WO2001062274A1 - Uso combinado de la quimiocina ip-10 y la interleucina-12 en la preparacion de composiciones para el tratamiento de tumores malignos - Google Patents

Uso combinado de la quimiocina ip-10 y la interleucina-12 en la preparacion de composiciones para el tratamiento de tumores malignos Download PDF

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WO2001062274A1
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tumor
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Iñigo NARVAIZA CUERVAS-MONS
Guillermo Mazzolini Rizzo
Ignacio Melero Bermejo
Cheng Qian
Jesús PRIETO VALTUEÑA
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Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A.
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the described invention comprises the therapeutic use of the combination of two immunoregulatory substances, 10kD interferon ⁇ -inducible protein (IP-10) and interleukin-12 (IL-12), to combat diseases of neoplastic origin and / or increase the intensity of the immune response of cytotoxic T lymphocytes.
  • IP-10 interferon ⁇ -inducible protein
  • IL-12 interleukin-12
  • the administration of a combination of these substances entails the rejection of distant untreated tumor nodules and protects against the appearance of new tumor nodules, this being a model of metastatic tumor disease such as advanced colon carcinoma.
  • the administration of both substances can be carried out by injection of recombinant protein or by the use of gene expression or transfer systems that code for IP-10 and IL-12 so that they are expressed.
  • the described invention has application in the preparation of drugs or therapeutic compositions for the treatment of patients affected by malignant tumors of any type.
  • IP-10 interferon gamma-10
  • Crg-2 a chemokine that belongs to the family of ⁇ -chemokines or CXC chemokines capable to stimulate at least the CXCR3 chemokine receptor (5-7).
  • the expression pattern of the CXCR3 receptor explains that IP-10 is capable of attracting, at least in-vitro, exclusively activated T lymphocytes and NK cells, but not virgin lymphocytes (5, 8-10). Tumor cell lines capable of stably expressing IP-10 are rejected by immune mechanisms (11).
  • IP-10 has been shown to possess antitumor properties based on its ability to inhibit tumor angiogenesis (12-14). This angiostatic effect seems not to be mediated by the CXCR3 receptor (15) and is of great importance in the antitumor effects of IL-12 in some animal models (16).
  • chemokine genes such as the lymphotactin (17) or MIP1- ⁇ (18) gene have been transfected into tumor cells where, when expressed and despite attracting T lymphocytes to the malignant tissue, tumor rejection is not achieved (17,18 ).
  • chemokines with other cytokines or costimulatory molecules with the capacity to activate lymphocytes, such as IL-2, B7-1 and IL-12, results in an outstanding antitumor effect (17,19,20).
  • Interleukin-12 is a cytokine produced naturally by macrophages (21) and dendritic cells (22) that plays a central role in the induction of cellular immune responses (23). It has been observed that IL-12 is capable of inducing important antitumor effects based on the amplification of cytotoxic activity by cytotoxic T lymphocytes (CTL), Th1 differentiation, activation of NK cells (21), and inhibition of tumor vascularization (24) . Unfortunately, the first attempts to test the clinically purified recombinant IL-12 failed due to dose-dependent toxicity (25,26).
  • the transgene is under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • CT26 cells adeno-colon carcinoma cell line induced by the N-nitroso-N-methylurethane carcinogen in BALB / c mice (H-2 d ) (30)
  • IP-10 and IL-12 genes transferred to the malignant cells by recombinant adenoviruses, rejection of tumor nodules by an immunological mechanism occurs, so that the The resulting effect of the combination is quantitatively and qualitatively different from that obtained with gene transfer of IP-10 or IL-12 separately.
  • the 293 cell line (human kidney embryonic cells stably transfected with the E1 region belonging to human adenovirus type 5, ECACC No. 85120602) allows the adenoviruses used, defective for this region of the adenoviral genome, to replicate inside 293 cells.
  • the HepG2 cell line is a human hepatoblastoma line.
  • the Cre8 cell line derived from 293, has an expression cassette based on the promoter of the ⁇ -actin gene that controls the Cre recombinase gene with an N-terminal nuclear localization signal stably integrated into the 293 cell line, and was ceded by Dr. S. Hardy (University of California, San Francisco, USA).
  • the culture medium used to grow these cell lines was complete DMEM (supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) inactivated at 56 ° C, 2 mM glutamine, 100 U / ml streptomycin, 100 mg / ml penicillin).
  • FCS fetal calf serum
  • the CT26 cell line kindly provided by Dr. K. Brand, Max-Planck-lnstitut fur Biochemie, Germany, is derived from a BALB / c mouse colorectal adenocarcinoma and was induced by the N-nitroso-N-methyl-urethane carcinogen.
  • the YAC-1 cell line (ATCC) is derived from a lymphoma induced by the Moloney leukemia transformed virus of an A / Sn mouse.
  • the human mastocytoma line P815 (H-2 d ) was obtained through the ATCC.
  • These cell lines were cultured in complete RPMI 1640 medium (supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) inactivated at 56 ° C, 2 mM glutamine, 100 U / ml streptomycin, 100 mg / ml penicillin).
  • FCS fetal calf serum
  • the cells described were cultured in humidified incubator chambers at 37 ° C and in a 5% C0 2 atmosphere.
  • Reagents for cell cultures are from Gibco (Basel, Switzerland), and culture plates are from Greiner Labortecknik (Frickenhausen, Germany) and TPP (Trasadingen, Switzerland).
  • mice Female BALB / c mice between 5 and 8 weeks were used (Charles Rives, Barcelona). During the period of experimentation the animals were kept in the animal shelter of the Center for Research in Applied Pharmacobiology (CIFA) of the University of Navarra in accordance with the rules that govern the institution.
  • CIFA Applied Pharmacobiology
  • the Crelox system was used (27).
  • Spleen cells obtained from an 8-week-old BALB / c mouse were cultured in vitro with complete RPMI medium on a 10 cm diameter plate (TPP, Trasadingen, Switzerland) and stimulated for 3 hours with lipopolysaccharide at a concentration of 20 ng / ml (SIGMA, Madrid, Spain) maintained at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • RNA from said cells was then extracted and purified with the denaturing solution of Ultraspect TM proteins (Biotecx Inc., Houston, TX, USA) followed by the method of Chomcznski and Sacchi (31). From a 1 ⁇ g sample of said RNA, the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique was performed using a thermocycler (Perkin-Elmer Gene Amp PCR system 2400) to obtain and amplify the complementary DNA (cDNA) of mlP-10.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • M-MuLV reverse transcriptase Gibco-BRL, Gaithersburg, Md, USA
  • 5x saline solution 250mM Tris-HCI pH 8.3, 374 mM KCI, 15mM MgCI 2
  • 5mM DTT 0.5mM deoxyribonucleot
  • a 20 ⁇ l (1 ⁇ g) aliquot of the cDNA was used for amplification of murine IP-10 by PCR in 60 ⁇ l of PCR buffer (160nM (NH 4 ) 2 S0 4 , 670mM Tris-HCI pH 8.8, 0.1% v / v Tween 20) supplemented with 1.5 mM MgCI 2 , 2 units of Biotaq TM DNA polymerase (Boline, London, UK) and 1 ⁇ l 10mM of specific sense and antisense primers of mlP-10: SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the amplification of mlP-10 cDNA was performed with 25 cycles (94 ° C, 64 ° C and 72 ° C for 45 seconds for each temperature). 40 ⁇ l of the PCR product were separated by electrophoresis in a 1.5% (w / v) agarose gel stained with ethidium bromide. The band obtained was visualized with an ultraviolet light lamp, cut and extracted from the gel, and the PCR product was purified by means of the DNA purification kit, Ultrafree-DA (Amicon-Milipore,
  • the 311 base pair fragment corresponding to the mlP-10 cDNA was cloned into plasmid pGEM-T using the PGEM-T vector system (Promega Co. Wl, USA) by a ligation reaction at 14 ° C for 12 hours using a T4 DNA ligase (Roche Diagnostics, Barcelona, Spain).
  • competent bacteria E. coli XL1-Blue Stratagen, La Jolla, Ca, USA were transformed.
  • the transformed bacteria were selected by their growth in Petri dishes with LB medium with ampicillin, since the vector contains a gene for resistance to this antibiotic.
