WO2001047627A1 - Verfahren und vorrichtung zur maskenfreien herstellung von biopolymeren mittels eines leuchtdiodenarrays - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur maskenfreien herstellung von biopolymeren mittels eines leuchtdiodenarrays Download PDF

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WO2001047627A1
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biopolymers
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Heinz Eipel
Markus Beier
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Basf Aktiengesellschaft
Deutsches Krebsforschungszentrum
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a method and an apparatus for the mask-free production of biopolymers, which are synthesized, for example on a slide, by an exposure sequence.
  • the fields are used to detect the presence of complementary nucleic acids in a liquid sample.
  • the regionally addressable irradiation of predefined regions on the surface allows the immobilization of oligonucleotides and other biopolymers in the activated regions of the
  • the surface of the substrate body is irradiated through a mask with a light source which emits a wavelength in the range between 280 and 420 nm, it being possible to select only certain preselectable regions for irradiation with each individual mask.
  • US 5,744,305 relates to materials applied in the form of a field to a carrier. These serve a synthesis strategy for the production of chemically divergent substrates. Photoactive protective groups of molecules are used to achieve chemical synthesis processes that run in parallel in areas controlled by light.
  • Binary masking techniques are used in the context of an exemplary embodiment. In the disclosed method, various chemical components are synthesized in parallel using a masked radiation source or using an activator. The lighting pattern determines which areas of the slide are prepared for a chemical reaction. The masking technique is also used here to select different areas to be exposed on the slide.
  • US 5,143,854 relates to a method for the photolithographic synthesis of polypeptides and a search method.
  • polypeptide fields are synthesized on a substrate by applying photoactive groups to the surface of a substrate which expose certain regions of the substrate to the light in order to activate the regions.
  • An amino acid monomer with a photoactive group is applied to the regions activated in this way, the activation and attachment steps being repeated until polypeptides of the desired length and sequence are synthesized.
  • the resulting field can be used to select those peptides that are able to bind a receptor.
  • 5,143,854 proposes using a diode light source for exposure and exposing the substrate to be exposed in accordance with the partial areas to be exposed. This procedure requires a complex mechanical control mechanism in order to align the substrate exactly in accordance with the areas to be exposed by the light-emitting diode. This mechanical alignment must be carried out each time anew for each new field to be exposed.
  • the control mechanism places very high demands on the manufacturing accuracy in order to achieve the above-mentioned positioning positions.
  • micromirrors In addition to masking the biopolymer regions to be exposed on the slide, it is known from WO 99/42813 to expose DNA sequences or polypeptides or the like by means of a device with controllable micromirrors, the micromirrors forming a coherent field which is composed of electronically addressable individual micromirrors is. A common light source is assigned to this.
  • the biopolymers on the slide are activated in certain patterns, the sequentially offered monomeric building blocks being coupled to the controlled areas. This process continues until all elements of a two-dimensional field on the substrate have reacted with the desired monomer.
  • the micromirror field can e.g. can be controlled in connection with a DNA synthesizer in such a way that the image sequence through the micromirror field is coordinated with the liquid sample applied to the slide.
  • photoactive monomeric building blocks or photoactive surfaces are used to create a site-oriented Enable synthesis.
  • the action of light serves to remove the photoactive groups of the monomeric building blocks or surfaces, so that a synthesis or an immobilization step can then take place at these points of the action of light.
  • masks are used or micromirror fields are controlled.
  • n-nucleotides from an ensemble of four different bases are linked in an n-mer sequence
  • 4 x n masks are required.
  • 20 x n masks are required.
  • Such a mask set must not only be provided in advance, but must also be adjusted very precisely during the exposure. This is accompanied by a considerable technical outlay, so that the masking process is not worthwhile for small series, but a new mask set has to be provided for each new synthesis.
  • the invention has for its object to provide a method for the synthesis of biopolymers, which simplifies exposure and activation of individual areas of a biopolymer-containing slide and makes it mask-free. According to the invention, this object is achieved by the features of claims 1 and 15.
  • Biopolymers such as Synthesize oligonucleotides and peptides, for example. Furthermore, biopolymers can be immobilized in a light-controlled manner; no masks are needed, the preparation and preparation of which are used
  • nucleotides and peptides can be synthesized on surfaces.
  • biopolymers can also be immobilized on the surfaces. Biopolymers are understood to mean, for example, nucleic acids, their analogs (e.g. PNA, LNA), amino acids, peptides, proteins, carbohydrates, and combinations of these.
  • the switching on and off of the light-emitting diodes of the light-emitting diode array from 9, 16, 25 or up to 100 or even more light-emitting diodes is preferably controlled automatically by a computing unit.
  • the computing unit contains the radiation arrangements desired in each case in a stored form.
  • the exposure time during which the individual light-emitting diodes selected areas of a slide can also be entered via the computing unit irradiate.
  • Such light-emitting diodes are preferably used which emit high-energy radiation in the UV range.
  • exposure processes can be carried out simultaneously by the light-emitting diode array containing several light-emitting diodes. A sequential sequence of exposure processes can also be set up.
