DE10025920A1

DE10025920A1 - Methods and agents for treating immune reactions in the eye

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Publication number: DE10025920A1
Application number: DE10025920A
Authority: DE
Inventors: Friedrich Hoffmann; Burghardt Wittig; Sven Andres Koenig-Merediz
Original assignee: MOLOGEN FORSCHUNGS ENTWICKLUNG
Current assignee: MOLOGEN FORSCHUNGS ENTWICKLUNG
Priority date: 2000-05-27
Filing date: 2000-05-27
Publication date: 2001-12-06
Also published as: WO2001091799A2; AU7046201A; WO2001091799A3; DE10192165D2

Abstract

The invention relates to an agent and a method for the gene therapy treatment of corneal diseases of the human or animal eye, for the inhibition of transplant rejection. The above comprises an expressed construct, with a sequence coding for an immunomodulatory protein or polypeptide under the control of a functional promoter and a functional polyadenylation signal.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur gentherapeutischen Behand lung von Hornhauterkrankungen des menschlichen oder tierischen Auges zur Un terdrückung der Transplantationsabstoßung.The invention relates to an agent and a method for gene therapy treatment development of corneal diseases of the human or animal eye suppression of transplant rejection.

Bei manchen Erkrankungen am Auge ist es notwendig, Fremdgewebe zu transplan tieren, welches meist von anderen, verstorbenen Menschen oder von Tieren stammt. Dieses übertragene oder transplantierte Fremdgewebe übernimmt die Funktion des ursprünglichen erkrankten oder zerstörten Gewebes. Das wichtigste und älteste Transplantationsverfahren am Auge stellt die Hornhautübertragung dar. Bei dieser Operation wird die getrübte Hornhaut eines menschlichen Auges entfernt und durch die klare Hornhaut eines Verstorbenen ersetzt. Auf diese Weise kann ein vorher blindes Auge wieder eine normale Sehschärfe erlangen. Von chirurgischer Seite ist dieses Operationsverfahren heute weitgehend optimiert und zu einem kaum noch verbesserungsfähigen Routineverfahren geworden. So werden jährlich in Deutschland ca. 5.000 und in den USA ca. 50.000 Patienten operiert.With some diseases of the eye it is necessary to transplant foreign tissue animals, mostly from other, deceased people or animals comes from. This transferred or transplanted foreign tissue takes over Function of the original diseased or destroyed tissue. The most important and the oldest transplantation procedure on the eye is the corneal transmission. This operation removes the clouded cornea from a human eye and replaced by the clear cornea of a deceased. In this way, a previously blind eyes regain normal visual acuity. From surgical On the one hand, this surgical procedure is largely optimized today and becomes one routine procedures that can hardly be improved. So be annually approximately 5,000 patients operated on in Germany and approximately 50,000 in the USA.

Das wichtigste, bisher ungelöste Problem dieser Fremdgewebsübertragung ist die Immunreaktion, bei der das Immunsystems des Transplantatempfängers das über tragene Gewebe als fremd erkennt und Abwehrmechanismen entwickelt, die die Zerstörung des transplantierten Fremdgewebes bewirken. The most important, as yet unsolved problem of this foreign tissue transfer is Immune response, in which the immune system of the transplant recipient over recognizes worn tissues as foreign and develops defense mechanisms that prevent Destruct the transplanted foreign tissue.

Je nach der Wahrscheinlichkeit eines Dauererfolges der Hornhautübertragung un terteilt man die Patienten in solche mit einer guten Prognose und solche mit einer schlechten Prognose. 10% der Patienten mit einer guten Prognose erkranken an einer Immunreaktion und 50% der Patienten mit einer schlechten Prognose erkran ken an einer Immunreaktion. Folge der Immunreaktion ist die Eintrübung der trans plantierten Hornhaut und damit die erneute Erblindung.Depending on the likelihood of long-term success of corneal transmission un one divides the patients into those with a good prognosis and those with one bad forecast. 10% of patients with a good prognosis fall ill an immune response and 50% of patients with a poor prognosis have an immune response. The consequence of the immune reaction is the clouding of the trans planted cornea and thus renewed blindness.

Zur Unterdrückung einer Immunantwort nach der Transplantation werden nach heu tigem Stand der Technik immunsuppressive Medikamente eingesetzt. Die wichtigs ten Medikamente zur Vermeidung einer Immunreaktion nach Hornhautübertragung sind Corticosteroide, die am Auge lokal als Augentropfen eingesetzt werden. Neben einer erheblichen Mißerfolgsrate dieser Behandlung gibt es gefährliche Folgen die ser Therapieform, nämlich Infektionen der Hornhaut, Entstehung des grünen Stars (Glaukom) und eine Trübung der Linse. Diese Nebenwirkungen verhindern eine höhere Dosierung und damit möglicherweise eine verbesserte Erfolgsrate. Aus die sem Grunde wird nach anderen Möglichkeiten gesucht, die Immunantwort zu modu lieren oder zu verhindern.To suppress an immune response after the transplant, heu state of the art used immunosuppressive drugs. The important medicines to prevent an immune response after corneal transmission are corticosteroids that are used locally as eye drops on the eye. Next A substantial failure rate of this treatment leads to dangerous consequences This form of therapy, namely infections of the cornea, development of the glaucoma (Glaucoma) and clouding of the lens. These side effects prevent one higher doses and possibly an improved success rate. From the Therefore, other options are sought to modulate the immune response or prevent.

Für einige wichtige immunsuppressive Mittel wie z. B. Cyclosporin A konnte nach Hornhautübertragung nur ein sehr geringer Effekt, dabei aber erhebliche Nebenwir kungen nachgewiesen werden, so dass sie klinisch nur in Ausnahmefällen einge setzt werden. Entsprechend ungünstig ist das Verhältnis von Wirkung zu möglicher Nebenwirkung bei dem Einsatz monoklonaler Antikörper.For some important immunosuppressive agents such as B. Cyclosporin A could after Corneal transmission is only a very slight effect, but it has considerable side effects proven, so that they are clinically used only in exceptional cases be set. The ratio of effect to possible is correspondingly unfavorable Side effect when using monoclonal antibodies.

