen des Gewebes, in dem sie wirken sollen, die Notwendigkeit der Stabilisierung durch Fusion mit Fremdpeptiden wegfällt, wie sie z.B. für das CTLA-4 durch Fusion mit Immunoglobulinpeptiden verwendet wird. Die exprimierten bioaktiven Proteine werden dadurch kleiner und können leichter im Gewebe diffundieren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von Expressionsvektoren für Proteine und Peptide gegenüber der Verwendung rekombinanter Proteine und Peptide.A major advantage of the invention is that the expression of the biologically active proteins by the cells of the tissue in which they are supposed to act eliminates the need for stabilization by fusion with foreign peptides, as is e.g. for which CTLA-4 is used by fusion with immunoglobulin peptides. As a result, the expressed bioactive proteins become smaller and can diffuse more easily in the tissue. This is a major advantage of using expression vectors for proteins and peptides over the use of recombinant proteins and peptides.
Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren wie folgt näher dargestellt:Further advantageous measures are contained in the remaining subclaims. The invention is illustrated in more detail using exemplary embodiments and figures as follows:
1. Synthese der DNA-Polvmere (Hantelkonstrukte)1. Synthesis of DNA Polymers (Dumbbell Constructs)
Expressionsvektor für murines CTAL4: 10 mg Plasmid pG mCTLA4 wurden mit Restriktionsenzym EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhof er Weg 11-12, 10829 Berlin, Deutschland) analog der in DE 196Expression vector for murine CTAL4: 10 mg plasmid pG mCTLA4 were mixed with restriction enzyme EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhof Berlin Weg 11 Germany, 10829) analogous to that in DE 196
48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.48 625 contained regulation implemented for dumbbell constructions.
Expressionsvektor für murines Interleukin 4: 10 mg Plasmid pG mlL4 wurden mit Restriktionsenzym EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg 11-12, 10829 Berlin, Deutschland) analog der in DE 196Expression vector for murine interleukin 4: 10 mg plasmid pG mlL4 were mixed with restriction enzyme EcoRI (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg Germany 11-12), 10829 analogous to that in DE 196
48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.48 625 contained regulation implemented for dumbbell constructions.
Das Reportergen Luciferase (zur Methodik siehe das Handbuch der Firma Promega Corp. 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 53711-5399, USA, unter http://www.promeaa.com/tbs/tm033/tm033.html ) wurde als Marker verwendet, um die erfolgreiche Behandlung von Hornhautzellen mittels ballistischen Transfer und damit die erfolgreiche Umsetzung der Erfindung nachzuweisen.The reporter gene luciferase (for the methodology, see the manual from Promega Corp. 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 53711-5399, USA, at http://www.promeaa.com/tbs/tm033/tm033.html) was used as a marker used to to prove the successful treatment of corneal cells by means of ballistic transfer and thus the successful implementation of the invention.
Expressionsvektor für Luciferase:10 mg Plasmid pMOL Lux wurden mit Restriktionsenzym Eco311 (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland) und Haarna- del-Oligodesoxyribonukleotid AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG undExpression vector for luciferase: 10 mg of plasmid pMOL Lux were mixed with restriction enzyme Eco311 (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG and
GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg 11-12, 10829 Berlin, Deutschland) analog der in DE 198 26 758 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB Molbiol, Tempelhofer Weg 11-12, 10829 Berlin, Germany) implemented in analogy to the regulation contained in DE 198 26 758 for barbell constructions.