  • the simultaneity of the activation of a plurality of light-emitting diodes of the light-emitting diode array can be achieved, for example, by the activation of the light-emitting diodes via the parallel interface of a computer.
  • the parallel execution of exposure cycles taking into account the sequence of individual exposure times stored in the computing unit, considerably shortens the synthesis of biopolymers.
  • the substrate for the biopolymers to be synthesized thereon is located in a feed device below a translucent area.
  • the feed device can be configured, for example, as a flow chamber in which the chemicals required for the synthesis to be carried out can be offered sequentially.
  • the respective sequences for the individual fields of the array to be synthesized are first entered into the controlling computer. With a corresponding program, the computer controls the individual light-emitting diodes in the light-emitting diode array correlated to sequential and cyclical supply of the individual monomers in accordance with these specifications.
  • the exposure preferably takes place spatially separate from the chemical synthesis in order to exclude any external disturbing influences during the exposure.
  • the sequential sequence of immobilization sites for freely selectable biopolymers can also be stored in the computing unit.
  • the device proposed according to the invention By means of the device proposed according to the invention, parallel, light-controlled synthesis or immobilization of biopolymers can be achieved by computer-assisted parallel control of individual light-emitting diodes without the need for masks.
  • the light-emitting diodes are preferably designed as light-emitting diodes which emit light in the UV wavelength range.
  • the light-emitting diode array can be optically imaged on the desired scale. Appropriate optical devices are used for this.
  • Fig. 1 shows a field of, for example, 4 x 4 individually controllable
  • FIG. 2 shows a fluorescence image of an oligonucleotide array, synthesized using a 4 ⁇ 4 light-emitting diode array after hybridization
  • Fig. 3 four surface fluorescence images in four different
  • Fig. 4 shows the structure of a sequence on a chip surface using a
  • FIG. 1 shows the top view of a field with, for example, 4 x 4 individually controllable light-emitting diodes and the associated control electronics.
  • FIG. 1 shows a light-emitting diode array 1, which is located below a slide 12 or below a chip surface 19.
  • the arrangement shown in FIG. 1 is a light-emitting diode arrangement 1, which contains 16 individually electrically controllable light-emitting diodes 2; of the light emitting diodes 2 shown, the light emitting diodes A 1? B 3 and D 4 are shown in more detail, which are to be controlled for example for one of sixteen DNA sequences.
  • Each activation of a light-emitting diode 2 of the light-emitting diode array 1 takes place via separate control lines 4, the individual light-emitting diodes 2 being connected to the supply part 8. Furthermore, the individual light-emitting diodes 2 of the light-emitting diode array 1 are each connected to resistors 5, from which further lines extend to memory cells 6 and 7, respectively.
  • the memory cells 6 and 7, in turn, are controlled via a parallel interface 10 provided on a computing unit 22.
  • the DNA sequences 20 and the exposure times required to remove the individual photolabile protective groups or the sequential sequence of immobilization sites can be stored in various files.
  • the computing unit 22 can provide those chemicals required for the synthesis of biopolymers such as, for example, oligonucleotides or peptides, which, depending on the sequence to be treated, react at precisely predefined exposure locations after the unstable photo protection groups have been removed there. Due to the correlation of the sequences, with the inflow of chemicals and the associated exposure locations, a simultaneous exposure of several exposure locations can take place by using the parallel port 10 on the computing unit 22.
  • biopolymers such as, for example, oligonucleotides or peptides
  • the light-controlled synthesis takes place, for example, in a feed device, which can be designed, for example, as a flow cell.
  • the flow of the chemicals necessary for synthesis flowing through the flow cell is controlled by a DNA synthesizer, for example by the computing unit 22.
  • photolabile protective groups In order to define, within a synthesis cycle taking place in a flow chamber, at which position which of the four nucleotide building blocks - deoxyadenosine, deoxythymidine, deoxyguanosine and deoxycytidine - is to be condensed, photolabile protective groups must be removed on the substrate support at predetermined times. The removal of the photolabile protective groups is necessary because only after their removal can a synthesis and the construction of a DNA oligomer be achieved.
  • individual light-emitting diodes 2 of the light-emitting diode arrangement 1 are preferably designed as individually electrically controllable light-emitting diodes 2. These emit very high-energy radiation, preferably in the ultraviolet range with a wavelength of preferably 360 nm. However, light-emitting diode arrangements 1 can also be used, in which individual light-emitting diodes 2 are received, which emit radiation of a different wavelength, which is different from the UV range. The optimal wavelength of the light-emitting diodes 2 must be matched to the photochemistry used.
  • the individual light-emitting diodes 2 of the light-emitting diode arrangement 1 it is determined at which point on the substrate support photo-protection groups are split off in order to enable the attachment of nucleotide building blocks to be coupled.
  • three light-emitting diodes 2 are identified by way of example in FIG. 1, which are denoted by Aj, B 3 and D.
  • the emitted high-energy radiation from the light-emitting diodes 2, denoted Ai, B 3 and D 4 preferably strikes the locations of the substrate carrier of the feed device and causes the unstable photo-protection groups to be removed at the precisely defined locations.
