WO2001006848A1 - Ratones transgenicos y modelo de sobreexpresion del gen ntrk3 (trkc) basado en los mismos para el estudio y monitorizacion de tratamientos de la ansiedad, depresion y enfermedades psiquiatricas relacionadas - Google Patents

Ratones transgenicos y modelo de sobreexpresion del gen ntrk3 (trkc) basado en los mismos para el estudio y monitorizacion de tratamientos de la ansiedad, depresion y enfermedades psiquiatricas relacionadas Download PDF

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Miguel Angel Pujana Genestar
Cristina Fillat Fonts
Mara Dierssen Sotos
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Xavier Estivill Palleja
Gratacos Mayora Monica
Miguel Angel Pujana Genestar
Cristina Fillat Fonts
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Definitions

  • the invention relates to the development of murine models that overexpress the NTRK3 gene in its different iso- forms will allow to study the pathophysiology, and develop pharmacological, genetic and behavioral treatments for anxiety, depression and related psychiatric disorders.
  • Panic disorder, agoraphobia, social phobia, simple phobia and other anxiety disorders affect 5-10% of the general population.
  • the prevalence of major depressive disorder ranges from 12 to 17%, with the most prevalent psychiatric disorder.
  • mb megabases
  • Duplication 15q24-25 is closely associated with panic disorder, agoraphobia, social phobia, simple phobia and major depression.
  • Duplication 15q24-25 is generated multiple times and is found in mosaicism in most patients.
  • Anxiety disorders are neurotic disorders that include generalized anxiety, phobic disorders, panic disorders (panic attacks, panic disorders and agoraphobia) and obsessive-compulsive disorders 1,2 .
  • panic disorder and agoraphobia have an autosomal dominant inheritance with incomplete penetrance 11.
  • it has been proposed a major gene for panic disorder it has also been postulated a multifactorial / polygenic inheritance 1 .
  • the prevalence in life of the major depressive disorder ranges between 12 and 17%, the most prevalent psychiatric disorder being 13.1 .
  • the clinical characteristics with which the disorder occurs allow us to differentiate two types of depression: the endogenous (in turn subdivisible in bipolar and unipolar due to its clinical and even genetic and biological differences) and the reactive 15 .
  • Panic disorder is a particularly frequent diagnosis in these patients, as well as generalized anxiety or social phobia 16,17 . Studies find that 24% of patients with panic disorder have a depressive disorder, dysthymia being more common than major depression 18 . However, family studies on the association between anxiety and depression have yielded conflicting results. In some cases, panic disorder and major depression are distinct disorders that are transmitted specifically and independently, while the comorbid condition does not represent a single or distinct syndrome 19 . In other cases, there seems to be a higher prevalence of reactive depression in relatives of patients with panic disorder 5 '19 .
  • duplication 15q24-25 causes anxiety disorders and other psychiatric disorders, still to be determined, is probably through a gene dose effect, with overexpression of one or more genes from the duplicated region.
  • candidate genes of the 10 mb of the duplicated region we must consider those genes with a possible role in the pathophysiology of these disorders.
  • For the pathology of psychiatric origin would be the genes that are expressed in structures of the central nervous system (CNS).
  • mice with certain anxious behavior have also been obtained, which have been chemically induced by the use of mutagenic agents such as nitrosurea 2 .
  • the murine models generated will contribute to the identification of genes involved in anxiety while allowing progress in the knowledge of the pathophysiology of anxiety and its relationship with depression. In addition, they will constitute an invaluable pharmacological tool for the trial of new drugs with a specific activity profile in the treatment of anxiety and depression disorders.
  • Duplication 15q24-25 is found in 6-9% of individuals in the general population and is the main genetic susceptibility factor for anxiety and depression, there is also a relationship with disorders comorbid to them, which include disorders food
  • TgNTRK3 NTRK3
  • TgNTRK3-ki14 The characterization of TgNTRK3-ki14 indicates that the neurochemical response of the serotonergic system in control animals to the administration of a panicogenic agent is significantly different from that obtained in TgNTRK3-kil mice.
  • Overexpression of NTRK3 could have a direct trophic effect on the proportion of noradrenergic neurons that interact with the locus coeruleus. This would have a neurochemical impact, increasing the responsiveness of the noradrenergic system to punitive environmental situations or to pharmacological agents.
  • the alteration of the functionality of the noradrenergic system could condition the alteration of the neurochemical response of other neuro-transmission systems related to anxiety / depression.
  • the mouse TgNT.RK3-.ki14 is a model for the study of pathophysiology, and the development of pharmacological, genetic and behavioral treatments of anxiety, depression and related psychiatric disorders.
  • Duplication 15q24-25 is involved in family cases of various anxiety and depression disorders, confirming the genetic and inherited basis of these alterations and defining a common biological basis of susceptibility for these pathologies (panic disorder, agoraphobia, simple phobia , social phobia and depression), also suggesting their participation in related diseases such as eating disorders and drug addictions.
  • the penetrance of this genetic alteration is not complete and the mutation is present in 6-9% of individuals in the general population.
  • This incomplete penetrance of the 15q24-25 mutation is in line with clinical estimates of the penetrance of a predisposition allele for panic disorder, under an autosomal dominant model.
  • the different types of 15q24-25 duplications involve a region of chromosome 15 of about 10 Mb, between markers D15S739 and D15S930, suggesting a common mutational mechanism. This mutation originates and loses by unequal recombination between sister chromatids during the mitosis or, more likely, is due to intrachromosomal rearrangements during mitosis. Gene conversions between different types of duplications and between chromosomes Duplicates and non-duplicates are a common feature of 15q24-25 duplication. NTRK3 and anxiety disorders
  • NTRK3 neurotrophin-3 receptor
  • TRKC neurotrophin-3 receptor
  • NE integrates and coordinates responses to fear stimuli.
  • the LC is the main nucleus that contains NE in the
  • NTRK3 noradrenergic neurons
  • NTRK3 an excellent candidate for anxiety disorders.
  • Overexpression of NTRK3 in the LC can induce an excessive trophic and proliferative effect on NE neurons. Because the main source of NE in the brain is LC, the final consequence of NTRK3 overexpression would be hyperactivity and increased efficacy of NE synapses, resulting in a dys- NE response regulation. This greater efficacy of NE synapses would lower the emotional arousal threshold of the individual and alter the fear and alarm regulation system.
  • the human cDNA of NTRK3-kil4 and TgNTRK3 were microinjected, both fused to the PDGFB gene promoter, according to the described methodology.
  • This promoter was chosen since it has been shown that it is capable of directing the expression of the fused gene specifically to brain 29 .
  • Southern blot analysis allowed to identify three independent lines of transgenic mice (57, 76 and 81) containing respectively 3, 2 and 1 copy of the integrated transgene (Fig. 1) for the construction PDGFB- ⁇ globin-NTRK3 -ki.
  • a line containing approximately 5 copies of the transgene has been obtained.
  • the quantification of the number of neurons in the LC did not show significant differences between groups, although there was a non-significant tendency to present greater cellularity in females compared to males, both in the control group and in the TgNTRK3 -kil4 group ( fig. 3B).
  • the quantification of the immunoreactive neuronal population against the antithyrosine hydroxylase antibody, a marker of catecholaminergic neurons showed no significant differences in the absolute number of neurons, although in the group of transgenic animals, both male and female showed a non-significant tendency to present an increase in anti-TH neurons compared to the respective controls (fig. 3C).
