OA11975A - Moyens pour l'identification du locus d'un gène majeur de la résistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications. - Google Patents

Description

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Moyens pour l’identification du locus d’un gène majeur de la résistance auvirus de la panachure jaune du riz et leurs applications. L'invention a pour objet des moyens, outils et procédés, pour l'identification du5 locus d'un gène majeur de résistance au virus de la panachure jaune du riz (en abrégé RYMVpour Rice Yellow Mottle Virus). Elle vise plus spécialement, en tant qu'outils, des marqueurs et des amorces PCR. RYMV est un virus endémique en-Afri que. Chez quelques rares variétés del’espèce africaine de riz cultivé Oryza glaberrima, une résistance très élevée au RYMV a été 10 identifiée. Mais comme les hybrides interspécifiques entre les deux espèces de riz cultivées sontextrêmement stériles, les recherches antérieures n'ont pas permis de décrire de bases génétiques,ni de mécanisme de cette résistance.

Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré qu'une variété dénomméeGigante, originaire du Mozambique et identifiée par l'ADRAO, de l'espèce asiatique de riz 15 cultivé Oryza sativa. manifestait les mêmes caractéristiques que celles observées chez O.glaberrima. Les inventeurs ont caractérisé la résistance à RYMV en mettant en évidence qu’elleest liée à un gène majeur de résistance récessif et identique chez les deux sources de résistanceconsidérée (O. Sativa et O. glaberrima}.

Cette résistance intervient au niveau du mouvement de cellule à cellule et se 20 traduit par un blocage du virus au niveau des cellules infectées alors que la réplicatiop du virusest normale.

La migration du RYMV se fait sous forme d’un complexe nucléoprotéiqueassociant acide nucléique viral, protéine de la capside et protéine du mouvement du virus. Dansles cellules des variétés sensibles, un facteur hôte, probablement une protéine, contribue 25 également au déplacement du virus. Chez les variétés résistantes au contraire, une mutation decette protéine ne permet plus l'association avec le virus et donc sa diffusion dans la plante.

Compte tenu de ces résultats, les inventeurs ont élaboré une méthode et des outilsspécifiques pour caractériser le fragment de chromosome portant ce gène de résistance au RYMVqui code pour cette protéine permettant d'assurer le mouvement du virus dans la plante. 119 7 5 2 L'invention a donc pour but de fournir un procédé pour l'identification desmarqueurs moléculaires du locus de résistance au RYMV.

Elle vise également, en tant que tels, les fragments d'ADN tels que révélés par ceprocédé, et utilisables en tant que marqueurs. 5 L'invention vise en outre les applications de tels marqueurs, notamment pour définir d'autres marqueurs de haute spécificité vis-à-vis du locus de résistance et pour prédire unphénotype résistant L’invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences des amorcesutilisées dans les techniques PCR mises en oeuvre. 10 Conformément à l’invention, l'identification dex marqueurs du locus d'un gène majeur de résistance à RYMV, comprend l'utilisation de marqueurs AFLP (Amplified FragmentsLength Polymorphism) et fait appel à la technique PCR.

Ce procédé d'identification est caractérisé en ce qu'il comprend : 15 - l'amplification sélective de fragments zd'ADN de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragmentsayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer desadaptateurs complémentaires d'amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotidesspécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation, 20 - la séparation des produits d'amplification, par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges defragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avecles fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le25 polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie lecas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du tauxde recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les fragments d'ADN sont obtenus pardigestion des ADN génomiques de plantes résistantes d'une part, et de plantes sensibles d'autrepart, et de leurs parents, à l'aide d'enzymes de restriction. 30 119/5 3

Des enzymes de restriction qui se sont révélées appropriées comprennent EcoRI et

Msel.

De courtes séquences nucléotidiques sont fixées aux fragments de digestion(adaptateurs) pour générer des extrémités franches auxquelles sont ensuite fixés des adaptateurs.

Les amorces utilisées dans l’étape d’amplification sont complémentaires de cesadaptateurs avec, à leur extrémité 3’, de 1 à 3 nucléotides qui peuvent être variables. L'étape d'amplification est conduite avantageusement selon la technique PCR.

Des profils d’amplification spécifiques sont obtenus avec des couples d'amorcespossédant à leur extrémité, respectivement, des motifs AAC et CAG, ACC et CAG, ou encoreAGCetCAG.

Les séquences correspondant aux adaptateurs EcoRI et Msel sont respectivementGAC TGC GTA CCA ATT C(SEQ ID N°l) et GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQID N° 2).

Les couples d'amorces mis en oeuvre pour l'amplification sont choisis parmi E-AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; et E-AGC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondentrespectivement à SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2. D'autres couples sont donnés dans le tableau 6dans les exemples. L'étude comparative des profils d'amplification obtenus permet de révéler desbandes polymorphes spécifiquement présentes chez les variétés parentales sensibles et leursdescendants sensibles, comme exposé dans les exemples, et correspondant en conséquence à desmarqueurs de résistance.

En particulier, la révélation sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantesconduit à l’identification de 2 bandes marqueurs Ml et M2 respectivement de 510 pb et 140 pb.

Ces 2 bandes déterminent après l'analyse des données de ségrégation un segmentchromosomique de 10 à 15 cM portant le locus de résistance et sont situées de part et d'autre dece locus, à 5-10 cM.

Selon une disposition du procédé de l'invention, les bandes polymorphesidentifiées en tant que marqueurs spécifiques du locus de la résistance au RYMV sont isolées àpartir des gels. On opère avantageusement par excision des gels d'électrophorèse. Cette étaped'isolement est suivie d'une purification en procédant selon les techniques classiques. On disposeainsi de fragments d'ADN. 4 1 19 7 5 ’

Selon une autre disposition de l'invention, lesdits fragments purifiés sont clonésdans un vecteur approprié, tel qu'un plasmide, introduit dans des cellules hôtes, notamment descellules bactériennes comme celles de E. coli.

Selon encore une autre disposition de l'invention, les fragments d'ADN purifiés etclonés sont séquencés.

Mettant à profit les séquences des inserts correspondant auxdits fragments d'ADN,l'invention fournit également un procédé d'obtention de marqueurs de grande spécificité vis-à-visdu locus d'un gène majeur de résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on définitdes couples d’amorces PCR complémentaires d'une partie de la séquence du fragment d’ADN quia été séquencé, omproeède à une amplification spécifique de cex fragment à l'aide de ces couplesd'amorces, puis on soumet les produits d'amplification à une migration sur gel d'électrophorèse.

Ces séquences d'ADN sont utilisables pour identifier un polymorphisme lié aulocus de résistance dans une variété à étudier suivant différents procédés ainsi que décrit dans lesexemples : / 1) en identifiant directement un polymorphisme de taille de ces séquences d'ADN aprèsamplification spécifique et séparation des fragments sur gel d'agarose, 2) en digérant les produits d'amplification parades enzymes de restriction pour séparer lesproduits de digestion sur gel d'agarose, 3) en utilisant ces séquences comme des sondes pour hybrider l'ADN de variétés de riz préalablement digérées par une enzyme de restriction et déterminer un polymorphisme derestriction. x L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les bandes AFLP polymorphestelles qu'identifiées par le procédé défini ci-dessus, à partir d'ADN de plantes de riz, et le caséchéant isolées, purifiées et séquencées.

Ces bandes AFLP sont caractérisées en ce qu'elles sont spécifiquement mises enévidence dans une variété sensible au RYMV (IR64) et dans la fraction de plantes sensiblesissues du croisement de cette variété avec la variété résistance Gigante comme décrit dans lesexemples. 119 7 5 5 L'invention vise tout spécialement les séquences d'ADN correspondant à cesbandes polymorphes, et qui permettent de définir un segment du chromosome 4 de 10-15 cMportant le locus de résistance au RYMV.

Compte tenu de leur procédé d'obtention, les bandes AJFLP correspondent à des5 fragments de restriction et en particulier, conformément à un mode de réalisation du procédé de l'invention, à des fragments EcoRI - Msel.

Des fragments de ce type sont appelés marqueurs Ml et M2 et sont caractériséspar une taille, respectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d'électrophorèse en conditionsdénaturantes.

10 Ces fragments sont caractérisés en ce qu'ils correspondent à des séquences d'ADN flanquant le locus de résistance et situés de part et d'autre de ce dernier à 5-10 cM. L'invention vise également des fragments clonés dans des vecteurs tels queplasmides, ces vecteurs de clonage en tant que tels, caractérisés par le fait qu'ils comportent detels fragments, et les cellules hôtes transformées à l'aide de ces vecteurs, tels que des cellules 15 bactériennes comme E. coli.