  • the exposure time can be different, also depending on the sequence to be generated.
  • the different exposure times that are to be observed by the light-emitting diodes with regard to their on time can also be stored in a file of the computing unit 22 and can thus be incorporated into the proposed exposure method.
  • the protective groups are now removed at these positions on the substrate carrier, so that a chain extension can be achieved only at these well-defined locations on the substrate carrier within this synthesis step.
  • the photolabile protective groups on the substrate can be split off, for example on the Positions 4 , B 2 and Dj take place, so that after the expiry of the exposure time required to remove the protective groups, a chain extension can only take place at these locations on the substrate with the provision of a monomeric unit to be guided through the flow chamber.
  • the light-emitting diode arrangement 1 is used as an array of individual light sources without an individual mask set being required for each substrate carrier or each chip surface 19.
  • preselection of the exposure locations, depending on the sequence file stored in the computer 22, small series can also advantageously be synthesized.
  • the light-emitting diode arrangement 1 controlled by means of the computing unit 22 assumes both the function of the exposure and that of masking the area to be exposed, as a result of which the need to reposition masks can be completely eliminated. Inaccuracies in mask repositioning during the synthesis process using the mask process have in the past led to considerable quality deficiencies in biopolymer components synthesized in this way.
  • a synthesized oligonucleotide array synthesized using an array of 4 ⁇ 4 individually controllable light-emitting diodes 2.
  • this can also have any number, for example 25, 400 or up to several thousand individual ones Contain radiation sources in the form of light-emitting diodes, it being possible to decide whether they can be arranged square, rectangular, ring-shaped or also circular. That in Fig. 2 the array shown is a fluorescence image obtained by hybridization with a fluorescence masked complementary strand probe.
  • FIG. 3 shows an overview of four surface fluorescence images, each with four different sensitivity levels.
  • a 3 x 3 light-emitting diode array 1 was used to determine a sufficient exposure time.
  • the four images show the same array, recorded in four different sensitivity levels of the detecting scanner.
  • FIGS. 4.1 and 4.2 show the structure of a sequence on a surface 19 with a light-emitting diode arrangement 1 containing 4 individual light-emitting diodes 2.
  • the sequence d (CGCTGGAC) was built up at the four positions 19, which are shown brighter, by means of light-controlled DNA chip synthesis.
  • the images shown in Fig. 4.1 and 4.2 were recorded with different sensitivity levels of the scanner.
  • Figures 4.1 and 4.2 shown were obtained after hybridization with the complementary 5'-Cy-5 labeled probe after scanning in a fluorescence imaging unit.
  • Sensitivity level high 18. Sensitivity level very high

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren auf Oberflächen. Dabei werden Muster einzelner Sequenzen (20) durch die Abbildung einer Anordnung (1) elektrisch individuell ansteuerbarer Leuchtdioden (2) auf den Oberflächen erzeugt.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR MASKENFREIEN HERSTELLUNG VON BIOPOLYMEREN MΓTTELS EINES LEUCHTDIODENARRAYS
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur 10 maskenfreien Herstellung von Biopolymeren, die beispielsweise auf einem Objektträger, durch eine Belichtungsabfolge synthetisiert werden.
Bislang sind zur licht-gesteuerten DNA-Chips-Synthese für jeden individuellen Chip Maskensätze erforderlich. Aus US 5,412,087 ist eine bereichsweise
15 adressierbare Immobilisierung von Oligonukleotiden und anderer chemischer Polymere auf Oberflächen bekannt. Gemäß dieses Verfahrens wird vorgeschlagen, Substrate mit Oberflächen, die Komponenten mit Thiolgruppen enthalten sowie photoaktiv entfernbare, schützende Gruppen aufweisen, dazu benutzt werden können, Felder von immobilisierten Anti-Liganden zu erzeugen,
20 wie beispielsweise Oligonukleotide oder andere Biopolymere. Die Felder dienen dazu, das Vorhandensein komplementärer Nukleinsäuren in einer Flüssigkeitsprobe zu detektieren. Die bereichsweise adressierbare Bestrahlung vordefinierter Regionen auf der Oberfläche gestattet die Immobilisierung von Oligonukleotiden und anderen Biopolymeren in den aktivierten Regionen der
25 Oberfläche. Bestrahlungszyklen auf unterschiedliche Oberflächenbereiche der Oberfläche und Immobilisierung verschiedener Anti-Liganden erlauben die Formierung einer immobilisierten Matrix von Anti-Liganden an bestimmten Stellen auf der Oberfläche. Die Immobilisierungsmatrix der Anti-Liganden erlaubt ein gleichzeitiges Durchsuchen einer Flüssigkeitsprobe nach Liganden, die
30 eine sehr hohe Affinität zu bestimmten Anti-Liganden in der Matrix aufweisen. Bei dem hier vorgeschlagenen Verfahren wird die Oberfläche des Substratkörpers mit einer Lichtquelle, die eine Wellenlänge im Bereich zwischen 280 und 420 nm aussendet, durch eine Maske bestrahlt, wobei mit jeder individuellen Maske nur bestimmte vorwählbare Regionen zur Bestrahlung selektiert werden können.