  • Plasmid DNA was extracted from the positive bacteria using the MiniPrep technique (Qiagen, Germany) to subsequently digest 2 ⁇ g of said plasmid with the Sphl / Sall enzymes (Roche Diagnostics) and electrophoresis to separate the result of said digestion in a gel 1.5% agarose to check the presence of the insert.
  • Plasmids with the expected 311 base pair fragment were sequenced to rule out amplification errors in an ABI PRISM 310 automatic sequencer (Perkin Elmer, Foster.CA, USA), using the Dye Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin sequencing kit) Elmer)
  • the PGEM-T / mlP-10 plasmid fragment containing the mlP-10 cDNA with the sequence SEQ ID NO: 3 coincided with the sequences SEQ ID NO: 4 and 5 described in the literature (3, 4).
  • Said fragment was cleaved by digestion with the restriction enzymes Sphl / Sall (Roche Diagnostics), the digestion product was analyzed on a 1.5% agarose gel, the band containing the fragment with the mlP-10 cDNA It was purified with the Ultrafree-DA DNA Purification Kit (Amicon-Milipore). The ends were completed by the enzyme Klenow (Roche Diagnostics) and subcloned into the plasmid pAdLox, previously opened with the enzyme Bgl II (Roche Diagnostics and treated with alkaline phosphatase (Roche Diagnostics), by a ligation at 14 ° C for 16 hours with the same enzyme and conditions as in the previous case, with the result, competent bacteria E.
  • Klenow Roche Diagnostics
  • Bgl II Roche Diagnostics and treated with alkaline phosphatase
  • coli DH-5 ⁇ (Clontech, Palo Alto, CA, USA) were transformed, ampicillin-resistant bacteria were selected and the plasmid DNA was purified from sectioned colonies following The techniques described above: A screening was performed by digestion with the restriction enzymes Ncol and Smal (Roche Diagnostics) and the product was separated on a 1.5% agarose gel to check the presence and orientation of the insert (cDNA of Murine IP-10).
  • the plasmid obtained, pAdlox / mlP10 contains an expression cassette with mlP-10 under the control of the CMV promoter followed by the polyadenylation (polyA) signal, preceded by the encapsidation sequence of human type 5 adenovirus.
  • polyA polyadenylation
  • plasmid pAdlox / mlP-10 was co-transfected into Cre8 cells along with the purified adenovirus genome ina5 recombinant defective ( Figure 1A), according to the methods used by Hardy et al. (30), to generate a defective recombinant adenovirus containing the mlP-10 gene, AdCMVIP-10 ( Figure 1A).
  • the supernatant resulting from said cotransfection was amplified and analyzed to verify the presence of mlP-10 and rule out residual contamination with the ⁇ 5 virus according to the techniques described and used by the same authors (30,32).
  • the RT-PCR technique was used to clone the cDNA of the murine IP-10 gene from spleen cells of a BALB / c mouse stimulated with LPS.
  • the mlP-10 cDNA was subcloned following the CMV eukaryotic promoter and preceding a Padlox plasmid polyA signal containing the adenoviral packaging signal se ⁇ al and a lox-P region, the whole set is flanked by adenoviral ITRs.
  • AdCMVIP-10 adenovirus was generated by co-transfection of the Padlox / IP-10 plasmid and the ⁇ 5 virus genome (defective adenovirus in E1 and E3) in the 293 cell line expressing the CRE recombinant (CRE8). LoxP site level recombination catalyzed by Cre recombinase directs the generation of AdCMVIP-10.
  • the obtained supernatant medium containing AdCMVIP-10, was used to amplify the virus.
  • 3 ml of said supernatant per plate 293 cells grown in 150 mm diameter plates (between 20 and 40 plates) were infected at a confluence of 80% for 30 minutes at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the cells had cytopathic effect (2-4 days) they were collected and centrifuged at 1500 rpm for 10 min at 4 ° C, resuspended in Tris (pH 8) 0.1 M (18ml) and stored at -80 ° C until the process of virus purification
  • AdCMVIP-10 The adenovirus, AdCMVIP-10, produced was purified by two centrifugations in cesium chloride gradients and subsequent dialysis of the lysate of previously infected cells.
  • the bands of the different tubes were added to another Quick-seal tube with a saturated cesium chloride solution, so that the final density gradient ranged from 1.25 g / ml to 1.4 g / ml, and was subjected to a centrifugation identical to the previous one.
  • the new band obtained was extracted in the indicated manner and dialyzed against 1 liter of 0.01M Tris solution (pH 8) for 1-2 hours at 4 ° C with stirring twice, this process allows removing the remains of cesium chloride toxic to cells.
  • AdCMVIP-10 sterile glycerol (ICN, USA) as a cryogenic protector to a final concentration of 0.5% (v / v), aliquoted in 1 ml tubes (Costar) and stored at -80 ° C.
  • ICN sterile glycerol
  • AdCMVIP-10 In order to determine the infective titer (plaque forming units, pfu) of the AdCMVIP-10 solution produced, the 96-well limit plate dilution method (TPP) with 293 cells (32) was used. With this system 293 cells (10 4 cells per well) are infected with serial dilutions of the viral solution to determine the maximum dilution capable of producing cytopathic effect. Titration is performed in triplicate for each virus. The titres obtained were: AdCMVIP-10: 3.2x10 12 pfu / ml AdCMVIL-12: 4.2x10 12 pfu / ml AdCMVLacZ: 2.11x10 12 pfu / ml
  • the expression and secretion of mlP-10 by AdCMVIP-10 was analyzed by a Western Blot assay from the supernatant of HepG2 cells infected with said adenovirus.
  • HepG2 cells cultured in 10 cm diameter plates and at a confluence of 75-80% were infected with AdCMVIP-10 (MOI: 65) for 1 hour at 37 ° C and 5% CO 2 well transfected with Padlox / IP- 10 with Fugene TM (Roche) according to the manufacturer's instructions or left uninfected (negative control), the 3 plates were maintained with 2ml of 1640 medium without serum for 36 hours at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • Migration assays of cells through a membrane allow to evaluate the chemotactic capacity of a substance.
  • activated T cell migration assays were performed, through polycarbonate membranes, in response to supernatants of HepG2 cells infected with AdCMVIP-10.
  • Spleen cells obtained from BALB / c mice were cultured in 10 cm diameter culture plates for 2 hours at 37 ° C and 5% CO 2 with complete RPMI 1640 medium.
  • T cells were cultured with complete RPMI1640 supplemented with IL-2 (20 lU / ml) (Peprotech) and activated by adding 2 ⁇ g / ml of Con A (SIGMA) to the culture medium, after 2 days the cells were collected , washed and resuspended in RPMI 1640 0.5% fetal calf serum and a concentration of 6x10 6 cells / ml.
  • IL-2 20 lU / ml
  • SIGMA Con A
  • Activated T cells 100 ⁇ l at 6x10 6 cells / ml were deposited in the upper chamber of each well and in the lower chamber the different supernatants obtained, recombinant mouse IP-10 (100 ng / ml) or infected cell supernatant with AdCMVIP-10 with neutralizing monoclonal antibodies against mouse IP-10 (R&D) (2 ⁇ g / ml).
  • the assay was maintained for 2 hours at 37 ° C and in an atmosphere of 5% CO 2.
  • the membranes were fixed in a 1% (v / v) solution of glutaraldehyde in PBS for 1 hour and stained, then in 0.5% (w / v) toluidine blue in a 30% (v / v) EtOH solution in PBS.
  • the quantification of migrating T cells is carried out by counting the number of cells adhered to the underside of the polycarbonate membranes; 10 microscopic fields were counted per well. The experiment was performed in triplicate. As shown in Figure 2, the number of activated T cells attracted by the supernatants of cells infected with AdCMVIP-10 was significantly higher than in the control groups.
  • tumors were established by subcutaneous injection, with insulin syringes (Becton-Dickinson, Spain), of 5x10 5 CT26 colon adenocarcinoma cells resuspended in 50 ⁇ l saline solution (PBS) on the right flank of syngeneic mice BALB / c. After 10 days, when the tumors reached an average diameter of 5-8mm, the animals were randomly divided into groups and treated with 10 9 pfu of
  • Tumor growth was monitored for more than 60 days by measuring two perpendicular diameters of the tumor using a precision gauge. Those animals with tumors that exceeded 1.5 cm in both tumor diameters or 2 cm in one of their diameters were sacrificed for institutionally regulated ethical reasons and considered as the animal's death.