Der Ablauf der Immunantwort ist teilweise bekannt. Die Aktivität des Immunsystems kann über mehrere Populationen von Helfer- und Effektorzellen vermittelt werden, man unterscheidet danach als Typen der Immunantwort eine zellvermittelte (zytoto xische) Typ 1 (Th1) bzw. eine durch lösliche Effektormoleküle vermittelte Typ 2- Reaktion (Th2). Die Reaktionen hemmen sich in bestimmten Grenzen gegenseitig und sind gekennzeichnet durch die Ausschüttung antworttypspezifischer Zytokine. Die Immunreaktion nach Organtransplantationen ist eine im wesentlichen zellvermit telte (zytotoxische) Antwort vom Typ Th1 und ist von der Expression der Th1- Zytokine IL-2 und IFN-gamma begleitet. Für die Toleranzbildung ist das Überwiegen der Th2- über die Th1-Zytokinexpression von Bedeutung. In der frühen Phase nach einer Organtransplantation kommt es zu einer verstärkten Expression des IL-2- Rezeptors (CD25), sowie der Zytokine IL-2, IFN-gamma, IL-4 und IL-10. Bei der anti-CD4 (RIB 5/2) induzierten, MHC spezifischen Transplantattoleranz geht IFN gamma schnell zurück, während IL-4 persistiert. Es besteht ein Th1/Th2 shift. Die Th1 Antwort wird blockiert (Lehmann 1997, Transplantation 64, 1181-7).The course of the immune response is partially known. The activity of the immune system can be mediated across multiple populations of helper and effector cells, A distinction is then made between types of immune response as cell-mediated (cytoto xical) type 1 (Th1) or a type 2 mediated by soluble effector molecules Reaction (Th2). The reactions inhibit each other within certain limits and are characterized by the release of response type-specific cytokines. The immune response after organ transplantation is essentially a cell-mediated telte (cytotoxic) response of the type Th1 and is dependent on the expression of the Th1 Cytokines IL-2 and IFN-gamma accompanied. For the formation of tolerance is predominance the Th2 over Th1 cytokine expression is important. In the early phase after organ transplantation leads to increased expression of IL-2 Receptor (CD25), and the cytokines IL-2, IFN-gamma, IL-4 and IL-10. In the anti-CD4 (RIB 5/2) induced, MHC specific graft tolerance goes IFN gamma quickly returned while IL-4 persisted. There is a Th1 / Th2 shift. The Th1 response is blocked (Lehmann 1997, Transplantation 64, 1181-7).

Verschiedene Faktoren spielen bei der Polarisierung des Th1- oder Th2-Weges eine Rolle, so z. B. das Zytokinprofil der natürlichen Immunität, die Natur des Antigens sowie die Aktivität ko-stimulatorischer Moleküle und örtlich sezernierter Hormone vor dem jeweiligen genetischen Hintergrund. Die Th1-Antwort ist gegenüber intrazellulären Pathogenen, bei der Transplantatabstoßung und bei Autoimmunkrankheiten, die Th2-Antwort gegenüber intestinalen Nematoden, der Transplantattoleranz und der graft versus host Reaktion von Bedeutung (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).Various factors play a role in the polarization of the Th1 or Th2 path Role, e.g. B. the cytokine profile of natural immunity, the nature of the antigen as well as the activity of co-stimulatory molecules and locally secreted hormones against the respective genetic background. The Th1 answer is opposite intracellular pathogens, in graft rejection and in Autoimmune diseases, the Th2 response to intestinal nematodes, the Graft tolerance and the graft versus host response matter (Romagnani 1997, Int Arch Allergy Immunol 113, 153-6).

Für die Unterdrückung der Abstoßungsreaktion nach Transplantation ist die Indukti on einer Th2-Immunreaktion sowie die Unterdrückung einer Th1-Reaktion vorteil haft. Da sich die Th1 bzw. Th2-Antworten gegenseitig hemmend beeinflussen, führt die Induktion einer Th2-Antwort zu einer Hemmung der Th1-Antwort, und umge kehrt.For the suppression of the rejection reaction after transplantation is the Indukti on a Th2 immune response and the suppression of a Th1 response advantageous arrested. Since the Th1 and Th2 responses mutually inhibit each other, leads induction of a Th2 response to inhibit the Th1 response, and vice versa returns.

T-Zell-abhängige Immunantworten werden durch eine Interaktion von T- Lymphozyten mit passendem T-Zellrezeptor (TcR) mit Antigen-präsentierenden Zel len (APC) eingeleitet, die dem TcR ein Antigenpeptid mit dem MHC-Molekül präsen tieren. Zur vollständigen T-Zellaktivierung ist diese Interaktion von TcR und MHC- Peptid aber unzureichend, und ein zweites, "kostimulatorisches" Signal muß sich aus einer adäquaten Paarung von akzessorischen Molekülen auf beiden an der In teraktion beteiligten Zellen ergeben. Gut definiert ist das Ko-Stimulationssystem, bei dem von der antigenpräsentierenden Zelle exprimierte Zell-Oberflächenprotein B7 (B7.1, B7.2)-Moleküle mit CD28-Molekülen interagieren, die von der aktivierten T- Zelle exprimiert werden (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc); diese B7-CD28-Interaktion führt zur Expression von CTLA-4 durch die T- Lymphozyten, das wegen seiner besonders hohen Affinität für B7 die Empfindlich keit der T-Zelle für eine Stimulation durch B7 weiter erhöht und schließlich die Transduktion eines adäquaten co-stimulatorischen Signals ermöglicht. Die Präventi on der Ko-Stimulation induziert eine spezifische T-Zell-Anergie in vitro und inhibiert Autoimmun- und Alloimmunantworten in vivo (Janeway 1994, Current Biology Ltd, Garland Publishing Inc. Linsley 1992, Science 257: 792-795; Lin 1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Wallace 1994, Transplantation 58: 602-610; Baliga 1994, Transplantation 58: 1082-1090).T cell-dependent immune responses are triggered by an interaction of T- Lymphocytes with matching T cell receptor (TcR) with antigen presenting cell len (APC) initiated, the TcR present an antigen peptide with the MHC molecule animals. This interaction of TcR and MHC- is necessary for complete T cell activation. However, the peptide is insufficient and a second, "costimulatory" signal must be generated from an adequate pairing of accessory molecules on both at the In Interaction involved cells result. The co-stimulation system is well defined, at the cell surface protein B7 expressed by the antigen presenting cell (B7.1, B7.2) molecules interact with CD28 molecules that are activated by the T Cell can be expressed (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc); this B7-CD28 interaction leads to the expression of CTLA-4 by the T- Lymphocytes, which are sensitive due to their particularly high affinity for B7 the T cell for stimulation by B7 and finally the Enables transduction of an adequate co-stimulatory signal. The preventi on co-stimulation induces and inhibits specific T cell anergy in vitro Autoimmune and alloimmune responses in vivo (Janeway 1994, Current Biology Ltd, Garland Publishing Inc. Linsley 1992, Science 257: 792-795; Lin 1994, transplant Proc. 26: 3200-3201; Wallace 1994, Transplantation 58: 602-610; Baliga 1994, Transplantation 58: 1082-1090).