US 5,744,305 bezieht sich auf feldförmig auf einen Träger aufgebrachte Materialien. Diese dienen einer Synthesestrategie zur Erzeugung chemisch divergierender Substrate. Es werden photoaktiv schützende Molekülgruppen dazu benutzt, um lichtgesteuert bereichsweise parallele ablaufende chemische Syntheseprozesse zu erzielen. Binäre Maskierungstechniken werden im Rahmen eines Ausführungsbeispiels eingesetzt. Bei dem offenbarten Verfahren werden mit einer maskierten Strahlungsquelle oder mittels eines Aktivators verschiedene chemische Komponenten parallel synthetisiert. Das Beleuchtungsmuster legt fest, welche Bereiche des Objektträgers für eine chemische Reaktion präpariert werden. Auch hier wird die Maskierungstechnik eingesetzt, um auf dem Objektträger jeweils zu belichtende verschiedene Bereiche zu selektieren.
US 5,143,854 bezieht sich auf ein Verfahren zur photolithographischen Synthese von Polypeptiden sowie ein Suchverfahren. Bei diesem Verfahren werden Polypeptidfelder auf einem Substrat synthetisiert, in dem photoaktive Gruppen auf die Oberfläche eines Substrats aufgebracht werden, die bestimmte Bereiche des Substrats zur Aktivierung der Regionen dem Licht aussetzen. Auf die solcher Art aktivierten Regionen wird ein Aminosäure-Monomer aufgebracht, mit einer photoaktiven Gruppe, wobei die Aktivierungs- und Anlagerungsschritte so oft wiederholt werden, bis Polypeptide der gewünschte Länge und Sequenz synthetisiert sind. Das resultierende Feld kann zur Auswahl derjenigen Peptide dienen, die einen Rezeptor zu binden vermögen. In US 5,143,854 wird neben der bereits angesprochenen Maskierungsmethode vorgeschlagen, eine Diodenlichtquelle zur Belichtung einzusetzen und das zu belichtende Substrat entsprechend den zu belichtenden Teilbereichen zu belichten. Bei dieser Vorgehensweise ist ein aufwendiger mechanischer Steuerungsmechanismus notwendig, um das Substrat genauestens entsprechend der durch die Leuchtdiode zu belichtenden Bereiche auszurichten. Diese mechanische Ausrichtung muß für jedes neue zu belichtende Feld jedes Mal neu erfolgen.
Der Steuerungsmechanismus stellt zur Erzielung der genannten Stellpositionen sehr hohe Anforderungen an die Fertigungsgenauigkeit.
Neben der Maskierung der zu belichtenden Biopolymerbereiche auf dem Objektträger ist aus WO 99/42813 bekannt, DNA-Sequenzen oder Polypeptide oder ähnliches mittels einer Einrichtung mit jeweils ansteuerbaren Mikrospiegeln zu belichten, wobei die Mikrospiegel ein zusammenhängendes Feld bilden, welches aus elektronisch adressierbaren einzelnen Mikrospiegeln zusammengesetzt ist. Diesem ist eine gemeinsame Lichtquelle zugeordnet. Die auf dem Objektträger befindlichen Biopolymere werden in bestimmten Mustern aktiviert, wobei an die angesteuerten Bereiche die jeweils sequentiell angebotenen monomeren Bausteine angekoppelt werden. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis alle Elemente eines zweidimensionalen Feldes auf dem Substrat mit dem jeweils gewünschten Monomer reagiert haben. Das Mikrospiegelfeld kann z.B. in Verbindung mit einem DNA-Synthetisierer so angesteuert werden, daß die Bildsequenz durch das Mikrospiegelfeld mit der auf dem Objektträger aufgebrachten Flüssigkeitsprobe abgestimmt ist.
Bei den dargestellten Maskierungsverfahren werden photoaktive monomere Bausteine bzw. photoaktive Oberflächen verwendet, um eine ortsgerichtete Synthese zu ermöglichen. Die Einwirkung von Licht dient dazu, die photoaktiven Gruppen der monomeren Bausteine bzw. Oberflächen zu entfernen, um dann an diesen Stellen der Lichteinwirkung eine Synthese oder einen Immobilisierungsschritt erfolgen zu lassen. Um das Licht ausschließlich an den jeweiligen Synthese- bzw. Immobilisierungsschritt benötigten Ort zu bringen, werden Masken eingesetzt bzw. Mikrospiegelfelder angesteuert.
Werden beispielsweise im Falle der lichtgesteuerten Oligonukleotidsynthese n- Nukleotide aus einem Ensemble von vier verschiedenen Basen in einer n-meren Sequenz verknüpft, werden 4 x n Masken benötigt. Soll eine lichtgesteuerte Synthese von Peptiden bei einer Sequenzlänge von n und einem Ensemble von 20 Aminosäuren erfolgen, werden 20 x n Masken benötigt. Ein solcher Maskensatz muß nicht nur bereits im Vorfeld bereitgestellt werden, sondern ist auch bei der Belichtung sehr genau zu justieren. Dies geht mit einem erheblichen technischen Aufwand einher, so daß das Maskierungsverfahren für kleine Serien nicht lohnenswert ist, dafür bei jeder neuen Synthese ein neuer Maskensatz bereitzustellen ist.