  • Extracellular serotonin levels were determined by in vivo microdialysis in control and TgNTRK3-kil4 mice. Baseline levels showed no significant differences between the two groups. After collecting baseline samples for 1.5 h, the infusion was carried out through the KCl dialysis cannula (100 mM, 30 min. to 1 ml / min.). Under these stimulation conditions there was a significant increase (300-400%) in the presynaptic release of dopamine that did not differ in both experimental groups (fig. 4). These data indicate that the serotonergic system retains the integrity of its neurotransmitter release mechanisms in transgenic mice, suggesting that the serotonergic system has not been affected by overexpression of TgNTRK3-kil4.
  • the invention consists in the generation of a urinary model of overexpression of NTRK3, whose characterization reveals facts that validate it as a possible model of anxiety / depression, and probably of the psychiatric disorders related to these pathologies.
  • the results obtained indicate that the neurochemical response of the serotonergic system, a neurotransmission system that has been implicated in anxiety and depression, in control animals in the administration of a panicogenic agent, is significantly different from that obtained in TgNTRK3-kil4 mice. . This effect is not due to the impairment of the functionality of the serotonergic system, but it probably occurs through an indirect route.
  • the human cDNA corresponding to the gene isoform with an insertion of 14 amino acids in the extracellular domain of the protein (pNIJ-3) (31) was kindly provided by Dr. Dionisio Mart ⁇ n-Zanca (University of Salamanca) and was subsequently used for the construction design NT.RiC3 -.ki14.
  • a primer with a restriction target ⁇ spHI (5 'CTTCGGCATGTCCAGAGATGTCTAC 3') was designed 18 bases before the start of said insertion, a primer in the 3 'region of AD ⁇ c immediately after the stop codon of the gene with the EcoRI target (5' ATACTTAAGTACTGGTGGTCGGTGG3 ') and the corresponding sequence was amplified by PCR using the product of a brain RT as a template.
  • Plasmid p ⁇ IJ3 was digested with the restriction enzymes ⁇ spHI and EcoRI and ligated to the new fragment obtained for obtain a new plasmid without insertion and that was used for the design of the NTRK3 construction.
  • NTRK3 -kil4 and NTRK3 Two independent constructions were made for the human isoforms NTRK3 -kil4 and NTRK3.
  • the promoter-regulatory region of the PDGFB gene was fused to the NTRK3-kil4 cDNA and the NTRK3 cDNA, independently.
  • the second intron of the ⁇ -globin gene was introduced in the 5 'zone of the NTRK3-kil4 and NTRK3 cDNA, and the SV40 virus polyadenylation signal in the 3' zone.
  • the different cloning stages were carried out in the plasmid PGetn-7. The integrity of the construction was confirmed in its entirety by sequencing, using different primers located in the promoter, intronic and coding region.
  • PDGFB -NTRK3 -kil4 and PDGFB-NTRK3 were obtained, the transgene was isolated from the plasmid sequences by digestion with Xbal and Xhol and subsequent electroelution.
  • the DNA was prepared at two different concentrations of 2 ng / l and 4 ng / ml and microinjection was carried out.
  • Embryo manipulation and microinjection procedure was performed according to standard protocols. For this, embryos were obtained in the unicellular stage of the female oviduct B6SJL Fl. The embryos were microinjected with the chimeric gene, PDGFB -NTRK3 -ki 14 or the chimeric gene PDGFB-NTRK3. The embryos that survived the microinjection were transferred to CD1 receptor females in a state of pseudogestation and at three weeks of age the mice were weaned and the presence or not of the transgene was analyzed. Four . Analysis of the transcranial by southern blot
  • BcoRI was digested in parallel with amounts equivalent to 5, 10 and 10 copies of the construction used.
  • the doses of the hybridization signals were determined in the autoradiographs by quantification of the intensity of the bands and the heights of the peaks, compared to the control markers by means of a densitometer (Phoretix, International, Newcastle, UK). 2. Analysis of the levels of expression of the trans ⁇ enes by RT-PCR
  • NTRK3hum / mou-F 5 '-TGTTTGACGAAGTGAGTCCC-3' and NTRK3hum / mou - R 5'-TCCAGTGACGAGGGCGTG-3 ' were used: 1) the samples were treated with RNAse Free RNAse (Boehringer Manheim), and 2) a gdx fragment was amplified with the gdx-F 5 'primers -GGCAGCTGATCTCCAAAGTCCTGG-3 'and gdx-R 5'AACGTTCGATGTCATCCAGTGTTA-3' gives rise to fragments of different sizes as they are amplified from RNA (125 bp) or DNA (235 bp).
  • the immune complexes were collected by centrifugation, and washed and resuspended in loading buffer for SDS-7% polyacrylamide electrophoresis and subsequent electro-magnetic transfer to a HyJond-P membrane (Amersham).
  • the primary anti-panTrk antibody (1: 1000) (Promega) and the secondary anti-chicken IgY conjugated to peroxidase (1: 1000) (Promega) were used to perform the Western Jblot. Protein detection was performed according to the ECL System (Amersham) protocol. The quantification of the bands obtained was performed by densitometry (Phoretix).
  • mice were perfused with a 4% paraformaldehyde solution, dissected and fixed for 24 h. 50 ⁇ m brain sections were cut, which were washed in PBS buffer to subsequently keep them in glycerol.
  • a previous blockade of the endogenous peroxidases was performed with a solution (PBS, 3% hydrogen peroxide and 10% methanol). The nonspecific binding was blocked by a PBS solution, 0.2% TxlOO, 0.2% gelatin, 0.2% acid, 0.2% glycine and 0.2% lysine.
  • TrkC TrkC
  • TrkC-kil4 TrkC-kil4
  • a polyclonal rabbit anti-trkC antibody (1: 100) (Santa Cruz Bio-technology, Inc.) was used. Incubation of the antibody was performed under 10% normal serum. The development was carried out using a PBS solution, 0.05% DAB and 0.1% hydrogen peroxide. Functional studies of transgenic mice
  • Stereology allows a quantitative biased study of variables such as number, surface and volume in biological structures.
  • the fundamental advantage is its efficiency, so that with a small number of data high precision is achieved in the estimate.
  • the brains were reintroduced into 30% sucrose and 50 mm thick serial cuts were made in a cryostat (2800 Frigocut, Reichert-Jung). Tissue cuts were mounted on jelly-like portals and kept in a solution of cresyl violet for 2 h at 40 ° c. After staining was completed, the cuts were dehydrated by successive passes by increasing concentrations of alcohol and mounted with DPX (Fluka). The volume calculation was performed according to the method of Cavalieri 33 , based on the possibility of obtaining an unbiased estimate of the volume of any object by adding the areas of parallel sections of said object separated by a known distance. The condition that the first section is chosen at random must be met.
  • the measurement of the area in each section is estimated by using point templates, each of which has a specific area associated. The measurements were made using the CAST-GRID program adapted to an OLYMPUS microscope.
  • the optical dissector method was used, which consists in the systematic use of a sampling window, the dissector, of dimensions chosen by the experimenter that runs the deep cut.
  • the area of interest is delimited with the smallest objective (2.5x) and within it random subdivisions are made with a size chosen by the experimenter within the XY axes. Within each of these subdivisions the dissector is superimposed, area where the neurons are going to be counted.