2. Keratoplastik2. Keratoplasty
Die Technik der Transplantation der Hornhaut im Mausmodell ist genau beschrieben worden („Orthotopic corneal transplantation in the mouse - a new surgical technique with minimal endothelial cell loss": Er-Ping Zhang et al. 1996, Graefe 's Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 714-719). Kurz dargestellt läuft diese wie folgt ab: Die Transplantation der Hornhaut wird in 5 Monate alten BALB/c (H-2d) Mäusen durchgeführt. MHC-differente C3h(H-2k) Mäuse dienen als Spender. Empfängermäuse werden mit einer Mischung aus 6 mg/kg Körpergewicht Xylazine (Rompun, Bayer) und 75 mg/kg Körpergewicht Ketamine Hydrochlorid (Ketanest, Parke-Davis) betäubt. Die Spenderhornhaut wird mit einer Catroviejo-Schere entnommen. Die Hornhaut wird in das Empfängerauge mit 8 Nähten eingenäht. Am Ende der Operation werden die Augenlider für 24 Stunden zugenäht. Die Mäuse werden 11 Tage lang mit Cortison behandelt (5x täglich, 2 Tropfen Spersadex Lösung).The technique of corneal transplantation in the mouse model has been described in detail ("Orthotopic corneal transplantation in the mouse - a new surgical technique with minimal endothelial cell loss": Er-Ping Zhang et al. 1996, Graefe ' s Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 714-719) Briefly, the procedure is as follows: The transplantation of the cornea is carried out in 5-month-old BALB / c (H-2d) mice, MHC-different C3h (H-2k) mice serve as donors a mixture of 6 mg / kg body weight Xylazine (Rompun, Bayer) and 75 mg / kg body weight Ketamine Hydrochloride (Ketanest, Parke-Davis) is anesthetized The donor cornea is removed with Catroviejo scissors and the cornea is inserted into the recipient's eye with 8 sutures At the end of the operation the eyelids are sewn for 24 hours and the mice are treated with cortisone for 11 days (5 times a day, 2 drops of Spersadex solution).
3. Ballistischer Gentransfer in Mäuseauqen3. Ballistic gene transfer in Mäuseauqen
Die Transfektion der Hornhaut erfolgt am Tag 11 mit einem kommerziell erhältlichen Apparat zum ballistischen Transfer (Modell „Helios", Bio-Rad, München). Für jede Transfektion wird 0.1 - 0.5 mg Gold (1 ,6 μm; Bio-Rad, Kalifornien) eingesetzt, welches nach Vorschrift des Herstellers mit 1 μg minimalistischen Genepressionsvektoren codierend für murines CTLA4 und / oder murines Interleukin 4 (Zusammensetzung der Beladung variiert ja nach experimentellen Parametern) beladen wurde. Die 1 ,6 μm großen Goldpartikel werden mit Helium unter Druck (200 psi = 1 ,38 hPa) auf das transplantierte Auge am Tag 10 nach Operation beschleunigt. Die Effizienz der Transfektion kann durch die Verwendung kleinerer Goldpartikel jedoch gesteigert werden, da dadurch das zu behandelnde und empfindliche Auge nicht so stark belastet wird (durch die großen Partikel). Aus diesem Grund kann bei Verwendung kleiner Goldpartikel unmittelbar nach der Operation des Auges, näm- lieh unter Umständen schon am 1. Tag danach der ballistische Transfer erfolgen.The transfection of the cornea is carried out on day 11 using a commercially available apparatus for ballistic transfer (model "Helios", Bio-Rad, Munich). For each transfection 0.1 - 0.5 mg gold (1.6 μm; Bio-Rad, California) used, which was loaded according to the manufacturer's instructions with 1 μg of minimalistic gene expression vectors coding for murine CTLA4 and / or murine interleukin 4 (composition of the load varies depending on experimental parameters). The 1.6 μm gold particles are loaded with helium under pressure (200 psi = 1.38 hPa) accelerated to the transplanted eye on day 10 after the operation. However, the efficiency of transfection can be increased by using smaller gold particles, since this does not put as much strain on the sensitive eye to be treated (due to the large particles). For this reason, if small gold particles are used, the ballistic transfer can take place immediately after the operation of the eye.
Bevorzugt ist daher die Verwendung von Goldpartikeln mit einer Größe bzw. mit einem Durchmesser < 1μg und einer Goldmenge < 0,3 mg pro Schuss. Die Beladung der Goldpartikel mit minimalistischen Genepressionsvektoren liegt bevorzugt zwischen 1 - 2 μg. Bei Wahl dieser Parameter mit geeigneten Zeitpunkten der Be- handlung wird die Beschaffenheit des Transplantates und sein Überleben überraschend positiv beeinflusst.It is therefore preferred to use gold particles with a size or with a diameter of <1μg and a quantity of gold <0.3 mg per shot. The loading of the gold particles with minimalistic gene expression vectors is preferably between 1 and 2 μg. Choosing these parameters with suitable times for treatment has a surprisingly positive effect on the nature of the graft and its survival.