Die in US 5,143,854 offenbarte modulierbare Lichtquelle erlaubt die translatorische Verschiebbarkeit des Objektträgers mit entsprechendem mechanischem Aufwand. Nachteilig ist ferner der Umstand, daß die Belichtung nur sequenziell und nicht parallel erfolgen kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren bereitzustellen, was Belichtung und Aktivierung einzelner Bereiche eines Biopolymere aufnehmenden Objektträgers vereinfacht und maskenfrei gestaltet. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 15 gelöst.
Die mit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lösung einhergehenden Vorteile sind vielfältiger Natur. Mit sehr einfachen Mitteln lassen sich Arrays von
Biopolymeren wie z.B. Oligonukleotide und Peptide beispielsweise synthetisieren. Ferner lassen sich Biopolymere lichtgesteuert immobiliseren, es werden keine Masken benötigt, deren Vorbereitung und Erstellung dienenden
Arbeitsschritte können vollständig entfallen. Mit dem Fortfall der Masken können auch die damit zusammenhängenden Justageabläufe vollständig entfallen. Es werden weder komplizierte und teure mechanische Verschiebetische zur
Ansteuerung der einzelnen Syntheseorte noch aufwendige
Positionierungsapparaturen benötigt. Die Belichtungsschritte können allesamt parallel ablaufen, ferner lassen sich durch das Entfallen der Masken mittels des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens auch die Synthese von Individual- oder Kleinserien extrem wirtschaftlich durchführen.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Nukleotide und Peptide auf Oberflächen synthetisieren. Daneben lassen sich auch Biopolymere auf den Oberflächen jeweils immobilisieren. Unter Biopolymeren sind beispielsweise Nucleinsäuren, deren Analoga (z.B. PNA, LNA), Aminosäuren, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, sowie Kombinationen von diesen zu verstehen. Das Ein- und Ausschalten der Leuchtdioden des Leuchtdioden- Arrays aus 9, 16, 25 oder bis zu 100 oder noch mehr Leuchtdioden wird bevorzugt über eine Recheneinheit automatisch gesteuert. Die Recheneinheit enthält die jeweils gewünschten Strahlungsanordnungen in gespeicherter Form.
Über die Recheneinheit läßt sich auch die Belichtungsdauer eingeben, während der die einzelnen Leuchtdioden ausgewählte Bereiche eines Objektträgers bestrahlen. Vorzugsweise werden solche Leuchtdioden verwendet, die eine energiereiche Strahlung im UV-Bereich emittieren. Zur Verkürzung des Synthesevorgangs durch Abkürzung der Aktivierungs- bzw. Immobilisierungszeiten lassen sich Belichtungsvorgänge durch das mehrere Leuchtdioden enthaltende Leuchtdioden-Array gleichzeitig vornehmen. Eine sequenzielle Abfolge von Belichtungsvorgängen läßt sich daneben ebenfalls einrichten.
Die Gleichzeitigkeit der Ansteuerung mehrerer Leuchtdioden des Leuchtdioden- Arrays läßt sich beispielsweise durch die Ansteuerung der Leuchtdioden über die Parallelschnittstelle eines Rechners verwirklichen. Die parallele Vornahme von Belichtungszyklen unter Beachtung der in der Recheneinheit abgelegter Sequenz individueller Belichtungszeiten verkürzt die Synthese von Biopolymeren erheblich. Das Substrat für die darauf zu synthetisierenden Biopolymere befindet sich in einer Speiseeinrichtung unterhalb eines lichtdurchlässigen Bereiches. Die Speiseeinrichtung kann beispielsweise als eine Durchflußkammer konfiguriert sein, in der sich die für die durchzuführende Synthese benötigten Chemikalien sequentiell anbieten lassen. In den ansteuernden Rechner werden zunächst die jeweiligen Sequenzen für die einzelnen Felder des zu synthetisierenden Arrays eingegeben. Mit einem entsprechenden Programm steuert der Rechner entsprechend dieser Vorgaben die einzelnen Leuchtdioden im Leuchtdioden- Array korreliert zu sequentiellen und zyklischen Zufuhr der einzelnen Monomere an.
Bevorzugt läuft die Belichtung räumlich getrennt von der chemischen Synthese ab, um jedwede äußeren störenden Einflüsse während der Belichtung auszuschließen. Neben der Pro-Sequenz individuell zu synthetisierenden Biopolymeren kann in der Recheneinheit auch die sequentielle Abfolge von Immobilisierungsplätzen für frei wählbare Biopolymere abgespeichert werden.
Mittels der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Vorrichtung kann durch Rechnergestütztes paralleles Ansteuern einzelner Leuchtdioden eine parallele lichtgesteuerte Synthese bzw. Immobilisierung von Biopolymeren erreicht werden, ohne dass Masken erforderlich sind. Bevorzugt sind die Leuchtdioden als Licht in UV- Wellenlängenbereich emittierende Leuchtdioden ausgelegt. Zur geometrischen Skalierung der Biopolymeren- Arrays kann beispielsweise eine optische Abbildung des Leuchtdioden-Arrays im gewünschten Maßstab erfolgen Hierfür werden entsprechend geeignete optische Vorrichtungen eingesetzt.