  • a potent antitumor therapeutic effect with the gene transfer of IL-12 by AdCMVIL-12 against colon adenocarcinoma derived from CT26 cells using doses of 10 9 pfu and 10 8 pfu (36,37) has been described by the inventors of this patent. ). Under these conditions, intratumoral injection of AdCMVIL-12 allows tumor eradication in 60-80% of cases. In order to evaluate the antitumor efficacy of the combination of the gene transfer of IP-10 and IL-12, the antitumor efficacy of the injection of AdCMVIP-10 with subtherapeutic doses of AdCMVIL-12 was tested so that the synergy between both substances was more evident.
  • tumors were established by subcutaneous injection of 5x10 5 CT26 colon adenocarcinoma cells resuspended in 50 ⁇ l saline (PBS) on the right flank of syngeneic BALB / c mice. After 10 days, when the tumors reached an average diameter of 5-8mm, the animals were divided into groups and treated with:
  • IP-10 + IL-12 combination allows obtaining the same antitumor efficacy in distant untreated tumors
  • another experimental model was developed by bilateral inoculation of 5x10 5 CT26 cells resuspended in 50 ⁇ l of saline solution (PBS) in both dorsolateral regions, in order to obtain two tumors simultaneously.
  • PBS saline solution
  • tumor nodules reached an approximate diameter of 5-6 mm, they were divided into groups, intratumoral administration, in the tumor of the right side of the animal, of AdCMVIL-12 (7.5x10 7 pfu), AdCMVIPIO (5x10 8 pfu) + AdCMVIL-12 (7.5x10 7 pfu) or saline solution and saline solution in all tumors of the left flank, the inoculated volume was 50 ⁇ l in all tumors. After treatment, the tumors were measured twice a week, for 90 days, to assess tumor regression. As can be seen in Table I, all mice treated with the IP-10 + IL-12 combination (6 of 6) rejected both treated and untreated tumors.
  • IP-10 and IL-12 have a synergistic effect in the induction of specific cytotoxic activity against the tumor.
  • the spleens of these animals 15 days after treatment the spleens of these animals and their cells used to measure the induction of specific cytotoxic activity against CT26 cells.
  • the spleens of each group of animals were disintegrated by using two frosted glass slides.
  • the red blood cells were then used by cell suspension in 2 ml of ACK lysis buffer solution (PBS with 0.83% (w / v) of (NH 4 ) KCI 2 ).
  • the spleen cell homogenate was washed by 3 7-minute centrifugations at 340 g in a 50 ml tube with 30 ml of clean RPMI 1640 medium per wash.
  • the cells were then re-stimulated for 6-7 days in 24-well culture plates with complete RPMI1640 medium.
  • Target CT26 were incubated with 100 ⁇ Ci of Na 2 Cr 51 0 4 per 10 6 cells for 1 hour at 37 ° C. After the uptake of this radioactive Cr 51 salt, the cells were washed by 3 centrifuges for 5 minutes at 280 g in a 50 ml tube with 30 ml of RPMI 1640 medium cleaned by centrifugation. The target cells were resuspended in complete RPMI 1640 medium at a concentration of 5x10 4 cells / ml and 100 ⁇ l / well of this suspension were seeded in 96-well plates (5x10 3 cells / well).
  • the spontaneous release of Cr 51 was determined from target cells cultured in the absence of effector cells in the same final volume of medium and incubated under the same conditions and the maximum release of Cr 51 from target cells under the same conditions as the above, but incubated with a detergent that smooths them, releasing all Cr 51 captured (0.8% Triton-X).
  • the peptides AH1 (SEQ ID NO: 6) (38) and P815AB (SEQ ID NO: 7) (39), restricted to H-2L d were synthesized following the FMOC technique (40) and its purity analyzed by high performance liquid chromatography affinity (HPLC). The release levels of Cr 51 were performed in the same manner as the previous experiment.
  • the results ( Figure 5B) show that cytotoxic activity is detected exclusively against P815 cells incubated with the peptide AH1 (specific antigenic determinant of CT26 cells) while cytotoxic activity is not detected against the other target cells. With these results it is demonstrated that the cytotoxic activity induced by the IP-10 + IL-12 combination is specific against the treated tumor and one of the antigens identified in it (38) and presented by the CMH-I H 2L molecule is recognized.
  • Figure 1A Construction of the defective recombinant adenovirus containing the murine gene IP-10 (AdCMVIP-10).
  • Figure 1 B Analysis by Western Blotting technique with a polyclonal antibody against murine protein IP-10 of supernatants of non-transfected HepG2 cells (1), infected with AdCMVIP-10 at an MOI of 65 (3), trans- fectated with plasmid pAdloxlP-10 (4) and recombinant mouse IP-10 protein as a positive control (2).
  • FIG. 1 Biofunctionality test of IP-10 encoded by AdCMVIP-10 by quantifying the ability to attract activated T lymphocytes:
  • FIG. 3 Effects of intratumoral injection with AdCMVIP-10.
  • FIG. 4 Combination of AdCMVIP-10 and AdCMVIL-12.
  • mice with subcutaneous tumors of CT26 cells received an intratumoral injection 9 days after tumor induction with adenoviruses: B) AdCMVIL-12, C) AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ, D) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12, E) AdCMVLacZ + AdCMVIL-12, F) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 or
  • FIG. 5 Intra-tumor transduction with IP-10 and IL-12 allows to increase specific cytotoxic T lymphocytes against the tumor
  • the spleens of Balb / c mice were extracted with subcutaneous tumors of CT26 cells treated with the indicated adenoviruses.
  • the cells of these spleens were re-stimulated in-vitro for 6 days with CT26 cells treated with Mitomycin-C to subsequently measure their cytotoxic activity against CT26 cells by 5-hour Cr 51 release assays.
  • the data represents the average of specific lysis levels (%) + SEM in different proportions of effector cells versus target cells (E: D), in abcisses, from three independent experiments.
  • IP-10 interferon-inducible gene
  • a macrophage LPS-inducible eariy gene j _ Q encodes the murine homologue of IP-10. Biochem Biopkys Res Commun 168: 1261.
  • IP-10 murine interferon-inducible protein 10
  • interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial ceils. J Exp Med 177: 1809. 9. Loetscher, P., M. Seitz, I. Clark-Lewis, M. Baggi ⁇ lini, and B. Moser. 1996. Activation of NK c ⁇ lls by CC chemokines. Chemotaxis, Ca2 + mobilization, and enzyme relée. JImmunol 156: 322.

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Abstract

La invención se relaciona con el uso combinado de la quimiocina IP-10 y la interleucina-12 como terapia frente a tumores malignos, así como el uso de IP-10 para potenciar el efecto antitumoral de IL-12. Estas dos sustancias son proteínas inmunomoduladoras que potencian la respuesta antitumoral. La administración en mamíferos de ambas sustancias en combinación permite aumentar la actividad antitumoral en el mamífero portador del tumor. La administración de ambas sustancias puede realizarse mediante proteína recombinante preparada in-vitro o mediante sistemas de expresión o transferencia génica que expresen dichas sustancias. La combinación de ambas substancias tiene un efecto sinérgico en la inducción de linfocitos citotóxicos específica frente a tumores. La combinación de ambas sustancias, en las proporciones y dosis adecuadas para cada caso, puede ser útil para el tratamiento de cualquier tipo de cáncer como por ejemplo el adenocarcinoma de colon.

Description

USO COMBINADO DE LA QUIMIOCINA IP-10 Y LA INTERLEUCINA-12 EN LA PREPARACIÓN DE COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES MALIGNOS.
