WO2000079002A1 - Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications - Google Patents

Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications Download PDF

Info

Publication number
WO2000079002A1
WO2000079002A1 PCT/FR2000/001724 FR0001724W WO0079002A1 WO 2000079002 A1 WO2000079002 A1 WO 2000079002A1 FR 0001724 W FR0001724 W FR 0001724W WO 0079002 A1 WO0079002 A1 WO 0079002A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
resistance
locus
fragments
marker
resistant
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/001724
Other languages
English (en)
Other versions
WO2000079002A8 (fr
Inventor
Alain Ghesquiere
Laurence Albar
Original Assignee
Institut De Recherche Pour Le Developpement (I.R.D.)
Association Pour Le Developpement De La Riziculture En Afrique De L'ouest (Adrao)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut De Recherche Pour Le Developpement (I.R.D.), Association Pour Le Developpement De La Riziculture En Afrique De L'ouest (Adrao) filed Critical Institut De Recherche Pour Le Developpement (I.R.D.)
Priority to JP2001505345A priority Critical patent/JP2003502076A/ja
Priority to EP00949554A priority patent/EP1185707A1/fr
Priority to AU62874/00A priority patent/AU6287400A/en
Priority to APAP/P/2002/002391A priority patent/AP2002002391A0/en
Publication of WO2000079002A1 publication Critical patent/WO2000079002A1/fr
Publication of WO2000079002A8 publication Critical patent/WO2000079002A8/fr
Priority to US10/023,476 priority patent/US20030093830A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the subject of the invention is means, tools and methods for identifying the locus of a major gene for resistance to the yellow rice variegation virus (abbreviated to RYMV for Rice Yellow Mottle Virus). More specifically, it targets, as tools, PCR markers and primers.
  • RYMV yellow rice variegation virus
  • RYMV is an endemic virus in Africa. In some rare varieties of the African cultivated rice species Or ⁇ za glaberrima, very high resistance to RYMV has been identified. However, since the interspecific hybrids between the two cultivated rice species are extremely sterile, previous research has failed to describe any genetic basis or mechanism for this resistance.
  • the work of the inventors in this field has shown that a variety called Gigante, originating in Mozambique and identified by WARDA, of the Asian cultivated rice species Or ⁇ za sativa, exhibits the same characteristics as those observed in O. glaberrima.
  • the inventors characterized resistance to RYMV by demonstrating that it is linked to a major recessive resistance gene and identical in the two sources of resistance considered (O. Sativa and O. glaberrima).
  • This resistance occurs at the level of cell-to-cell movement and results in blockage of the virus in infected cells while replication of the virus is normal.
  • RYMV migration takes place in the form of a nucleoprotein complex associating viral nucleic acid, capsid protein and virus movement protein.
  • a host factor possibly a protein, also contributes to the movement of the virus.
  • resistant varieties on the contrary, a mutation of this protein no longer allows association with the virus and therefore its diffusion in the plant.
  • the invention therefore aims to provide a method for the identification of molecular markers of the locus of resistance to RYMV.
  • the invention also relates, as such, to the DNA fragments as revealed by this method, and which can be used as markers.
  • the invention further relates to the applications of such markers, in particular for defining other markers of high specificity with respect to the resistance locus and for predicting a resistant phenotype.
  • the invention also relates, as new products, to the sequences of the primers used in the PCR techniques used.
  • the identification of markers of the locus of a major gene for resistance to RYMV includes the use of AFLP markers (Amplified Fragments Length Polymorphism) and uses the PCR technique.
  • This identification process is characterized in that it comprises: - the selective amplification of rice DNA fragments on the one hand from resistant individuals, on the other hand from sensitive individuals, descended from parental varieties, these fragments having been previously subjected to a digestion step, then of ligation to fix complementary adapters of primers having, at their end, one or more specific nucleotides, one of the primers of the pair being marked for the purpose of disclosure, - the separation of the amplification products, by gel electrophoresis under denaturing conditions, and
  • the DNA fragments are obtained by digestion of the genomic DNAs of resistant plants on the one hand, and of sensitive plants on the other hand, and of their parents, using restriction enzymes. Restriction enzymes which have been found to be suitable include EcoRI and Msel.
  • Short nucleotide sequences are attached to the digestion fragments (adapters) to generate blunt ends to which adapters are then attached.
  • the primers used in the amplification step are complementary to these adapters with, at their 3 ′ end, from 1 to 3 nucleotides which may be variable.
  • the amplification step is advantageously carried out according to the PCR technique.
  • Specific amplification profiles are obtained with pairs of primers having at their end, respectively, AAC and CAG, ACC and CAG, or AGC and CAG motifs.
  • sequences corresponding to the EcoRI and Msel adapters are respectively GAC TGC GTA CCA ATT C (SEQ ID No.1) and GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID No.2).
  • the pairs of primers used for the amplification are chosen from E-AAC / M-CAG; E-ACC / M-CAG; and E-AGC / M-CAG; in which E and M correspond respectively to SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2.
  • Other couples are given in table 6 in the examples.
  • the polymorphic bands identified as specific markers of the locus of resistance to RYMV are isolated from the gels.
  • the electrophoresis gels are excised. This isolation step is followed by purification by proceeding according to conventional techniques. DNA fragments are thus available.
  • said purified fragments are cloned in an appropriate vector, such as a plasmid, introduced into host cells, in particular bacterial cells such as those of E. coll.
  • the purified and cloned DNA fragments are sequenced.
  • the invention also provides a method for obtaining markers of high specificity with respect to the locus of a major gene for resistance to RYMV.
  • This process is characterized in that pairs of PCR primers are defined which are complementary to a part of the sequence of the DNA fragment which has been sequenced, and a specific amplification of this fragment is carried out using these pairs of primers, then the amplification products are subjected to migration on an electrophoresis gel.
  • DNA sequences can be used to identify a polymorphism linked to the resistance locus in a variety to be studied according to different methods as described in the examples:
  • the invention relates, as new products, to the polymorphic AFLP bands as identified by the method defined above, from DNA of rice plants, and where appropriate isolated, purified and sequenced.
  • AFLP bands are characterized in that they are specifically demonstrated in a variety sensitive to RYMV (IR64) and in the fraction of sensitive plants resulting from the crossing of this variety with the Gigante resistance variety as described in the examples.
  • the invention particularly relates to the DNA sequences corresponding to these polymorphic bands, and which make it possible to define a segment of chromosome 4 of 10-15 cM carrying the locus of resistance to RYMV.
  • the AFLP bands correspond to restriction fragments and in particular, in accordance with an embodiment of the method of the invention, to EcoRI - Msel fragments.
  • markers M1 and M2 are characterized by a size, respectively, of 510 bp and 140 bp in electrophoresis gel under denaturing conditions. These fragments are characterized in that they correspond to DNA sequences flanking the resistance locus and located on either side of the latter at 5-10 cM.
  • the invention also relates to fragments cloned into vectors such as plasmids, these cloning vectors as such, characterized by the fact that they contain such fragments, and the host cells transformed using these vectors, such than bacterial cells like E. coli.
  • the invention relates in particular to the DNA sequence corresponding to the fragment identified as a M1 marker, and corresponding to the following sequence SEQ ID No. 3: CGTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAG CGAAGGTTCAACGTCGAGAGGGGGGGGGGGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGAGGAGGAGAGAGAGGAGGAGGAGAGAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGA
  • the DNA sequence of the marker M1 has a size of 471 bp.
  • the invention also relates, as new products, to the nucleotide sequences used as PCR amplification primers.
  • Such primers include the E-AAC / M-CAG pairs; E-ACC / M-CAG; E-ACC / M-CAG; in which E and M correspond respectively to SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 2.
  • sequences identified in the sequence of the fragment called the M1 marker are in particular sequences (5 ′, 3 ′) chosen from:
  • the invention also relates to the DNA sequence corresponding to the fragment identified as marker M2 and corresponding to the sequence SEQ ID No. 9 AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTA GCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCCATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTG
  • the size of M2 is 120 bp.
  • the invention relates to the use of the DNA sequences obtained with the above primers to define polymorphisms allowing the identification of resistant phenotypes.
  • the invention also relates to a method for identifying the DNA sequence carrying the major gene for resistance to RYMV. This process is characterized by the screening of a library made up of DNA fragments of 100 to 150 kb of the IR64 variety or other, such as the BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) library, clones in bacteria, for selecting the clone (s) of the library containing the markers defined above above and the RYMV resistance gene.
  • BAC bank is available from IRRI.
  • mapping of the sequence corresponding to the marker M1 makes it possible to identify a chromosomal area on chromosome 4 of rice carrying the locus of resistance to RYMV.
  • the mapping of the resistance gene to RYMV on chromosome 4 of the genetic map of rice makes it possible to identify markers closer to the resistance locus.
  • markers closer to the resistance locus are in particular microsatellite markers RM252 and RM273 or any other marker within the interval (4-5cM) defined by these markers making it possible to identify a polymorphism between the parents IR64 and Gigante such as the RFLP markers from genomic or cDNA libraries, microsatellites, AFLP markers or markers derived from the physical mapping of the region such as the BAC, YAC clones or their cosmids.
  • Gigante or O. glaberrima with varieties of rice sensitive to RYMV can be used for the transfer of resistance to RYMV in sensitive varieties by successive crossover followed by selection assisted by markers.
  • - Figure 1 the cloning of the M1 marker in the plasmid PGEMTeasy. Digestion of the plasmid shows a DNA fragment of 510 bp corresponding to the Ml band; - Figure 2: amplification of the Ml marker in the four varieties of rice (Azucena, Gigante, IR64 and Tog5681) using the pairs of primers
  • IR64 and Tog5681 releases an 86 bp fragment which reduces the size of the amplified fragment accordingly;
  • FIG. 8 hybridization of the marker Ml used as a probe on membranes carrying the DNA of the 4 varieties (IR64, Azucena, Gigante and Tog5681) digested with 6 restriction enzymes Apal, Kpnl, PstI, Seal, HaelII.
  • the variety Tog5681 has a different restriction profile from the other varieties for the Seal enzyme which can be used to mark the resistance locus of this variety;
  • the varieties used in the study of resistance and in particular the two resistant varieties Gigante and Tog5681 were characterized using microsatellite markers on a representative sampling of loci.
  • Polymorphism is manifested by the number of repetitions of a short nucleotide motif, most often binucleotide which is characteristic of a given variety.
  • Table 1 gives the results from a reference system established by Chen et al, above according to which the alleles are identified by the number of repeats of the motif compared to the IR36 variety which serves as a control.
  • the two varieties Gigante and Tog5681 are thus described specifically on 15 loci with respect to all other varieties (the microsatellite markers are given in the 1st column).
  • Resistance was characterized from the artificial inoculation of young seedlings with virus compared to an extremely sensitive control variety IR64.
  • the virus content was monitored for 60 days after inoculation using ELISA tests on the last leaves issued.
  • the FI hybrids obtained between the susceptible and resistant varieties were tested for resistance to the RYMV virus by ELIS A test and symptom monitoring.
  • This table gives the distribution of ELISA responses (at 405 nm) in the leaves infected by the systemic route of the FI hybrids, backcrosses and F2 descendants obtained from the backcrosses between the sensitive IR64 variety and the 2 resistant cultivars Gigante and Tog5681.
  • Gigante the inheritance of the resistance was confirmed by a resistance test on 55 F3 families of the cross (IR64 x Gigante). The results are given in Table 3.
  • the DNAs were then mixed stoichiometrically to constitute two pools of DNA corresponding respectively to 10 sensitive or resistant F2 plants with a final concentration of the mixture of 50 ng / ⁇ l. These mixtures served as a basis for the identification of resistance markers by the AFLP method (Amplified Fragments Length Polymorphism) for amplified fragment length polymorphism which was developed by Zabeau et al (4), and Vos et al. (5 ).
  • the products used are in the form of a commercial kit (Gibco BRL) issued by Keygene & Life Technologies.
  • Digestion reaction 25 ⁇ l: 5 ⁇ l of DNA (50 ng / ml) 0.2 ⁇ l (2 U) of EcoRI (10 U / ⁇ l) 0.2 ⁇ l (2 U) of Msel (5 U / ⁇ l ) 5 ⁇ l of T4 ligase 5X buffer 14.5 ⁇ l of H 2 O.
  • the digestion reaction is carried out for two hours at 37 ° C., then 15 min. at 70 ° C to inactivate restriction enzymes. After digestion, a ligation reaction is carried out.
  • the ligation reaction is carried out at 37 ° C for 3 hours, followed by inactivation of the enzyme at 60 ° C for 10 min. c - Amplification
  • the actual amplification was carried out in two stages: preamplification and specific amplification.
  • the characteristics of the preamplification by PCR are as follows: 0 cycles with denaturation: 30 sec at 94 ° C hybridization: 30 sec at 56 ° C elongation: 1 min at 72 ° C Selective amplification is done from an aliquot of the first amplification diluted 1/30 by using primers having 3 selective nucleotides at the 3 'end, and by labeling one of the primers to reveal the bands on a autoradiographic film. The following pairs of primers are used: E-AAC / M-CAG
  • E-ACC / M-CAG E-AGC / M-CAG in which E corresponds to the sequence GAC TGC GTA CCA ATT C (SEQ ID N ° 1), and
  • the hybridization temperature is reduced by 0.7 ° C per cycle, during the following 1 1 cycles: last 20 denaturation cycles: 30 sec at 90 ° C hybridization: 30 sec at 56 ° C elongation: 1 min at 72 ° C
  • the EcoRI primer is labeled (reduced to a tube of 0.5 ⁇ l): 0.18 ⁇ l of the EcoRI primer (5 ng) 0.1 ⁇ l of ⁇ 33 P ATP (10 mCu / ⁇ l)
  • the labeling reaction is carried out at 37 ° C for 1 hour and is stopped for 10 minutes at 70 ° C.
  • the amplification products are separated by electrophoresis on a denaturing polyacrylamide gel.
  • the gel is transferred to 3M Wattman paper and dried for 45 minutes at 80 ° C with a gel dryer.
  • the gel is placed in a cassette with an ultra-sensitive film.
  • the segregation data between the AFLP markers Ml to M6 and the resistance locus for the F2 pools (IR64 x Gigante) and the interspecific backcross (IR64 x Tog5681) x Tog5681 are summarized in Tables 4 and 5.
  • Data analysis of segregation and of the rare recombinants observed in the two crossings makes it possible to evaluate the rates of recombination between these different markers and the locus of resistance.
  • the markers M1 on the one hand and the markers M2 to M6 on the other hand determine a segment lower than 10-15 cM carrying the resistance locus. Ml and M2 are thus less than 5-10 cM and placed on either side of this locus.
  • Resistant F2 pool (IR64 x gigantic) 10 Sensitive F2 pool (IR64 x gigantic) 10 Interspecific backcross Tog5681 1 1
  • Resistant F2 pool (IR64 x gigantic) 1 1 0 - Sensitive F2 pool (IR64 x gigantic) 0 10 Interspecific backcross Tog5681 10 2 - 0 8
  • Resistant F2 pool (IR64 x gigantic) 11 0 - Sensitive F2 pool (IR64 x gigantic) - - 0 10 Interspecific backcross Tog5681 9 3 - 0 8 TABLE 5
  • Resistant F2 pool (IR64 x gigantic) 0 1 0 10 Sensitive F2 pool (IR64 x gigantic) 10 0 0 0 Interspecific backcross Tog5681 11 2 2 1 1
  • the amplification product was separated again on 6% denaturing acrylamide gel, and compared to the parents and to the sensitive and resistant pools.
  • the track corresponding to this amplification product shows a single band of 510 bp migrating at exactly the same level as the original band which had been excised.
  • Another 5 ⁇ l aliquot was also amplified with the same primers and was separated on 1.8% agarose gel.
  • the band corresponding to the expected size (510bp) was again excised and purified with a clean gene kit (Promega).
  • plasmid DNA was carried out with the Wizard plus kit (Promega).
  • the plasmid DNA containing the insert was digested with the EcoRI enzyme to verify the presence of the M1 marker.
  • a 1.8% agarose gel made it possible to verify the presence of the 3 kb band corresponding to the plasmid and the 510 bp band corresponding to the Ml marker (photo 1).
  • sequence of the insert (SEQ ID N ° 3) is as follows (5 ', 3'): SEQ ID N ° 3
  • the real size of the cloned rice DNA fragment is 471 bp.
  • the marker was tested on the F2 individuals from the sensitive pool and the cross-resistant pool (IR64 x Gigante). All resistant individuals have the profile of the Gigante variety (absence of the AFLP M1 marker associated with the absence of the Hpall / Mspl restriction site) with the exception of the individual (5.11). Sensitive individuals present the Hpall / Mspl restriction site in the homozygous state like the IR64 variety with the exception of two heterozygous individuals who are recombined (fig. 5).
  • the sequence of the M1 marker which can be amplified by specific primers corresponds well to the AFLP M1 marker. Digestion with the enzyme Hpall / Mspl makes it possible to distinguish the allele coming from the sensitive parent (IR64) from the resistant parent (Gigante).
  • Example 9 Marking of the resistance locus of the variety Tog5681
  • the presence of the Hpall / Mspl restriction site in the Tog5681 variety does not allow the strategy of Example 8 to be used to verify that the marker M1 is also a marker of the resistance originating from Tog5681.
  • the 4 varieties Azucena, Gigante, IR64 and Tog5681 were digested with 12 restriction enzymes (BamHI, Bg / II, Dral, EcoRI, EcoRV, HindIII, Apal, Kpnl, PstI, Seal, Xbal, HaelII) restriction polymorphism using the DNA sequence of the M1 marker as a probe.
  • the Seal enzyme identifies a polymorphism between IR64 and Tog5681 (fig. 8). This polymorphism was used to validate the Ml marker on a crossover (IR64 x Tog5681) x IR64 in segregation for resistance. 5 individuals sensitive to this crossover have been tested and all show the characteristic band of IR64. The 9 resistant individuals show only the Tog5681 band with the exception of one which is recombinant (fig. 9). The restriction polymorphism demonstrated by the Seal enzyme using the Ml marker as a probe is therefore well linked to the resistance locus of Tog5681. The genetic analysis and the identification of resistance markers are consistent in considering that the marker Ml maps the same resistance locus in the two varieties Gigante and Tog5681.
  • the AFLP band obtained with the pair of primers E-ACC / M-CAG and corresponding to the M2 band visible in the sensitive parent (IR64) and present in all the individuals making up the sensitive pool was cloned according to the same protocol as for the marker Ml. The sequence corresponding to this band was determined and 3 primers were defined (1 forward - 2 reverse) to allow the transformation of this marker into a PCR-specific marker.
  • the M2 marker can be amplified alone with a hybridization temperature of 60.5 ° C, the other parameters remaining unchanged. Under these amplification conditions, the M2 marker appears as a dominant marker characterized by the presence of a band in the sensitive parent (IR64) and the absence of a band in the parent (Gigante).
  • Example 11 Creation of a population of recombinant resistant plants between the markers M1 and M2 to order within this interval the markers AFLP candidates for the marking of the resistance 750 individuals F2 (IR64 x Gigante) were artificially inoculated with the RYMV virus (strain BF1). The symptomless plants were transplanted in the greenhouse either
  • Example 13 Anchoring the RYMV Resistance Locus Using Microsatellite Markers
  • the markers RM241, RM252, RM273 were mapped on an F2 population (IR64 x Gigante) evaluated in parallel for resistance to RYMV.
  • the results on 183 F2 individuals make it possible to characterize an interval of approximately 3.6 cM bounded by the two microsatellite loci RM 252 and RM273 flanking the gene for resistance to RYMV.
  • Example 14 Fine mapping of the interval carrying the resistance locus and ordering of the resistance markers in the interval M1-M2
  • the 45 resistant and recombinant F2 individuals (IR64 x Gigante) for the markers M1 and M2 were characterized for the microsatellite markers identified in example 13.
  • the mapping of the markers in segregation on all the available F2 individuals (IR64 x Gigante) (321) confirms the order and the distance between the markers of the interval M1 - M2 and in particular the interval RM252 - RM273 which is evaluated at 3.6 cM (FIG. 10 (b)).
  • the 45 resistant and recombinant F2 individuals (IR64 x Gigante) for the markers M1 and M2 make it possible to confirm the order of the AFLP markers identified in example 12.
  • AFLP EACG / MACA remains in the range RM252 - RM273 and represents the marker closest to the locus of resistance to RYMV (Table 9).
  • Table 9 the marker closest to the locus of resistance to RYMV.
  • Example 15 Transfer of resistance assisted by markers The markers close to the resistance locus were tested on irrigated varieties very sensitive to the RYMV virus (var. BG90-2, Bouakél89, Jaya).
  • 3 markers (Ml, RM241, RM252) show a polymorphism between these 3 varieties and the Gigante variety, which makes it possible to envisage the use of these markers to transfer resistance into sensitive genotypes.
  • the experimental transfer of resistance in these varieties was carried out up to the level of the 2nd crossover. At each crossing, the plants are checked for the presence of markers from the Gigante variety and segregation for resistance is checked by progeny tests on F2. The results are given in Table 10.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