Zur Messung der Expression von Transgenen wurden minimalistische Expressionsvektoren, kodierend für Luciferase, in die nativen Hornhäute von Mäusen mit der gleichen Methodik eingebracht, wie oben für CTLA4 und IL-4 beschrieben. Die Hornhäute wurden zum Zeitpunkt der Messung entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und nach bekannten Methoden (s. oben: Katalog von Promega Ine, Madison, Wisconsin, USA) auf die Expression von Luciferase untersucht. Die Ergebnisse der Messungen sind in Fig. 1 gezeigt. Daraus ist ein Maximum der Expression schon nach 24 Stunden erkennbar. Die dargestellten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen.To measure the expression of transgenes, minimalistic expression vectors coding for luciferase were introduced into the native corneas of mice using the same methodology as described above for CTLA4 and IL-4. The corneas were removed at the time of the measurement, snap-frozen in liquid nitrogen, homogenized and examined for the expression of luciferase by known methods (see above: catalog from Promega Ine, Madison, Wisconsin, USA). The results of the measurements are shown in Fig. 1. From this, a maximum of expression can be seen after only 24 hours. The measured values shown are mean values from three measurements.
Ebenso wurden Expressionsvektoren für IL-4 und IL-10 in Mäusecorneae eingebracht. Die Ergebnisse der Expression, ermittelt mit einem handelsüblichen ELISA für die betreffenden Genprodukte, sind in Fig. 2 dargestellt. Mit der ballistischen Methode wurden Corneae wie beschrieben transfiziert. Es wurden mit Expressions- Vektoren für die bezeichneten Gene beschichtete Goldpartikel der Grosse 1 μm eingesetzt, als Kontrolle wurden Mäuseaugen mit unbeschichtetem Gold analog behandelt. Man erkennt eine von einem niedrigen Basalniveau um zwei Größenordun- gen erhöhte Expression des transfizierten Zytokingens im Falle des IL-4, sowie eine ebenfalls deutlich erhöhte Expression des IL-10. Bei letzterem Versuch ist - vermut- lieh durch die Transfektionsmethode verursacht - das Basalniveau jedoch erhöht. Die dargestellten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen. Durch die Verwendung kleiner Goldpartikel lassen sich die Nebenwirkungen, wie sie z.B. durch größere Goldpartikel ausgelöst werden, verringern bis beseitigen, da das Gewebe nicht mehr so stark belastet wird. Zu diesem frühen Zeitpunkt eingesetztes IL 10 hat eine deutliche immunsupressive Wirkung, die sich in der Verzögerung der Abstoßungsreaktion zeigt.Expression vectors for IL-4 and IL-10 were also introduced into mouse corneae. The results of the expression, determined using a commercial ELISA for the gene products in question, are shown in FIG. 2. Corneae were transfected using the ballistic method as described. Gold particles of the size 1 μm coated with expression vectors were used for the designated genes, and mouse eyes were treated analogously with uncoated gold as a control. One can see an expression of the transfected cytokine gene increased by two orders of magnitude from a low basal level in the case of the IL-4, as well as a significantly increased expression of the IL-10. In the latter attempt, however - presumably caused by the transfection method - the basal level was increased. The measured values shown are mean values from three measurements. By using small gold particles, the side effects, such as those caused by larger gold particles, can be reduced or eliminated, since the tissue is no longer so heavily loaded. IL 10 used at this early stage has a clear immunosuppressive effect, which is shown by the delay in the rejection reaction.
Die Ergebnisse der Transplantatüberlebensuntersuchung sind in den Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. In Fig. 3 ist die Anzahl der bis zur klinisch manifesten Abstoßungsreaktion des Transplantats vergangenen Tage auf der Y-Achse über den verschiedenen Gruppen aufgetragen; in Fig. 4 auf der X-Achse. The results of the graft survival examination are shown in FIGS. 3 and 4. 3 shows the number of days past until the clinically manifest rejection of the transplant on the Y axis over the various groups; 4 on the X axis.