Die Prävention solcher Ko-Stimulation kann z. B. durch Expression löslicher Ligan den für B7 erfolgen, die das CD28-Molekül "sättigen" und das Erkennen der ge meinsamen Signalpräsenz von TcR und CD28 verhindern. So wurde ein CTLA4-lg Fusionsprotein produziert, bei dem der extrazelluläre Teil des murinen CTLA4- Moleküls und die konstante Region von menschlichem Immunglobulin gamma1 mit einander fusioniert sind, mCTL4-4 gamma1, das sich funktionell wie ein monoklona ler Antikörper gegen B7 verhält (Lane et al. Immunology 1993 Sep. 80(1): 56-61). Die Blockade des CD28-B7 T-Zell-Co-Stimulationsweges durch das Fusionsprotein CTLA4-lg induziert Toleranz gegenüber Nieren-, Lungen- und Herzallotransplanta ten bei Ratten und Pankreas-Allotransplantaten bei Mäusen und Ratten und eine deutliche Verlängerung des Hornhauttransplantatüberlebens bei der Maus (Lin 1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Lenschow 1992, Science 257: 789-792; Yin 1995, J Immunol 155: 1655-1659; Chahine 1995, Transplantation 59: 1313-1318; Matsumura 1995, Transplantation 59: 551-558; Finck 1992, PNAS 89: 102-106; Hoffmann 1997, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 535-540).The prevention of such co-stimulation can e.g. B. by expression of soluble ligan those for B7 that "saturate" the CD28 molecule and the recognition of the ge prevent common signal presence of TcR and CD28. So a CTLA4-lg Fusion protein produced in which the extracellular part of the murine CTLA4- Molecule and the constant region of human immunoglobulin gamma1 with are fused together, mCTL4-4 gamma1, which functions as a monoclonal Antibody to B7 behaves (Lane et al. Immunology 1993 Sep. 80 (1): 56-61). Blockage of the CD28-B7 T cell co-stimulation pathway by the fusion protein CTLA4-lg induces tolerance to kidney, lung and cardiac allotransplanta rat and pancreatic allograft in mouse and rat and one significant increase in corneal transplant survival in the mouse (Lin 1994, Transplant Proc. 26: 3200-3201; Lenschow 1992, Science 257: 789-792; Yin 1995, J Immunol 155: 1655-1659; Chahine 1995, Transplantation 59: 1313-1318; Matsumura 1995, Transplantation 59: 551-558; Finck 1992, PNAS 89: 102-106; Hoffmann 1997, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 535-540).

Die ko-stimulatorischen Signale B7/CD28 sind für die Aktivierung von Th1 Zellen von großer Bedeutung. Nach Lebertransplantation an der Ratte ist die Allograftreak tion durch eine Invasion von Makrophagen und CD4+ Zellen in das Transplantat und eine Th1 Reaktion charakterisiert. Nach Behandlung mit CTLA4 Fusionsprotein ist die Monozyteninvasion reduziert, und es kommt zur Expression von IL-4 und IL- 10 (Mark 1997, Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 114: 299-302). Die CD28/B7 Blockade mit CTLA4lg behindert die Th1-, nicht aber die Th2- Zytokinsynthese (Akalin 1996, Transplantation 62: 1942-1945). Sie führt nach Nie rentransplantation an der Ratte im Transplantat unter anderem zur Expression der Th2-Zytokine IL-4 und IL-10, bei unbehandelten Kontrollen dagegen zur Expression der Th1-Zytokine IL-2 und IFN-gamma (Sayegh 1995, J Exp Med 181: 1869-1874).The co-stimulatory signals B7 / CD28 are for the activation of Th1 cells of great importance. After liver transplantation on the rat, the allograftreak is tion by invading macrophages and CD4 + cells into the graft and characterized a Th1 reaction. After treatment with CTLA4 fusion protein the monocyte invasion is reduced and expression of IL-4 and IL- 10 (Mark 1997, Langenbeck's Arch Chir Suppl Kongressbd 114: 299-302). The CD28 / B7 blockade with CTLA4lg hinders Th1- but not Th2- Cytokine synthesis (Akalin 1996, Transplantation 62: 1942-1945). It leads to never Transplantation on the rat in the graft, among other things, for the expression of the Th2 cytokines IL-4 and IL-10, however, for untreated controls for expression the Th1 cytokines IL-2 and IFN-gamma (Sayegh 1995, J Exp Med 181: 1869-1874).

Die Inhibition ko-stimulatorischer Signale, die zur T-Zell-Aktivierung essentiell sind, hat sich im Tierversuch insofern als besonders effektiv zur Verhinderung der Transplantatabstoßung erwiesen, als sie zur Induktion von anergen T-Lymphozyten führt. Diese erkennen das betreffende Alloantigen zwar, reagieren darauf aber nicht mehr (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc). Eine solche Strategie hat gegenüber der Behandlung mit Immunsuppresiva den Vorteil, nur für einen rela tiv kurzen Zeitraum, nämlich während der Initialphase der Exposition des Empfän ger-Immunsystems gegenüber den Transplantat-Alloantigenen, appliziert werden zu müssen.The inhibition of co-stimulatory signals that are essential for T cell activation has therefore proven to be particularly effective in preventing animal transplant rejection in animal experiments proven to induce anergic T lymphocytes. These recognize the alloantigen in question, but no longer react to it (Janeway 1994, Current Biology Ltd., Garland Publishing Inc). Such a strategy has the advantage over the treatment with immunosuppresives, only for a rela tiv short period, namely during the initial phase of exposure of the recipient ger immune system against the transplant alloantigens, to be applied have to.