L'invention vise un procédé pour l'identification de marqueurs du locus d'un gène majeur de résistance à RYMV. Ce procédé comprend l'amplification sélective de fragments d'AND de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragments ayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer des adaptateurs complémentaires d'amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides spécifiques, la séparation des produits d'amplification, la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges de fragments issus de descendants résistants et de descendants sensibles, avec les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du taux de recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance. Application notamment pour l'identification de phénotypes résistants et le transfert du gène de résistance à RYMV.

Description

Moyens pour l'identification du locus d'un gène majeur de la résistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications.
L'invention a pour objet des moyens, outils et procédés, pour l'identification du locus d'un gène majeur de résistance au virus de la panachure jaune du riz (en abrégé RYMV pour Rice Yellow Mottle Virus). Elle vise plus spécialement, en tant qu'outils, des marqueurs et des amorces PCR.
RYMV est un virus endémique en Afrique.Chez quelques rares variétés de l'espèce africaine de riz cultivé Orγza glaberrima, une résistance très élevée au RYMV a été identifiée. Mais comme les hybrides interspécifiques entre les deux espèces de riz cultivées sont extrêmement stériles, les recherches antérieures n'ont pas permis de décrire de bases génétiques, ni de mécanisme de cette résistance.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré qu'une variété dénommée Gigante, originaire du Mozambique et identifiée par l'ADRAO, de l'espèce asiatique de riz cultivé Orγza sativa, manifestait les mêmes caractéristiques que celles observées chez O. glaberrima. Les inventeurs ont caractérisé la résistance à RYMV en mettant en évidence qu'elle est liée à un gène majeur de résistance récessif et identique chez les deux sources de résistance considérée (O. Sativa et O. glaberrima).
Cette résistance intervient au niveau du mouvement de cellule à cellule et se traduit par un blocage du virus au niveau des cellules infectées alors que la réplication du virus est normale.
La migration du RYMV se fait sous forme d'un complexe nucléoprotéique associant acide nucléique viral, protéine de la capside et protéine du mouvement du virus. Dans les cellules des variétés sensibles, un facteur hôte, probablement une protéine, contribue également au déplacement du virus. Chez les variétés résistantes au contraire, une mutation de cette protéine ne permet plus l'association avec le virus et donc sa diffusion dans la plante.
Compte tenu de ces résultats, les inventeurs ont élaboré une méthode et des outils spécifiques pour caractériser le fragment de chromosome portant ce gène de résistance au RYMV qui code pour cette protéine permettant d'assurer le mouvement du virus dans la plante. L'invention a donc pour but de fournir un procédé pour l'identification des marqueurs moléculaires du locus de résistance au RYMV.
Elle vise également, en tant que tels, les fragments d'ADN tels que révélés par ce procédé, et utilisables en tant que marqueurs. L'invention vise en outre les applications de tels marqueurs, notamment pour définir d'autres marqueurs de haute spécificité vis-à-vis du locus de résistance et pour prédire un phénotype résistant.
L'invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences des amorces utilisées dans les techniques PCR mises en oeuvre. Conformément à l'invention, l'identification de marqueurs du locus d'un gène majeur de résistance à RYMV, comprend l'utilisation de marqueurs AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) et fait appel à la technique PCR.
Ce procédé d'identification est caractérisé en ce qu'il comprend : - l'amplification sélective de fragments d'ADN de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragments ayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer des adaptateurs complémentaires d'amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides spécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation, - la séparation des produits d'amplification, par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, et
- la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges de fragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avec les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie le cas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du taux de recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance.
Dans un mode de réalisation de l'invention, les fragments d'ADN sont obtenus par digestion des ADN génomiques de plantes résistantes d'une part, et de plantes sensibles d'autre part, et de leurs parents, à l'aide d'enzymes de restriction. Des enzymes de restriction qui se sont révélées appropriées comprennent EcoRI et Msel.
De courtes séquences nucléotidiques sont fixées aux fragments de digestion (adaptateurs) pour générer des extrémités franches auxquelles sont ensuite fixés des adaptateurs. Les amorces utilisées dans l'étape d'amplification sont complémentaires de ces adaptateurs avec, à leur extrémité 3', de 1 à 3 nucléotides qui peuvent être variables.
L'étape d'amplification est conduite avantageusement selon la technique PCR. Des profils d'amplification spécifiques sont obtenus avec des couples d'amorces possédant à leur extrémité, respectivement, des motifs AAC et CAG, ACC et CAG, ou encore AGC et CAG.
Les séquences correspondant aux adaptateurs EcoRI et Msel sont respectivement GAC TGC GTA CCA ATT C(SEQ ID N°l) et GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N° 2).
Les couples d'amorces mis en oeuvre pour l'amplification sont choisis parmi E- AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; et E-AGC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondent respectivement à SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2. D'autres couples sont donnés dans le tableau 6 dans les exemples.
L'étude comparative des profils d'amplification obtenus permet de révéler des bandes polymorphes spécifiquement présentes chez les variétés parentales sensibles et leurs descendants sensibles, comme exposé dans les exemples, et correspondant en conséquence à des marqueurs de résistance.
En particulier, la révélation sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes conduit à l'identification de 2 bandes marqueurs Ml et M2 respectivement de 510 pb et 140 pb.
Ces 2 bandes déterminent après l'analyse des données de ségrégation un segment chromosomique de 10 à 15 cM portant le locus de résistance et sont situées de part et d'autre de ce locus, à 5-10 cM.
Selon une disposition du procédé de l'invention, les bandes polymorphes identifiées en tant que marqueurs spécifiques du locus de la résistance au RYMV sont isolées à partir des gels. On opère avantageusement par excision des gels d'électrophorèse. Cette étape d'isolement est suivie d'une purification en procédant selon les techniques classiques. On dispose ainsi de fragments d'ADN. Selon une autre disposition de l'invention, lesdits fragments purifiés sont clones dans un vecteur approprié, tel qu'un plasmide, introduit dans des cellules hôtes, notamment des cellules bactériennes comme celles de E. coll.
Selon encore une autre disposition de l'invention, les fragments d'ADN purifiés et clones sont séquences.
Mettant à profit les séquences des inserts correspondant auxdits fragments d'ADN, l'invention fournit également un procédé d'obtention de marqueurs de grande spécificité vis-à-vis du locus d'un gène majeur de résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on définit des couples d'amorces PCR complémentaires d'une partie de la séquence du fragment d'ADN qui a été séquence, on'prβeède à une amplification spécifique de ce fragment à l'aide de ces couples d'amorces, puis on soumet les produits d'amplification à une migration sur gel d'électrophorèse.
Ces séquences d'ADN sont utilisables pour identifier un polymorphisme lié au locus de résistance dans une variété à étudier suivant différents procédés ainsi que décrit dans les exemples :
1) en identifiant directement un polymorphisme de taille de ces séquences d'ADN après amplification spécifique et séparation des fragments sur gel d'agarose,
2) en digérant les produits d'amplification par des enzymes de restriction pour séparer les produits de digestion sur gel d'agarose, 3) en utilisant ces séquences comme des sondes pour hybrider l'ADN de variétés de riz préalablement digérées par une enzyme de restriction et déterminer un polymorphisme de restriction.
L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les bandes AFLP polymorphes telles qu'identifiées par le procédé défini ci-dessus, à partir d'ADN de plantes de riz, et le cas échéant isolées, purifiées et séquencées.
Ces bandes AFLP sont caractérisées en ce qu'elles sont spécifiquement mises en évidence dans une variété sensible au RYMV (IR64) et dans la fraction de plantes sensibles issues du croisement de cette variété avec la variété résistance Gigante comme décrit dans les exemples. L'invention vise tout spécialement les séquences d'ADN correspondant à ces bandes polymorphes, et qui permettent de définir un segment du chromosome 4 de 10-15 cM portant le locus de résistance au RYMV.
Compte tenu de leur procédé d'obtention, les bandes AFLP correspondent à des fragments de restriction et en particulier, conformément à un mode de réalisation du procédé de l'invention, à des fragments EcoRI - Msel.
Des fragments de ce type sont appelés marqueurs Ml et M2 et sont caractérisés par une taille, respectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes. Ces fragments sont caractérisés en ce qu'ils correspondent à des séquences d'ADN flanquant le locus de résistance et situés de part et d'autre de ce dernier à 5-10 cM.
L'invention vise également des fragments clones dans des vecteurs tels que plasmides, ces vecteurs de clonage en tant que tels, caractéπsés par le fait qu'ils comportent de tels fragments, et les cellules hôtes transformées à l'aide de ces vecteurs, tels que des cellules bactériennes comme E. coli.
L'invention vise notamment la séquence d'ADN correspondant au fragment identifié comme marqueur Ml, et répondant à la séquence SEQ ID N° 3 suivante : CGTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAG CGAAGGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCG GATCGGAGGAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAA
GGGCAGATGAGGAGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGC AGATGCAAGATGGCTAGCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAG GGGCTTTCTTTGGGAGTATGCGCTCAGCATGGAACTGCGCGAAAGAAGTAGATTTCA GAGCAATGAAAGACAATCTGTTCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAAC GAGTTATGAATGAAGGTCCATGGACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAAT
ATGATGGCTGGTCCAAGATTGAAT
La séquence d'ADN du marqueur Ml présente une taille de 471 pb. L'invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences de nucléotides utilisées comme amorces d'amplification en PCR. De telles amorces comprennent les couples E-AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondent respectivement à SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2.