L'invention vise notamment la séquence d'ADN correspondant au fragmentidentifié comme marqueur Ml, et répondant à la séquence SEQ ID N° 3 suivante :CGTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAGCGAAGGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCG

20 GATCGGAGGAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAAGGGCAGATGAGGAGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGCAGATGCAAGATGGCTAGCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAGgggctttctttgggagtatgcgctcagcatggaactgcgcgaaagaagtagatttcaGAGCAATGAAAGACAATCTGTTCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAAC

25 GAGTTATGAATGAAGGTCCATGGACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAAT

ATGATGGCTGGTCCAAGATTGAAT

La séquence d'ADN du marqueur Ml présente une taille de 471 pb. L'invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences de nucléotides utilisées comme amorces d'amplification en PCR. 6 119/5

De telles amorces comprennent les couples E-AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ;E-ACC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondent respectivement à SEQID N° 1 et SEQ IDN°2. D'autres amorces encore sont complémentaires de séquences identifiées dans la5 séquence du fragment appelé marqueur Ml. Il s'agit en particulier de séquences (5', 3') choisies parmi : AGGAAGGGGAACACAACAGCC (21 pb) (SEQ ID N° 4) TTATGCTGGAGGGGCTTGACC (21 pb) (SEQ ID N° 5) GCAGTTCCATGCTGAGCGCAT (21 pb) (SEQ ID N° 6) 10 CCGAACATCCTCGAAAGGTCC (21 pb) (SEQ ID N° 7) xTCATATTCTGCGAGGAGCACC (21 pb) (SEQ ID N° 8) ’

L’invention vise également la séquence d'ADN correspondant au fragmentidentifié comme marqueur M2 et répondant à la séquence SEQ ID N°9AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTA

15 GCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCC ATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTG

GCCTTAGGTT TGCCTCTGTTA *.4

La taille de M2 est de 120 pb. «

Des amorces spécifiques complémentaires des séquences identifiées dans laséquence de M2 ont été définies. De telles séquences répondent aux enchaînements suivants (5', 20 3') : SEQIDN°10 AACCTAAGGCCACCTCCAATSEQ IDN°ll GCAAACCTAAGGCCACCTC25 SEQIDN°12

ATTCACCCCATGCCCTAAG

Selon encore un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des séquences d'ADNobtenues avec les amorces ci-dessus pour définir des polymorphismes permettant l'identificationde phénotypes résistants.

30 L'invention concerne également un procédé d'identification de la séquence d'ADN portant le gène majeur de la résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé par le criblage d'une 7 119/5 banque constituée de fragments d'ADN de 100 à 150 kb de la variété IR64 ou autre, tel que labanque BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), clonés dans des bactéries, pour sélectionner leou les clones de la banque renfermant les marqueurs définis ci-dessus et le gène de résistance auRYMV. 5 Une telle banque BAC est disponible auprès de l'IRRI. L'existence de sites de restriction différents sur la séquence correspondant au marqueur Ml et notamment les sites correspondant à Hpall/Mcpl permet d'identifieravantageusement les phénotypes résistants. L'identification de sites de restriction différents sur la séquence correspondant au 10 marqueur Mi permet de caractériser un polymorphisme qui peut être exploité avantageusementpour cartographier le marqueur Ml sur les cartes de liaison génétique du riz.

La cartographie de la séquence correspondant au marqueur Ml permet d'identifierune zone chromosomique sur le chromosome 4 du riz portant le locus de résistance au RYMV.

La cartographie du gène de résistance au RYMV sur le chromosome 4 de la carte 15 génétique du riz permet d'identifier des marqueurs plus proches du locus de résistance. Il s'agit enparticulier de marqueurs microsatellites RM252 et RM273 ou tout autre marqueur à l'intérieur del'intervalle (4-5cM) défini par ces marqueurs permettant d'identifier un polymorphisme entre lesparents IR64 et Gigante tel que les marqueurs RFLP issus de banques génomiques ou d'ADNc,les microsatellites, les marqueurs AFLP ou les marqueurs dérivés de la cartographie physique de 20 la région comme les clones BAC, Y AC ou leurs cosmides.

Les marqueurs identifiés conformément à l'invention ou tout autre marqueur situé dans cet intervalle permettant d'identifier un polymorphisme entre des variétés résistantes tel queGigante ou O. glaberrima avec des variétés de riz sensibles au RYMV peuvent être utilisés pourle transfert de la résistance au RYMV dans des variétés sensibles par recroisement successifs 25 suivis de sélection assistée par marqueurs. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures I à 10 qui concernentrespectivement, - la figure 1 : le clonage du marqueur Ml dans le plasmide PGEMTeasy. La 30 digestion du plasmide montre un fragment d'ADN de 510 pb correspondant à la bande Μ1 ; 119 7 5 8 - la figure 2 : l'amplification du marqueur Ml dans les quatre variétés de riz(Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681) en utilisant les couples d'amorces 2-4) : 291 pb ; (2-5) : 310 pb ; (1-3) : 288 pb ; (1-4) :406 pb ; (1-5) : 425 pb ; (2-3). Le fragment Ml est légèrement plus grand chez Tog5681que chez les autres variétés ; - la figure 3 : l'identification de sites de restriction sur la séquence du marqueurMl chez les 4 variétés IR64, Azucena, Gigante et Tog5681 ; - la figure 4 : la digestion du marqueur Ml avec l'enzyme Hpall aprèsamplification PCR en utilisant les couples d'amorces (1-3), (1-4) et (1-5) sur les quatre variétés(Azucena, Gigante-IR64 et Tog5681). La présence d'un site de restriction Hpall dans les variétésIR64 et Tog5681 libère un fragment de 86 pb qui réduit d'autant la taille du fragment amplifié ; - la figure 5 : la caractérisation du marqueur Ml sur les plantes sensibles etrésistantes de la descendance F2 (IR64 x Gigante). Les plantes F2 résistantes ont le profil duparent résistant (IR64-absence du site Hpall), à l'exception d'un seul recombinant, les plantesrésistantes ont le profil du parent sensible (IR64-présence du site Hpall) à l'exception de deuxrecombinants ; - la figure 6 : la ségrégation du marqueur Ml dans la population HD (IR64 xAzucena) : IR64-Azucena-30 individus HD (IR64 X Azucena); - la figure 7 : la carte de liaison génétique du chromosome 4 du riz avec lepositionnement du marqueur Ml et l'identification de l'intervalle dans lequel se trouve le locus derésistance ; - la figure 8 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur desmembranes portant l'ADN des 4 variétés (IR64, Azucena, Gigante et Tog5681) digérées par 6enzymes de restriction Apal, Kpnl, PstI, Seal, HaelII. La variété Tog5681 présente un profil derestriction différent des autres variétés pour l'enzyme Seal qui peut être utilisée pour marquer lelocus de résistance de cette variété ; - la figure 9 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur desmembranes portant l'ADN d'individus issus de recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog 5681 etdigérés avec l'enzyme Seal. Cette descendance est en ségrégation pour la résistance au RYMV.Les individus sensibles (5) montrent tous la bande d'IR64 associée à la bande de Tog5681 119 7 5 9 (individus hétérozygotes). Les individus résistants (9) ne montrent que la bande de Tog5681 àl'exception d'un individu recombinant ; et - la figure 10 : la cartographie et l'ancrage du locus de résistance élevée au RYMVsur la carte IR64 x Azucena.

Exemple 1 : Identification des variétés sources de résistance

Les variétés utilisées dans l’étude de la résistance et en particulier les deuxvariétés résistantes Gigante et Tog5681 ont été caractérisées grâce à des marqueursmicrosatellites sur un échantillonnage représentatif de loci.

Le polymorphisme se manifeste par le nombre Me répétitions d’un court motifnucléotidique, le plus souvent binucléotidique qui est caractéristique d’une variété donnée. 1 Sur un ensemble de loci, les allèles répertoriés permettent de disposer descaractéristiques spécifiques de chaque variété.

La mise en évidence de ces marqueurs microsatellites s’effectue parl’amplification de l’ADN avec des amorces spécifiques déterminées par Chen et aZ.(l), suivied’une migration sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes suivant le protocole décritpar les mêmes auteurs.