Es können zur Unterdrückung der Kostimulation also lösliche Liganden der an der Signalvermittlung zwischen APC und T-Zelle beteiligten Oberflächenmoleküle ein gesetzt werden. Dabei können diese Moleküle dem Patienten als Proteine syste misch oder lokal verabreicht werden, denkbar ist allerdings auch die Verabreichung geeigneter Expressionskonstrukte aus DNA, auf denen die für die Herstellung sol cher Inhibitoren notwendige Informationen enthalten ist, und die nach Einschleu sung in körpereigene Zellen diese zur Herstellung der Inhibitoren veranlassen.To suppress costimulation, soluble ligands can therefore be used at the Signal mediation between APC and T cell involved surface molecules be set. These molecules can act as proteins for the patient can be administered mixed or locally, but administration is also conceivable suitable expression constructs from DNA on which the sol necessary inhibitors is contained, and that after insertion solution in the body's own cells cause them to produce the inhibitors.

Der Transport und die Expression von genetischer Information in Zellen ist weithin bekannt und beschrieben. Es werden dabei zum einen Systeme biologischer Her kunft, wie attenuierte oder modifizierte virale oder bakterielle Vektoren verwendet, die in ihrem genetischen "Inhalt" so verändert worden sind, dass sie eine bestimmte, erwünschte Information in der infizierten Zelle zur Expression bringen. Neben Si cherheitsbedenken hinsichtlich Rückmutation oder -Rekombination zu pathogenen Stämmen haben solche Vektoren den Nachteil, dass sie dem Immunsystem eine Vielzahl potentieller Erkennungsstrukturen liefern, was ihre Verwendbarkeit in the rapeutischen Ansätzen einschränkt. Zum anderen bedient man sich zum Gentrans fer physikalischer oder chemischer Methoden, wie z. B. der Lipofektion oder dem spannungsinduzierten Transfer (Elektroporation).The transport and expression of genetic information in cells is extensive known and described. On the one hand, there are systems of biological origin how to use attenuated or modified viral or bacterial vectors, which have been changed in their genetic "content" in such a way that they express desired information in the infected cell. In addition to Si safety concerns regarding back mutation or recombination to pathogenic Strains have the disadvantage that such vectors have a negative impact on the immune system Numerous potential recognition structures provide what makes them usable in the therapeutic approaches. On the other hand you use gene trans fer physical or chemical methods, such as. B. the lipofection or the voltage-induced transfer (electroporation).

Bereits 1994 beschrieben Mashour et al. (Mashour et al. 1994, Gene Ther 1: 122-126) die Expression von Reportergenen in Mäusen nach Transfektion mit adenoviralen Vekoren. Ähnliches berichten Budenz et al. (Budenz et al. 1995, Invest. Ophtalmol Vis Sci 36: 2211-2215). Auch ist die Transfektion von Endothelzellen der Hornhaut von Kaninchen mittels adenoviraler Vektoren bekannt, dabei wurde die Expression des Reportergens lacZ beobachtet (Larkin 1996, Transplantation 61: 363-370). Ebenfalls wurde die Reportergenexpression an menschlichen Hornhaut-Endothelzellen nach adenoviralem Transfer sowie die Ex- Endothelzellen nach adenoviralem Transfer sowie die Expression von CTLA4lg in vitro beobachtet (Oral et al. 1997, Gene Ther 4: 639-647). Eine Variation der Me thode, die sich der sog. Lipoadenofektion bedient, wurde ebenfalls publiziert (Aran chibia-Carcamo et al. 1998, Transplatation 65: 62-67).Mashour et al. (Mashour et al. 1994, Gene Ther 1: 122-126) the expression of reporter genes in mice after transfection with adenoviral vectors. Budenz et al. (Budenz et al. 1995, Invest. Ophtalmol Vis Sci 36: 2211-2215). Also is the transfection of Endothelial cells of the cornea of rabbits known by means of adenoviral vectors, the expression of the reporter gene lacZ was observed (Larkin 1996, Transplantation 61: 363-370). Reporter gene expression was also started human corneal endothelial cells after adenoviral transfer and the ex- Endothelial cells after adenoviral transfer and the expression of CTLA4lg in observed in vitro (Oral et al. 1997, Gene Ther 4: 639-647). A variation of the me The method, which uses the so-called lipoadenofection, has also been published (Aran chibia-Carcamo et al. 1998, Transplation 65: 62-67).

Eine Reihe weiterer Transfektionsversuche ist beschrieben. So verhindert der Ep stein-Barr-Virus-vermittelte Transfer von IL-10-Expressionsvektoren die Allograft- Abstoßung bei der Transplantation von Herzmuskelgewebe in Kaninchen (Brauner et al. 1997, J Thorac Cardiovasc Surg 114: 923-933).A number of other transfection attempts are described. So the ep Stein-Barr virus-mediated transfer of IL-10 expression vectors to the allograft Rejection in the transplantation of cardiac muscle tissue in rabbits (Brauner et al. 1997, J Thorac Cardiovasc Surg 114: 923-933).

Die Herpesvirus-induzierte Autoimmunreaktion (Herpetic Stromal Keratitis) konnte bei Mäusen durch die Applikation von CTLA4lg Fusionsprotein unterdrückt werden. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).The herpes virus-induced autoimmune reaction (Herpetic Stromal Keratitis) could in mice can be suppressed by the application of CTLA4lg fusion protein. (Gangappa et al. 1998, Clin Immunol Immunopathol 86: 88-94).

Der nichtvirale Reportergentransfer auf der Basis eines peptidbasierten Systems wurde bei verschiedenen Spezies, darunter Mensch, publiziert (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).Non-viral reporter gene transfer based on a peptide-based system has been published in various species, including humans (Shrewing et al. 1997, Transplantation 64: 763-769).

Es sind etliche Verfahren zum Einbringen von Targets in Zielzellen bekannt, bei spielsweise Transfektion, Lipofektion, Injektion, "ballistischer Transfer" (siehe WO 91/07487 und DE 44 16 784), virale Vektoren oder Elektroporation. So ist es be kannt, dass sich Hornhautepithelzellen durch Elektroporation mit Reportergenen transfizieren lassen (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).A number of methods for introducing targets into target cells are known from for example transfection, lipofection, injection, "ballistic transfer" (see WO 91/07487 and DE 44 16 784), viral vectors or electroporation. So it is knows that corneal epithelial cells can be removed by electroporation with reporter genes can be transfected (Oshima et al. 1998, Gene Ther: 1347-54).

Hantelförmige Expressionskonstrukte sind in WO 98/21322 beschrieben.Dumbbell-shaped expression constructs are described in WO 98/21322.

Aus der WO 98/56417, sowie der WO 96/31229 und EP 0 682 039 ist bekannt, dass sich die Abstoßungsreaktion durch Inhibition kostimulatorischer Signale unterdrü cken lässt.It is known from WO 98/56417, WO 96/31229 and EP 0 682 039 that the rejection reaction is suppressed by inhibition of costimulatory signals leaves.