  • Avertin Tribromoethanol / Tertamylalcohol 1.6 / 1 p / p; 0.1 mL / 10 g administered intraperitoneally.
  • the dialysis probe was connected to a continuous infusion pump, through which a Krebs Ringer solution was perfused at a flow rate of 1 ml / min. After a balancing period of one hour dialysate samples were collected every 20 min. The collection of dialysate samples was performed under baseline conditions, after stimulation with 100 mM KCl and after intraperitoneal administration of sodium lactate (0.5-2.5 mEq / kg), a substance validated as a panicogenic agent 30 . The dialysates were analyzed to determine the serotonin content by HPLC with electrochemical detection.
  • the detection is carried out by means of a 3 mm electrode, at + 0.85 v.
  • the injection volume was 5 ml.
  • the data is presented as mean +. ESM The analysis of the statistical significance of the results is performed using ANOVA using Bonferroni's analysis as a posttest.
  • Kendell RE The classification of depressions: a review of contemporary confusion. Br. J. Psvchiatrv 129, 15-28 (1976).
  • Figure 2. A) Determination of NTRK3-kil4 expression in murine line number 57. Lane 1: RT-PCR with trkC primers hum / mou F / R from total RNA obtained from the brain of a wild mouse (WT) ; lane 2, mouse TgNTRK3 -kil4
  • TG RT-PCR with trkC hum / mou F / R primers from total RNA obtained from the brain of a WT mouse and treated with DNAse RNAse free (Boehringer Manheim); lane 4, mouse TG; lanes 5-8, controls of genomic contamination in RT-PCR reactions using gdx murine gene primers to discriminate between amplification from RNA (125 bp) or from DNA (235 bp); rails 5 and 6, of WT and TG mice respectively, without treating with RNAse free RNAse, lanes 7 and 8, of WT and TG mice respectively, with RNAse treatment, free, lanes 9 and 10, controls murine genomic DNA; lanes 11-14, RT-PCR control with specific primers of the murine dscrl gene (672 bp); lane 15, control trkC hum / mou F / R from the construct used; lane 16, control of the trkC hum / mou F / R primers;
  • FIG. 4 Response of the serotonergic system against the sodium lactate panicogenic agent in TgNTRK3-kil4 mice and controls.
  • K + indicates infusion of KCl.
  • the arrow indicates the infusion of sodium lactate.

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Abstract

Se han desarrollado líneas de ratones transgénicos que sobreexpresan el gen NTRK3 (TRKC), localizado en la región cromosómica 15q24-25 duplicada en los pacientes con tastornos de ansiedad. Los ratones trangénicos desarrollados constituyen un modelo para el estudio de la fisiopatología, y el desarrollo de tratamientos farmacológicos, genéticos y conductuales de la ansiedad y de la depresión y trastornos psiquiátricos relacionados, entre otros, trastornos de pánico, agorafobia, fobia social, fobia simple, trastorno bipolar, trastornos alimentarios (tipo anorexia, bulimia y obesidad), drogodependencia, etc.

Description

RATONES TRANSGENICOS Y MODELO DE SOBREEXPRESIÓN DEL GEN
NTRK3 { TRKC) BASADO EN LOS MISMOS PARA EL ESTUDIO Y
MONITORIZACION DE TRATAMIENTOS DE LA ANSIEDAD, DEPRESIÓN Y
ENFERMEDADES PSIQUIÁTRICAS RELACIONADAS
Campo de la invención
La invención versa sobre el desarrollo de modelos murinos que sobreexpresen el gen NTRK3 en sus distintas iso- formas permitirá estudiar la fisiopatología, y desarrollar tratamientos farmacológicos, genéticos y conductuales para la ansiedad, depresión y trastornos psiquiátricos relacionados .
Estado de la técnica anterior
El trastorno de pánico, la agorafobia, la fobia social, la fobia simple y otros trastornos de ansiedad afectan al 5- 10% de la población general. La prevalencia del trastorno depresivo mayor oscila entre un 12 y un 17%, siendo el trastorno psiquiátrico más prevalente. Hemos detectado una duplicación de unas 10 megabases (mb) del cromosoma 15 (15q24-25) en los individuos que sufren trastornos de ansiedad y depresión. Hemos observado que la duplicación 15q24-25 está estrechamente asociada al trastorno de pánico, agorafobia, fobia social, fobia simple y depresión mayor. La duplicación 15q24-25 se genera en múltiples ocasiones y se encuentra en mosaicismo en la mayoría de los pacientes. El 6-9% de los individuos de la población general tienen la duplicación 15q24-25, la cual constituye el principal factor genético de susceptibilidad para la ansiedad y depresión, y probablemente para los trastornos comórbidos a los mismos, los cuales incluyen trastornos alimentarios (anorexia y bulimia) y dependencias (alcoholismo y drogodependencias) . La región duplicada contiene unos 50-100 genes, siendo el mejor candidato para los trastornos de ansiedad y depresión el gen que codifica para el receptor de la neurotrofina-3 , NTRK3 , (también conocido como TRKC) . Los trastornos de ansiedad son alteraciones neuróticas que incluyen la ansiedad generalizada, los trastornos fóbi- cos, los trastornos de pánico (ataques de pánico, trastornos de pánico y agorafobia) y trastornos obsesivo-compulsivos1,2. La prevalencia de este grupo de alteraciones se estima en 10% en la población adulta y el 5% en los pacientes infantiles3"5. Se estima que hay varios millones de personas afectadas de trastornos de ansiedad en Europa y en Estados Unidos, pero la prevalencia real de estas alteraciones es probablemente mayor. Los trastornos de ansiedad y pánico segregan familiarmente, de forma que el 25-65% de los casos tienen una historia familiar positiva. Sin embargo, la transmisión familiar de los trastornos de ansiedad se ha explicado a menudo por factores ambientales familiares comunes . El riesgo de los familiares de primer grado de pacientes con trastornos de pánico se ha estimado en 8 a 17%, mientras que la prevalencia en la población general de los trastornos de pánico es del 3%4"7. Estudios en gemelos con trastornos de ansiedad muestran una concordancia del 15-63% para los gemelos monocigotos, frente al 0-43% entre los gemelos dicigotos8"10. El tipo de transmisión familiar de los trastornos de pánico no está bien definida, pero se ha sugerido que los trastornos de pánico y la agorafobia tienen un patrón de herencia autosómico dominante con una penetrancia incompleta11. A pesar de que se ha propuesto un gen principal para el trastorno de pánico, también se ha postulado una herencia multifactorial/poligénica1.
La prevalencia en vida del trastorno depresivo mayor oscila entre un 12 y un 17%, siendo el trastorno psiquiá- trico más prevalente13,1. A pesar de constituir una única entidad diagnóstica, las características clínicas con las que se presenta el trastorno permiten diferenciar dos tipos de depresión: la endógena (a su vez subdivisible en bipolar y unipolar debido a sus diferencias clínicas e incluso genéticas y biológicas) y la reactiva15.