Le tableau 1 donne les résultats à partir d’un système de référence établi par Chenet al., ci-dessus suivant lequel les allèles sont identifiés par le nombre de répétitions du motifcomparativement à la variété IR36 qui sert de témoin. Les deux variétés Gigante et Tog5681 sontainsi décrites spécifiquement sur 15 loci vis-à-vis de toutes autres variétés (les marqueursmicrosatellites sont donnés dans la 1ère colonne). 119? S, » 10 TABLEAU 1

Locus Chr Taille sur IR 36 référence IR36 Gigante IR64 Azucena TOG 568113 RM001 1 113 (2) n n-26 n n-22 n-26 RM005 1 113 (2) n n-6 n-4 n+16 n-8 RMOll 7 140 (2) n n-4 n n-24 n-16 RM018 7 157 (2) n n+4 n+6 n+8 n-6 RM019 12 226 (2) n n n+21 n-9 n-21 RM021 11 157 _ (2) n n+8 n n-14 n-32 RM148 3 129 (3) n n+6 n n· n+6 RMI 67 11 128 (3) n n+4 n n+32 n+24 RM168 3 116 (3) n n-20 n n-20 n-24 RM232 3 158 (1) n n-14 n n-12 n-16 RM022 3 194 (2) n n-2 n n-4 n-2 RM252 4 216 (O n n+38 n+2 n-20 n+10 RM255 4 144 (1) n n * n n n RM246 1 116 (0 n n-12 n-12 n-16 n-12 RM231 3 182 (O n n+6 n-22 n-4 n-12

Exemple 2 : Caractérisation de la résistance 5 La résistance a été caractérisée à partir de l’inoculation artificielle de jeunes plantules avec du virus comparativement à une variété témoin IR64 extrêmement sensible.

Le contenu en virus a été suivi pendant 60 jours après inoculation grâce à des testsELISA sur les dernières feuilles émises.

Ces tests n’ont jamais pu mettre en évidence de signal significativement différent10 de plantes témoins non inoculées par le virus.

Une autre expérimentation a été réalisée en inoculant des protoplastes isolés desdeux variétés Tog5681 et Gigante. Dans les deux cas, il possible de détecter la présence desprotéines virales (protéine de la capside et protéine de mouvement PI), ainsi que l’accumulation 119 7 5 11 d’ARN viral, qui témoignent de la capacité de ces protoplastes à multiplier le virus, et ceci de lamême manière que les protoplastes de variétés sensibles comme IR64.

Ainsi, si on considère que la réplication, le mouvement de cellule à cellule, et letransport à longue distance à travers les vaisseaux, sont les trois étapes principales du 5 déroulement du cycle infectieux dans la plante, la résistance de ces deux variétés réside le pluslogiquement dans un blocage du virus au niveau des cellules infectées.

Exemple 3 : Génétique de la résistance

Différents croisements Fl ont été réalisés entrera variété d’<9. sativa résistante10 (Gigante), une variété d’O. glaberrima résistante Tog5681 (également identifiée par l’ADRAO) et la variété de référence très sensible IR64 (sélectionnée à l’IRRI).

La culture du matériel végétal, les croisements et la production des descendancesont été réalisés dans les serres de l’IRD à Montpellier.

Les hybrides Fl obtenus entre les variétés sensibles et résistantes ont été testés15 pour la résistance au virus du RYMV par test ELIS A et suivi des symptômes.

Ces hybrides F1 se sont tous révélés aussi sensibles que le parent sensible et ontdonc montré que la nature de la résistance était récessive.

En revanche, les hybrides entre les deux sources de résistance Gigante et Tog5681n’ont donné que des hybrides F1 résistants en faveur d’un seul et unique locus de résistance chez 20 ces deux sources de résistance. x

Ces résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-après.

Ce tableau donne la distribution des réponses ELISA (A 405 nm) dans les feuillesinfectées par voie systémique des hybrides Fl, des backcross et des descendants F2 obtenus àpartir des backcross entre la variété IR64 sensible et les 2 cultivars résistants Gigante et 25 Tog568i. 12 sa u d ai en vo

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En ce qui concerne Gigante, l’hérédité de la résistance a été confirmée par un-testde résistance sur 55 familles F3 du croisement (IR64 x Gigante). Les résultats sont donnés dansle tableau 3. 11 14 î.’îî tableau donne la ségrégation de la résistance à RYMV dans les descendances P3 ( 11(64 x Gigarite) . L'inoculation est effectuée 10 ft 1*7 jours après la germination avec l'isolat duBurkina Paso et les syrntômes sont suivis 45 jours après l'inoculation . « ci a 3] Ό 3]

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Exemple 4 : Identification des marqueurs de résistance Ml et M2 selon leprotocole AFLP

a - Obtention de pools d'ADN

Les feuilles de 10 plantes sensibles et de 10 plantes résistantes issues d'une F2 15 (IR64 x Gigante) ont été prélevées pour extraire leur ADN.

Les ADN ont été ensuite mélangés de manière stoechiométrique pour constituer deux pools d'ADN correspondant respectivement à 10 plantes F2 sensibles ou résistantes avecune concentration finale du mélange de 50 ng/μΐ. Ces mélanges ont servi de base àl'identification de marqueurs de résistance par la méthode AFLP (Amplified Fragments Length 20 Polymorphism) pour polymorphisme de longueur de fragments amplifiés qui a été développéepar Zabeau et al (4), et Vos et c/.(5). Les produits utilisés se présentent sous forme d'un kitcommercial (Gibco BRL) délivré par Keygene &amp; Life Technologies. b - Obtention de fragments de restriction 25 250 ng de chacun des pools d'ADN à 50 ng/μΐ et des parents sont digérés simultanément par deux enzymes de restriction (EcoRI et Msel). Réaction de digestion (25 μΐ) : 5 μΐ d’ADN (50 ng/ml) 0,2 μΐ (2 U) de EcoRI (10 U/μΙ)0,2 μΐ (2 U) de Msel (5 U/μΙ) 30

16 5 μΐ de tampon T4 ligase 5X , ; ' : 14,5pldeH2O. - -

La réaction de digestion s'effectue pendant deux heures à 37°C, puis 15 min. à70°C pour inactiver les enzymes de restriction. Après digestion, il est procédé à une réaction de 5 ligation. Réaction de ligation (50 μΐ) : 25 μΐ du milieu réactionnel de double digestion1 μΐ d'adaptateur EcoRI1 μΐ d'adaptateur Msel

10 5 μΐ de tampon T4 Ligase 5X 1 μΐ ( 1 U) de ligase ( 10 U/μΙ) 17 μΐ H2O.

La réaction de ligation s'effectue à 37®C, pendant 3 heures, suivie d'uneinactivation de l'enzyme à 60°C pendant 10 min. 15 c - Amplification L'amplification proprement dite a été réalisée en deux étapes : préamplification et amplification spécifique.

Cl - Réaction de pré amplification (50 μΐ) 5 μΐ du milieu réactionnel renfermant l'ADN digéré et fixé aux adaptateurs, dilué 20 au 1/10 25 0,5 μΐ d'amorce EcoRI (150 ng/μΐ) 0,5 μΐ d'amorce Msel (150 ng/μΐ)

2 μΐ de mélange de nucléotides 5 mM 5 μΐ de tampon 10 X, Promega

5 μΐ de MgCl2 25 mM 0,2 μΐ (1 U) de Taq polymérase (5 U/μΙ) 31,8 μΐ de H2O.

Les caractéristiques de la pré-amplification par PCR sont les suivantes : 20 cycles avec

dénaturation : 30 sec à 94°Chybridation : 30 sec à 56®Célongation : 1 min à 72®C 30 119 7 5 17 10 20 25 L'amplification sélective se fait à partir d'un aliquote de la première amplification diluée au 1/30en utilisant des amorces ayant 3 nucléotides sélectifs à l'extrémité 3', et en marquant l'une desamorces pour révéler les bandes sur un film autoradiographique.

On utilise les couples d'amorces suivants : E-AAC/M-CAGE-ACC/M-CAGE-AGC/M-CAG,dans lesquels E répond à la séquence < GAC TGC GTA CCA ATT C (SEQ IDN°1), et M à la séquence GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N° 2).

La température d'hybridation est diminuée de 0,7°C par cycle, pendant les 11 cycles 15

suivants : 20 derniers cycles dénaturation : 30 sec à 90°C hybridation : 30 sec à 56°C élongation : 1 min à 72°C

On procède au marquage de l'amorce EcoRJ (ramené à un tube de 0,5 μΐ) : 0,18 μΐ de l'amorce EcoRI (5ng) 0,1 μΐ de γ33Ρ ATP ( 10 mCu/μΙ)

0,05 μΐ de tampon kinase 10 X 0,02 μΐ (0,2U) de T4 polymérase kinase (lOU/μΙ) 0,15 μΐ deH20.