Bislang ist die Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion nach Hornhauttransplanta tion durch die Expression geeigneter Gene nach Kenntnis der Anmelderin bisher nicht beschrieben worden. Die bisherigen Erkenntnisse zur Entstehung der Immun reaktion weisen daraufhin, dass es zur Unterdrückung einer Immunantwort wichtig ist, innerhalb des transplantierten Gewebes möglichst frühzeitig eine Expression der Th2 Zytokine IL4 und/oder der extrazellulären Domäne des CTLA4-Liganden oder anderer Hemmer der ko-stimulatorischen Signale zu ermöglichen.So far, the suppression of a rejection reaction after corneal transplant tion by the expression of suitable genes to the knowledge of the applicant so far has not been described. The previous knowledge about the development of the immune system reaction indicate that it is important in suppressing an immune response is an expression of the within the transplanted tissue as early as possible Th2 cytokines IL4 and / or the extracellular domain of the CTLA4 ligand or to allow other inhibitors of the co-stimulatory signals.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung, geeignete Mittel bereitzustellen, um die postoperative Unterdrückung der Abstoßungsreaktion und somit eine dauerhafte Toleranz des Transplantats zu er möglichen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, den Transfer von therapeutisch wirksamen Nukleisäurekonstrukten ins Augengewebe, insbesondere die Hornhaut, zu ermöglichen, insbesondere in einer Form, in der die transferierten Nukleinsäure konstrukte operational aktiv sind, d. h. abgelesen werden können.Based on this prior art, it is the task of those described here Invention to provide suitable means for the postoperative suppression of the Rejection reaction and thus a permanent tolerance of the graft to it possible. Furthermore, it is an object of the invention to transfer from therapeutic effective nucleic acid constructs in the eye tissue, especially the cornea, to enable, especially in a form in which the transferred nucleic acid constructs are operationally active, d. H. can be read.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass sog. Expressionskon strukte, also DNA-Polymere, insbesondere solche, welche eine für ein immunmodu latorisches Protein oder Polypeptid kodierende Sequenz unter Kontrolle eines funk tionellen Promotors sowie eines funktionellen Polyadenylierungssignals tragen, in das Gewebe der Hornhaut oder andere das Auge umgebende Gewebeverbände so eingebracht werden, dass diese Expressionskonstrukte zur Synthese des immun modulatorischen Proteins oder Peptides, oder einer Mehrzahl derselben, führen.According to the invention, this object is achieved in that so-called expression con structs, so DNA polymers, especially those that are one for an immune module regulatory protein or polypeptide coding sequence under the control of a radio tional promoter and a functional polyadenylation signal, in the tissue of the cornea or other tissue associations surrounding the eye be introduced that these expression constructs for the synthesis of the immune modulatory protein or peptides, or a plurality thereof.

Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte sog. minimalistische Hantelkonstrukte, d. h. hantelförmige, lineare doppelsträngige kovalent geschlossene Nukleinsäuremo leküle, eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE 196 48 625 beschrieben sind. Diese bieten den Vorteil, keine Sequenzen zu enthalten, die nicht dem unmittelba ren Zweck der Behandlung dienen, und sind deswegen kleiner sowie auch hinsicht lich des Charakters der durch die DNA selber induzierten Immunantwort sicherer. Das hierbei wesentliche Problem ist, dass in bakterieller DNA vorkommende un methylierte Sequenzen der generellen Basenfolge NNCGNN (mit N: jede Base, C: Cytosin; G: Guanin) eine starke immunstimulatorische Wirkung haben können, und dabei vor allem den zytotoxischen, also Transplantat-Abstoßungs-vermittelnden Arm der Immunantwort stärken. Die besagten minimalistischen Hantelkonstrukte minimieren die Anzahl der auf ihnen enthaltenen immunstimulatorischen Sequenz elemente und damit die stärke des DNA-induzierten cytotoxischen Stimulus.So-called minimalistic dumbbell constructs are preferred as expression constructs, d. H. dumbbell-shaped, linear double-stranded covalently closed nucleic acid mo leküle used, as described for example in DE 196 48 625. The advantage of this is that they do not contain any sequences that are not immediately serve the purpose of the treatment, and are therefore smaller as well as respect the character of the immune response induced by the DNA itself is more certain. The main problem here is that un methylated sequences of the general base sequence NNCGNN (with N: each base, C: Cytosine; G: guanine) can have a strong immunostimulatory effect, and above all the cytotoxic, i.e. graft rejection mediators Strengthen the arm of the immune response. The said minimalist dumbbell constructions minimize the number of immunostimulatory sequences contained on them elements and thus the strength of the DNA-induced cytotoxic stimulus.

Als Transfektionsmethode kommt prinzipiell jede Methode in Frage, welche DNA in Zellen zur Expression bringen kann, also v. a. Lipofektion, peptidvermittelte Methoden, Elektroporation oder der ballistische Transfer, wie er beispielsweise in der EP 0 686 697 beschrieben ist. Die zuletzt genannte Methode, der Transfer durch Be schuß des zu transfizierenden Gewebes mit stark beschleunigten Partikeln, ist ge nerell sehr effektiv, da die DNA direkt in den Kern der zu transfizierenden Zellen transportiert wird. Alle anderen nicht-viralen Methoden leiden unter einer z. T. gerin gen Effizienz dieses Kerntransports. Die Natur der ballistischen Transfermethode bringt es allerdings auch mit sich, dass ein Teil des Gewebes durch die Behandlung geschädigt wird, und dass Partikel in dem transfizierten Gewebe abgeladen werden. Es konnte ferner festgestellt werden dass auch die direkte, postoperative Transfek tion von Implantaten mittels einer sog. "Gene Gun" (Bio-Rad, München, WO 95/19799) zur deutlichen Verzögerung der Abstoßungsreaktion bei hornhauttrans plantierten Mäusen führt, und dass in der ophtalmologischen Untersuchung des behandelten Auges keine Schädigungen entdeckt werden konnten, die den Gebrauch der Methode beim Patienten ausschließen würden.In principle, any method that uses DNA as a transfection method can be used Can express cells, so v. a. Lipofection, peptide-mediated methods, Electroporation or ballistic transfer, as described, for example, in EP 0 686 697 is described. The latter method, the transfer by Be shot of the tissue to be transfected with strongly accelerated particles is ge Very effective because the DNA is directly in the nucleus of the cells to be transfected is transported. All other non-viral methods suffer from e.g. T. gerin efficiency of this core transport. The nature of the ballistic transfer method However, it also involves part of the tissue from the treatment is damaged, and that particles are deposited in the transfected tissue. It was also found that the direct, postoperative transfect tion of implants using a so-called "gene gun" (Bio-Rad, Munich, WO 95/19799) to significantly delay the rejection reaction in corneal trans planted mice leads, and that in the ophthalmic examination of the treated eye no damage could be detected that the Would exclude use of the method in the patient.

Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung von Stammzellen oder Stamm zelltransplantaten, besonders des Limbusepithels. Stammzellen kommen überall dort vor, wo Zellen kontinuierlich erneuert werden müssen. Sie sind die Reservezel len für die Zellproliferation und teilen sich immer dann, wenn ein Bedarf für Zeller neuerung besteht. Aufgabe der Zellerneuerung ist es, die Anzahl der Zellen kon stant zu erhalten, so dass einerseits nicht zu viele Zellen gebildet, und andererseits ein plötzlicher Zellverlust ausgeglichen werden kann. Bei Bedarf können einzelne Stammzellen zu Teilungszellen werden. Das Epithel der Hornhautoberfläche ist ei nem konstanten Prozeß der Zellerneuerung unterworfen, bei dem abgeschilferte Zellen durch neue ersetzt werden müssen. Nur die unterste Zellschicht enthält Zel len, die sich teilen können. Dadurch entsteht eine vertikale Wanderungsbewegung. Gleichzeitig besteht eine horizontale Zellwanderungsbewegung vom Limbus zum Zentrum. Stammzellen gibt es nur im basalen Limbusepithel. Die Regeneration der Augenoberfläche beispielsweise nach Verätzungen wird maßgeblich von der Integri tät des Limbusepithels beeinflußt. Ein Verlust aller Stammzellen führt zu schwersten Wundheilungsstörungen. Eine medikamentöse Therapie der Limbusinsuffizienz ist nicht möglich. Lediglich eine Limbustransplantation verbessert die Situation und führt zur Wundheilung. Allogene Transplantate bieten jedoch wenig Aussichten auf Erfolg, da in das transplantierte Gewebe Gefäße einwachsen und sehr wahrschein lich eine Immunreaktion folgt. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96(5): 709-22). The invention is also suitable for the treatment of stem cells or stem cell transplants, especially the limbus epithelium. Stem cells come everywhere wherever cells have to be renewed continuously. They are the reserve tent len for cell proliferation and divide whenever there is a need for cell innovation exists. The task of cell renewal is to count the number of cells Stant to get, so that on the one hand not too many cells are formed, and on the other hand a sudden cell loss can be compensated. If necessary, individual Stem cells become division cells. The epithelium of the corneal surface is egg subjected to a constant process of cell renewal, in which the peeled off Cells need to be replaced with new ones. Only the lowest cell layer contains Zel len that can share. This creates a vertical migration movement. At the same time, there is a horizontal cell migration movement from the limbus to the Center. Stem cells are only found in the basal limbus epithelium. The regeneration of the The surface of the eye, for example, after burns, is largely determined by the integri affected by the limbal epithelium. A loss of all stem cells leads to the most severe Wound healing disorders. Drug therapy for limbus insufficiency is not possible. Only a limbus transplant improves the situation and leads to wound healing. However, allogeneic grafts offer little prospect Success because vessels grow into the transplanted tissue and are very likely An immune reaction follows. (Kenyon 1989, Ophthalmology 96 (5): 709-22).

Der Vorteil der Behandlung von Stammzellen mit dem erfindungsgemäßen Mittel ist daher offensichtlich, wird dadurch doch die auf die Abstossung des Transplantats gerichtete Immunabwehr gezielt unterdrückt, ohne dass eine Infektionsgefahr geför dert wird.The advantage of treating stem cells with the agent according to the invention is therefore obvious, because it is the rejection of the graft targeted immune defense suppressed without risk of infection is changed.

Die Erfindung eignet sich aber auch zur Behandlung der virusinduzierten Keratitis. So haben experimentelle Untersuchungen gezeigt, dass das lymphozytäre Infiltrat in der Hornhaut während der Entwicklungsphase der Herpes simplex Keratitis vorran gig Th1 Zellen enthält, welche IL2 und IFN-Gamma produzieren, während IL4 pro duzierende Th2 Zellen an der Abheilung beteiligt sind (Niemialtowski 1992, J Immu nol 148: 1864-70). Das Ziel einer Therapie besteht darin, die Immunabwehr gezielt zu unterdrücken, ohne die Infektion zu fördern. Im Tierexperiment ist dies bereits gelungen. Durch die systemische und intracorneale Gabe von IL10 vor der HSV- Infektion konnte die Entzündung der Hornhaut erheblich reduziert werden, ohne die Abwehrkraft zu schwächen (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Ebenso konn te die Entzündung durch Gabe von Anti-Interferon-gamma und anti-IL2 bei aller dings geschwächter Abwehrkraft reduziert werden (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).However, the invention is also suitable for the treatment of virus-induced keratitis. Experimental studies have shown that the lymphocytic infiltrate in the cornea during the development phase of herpes simplex keratitis gig Th1 contains cells that produce IL2 and IFN-gamma, while IL4 pro inducing Th2 cells are involved in the healing process (Niemialtowski 1992, J Immu nol 148: 1864-70). The goal of therapy is to target the immune system to suppress without promoting the infection. This is already the case in animal experiments succeeded. Systemic and intracorneal administration of IL10 before HSV The inflammation of the cornea could be significantly reduced without the infection To weaken the immune system (Tumpey 1994, J Immunol 153: 2258-65). Likewise Inflammation caused by anti-interferon-gamma and anti-IL2 in all weakened immune system (Hendricks 1992, J Immunol 149: 3023-3028).