Los trastornos de ansiedad presentan una importante comorbilidad con los trastornos depresivos. El trastorno de pánico es un diagnóstico especialmente frecuente es estos pacientes, así como la ansiedad generalizada o la fobia social16,17. Los estudios encuentran que un 24% de pacientes con trastorno de pánico tienen un trastorno depresivo, siendo más común la distimia que la depresión mayor18. Sin embargo, los estudios familiares sobre la asociación entre ansiedad y depresión han dado resultados contradictorios. En algunos casos el trastorno de pánico y la depresión mayor son trastornos distintos que se transmiten específica e independientemente, mientras que la condición comórbida no representa un síndrome único o distinto19. En otros casos parece que existe una prevalencia mayor de depresión reac- tiva en parientes de pacientes con trastorno de pánico5'19. Se han propuesto varias hipótesis para explicar esta asociación: 1/ la asociación puede existir por azar, ya que al ser ambos trastornos altamente prevalentes, habría una probabilidad estadísticamente más elevada de que con- currieran en un mismo individuo; 2/ una enfermedad predispone a la otra; y 3/ la ansiedad y la depresión pueden ser dos manifestaciones de una sola enfermedad de base20.
Hemos detectado duplicaciones intersticiales del cromosoma 15q24-25 en pacientes afectados de trastorno de pá- nico, agorafobia, fobia social, fobia simple, depresión mayor e hiperlaxitud articular (casos familiares y casos no relacionados) . Esta mutación genómica es el factor genético de predisposición para los cuadros psiquiátricos descritos y se encuentra en el 6-9% de la población general. Hemos desarrollado métodos citológicos y citogenéticos basados en hibridación in situ fluorescente, para la detección de la duplicación 15q24-25 y el mosaicismo asociado. Hemos desarrollado métodos moleculares, basados en análisis de ADN o ARN, para la determinación cuantitativa de genes o de otras secuencias de la región 15q24-25, que pueden ser útiles para el diagnóstico de la ansiedad y las patologías relacionadas con la misma, incluyendo agorafobia, fobia social, fobia simple, ataques de pánico, trastornos de pánico, depresión mayor y otras patologías asociadas (Solicitud de Patente 09/121.546, U.S.A., "Duplications of human chromosome 15q24- 25 and anxiety disorders, diagnostic methods and their detection" , 23 de julio de 1998).
El mecanismo mediante el cual la duplicación 15q24-25 causa trastornos de ansiedad y otros trastornos psiquiátri- eos, todavía por determinar, es probablemente a través de un efecto de dosis génica, con sobreexpresión de uno o varios genes de la región duplicada. Entre los genes candidatos de las 10 mb de la región duplicada, debemos considerar aquellos genes con un posible papel en la patofisiología de estos trastornos. Para la patología de origen psiquiátrico serían los genes que se expresan en estructuras del sistema nervioso central (SNC) .
La necesidad de comprender las bases neuropatológicas de los trastornos de ansiedad, unida a la carencia de mode- los biológicos específicos para el ensayo farmacológico, ha determinado un notable interés en la búsqueda de modelos de ansiedad. Los esfuerzos realizados hasta la actualidad se han canalizado en diferentes direcciones: i) modelos inducidos químicamente [colecistokinina (CCK4 y CCK8) , C02, lactato sódico, agonistas noradrenérgicos (como la yohimbina o la cafeína) , antagonistas GABAErgicos (como la bicuculi- na) , o fármacos de carácter serotoninérgico] , ii) modelos obtenidos mediante lesión o estimulación de diferentes áreas cerebrales (inhibición tónica del hipotálamo dorsomedial, la estimulación selectiva de la amígdala o la estimulación neuroquirúrgica de la sustancia gris periaqueductal) , y iii) modelos obtenidos mediante selección genética de cepas de animales que muestran una marcada reactividad emocional en pruebas conductuales específicas. A partir de estos estudios se han generado diferentes modelos experimentales que permiten un análisis de los factores genéticos subyacentes. Existen diferentes cepas obtenidas mediante este método. A partir del apareamiento selectivo de la cepa murina siracusa en función de la respuesta de evitación de cada animal, se han obtenido líneas murinas de ansiedad elevada o reducida. De igual manera, en ratas de la cepa romana se han obtenido dos líneas con respuestas diferenciales, tanto a nivel con- ductual como a nivel neuroendocrino . Las líneas que presentan un índice de evitación elevado y que, por tanto, se consideran más ansiosas, se han denominado román high avoidance (RHA) y las poco evitadoras, román low avoidance (RLA)21. También se han obtenido modelos genéticos de ratones con cierto comportamiento ansioso, los cuales se han inducido químicamente mediante el empleo de agentes muta- génicos como es la nitrosurea2.
En el marco de una estrategia diferente, el desarrollo de modelos murinos de sobreexpresión de genes contenidos en la mutación DUP25 constituye la aproximación más parecida a la alteración genética que responsable de los trastornos de ansiedad y depresión detectados en humanos. La utilización de estos modelos permitirá disponer de puntos de referencia para la evaluación conductual, siendo necesario comprobar que los modelos obtenidos son capaces de separar las características de las diferentes formas en que se expresa la ansiedad patológica en el humano: ansiedad generalizada, ansiedad en la interacción social (fobia social) o a través de trastornos de pánico (ataques de pánico, trastorno de angustia con crisis de pánico o agorafobia) . Precisamente una de las principales limitaciones de los modelos murinos existentes es que estos cuadros se confunden, de tal manera que aquellos considerados de ansiedad pueden compartir características de los trastornos de pánico en todos o en alguno de los criterios de validación. Paralelamente, es necesario seleccionar procedimientos experimentales adecuados que cumplan los criterios de homología farmacológica y detecten el fenotipo concreto desarrollado. Los modelos murinos generados contribuirán a la identificación de genes implicados en la ansiedad al tiempo que permitirán avanzar en el conocimiento de la fisiopatología de la ansiedad y su relación con la depresión. Además, constituirán una herramienta farmacológica inestimable para el ensayo de nuevos fármacos con un perfil de actividad específico en el tratamiento de los trastornos de ansiedad y depresión.
Sumario de la invención
La duplicación 15q24-25 se encuentra en el 6-9% de los individuos de la población general y es el principal factor genético de susceptibilidad para la ansiedad y depresión, existiendo también una relación con trastornos comórbidos a los mismos, los cuales incluyen los trastornos alimentarios
(anorexia y bulimia) y alcoholismo y drogodependencias .
Hemos desarrollado líneas de ratones transgénicos que so- breexpresan el gen NTRK3 ( TRKC) , localizado en la región cromosómica 15q24-25 duplicada en los pacientes con trastornos de ansiedad. La caracterización del TgNTRK3-ki14 indica que la respuesta neuroquímica del sistema serotoni- nérgico en los animales control ante la administración de un agente panicogénico, es significativamente diferente de la obtenida en ratones TgNTRK3-kil . La sobreexpresión de NTRK3 podría tener un efecto trófico directo sobre la proporción de neuronas noradrenérgicas que interaccionan con el locus coeruleus. Ello tendría una repercusión neuroquímica, incrementando la capacidad de respuesta del sistema noradrenérgico frente a situaciones ambientales punitivas o a agentes farmacológicos. La alteración de la funcionalidad del sistema noradrenérgico podría condicionar la alteración de la respuesta neuroquímica de otros sistemas de neuro- transmisión relacionados con ansiedad/depresión. El ratón TgNT.RK3-.ki14 constituye un modelo para el estudio de la fisiopatología, y el desarrollo de tratamientos farmacológicos, genéticos y conductuales de la ansiedad, depresión y trastornos psiquiátricos relacionados.