La réaction de marquage se fait à 37°C pendant 1 heure et est arrêtée par 10minutes à 70°C. C2 - Réaction d’amplification spécifique (20 μΐ) : 0,5 μΐ d'amorce EcoRI marquée 5 μΐ du milieu réactionnel de pré-amplification, dilué au 1/30, 0,3 μΐ d'amorce Msel (100 ng/μΐ)

0,8 μΐ de mélange de nucléotides 5 mM 30 18 2 μΐ de tampon 10 X Promega

2 μΐ de MgCl2 25 mM 0,1 μΐ (0,5 U) de Taq polymérase (5 U/μΙ) 9,3 μΐ de H20. 5 Les caractéristiques de l'amplification sont les suivantes : 32 cycles avec . pour le premier cycle :

dénaturation : 30 sec à 94°Chybridation : 30 sec à 65®C

10 élongation : 1 min à 72°C . les 11 cycles suivants : les mêmes conditions que précédemment, avec diminution à chaquecycle de 0,7°C de la température d'hybridation ; et pour. les 20 derniers cycles :

dénaturation : 30 sec à 90°C15 hybridation :30secà56°C élongation : 1 min à 72°Cd - Electrophorèse et Autoradiographie A la fin de la réaction d'amplification, 20 μΐ de tampon de charge sont ajoutés (98 % de formamide, 0,005 % de xylène cyanol et 0,005 % de bleu de bromophénol). Les20 produits d'amplification sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

(6 % d'acrylamide, 8 M d'urée) avec un tampon de migration TBE (Tris 18 mM, EDTA 0,4 mM,acide borique 18 mM, pH 8,0) pendant 3 heures de migration à puissance de 50 watts. Aprèsmigration, le gel est fixé dans une solution IV d'acide acétique/2V d'éthanol absolu pendant20 minutes. Le gel est transféré sur un papier Wattman 3M et séché pendant 45 minutes à 80°C 25 avec un sécheur de gel. Le gel est placé dans une cassette avec un film ultrasensible.L'autoradiographie est révélée après deux jours d'exposition. La comparaison des profils obtenuschez les parents et les pools de plantes sensibles ou résistantes permet d'identifier des bandesprésentes dans l'un des pools, mais absentes dans l'autre. Ces bandes candidates au marquage dela résistance sont ensuite vérifiées individuellement sur chacune des plantes composant les pools 30 d'ADN. 19 119 y 5 e - Résultats L'étude des résultats obtenus montre que les deux marqueurs appelés Ml et M2sont présents chez le parent sensible (IR64) ainsi que dans toutes les plantes F2 (IR64 x Gigante)composant le pool de plantes sensibles, alors que cette bande est absente chez le parent résistant 5 (Gigante) et qu’un seul individu du pool résistant manifeste cette bande. Le même type devariation est observé dans le recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. Les autres marqueursidentifiés dans cette analyse (M3 à M6) montrent aussi la même variation: - présence des bandes chez le parent sensible et le pool des plantes sensibles F2 (IR64 xGigante) ainsi que les~plantes sensibles du recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. 10 - absence de bande chez les parents résistants Gigante et Tog5681, chez le pool des plantes résistantes F2 (IR64 x Gigante) et chez les plantes résistantes du recroisement (IR64 xTog5681) x Tog5681.

Les données de ségrégation entre les marqueurs AFLP Ml à M6 et le locus de résistancepour les pools F2 (IR64 x Gigante) et le backcross interspécifique (IR64 x Tog5681) x Tog5681 15 sont résumées dans les tableaux 4 et 5. L’analyse des données de ségrégation et des raresrecombinants observés dans les deux croisements permet d’évaluer les taux de recombinaisonentre ces différents marqueurs et le locus de résistance. En particulier, les marqueurs Ml d’unepart et les marqueurs M2 à M6 d’autre part déterminent un segment inférieur à 10-15 cM portantle locus de résistance. Ml et M2 sont ainsi à moins de 5-10 cM et placés de part et d’autre de ce 20 locus. 119 7 5 20 TABLEAU4 RésistanceZMarqueur Μ1 Nombre d'individus observés

Phénotype Génotype résistance RYMV Marqueur AFLP Résistant Sensible Mgg -A tt +A gg It -A It +/- It -A h Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 10 1 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) - - - - - 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 11 1 - 0 8 - - RésistanceZMarqueur M2,M3,M4,M6 Phénotype Génotype résistance RYMV Marqueur AFLP Nombres d'indjvidus observés Résistant Sensible -A tt +/- gg +/ It -A It Π +/- -/- 11 Pool F2 résistant (ER64 x gigante) 11 - 0 - - - - Pool F2 sensible (IR64 x gigante) - - - 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 10 2 - 0 8 - RésistanceZMarqueur M5 .Nombre d'individus observés Phénotype Résistant Sensible Génotype résistace RYMV rt/gg tt gg It It II II Marqueur AFLP -/ +/- +/ -A +/- -A +/ Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 11 - 0 - - - - - Pool F2 sensible (ER64 x gigante) - - - - - - 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 9 3 - 0 8 - - 21 119/ 5 TABLEAU 5

Marqueur M 1/Marqueurs M2,M3,M4,M6

Nombre d'individus observés Génotype Μ1 -/♦ +/* -/- -/- Génotype M2,M3,M4,M6 +/* -/- +/* -/- Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 1 0 10 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 11 2 2 11

Marqueur Ml/Marqueur ,M5 Nombres d'individus observés Génotype Ml -Z* +/* -/- -/- Génotype M5 +/* -/- +/* -/- Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 1 0 10 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 11 2 3 10

Marqueur M5/Marqueurs M2,M3,M4,M6 Génotype M5 Génotype M2,M3,M4,M6 Nombre d'individus observés +/* +/* +/* -/- +/* -/- -/- Pool F2 résistant (IR64 x gigante) 0 0 0 11 Pool F2 sensible (IR64 x gigante) 10 0 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 13 1 0 12 * : (-) backcross interspécifique Tog5681.(+ ou-) pool F2 22 119} 5

Exemple 5 : Isolement du marqueur Ml

Une nouvelle amplification, avec le même couple d’amorces, a été réalisée, suivied'une migration sur gel de poîyacrylamide dans les mêmes conditions que celles énoncées ci-dessus. La révélation a été faite par une coloration au nitrate d’argent, avec le kit silver staining 5 (Promega), pour visualiser directement les bandes sur le gel. Après révélation, la bande Ml a étéexcisée du gel, puis l’ADN a été élué dans 50 μΐ d’eau à 4°C pendant une nuit.

Un aliquot de 5 μΐ a été prélevé et réamplifié avec les mêmes couples d’amorcesavec un marquage au p33.

Le produit d’amplification a été séparé à nouveau sur gel d’acrylamide dénaturant10 à 6%, et comparé-aux-parents et aux pools sensibles et résistants. La piste correspondant à ceproduit d’amplification montre une seule bande de 510 pb migrant exactement au même niveauque la bande d’origine qui avait été excisée. Un autre aliquot de 5 μΐ a été également amplifiéavec les mêmes amorces et a été séparé sur gel d’agarose à 1,8%. La bande correspondant à la taille attendue (51 Opb) a été à nouveau excisée et purifiée avec un kit gene clean (Promega). 15

Exemple 6 : Clonage et séquençage du marqueur Ml . clonage 3 μΐ du produit de purification ont été utilisés pour une réaction de clonagependant une nuit à 37°C. 20 3 μΐ de produit de purification

1 μΐ de vecteur PGEMTeasy1 μΐ de T4 Tampon ligase 10 X1 μΐ de T4 DNA Ligase4 μΐ de H2O 25 La transformation a été réalisée avec la souche £. Coli JM 109 en ajoutant 5 μΐ du produit de clonage à 100 μΐ de cellules compétentes de E. Coli JM 109. Une préculture a étéréalisée sur milieu de culture LB pendant 1 heure, à 37 °C. Ensuite les bactéries ont été étaléessur boîte de Pétri contenant de l’agar à 1/1000 d’ampicilline. 50 μΐ d’IPTG-XGal sont ajoutésjuste avant l’étalement des bactéries pour sélectionner les bactéries transformées. Une colonie 30 blanche (transformée) a été sélectionnée et remise en culture dans les mêmes conditions (Agarplus ampicilline). 119 7 5 23 A partir de cette culture, une mini-préparation d’ADN plasmidique a été réaliséeavec le kit Wizard plus (Promega). L’ADN plasmidique contenant l’insert a été digéré avecl’enzyme Eco RI pour vérifier la présence du marqueur Ml. Un gel d’agarose à 1,8% a permis devérifier la présence de la bande de 3 kb correspondant au plasmide et de la bande de 510 pbcorespondant au marqueur Μ1 (photo 1). . Séquençage