Bevorzugt werden als Expressionskonstrukte für die Unterdrückung der Transplan tationsabstoßung bzw. der virusinduzierten Keratitis solche, die die Cytokine IL-4, IL-10, den extrazellulären Teil von CTLA4 oder Inhibitoren anderer ko stimulatorischer Signale, zum Beispiel nicht-signalinduzierende Antikörper gegen CD-40 oder CD-40-Ligand zur Expression bringen. Bevorzugte Promotoren sind der Immediate-Early-Promotor des Cytomegalievirus sowie andere virale Promotoren (SV40) und gewebespezifische Promotoren, insbesondere für Hornhautzellen des Auges spezifische Keratingenpromotoren.Preferred as expression constructs for suppression are the transplanes rejection or virus-induced keratitis, those which the cytokines IL-4, IL-10, the extracellular part of CTLA4 or inhibitors of other ko stimulatory signals, for example non-signal-inducing antibodies against Express CD-40 or CD-40 ligand. Preferred promoters are Immediate early promoter of the cytomegalovirus and other viral promoters (SV40) and tissue-specific promoters, especially for corneal cells of the Eye-specific keratin gene promoters.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist, dass durch die Expression der biologisch aktiven Proteine durch die Zellen des Gewebes, in dem sie wirken sollen, die Not wendigkeit der Stabilisierung durch Fusion mit Fremdpeptiden wegfällt, wie sie z. B. für das CTLA-4 durch Fusion mit Immunoglobulinpeptiden verwendet wird. Die exprimierten bioaktiven Proteine werden dadurch kleiner und können leichter im Gewebe diffundieren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von Expressionsvektoren für Proteine und Peptide gegenüber der Verwendung rekombinanter Proteine und Peptide.A major advantage of the invention is that by the expression of the biologically active proteins through the cells of the tissue in which they are supposed to act, the need Maneuverability of stabilization by fusion with foreign peptides, such as z. B. for which CTLA-4 is used by fusion with immunoglobulin peptides. The expressed bioactive proteins are smaller and can be more easily Diffuse tissue. This is a major advantage of using expression vectors for proteins and peptides versus using recombinant Proteins and peptides.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren wie folgt näher dargestellt:Further advantageous measures are contained in the remaining subclaims. The invention will be explained in more detail using exemplary embodiments and figures as follows shown:

1. Synthesis of DNA polymers (dumbbell constructs)

Expressionsvektor für murines CTAL4: 10 mg Plasmid pG mCTLA4 wurden mit Re striktionsenzym EcoRI (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 196 48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.Expression vector for murine CTAL4: 10 mg plasmid pG mCTLA4 were labeled with Re restriction enzyme EcoRI (MBI, Leon Rot) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analogous to that in DE 196 48 625 included regulation on dumbbell constructions implemented.

Expressionsvektor für murines Interleukin 4: 10 mg Plasmid pG mlL4 wurden mit Restriktionsenzym EcoRI (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 196 48 625 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.Expression vector for murine interleukin 4: 10 mg plasmid pG mlL4 were also analyzed Restriction enzyme EcoRI (MBI, Leon Rot) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AATTCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analogous to that in DE 196 48 625 included regulation on dumbbell constructions implemented.

Das Reportergen Luciferase (zur Methodik siehe das Handbuch der Firma Prome ga, Madison, Wisconsin, USA, unter http://www.promeqa.com/tbs/tm033/tm033.html ) wurde als Marker verwendet, um die erfolgreiche Behandlung von Hornhautzellen mittels ballistischen Transfer und damit die erfolgreiche Umsetzung der Erfindung nachzuweisen.The reporter gene luciferase (for methodology, see the Prome manual ga, Madison, Wisconsin, USA, at http://www.promeqa.com/tbs/tm033/tm033.html ) was used as a marker to successfully treat corneal cells by means of ballistic transfer and thus the successful implementation of the invention to prove.

Expressionsvektor für Luciferase: 10 mg Plasmid pMOL Lux wurden mit Restrikti onsenzym Eco31l (MBI, Leon Rot) und Haarnadel-Oligodesoxyribonukleotid AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG und GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analog der in DE 198 26 758 enthaltenen Vorschrift zu Hantelkonstrukten umgesetzt.Expression vector for luciferase: 10 mg of plasmid pMOL Lux were restricted Onsenzym Eco31l (MBI, Leon Rot) and hairpin oligodeoxyribonucleotide AGGGCGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG and GGGACGGCCG GCCGTTTTCG GCCGGCCG (TIB, Berlin) analogous to the regulation contained in DE 198 26 758 Dumbbell constructions implemented.

2. Keratoplasty

Die Technik der Transplantation der Hornhaut im Mausmodell ist genau beschrieben worden ("Orthotopic corneal transplantation in the mouse - a new surgical technique with minimal endothelial cell loss": Er-Ping Zhang et al. 1996, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 714-719). Kurz dargestellt läuft diese wie folgt ab: Die Trans plantation der Hornhaut wird in 5 Monate alten BALB/c (H-2d) Mäusen durchgeführt. MHC-differente C3h(H-2k) Mäuse dienen als Spender. Empfängermäuse werden mit einer Mischung aus 6 mg/kg Körpergewicht Xylazine (Rompun, Bayer) und 75 mg/kg Körpergewicht Ketamine Hydrochlorid (Ketanest, Parke-Davis) betäubt. Die Spenderhornhaut wird mit einer Catroviejo-Schere entnommen. Die Hornhaut wird in das Empfängerauge mit 8 Nähten eingenäht. Am Ende der Operation werden die Augenlider für 24 Stunden zugenäht. Die Mäuse werden 11 Tage lang mit Cortison behandelt (5 × täglich, 2 Tropfen Spersadex Lösung).The technique of corneal transplantation in the mouse model is described in detail ("Orthotopic corneal transplantation in the mouse - a new surgical technique with minimal endothelial cell loss ": Er-Ping Zhang et al. 1996, Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 714-719). Briefly, this works as follows: The Trans Corneal plantation is performed in 5 month old BALB / c (H-2d) mice. MHC-different C3h (H-2k) mice serve as donors. Become recipient mice with a mixture of 6 mg / kg body weight xylazine (Rompun, Bayer) and 75 mg / kg Body weight anesthetized ketamine hydrochloride (Ketanest, Parke-Davis). The Donor cornea is removed using Catroviejo scissors. The cornea will sewn into the receiver eye with 8 seams. At the end of the operation, the Eyelids sewn for 24 hours. The mice are given cortisone for 11 days treated (5 times a day, 2 drops of Spersadex solution).