Anhand der Zeichnung wird die Erfindung nachstehend näher erläutert:
Es zeigt:
Fig. 1 ein Feld von beispielsweise 4 x 4 individuell ansteuerbarer
Leuchtdioden mit den elektrischen Ansteuerleitungen,
Fig. 2 ein Fluoreszenz-Bild eines Oligonukleotid-Arrays, synthetisiert unter Verwendung eines 4 x 4 Leuchtdioden-Arrays nach Hybridisierung, Fig. 3 vier Oberflächenfluoreszenzbilder in vier unterschiedlichen
Empfindlichkeitsstufen zur Ermittlung einer ausreichenden Belichtungszeit mit einem 3 x 3 Leuchtdioden-Array,
Fig. 4 den Aufbau einer Sequenz auf einer Chipoberfläche mit Hilfe eines
2 x 2 Leuchtdioden-Arrays.
In Fig. 1 ist die Draufsicht auf ein Feld mit beispielsweise 4 x 4 individuell ansteuerbaren Leuchtdioden und die dazugehörige Ansteuerungselektronik beispielhaft dargestellt.
In schematischer Darstellung ist in Fig. 1 ein Leuchtdioden-Array 1 wiedergegeben, welches unterhalb eines Objektträgers 12 oder unterhalb einer Chipoberfläche 19 liegt. Bei der in Fig. 1 gezeichneten Anordnung handelt es sich um eine Leuchtdiodenanordnung 1, die 16 individuell elektrisch ansteuerbare Leuchtdioden 2 enthält; von den dargestellten Leuchtdioden 2 sind die Leuchtdioden A1? B3 und D4 näher dargestellt, die beispielsweise für eine von sechzehn DNA-Sequenzen anzusteuern sind.
Jede Ansteuerung einer Leuchtdiode 2 des Leuchtdioden-Array 1 erfolgt über separate Ansteuerleitungen 4, wobei die einzelnen Leuchtdioden 2 mit dem Versorgungsteil 8 verbunden sind. Ferner sind die einzelnen Leuchtdioden 2 des Leuchtdioden-Arrays 1 jeweils mit Widerständen 5 verbunden, von welchen sich weitere Leitungen zu Speicherzellen 6 bzw. 7 erstrecken. Die Speicherzellen 6 bzw. 7 ihrerseits werden über eine an einer Recheneinheit 22 vorgesehenen Parallelschnittstelle 10 angesteuert. Im hier nur schematisch mit seiner Parallelschnittstelle 10 dargestellten Rechner 22 lassen sich in verschiedenen Dateien beispielsweise die DNA-Sequenzen 20 sowie die zur Entfernung der einzelnen photolabilen Schutzgruppen erforderlichen Belichtungszeiten oder auch die sequentielle Abfolge von Immobilisierungsplätzen abspeichern. Ferner können durch die Recheneinheit 22 diejenigen für die Synthese von Biopolymeren wie beispielsweise Oligonukleotiden oder Peptiden benötigten Chemikalien bereitgestellt werden, wobei diese je nach zu behandelnder Sequenz an genau vorgebbaren Belichtungsorten, nachdem dort die labilen Fotoschutzgruppen entfernt worden sind, reagieren. Durch die Korrelation der Sequenzen, mit dem Chemikalienzufluß und den zugehörigen Belichtungsorten kann durch die Verwendung des Parallelports 10 an der Recheneinheit 22 ein gleichzeitiges Belichten mehrerer Belichtungsorte erfolgen.
Die lichtgesteuerte Synthetisierung findet in einer Speiseeinrichtung beispielsweise statt, die beispielsweise als eine Durchflußzelle ausgebildet sein kann. Der Durchfluß der durch die Durchflußzelle strömenden zur Synthese notwendigen Chemikalien wird von einem DNA-Synthetisizer beispielsweise von der Recheneinheit 22, kontrolliert. In dieser liegen in Dateien beispielsweise die DNA-Sequenzen 20, in abgespeicherter digitaler Form vor.
Um innerhalb eines in einer Durchflußkammer stattfindenden Synthesezyklus zu definieren, an welcher Position welcher der vier Nukleotidbausteine - des Desoxyadenosin, Desoxythymidin, Desoxyguanosin und Desoxycytidin - aufzukondensieren ist, müssen auf dem Substratträger zu vorgegebenen Zeiten, fotolabile Schutzgruppen entfernt werden. Die Entfernung der fotolabilen Schutzgruppen ist erforderlich, weil sich nur nach deren Entfernung eine Synthese und der Aufbau eines DNA-Oligomers erreichen läßt. Die Belichtung des Substratträgers an den Orten, an denen die fotolabilen Schutzgruppen entfernt werden sollen, erfolgt durch die Leuchtdiodenanordnung 1 gemäß Fig. 1. Die einzelnen Leuchtdioden 2 der Leuchtdiodenanordnung 1 sind vorzugsweise als einzeln elektrisch ansteuerbare Leuchtdioden 2 ausgebildet. Diese emittieren eine sehr energiereiche Strahlung, vorzugsweise im ultravioletten Bereich mit einer Wellenlänge von vorzugsweise 360 nm. Es können jedoch auch Leuchtdiodenanordnungen 1 Verwendung finden, in denen Einzelleuchtdioden 2 aufgenommen sind, die eine Strahlung anderer Wellenlänge emittieren, die verschieden vom UV-Bereich ist. Die optimale Wellenlänge der Leuchtdioden 2 ist auf die verwendete Photochemie abzustimmen.