D'autres amorces encore sont complémentaires de séquences identifiées dans la séquence du fragment appelé marqueur Ml. Il s'agit en particulier de séquences (5', 3') choisies parmi :
AGGAAGGGGAACACAACAGCC (21 pb) (SEQ ID N° 4) TTATGCTGGAGGGGCTTGACC (21 pb) (SEQ ID N° 5) GCAGTTCCATGCTGAGCGCAT (21 pb) (SEQ ID N° 6) CCGAACATCCTCGAAAGGTCC (21 pb) (SEQ ID N° 7)
TCATATTCTGCGAGGAGCACC (21 pb) (SEQ ID N° 8)
L'invention vise également la séquence d'ADN correspondant au fragment identifié comme marqueur M2 et répondant à la séquence SEQ ID N°9 AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTA GCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCCATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTG
GCCTTAGGTT TGCCTCTGTTA
La taille de M2 est de 120 pb.
Des amorces spécifiques complémentaires des séquences identifiées dans la séquence de M2 ont été définies. De telles séquences répondent aux enchaînements suivants (5', 3') :
SEQ ID N°10
AACCTAAGGCCACCTCCAAT SEQ ID N°11
GCAAACCTAAGGCCACCTC SEQ ID N°12
ATTCACCCCATGCCCTAAG
Selon encore un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des séquences d'ADN obtenues avec les amorces ci-dessus pour définir des polymorphismes permettant l'identification de phenotypes résistants. L'invention concerne également un procédé d'identification de la séquence d'ADN portant le gène majeur de la résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé par le criblage d'une banque constituée de fragments d'ADN de 100 à 150 kb de la variété IR64 ou autre, tel que la banque BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), clones dans des bactéries, pour sélectionner le ou les clones de la banque renfermant les marqueurs définis ci-dessus et le gène de résistance au RYMV. Une telle banque BAC est disponible auprès de l'IRRI.
L'existence de sites de restriction différents sur la séquence correspondant au marqueur Ml et notamment les sites correspondant à Hpall/Mcpl permet d'identifier avantageusement les phenotypes résistants.
L'identification de sites de restriction différents sur la séquence correspondant au marqueur Ml permet de caractériser un polymorphisme qui peut être exploité avantageusement pour cartographier le marqueur Ml sur les cartes de liaison génétique du riz.
La cartographie de la séquence correspondant au marqueur Ml permet d'identifier une zone chromosomique sur le chromosome 4 du riz portant le locus de résistance au RYMV.
La cartographie du gène de résistance au RYMV sur le chromosome 4 de la carte génétique du riz permet d'identifier des marqueurs plus proches du locus de résistance. Il s'agit en particulier de marqueurs microsatellites RM252 et RM273 ou tout autre marqueur à l'intérieur de l'intervalle (4-5cM) défini par ces marqueurs permettant d'identifier un polymorphisme entre les parents IR64 et Gigante tel que les marqueurs RFLP issus de banques génomiques ou d'ADNc, les microsatellites, les marqueurs AFLP ou les marqueurs dérivés de la cartographie physique de la région comme les clones BAC, YAC ou leurs cosmides.
Les marqueurs identifiés conformément à l'invention ou tout autre marqueur situé dans cet intervalle permettant d'identifier un polymorphisme entre des variétés résistantes tel que
Gigante ou O. glaberrima avec des variétés de riz sensibles au RYMV peuvent être utilisés pour le transfert de la résistance au RYMV dans des variétés sensibles par recroisement successifs suivis de sélection assistée par marqueurs.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 10 qui concernent respectivement,
- la figure 1 : le clonage du marqueur Ml dans le plasmide PGEMTeasy. La digestion du plasmide montre un fragment d'ADN de 510 pb correspondant à la bande Ml ; - la figure 2 : l'amplification du marqueur Ml dans les quatre variétés de riz (Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681) en utilisant les couples d'amorces
2-4) : 291 pb ; (2-5) : 310 pb ; (1-3) : 288 pb ;
(1-4) :406 pb ; (1-5) : 425 pb ; (2-3). Le fragment Ml est légèrement plus grand chez Tog5681 que chez les autres variétés ;
- la figure 3 : l'identification de sites de restriction sur la séquence du marqueur M 1 chez les 4 variétés IR64, Azucena, Gigante et Tog5681 ;
- la figure 4 : la digestion du marqueur Ml avec l'enzyme Hpall après amplification PCR en utilisant les couples d'amorces (1-3), (1-4) et (1-5) sur les quatre variétés (Azucena, Gigante- IR64 et Tog5681). La présence d'un site de restriction Hpall dans les variétés
IR64 et Tog5681 libère un fragment de 86 pb qui réduit d'autant la taille du fragment amplifié ;
- la figure 5 : la caractérisation du marqueur Ml sur les plantes sensibles et résistantes de la descendance F2 (IR64 x Gigante). Les plantes F2 résistantes ont le profil du parent résistant (IR64-absence du site Hpall), à l'exception d'un seul recombinant, les plantes résistantes ont le profil du parent sensible (IR64-présence du site Hpall) à l'exception de deux recombinants ;
- la figure 6 : la ségrégation du marqueur Ml dans la population HD (IR64 x Azucena) : IR64-Azucena-30 individus HD (IR64 x Azucena);
- la figure 7 : la carte de liaison génétique du chromosome 4 du riz avec le positionnement du marqueur Ml et l'identification de l'intervalle dans lequel se trouve le locus de résistance ;
- la figure 8 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur des membranes portant l'ADN des 4 variétés (IR64, Azucena, Gigante et Tog5681) digérées par 6 enzymes de restriction Apal, Kpnl, PstI, Seal, HaelII. La variété Tog5681 présente un profil de restriction différent des autres variétés pour l'enzyme Seal qui peut être utilisée pour marquer le locus de résistance de cette variété ;
- la figure 9 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur des membranes portant l'ADN d'individus issus de recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog 5681 et digérés avec l'enzyme Seal. Cette descendance est en ségrégation pour la résistance au RYMV. Les individus sensibles (5) montrent tous la bande d'IR64 associée à la bande de Tog5681 (individus hétérozygotes). Les individus résistants (9) ne montrent que la bande de Tog5681 à l'exception d'un individu recombinant ; et
- la figure 10 : 1a cartographie et l'ancrage du locus de résistance élevée au RYMV sur la carte IR64 x Azucena. Exemple 1 : Identification des variétés sources de résistance
Les variétés utilisées dans l'étude de la résistance et en particulier les deux variétés résistantes Gigante et Tog5681 ont été caractérisées grâce à des marqueurs microsatellites sur un échantillonnage représentatif de loci.
Le polymorphisme se manifeste par le nombre de répétitions d'un court motif nucléotidique, le plus souvent binucléotidique qui est caractéristique d'une variété donnée.
Sur un ensemble de loci, les allèles répertoriés permettent de disposer des caractéristiques spécifiques de chaque variété.
La mise en évidence de ces marqueurs microsatellites s'effectue par l'amplification de l'ADN avec des amorces spécifiques déterminées par Chen et α/.(l), suivie d'une migration sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes suivant le protocole décrit par les mêmes auteurs.
Le tableau 1 donne les résultats à partir d'un système de référence établi par Chen et ai, ci-dessus suivant lequel les allèles sont identifiés par le nombre de répétitions du motif comparativement à la variété IR36 qui sert de témoin. Les deux variétés Gigante et Tog5681 sont ainsi décrites spécifiquement sur 15 loci vis-à-vis de toutes autres variétés (les marqueurs microsatellites sont donnés dans la 1ère colonne).
TABLEAU 1
Figure imgf000011_0001
Exemple 2 : Caractérisation de la résistance
La résistance a été caractérisée à partir de l'inoculation artificielle de jeunes plantules avec du virus comparativement à une variété témoin IR64 extrêmement sensible.
Le contenu en virus a été suivi pendant 60 jours après inoculation grâce à des tests ELISA sur les dernières feuilles émises.
Ces tests n'ont jamais pu mettre en évidence de signal significativement différent de plantes témoins non inoculées par le virus.
Une autre expérimentation a été réalisée en inoculant des protoplastes isolés des deux variétés Tog5681 et Gigante. Dans les deux cas, il possible de détecter la présence des protéines virales (protéine de la capside et protéine de mouvement PI), ainsi que l'accumulation d'ARN viral, qui témoignent de la capacité de ces protoplastes à multiplier le virus, et ceci de la même manière que les protoplastes de variétés sensibles comme IR64.
Ainsi, si on considère que la réplication, le mouvement de cellule à cellule, et le transport à longue distance à travers les vaisseaux, sont les trois étapes principales du déroulement du cycle infectieux dans la plante, la résistance de ces deux variétés réside le plus logiquement dans un blocage du virus au niveau des cellules infectées.
Exemple 3 : Génétique de la résistance
Différents croisements FI ont été réalisés entre la variété d'O. sativa résistante (Gigante), une variété ά'O. glaberrima résistante Tog5681 (également identifiée par l'ADRAO) et la variété de référence très sensible IR64 (sélectionnée à l'IRRI).
La culture du matériel végétal, les croisements et la production des descendances ont été réalisés dans les serres de l'IRD à Montpellier.
Les hybrides FI obtenus entre les variétés sensibles et résistantes ont été testés pour la résistance au virus du RYMV par test ELIS A et suivi des symptômes.
Ces hybrides F 1 se sont tous révélés aussi sensibles que le parent sensible et ont donc montré que la nature de la résistance était récessive.
En revanche, les hybrides entre les deux sources de résistance Gigante et Tog5681 n'ont donné que des hybrides FI résistants en faveur d'un seul et unique locus de résistance chez ces deux sources de résistance.
Ces résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-après.
Ce tableau donne la distribution des réponses ELISA (A 405 nm) dans les feuilles infectées par voie systémique des hybrides FI, des backcross et des descendants F2 obtenus à partir des backcross entre la variété IR64 sensible et les 2 cultivars résistants Gigante et Tog5681.
Figure imgf000013_0001
En ce qui concerne Gigante, l'hérédité de la résistance a été confirmée par un test de résistance sur 55 familles F3 du croisement (IR64 x Gigante). Les résultats sont donnés dans le tableau 3.
Ce tableau donne la ségrégation de la résistance à RYMV dans les descendances F3
(1R64 κ Gigante) . L'inoculation est effectuée 10 à 17 jours après la germination avec l'isolât du
Figure imgf000015_0001
Hurkina Faso et les syintômes sont suivis 45 jours après l'inoculation .
Tableau 3
Classes de Nombre de Nombre de plantes' | Fréquence des
i e i tance descendances Total Sensible Résistant plantes rés i stantes
.'Jenui ble 15 191 191 0 0 en ségrégation 30 343 262 01 0,24
«2 0,07 (3:1)
Rési stant 4 45 14 31 0,69
I ι PS rési tant 6 07 0 07 1
l<e s i s tant * 73 23 0,60 l i es rés ant * 56
» descendances F3 dérivées de plantes résistantes F2 analysées par tests RL1SΛ