Campo de la invención
La invención descrita comprende la utilización terapéutica de la combinación de dos sustancias inmunoreguladoras, proteína inducible por interferon γ de 10kD (IP-10) e interleucina-12 (IL-12), para combatir enfermedades de origen neoplásico y/o aumentar la intensidad de la respuesta inmunitaria de linfocitos T citotóxicos. Hemos comprobado que la combinación de ambas sustancias permite alcanzar una eficacia antitumoral mayor que la obtenida con cada una de ellas por separado, que su uso combinado aumenta la actividad citotóxica especifica mediada por linfocitos T CD8+ frente a las células tumorales y que IP-10 aumenta el efecto antitumoral de IL-12 de forma sinérgica. Asimismo hemos demostrado que la administración de una combinación de dichas sustancias conlleva el rechazo de nodulos tumorales distantes no tratados y protege frente a la aparición de nuevos nodulos tumorales siendo éste un modelo de la enfermedad tumoral metastásica como por ejemplo el carcinoma de colon avanzado. La administración de ambas sustancias puede realizarse mediante la inyección de proteína recombinante o mediante el uso de sistemas de expresión o transferencia de genes que codifican para IP-10 e IL-12 de modo que se expresen. La invención descrita tiene aplicación en la preparación de fármacos o composiciones terapéuticas para el tratamiento de pacientes afectados por tumores malignos de cualquier tipo.
Estado de la técnica
La proteína inducible por interferon gamma-10 (IP-10)(1 ,2) cuyo análogo en ratones se denomina Crg-2 (3,4), es una quimiocina que pertenece a la familia de las α-quimiocinas o CXC quimiocinas capaz de estimular al menos el receptor de quimiocinas CXCR3 (5-7). El patrón de expresión del receptor CXCR3 explica que IP-10 sea capaz de atraer, al menos in-vitro, exclusivamente linfocitos T activados y células NK, pero no linfocitos vírgenes (5, 8-10). Líneas celulares tumorales capaces de expresar establemente IP-10 son rechazadas mediante mecanismos inmunitarios (11 ). Además, se ha demostrado que IP-10 posee propiedades antitumorales basadas en su capacidad para inhibir la angiogénesis tumoral (12-14). Dicho efecto angiostático parece que no esta mediado por el receptor CXCR3 (15) y tiene gran importancia en los efectos antitumorales de IL-12 en algunos modelos animales (16).
Otros genes de quimiocinas como el gen de linfotactina (17) o de MIP1-α (18) han sido transfectados en células tumorales donde, al expresarse y a pesar de atraer linfocitos T al tejido maligno, no se consigue el rechazo tumoral (17,18). Sin embargo la combinación de dichas quimiocinas con otras citocinas o moléculas coestimuladoras con capacidad para activar linfocitos, tales como IL-2, B7-1 e IL-12, tiene como resultado un destacado efecto antitumoral (17,19,20).
La interleucina-12 es una citocina producida naturalmente por macrófagos (21 ) y células dendríticas (22) que juega un papel central en la inducción de las respuestas inmunes celulares (23). Se ha observado que la IL- 12 es capaz de inducir efectos antitumorales importantes basados en la amplificación de actividad citolítica por linfocitos T citotóxicos (CTL), diferenciación Th1 , activación de células NK (21 ), e inhibición de la vascularización tumoral (24). Desafortunadamente los primeros intentos para probar la IL-12 recombinante purificada en clínica fracasaron debido a toxicidad dosis-dependiente (25,26).
Descripción
Para estudiar los efectos antitumorales in-vivo de IP-10 y su combinación con IL-12, hemos optado por la transferencia génica mediada por adenovirus recombinantes defectivos. Para ello hemos generado un adenovirus recombinante defectivo que expresa la proteína IP-10 murina (mlP-10), AdCMVIP-10, mediante el sistema Cre-lox(27), y empleado un adenovirus recombinante defectivo que expresa IL-12 murina (AdCMVIL-12) y un adenovirus recombinante defectivo que expresa el gen de la β-galactosidasa como adenovirus control, ambos generados en nuestro laboratorio anteriormente (28,29). En los tres adenovirus citados el transgén está bajo control del promotor del Citomegalovirus (CMV). Como ejemplo de modelo tumoral in-vivo hemos utilizado la inyección subcutánea de células CT26 (línea celular de adeno-carcinoma de colon inducida por el carcinógeno N-nitroso-N- metiluretano en ratones BALB/c (H-2d) (30). Hemos demostrado experi- mentalmente que a resultas de un efecto sinérgico de la expresión combinada de los genes IP-10 e IL-12 transferidos a las células malignas mediante adenovirus recombinantes ocurre el rechazo de nodulos tumorales por un mecanismo inmunológico, de suerte que el efecto resultante de la combinación es cuantitativa y cualitativamente distinto del obtenido con la transferencia génica de IP-10 o IL-12 por separado.
Descripción detallada de la invención
Cultivos celulares
La línea celular 293 (células embrionarias de riñon humano transfectadas de forma estable con la región E1 perteneciente al adenovirus humano tipo 5, ECACC N° 85120602) permite que los adenovirus empleados, defectivos para esta región del genoma adenoviral, puedan replicarse en el interior de las células 293. La línea celular HepG2 es una línea de hepatoblastoma humano. La línea celular Cre8, derivada de 293, posee un cásete de expresión basado en el promotor del gen de la β-actina que controla el gen de la recombinasa Cre con una señal de localización nuclear N-terminal integrado establemente en la línea celular 293, y fue cedida por el Dr. S. Hardy (Universidad de California, San Francisco, USA). El medio de cultivo empleado para crecer estas líneas celulares fue DMEM completo (suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS) inactivado a 56°C, glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 mg/ml). La línea celular CT26, gentilmente cedida por el Dr. K. Brand, Max- Planck-lnstitut fur Biochemie, Alemania, deriva de un adenocarcinoma colorectal de ratón BALB/c y fue inducida por el carcinógeno N-nitroso-N-metil-uretano. La línea celular YAC-1 (ATCC) deriva de un linfoma inducido por el virus transformado de la leucemia Moloney de un ratón A/Sn. La línea de mastocitoma humano P815 (H-2d) fue obtenida a través de la ATCC. Estas líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 completo (suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS) inactivado a 56°C, glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 mg/ml).
Las células descritas fueron cultivadas en cámaras incubadoras humidificadas a 37°C y en una atmósfera al 5% de C02.
Los reactivos para los cultivos celulares son de Gibco (Basilea, Suiza), y las placas de cultivo son de Greiner Labortecknik (Frickenhausen, Alemania) y TPP (Trasadingen, Suiza).
Animales empleados
En los estudios realizados se utilizaron ratones hembras BALB/c de entre 5 y 8 semanas (Charles Rives, Barcelona). Durante el período de experimentación los animales fueron mantenidos en el animalario del Centro de Investigación en Farmacobiología Aplicada (CIFA) de la Universidad de Navarra de acuerdo con las normas que rigen en la institución.