Durch die Ansteuerung der einzelnen Leuchtdioden 2 der Leuchtdiodenanordnung 1 wird festgelegt, an welcher Stelle des Substratträgers Fotoschutzgruppen abgespalten werden, um die Anlagerung zu koppelnder Nukleotidbausteine zu ermöglichen. Dazu sind beispielhaft in Fig. 1 drei Leuchtdioden 2 herausgegriffen, die mit Aj, B3 sowie D bezeichnet sind. An den Stellen des Substratträgers der Speiseeinrichtung trifft vorzugsweise die emittierte energiereiche Strahlung der mit Ai, B3 und D4 bezeichneten Leuchtdioden 2 auf und bewirkt an den so exakt festgelegten Orten die Entfernung der labilen Fotoschutzgruppen. Je nach auf dem Träger aufgebrachten Substrat, kann die Belichtungszeit unterschiedlich sein, auch abhängig von der zu erzeugenden Sequenz. Die unterschiedlichen Belichtungszeiten, die von den Leuchtdioden in Bezug auf deren Einschaltdauer einzuhalten sind, können ebenfalls in einer Datei der Recheneinheit 22 abgelegt werden und auf diese Weise in das vorgeschlagene Belichtungsverfahren eingebaut werden.
Durch die Ansteuerung der den Positionen Ai, B3 und D4 entsprechenden Leuchtdioden 2 erfolgt nun an diesen Positionen auf dem Substratträger eine Entfernung der Schutzgruppen, so daß auch nur an diesen wohl definierten Orten innerhalb dieses Syntheseschrittes am Substratträger eine Kettenverlängerung erzielbar ist. Bei einem beispielsweise darauffolgenden Syntheseschritt kann eine Abspaltung der photolabilen Schutzgruppen am Substrat beispielsweise an den Stellen 4, B2 und Dj erfolgen, so daß nach Ablauf der zur Entfernung der Schutzgruppen benötigten Belichtungszeit, nur an diesen Orten am Substrat eine Kettenverlängerung bei Zurverfügungstellung eines durch die Durchflußkammer zu führenden monomeren Bausteines erfolgen kann.
Mittels der hier skizzierten Vorgehensweise wird die Leuchtdiodenanordnung 1 als ein Feld von Einzellichtquellen eingesetzt, ohne daß eine für jeden Substratträger oder jede Chipoberfläche 19 individueller Maskensatz erforderlich ist. Mittels der Rechner gestützten individuellen Ansteuerung einzelner Leuchtdioden in Bezug auf Einwirkungszeit der Belichtung, Vorwahl der Belichtungsorte, abhängig von dem Rechner 22 abgelegten Sequenzdatei, können vorteilhaft auch Kleinserien synthetisiert werden.
Die mittels der Recheneinheit 22 angesteuerten Leuchtdiodenanordnung 1 übernimmt sowohl die Funktion der Belichtung als auch die einer Maskierung des zu belichtenden Bereiches, wodurch die Notwendigkeit, Masken zu repositionieren, vollständig entfallen kann. Ungenauigkeiten bei der Maskenrepositionierung während der Synthetisierung nach dem Maskenverfahren haben in der Vergangenheit zu erheblichen Qualitätsmängeln an solcher Art synthetisierten Biopolymerbausteinen gefuhrt.
Fig. 2 zeigt ein synthetisiertes Oligonukleotid-Array, synthetisiert unter Verwendung eines Arrays von 4 x 4 einzeln elektrisch ansteuerbaren Leuchtdioden 2. Neben der hier dargestellten Konfiguration eines Leuchtdioden- Arrays 1 kann dieses auch beliebig viele beispielsweise 25, 400 oder bis zu mehreren tausend einzelne Strahlungsquellen in Form von Leuchtdioden enthalten, wobei dahingestellt sein kann, ob diese quadratisch, rechteckig, ringförmig oder auch kreisfömig angeordnet werden können. Das in Fig. 2 abgebildete Array ist ein Fluoreszenzbild, das durch Hybridisierung mit einer Fluoreszenz maskierten Komplementärstrang-Sonde erhalten wurde.
Fig. 3 zeigt in Zusammenschau vier Oberflächenfluoreszenzbilder jeweils mit vier unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen aufgenommen. Zur Ermittlung einer ausreichenden Belichtungszeit wurde ein 3 x 3 -Leuchtdioden-Array 1 verwendet. Die vier Bilder zeigen dasselbe Array, aufgenommen in vier unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen des detektierenden Scanners.