Descripción detallada de la invención
La duplicación 15q24-25 está implicada en los casos familiares de varios trastornos de ansiedad y depresión, confirmando la base genética y hereditaria de estas altera- ciones y definiendo una base biológica común de susceptibilidad para estas patologías (trastorno de pánico, agorafobia, fobia simple, fobia social y depresión) , también sugiriendo su participación en enfermedades relacionadas como los trastornos alimentarios y las drogodependencias . La penetrancia de esta alteración genética no es completa y la mutación está presente en 6-9% de los individuos de la población general . Esta penetrancia incompleta de la mutación 15q24-25 está en consonancia con las estimaciones clínicas sobre la penetrancia de un alelo de predisposición para el trastorno de pánico, bajo un modelo autosómico dominante .
Las distintos tipos de duplicaciones 15q24-25 implican una región del cromosoma 15 de unas 10 Mb, entre los marcadores D15S739 y D15S930, sugiriendo un mecanismo mutacional común. Esta mutación se origina y pierde mediante recombinación desigual entre cromátides hermanas durante la mito- sis o, más probablemente, es debida a reordenamientos intra- cromosómicos durante la mitosis. Las conversiones génicas entre distintos tipos de duplicaciones y entre cromosomas duplicados y no duplicados son una característica común de la duplicación 15q24-25. NTRK3 y trastornos de ansiedad
Entre los genes duplicados de 15q24-25 el mejor candidato para explicar los trastornos de ansiedad en base a la sobreexpresión del mismo es el gen que codifica para el receptor de la neurotrofina-3 , NTRK3 , (también conocido como TRKC) 23, 2* . A pesar de que los factores neurotróficos tienen importancia en enfermedades neurodegenerativas, también están implicados en plasticidad neuronal, y pueden mediar cambios en las conexiones asociadas con memoria y aprendizaje25. También se ha visto que los fármacos antidepresivos causan modificaciones en los niveles de expresión de las neurotrofinas y sus receptores, especialmente neurotro- fina-3 (NT-3)26. En el SNC, NTRK3 se expresa abundantemente en corteza cerebral, hipocampo, tálamo e hipotálamo. NTRK3 es el único receptor de neurotrofinas detectado en el locus coeruleus (LC)27. En la patogenia del trastorno de pánico existe un incremento significativo de la función noradre- nérgica central, debido a que el sistema de norepinefriña
(NE) integra y coordina las respuestas a los estímulos de miedo. El LC es el principal núcleo que contiene NE en el
SNC, y juega un importante papel en la atención y la respuesta a los estímulos de estrés28. La expresión específica de NTRK3 en las neuronas noradrenérgicas y su localización en la región duplicada en los pacientes con trastornos de ansiedad, la cual puede causar su sobre- expresión, sitúa a NTRK3 como un candidato excelente para los trastornos de ansiedad. La sobreexpresión de NTRK3 en el LC puede inducir un efecto trófico y proliferativo excesivo en las neuronas NE. Debido a que la principal fuente de NE en el cerebro es el LC, la consecuencia final de la sobre- expresión de NTRK3 sería una hiperactividad e incremento de eficacia de las sinapsis NE, dando como resultado una dis- regulación en la respuesta NE. Esta mayor eficacia de las sinapsis NE disminuiría el umbral de excitación emocional del individuo y alteraría el sistema de regulación del miedo y alarma.
Generación de ratones transgénicos TcrNTRK3 -kil4 γ TaNTRK3
Para la generación de los ratones transgénicos se procedió a la microinyección del ADNc humano de NTRK3-kil4 y TgNTRK3 , ambos fusionados al promotor del gen PDGFB, según la metodología descrita. Se escogió dicho promotor dado que se ha demostrado que es capaz de dirigir la expresión del gen fusionado de forma específica a cerebro29. El análisis por southern blot permitió identificar para la construcción PDGFB -βglobina-NTRK3 -ki 14 tres líneas independientes de ratones transgénicos (57, 76 y 81) que contenían respectivamente 3, 2 y 1 copia del transgén integrado (fig. 1) . Para la construcción TgNTRK3 se ha obtenido una línea que contiene aproximadamente unas 5 copias del transgén.
Análisis de la expresión del transαén
Los estudios de expresión se han llevado a cabo en la generación Pl de los ratones TgNTRK3 -kil4 de la línea 57. Los resultados demuestran que el transgén se expresa, tanto a nivel de ARN, determinado por técnicas de RT-PCR, (fig. 2A) como a nivel de proteína, como se observa tras el análisis por western blot y la inmunohistoquímica (fig. 2B y 2C) . La cuantificación de los niveles de expresión ha permitido estimar que la cantidad de proteína en los ratones TgNTRK3 -kil4 es dos veces la de los animales control . Incremento OroOorciónal de neuronas noradrenércricas en el locus coeruleus en TαNTRK3 -kil4
Las estimaciones de los volúmenes se obtuvieron sepa- radamente en machos y hembras controles vs TgNTRK3 -kil4 . No se apreciaron diferencias significativas en ninguno de los grupos analizados (fig. 3A) .
La cuantificación del número de neuronas en el LC no mostró diferencias significativas entre grupos, si bien se observó una tendencia no significativa a presentar una mayor celularidad en las hembras frente a los machos, tanto en el grupo control como en el grupo TgNTRK3 -kil4 (fig. 3B) . La cuantificación de la población neuronal inmu- norreactiva frente al anticuerpo antitirosina hidroxilasa, marcador de neuronas catecolaminérgicas, no mostró diferencias significativas en el número absoluto de neuronas, si bien en el grupo de animales transgénicos, tanto machos como hembras mostraron una tendencia no significativa a presentar un aumento de neuronas anti-TH frente a los res- pectivos controles (fig. 3C) . Estas tendencias determinaron que el porcentaje de neuronas noradrenérgicas vs neuronas totales (100 neuronas AntiTH/neuronas Totales) estuviera incrementado en los animales TgNTRK3 -kil4 respecto a los controles, alcanzando estas diferencias significación esta- dística en las hembras, debido al reducido número de machos control de los que se disponía (fig. 3D) .
Respuesta diferencial del sistema serotoninérαico frente al agente panicoαénico lactato sódico en ratones TσNTRK3 -kil4
Los niveles extracelulares de serotonina se determinaron mediante microdiálisis in vivo en ratones control y TgNTRK3 -kil4 . Los niveles básales no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos. Tras la recogida de muestras básales durante 1,5 h, se procedió a la infusión a través de la cánula de diálisis de KCl (100 mM, 30 min. a 1 ml/min.). En estas condiciones de estimulación se produjo un incremento (300-400%) significativo en la liberación presináptica de dopamina que no difirió en ambos grupos experimentales (fig. 4) . Estos datos indican que el sistema serotoninérgica conserva la integridad de sus mecanismos de liberación de neurotransmisor en los ratones transgénicos, sugiriendo que el sistema serotoninérgico no ha sido afectado por la sobreexpresión de TgNTRK3 -kil4 . Experimentos iniciales mostraron que la inyección intraperitoneal de dosis bajas de lactato sódico (0,5 mEq/kg) producía un ligero incremento en la concentración extracelular de sero- tonina (125%) durante los primeros 30 min. tras la administración, que no se observaba en los animales transgénicos. A dosis más elevadas (2,5 mEq/kg), cuyo efecto panicogénico ha sido demostrado en rata30, en animales control se produjo un incremento muy importante (1200%) de la concentración extracelular de serotonina, que no fue observable en ratones transgénicos, en los que el incremento alcanzó escasa- mente un 300% respecto al valor basal, siendo la diferencia entre ambos grupos muy significativa (p<0.001).