Construcción de un adenovirus que expresa mlP-10, AdCMVIP-10
Para la construcción de un adenovirus recombinante que exprese el gen murino IP-10 bajo control del promotor eucariótico del Citomegalovirus se utilizó el sistema Crelox (27). Células de bazo obtenidas de una ratona BALB/c de 8 semanas de edad se cultivaron in-vitro con medio RPMI completo en una placa de 10 cm de diámetro (TPP, Trasadingen, Suiza) y se estimularon durante 3 horas con lipopolisacárido a una concentración de 20 ng/ml (SIGMA, Madrid, España) mantenidas a 37°C y 5% de CO2. A continuación se extrajo y purificó el ARN total de dichas células con la solución desnaturalizante de proteínas Ultraspect™ (Biotecx Inc., Houston, TX, USA) seguida del método de Chomcznski y Sacchi (31 ). A partir de una muestra de 1 μg de dicho RNA se realizo la técnica de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando un termociclador (Perkin-Elmer Gene Amp PCR system 2400) para obtener y amplificar el ADN complementario (cADN) de mlP-10. El ARN total fue transcrito (60 minutos a 37°C) con 400 unidades de M-MuLV transcriptasa reversa (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md, USA) en un volumen final de 40 μl de solución salina 5x (250mM Tris-HCI pH 8,3, 374 mM KCI, 15mM MgCI2), suplementado con 5mM DTT, 0,5mM desoxirribonucleótidos trifosfato (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 48 unidades de inhibidores de ARNsas (Promega Co., MD, USA) y 400 ng de hexámeros aleatorios (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Después de desnaturalizar la transcriptasa reversa (95°C, 1 minuto), una alícuota de 20 μl (1μg) del cADN fue utilizada para la amplificación de IP-10 murino por PCR en 60 μl de buffer de PCR (160nM (NH4)2S04, 670mM Tris-HCI pH 8,8, 0,1% v/v Tween 20) suplementado con 1 ,5 mM MgCI2, 2 unidades de Biotaq™ ADN polimerasa (Bíoline, Londres, UK) y 1 μl 10mM de cebadores sentido y antisentido específicos de mlP-10: SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2. La amplificación de cADN de mlP-10 se realizó con 25 ciclos (94°C, 64°C y 72°C durante 45 segundos por cada temperatura). 40 μl del producto de PCR fueron separados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 ,5% (p/v)teñido con bromuro de etidio. La banda obtenida se visualizó con una lámpara de luz ultravioleta, se corto y extrajo del gel, y el producto de la PCR se purifico mediante el kit de purificación de ADN, Ultrafree-DA (Amicon-Milipore,
Madrid, España). El fragmento de 311 pares de bases correspondiente al cADN de mlP-10 se clonó en el plásmido pGEM-T utilizando el PGEM-T vector system (Promega Co. Wl, USA) mediante una reacción de ligación a 14°C durante 12 horas empleando una T4 ADN ligasa (Roche Diagnostics, Barcelona, España). Con el resultado de dicha ligación se transformaron bacterias competentes E. coli XL1-Blue Stratagen, La Jolla, Ca, USA) las bacterias transformadas se seleccionaron por su crecimiento en placas de Petri con medio LB con ampicilina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Se extrajo el ADN plasmídico de las bacterias positivas mediante la técnica de MiniPrep (Qiagen, Alemania) para, posteriormente, digerir 2μg de dicho plásmido con las enzimas Sphl/Sall (Roche Diagnostics) y separar por electroforesis el resultado de dicha digestión en un gel de agarosa al 1 ,5% para comprobar la presencia del inserto. Los plásmidos con el fragmento de 311 pares de bases esperado se secuenciaron para descartar errores en la amplificación en un secuenciador automático ABI PRISM 310 (Perkin Elmer, Foster.CA, USA), utilizando el kit de secuenciación Dye Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). El fragmento del plásmido PGEM-T/mlP- 10 conteniendo el cADN de mlP-10 con la secuencia SEQ ID NO: 3 coincidió con las secuencias SEQ ID NO: 4 y 5 descritas en la bibliografía (3, 4). Dicho fragmento se escindió mediante una digestión con las enzimas de restricción Sphl/Sall (Roche Diagnostics), el producto de la digestión se analizó en un gel de agarosa al 1 ,5%, la banda conteniendo el fragmento con el cADN de mlP-10 se purificó con el Kit de purificación de ADN Ultrafree-DA (Amicon-Milipore). Los extremos se completaron mediante la enzima Klenow (Roche Diagnostics)y se subclonó en el plásmido pAdLox, previamente abierto con la enzima Bgl II (Roche Diagnostics y tratado con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics), mediante una ligación a 14°C durante 16 horas con la misma enzima y condiciones que en el caso anterior. Con el resultado se transformaron bacterias competentes E. coli DH-5α (Clontech, Palo Alto, CA, USA) se seleccionaron las resistentes a ampicilina y purificó el ADN plasmídico de colonias seccionadas siguiendo las técnicas descritas anteriormente. Se realizó un screening mediante una digestión con las enzimas de restricción Ncol y Smal (Roche Diagnostics) y el producto se separó en un gel de agarosa al 1 ,5% para comprobar la presencia y orientación del inserto (cADN de IP-10 murino).
El plásmido obtenido, pAdlox/mlP10, contiene un cásete de expresión con mlP-10 bajo el control del promotor CMV seguido de la señal de poliadenilación (poliA), precedido por la secuencia de encapsidación del adenovirus tipo 5 humano. Una vez purificado, el plásmido pAdlox/mlP-10 se cotransfectó en células Cre8 junto con el genoma purificado del adenovirus recombinante defectivo ψ5 (figura 1A), de acuerdo con los métodos utilizados por Hardy et al. (30), para generar un adenovirus recombinante defectivo que contenga el gen de mlP-10, AdCMVIP-10 (figura 1A). El sobrenadante resultado de dicha cotransfección se amplificó y analizó para comprobar la presencia de mlP-10 y descartar contaminación residual con el virus ψ5 según las técnicas descritas y empleadas por los mismos autores (30,32).
La técnica RT-PCR fue utilizada para clonar el cADN del gen IP-10 murino a partir de células de bazo de una ratona BALB/c estimuladas con LPS. El cADN de mlP-10 fue subclonado a continuación del promotor eucariótico CMV y precediendo a una señal poliA en plásmido Padlox que contiene la señal de empaquetamiento adenoviral ψ y una región lox-P, todo el conjunto esta flanqueado por los ITR adenovirales. El adenovirus recombinante AdCMVIP-10 fue generado mediante la co-transfección del plásmido Padlox/IP-10 y el genoma del virus ψ5 (adenovirus defectivo en E1 y E3) en la línea celular 293 que expresa la recombinasa CRE (CRE8). La recombinación a nivel de los sitios loxP catalizada por la recombinasa Cre dirige la generación de AdCMVIP-10.
Preparación del lote de adenovirus recombinante de trabajo.
El medio sobrenadante obtenido, conteniendo AdCMVIP-10, se utilizó para amplificar el virus. Con 3ml de dicho sobrenadante por placa, se infectaron células 293 cultivadas en placas de 150 mm de diámetro (entre 20 y 40 placas) a una confluencia del 80% durante 30 minutos a 37°C y 5% de CO2. Cuando las células presentaron efecto citopático (2-4 días) fueron recolectadas y centrifugadas a 1500 r.p.m. durante 10 min a 4°C, resuspendidas en Tris (pH 8) 0.1 M (18ml) y almacenadas a -80°C hasta el proceso de purificación del virus.
Purificación del adenovirus.
El adenovirus, AdCMVIP-10, producido se purificó mediante dos centrifugaciones en gradientes de cloruro de cesio y posterior diálisis del lisado de las células previamente infectadas. Las células infectadas con AdCMVIP-10 almacenadas se descongelaron y resuspendieron en 18-20 mi de Tris 0,01 M
(pH 7,4) con deoxicolato sódico (SDS) al 10% en una proporción 10/1 (v/v) durante 30 minutos a temperatura ambiente, este procedimiento se emplea para lisar las células. La solución obtenida se sometió a un proceso de homogeneizado con un homogeneizador manual de cristal preenfriado, el proceso se realizó durante 5-10 minutos en hielo, una vez terminado el proceso, se obtiene una solución homogénea en la que las células quedan totalmente disgregadas y el virus queda liberado del interior celular. A la suspensión con el virus y restos celulares resultante se le añadieron 5,8 mi de una solución saturada de cloruro de cesio por cada 10 mi de suspensión viral. Esta mezcla se distribuyó en tubos de polihalómero para centrifugación Quick-seal (Beckman Instruments, Ca, USA), los tubos fueron equilibrados con una error de + 0,5mg y sellados con calor. Los tubos fueron centrifugados durante 21 horas a 35.000 r.p.m. a 4°C en un rotor de ángulo fijo Beckman 50Ti en una ultracentrifugadora Beckman. Tras la centrifugación los tubos se extrajeron y la banda conteniendo el virus (la banda tiene una densidad aproximada de 1 ,35gr/ml) fue extraída con una jeringa de 10ml atravesando el tubo desde una zona inferior a la banda. Las bandas de los diferentes tubos se añadieron a otro tubo Quick-seal con una solución de cloruro de cesio saturada, de forma que el gradiente de densidad final abarcara desde 1 ,25gr/ml hasta 1 ,4gr/ml, y se sometió a una centrifugación idéntica a la anterior. La nueva banda obtenida se extrajo de la forma indicada y se dializó frente a 1 litro de solución Tris 0,01 M (pH 8) durante 1-2 horas a 4°C en agitación por dos veces, este proceso permite eliminar los restos de cloruro de cesio tóxico para las células. A la solución de AdCMVIP-10 concentrada se le añadió glicerol estéril (ICN, USA) como protector criogénico hasta una concentración final del 0,5% (v/v), alicuotada en tubos de 1 ml (Costar) y almacenados a -80°C.
Determinación del título infectivo del adenovirus.