Während in den mit geringen Empfindlichkeiten 15, 16 aufgenommenen Oberflächenfluoreszenzbildern 14, 3.1 und 3.2 keine Signale enthalten sind, sind diese bei den in Fig. 3.3 und 3.4 dargestellten Oberflächenfluoreszenzabbildungen mit höheren Empfindlichkeitsstufen 17 bzw. 18 deutlich erkennbar. Die Intensität der Signale verhält sich proportional zur Effizienz der Abspaltung der labilen Fotoschutzgruppen an der jeweiligen Position auf dem Substratträger 12 bei vorgebbarer Bestrahlungsdauer. Die Bestrahlung erfolgte mit 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 20 und 30 Minuten Dauer. Sichtbar wurde die erfolgreiche Entfernung der Fotoschutzgruppe aufgrund der Bestrahlung durch eine kovalente Anbindung eines Cy 5- Phosphoramidites nach erfolgter Bestrahlung.
In den Fig. 4.1 und 4.2 ist der Aufbau einer Sequenz auf einer Oberfläche 19 mit einer 4 Einzelleuchtdioden 2 enthaltenden Leuchtdiodenanordnung 1 sichtbar gemacht.
Auf den Oberflächenfluoreszenzbildern 14, die mit unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen 16, 18 aufgenommen sind, wurden an den vier heller wiedergegebenen Positionen 19 die Sequenz d(CGCTGGAC) mittels lichtgesteuerter DNA-Chipsynthese aufgebaut. Dazu wurde ein vier Einzelleuchtdioden 2 enthaltendes Leuchtdioden-Array 1 verwendet, die Strahlung im ultravioletten Wellenlängenbereich aussenden. Die in Fig. 4.1 und 4.2 dargestellten Abbildungen wurden mit verschiedenen Empfindlichkeitsstufen des Scanners aufgenommen. Es erfolgte eine DNA-Chipsynthese mit 2 x 2 UV- Leuchtdiodenanordnung 1 der Sequenz CGCTGGAC, die mit fluoreszenzmarkierten GTCCAGCG hybridisiert wurde bei einer Belichtungszeit von 10 Minuten.
Die abgebildeten Fig. 4.1 und 4.2 wurden nach Hybridisierung mit der komplementären 5'-Cy-5 markierten Sonde nach dem Scannen in einer Fluoreszenzabbildungseinheit erhalten.
Bezugszeichenliste
1. Leuchtdioden-Array
2. Einzelleuchtdiode
3. Feldgrenze
4. Ansteuerleitung
5. Widerstand
6. Speicherzelle
7. Speicherzelle
8. Versorgungsspannungsteil
9. Erdung
10. Parallelschnittstelle PC
11. Schnittstellenleitung 1 bis 25
12. Objektträger
13. Seitenkante
14. Oberflächenfluoreszenzbild
15. Empfindlichkeitsstufe niedrig
16. Empfindlichkeitsstufe höher
17. Empfindlichkeitsstufe hoch 18. Empfindlichkeitsstufe sehr hoch
19. Chipoberfläche At Leuchtdiodenposition
20. Sequenz d (CGCTGGAC) B3 Leuchtdiodenposition
21. Sequenzposition D4 Leuchtdiodenposition
22. Recheneinheit

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß Selektion und Aktivieren von Bereichen auf einem festen Träger durch die Abbildung einer Anordnung (1) elektrisch ansteuerbarer Leuchtdioden (2) herbeigeführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Biopolymere auf Objektträgern (12, 19) immobilisiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtidoden (2) entsprechend einer in einem Rechner (22) abgelegten Datei von Sequenzen (20) einzeln angesteuert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Leuchtdioden (2) energiereiche Strahlung im UV-Bereich emittieren.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung mehrerer Bereiche durch die Leuchtdioden (2) gleichzeitig erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung sequenziell erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ansteuerung der Leuchtdioden (2) des Leuchtdioden-Arrays (1) durch die Parallelschnittstelle (10, 11) einer Recheneinheit (22) erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Substrat für die darauf zu synthetisierenden Biopolymere in einer Speiseeinrichtung unter einem lichtdurchlässigen Bereich befindet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Synthese benötigten Chemikalien sequenziell angeboten werden und die Belichtung in der Speiseeinrichtung erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung räumlich getrennt von der chemischen Synthese abläuft.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzielle Abfolge der Immobilisierungsplätze im Rechner (22) in einer Datei abgelegt ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur geometrischen Skalierung des Leuchtdioden-Arrays (1) auf das Biopolymeren- Array geeignete optische Abbildungsverfahren verwendet werden.
13. Vorrichtung zur lichtgesteuerten Biopolymersynthese auf Objektträgern (12, 19) mit einer Belichtungsquelle, dadurch gekennzeichnet, daß einem Objektträger (12, 19) eine Belichtungsanordnung (1) zugeordnet ist, die aus elektrisch ansteuerbaren Leuchtdioden (2) besteht.
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