L'examen de ce tableau montre que :
- 1/4 de plantes F2 ne donne que des plantes résistantes dans les descendances F3, et sont homozygotes pour la résistance
- 1/4 de plantes F2 ne donne que des plantes sensibles dans les descendances F3, et sont homozygotes pour la sensibilité
- 1/2 des plantes F2 sont en ségrégation pour la résistance et donnent des plantes sensibles et résistantes avec la même proportion (3: 1) dans les descendances F3.
L'ensemble des résultats s'accorde parfaitement avec un seul gène de résistance récessif présent chez les deux variétés Gigante et Tog5681.
Exemple 4 : Identification des marqueurs de résistance Ml et M2 selon le protocole AFLP a - Obtention de pools d'ADN
Les feuilles de 10 plantes sensibles et de 10 plantes résistantes issues d'une F2 (IR64 x Gigante) ont été prélevées pour extraire leur ADN.
Les ADN ont été ensuite mélangés de manière stoechiométrique pour constituer deux pools d'ADN correspondant respectivement à 10 plantes F2 sensibles ou résistantes avec une concentration finale du mélange de 50 ng/μl. Ces mélanges ont servi de base à l'identification de marqueurs de résistance par la méthode AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) pour polymorphisme de longueur de fragments amplifiés qui a été développée par Zabeau et al (4), et Vos et al.(5). Les produits utilisés se présentent sous forme d'un kit commercial (Gibco BRL) délivré par Keygene & Life Technologies.
b - Obtention de fragments de restriction 250 ng de chacun des pools d'ADN à 50 ng/μl et des parents sont digérés simultanément par deux enzymes de restriction (EcoRI et Msel). Réaction de digestion (25 μl) : 5 μl d'ADN (50 ng/ml) 0,2 μl (2 U) de EcoRI (10 U/μl) 0,2 μl (2 U) de Msel (5 U/μl) 5 μl de tampon T4 ligase 5X 14,5 μl de H2O.
La réaction de digestion s'effectue pendant deux heures à 37°C, puis 15 min. à 70°C pour inactiver les enzymes de restriction. Après digestion, il est procédé à une réaction de ligation.
Réaction de ligation (50 μl) :
25 μl du milieu réactionnel de double digestion 1 μl d'adaptateur EcoRI 1 μl d'adaptateur Msel 5 μl de tampon T4 Ligase 5X
1 μl l U) de ligase (10 U/μl) 17 μl H2O.
La réaction de ligation s'effectue à 37°C, pendant 3 heures, suivie d'une inactivation de l'enzyme à 60°C pendant 10 min. c - Amplification
L'amplification proprement dite a été réalisée en deux étapes : préamplification et amplification spécifique.
Cl - Réaction de pré amplification (50 μl)
5 μl du milieu réactionnel renfermant l'ADN digéré et fixé aux adaptateurs, dilué au 1/10
0,5 μl d'amorce EcoRI (150 ng/μl) 0,5 μl d'amorce Msel (150 ng/μl) 2 μl de mélange de nucléotides 5 mM 5 μl de tampon 10 X, Promega 5 μl de MgCl2 25 mM
0,2 μl (1 U) de Taq polymérase (5 U/μl) 31,8 μl de H2O.
Les caractéristiques de la pré-amplification par PCR sont les suivantes : 0 cycles avec dénaturation : 30 sec à 94°C hybridation : 30 sec à 56°C élongation : 1 min à 72°C L'amplification sélective se fait à partir d'un aliquote de la première amplification diluée au 1/30 en utilisant des amorces ayant 3 nucléotides sélectifs à l'extrémité 3', et en marquant l'une des amorces pour révéler les bandes sur un film autoradiographique. On utilise les couples d'amorces suivants : E-AAC/M-CAG
E-ACC/M-CAG E-AGC/M-CAG, dans lesquels E répond à la séquence GAC TGC GTA CCA ATT C (SEQ ID N° 1 ), et
M à la séquence GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N° 2).
La température d'hybridation est diminuée de 0,7°C par cycle, pendant les 1 1 cycles suivants : 20 derniers cycles dénaturation : 30 sec à 90°C hybridation : 30 sec à 56°C élongation : 1 min à 72°C On procède au marquage de l'amorce EcoRI (ramené à un tube de O,5 μl) : 0, 18 μl de l'amorce EcoRI (5ng) 0, 1 μl de γ33P ATP ( 10 mCu/μl)
0,05 μl de tampon kinase 10 X 0,02 μl (0,2U) de T4 polymérase kinase (lOU/μl) 0,15 μl de H20.
La réaction de marquage se fait à 37°C pendant 1 heure et est arrêtée par 10 minutes à 70°C.
C2 - Réaction d'amplification spécifique (20 μl) : 0,5 μl d'amorce EcoRI marquée
5 μl du milieu réactionnel de pré-amplification, dilué au 1/30, 0,3 μl d'amorce Msel (100 ng/μl) 0,8 μl de mélange de nucléotides 5 mM 2 μl de tampon 10 X Promega 2 μl de MgCl2 25 mM 0,1 μl (0,5 U) de Taq polymérase (5 U/μl) 9,3 μl de H20. Les caractéristiques de l'amplification sont les suivantes :
32 cycles avec . pour le premier cycle : dénaturation : 30 sec à 94°C hybridation : 30 sec à 65°C élongation : 1 min à 72°C
. les 1 1 cycles suivants : les mêmes conditions que précédemment, avec diminution à chaque cycle de 0,7°C de la température d'hybridation ; et pour . les 20 derniers cycles : dénaturation : 30 sec à 90°C hybridation : 30 sec à 56°C élongation : 1 min à 72°C d - Electrophorèse et Autoradiographie
A la fin de la réaction d'amplification, 20 μl de tampon de charge sont ajoutés
(98 % de formamide, 0,005 % de xylène cyanol et 0,005 % de bleu de bromophénol). Les produits d'amplification sont séparés par electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant
(6 % d'acrylamide, 8 M d'urée) avec un tampon de migration TBE (Tris 18 mM, EDTA 0,4 mM, acide borique 18 mM, pH 8,0) pendant 3 heures de migration à puissance de 50 watts. Après migration, le gel est fixé dans une solution IV d'acide acétique/2V d'éthanol absolu pendant
20 minutes. Le gel est transféré sur un papier Wattman 3M et séché pendant 45 minutes à 80°C avec un sécheur de gel. Le gel est placé dans une cassette avec un film ultrasensible.
L'autoradiographie est révélée après deux jours d'exposition. La comparaison des profils obtenus chez les parents et les pools de plantes sensibles ou résistantes permet d'identifier des bandes présentes dans l'un des pools, mais absentes dans l'autre. Ces bandes candidates au marquage de la résistance sont ensuite vérifiées individuellement sur chacune des plantes composant les pools d'ADN. e - Résultats
L'étude des résultats obtenus montre que les deux marqueurs appelés Ml et M2 sont présents chez le parent sensible (IR64) ainsi que dans toutes les plantes F2 (IR64 x Gigante) composant le pool de plantes sensibles, alors que cette bande est absente chez le parent résistant (Gigante) et qu'un seul individu du pool résistant manifeste cette bande. Le même type de variation est observé dans le recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. Les autres marqueurs identifiés dans cette analyse (M3 à M6) montrent aussi la même variation:
- présence des bandes chez le parent sensible et le pool des plantes sensibles F2 (IR64 x Gigante) ainsi que les plantes sensibles du recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. - absence de bande chez les parents résistants Gigante et Tog5681, chez le pool des plantes résistantes F2 (IR64 x Gigante) et chez les plantes résistantes du recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681.
Les données de ségrégation entre les marqueurs AFLP Ml à M6 et le locus de résistance pour les pools F2 (IR64 x Gigante) et le backcross interspécifique (IR64 x Tog5681) x Tog5681 sont résumées dans les tableaux 4 et 5. L'analyse des données de ségrégation et des rares recombinants observés dans les deux croisements permet d'évaluer les taux de recombinaison entre ces différents marqueurs et le locus de résistance. En particulier, les marqueurs Ml d'une part et les marqueurs M2 à M6 d'autre part déterminent un segment inférieur à 10-15 cM portant le locus de résistance. Ml et M2 sont ainsi à moins de 5-10 cM et placés de part et d'autre de ce locus.
TABLEAU 4
Résistance/Marqueur Ml Nombre d'individus observes
Phénotype Résistant Sensible
Génotype résistance RYMV tt/gg tt gg It It It It Marqueur AFLP -/- +/- +/ -/- +/- -/- +/
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 10 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 Backcross interspécifique Tog5681 1 1
Résistance/Marqueur M2,M3,M4,M6 Nombres d'individus observes
Phénotype Résistant Sensible
Génotype résistance RYMV tt/gg tt gg it It II Marqueur AFLP -/- +/- +/ -/- +/- -/- +/
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 1 1 0 - Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 10 2 - 0 8
Résistance/Marqueur M5 Nombre d'individus observés
Phénotype Résistant Sensible
Génotype resistace RYMV tt/gg tt gg it It II Marqueur AFLP -/ +/- +/ -/- +/- -/- +/
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 11 0 - Pool F2 sensible (IR64 x gigante) - - 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 9 3 - 0 8 TABLEAU 5
Marqueur Ml /Marqueurs M2,M3,M4,M6 Nombre d'individus observés
Génotype M 1 -/* +/* -/- -/-
Génotype M2,M3,M4,M6 +/* -/- +/* -/-
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 1 0 10 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 11 2 2 1 1
Marqueur Ml /Marqueur .M5 Nombres d'individus observés
Génotype Ml -/* +/* -/- -/- Génotype M5 +/* -/- +/* -/-
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 1 0 10 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 1 1 2 3 10
Marqueur M5/Marqueurs M2,M3,M4,M6 Nombre d'individus observés
Génotype M5 +/* +/* -/- -/-
Génotype M2,M3,M4,M6 +/* -/- +/* -/-
Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 0 0 11 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 13 1 0 12
: (-) backcross interspécifique Tog5681.(+ ou-) pool F2
Exemple 5 : Isolement du marqueur Ml
Une nouvelle amplification, avec le même couple d'amorces, a été réalisée, suivie d'une migration sur gel de polyacrylamide dans les mêmes conditions que celles énoncées ci- dessus. La révélation a été faite par une coloration au nitrate d'argent, avec le kit silver staining (Promega), pour visualiser directement les bandes sur le gel. Après révélation, la bande Ml a été excisée du gel, puis l'ADN a été élue dans 50 μl d'eau à 4°C pendant une nuit.
Un aliquot de 5 μl a été prélevé et réamplifié avec les mêmes couples d'amorces avec un marquage au p33.
Le produit d'amplification a été séparé à nouveau sur gel d'acrylamide dénaturant à 6%, et comparé-aux- parents et aux pools sensibles et résistants. La piste correspondant à ce produit d'amplification montre une seule bande de 510 pb migrant exactement au même niveau que la bande d'origine qui avait été excisée. Un autre aliquot de 5 μl a été également amplifié avec les mêmes amorces et a été séparé sur gel d'agarose à 1,8%. La bande correspondant à la taille attendue (510pb) a été à nouveau excisée et purifiée avec un kit gène clean (Promega).
Exemple 6 : Clonage et séquençage du marqueur Ml . clonage
3 μl du produit de purification ont été utilisés pour une réaction de clonage pendant une nuit à 37°C. 3 μl de produit de purification
1 μl de vecteur PGEMTeasy 1 μl de T4 Tampon ligase 10 X 1 μl de T4 DNA Ligase 4 μl de H2O La transformation a été réalisée avec la souche E. Coli JM109 en ajoutant 5 μl du produit de clonage à 100 μl de cellules compétentes de E. Coli JM109. Une préculture a été réalisée sur milieu de culture LB pendant 1 heure, à 37 °C. Ensuite les bactéries ont été étalées sur boîte de Pétri contenant de l'agar à 1/1000 d'ampicilline. 50 μl d'IPTG-XGal sont ajoutés juste avant l'étalement des bactéries pour sélectionner les bactéries transformées. Une colonie blanche (transformée) a été sélectionnée et remise en culture dans les mêmes conditions (Agar plus ampicilline). A partir de cette culture, une mini-préparation d'ADN plasmidique a été réalisée avec le kit Wizard plus (Promega). L'ADN plasmidique contenant l'insert a été digéré avec l'enzyme EcoRI pour vérifier la présence du marqueur Ml . Un gel d'agarose à 1,8% a permis de vérifier la présence de la bande de 3 kb correspondant au plasmide et de la bande de 510 pb corespondant au marqueur Ml (photo 1).