Para determinar el título infectivo (unidades formadoras de placa, ufp) de la solución de AdCMVIP-10 producida se empleó el método de dilución limite en placas de 96 pocilios (TPP) con células 293 (32). Con este sistema se infectan células 293 (104 células por pocilio) con diluciones seriadas de la solución viral para determinar la máxima dilución capaz de producir efecto citopático. La titulación se realiza por triplicado para cada virus. Los títulos obtenidos fueron: AdCMVIP-10: 3,2x1012 ufp/ml AdCMVIL-12: 4,2x1012 ufp/ml AdCMVLacZ: 2,11x1012 ufp/ml
Análisis por Western Blot de la proteína expresada por AdCMVIP-10.
La expresión y secreción de mlP-10 por AdCMVIP-10 se analizó mediante un ensayo de Western Blot a partir del sobrenadante de células HepG2 infectadas con dicho adenovirus. Células HepG2 cultivadas en placas de 10 cm de diámetro y a una confluencia del 75-80% se infectaron con AdCMVIP- 10 (MOI: 65) durante 1 hora a 37°C y 5% de CO2 bien se transfectaron con Padlox/IP-10 con Fugene™ (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se dejaron sin infectar (control negativo), las 3 placas se mantuvieron con 2ml de medio 1640 sin suero durante 36 horas a 37°C y 5% de CO2 Los sobrenadantes con la proteína expresada se recogieron y concentraron usando Centricom YM-3 (Amicon, Milipore Co.). Las proteínas de las muestras se separaron por SDS-PAGE al 15% usando una solución tampón Tris/Trícina (33) de acuerdo con el método de Laemmli (34) y se transfirieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una membrana Hybond-P (Amersham- Pharmacia Biotech Inc., Madrid España), que se bloqueo en PBS con un 0,1 % (v/v)de Tween 20 (PBS-T) y un 5% (p/v) de leche desnatada (Nestlé, Barcelona, España) a 4°C durante 16 horas. Después de lavar la membrana 5 veces durante 3 minutos en agitación con 60 mi de PBS-T, la membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1/1000 de anticuerpo
IgG policlonal de cabra frente a IP-10 de ratón (Santa Cruz Biotechnology Inc. CA, USA) en PBS (Sigma) con un 0,01 % de Tween 20 (Sigma) (PBS-T) y un 1% de leche desnatada (Nestlé) La membrana fue lavada de la forma citada anteriormente e incubada con una dilución 1/5000 de anticuerpo de burro frente a IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Santa Cruz
Biotechnologies Inc.) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavada de la misma manera. Las membranas se revelaron con el kit de detección ECL Plus de Amersham-Pharmacia de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados (figura 1 B) muestran que la infección de células HepG2 con AdCMVIP-10 da lugar a la expresión de mlP-10 y su liberación al medio sobrenadante que es detectado con anticuerpos policlonales frente a mlP-10 (calle 3). También es posible detectar mlP-10 tras la transfección, mediante complejos de liposomas, del plásmido Padlox/IP-10 (calle 4). La proteína no es detectada en células no infectadas (calle 1 ). 10 ng de IP-10 recombinante de ratón (R&D Systems, MN, USA) se emplearon como control positivo (calle 2).
Análisis de la biofuncionalidad de mlP-10 expresado por AdCMVIP-10.
Los ensayos de migración de células a través de una membrana permiten evaluar la capacidad quimiotáctica de una substancia. Para verificar que la proteína expresada por AdCMVIP-10 es biológicamente activa, se realizaron ensayos de migración de células T activadas, a través de membra- ñas de policarbonato, en respuesta a sobrenadantes de células HepG2 infectadas con AdCMVIP-10. Células de bazo obtenidas de ratones BALB/c se cultivaron en placas de cultivo de 10 cm de diámetro durante 2 horas a 37°C y 5% de CO2 con medio RPMI 1640 completo. Tras este periodo de tiempo se recogió el medio que contiene las células de bazo no adherentes, esta suspensión de células se hizo pasar por columnas de lana de nylon siguiendo el protocolo que aparece publicado en Current Protocols in Immunology (Wisley, USA) de forma que la solución final obtenida solo contiene linfocitos T y células NK. Estas células T se cultivaron con RPMI1640 completo suplementado con IL- 2 (20 lU/ml) (Peprotech) y activadas mediante la adición al medio de cultivo de 2 μg/ml de Con A (SIGMA), tras 2 días las células se recogieron, lavaron y resuspendieron en medio RPMI 1640 al 0,5% de suero de ternera fetal y una concentración de 6x106 células/ml. Células HepG2 al 70-80% en placas de 10 cm de diámetro se infectaron a una MOI= 65 con AdCMVLacZ, AdCMVIP-10 o se mantuvieron sin infectar en medio RPMI 1640 al 0,5% de suero de ternera fetal. A las 48 horas se recogió el medio de las células infectadas y no infectadas. Los ensayos de migración se realizaron en cámaras de cultivo Transwell cell culture chambers (Costar Corp., Cambridge, MA, USA) a través de membranas de policarbonato de 6 μm de diámetro, 10 μm de grosor, y 5 μm de tamaño de poro siguiendo el protocolo descrito por Vicente-Manzanares et al. (35). En la cámara superior de cada pocilio se depositaron las células T activadas (100 μl a 6x106 células/ml) y en la cámara inferior los diferentes sobrenadantes obtenidos, IP-10 recombinante de ratón (100 ng/ml) o sobrenadante de células infectadas con AdCMVIP-10 con anticuerpos monoclonales neutralizante frente a IP-10 de ratón (R&D) (2μg/ml). El ensayo se mantuvo durante 2 horas a 37°C y en una atmósfera del 5% de CO2 Las membranas se fijaron en una disolución al 1 % (v/v) de glutaraldehido en PBS durante 1 hora y teñidos, a continuación, en azul de toluidina al 0.5% (p/v) en una solución de EtOH al 30% (v/v) en PBS. La cuantificación de células T que migran se lleva a cabo contando el número de células adheridas a la cara inferior de las membranas de policarbonato; se contaron 10 campos microscópicos por pocilio. El experimento se realizó por triplicado. Como se muestra en la figura 2 el número de células T activadas atraídas por los sobrenadantes de células infectadas con AdCMVIP-10 fue significativamente mayor que en los grupos control. Este efecto es neutralizado cuando se añade anticuerpo monoclonal frente a mlP-10 y no se aprecia en los sobrenadantes de células infectadas con AdCMVLacZ. Las diferencias significativas con una p<0.01 de acuerdo con el test de Mann-Whitney con ajuste de Bonferroni se indican con **.
Tratamiento in-vivo de tumores establecidos con AdCMVIP-10.
Para analizar la eficacia antitumoral de la transferencia génica de IP-10 mediante AdCMVIP-10 se establecieron tumores mediante la inyección subcutánea, con jeringas de insulina (Becton-Dickinson, España), de 5x105 células de adenocarcinoma de colon CT26 resuspendidas en 50 μl de solución salina (PBS) en el flanco derecho de ratones singénicos BALB/c. Después de 10 días, cuando los tumores alcanzaron un diámetro medio de 5-8mm, se dividieron aleatoriamente los animales en grupos y fueron tratados con 109 ufp de
AdCMVIP-10 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS), 109 ufp de adenovirus control (AdCMVLacZ) diluido en 50 μl de solución salina (PBS) o con 50 μl de solución salina (PBS) mediante su inyección intratumoral con una jeringa de precisión de 50μl Hamilton. El crecimiento de los tumores fue monitorizado durante más de 60 días midiendo dos diámetros perpendiculares del tumor empleando un calibrador de precisión. Aquellos animales con tumores que sobrepasaron 1.5 cm en ambos diámetros tumorales o 2 cm en uno de sus diámetros fueron sacrificados por razones éticas reguladas institucionalmente y se consideró como muerte del animal. La inyección intratumoral de AdCMVIP-10 indujo la regresión tumoral completa en dos de los catorce ratones tratados y se apreció un leve retraso en el crecimiento de algunos tumores en comparación con los animales que recibieron suero salino o AdCMVLacZ, todos los tumores terminaron causando la muerte de los ratones en estos dos grupos. En la figura 3 se puede apreciar el seguimiento individual del diámetro tumoral medio de los animales de cada grupo.