3. Ballistic gene transfer in mouse eyes

Die Transfektion der Hornhaut erfolgt am Tag 11 mit einem kommerziell erhältlichen Apparat zum ballistischen Transfer (Modell "Helios", Bio-Rad, München). Für jede Transfektion wird 0.1-0.5 mg Gold (1,6 µm; Bio-Rad) eingesetzt, welches nach Vorschrift des Herstellers mit 1 µg minimalistischen Genepressionsvektoren codie rend für murines CTLA4 und/oder murines Interleukin 4 (Zusammensetzung der Beladung variiert ja nach experimentellen Parametern) beladen wurde. Die 1,6 µm großen Goldpartikel werden mit Helium unter Druck (200 psi) auf das transplantierte Auge am Tag 10 nach Operation beschleunigt.The transfection of the cornea takes place on day 11 with a commercially available one Ballistic transfer device (model "Helios", Bio-Rad, Munich). For every Transfection is used 0.1-0.5 mg gold (1.6 µm; Bio-Rad), which according to Manufacturer's specification with 1 µg minimalistic gene expression vectors codie rend for murine CTLA4 and / or murine interleukin 4 (composition of the Loading varies depending on experimental parameters). The 1.6 µm Large gold particles are grafted onto the transplant using helium under pressure (200 psi) Eye accelerated on day 10 after surgery.

Zur Messung der Expression von Transgenen wurden minimalistische Expressions vektoren, kodierend für Luciferase, in die nativen Hornhäute von Mäusen mit der gleichen Methodik eingebracht, wie oben für CTLA4 und IL-4 beschrieben. Die Hornhäute wurden zum Zeitpunkt der Messung entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und nach bekannten Methoden (s. oben: Katalog von Promega Inc. Madison, Wisconsin, USA) auf die Expression von Luciferase untersucht. Die Ergebnisse der Messungen sind in Fig. 1 gezeigt. Daraus ist ein Maximum der Expression schon nach 24 Stunden erkennbar. Die dargestellten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen.To measure the expression of transgenes, minimalistic expression vectors coding for luciferase were introduced into the native corneas of mice using the same methodology as described above for CTLA4 and IL-4. The corneas were removed at the time of the measurement, snap frozen in liquid nitrogen, homogenized and examined for the expression of luciferase by known methods (see above: catalog from Promega Inc. Madison, Wisconsin, USA). The results of the measurements are shown in Fig. 1. From this, a maximum of expression can be seen after only 24 hours. The measured values shown are mean values from three measurements.

Ebenso wurden Expressionsvektoren für IL-4 und IL-10 in Mäusecorneae einge bracht. Die Ergebnisse der Expression, ermittelt mit einem handelsüblichen ELISA für die betreffenden Genprodukte, sind in Fig. 2 dargestellt. Mit der ballistischen Methode wurden Corneae wie beschrieben transfiziert. Es wurden mit Expressions vektoren für die bezeichneten Gene beschichtete Goldpartikel der Grösse 1 µm ein gesetzt, als Kontrolle wurden Mäuseaugen mit unbeschichtetem Gold analog be handelt. Man erkennt eine von einem niedrigen Basalniveau um zwei Grössenor dungen erhöhte Expression des transfizierten Zytokingens im Falle des IL-4, sowie eine ebenfalls deutlich erhöhte Expression des IL-10, allerdings von einem, mut masslich durch die Transfektionsmethode, bereits erhöhtem Niveau. Die dargestell ten Messwerte sind Mittelwerte von 3 Messungen.Expression vectors for IL-4 and IL-10 were also introduced into mouse corneae. The results of the expression, determined using a commercially available ELISA for the gene products in question, are shown in FIG. 2. Corneae were transfected using the ballistic method as described. Coated gold particles with a size of 1 μm were used with expression vectors for the designated genes; mouse eyes were treated with uncoated gold analogously as a control. One recognizes an expression of the transfected cytokine gene increased in the case of the IL-4 from a low basal level by two magnitudes, as well as an also significantly increased expression of the IL-10, but of an already increased level, presumably due to the transfection method. The measured values shown are mean values of three measurements.

Die Ergebnisse der Transplantatüberlebensuntersuchung sind in den Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. In Fig. 3 ist die Anzahl der bis zur klinisch manifesten Abstossungsre aktion des Tranplantats vergangenen Tage auf der Y-Achse über den verschiede nen Gruppen aufgetragen; in Fig. 4 auf der X-Achse.The results of graft survival study are shown in FIGS. 3 and Fig. 4. In Fig. 3, the number of days past until the clinically manifest rejection reaction of the graft is plotted on the Y axis over the various groups; in Fig. 4 on the X-axis.

Claims

1. Means for gene therapy treatment of corneal diseases of the human or animal eye to suppress the transplant ons rejection, consisting of an expression construct with one for one immunomodulatory protein or polypeptide coding sequence below Control of a functional promoter and a functional polyadeny lation signal.

2. Composition according to claim 1, wherein the expression product is the cytokine interleu kin 4 (IL-4) expresses.

3. Composition according to claim 1, wherein the expression product of the cytoknn interleu kin 10 (IL-10) expresses.

4. Composition according to claim 1, wherein the expression product of the extracellular Expresses part of CTLA4 (CD 152).

5. Composition according to claim 1, wherein the expression product inhibitors of ko stimulatory signals, especially non-signal-inducing protein of CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B-7.2 or CD-28 ter in particular antibodies against CD-40 or CD-40 ligand, or B7.1, B- 7.2 or CD-28, expresses.

6. Composition according to one or more of claims 1 to 5, wherein the Promoto ren are selected from the group of the immediate early promoter of the Cy tomegalievirus (CMV) or the viral promoter (SV40) or for cornea cells of the eye tissue-specific keratin gene promoters.

7. Composition according to at least one of the preceding claims, wherein the Expression constructs dumbbell-shaped, linear double-stranded covalently ge are closed nucleic acid molecules.

8. Composition according to claim 1, wherein this in the tissue of the cornea or tissue surrounding the eye is inserted so that the se expression constructs for the synthesis of the immunomodulatory protein or peptides, or a plurality thereof.

9. Medicament or vaccine containing the agent according to claim 1 to 8 Use in gene therapy.

10. Procedure for the treatment of corneal diseases of the human or animal eye, in which the cornea or parts thereof with a Agent according to claim 1 to 8 is treated.

11. The method according to claim 10, wherein the agent via transfection, lipofection, Injection, ballistic transfer, viral vectors, electroporation or any other means is introduced into cells of the cornea or parts thereof.

12. The method of claim 10 or 11, wherein isolated corneal cells with the agent are treated according to claims 1 to 8.

13. The method according to claim 10 or 11, wherein stem cells of the limbuse epithelium of the human or animal eye by means of the An Proverbs 1 to 8 are treated.

14. Corneal cells treated with an agent according to claims 1 to 8.