. Séquençage
La séquence de l'insert (SEQ ID N° 3) est la suivante (5', 3') : SEQ ID N° 3
20 30 40 50 60 70 GTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAGC
GAAGGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCGG ATCGGAGGAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAAG GGCAGATGAGGAGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGCA GATGCAAGATGGCTAGCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAGG GGCTTTCTTTGGGAGTATGCGCTCAGCATGGAACTGCGCGAAAGAAGTAGATTTCAG
AGCAATGAAAGACAATCTGTTCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAACG AGTTATGAATGAAGGTCCATGGACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAATA TGATGGCTGGTCCAAGATTGAAT
Les séquences correspondant aux amorces utilisées pour les amplifications AFLP ont été retrouvées et montrent que la bande correspond à un fragment de restriction (EcoRI -
Msel).
En déduisant les séquences correspondant aux amorces, la taille réelle du fragment d'ADN de riz clone est de 471 pb.
L'utilisation des différents couples d'amorces (1-3), (1-4), (1-5) d'une part et (2-3), (2-4), (2-5) d'autre part permet de valider le clonage de la bande AFLP Ml. L'amplification de l'ADN des variétés utilisées dans les croisements avec ces amorces ne montre qu'une seule bande. Le fragment correspondant à la variété Tog56581 est un peu plus important que celui des autres variétés (fig. 2).
Exemple 7 : Transformation de la séquence M 1 en marqueur polymorphe Un polymorphisme pour le marqueur Ml a été déterminé entre les parents de la population haploïde doublée (IR64 x Azucena). Cette population compte plus de 300 marqueurs répartis sur les 12 chromosomes du riz. Pour cela, on s'est appuyé sur les sites de restriction de la séquence du marqueur Ml déterminée sur le parent IR64 (fig. 3). Les amorces (1-3), (1-4) et (1- 5) ont été utilisés pour amplifier l'ADN des parents des croisements qui a ensuite été digéré par des enzymes de restriction. Le site de restriction Hpall/Mspl libère un fragment de 86 pb lorsque l'amorce 1 est utilisée. Ce site est absent chez les variétés Gigante et Azucena. (fig. 4).
Le marqueur a été testé sur les individus F2 du pool sensible et du pool résistant du croisement (IR64 x Gigante). Tous les individus résistants ont le profil de la variété Gigante (absence du marqueur AFLP Ml associée à l'absence du site de restriction Hpall/Mspl) à l'exception de l'individu (5.11). Les individus sensibles présentent le site de restriction Hpall/Mspl à l'état homozygote comme la variété IR64 à l'exception de deux individus hétérozygotes qui sont recombinés (fig. 5).
La séquence du marqueur Ml que l'on peut amplifier par des amorces spécifiques correspond bien au marqueur AFLP Ml. La digestion par l'enzyme Hpall/Mspl permet de distinguer l'allèle venant du parent sensible (IR64) du parent résistant (Gigante).
Ces nouvelles données permettent de conforter la position du locus de résistance entre les marqueurs Ml et M2 et d'estimer les taux de recombinaison à 0,065 ± 0,045 pour la distance entre Ml et le locus de résistance et 0,1 1 ± 0,047 pour la distance entre les marqueurs Ml et M2.
Exemple 8 : Cartographie du marqueur Ml
Soixante individus de la population (IR 64 x Azucena) ont été passés pour le marqueur Ml : amplification avec les amorces (1-3) et digestion par l'enzyme Hpall/Mspl, suivie d'une séparation des fragments sur un gel d'agarose à 2,5 %. La ségrégation du marqueur Ml est sans distorsion (fig. 6). Les résultats permettent de cartographier le marqueur Ml en utilisant un logiciel de cartographie (Mapmaker V3), qui permet de placer le marqueur Ml sur le chromosome 4 entre les marqueurs RG 163 et RG 214 (fig. 7). Cet intervalle représente la zone où se situe le locus de résistance au RYMV.
Exemple 9 : Marquage du locus de résistance de la variété Tog5681 La présence du site de restriction Hpall/Mspl dans la variété Tog5681 ne permet pas d'utiliser la stratégie de l'exemple 8 pour vérifier que le marqueur Ml est aussi un marqueur de la résistance provenant de Tog5681. Aussi, les 4 variétés Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681 ont été digérées avec 12 enzymes de restriction (BamHI, Bg/II, Dral, EcoRI, EcoRV, HindIII, Apal, Kpnl, PstI, Seal, Xbal, HaelII) pour identifier un polymorphisme de restriction en utilisant la séquence d'ADN du marqueur Ml comme sonde. L'enzyme Seal permet d'identifier un polymorphisme entre IR64 et Tog5681 (fig. 8). Ce polymorphisme a été utilisé pour valider le marqueur Ml sur un recroisement (IR64 x Tog5681) x IR64 en ségrégation pour la résistance. 5 individus sensibles de ce recroisement ont été testés et montrent tous la bande caractéristique d'IR64. Les 9 individus résistants ne montrent que la bande de Tog5681 à l'exception d'un seul qui est recombinant (fig. 9). Le polymorphisme de restriction mis en évidence par l'enzyme Seal en utilisant le marqueur Ml comme sonde est donc bien lié au locus de résistance de Tog5681. L'analyse génétique et l'idendification de marqueurs de résistance sont cohérentes pour considérer que le marqueur Ml cartographie bien le même locus de résistance chez les deux variétés Gigante et Tog5681.
Exemple 10 : Clonage et séquençage du marqueur M2 en marqueur PCR-spécifique
La bande AFLP obtenue avec le couple d'amorces E-ACC/M-CAG et correspondant à la bande M2 visible chez le parent sensible (IR64) et présente chez tous les individus composant le pool sensible a été clonée suivant le même protocole que pour le marqueur Ml . La séquence correspondant à cette bande a été déterminée et 3 amorces ont été définies (1 forward - 2 reverse) pour permettre la transformation de ce marqueur en marqueur PCR-spécifique.
Séquence du marqueur M2 (120pb) (SEQ ID N°9) :
AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTA GCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCCATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTG
GCCTTAGGTT TGCCTCTGTTA
Amorces :
(SEQ ID N°10) : AACCTAAGGCCACCTCCAAT (droite) (SEQ ID N°11) : GCAAACCTAAGGCCACCTC (droite) (SEQ ID N°12) : ATTCACCCCATGCCCTAAG (gauche)
Les conditions suivantes sont utilisées pour amplifier simultanément les marqueurs Ml et M2
- tampon 10X Promega 1,5 μl
- MgCl2 Promega 1 ,5 μl - dNTP (5 mM) 0,6 μl
- amorce Ml-1 (10 μM) 0,15 μl - amorce M 1-4 (10 mM) 0,15 μl
- amorce M2-1 (10 mM) 0,15 μl
- amorce M2-2 ( 10 mM) 0, 15 μl - HsO 7,74 μl
- Taq Polymérase 0,06 μl
- ADN (5 ng/μl) 3 μl
Programme PCR - 5mn à 94°C
- lmn à 94°C
- 30 s à 59°C - l ran à 72°C
- 35 cycles - 5 mn à 72°C
- 10 mn à 4°C
Le marqueur M2 peut être amplifié seul avec une température d'hybridation de 60.5°C, les autres paramètres restant inchangés. Dans ces conditions d'amplification, le marqueur M2 apparaît comme un marqueur dominant se caractérisant par une présence de bande chez le parent sensible (IR64) et absence de bande chez le parent (Gigante).
Exemple 11 : Création d'une population de plantes résistantes recombinantes entre les marqueurs Ml et M2 pour ordonner à l'intérieur de cet intervalle les marqueurs AFLP candidats au marquage de la résistance 750 individus F2 (IR64 x Gigante) ont été inoculés artificiellement avec le virus RYMV (souche BF1). Les plantes sans symptômes ont été repiquées en serre soit
188 individus. Par la suite, des tests complémentaires basés sur des tests Elisa et des tests de descendances ont permis d'éliminer une dernière fraction de 50 plantes sensibles. Les 138 plantes restantes et homozygotes pour la résistance ont été systématiquement génotypées pour les deux marqueurs Ml et M2 comme précédemment définis. 45 individus ont été ainsi sélectionnés (38 recombinants par rapport à Ml ; 7 recombinants par rapport à M2) et 2 doubles recombinants. Ces individus recombinants ont servi à l 'ordonnancement des marqueurs AFLP dans l'intervalle entre Ml et M2. Ces résultats sont résumés dans le tableau 6 suivant :
TABLEAU 6 Sélection d'une sous-population F2 (IR64 x Gigante) recombinante dans l'intervalle des marqueurs M1-M2
Nombre %
Etapes réalisées F2 (IR64 x Gigante) de plantes
Inoculation des plantes F2 (10 jours après semis) 768
Transplantation en serre (5 semaines après inoculation) 1 38
Elimination de plantes sensibles 5 0 (suivi des symptômes - Test Elisa et Test de descendance)
Sélection de plantes résistantes homozygotes pour le gène de résistance élevée 1 38 1 7 ,9 Géπotypage des individus sélectionnés pour les marqueurs M1 et M2
Plantes recombiπées par rapport à M 1 35 1 8 , 8 plantes recombinées par rapport à M1 et M2 2 1 ,4
Plantes recombinées par rapport à 2 7 5 , 1
Exemple 12 : Criblage de marqueurs AFLP pour sélectionner de nouveaux marqueurs candidats à la résistance
Un total de 328 couples d'amorces EcoRI/Msel, chacun défini par 3 nucléotides, a été utilisé suivant le protocole précédemment défini. Ces amorces sont données dans le tableau 7 ci- après. TABLEAU 7
N°de Amorce Amorce N°de Amorce Amorce N°de Amorce Amorce combinaisα π EαoRI Msel combinaison EcoRI Msel combinaison EcoRI Msel
1 AAC CAA 55 ACA CTG 109 ACG AGG
2 AAC CAC 56 ACA CTT 110 ACG AGT
5* AAC CAG , 57 ACA AAC 111 ACT CAA
4 AAC CAT 53 ACA AAG 112 ACT CAC
5 AAC CCA 59 ACA AAT 113 ACT CAG
S AAC CCT 50 ACA ACA 114 ACT CAT
7 AAC CGA 51 ACA ACC 115 ACT CCA
3 AAC CGT 62 ACA ACG 116 ACT CCT
9 AAC CTA 63 ACA ACT 117 ACT CGA
10 AAC CTC 64 ACA AGC 118 ACT CGT
11 AAC CTG 65 ACA AGG 119 ACT CTA
12 AAC CTT 66 ACA AGT 120 ACT C C
13 AAC AAC 67 ACC CAA 121 ACT CTG
14 AAC AAG 63 ACC CAC 122 ACT CTT
15 AAC. AAT ~~ g- ~~ ~~~ÂB ?a 123 ACT AAC
1 S AAC ACA 70 ACC CAT 124 ACT AAG
17 AAC ACC 71 ACC CCA 125 ACT AAT
13 AAC ACG 72 ACC CCT 126 ACT ACA
19 AAC ACT 73 ACC CGA 127 ACT ACC
20 AAC AGC 74 ACC CGT 123 ACT ACG
21 AAC AGG 75 ACC CTA 129 ACT ACT
22 AAC AGT 76 ACC CTC 130 ACT AGC
23 AAG CAA 77 ** ACC CB3 131 ACT AGG
24 AAG CAC 78 ACC CTT 132 ACT AGT
25 AAG CAG 79 ACC AAC 133 AGA CAA
25 AAG CAT 80 ACC AAG 134 AGA CAC
27 AAG CCA ^31 ** ..-& - ÀAT. 135 AGA CAG
23 AAG CCT 82 ACC ACA 136 AGA CAT
29 AAG CGA 83 ACC ACC 137 AGA CCA
30 AAG CGT 34 ACC ACG 133 AGA CCT
31 AAG CTA 35 ACC ACT 139 AGA CGA
32 AAG CTC as - r*Λr ACC 140 AGA CGT
33 AAG CTG 37 ACC AGG 141 AGA CTA
34 AAG CTT 33 ACC AGT 142 AGA CTC
35 AAG AAC 89 ACG CAA 143 AGA CTG
36 AAG AAG 90 ACG CAC 144 AGA CTT
37 AAG AAT " ..Si " >C& .. CAG 145 AGA AAC
33 AAG ACA 92 ACG CAT 143 AGA AAG
39 AAG ACC 93 ACG CCA 147 AGA AAT
40 AAG ACG 94 ACG CCT 143 AGA ACA
41 AAG ACT 95 ACG CGA 149 AGA ACC
42 AAG AGC 96 ACG CGT 150 AGA ACG
43 AAG AGG 97 ACG CTA 151 AGA ACT
44 AAG AGT 98 ACG CTC 152 AGA AGC
45 ACA CAA 99 ACG CTG 153 AGA AGG
46 ACA CAC 100 ACG CTT 1S4 "* . "ASA AGT
47 ACA CAG 101 ACG AAC 155 AGC CAA
43 ACA CAT 102 ACG AAG 156 AGC CAC
49 ACA CCA 103 ACG AAT Î57 *" ASC C S
50 ACA CCT 104 * ΛOS. ACA 158 AGC CAT