En resumen, la invención consiste en la generación de un modelo urino de sobreexpresión de NTRK3, cuya caracterización revela hechos que lo validan como posible modelo de ansiedad/depresión, y probablemente de los trastornos psiquiátricos relacionados con estas patologías. Los resultados obtenidos indican que la respuesta neuroquímica del sistema serotoninérgico, un sistema de neurotransmisión que ha sido implicado en ansiedad y depresión, en los ani- males control ante la administración de un agente panicogénico, es significativamente diferente de la obtenida en ratones TgNTRK3 -kil4 . Este efecto no se debe a la afectación de la funcionalidad del sistema serotoninérgico, sino que probablemente se produce a través de una vía indi- recta. Los estudios estereológicos indicarían, sin embargo, que la sobreexpresión de NTRK3 podría tener un efecto trófico directo sobre la proporción de neuronas noradrenér- gicas localizadas en este núcleo. Ello tendría una repercusión neuroquímica, incrementando la capacidad de res- puesta del sistema noradrenérgico frente a situaciones ambientales punitivas o a agentes farmacológicos. La alteración de la funcionalidad del sistema noradrenérgico podría condicionar la alteración de la respuesta neuroquímica de otros sistemas de neurotransmisión relacionados con ansiedad/depresión.
Metodología empleada en la ixnplementac±ón de la invención
Generación de ratones transgénicos
1. Identificación del ADNc de NTRK3 -kil4 v NTRK3
El ADNc humano correspondiente a la isoforma del gen con una inserción de 14 aminoácidos en el dominio extrace- lular de la proteína (pNIJ-3) (31) fue amablemente cedido por el Dr. Dionisio Martín-Zanca (Universidad de Salamanca) y fue utilizado posteriormente para el diseño de la construcción NT.RiC3 -.ki14. Para la obtención del ADΝc humano correspondiente a la isoforma del gen con la deleción de esos mismos 14 aminoácidos, se diseñó un cebador con una diana de restricción ΝspHI (5' CTTCGGCATGTCCAGAGATGTCTAC 3') 18 bases antes del inicio de dicha inserción, un cebador en la región 3' del ADΝc inmediatamente después del codón stop del gen con la diana EcoRI (5 'ATACTTAAGTACTGGTGGTCGGTGG3 ' ) y se amplificó por PCR la secuencia correspondiente utilizando el producto de una RT de cerebro como molde. El plás- mido pΝIJ3 fue digerido con las enzimas de restricción ΝspHI y EcoRI y ligado al nuevo fragmento obtenido para obtener un nuevo plásmido sin la inserción y que se utilizó para el diseño de la construcción NTRK3.
2. Diseño de las construcciones PDGFB -ki!4 y PDGFB -NTRK3
Se realizaron dos construcciones independientes para las isoformas humanas NTRK3 -kil4 y NTRK3. La región promotora-reguladora del gen PDGFB se fusionó al ADNc NTRK3 -kil4 y al ADNc NTRK3 , independientemente. Con la finalidad de estabilizar los transcritos generados se introdujo el segundo intrón del gen de la β-globina en la zona 5 ' del ADNc de NTRK3 -kil4 y NTRK3 , y la señal de poliadenilación del virus SV40 en la zona 3'. Las diferentes etapas de clonación se llevaron a cabo en el plásmido PGetn-7. La integri- dad de la construcción fue confirmada en su totalidad por secuenciación, utilizando diferentes cebadores situados en la región promotora, intrónica y codificante. Una vez obtenidas las dos construcciones, PDGFB -NTRK3 -kil4 y PDGFB- NTRK3 se aisló el transgén de las secuencias plasmídicas por digestión con Xbal y Xhol y posterior electroelución. El ADN se preparó a dos concentraciones distintas de 2 ng/ l y 4 ng/ml y se procedió a la microinyección.
3. Microinγección a ooci tos fecundados
La manipulación de los embriones y el procedimiento de microinyección se realizó de acuerdo con protocolos están- dars . Para ello se obtuvieron embriones en el estadio unicelular del oviducto de hembras B6SJL Fl . Los embriones se microinyectaron con el gen quimérico, PDGFB -NTRK3 -ki 14 o el gen quimérico PDGFB- NTRK3 . Los embriones que sobrevivieron a la microinyección fueron transferidos a hembras receptoras CD1 en estado de pseudogestación y a las tres semanas de edad los ratones se destetaron y se analizó la presencia o no del transgén. 4 . Análisis de los transcrénicos mediante southern blot
Para la identificación de los ratones transgénicos se procedió al análisis de southern blot. A partir de biopsias de cola de ratón se obtuvo ADN genómico. 10 μg de ADN se digirieron con JScoRI y los fragmentos generados se separaron en un gel de agarosa. El ADN se transfirió a membranas de nitrocelulosa y se procedió a la hibridación con una sonda específica del transgén, que consistió en la secuencia humana completa del ADNc de NTRK3. Las sondas se marcaron con 32P mediante el método del random priming32. Las hibridaciones se realizaron a 65°C en tampón Denhardts-SSC y se lavaron en 0. lx SSC, 0.1% SDS durante 15 min. Los filtros se expusieron frente a película de rayos x (Curix, Agfa) durante una noche a -80 °C32. El análisis del patrón de bandas obtenido permitió identificar un fragmento de 2,7 kb correspondiente al esperado del transgén.
Expresión de iV RJ:3-kil4 y NTRK3 en ratones TgNTRK3 -kil4 y TgNTRK3
1 . Determinación del número de copias de los transαenes
Para la determinación del número de copias insertadas en cada una de las líneas transgénicas obtenidas se digerió con BcoRI de forma paralela cantidades equivalentes a l, 5 y 10 copias de la construcción utilizada. Las dosis de las señales de hibridación se determinaron en las autorradio- grafías mediante cuantificación de la intensidad de las bandas y de las alturas de los picos, en comparación con los marcadores controles mediante un densitómetro (Phoretix, International, Newcastle, U.K.). 2. Análisis de los niveles de expresión de los transαenes mediante RT-PCR
Para el análisis de expresión de los transgenes se obtuvo ARN total a partir de cerebros de ratones trangéni- cos y ratones control. Este ARN se aisló utilizando el sistema RNeasy Mini Ki t (Quiagen) . Los diferentes ARN totales fueron retrotranscritos utilizando el protocolo GeneAmp ARN SuperScript (GibcoBRl ) . Los cebadores utilizados para el análisis de la expresión de los transgenes en los ARN retrotranscritos, se diseñaron evitando que estuviesen situados en un mismo exón, evitando también las zonas de homología entre las secuencias de NTRK3 de ratón y NTRK3 humano. La identificación de las zonas de baja homología se consiguió por el apareamiento de las secuencias humana y de ratón, utilizando el programa BLAST2 sequences (NCBI) . Los cebadores fueron:
NTRK3hum/mou-F 5' -TGTTTGACGAAGTGAGTCCC-3 ' y NTRK3hum/mou - R 5'-TCCAGTGACGAGGGCGTG-3' . A fin de identificar la posible contaminación de ADN genómico en la retrotranscripción se utilizaron dos estrategias: 1) se trataron las muestras con ADNse ARNse Free (Boehringer Manheim) , y 2) se amplificó un fragmento de gdx con los cebadores gdx-F 5 ' -GGCAGCTGATCTCCAAAGTCCTGG-3 ' y gdx-R 5'AACGTTCGATGTCATCCAGTGTTA-3 ' da lugar a fragmentos de diferente tamaño según se amplifiquen a partir de ARN (125 pb) o ADN (235 pb) .