La séquence de l’insert (SEQ ID N° 3) est la suivante (5', 3') : SEQ ID N° 3 20 30 ‘ “40 50 60 70

GTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAGC

GAAGGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCGG

ATCGGAGGAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAAG

GGCAGATGAGGAGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGCA

GATGCAAGATGGCTAGCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAGG

GGCTTTCTTTGGGAGTATGCGCTCAGCATGGAACTGCGCGAAAGAAGTAGATTTCAG

AGCAATGAAAGACAATCTGTTCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAACG

AGTTATGAATGAAGGTCCATGGACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAATA

TGATGGCTGGTCCAAGATTGAAT

Les séquences correspondant aux amorces utilisées pour les amplifications AF LPont été retrouvées et montrent que la bande correspond à un fragment de restriction (EcoRI -Msel).

En déduisant les séquences correspondant aux amorces, la taille réelle dufragment d’ADN de riz cloné est de 471 pb. L'utilisation des différents couples d'amorces (1-3), (1-4), (1-5) d'une part et (2-3),(2-4), (2-5) d'autre part permet de valider le clonage de la bande AFLP Ml. L'amplification del'ADN des variétés utilisées dans les croisements avec ces amorces ne montre qu'une seulebande. Le fragment correspondant à la variété Tog56581 est un peu plus important que celui desautres variétés (fig. 2).

Exemple 7 : Transformation de la séquence Ml en marqueur polymorphe 24

Un polymorphisme pour le marqueur Ml a été déterminé entre les parents de lapopulation haploïde doublée (IR64 x Azucena). Cette population compte plus de 300 marqueursrépartis sur les 12 chromosomes du riz. Pour cela, on s'est appuyé sur les sites de restriction de laséquence du marqueur Ml déterminée sur le parent IR64 (fig. 3). Les amorces (1-3), (1-4) et (1- 5) ont été utilisés pour amplifier l'ADN des parents des croisements qui a ensuite été digéré pardes enzymes de restriction. Le site de restriction Hpall/Mspl libère un fragment de 86 pb lorsquel'amorce 1 est utilisée. Ce site est absent chez les variétés Gigante et Azucena. (fig. 4).

Le marqueur a été testé sur les individus F2 du pool sensible et du pool résistantdu croisement (IR64 x Gigante). Tous les individus résistants ont le profil de la variété Gigante(absence du marqueur AFLP Ml associée à l'absence du site de restriction Hpall/Mspl) àl'exception de l'individu (5.11). Les individus sensibles présentent le site de restrictionHpall/Mspl à l'état homozygote comme la, variété IR64 à l'exception de deux individushétérozygotes qui sont recombinés (fig. 5).

La séquence du marqueur Ml que l'on peut amplifier par des amorces spécifiquescorrespond bien au marqueur AFLP Ml. La digestion par l'enzyme Hpall/Mypl permet dedistinguer l'allèle venant du parent sensible (IR64) du parent résistant (Gigante).

Ces nouvelles données permettent de conforter la position du locus de résistanceentre les marqueurs Ml et M2 et d'estimer les taux de recombinaison à 0,065 ± 0,045 pour ladistance entre Ml et le locus de résistance et 0,11 ± 0,047 pour la distance entre les marqueursMl etM2.

Exemple 8 : Cartographie du marqueur Ml

Soixante individus de la population (IR 64 x Azucena) ont été passés pour le marqueur Ml : amplification avec les amorces (1-3) et digestion par l'enzyme Hpall/Mspl, suivied'une séparation des fragments sur un gel d'agarose à 2,5 %. La ségrégation du marqueur Ml estsans distorsion (fig. 6). Les résultats permettent de cartographier le marqueur Ml en utilisant unlogiciel de cartographie (Mapmaker V3), qui permet de placer le marqueur Ml sur lechromosome 4 entre les marqueurs RG 163 et RG 214 (fig. 7). Cet intervalle représente la zoneoù se situe le locus de résistance au RYMV.

Exemple 9 : Marquage du locus de résistance de la variété Tog5681 119 7 5 25

La présence du site de restriction Hpall/Mspl dans la variété Tog5681 ne permetpas d'utiliser la stratégie de l'exemple 8 pour vérifier que le marqueur Ml est aussi un marqueurde la résistance provenant de Tog5681. Aussi, les 4 variétés Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681ont été digérées avec 12 enzymes de restriction (BamHI, Bg/II, Dral, EcoRI, EcoRV, HindlII, 5 Apal, Kpnl, PstI, Seal, Xbal, HaelII) pour identifier un polymorphisme de restriction en utilisantla séquence d'ADN du marqueur Ml comme sonde. L'enzyme Seal permet d'identifier unpolymorphisme entre IR64 et Tog5681 (fig. 8). Ce polymorphisme a été utilisé pour valider lemarqueur Ml sur un recroisement (IR64 x Tog5681) x IR64 en ségrégation pour la résistance. 5individus sensibles de” ce recroisement ont été testés et montrent tous la bande caractéristique 10 d'IR64. Les 9 individus résistants ne montrent que la bande de Tog5681 à l'exception d'un seul qui est recombinant (fig. 9). Le polymorphisme de restriction mis en évidence par l'enzyme Sealen utilisant le marqueur Ml comme sonde est donc bien lié au locus de résistance de Tog5681.L’analyse génétique et l'idendification de marqueurs de résistance sont cohérentes pourconsidérer que le marqueur Ml cartographie bien le même locus de résistance chez les deux 15 variétés Gigante et Tog5681.

Exemple 10 : Clonage et séquençage du marqueur M2 en marqueur PCR-spécifiqueLa bande AFLP obtenue avec le couple d'amorces E-ACC/M-CAG et correspondant à la bande M2 visible chez le parent sensible (IR64) et présente chez tous les individus composant le 20 pool sensible a été clonée suivant le même protocole que pour le marqueur Ml. La,séquencecorrespondant à cette bande a été déterminée et 3 amorces ont été définies (1 forward - 2 reverse)pour permettre la transformation de ce marqueur en marqueur PCR-spécifique. Séquence du marqueur M2 (120pb) (SEQID N°9) :

AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTA

25 GCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCCATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTGGCCTTAGGTT TGCCTCTGTTA

Amorces : (SEQ ID N°10) : AACCTAAGGCCACCTCCAAT (droite) 30 (SEQ ID N° 11 ) : GCAAACCTAAGGCCACCTC (droite)

F

26 - (SEQID Ν° 12) : ATTCACCCCATGCCCTAAG (gauche)

Les conditions suivantes sont utilisées pour amplifier simultanément les marqueurs Ml et M2 - tampon 10X Proméga 1,5 μΐ - MgCl2 Proméga 1,5 μΐ 5 - dNTP (5 mM) 0,6 μΐ - amorce Ml-I (10 μΜ) 0,15 μΐ -amorceΜ1-4 (10mM) 0,15 μΐ - amorce M2-1 (10 mM) 0,15 μΐ - amorce M2-2 (10 mM) 0,15 μΐ 10 - HjO _ 7,74 μΐ - Taq Polymerase 0,06 μΐ - ADN (5 ng/μΐ) ' 3 μΐ

Programme PCR

15 - 5mn à 94°C

- lmnà94°C

- 30 s à 59°C

- 1 mn à 72°C - 35 cycles

20 - 5 mn à 72°C

-10 mn à4°C

Le marqueur M2 peut être amplifié seul avec une température d’hybridation de60.5°C, les autres paramètres restant inchangés. Dans ces conditions d’amplification, lemarqueur M2 apparaît comme un marqueur dominant se caractérisant par une présence de bande 25 chez le parent sensible (IR64) et absence de bande chez le parent (Gigante).