Tratamiento in-vivo de tumores establecidos mediante la combinación AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12
Se ha descrito por los inventores de esta patente un potente efecto terapéutico antitumoral con la transferencia génica de la IL-12 mediante AdCMVIL-12 frente a adenocarcinoma de colon derivado de células CT26 empleando dosis de 109 ufp y 108 ufp(36,37). Bajo estas condiciones, la inyección intratumoral de AdCMVIL-12 permite la erradicación tumoral en un 60- 80% de los casos. Con vistas a evaluar la eficacia antitumoral de la combinación de la transferencia génica de IP-10 e IL-12 se probó la eficacia antitumoral de la inyección de AdCMVIP-10 con dosis subterapéuticas de AdCMVIL-12 de forma que la sinergia entre ambas sustancias fuera más evidente. Para ello se establecieron tumores mediante la inyección subcutánea de 5x105 células de adenocarcinoma de colon CT26 resuspendidas en 50 μl de solución salina (PBS) en el flanco derecho de ratones singénicos BALB/c. Después de 10 días, cuando los tumores alcanzaron un diámetro medio de 5-8mm, se dividieron los animales en grupos y fueron tratados con:
- 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS), - 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7,5x107 ufp de AdCMVLacZ en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS)
- 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 + 5x108 ufp de AdCMVLacZ en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS) - 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS)
- 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS)
- o con 50 μl de solución salina PBS Los resultados obtenidos, figura 4, demuestran que con la dosis subterapéutica de AdCMVIL-12 (7,5x107 ufp) sólo se consiguió la desaparición tumoral en 4 de 11 ratones tratados y al retraso del crecimiento tumoral en algunos casos. Por contra, la inyección intratumoral con una combinación de AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 resultó en la regresión tumoral de todos los tumores tratados con las dos dosis de AdCMVIL-12 utilizadas, 7,5x107 ufp (10 de 10) y 5x107 ufp (5 de 5). Para descartar que estos resultados puedan estar relacionado con la combinación de dos adenovirus independientemente de los transgenes expresados, se trataron otros dos grupos de animales, uno con AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ y otro con AdCMVIL-12 + AdCMVLacZ en sus dosis correspondientes (figura 4). En el grupo de animales tratados con la combinación AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ no se produjo ningún rechazo tumoral, tan solo un retraso en el crecimiento tumoral en 3 de 10 casos. En el grupo de animales tratados con AdCMVIL-12 + AdCMVLacZ se obtuvo una regresión tumoral en el 40% de los casos (2 de 5) en concordancia con los resultados obtenidos con la inyección de AdCMVIL-12 a la misma dosis. Estos datos demuestran que la combinación de la transferencia génica de IP-10 en combinación con la transferencia génica de IL-12 tiene como resultado una respuesta antitumoral muy importante que permite alcanzar el 100% de erradicación tumoral en este modelo, y que la administración de IP-10 potencia significativamente el efecto antitumoral de la IL-12. Efecto a distancia de la combinación IP-10 + IL-12._
Para comprobar si la combinación IP-10+ IL-12 permite obtener la misma eficacia antitumoral en tumores distantes no tratados, se desarrolló otro modelo experimental mediante la inoculación bilateral de 5x105 células CT26 resus- pendidas en 50 μl de solución salina (PBS) en ambas regiones dorsolaterales, con el objeto de obtener dos tumores de manera simultánea. Dicho modelo reproduce la situación de un adenocarcinoma diseminado. Cuando estos nodulos tumorales alcanzaron un diámetro aproximado de 5-6 mm, se dividieron en grupos, se procedió a la administración intratumoral, en el tumor del lado derecho del animal, de AdCMVIL-12 (7,5x107 ufp), AdCMVIPIO (5x108 ufp) + AdCMVIL-12 (7,5x107 ufp) o solución salina y solución salina en todos los tumores del flanco izquierdo, el volumen inoculado fue 50μl en todos los tumores. Tras el tratamiento, los tumores fueron medidos dos veces por semana, durante 90 días, para evaluar la regresión tumoral. Como se puede observar en la Tabla I, todos los ratones tratados con la combinación IP-10 + IL- 12 (6 de 6) rechazaron tanto los tumores tratados como los no tratados. Sin embargo en el grupo de ratones tratados con 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en el tumor derecho solo se produjo una remisión tumoral completa en dicho tumor tratado (1 de 6) y ninguna en los nodulos distantes. En el grupo control tratado con PBS no se observó ningún rechazo tumoral. Podemos afirmar que la combinación de IP-10 + IL-12 permite obtener un potente efecto terapéutico frente a nodulos tumorales distantes no tratados directamente lo que constituye una valiosa herramienta en el tratamiento de la enfermedad metastásica diseminada.
La transferencia génica de IP-10 e IL-12 tiene un efecto sinérgico en la inducción de actividad citotóxica específica frente al tumor.
Se ha demostrado que la transferencia génica de IL-12 induce la activación de una respuesta citotóxica frente a las células tumorales (36,37). Para comprobar si la combinación de IP-10 + IL-12 permite aumentar dicha respuesta se realizaron los siguientes experimentos. Ratones con tumores subcutáneos inducidos mediante la inyección de 5x105 células CT26 en 50 μl de solución salina en el flanco derecho fueron tratados, 10 días después de dicha inducción, con diferentes combinaciones de adenovirus (2-3 ratones por grupo):
- 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS),
- 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS)
- 5x108 ufp de AdCMVIP-10 en un volumen de 50 μl de solución salina (PBS)
15 días después del tratamiento los bazos de estos animales y sus células utilizadas para medir la inducción de actividad citotóxica específica frente a células CT26. Para ello los bazos de cada grupo de animales se disgregaron mediante el empleo de dos portas de vidrio esmerilado. A continuación se usaron los glóbulos rojos mediante la suspensión celular en 2 mi de solución tampón de lisis ACK (PBS con 0,83% (p/v) de (NH4)KCI2). El homogeneizado de células de bazo se lavó mediante 3 centrifugaciones de 7 minutos a 340 g en un tubo de 50ml con 30 mi de medio RPMI 1640 limpio por lavado. A continuación se procedió a la re-estimulación de las células durante 6-7 días en placas de 24 pocilios cultivas con medio RPMI1640 completo. En cada pocilio se re-estimularon 7-8 x106 células de bazo con 7-8x105 células CT26 tratadas previamente, para inhibir su crecimiento, con 150 μg/ml de Mitomicina C (Sigma, Madrid, España) durante 1 hora a 37°C. Después de 6-7 días de re-estimulación se midió la actividad citotóxica de las células re-estimuladas mediante un ensayo de liberación del isótopo radioactivo Cr51, previamente cargado en las células diana. Cuando las células diana son usadas por las células T citotóxicas especificas frente a los antígenos que dicha célula diana presenta asociados a las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de Clase I (38) las células liberan el isótopo radioactivo intracelular. Para su mareaje las células
CT26 diana fueron incubadas con 100 μCi de Na2Cr5104 por cada 106 células durante 1 hora a 37°C. Después de la captación de esta sal de Cr51 radioactivo las células se lavaron mediante 3 centrifugaciones de 5 minutos a 280 g en un tubo de 50ml con 30 mi de medio RPMI 1640 limpio por centrifugación. Las células diana se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo a una concentración de 5x104células/ml y se sembraron 100 μl/pocillo de esta suspensión en placas de 96 pocilios (5x103 células/pocilio). A continuación se añadieron diferentes cantidades de células T citotóxicas efectoras por pocilio de forma que las pro-porciones finales célula efectora/célula diana (E:D) fueron 100:1 , 33:1 , 11 :1 por cada grupo de tratamiento. En cada experimento se sembraron tres replicas por tratamiento y proporción E:D. Las células diana incubadas junto con las efectoras se incubaron durante 5 horas a 37°C en una atmósfera con un 5% de CO2, después se recogieron 50μl de medio sobrenadante de cada pocilio y se midió la radioactividad (cuentas por minuto, cpm) en un contador estándar de radiación-γ (Packard). Se determinó la liberación espontánea de Cr51 a partir de células diana cultivadas en ausencia de células efectoras en un mismo volumen final de medio e incubadas en las mismas condiciones y la liberación máxima de Cr51 a partir de células diana en las mismas condiciones que las anteriores, pero incubadas con un detergente que las lisa liberando todo el Cr51 captado (Triton-X al 0.8%). El porcentaje de lisis celular específica se calculó empleando la siguiente fórmula matemática: % de lisis = 100x (cpm muestra - cpm espontánea)/(cpm máxima - cpm espontánea).