51 ACA CGA 105 ACG ACC 159 AGC CCA
52 ACA CGT 106 ACG ACG 160 AGC CCT
53 ACA CTA 107 ACG ACT 161 AGC CGA
54 ACA CTC 108 ACG AGC 162 AGC CGT ombre polymorphisme pour une ou plusieurs bandes entre les pools sersicle et r sistant ' présence une ou plusieurs bandes polymorphes dans le pool sensible présence une ou plusieurs bandes polymorphes dans le pool résistant "* présence dune ou plusieurs bandes polymorphes dans le pool sensipie et le pool résistant TABLEAU 7 suite
N°de Amorce Amorce N°de Amorce Amorce N°de Amorce A orce ccπoinaisoπ EcoRI Msel cαrriDinaisoπ EcoRI Msel cc-ιoιπaιsoπ EcoRI Msel
163 AGC CTA 213 AGT AGC 273 CAT CTA
! 164 AGC CTC 219 AGT AGG 274 CAT CTC j 165 AGC CTG 220- * „" A5T. ' ACT 275 CAT CTG
166 AGC CTT 221 ATC CAA 276 CAT CTT
167 AGC AAC 222 ATC CAC 277 CAT AAC
163 AGC AAG 223 ATC CAG 273 CAT AAG
159 AGC AAT 224 ATC CAT 279 CAT AAT
1 0 AGC ACA 225 ATC CCA 2βa- CAT ACA
171 AGC ACC 225 ATC ce- 231 CAT ACC
172 AGC ACG 227 ATC CGA 232 CAT ACG
! 173 AGC ACT 228 ATC CGT 233 CAT ACT
; IT "'•" " AGÇ AGC" ' 229 ATC CTA 234 CAT AGC
: 17S — AGC AGG 230 ATC CTC 285 CAT AGG
1 3 AGC AGT 231 ATC CTG 286 CAT AGT
177 AGG CAA 232 ATC CTT ,257 ' „ CT - ~CAA™"
178 AGG CAC 233 ""• ATC AAC 283 CTA CAC
179 AGG CAG 234 -"' ATC AAC 289 CTA CAG
180 AGG CAT 235T* ,ATC , '"AAT 290 CTA CAT
131 AGG CCA 236 ATC ACA . 2St ' CTA CCA
182 AGG CCT 237 ATC ACC 292 CTA CCT
183 AGG CGA 233 ATC ACG 293 CTA CGA
134 AGG CGT 239 ATC ACT 294 CTA CGT
185 AGG CTA 240 ATC AGC 295 CTA CTA
186 AGG CTC 241 ATC AGG 296 CTA CTC
187 AGG CTG 242 ATC AGT "" 237 '- CT CTG
183 AGG CTT 243 CAA CAA 293 CTA CTT
189 AGG AAC 244 CAA CAC 299 CTA AAC
190 AGG AAG 245 CAA CAG 300 CTA AAG
191 AGG AAT 245 CAA CAT 301 CTA AAT
192 AGG ACA 247 CAA CCA 302 CTA ACA
193 AGG ACC 243 CAA CCT 303 CTA ACC
134 AGG ACG 249 CAA CGA 304 CTA ACG
1S5 ~ AGG ACT 2S0 " CAA CGT 305 CTA ACT
195 AGG AGC 251 CAA CTA 306 CTA AGC
137 -• ' ÀGO AGG 252 CAA CTC 307 CTA AGG 98 AGG AGT , 253 CAA CTG^ 308 CTA AGT
199 AGT CAA 254..' _ AA_ ≈rV 309 CTT CAA
200 AGT CAC 255 CAA AAC 310 CTT CAC
201 AGT CAG 256 CAA AAG CTT CAG 202 AGT CAT ^CAA""™ " AAT ÇTT^sv , CAT
203 AGT CCA -255- •' , , &&.„.. , *CA 313 CTT CCA
204 AGT CCT 259 CAA ACC 314 CTT CCT
205 AGT CGA 260 CAA ACG 315 CTT CGA
205 AGT CGT 261 CAA ACT CTT CGT
207 AGT CTA 262 CAA AGC 317 CTT CTA
203 AGT CTC 253 CAA AGG 3.1& » cττ CTC
209 AGT CTG 264 CAA AGT 3.13 "* CTT CTG
210 AGT CTT 265 CAT CAA 320 CTT CTT
211 AGT AAC 256 CAT CAC 321 CTT AAC
—A!?... AGT AAG_ 267 CAT CAG 322 CTT AAG f 21.3 '" "AG "MT" 253 CAT CAT 323 CTT AAT
214 AGT ACA 269 CAT CCA 324 CTT ACA
: 215 "* AGT ACC 270 CAT CCT 325 CTT ACC
215 AGT ACG 271 CAT CGA 325 CTT ACG
21" AGT AC_ 272 ' CAT CGT • 32" CTT ACT
323 r AG- en ombre poiymorpnismβ pour une ou plusieurs oandes entre les pools sens cie et resis'art ' présence ne ou plusieurs oandes polymorphes dans le pool sensible présence G une ou plusieurs oandes polyr-Λπjnes ians le pool résistant Ce criblage a permis d'identifier une ou plusieurs bandes polymorphes selon leur apparition chez le parent sensible et ou le parent résistant. 23 couples d'amorces ont permis d'identifier un polymorphisme entre les parents confirmés par les pools d'ADN F2 sensible ou résistant.Le tableau récapitule et donne la position dans l'intervale M1-M2 des marqueurs AFLP liés au locus de résistance élevée au virus de la panachure jaune du riz..
TABLEAU 8
N- de Nucleottdes vaπaoles Présence de(sl aande(s) Position des marqueurs mbinaisc in Amorce EcoRI Amorce Msel pool sensible pool résistant sur l'intervalle M1-M2
3 AAC CAG = Marqueur clone 1
6 9 ACG CAG = Marqueur clone M2
77 ACC CTG non détermine
8 1 ACC AAT non détermine
86 ACC AGC non détermine
9 1 ACG CAG non détermine
1 04 ACG ACA entre R et Rm273
1 54 AGA AGT au delà de M2
1 57 AGC CAG en cosegregation avec M2
1 74 AGC AGC non détermine
1 75 AGC AGG entre M 1 et Rm241
1 97 AGG AGG entre M 1 et Rm241
2 1 5 AGT ACC non détermine
220 AGT AGT entre Rm273 et M2
233 ATC AAG entre M 1 et Rm241
250 CAA CGT non détermine
254 CAA CTT au delà de M2
258 CAA ACA entre M 1 et Rm241
280 CAT ACA au delà de M2
287 CTA CAA entre Rm273 et M2
291 CTA CCA entre 1 et Rm241
3 1 8 CTT CTC entre Rm273 et M2
3 1 9 CTT CTG non détermine
Après vérification individuelle sur chacun des individus composant les pools, les marqueurs candidats correspondant à des bandes présentes chez le parent IR64 peuvent être testées sur les recombinants identifiés dans l'exemple 11. 9 marqueurs ont été confirmés ainsi comme appartenant à l'intervalle Ml -M2. Le tableau 9 donne l'ordonnancement dans l'intervalle M1-M2 des marqueurs AFLP identifiés par comparaison de pools d'ADN sensible et résistant à partir d'une sous population résistante d'une F2 (IR64 x Gigante). TABLEAU 9
Individus résistants VJ1 EAGG c-ATC E-CAA EAGC ; E TA Resist. EACG ≡-AGT E-CTT E-CTA M2
F2 (1R64 x Gigante) -iGG M-AAG ; VI-ACA MAGG I M-CCA RW241 RVI252 RYMV -ACA RW273 y-AGT M-CTC vi-CAA
H D D 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 8
7 H 0 D 0 D 0 3 3 a 3 3 a 3 9
3 H 0 D D D D 3 3 3 3 B a 3 9
10 H D 0 0 ≡ 0 3 B 3 3 3 3 3 a
21 H 0 D 0 D 3 C 3 3 3 3 B 3 a a
23 H D 0 0 E 0 3 3 3 3 3 3 3 a
25 H D 0 D 0 0 E 7 S ' 3 3 3 3 3 3
23 H D D 0 3 S C 3 3 3 a 3 B 3 S
37 H D 0 0 s D = 6 a 3 3 3 3 3
43 H D 0 D 0 0 a 3 3 3 3 3 3 3
55 0 D 0 D 0 Ξ r* 3 3 S B a 3 3
51 4 D D D 0 0 = H 5.. 3 3 S B a 3
35 -H 0 D 0 a C 3 a 3 3 3 3 3 a
95 H c 0 D 0 3 C 3 3 3 3 3 B 3 a
103 H £ 0 0 3 C 3 3 3 B B 3 3 3
104 H D 0 0 3 3 C 3 3 3 3 S 3 3 3
109 H 3 3 3 3 3 C 3 3 3 3 3 3 3 B
111 H Ξ D D 0 D 3 3 3 3 3 3 3 a
119 H 0 D D D D 3 3 B 3 3 3 3 B
120 A 0 0 D 0 3 C 3 3 3 3 3 3 3 3
123 H B S B E D 3 3 3 3 B B 3 3
127 H 3 c 3 3 3 3 3 3 3 B
13' = Ξ ζ E 0 3 3 3 B a a 3 S
133 H 3 c B 3 3 3 3 3 3
141 H ç B £ ≈ D = 3 S 3 a B 3 8
154 H B B = Ξ 0 3 3 3 B 3 3 a 3
153 H B = ç E 0 3 3 3 3 3 3 3 S
159 H - 3 c 3 3 3 a 3 3 S
150 H B B c = D 3 3 S 3 3 3 3 3
151 H _ B E £ 0 3 3 3 3 3 3 3 3
153 H 3 c 3 3 3 3 3 3 3 3
157 H 3 a 3 3 3 3 3 B 3 3
171 H 3 3 3 3 3 3 B 3 3 3
175 H B = E D 0 3 3 3 3 3 3 S 3 3
173 H - 3 3 3 3 3 3 3 B 3 3 3
133 H Ξ B ≈ E 0 3 ^ 3 .2 3 ^3 3 3 3 3
35 H 0 0 D 0 D H A ' , ' % £>7 « ; 0 D 0 D
135 H B ç ε B D H .1 , -& ^ , 6 - 0 D 0 D
17 H B a 3 3 3 3 - ε C 0 D D D
20 S S a 3 B a 3 S 3 S H D 0 D D
33 B S 3 3 B a B & - 0 D D D
93 a B 3 3 3 3 3 3 S - , ε H D 0 D D
105 B B 3 3 3 3 a 3 S. , .<? ,„ H D D 3 0
145 3 - 3 3 3 S 3 a S B 3 3 D
130 S S 3 3 a 3 3 3 3 0 D 0 D rreαuence d individus reccπrjines'
Intervalle M1 - R 097 097 097 037 051 029 0 '3
Intervalle R - 2 057 073 089 039 039 Distance / résistance (CM) 11 4" 11 03 1 ' 03 11 03 933 S 90 3 33 00 333 339 444 444 444 50"
A gercr/pe Homozygote pour l'allele du parent sensible (IR64)
H génotype hétérozygote
3 génotype nomozygote pour I allele du parent résistant ( Gigante)
0 génotype non homozygote pour I allele du parent résistant (gigante)
' sous i hypothèse d apsence de douole recomomaisαπ dans I intervalle M1 - R et M2 - P
" distance estimée a partir de la cartographie de la résistance sur 133 F2 (IR54 x Giςarte) cf (figure X) 14 bandes provenant du parent résistant ont été également identifiées et seront confirmées ou non sur les recombinants générés dans la population F2 (IR64 x Gigante).
Exemple 13 : Ancrage du locus de résistance au RYMV à l'aide de marqueurs microsatellites
Le marqueur Ml ayant été placé sur le chromosome 4 de la carte génétique (IR64 x Azucena ; exemple 9), des marqueurs microsatellites tel que définis dans (6) et appartenant à ce chromosome ont été utilisés pour affiner la cartographie du locus de résistance au RYMV. Les marqueurs microsatellites suivants ont été testés : RM241, RM252 (1), RM273 et RM 177 (6) dans les conditions expérimentales définies dans (1) et (6). A l'exception du marqueur RM177 non polymorphe entre les parents IR64 et Gigante, les marqueurs RM241, RM252, RM273 ont été cartographiés sur une population F2 (IR64 x Gigante) évaluée parallèlement pour la résistance au RYMV. Les résultats sur 183 individus F2 permettent de caractériser un intervalle d'environ 3.6 cM borné par les deux locus microsatellites RM 252 et RM273 encadrant le gène de résistance au RYMV.(voir figure 10 (a))
Exemple 14 : Cartographie fine de l'intervalle portant le locus de résistance et ordonnancement des marqueurs de résistance dans l'intervalle M1-M2
Les 45 individus F2 (IR64 x Gigante) résistants et recombinants pour les marqueurs Ml et M2 ont été caractérisés pour les marqueurs microsatellites identifiés dans l'exemple 13. La cartographie des marqueurs en ségrégation sur la totalité des individus F2 (IR64 x Gigante) disponibles (321) confirme l'ordre et la distance entre les marqueurs de l'intervalle Ml - M2 et en particulier l'intervalle RM252 - RM273 qui est évalué à 3.6 cM (figure 10(b)). Les 45 individus F2 (IR64 x Gigante) résistants et recombinants pour les marqueurs Ml et M2 permettent de confirmer l'ordre des marqueurs AFLP identifiés dans l'exemple 12. Un marqueur
AFLP EACG/MACA reste compris dans l'intervalle RM252 - RM273 et représente le marqueur le plus proche du locus de résistance au RYMV (Tableau 9). Au total sur les 321 individus F2 testés, il reste 20 individus recombinés d'un côté ou de l'autre du locus de résistance au RYMN et qui pourront être avantageusement utilisés pour identifier des marqueurs plus proches et/ou cloner le gène de résistance. Exemple 15 : Transfert de la résistance assistée par les marqueurs Les marqueurs proches du locus de résistance ont été testés sur des variétés irriguées très sensibles au virus du RYMV (var. BG90-2, Bouakél89, Jaya). 3 marqueurs (Ml, RM241, RM252) présentent un polymorphisme entre ces 3 variétés et la variété Gigante ce qui permet d'envisager l'utilisation de ces marqueurs pour transférer la résistance dans des génotypes sensibles. Le transfert expérimental de la résistance dans ces variétés a été réalisé jusqu'au niveau du 2eme recroisement. A chaque croisement, les plantes sont vérifiées pour la présence des marqueurs en provenance de la variété Gigante et la ségrégation pour la résistance est contrôlée par des tests de descendance sur F2. Les résultats sont donnés dans le tableau 10.
TABLEAU 10
parent Polymorphisme / parent donneur (Gigante) Génération % théoπque Nb de lignées reçurent M1 RM241 RM252 RM273 RM177 obtenue parent reçurent obtenues
BG90-2 poly poly poly 3C2 2 37,5 4
Bouake 189 poly poly poly BC2F2 37,5 1
Jaya poly poly poly BC2F2 37,5 2
IR64 poly poly poly poly 3C3 93,7 5
Références bibliographiques
(1) Chen, X. et al., (1997), Development of a microsatellite framework map providing genome- wide coverage in rice (Orγza sativa L) Theor Appl Genêt 95 : 553-567. (2) Panaud, O. et al., (1996), Development of microsatellite markers and characterization of simple séquence length polymorphism (SSLP) in rice (Orγza sativa L) Mol Gen Genêt 252 : 597-607.
(3) Wu K.S. et al., (1993), Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Mol Gen Genêt 241 : 225-235. (4) Zabeau et al.,_(1993), Sélective restriction fragment amplification : a gênerai method for
DNA fingerprinting. EP 92402629.7.
(5) Vos et al., (1995), AFLP, a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407-4414.
(6) Temnyck et al (2000) Theor Appl Genêt 100 : 697-712