Exemple 11 : Création d’une population de plantes résistantes recombinantes entre lesmarqueurs Ml et M2 pour ordonner à l’intérieur de cet intervalle les marqueurs AFLP candidatsau marquage de la résistance 750 individus F2 (IR64 x Gigante) ont été inoculés artificiellement 30 avec le virus RYMV (souche BF1). Les plantes sans symptômes ont été repiquées en serre soit188 individus. Par la suite, des tests complémentaires basés sur des tests Elisa et des tests de 75 27 descendances ont permis d’éliminer une dernière fraction de 50 plantes sensibles. Les 138plantes restantes et homozygotes pour la résistance ont été systématiquement génotypées pour lesdeux marqueurs Ml et M2 comme précédemment définis. 45 individus ont été ainsi sélectionnés(38 recombinants par rapport à Ml ; 7 recombinants par rapport à M2) et 2 doubles 5 recombinants. Ces individus recombinants ont servi à l’ordonnancement des marqueurs AFLPdans l’intervalle entre Ml et M2.

Ces résultats sont résumés dans le tableau 6 suivant : - - TABLEAU 6 10 Sélection d'une soùs-population F2 (IR64 x Gigante) recombinante dans l’intervalle des marqueurs M1-M2

Etapes réalisées F2 (IR64 x Gigante) Nombrede plantes % Inoculation des plantes F2 (10 jours après semis) 768 Transplantation en serre (5 semaines après inoculation) 1 88 Elimination de plantes sensibles 50 (suivi des symptômes - Test Elisa et Test de descendance) Sélection de plantes résistantes homozygotes pour le gène de résistance élevée 1 38 17,9 Génotypage des individus sélectionnés pour les marqueurs Ml et M2 Plantes recombinées par rapport à M1 36 18,8 plantes recombinées par rapport à M1 et M2 2 1,4 Plantes recombinées par rapport à M2 7 5,1

Exemple 12 : Criblage de marqueurs AFLP pour sélectionner de nouveaux marqueurs25 candidats à la résistance

Un total de 328 couples d’amorces EcoRJ/Msel, chacun défini par 3 nucléotides, a étéutilisé suivant le protocole précédemment défini. Ces amorces sont données dans le tableau 7 ci-après. 28 119/5 TABLEAU 7

îu plusieurs bandes entre les pools sensible et résistantes polymorpnes Pans le pool sensibleces polymorphes sans le pool résistant'pes polymorphes Sans le pool sensible et le poil résistant «n ombré : polymorphisme pour un«' presence «'un* ou plus.eurs isri·· presence «'une ou plusieurs par··" présence S’une ou plusieurs Pi ρ î O ÿ 5 29 TABLEAU 7 suite

I N” de Amorce Amorce combinaison EraRI Mse! 163 AGC CTA 154 AGC CTC 165 AGC CTG 1 56 AGC CTT 157 AGC AAC 1 53 AGC AAG 1S9 ACC AAT 170 ASC ACA 171 ASC fiCZ 172 ASC flca 173 ASC ACT

' 'Ï7S·' T ' ' „ &amp;&amp; -Tù AGG 176 ACC _ AGT 177 AGG CAA 178 AGG CAC 179 A3G CAG 130 AGG CAT 131 AGG CCA 132 AGG CCT 133 AGG G3A 184 AGG CGT 135 AGG CTA 133 AGG CTC 187 AGG CTG 133 AGG CTT 189 ACG AAC t90 AGG AAG 191 AGG AAT 192 AGG ACA 193 ACG ACC 1 34 AGG ACG L 1S5 'T AGG· ,ACT 193 AGG AGC 197 "· AGG AGG 193 AGG AGT 199 AGT CAA 200 AGT CAC 201 AGT C«S 202 AGT CAT 203 AGT CCA 204 AGT CCT 205 AGT CCA 203 AGT CGT 207 AGT CTA 208 AGT CTC 209 AGT CTG 210 AGT CTT 21 1 AGT AAC 212 AGT AAC

''AGT'fv 214 AGT ACA ^"275/-·'·. ' . .AG.7 ' ’ ACC '· 215 AGT ACG 217 AGT ACT N° de combinaison Amorce EosRI Amorce Mse! N» de combinai; Amorce ion EooRI Amorce Msel 213 AGT AGC 273 CAT CTA 219 AC i AGG 274 CAT CTC 223·; # ' , ·: 275 CAT CTG 221 ATC CAA 275 CAT CTT 222 ATC CAC 277 CAT AAC 223 ATC CAG 273 CAT AAG 224 ATC CAT 279 CAT AAT 225 ATC CCA 2SS * CAT ACA. 225 ATC- CCT 231 CAT ACC 227 . ATC CGA 232 CAT ACG 223 ATC CGT 233 CAT ACT 229 ATC CTA < 234 CAT AGC 230 ATC CTC 235 CAT AGG 231 ATC CTG 236 CAT AGT 232 ATC CTT •Au J- *. ' 23? —.5? s J./ •-«•V *A 288 CTA CAC ' '234 T*/ sw> - ? ATC '".VAAG 289 CTA CAG 23S \ > 290 CTA CAT 233 ATC ACA 2ST * - „ CCA 237 ATC 292 CTA CCT 233 ATC ACG 293 CTA CGA 239 ATC ACT. 294 CTA CGT 240 ATC ACC 295 CTA CTA 241 ATC AjG 296 CTA CTC 242 ATC AGT <<:<¥?:2S7 ' CTA 243 CAA CAA 293 CTA CTT 244 CAA CAC 299 CTA AAC 245 CAA CAG 300 CTA AAG 245 CAA CAT 301 CTA AAT 247 CAA CCA 302 CTA ACA 243 CAA CCT 303 CTA ACC 243 CAA CCA 304 CTA ACG CAA CST 305 CTA ACT 251 CAA CTA 3QS CTA AGC -, 252 CAA CTC 307 CTA ACG 253 CAA CTG 308 CTA AGT 254 ' CAA CTT 309 CTT CAA 255 CAA AAC 310 CTT CAC 256 CAA AAG 311 CTT CAG 257 ' „ CAA. AAT 3“Î2 '* cré;,.. CAT 256 ** CM., 313 err CCA 259 CAA ACC 3 1 e CTT CCT 2S0 CAA ACG 315 CTT CCA 2S1 CAA ACT 31S CTT CGT 252 CAA ACC 317 CTT CTA 253 CAA AGG 313 ' CTT CTC 254 CAA AGT -·: 3 t S :·/*: CTT CTG 255 CAT CAA 320 CTT CTT 255 CAT cac 321 CTT AAC 257 CAT CAC 322 ctt AAG 253 CAT CAT 323 CTT AAT 259 CAT CCA 324 ctt ACA 270 CAT CCT 325 CTT ACC 271 CAT CCA 325 CTT ACG 272 ' , ' ÇAT-, '."-'..ZZsll· 4 * 327 CTT ACT 323 CTT AC * en srrere poiymorpnisæe pouf une au plusieurs punies entre les pools sens.Pie et résistant• presence d’une ou plusieurs pondes polymorpnes oons le pool sensible 119 7 5 30

Ce criblage a permis d’identifier une ou plusieurs bandes polymorphes selon leur apparition chezle parent, sensible et/ou le parent résistant. 23 couples d’amorces ont permis d’identifier unpolymorphisme entre les parents confirmés par les pools d’ADN F2 sensible ou résistant.Letableau récapitule et donne la position dans l'intervale M1-M2 des marqueurs AFLP liés au locusde résistance élevée au virus de la panachure jaune du riz.. TABLEAU 8 N· de combinaison Nucléotides variables Présence de(s) bande(s) Position des marqueurs nt sur l'intervalle M1-M2 Amorce EcoRl Amorce Msel pool sensible pool résista 3 AAC~ CAG - = Marqueur cloné Ml 69 ACC— CAG = Marqueur cloné M2 77 ACC CTG - 4· non déterminé 81 ACC AAT - + non déterminé 86 ACC AGC - * non déterminé 91 ACG CAG - 4· non déterminé 104 ACG ACA ♦ - entre R et Rm273 154 AGA AGT * au delà de M2 157 AGC CAG 4» en coségrégation avec M2 174 AGC AGC • * non déterminé 175 AGC AGG 4» entre M1 et Rm241 197 AGG AGG * 4» entre M1 et Rm241 215 AGT ACC - 4» non déterminé 220 AGT AGT 4»· - entre Rm273 et M2 233 ATC AAG 4» entre M1 et Rm241 250 CAA CGT - +· non déterminé 254 CAA CTT 4· au delà de M2 258 CAA ACA entre Ml et Rm241 280 CAT ACA au delà de M2 287 CTA CAA entre Rm273 et M2 291 CTA CCA + entre Ml et Rm241 318 CTT CTC + 4» entre Rm273 et M2 319 CTT CTG - non déterminé