Claims

Patentansprüche claims
1. Arzneimittel zur gentherapeutischen Behandlung zur Unterdrückung der Transplantationsabstoßung des menschlichen oder tierischen Auges, bestehend aus einem Expressionskonstrukt mit einer für ein immunmodulatori- sches Protein oder Polypeptid kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines funktionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadenylierungssignals, wobei das Expressionskonstrukt1. Medicament for gene therapy treatment for suppressing the transplant rejection of the human or animal eye, consisting of an expression construct with a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal, the expression construct
• das Zytokin Interleukin 4 (IL-4), und/oderThe cytokine interleukin 4 (IL-4), and / or
• das Zytokin Interleukin 10 (IL-10), und/oderThe cytokine interleukin 10 (IL-10), and / or
• den extrazellulären Teil von CTLA4 (CD 152), und/oder • einen oder mehrere der Inhibitoren von ko-stimulatorischen Signalen, insbesondere nicht-signalinduzierende Proteinliganden von CD-40 oder CD-40-Ligand, oder B7.1 , B-7.2 oder CD-28, darunter insbesondere Antikörper gegen CD-40 oder CD-40-Ligand, oder B7.1 , B- 7.2 oder CD-28 zur Expression bringt:• the extracellular part of CTLA4 (CD 152), and / or • one or more of the inhibitors of co-stimulatory signals, in particular non-signal-inducing protein ligands of CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B-7.2 or CD-28, including in particular antibodies against CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B-7.2 or CD-28 for expression:
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 , wobei die Promotoren ausgewählt sind aus der Gruppe des Immediate-Early-Promotor des Cytomegalievirus (CMV) o- der des viralen Promotors (SV40).2. Medicament according to claim 1, wherein the promoters are selected from the group of the immediate early promoter of the cytomegalovirus (CMV) or the viral promoter (SV40).
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 , wobei die Expressionskonstrukte hantelförmi- ge, lineare doppelsträngige kovalent geschlossene Nukleinsäuremoleküle sind.3. Medicament according to claim 1, wherein the expression constructs are dumbbell-shaped, linear double-stranded covalently closed nucleic acid molecules.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 3, wobei dieses als Impfstoff verwendet wird. 4. Medicament according to claim 1 to 3, which is used as a vaccine.
5. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 1 bis 4 zur Behandlung der Hornhaut oder Teile derselben oder Stammzellen des Limbusepithels des menschlichen oder tierischen Auges zur Unterdrückung der Transplantationsabstoßung des menschlichen oder tierischen Auges.5. Use of the medicament according to claim 1 to 4 for the treatment of the cornea or parts thereof or stem cells of the limbus epithelium of the human or animal eye to suppress the transplant rejection of the human or animal eye.
6. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5, wobei die Behandlung mittels Transfektion, Lipofektion, Injektion, ballistischen Transfer, virale Vektoren, Elektroporation oder jedes andere Mittel in Zellen der Hornhaut oder Teile derselben geschieht.6. Use of the medicament according to claim 5, wherein the treatment by means of transfection, lipofection, injection, ballistic transfer, viral vectors, electroporation or any other means takes place in cells of the cornea or parts thereof.
7. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 6, wobei für den ballistischen Transfer Goldpartikel mit einer Größe (Durchmesser) von ≤1 ,6 μm in einer7. Use of the drug according to claim 6, wherein for the ballistic transfer gold particles with a size (diameter) of ≤1, 6 microns in one
Menge von 0,1 - 0,5 mg bevorzugt sind.Amount of 0.1-0.5 mg are preferred.
8. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7, wobei für den ballistischen Transfer Goldpartikel mit einer Größe (Durchmesser) von < 1 μg besonders bevorzugt sind.8. Use of the medicament according to claim 7, wherein gold particles with a size (diameter) of <1 μg are particularly preferred for the ballistic transfer.
9. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7, wobei für den ballistischen9. Use of the medicament according to claim 7, wherein for the ballistic
Transfer Goldpartikel in einer in einer Menge von < 0,3 mg besonders bevorzugt sind.Transfer gold particles in an amount of <0.3 mg are particularly preferred.
10. Verwendung des Arzneimittels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung von isolierten Hornhautzellen. 10. Use of the medicament according to one or more of the preceding claims for the treatment of isolated corneal cells.
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