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé pour l'identification de marqueurs du locus d'un gène majeur de résistance à RYMV, caractérisé en ce qu'il comprend
- l'amplification sélective de fragments d'ADN de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragments ayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer des adaptateurs complémentaires d' amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides spécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation,
- la séparation des produits d'amplification, par electrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, et
- la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges de fragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avec les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie le cas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du taux de recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fragments d'ADN sont obtenus par digestion des ADN génomiques de plantes résistantes d'une part, et de plantes sensibles d'autre part, et de leurs parents, à l'aide d'enzymes de restriction.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise, comme enzymes de restriction, EcoRI et Msel.
4/ Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que les fragments de restriction sont soumis à une ligation pour fixer des adaptateurs.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les fragments obtenus sont amplifiés à l'aide de couples d'amorces complémentaires des adaptateurs dont les séquences sont respectivement GAC TGC GTA CCA ATT C(SEQ ID N° 1) et GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N°2). 6/ Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que les fragments obtenus sont amplifiés à l'aide de couples d'amorces possédant à leur extrémité, respectivement, des motifs AAC et CAG, ACC et CAG, ou encore AGC et CAG.
Il Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par l'identification de bandes marqueurs de résistance, Ml et M2, présentant respectivement des tailles de 510 pb et 140 pb, telles que déterminées en electrophorèse sur gel en conditions dénaturantes.
8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites bandes marqueurs déterminent un segment inférieur à 10-15 cM portant le locus de résistance. 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites bandes marqueurs sont situées de part et d'autre du locus et à moins de 5-10 cM.
10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'isolement des bandes marqueurs identifiées.
11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé par la purification des bandes marqueurs isolées afin de disposer de fragments d'ADN.
12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le clonage des bandes marqueurs dans un vecteur et l'introduction du vecteur dans une cellule hôte.
13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 1 ou 12, caractérisé par la récupération et le séquençage des fragments d'ADN purifiés, clones. 14/ Procédé d'obtention de marqueurs de grande spécificité vis-à-vis du locus d'un gène majeur de résistance au RYMV, caractérisé en ce qu'on définit des couples d'amorces PCR complémentaires de la séquence du fragment cloné, on procède à une amplification spécifique de ce fragment à l'aide de ces couples d'amorces, puis on soumet les produits d'amplification à une migration sur gel d'électrophorèse précédée ou non d'une digestion par enzyme de restriction pour identifier un polymorphisme.
15/ Bandes AFLP polymorphes telles qu'identifiées par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 à partir d'ADN de plantes de riz.
16/ Bandes AFLP selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles sont spécifiquement mises en évidence dans une variété sensible au RYMV, et dans la fraction de plantes sensibles issues du croisement de cette variété avec une variété résistante. 17/ Séquences d'ADN correspondant aux bandes polymorphes selon la revendication 15 ou 16, et qui permettent de définir un segment du chromosome 4 de 10-15 cM portant le locus de résistance au RYMV.
18/ Séquences d'ADN selon la revendication 17, caractérisées en ce qu'elles correspondent à des fragments EcoRI-Msel.
19/ Séquences d'ADN selon la revendication 18, caractérisées par une taille respectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes.
20/ Séquences d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisées en ce qu'elles correspondent à des séquences flanquant le locus de résistance et situées de part et d'autre de ce dernier à 5- 10 cM ou même à moins de 5 cM..
21/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle répond à SEQ ID N°3. 22/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle répond à SEQ ID N°9. 23/ Vecteurs de clonage, caractérisés en ce qu'ils comportent la séquence SEQ ID N°3 selon la revendication 21 ou la séquence SEQ ID N°9 selon la revendication 22. 24/ Cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par des vecteurs selon la revendication 22.
25/ Utilisation des bandes polymorphes selon la revendication 15 ou 16 ou des séquences d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 22 pour l'identification de phenotypes résistants et le transfert du gène de résistance. 26/ Fragments de 4-5 cM au plus de chromosome 4 et bandes AFLP polymorphes selon la revendication 15 ou 16 définissant un segment de 4-5cM ou inférieur portant le locus de résistance au RYMV.
27/ Utilisation de SEQ ID N°3 ou de SEQ ID N°9 ou de marqueurs microsatellites tels que RM252 et RM273 ou encore tout autre marqueur dans cet intervalle et manisfestant un polymoφhisme entre une variété sensible et une variété résistante pour transférer la résistance dans une variété sensible par sélection assistée par marqueur.
PCT/FR2000/001724 1999-06-21 2000-06-21 Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications WO2000079002A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001505345A JP2003502076A (ja) 1999-06-21 2000-06-21 イネ黄斑病ウイルス耐性主要遺伝子の遺伝子座同定用手段及びその応用
EP00949554A EP1185707A1 (fr) 1999-06-21 2000-06-21 Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications
AU62874/00A AU6287400A (en) 1999-06-21 2000-06-21 Means for identifying the locus of a major resistance gene with respect to the virus of the rice yellow mottle virus and uses thereof
APAP/P/2002/002391A AP2002002391A0 (en) 1999-06-21 2000-06-21 Means for identifying the locus of a major resistance gene with respect to the virus of the rice yellow mottle virus and uses thereof.
US10/023,476 US20030093830A1 (en) 1999-06-21 2001-12-20 Means for identifying the locus of a major resistance gene to the rice yellow mottle virus, and their applications