Après vérification individuelle sur chacun des individus composant les pools, les marqueurscandidats correspondant à des bandes présentes chez le parent IR64 peuvent être testées sur lesrecombinants identifiés dans l’exemple 11. 9 marqueurs ont été confirmés ainsi commeappartenant à l’intervalle Ml -M2. Le tableau 9 donne l'ordonnancement dans l'intervalle M1-M2des marqueurs AFLP identifiés par comparaison de pools d'ADN sensible et résistant à partird'une sous population résistante d'une F2 (IR64 x Gigante). TABLEAU 9 individus résistants=2 (1P.S4 x Gigante) 119/5 31

Ml SAGG 3-A7C Ξ-2ΑΑ Z-AGZ ê-CTA Râsist- S AGS S-AGT c-CTT ΰ-CTA M2

MAGG M-lAG M-ACA M-AGG M-CCA S.M24, SM252 RYMV M-ACA RM273 M-AGT M-CTC M-CAA 2 H O 0 O O O 5 3 3 3 ? H □ 0 £ D O 5 3 3 3 3 H O O 0 O □ - 3 3 3 3 10 H □ 0 0 £ a • 3 3 3 S 21 H O □ 0 D 3 C = 3 3 3 23 H O 0 0 £ O 3 3 3 3 25 H O 0 0 O D 2 H. 3 3 S 23 H O □ 0 3 3 Q 5 3 3 3 37 H 0 0 c ê O £ H g 3 3 43 H O O 0 O O - 3 3 S a 55 H O O 0 O O 2 3. 3 3 3 1 O O 0 O O £ S 3 55 -W O 0 O • s c 3 .3 3 3 55 H e O O O s C- 3 3 3 9 103 H c O c - 3 c 3 3 3 S t04 H O O □ 3 3 c 3 3 5 3 t‘33 M 3 3 3 3 3 c 3 3 3 9 t 1 1 H = O c O O - 3 3 3 a 1 19 H O O O O O - 3 3 3 3 120 A O 0 c O 3 c 3 3 3 3 125 H £ 2 2 £ 0 • 3 3 3 3 12' H 3 c 3' 3 9 a 131 H 6 Ξ 3 2 O 3 3 3 3 133 H - 3 c 3 3 • 3 îil H s £ £ = O £ Fi 5 3 3 154 H 5 2 2 2 O • 3 3 3 3 153 H 2 2 c 2 O 3 a s 9 159 H 3 c 3 3 - 3 150 H £ 2 2 £ O 3 3 s 3 151 H S £ £ 2 O 3 3 3 s 153 H • 3 3 3 3 3 15' H • 3 3 3 3 S S 171 H 3 3 3 3 3 3 175 H s £ 2 O O 3 3 3 3 β 175 H e 3 3 3 3 3 3 3 133 H 2 c c 2 O 3 3 3 3 3 35 H c O O 0 O H H 3- , £>? H 135 H ζ. c 2 = O H K , * ' S V Ή 17 H 3 3 3 3 3 3 ε &amp; 20 s S 3 3 3 3 3 3 δ ' ο ' H 33 a 9 3 3 3. 3 • 3 fcwKvWKÿ 93 3 3 3 3 3 5 5 3 g D Ή 105 3 3 3 3 3 3 9 3 g O H 14« 3 • 3 3 3 3 3 3 3 ,30 3 - • 3 3 3 3 3 3 9 3 Fréquence d’individus recsmcinés* ir.cerwaite Mt · 3 3.37 0 57 0 37 G 57 a ai G 25 0 15 inïervatfe 3 - M2 0 57 0.75 Distance r résistance (cM| t 1 4" ' 1 1.03 1 1.03 1 : 03 3 35 S 90 3.33 2 · 0 -9 f Π 3 33 3.39 3 3

3 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 3a 33 33 33 33 33 33 33 39 33 33 33 33 S3 33 39 33 99 3O OO OO OO 0O OO OO O3 3O O 3 3 3 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 39 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 , 33 3'3 33 33 30 0O 0O 00 00 00 0□ 03 00 0 0.35 0 39 4.44 4 44 G. 35

4.44 5 G génotype homozygote pouf l'alléle du parent sensible JR3A) génotype hétérozygote génotype homozygote pour l'allele du parent res.stant ; Gigante)génotype non homozygote pour l'allele eu p3rent res.stant (gigantejsous Î'hypothése d'aosence de douole reccmeinaiscn dans l'mter/aile Mt -R et M2 · R.distance estimée a partir de la cartographie de la res.starce sur 133 .-2 (..-<54 < -ugante) d.* 4Sgure A) 119? 5 32 14 bandes provenant du parent résistant ont été également identifiées et seront confirmées ou nonsur les recombinants générés dans la population F2 (IR64 x Gigante).

Exemple 13 : Ancrage du locus de résistance au RYMV à l’aide de marqueurs5 microsatellites

Le marqueur Ml ayant été placé sur le chromosome 4 de la carte génétique (IR64 xAzucena ; exemple 9), des marqueurs microsatellites tel que définis dans (6) et appartenant à cechromosome ont été utilisés pour affiner la cartographie du locus de résistance au RYMV. Lesmarqueurs microsatellites suivants ont été testés : RM241, RM252 (1), RM273 et RM 177 (6) 10 dans les conditions expérimentales définies dans (1) et (6). A l’exception du marqueur RM177non polymorphe entre les parents IR64 et Gigante, les marqueurs RM241, RM252, RM273 ontété cartographiés sur une population F2 (IR64 x Gigante) évaluée parallèlement pour larésistance au RYMV. Les résultats sur 183 individus F2 permettent de caractériser un intervalled’environ 3.6 cM borné par les deux locus microsatellites RM 252 et RM273 encadrant le gène 15 de résistance au RYMV.(voir figure 10 (a))

Exemple 14 : Cartographie fine de l’intervalle portant le locus de résistance etordonnancement des marqueurs de résistance dans l’intervalle M1-M2

Les 45 individus F2 (IR64 x Gigante) résistants et recombinants pour les marqueurs Ml 20 et M2 ont été caractérisés pour les marqueurs microsatellites identifiés dans l’exemple 13. Lacartographie des marqueurs en ségrégation sur la totalité des individus F2 (IR64 x Gigante)disponibles (321) confirme l’ordre et la distance entre les marqueurs de l’intervalle Ml - M2 eten particulier l’intervalle RM252 - RM273 qui est évalué à 3.6 cM (figure 10(b)). Les 45individus F2 (IR64 x Gigante) résistants et recombinants pour les marqueurs Ml et M2 25 permettent de confirmer l’ordre des marqueurs AFLP identifiés dans l’exemple 12. Un marqueurAFLP EACG/MACA reste compris dans l’intervalle RM252 - RM273 et représente le marqueurle plus proche du locus de résistance au RYMV (Tableau 9). Au total sur les 321 individus F2testés, il reste 20 individus recombinés d’un côté ou de l’autre du locus de résistance au RYMVet qui pourront être avantageusement utilisés pour identifier des marqueurs plus proches et/ou 30 cloner le gène de résistance. 119 7 5 33

Exemple 15 : Transfert de la résistance assistée par les marqueurs

Les marqueurs proches du locus de résistance ont été testés sur des variétés irriguées très sensibles au virus du RYMV (var. BG90-2, Bouakél 89, Jaya). 3 marqueurs(Ml, RM241, RM252) présentent un polymorphisme entre ces 3 variétés et la variété Gigante ce 5 qui permet d’envisager l’utilisation de ces marqueurs pour transférer la résistance dans desgénotypes sensibles. Le transfert expérimental de la résistance dans ces variétés a été réaliséjusqu’au niveau du 2eme recroisement. A chaque croisement, les plantes sont vérifiées pour laprésence des marqueurs en provenance de la variété Gigante et la ségrégation pour la résistanceest contrôlée par des tests de descendance sur F2. Les résultats sont donnés dans le tableau 10. D ~ TABLEAU 10 parent récurent Polymorphisme / parent donneur (Gigante) Génération obtenue % théorique parent récurent Nb de lignées obtenues M1 RM241 RM252 RM273 RM 177 8GSO-2 poly poly poly - - 8C2F2 97.5 4 Bouaké 189 poly poly poly - - SC2F2 37,5 1 Jaya poiy poly poly - - 3C2F2 97,5 2 IR64 poly poly poly poly * mono SC3 93,7 5 20 34 119 -/ 5 Références bibliographiques (1) Chen, X. et al., (1997), Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L) TheorAppl Genet 95 : 553-567. 5 (2) Panaud, O. , et al., (1996), Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L) Mol Gen Genet 252 :597-607. (3) Wu K.S. et al., (1993), Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites inrice. Mol Gen Genet 241 : 225-235. 10 (4) Zabeau et al.,.(1993), Sélective restriction fragment amplification : a general method for DNA fingerprinting. EP 92402629.7. (5) Vos et al., (1995), AFLP, a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research23:4407-4414. (6) Temnyck et al (2000) Theor Appl Genet 100 : 697-712 î 19 7 5