3. Análisis v cuantif icación de la expresión de NTRK3 -ki l4 mediante western blot
Se obtuvieron lisados totales de cerebro de ratones trangénicos y ratones control en tampón de lisis RIPA (PBS
1 % TxlOO, 0.1 % SDS, 5 mM EDTA, 2.5 U/ml aprotinina y 1 mM PMSF) . Tras el aclaramiento de los lisados por centrifu- gación a 1000 xg 15 min. y a 100.000 xg 30 min. se realizó una cuantificación proteica mediante el protocolo BCA Pro- tein Assay Reagent (Pierce) . Cantidades equivalentes de lisados (1-2 mg) se immunoprecipitaron con anti-panTrk (5 /xg) ( Promega) y proteína-A Sepharose (Pharmacia) . Los inmuno complejos se recogieron mediante centrifugación, y se lavaron y resuspendieron en tampón de carga para electroforesis SDS-7% poliacrilamida y posterior transferencia electro- forética a una membrana HyJond-P (Amersham) . Para realizar el Western Jblot se utilizó el anticuerpo primario anti- panTrk (1:1000) ( Promega) y el secundario anti-chicken IgY conjugado con peroxidasa (1:1000) (Promega) . La detección de la proteína se realizó según el protocolo ECL System (Amersham) . La cuantificación de las bandas obtenidas se realizó por densitometría (Phoretix) .
4. Análi sis de la expresión de NTRK3 -kil4 mediante inmuno- hi s toquími ca
Para el análisis mediante inmunohistoquímica los ratones fueron perfundidos con una solución al 4% paraformal- dehído, diseccionados y fijados durante 24 h. Se cortaron secciones cerebrales de 50 μm, que se lavaron en tampón PBS para mantenerlas posteriormente en glicerol. Se realizó un bloqueo previo de las peroxidasas endógenas con una solución (PBS, 3% agua oxigenada y 10% metanol) . El bloqueo de las uniones inespecíficas se realizó mediante una solución PBS, 0.2% TxlOO, 0.2% gelatina, 0.2% acida, 0.2% glicina y 0.2% lisina. Para la detección de las proteínas TrkC (Ntrk3) y TrkC-kil4 (Ntrk-kil4) se utilizó un anticuerpo de conejo policlonal anti-trkC (1:100) ( Santa Cruz Bio- technology, Inc. ) . La incubación del anticuerpo se realizó bajo un 10% de suero normal. El revelado se realizó mediante una solución PBS, 0.05% DAB y 0.1% agua oxigenada. Estudios funcionales de los ratones transgénicos
TgNTRK3 -kil4 y TgNTRK3
1 . Estudios estereolóaicos en TaNTRK3 -kil4
La estereología permite un estudio cuantitativo no sesgado de variables como son número, superficie y volumen en estructuras biológicas. La ventaja fundamental es su eficiencia, de forma que con un número reducido de datos se consigue una alta precisión en la estimación. Para los estudios estereológicos se utilizaron 11 ratones TgNTRK3 - kil4 y 9 ratones control (20-25 gr.) . Una vez extraídos los cerebros y perfundidos toda la noche con solución de fijación (paraformaldehído 4%, ácido pícrico 2% en tampón fosfato 0,1 m, pH = 7,3) a 4°C, se sustituyó el fijador por sacarosa al 30% y posteriormente por una mezcla anticongelante. Los cerebros se almacenaron a -20°C hasta su utilización. Antes de iniciar la técnica los cerebros se volvieron a introducir en sacarosa 30% y se hicieron cortes seriados de 50 mm de grosor en un criostato (2800 Frigocut, Reichert-Jung) . Los cortes de tejido se montaron sobre portas gelatinados y se mantuvieron en una solución de violeta de cresilo durante 2 h a 40°c. Una vez completada la tinción, se deshidrataron los cortes mediante pases sucesivos por concentraciones crecientes de alcohol y se montaron con DPX (Fluka) . El cálculo del volumen se realizó según el método de Cavalieri33, basado en la posibilidad de obtener una estimación no sesgada del volumen de cualquier objeto mediante la suma de las áreas de secciones paralelas de dicho objeto separadas por una distancia conocida. Debe cumplirse la condición de que la primera sección se elija al azar. La medida del área en cada sección se estima mediante la utilización de plantillas de puntos, cada uno de los cuales lleva asociada un área determinada. Las mediciones se realizaron mediante el programa CAST-GRID adaptado a un microscopio OLYMPUS . Para el recuento de células en cortes de 50 mm se empleó el método del disector óptico, que consiste en la utilización sistemática de una ventana de muestreo, el disector, de dimensiones escogidas por el experimentador que recorre el corte en profundidad. En cada preparación a estudio se delimita la zona de interés con el objetivo más pequeño (2,5x) y dentro de ella se realizan subdivisiones al azar con un tamaño elegido por el experimentador dentro de los ejes XY. Dentro de cada una de estas subdivisiones se sobrepone el disector, área donde se van a contar las neuronas. Se estima que estamos situados en la superficie cuando la primera estructura de la zona que estamos observando queda enfocada. Para asegurar que todas las neuronas que contamos pertenecen a nuestra sección, se profundiza en el corte dejando una zona de seguridad (3 mm) . Se incluyen en el recuento aquellas neuronas cuyo nucléolo entra en foco por debajo de 3 mm y antes de la altura fijada por el disector (10 mm) . Para realizar el recuento se emplea el objetivo de inmersión lOOx. En el presente análisis se estudió el volumen, número total de neuronas y número de neuronas anti-TH (tirosin hidroxilasa) en el LC.
2. Experimentos de microdiálisis in vivo en TcrNTRK3 -kil4
En los experimentos de microdiálisis se utilizaron 6 ratones control y 7 ratones TgNTRK3 -kil4 (peso = 20-25 grs.). Para la implantación de las sondas de microdiálisis se anestesiaron los ratones con Avertin (Tribromoeta- nol/Tertamilalcohol 1,6/1 p/p; 0,1 mL/10 g) administrado por vía intraperitoneal . Tras la anestesia, se colocaron los animales en un aparato de estereotaxia, y las sondas de microdiálisis (Cuprophane, cutoff = 6000 Daltons; membrana 2 mm longitud, 0,24 mm diámetro externo) se implantaron en corteza cingular (coordenadas estereotóxicas respecto a Bregma: anterior: 1,5 mm; lateral: -0,04 mm; paxinos) . La situación de la sonda se verificó mediante examen histológico. Tras la cirugía, los animales se devolvieron a sus cajas de estabulación, con comida y bebida ad liJbituzn. 24 horas después de la implantación de la cánula, los animales se colocaron en cajas de dialización de metacrilato transparente, provistas de brazos de balanceo, para evitar la torsión de las cánulas de perfusión. Al inicio del experimento la sonda de diálisis se conectó a una bomba de infusión continua, a través de la cual se perfundió una solución Krebs Ringer a una velocidad de flujo de 1 mi/min. Tras un periodo de equilibrado de una hora se recogieron muestras de dializado cada 20 min. La recogida de muestras de dializado se realizó en condiciones básales, tras estimulación con KCl 100 mM y tras la administración intraperitoneal de lactato sódico (0,5 - 2,5 mEq/kg), una sustancia validada como agente panicogénico30. Se analizaron los dializados para determinar el contenido de serotonina mediante HPLC con detección electroquímica. Las monoaminas se separaron en columna de microboro de fase reversa (C-18; 5 mm, 1 x 150 mm) , utilizando una fase móvil compuesta por tampón citrato-fosfato 0,03M, con 2,1 mM de ácido octano- sulfónico, 0,1 mM de EDTA y 17% de metanol, (pH = 3,6 flujo 90 ml/min) . La detección se realiza mediante electrodo de 3 mm, a + 0,85 v. El volumen de inyección fue de 5 mi. Para el análisis estadístico, los datos se presentan como media +. ESM. El análisis de la significación estadística de los resultados se realiza mediante ANOVA utilizando como posttest el análisis de Bonferroni.