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR99/07834 1999-06-21
FR9907834A FR2795094B1 (fr) 1999-06-21 1999-06-21 Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000079002A1 true WO2000079002A1 (fr) 2000-12-28
WO2000079002A8 WO2000079002A8 (fr) 2001-06-21

Family

ID=9547055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2000/001724 WO2000079002A1 (fr) 1999-06-21 2000-06-21 Moyens pour l'identification du locus d'un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20030093830A1 (fr)
EP (1) EP1185707A1 (fr)
JP (1) JP2003502076A (fr)
AP (1) AP2002002391A0 (fr)
AU (1) AU6287400A (fr)
FR (1) FR2795094B1 (fr)
OA (1) OA11975A (fr)
WO (1) WO2000079002A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003033736A2 (fr) * 2001-10-17 2003-04-24 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Procedes de cartographie precise et d'application de marqueurs adn lies a un gene de resistance a la cecidomyie a galle utilises dans la selection du riz a l'aide de marqueurs
WO2005056833A1 (fr) * 2003-11-15 2005-06-23 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Marqueurs moleculaires pour le mappage et le marquage du gene gm8

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015103136A1 (fr) * 2013-12-30 2015-07-09 International Rice Research Institute Plants de riz à texture peu crayeuse et matériaux et méthodes associés
WO2020096782A1 (fr) * 2018-11-06 2020-05-14 Dowd Scot E Dosages universels ou à large plage et procédé de diagnostic spécifique d'échantillons à marqueurs multiples à l'aide d'un séquençage non optique

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997006259A2 (fr) * 1995-08-07 1997-02-20 Keygene N.V. Resistance aux champignons provoquant la fletrissure
WO1998030721A1 (fr) * 1997-01-10 1998-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Amplification et analyse genetiques sur la base d'une hybridation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997006259A2 (fr) * 1995-08-07 1997-02-20 Keygene N.V. Resistance aux champignons provoquant la fletrissure
WO1998030721A1 (fr) * 1997-01-10 1998-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Amplification et analyse genetiques sur la base d'une hybridation

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBAR, L. (1) ET AL: "Genetic basis and mapping of the resistance to rice yellow mottle virus: I. QTLs identification and relationship between resistance and plant morphology.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, (NOV., 1998) VOL. 97, NO. 7, PP. 1145-1154., XP000892947 *
CHEN, D.-H. (1) ET AL: "Molecular mapping of the blast resistance gene, Pi44(t), in a line derive from a durably resistant rice cultivar.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, (MAY, 1999) VOL. 98, NO. 6-7, PP. 1046-1053., XP000893042 *
DATABASE EMBL embl; 10 June 2000 (2000-06-10), WING ET AL: "A BAC end sequencing framework to sequence the rice genome", XP002149653 *
MAHESWARAN, M. ET AL: "Polymorphism, distribution, and segregation of AFLP markers in double haploid rice population.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, (1997) VOL. 94, NO. 1, PP. 39-45., XP000893041 *
PRESSOIR, G. ET AL: "Genetic basis and mapping of the resistance to rice yellow mottle virus: II. Evidence of a complementary epistasis between two QTLs.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, (NOV., 1998) VOL. 97, NO. 7, PP. 1155-1161., XP000892950 *
SUBUDHI, P. K. ET AL: "Classification of rice germplasm: III. High-resolution fingerprinting of cytoplasmic genetic male-sterile (CMS) lines with AFLP.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, (MAY, 1998) VOL. 96, NO. 6-7, PP. 941-949., XP000893043 *
VOS P ET AL: "AFLP: a new technique for DNA fingerprinting", NUCLEIC ACIDS RESEARCH,GB,OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, vol. 23, no. 21, 1995, pages 4407 - 4414-4414, XP002109691, ISSN: 0305-1048 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003033736A2 (fr) * 2001-10-17 2003-04-24 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Procedes de cartographie precise et d'application de marqueurs adn lies a un gene de resistance a la cecidomyie a galle utilises dans la selection du riz a l'aide de marqueurs
WO2003033736A3 (fr) * 2001-10-17 2003-09-18 Icgeb Procedes de cartographie precise et d'application de marqueurs adn lies a un gene de resistance a la cecidomyie a galle utilises dans la selection du riz a l'aide de marqueurs
WO2005056833A1 (fr) * 2003-11-15 2005-06-23 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Marqueurs moleculaires pour le mappage et le marquage du gene gm8

Also Published As

Publication number Publication date
AP2002002391A0 (en) 2002-03-31
EP1185707A1 (fr) 2002-03-13
FR2795094B1 (fr) 2003-08-22
FR2795094A1 (fr) 2000-12-22
OA11975A (fr) 2006-04-17
WO2000079002A8 (fr) 2001-06-21
AU6287400A (en) 2001-01-09
JP2003502076A (ja) 2003-01-21
US20030093830A1 (en) 2003-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rakoczy-Trojanowska et al. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants
EP2342337B1 (fr) Procédé pour le développement de marqueurs diagnostiques
Yan et al. Genotyping-by-sequencing application on diploid rose and a resulting high-density SNP-based consensus map
WO2019203942A1 (fr) Procédés d&#39;identification, de sélection et de production de riz résistant à la brûlure helminthosporienne bactérienne
Sajer et al. Development of sequence‐tagged site markers linked to the pillar growth type in peach (Prunus persica)
WO2000079002A1 (fr) Moyens pour l&#39;identification du locus d&#39;un gene majeur de la resistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications
CN106701895B (zh) 与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记
CN1314782A (zh) 针对马铃薯中抗病性的种质与分子标记
CA2882160A1 (fr) Marqueurs moleculaires et criblage phenotypique pour la tolerance au metribuzine dans le soja
Adachi Development of the SCAR markers linked to the Sh gene in buck-wheat
EP1185708B1 (fr) Moyens pour l&#39;identification d&#39;une nouvelle classe de genes de resistance au virus de la panachure jaune du riz et du locus d&#39;un gene majeur de la resistance au virus, et leurs applications
US9725773B2 (en) Molecular markers associated with green snap in maize
Truong et al. Conversion of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker UBC# 116 linked to Fusarium crown and root rot resistance gene (Frl) into a co-dominant sequence characterized amplified region (SCAR) marker for marker-assisted selection of tomato
AU2014318042A1 (en) Molecular markers for blackleg resistance gene Rlm4 in Brassica napus and methods of using the same
CN113502347B (zh) 一种用于鉴别辣椒抗感cmv的引物对及其应用
US11866716B2 (en) Methods and compositions for generating doubled haploid plants and use of same in breeding
US20230292686A1 (en) Methods and compositions for developing cereal varieties with chilling tolerance
US20220090114A1 (en) Soybean Transgenic Event IND-00410-5
Rauscher Qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in reciprocal backcross progenies of Solanum tuberosum and S. berthaultii
AU2014386227B2 (en) Markers linked to reniform nematode resistance
Frerichmann et al. Detection of new sequence variants for flowering and bolting time genes in species of the genus Beta
van den Haak Molecular Breeding in Lilium
US20150159228A1 (en) Molecular markers associated with culture and transformation in maize
US20140259232A1 (en) Molecular markers associated with earliness in maize

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: C1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: C1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

CFP Corrected version of a pamphlet front page
CR1 Correction of entry in section i
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000949554

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 505345

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000949554

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000949554

Country of ref document: EP