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5A, se observa que la combinación de la transferencia génica de IP-10 + IL-12 induce la generación de una actividad citotóxica que ronda el 60% cuando se aplica un ratio E:D de 100 a 1. Sin embargo, la transferencia génica de IL-12 o IP-10 de forma independiente, en las mismas dosis que cuando son combinados, inducen tan solo niveles del 7-9% con un ratio de 100 a 1. La combinación de IP-10+ IL-12 permite obtener una actividad citotóxica especifica mucho mayor cuando son administradas de forma combinada que cuando cada sustancia es administrada de forma aislada e individual.
Experimentos similares se llevaron a cabo para demostrar que la actividad citotóxica detectada es específica frente a células CT26. Células efectoras extraídas de bazos de animales con tumores similares tratados con 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7,5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 μ I de solución salina (PBS) se enfrentaron, en las mismas proporciones E:D, durante el mismo tiempo y mismas condiciones, frente a células P815, células P815 incubadas durante el ensayo con el péptido AH1 , células P815 incubadas durante el ensayo con el péptido P815AB y células YAC-1 todas ellas marcadas con Cr51 de la forma descrita anteriormente. Los péptidos AH1 (SEQ ID NO: 6) (38) y P815AB (SEQ ID NO: 7) (39), restringidos a H-2Ld fueron sintetizados siguiendo la técnica FMOC (40) y su pureza analizada por cromatografía líquida de alta afinidad (HPLC). Los niveles de liberación de Cr51 se realizaron de la misma manera que el experimento anterior. Los resultados (figura 5B) muestran que se detecta actividad citotóxica exclusivamente frente a las células P815 incubadas con el péptido AH1 (determinante antigénico especifico de células CT26) mientras que frente al resto de células diana no se detecta actividad citotóxica. Con estos resultados queda demostrado que la actividad citotóxica inducida por la combinación IP-10 + IL-12 es específica frente al tumor tratado y se reconoce uno de los antígenos identificados en él (38) y presentado por la molécula del CMH-I H 2L
Para estudiar la generación de inmunidad protectiva frente a una nueva administración de células tumorales, se realizó la inoculación de 5 x 105 células CT26 en 50 ul de solución salina 2 meses después de la desaparición del primer tumor en 10 animales tratados con IP-10 + IL-12. Como grupo control se utilizaron animales sanos a los cuales se les inoculó la misma cantidad de células tumorales. En ninguno de los 10 ratones que previamente ya rechazaron el primer tumor se detectaron nodulo tumoral alguno. Todos los animales del grupo control desarrollaron tumores. Con este experimento queda demostrado el desarrollo de inmunidad sistémica protectiva después de la transferencia génica de IP-10 e IL-12.
Descripción de las figuras
Figura 1A: Construcción del adenovirus recombinante defectivo que contiene el gen murino IP-10 (AdCMVIP-10).
Figura 1 B: Análisis mediante la técnica de Western Blotting con un anticuerpo políclonal frente a la proteína murina IP-10 de sobrenadantes de células HepG2 no transfectadas (1 ), infectadas con AdCMVIP-10 a una MOI de 65 (3), trans- fectadas con el plásmido pAdloxlP-10 (4) y proteína IP-10 recombinante de ratón como control positivo (2).
Figura 2: Ensayo de biofuncionalidad de IP-10 codificada por AdCMVIP-10 mediante la cuantificación de la capacidad para atraer linfocitos T activados:
Ensayo de transmigración a través de una membrana de policarbonato con poros de 5μm de diámetro que separa dos cámaras, en la inferior se encuentra la sustancia quimiotáctica y en la superior blastos de células T activadas con ConA. La actividad quimiotáctica de proteína IP-10 recombinante (rlP-10) de ratón purificada a una concentración de 10ng/ml, sobrenadante de células HepG2 infectadas 48 horas antes con AdCMVLacZ, AdCMVIP-10 (con o sin anticuerpos neutralizantes anti IP+10 MAb) o células no infectadas, control (C) en abcisas, es cuantificada mediante el recuento por campo microscópico de blastos del número de células T estimuladas con Con-A adheridas a la cara inferior de la membrana (número celúlas/campo (40x) en ordenadas).
Figura 3: Efectos de la inyección intratumoral con AdCMVIP-10.
Nodulos tumorales inducidos en ratones BALB/c mediante la inoculación subcutánea de 5x106 células CT26 en el flanco derecho fueron inyectados intra- tumoralmente 9 días después con B) AdCMVIP-10 (109 upf), C) AdCMVLacZ
(109 upf) o A) con solución salina (PBS), como control. La evolución individual (en días, abcisas) de los tumores fue evaluada midiendo dos diámetros perpendiculares. El valor representado en ordenadas es la media aritmética de ambos diámetros, en mm.
Figura 4: Combinación de AdCMVIP-10 e AdCMVIL-12.
Grupos de ratones con tumores subcutáneos de células CT26 recibieron una inyección intratumoral 9 días después de la inducción tumoral con los adenovirus: B) AdCMVIL-12, C) AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ, D) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12, E) AdCMVLacZ + AdCMVIL-12, F) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 o
A) solución salina. La evolución del diámetro tumoral fue monitorizada individualmente (días postratamiento en abcisas). Las dosis administradas y la fracción de animales cuyos tumores fueron rechazados, -en quebrado y %- aparecen también indicados.
Figura 5: La transducción intratumoral con IP-10 e IL-12 permite aumentar los linfocitos T citotóxicos específicos frente al tumor
A . Se extrajeron los bazos de ratones Balb/c con tumores subcutáneos de células CT26 tratados con los adenovirus indicados. Las células de dichos bazos fueron re-estimulados in-vitro durante 6 días con células CT26 tratadas con Mitomicina-C para, posteriormente, medir su actividad citotóxica frente a células CT26 mediante ensayos de liberación de Cr51 de 5 horas de duración.
Los datos representan en ordenadas la media de los niveles de lisis específica (%) + EEM a diferentes proporciones de células efectoras frente a células diana (E:D), en abcisas, a partir de tres experimentos independientes.
B . Células de bazo de ratones que rechazaron tumores de células CT26 después del tratamiento con AdCMVIP-10 y AdCMVIL-12 se cultivaron in- vitro durante 6 días con células CT26 tratadas con Mitomicina-C. Se estudio la actividad citotóxica de los linfocitos de dichos bazos frente a células P815, YAC-1 , P815 + 10ng/ml de los octapéptidos indicados AH1 o P815AB (péptido control) mediante ensayos de liberación de Cr51. Los datos representan en ordenadas la media de lisis específica + EEM de dos experimentos. Con respecto al ratio (E:D) en abcisas, de células efectoras frente a células diana.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso combinado de la proteína inducible por interferon gamma 10 (IP- 10) y la interleucina 12 (IL-12) en la fabricación de composiciones útiles para el tratamiento de tumores malignos, particularmente del adenocarcinoma de colon metastásico.
2. Uso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición consiste en un sistema de expresión recombinante que expresa conjuntamente IP-10 y IL-12 fragmentos de las mismas que tengan el mismo efecto antitumoral.
3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el sistema de expresión recombinante consiste en un vector viral.
4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el vector viral consiste en un adenovirus, un virus adeno-asociado, un alfa virus, un herpes- virus o un lentivirus defectivo, o combinaciones de los mismos.
5.-Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el sistema de expresión recombinante consiste en un vector no viral.
6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el vector no viral consiste en un plásmido.
7. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el sistema de expresión recombinante consiste en una molécula de ADN o ARN, o combinaciones de los mismos.
8. Uso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la composición comprende las propias proteínas recombinantes IP-10 e IL-12 obtenidas in vitro o fragmentos de las mismas que tengan el mismo efecto antitumoral.
9. Uso combinado de la proteína inducible por interferon gamma 10 (IP- 10) y la interleucina 12 (IL-12) en la preparación de composiciones útiles en la inducción de una respuesta citotóxica frente a antígenos o células tumorales.
10. Uso combinado de la proteína inducible por interferon gamma 10 (I P- 10) y la interleucina 12 (I -12) como adyuvante en composiciones inductoras de respuestas inmunitarias.
11. Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque la composición consiste en una formulación de vacuna.
12. Uso de IP-10 en la preparación de composiciones que potencien el efecto antitumoral de IL-12 .
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