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Explicación de las figuras
Figura 1.
A) Estructura de la construcción utilizada para la obtención de ratones transgénicos TgNTRK3 -kil4 y TgNTRK3. B) análisis por digestión de ADN genómico mediante coRI de tres líneas transgénicas (57, 76 y 81) y cuantificación del número de copias insertado en cada una de ellas según controles adyacentes de la construcción con 1, 5 y 10 copias . Figura 2. A) Determinación de la expresión del NTRK3 -kil4 en la línea murina número 57. Carril 1: RT-PCR con cebadores trkC hum/mou F/R a partir de ARN total obtenido del cerebro de un ratón salvaje (WT) ; carril 2, de ratón TgNTRK3 -kil4
(TG) ; carril 3 , RT-PCR con cebadores trkC hum/mou F/R a partir de ARN total obtenido del cerebro de un ratón WT y tratado con ADNse ARNse free (Boehringer Manheim) ; carril 4, de ratón TG; carriles 5-8, controles de contaminación genómica en las reacciones de RT-PCR utilizando cebadores del gen murino gdx para discriminar entre amplificación a partir de ARN (125 pb) o a partir de ADN (235 pb) ; carriles 5 y 6, de ratones WT y TG respectivamente, sin tratar con ADNse ARNse free, carriles 7 y 8, de ratones WT y TG respectivamente, con tratamiento de ADNse ARNse, free, carriles 9 y 10, controles de ADN genómico murino; carriles 11-14, control de RT-PCR con cebadores específicos del gen murino dscrl (672 pb) ; carril 15, control trkC hum/mou F/R a partir del constructo utilizado; carril 16, control de los cebadores trkC hum/mou F/R; MW, marcador de peso molecular. B) Western lot de immunoprecipitados con anti- pantrk (Promega) a partir de proteínas totales del cerebro de ratones WT y TG procedentes de la línea 57, y cuantificación por densitometría. C) immunohistoquímica de cortes procedentes de ratones WT y TG de la línea 57. 1, hipocampo de ratón WT; 2, hipocampo de ratón TG; 3, corteza cerebral de ratón WT; 4, corteza cerebral de ratón TG.
Figura 3.
Resultados estereológicos para TgNTRK3 -kil4 y controles. A, medida del volumen del LC. B, cuantificación del número de neuronas en el LC. C y D, cuantificación de la población neuronal inmunorreactiva frente al anticuerpo antitirosina hidroxilasa.
Figura 4. Respuesta del sistema serotoninérgico frente al agente panicogénico lactato sódico en ratones TgNTRK3 -kil4 y controles. K+, indica infusión de KCl. La flecha señala la infusión de lactato sódico.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Ratón transgénico TgNTRK3 que sobreexpresa el gen NTRK3 en su forma completa bajo el control del promotor del gen PDGFB .
2 . Ratón transgénico TgNTRK3 -kil4 que sobreexpresa el gen NTRK3 en su isoforma con la inserción de 14 aminoácidos en el dominio kinasa NTRK3 -kil4 bajo el control del promotor del gen PDGFB .
3. Uso del ratón transgénico de la reivindicación 1 como modelo para el estudio de la fisiopatología de los trastornos de ansiedad, entre otros, el trastorno de pánico, agorafobia, fobia social, fobia simple y ansiedad generalizada.
4. Uso del ratón transgénico de la reivindicación 2 como modelo para el estudio de la fisopatología de los trastornos de ansiedad, entre otros, el trastorno de pánico, agorafobia, fobia social, fobia simple y ansiedad generalizada.
5. Uso de los ratones transgénicos TgNTRK3 y/o TgNTRK3 - kil4 que sobreexpresan el gen NTRK3 en sus isoformas NTRK3 o NTRK3 -kil4 , definidos en las reivindicaciones 1 y 2, como modelos para el estudio de la fisiopatología de los trastornos depresivos, entre otros, de la depresión mayor y el trastorno bipolar.
6. Uso de los ratones transgénicos TgNTRK3 y/o TgNTRK3 - kil4 que sobreexpresan el gen NTRK3 en sus isoformas NTRK3 o NTRK3 -kil4 , definidos en las reivindicaciones 1 y 2, como modelos para el estudio de la fisiopatología de trastornos alimentarios relacionados con ansiedad, entre otros de la anorexia, bulimia y obesidad.
7. Uso de los ratones transgénicos TgNTRK3 y/o TgNTRK3 - kil4 que sobreexpresan el gen NTRK3 en sus isoformas NTRK3 o NTRK3-kil4 , definidos en las reivindicaciones 1 y 2, como modelos para el estudio de la fisiopatología de los tras- tornos de abuso de substancias, entre otros de la drogo- dependencia.
8. Uso de cualquiera de los modelos basados en los ratones transgénicos definidos en las reivindicaciones 1 o 2 , o en cualquier otro ratón transgénico que sobreexprese el gen NTRK3 y/o el gen NTRK3 -kil4 , en la identificación, moni- torización y estudio de fenotipos de ansiedad, depresión, trastornos alimentarios y drogodependencia, inducidos mediante manipulación ambiental .
9. Uso de cualquiera de los modelos basados en ratones los transgénicos definidos en las reivindicaciones 1 o 2, o en cualquier otro ratón transgénico que sobreexprese el gen NTRK3 y/o el gen NTRK3 -kil4 , en la identificación, monito- rización y estudio de fenotipos de ansiedad, depresión, trastornos alimentarios y drogodependencia, e inducidos mediante un tratamiento farmacológico.
10. Uso de los ratones transgénicos definidos en las reivindicaciones 1 y 2, o de cualquier otro transgénico que sobreexprese el gen NTRK3 y/o el gen NTRK3 -kil4 , en la moni- torización de composiciones útiles para el tratamiento farmacológico de los trastornos de ansiedad, depresión, trastornos alimentarios y drogodependencia.
11. Uso de los ratones transgénicos definidos en las reivindicaciones 1 y 2 , o de cualquier otro transgénico que sobreexprese el gen NTRK3 y/o el gen NTRK3 -kil4 , en la monitorización de tratamientos conductuales de los trastornos de ansiedad, depresión, trastornos alimentarios y drogodependencia .
12. Uso de los ratones transgénicos definidos en las reivindicaciones 1 y 2, o de cualquier otro transgénicos basado en la sobreexpresión de NTRK3 y/o NTRK3 -kil4, en la monitorización de composiciones útiles en los tratamientos de transferencia génica, incluyendo secuencias antisentido, de los trastornos de ansiedad, depresión, trastornos alimen- tarios y drogodependencia.
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