LISTE DE SEQUENCES

<110> I.R.D. et A.D.R.A.O <120> Moyens pour l'identification du locus d'un gène majeurde la résistance au virus de la panachure jaune du rizet leurs applications. <130> 59783-1157 <140> <141> <150> 9907334 <15l> 1999-06-21 <160> 12 <17Q> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 ». <211> 16

<212> ADN <2I3> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <400> 1 gactgcgtac caattc 16 <210> 2 <211> 16

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <400> 2 gatgagtcct gagtaa 16 <210> 3 <211> 472

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucleotide <400> 3 cgtgcttgct tatagcacta caggagaagç aaggggaaca caacagccat ggcgagcgaa 60 ggttcaacgt cggagaaaca ggctgcgacg çgcagcaagg tgccggcggc ggatcggagg 120 aaggaaaagg aggaaatcga agtcatgcrg çaggggctrg acctaagggc agatgaggag ISO gaggatgtgg aattggagga agatctagag çagcttgagg cagacgcaag atggctagcc 240 ctagccacag tzcatacgaa agtcaaggçg ctctcctcgg gagtatgcgc 300 tcagcatgga actgcgcgaa açaagc&amp;gat rrcagagcaa cgaaagacaa tctgttcccg 360 atccaattca attgtttggg gçancççgaa » 3» g U· U> â * â azgaaggtcc &amp; <- g 3. c cc u 420 ogaggatgtc O .J c ''-'l ÿ — — - 7*-gçccgç- ccaagatcga ac 472 36 119 7 5

<210> 4<211> 21<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificieile:Nuciéotide <400> 4 21 agçaaçggga acacaacagc <_ <210> 5 <211> 21

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle-.Nucléotide <400> 5 ttatgctçga ggggcttgac c . 2i <21O> 6 <211> 21

<212> ADN <21.3> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <400> 6 gcagttccat gdtgagcgca t 2* <210> 7 <211> 21

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <400> 7 21 ccgaacatcc tcgaaaggtc c <210> 8 <211> 21

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la sequence artmcierie:Nucléotcde <400> 3 21 CCâCâ-CCCÇf CÇâÇÇâÇCâC 2 ·

37

<210> 9<211> 121<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description ce la séquence artificreilerNucléotrce <400> 9 aattcacccc atgccctaag ccaççacgcc ctcagcttag tggtgtggta gcctcttcta SCttttcctaag cacccatcga agtacttcçc attggaggcg gcctcaççtc cgcccctgtt 1a 1 <210> 10 <211> 20

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <4Û0> 10 aacctaaggc cacctccaat 20 <210> li <211> 19

<212> ADN <213> Séquence arcificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:Nucléotide <400> 11 gcaaacctaa ggccacctc 13 <210> 12 <211> 19

<212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence arcificielle:Nucléotide <400> 12 attcacccca cgccctaag 19

Claims (3)

119/5 38 REVENDICATIONS 1/ Procédé pour l'identification de marqueurs du locus d'un gène majeur de 5 résistance à RYMV, caractérisé en ce qu'il comprend - l'amplification sélective de fragments d'ADN de riz d'une part d'individusrésistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragmentsayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer desadaptateurs complémentaires d'amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides 10 spécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation, - la séparation des produits d'amplification, par électrophorèse sur gel dans desconditions dénaturantes, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges defragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avec 15 les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont lepolymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie lecas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du tauxde recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance.

2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fragments d’ADN 20 sont obtenus par digestion des ADN génomiques de plantes résistantes d'une part, et de plantessensibles d'autre part, et de leurs parents, à l'aide d'enzymes de restriction. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise, commeenzymes de restriction, EcoRI et Msel. 4/ Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que les fragments de 25 restriction sont soumis à une ligation pour fixer des adaptateurs. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les fragments obtenus sont amplifiés à l'aide de couples d'amorces complémentaires des adaptateurs dont les séquencessont respectivement G AC TGC GTA CCA ATT C(SEQ ID N° 1) et GAT GAG TCC TGA GTAA (SEQ ID N°2).

3 119/5 39 6/ Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que les fragments obtenus sont amplifiés à l'aide de couples d'amorces possédant à leur extrémité, respectivement, ; · y,C'ZH'/i des motifs AAC et CAG, ACC et CAG, ou encore AGC et CAG. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par 5 l'identification de bandes marqueurs de résistance, Ml et M2, présentant respectivement destailles de 510 pb et 140 pb, telles que déterminées en électrophorèse sur gel en conditionsdénaturantes. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites bandesmarqueurs déterminent un segment inférieur à 10-15 cM portant le locus de résistance. 10 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites bandes marqueurs sont situées de part et d'autre du locus et à moins de 5-10 cM. 10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en cequ'il comprend en outre une étape d'isolement des bandes marqueurs identifiées. 11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé par la purification des bandes15 marqueurs isolées afin de disposer de fragments d’ADN. 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le clonage des bandesmarqueurs dans un vecteur et l'introduction du vecteur dans une cellule hôte. 13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisé par larécupération et le séquençage des fragments d'ADN purifiés, clonés. 20 14/ Procédé d'obtention de marqueurs de grande spécificité vis-à-vis du locus d'un gène majeur de résistance au RYMV, caractérisé en ce qu'on définit des couples d'amorces PCR X complémentaires de la séquence du fragment cloné, on procède à une amplification spécifique dece fragment à l'aide de ces couples d'amorces, puis on soumet les produits d'amplification à unemigration sur gel d'électrophorèse précédée ou non d'une digestion par enzyme de restriction 25 pour identifier un polymorphisme. 15/ Bandes AF LP polymorphes telles qu'identifiées par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14 à partir d'ADN de plantes de riz. 16/ Bandes AFLP selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles sont spécifiquement mises en évidence dans une variété sensible au RYMV, et dans la30 fraction de plantes sensibles issues du croisement de cette variété avec une variété résistante. 119 75 40 17/ Séquences d’ADN correspondant aux bandes polymorphes selon larevendication 15 ou 16, et qui permettent de définir un segment du chromosome 4 de 10-15 cMportant le locus de résistance au RYMV. 18/ Séquences d'ADN selon la revendication 17, caractérisées en ce qu'elles5 correspondent à des fragments EcoRI-Msel. 19/ Séquences d'ADN selon la revendication 18, caractérisées par une taillerespectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes. 20/ Séquences d’ADN selon l’une quelconque des revendications 17 à 19,caractérisées en ce qu’elles correspondent à des séquences flanquant le locus de résistance et 10 situées de part et d’autre de ce dernier à 5-10 cM ou même à moins de 5 cM.. 21/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle répond à SEQID N°3. 22/ Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle répond à SEQ ED N°9. 23/ Vecteurs de clonage, caractérisés en ce qu'ils comportent la séquence SEQ EDN°3 selon la revendication 21 ou la séquence SEQ ID N°9 selon la revendication 22. Z 15 24/ Cellules hôtes, caractérisées en ce qü'elles sont transformées par des vecteurs selon la revendication 22. 25/ Utilisation des bandes polymorphes selon la revendication 15 ou 16 ou desséquences d'ADN selon l'une quelconque des revendications 17 à 22 pour l'identification dephénotypes résistants et le transfert du gène de résistance. 20 26/ Fragments de 4-5cM au plus de chromosome 4 et bandes AFLP polymorphes selon la revendication 15 ou 16 définissant un segment de 4-5cM ou inférieur portant le locus derésistance au RYMV. , 27/ Utilisation de SEQ ID N°3 ou de SEQ ID N°9 ou de marqueurs microsatellites tels que RM252 et RM273 ou encore tout autre marqueur dans cet intervalle et 25 manisfestant un polymorphisme entre une variété sensible et une variété résistante pour transférerla résistance dans une variété sensible par sélection assistée par marqueur.