WO2000062809A1 - Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes - Google Patents

Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes Download PDF

Info

Publication number
WO2000062809A1
WO2000062809A1 PCT/JP2000/002544 JP0002544W WO0062809A1 WO 2000062809 A1 WO2000062809 A1 WO 2000062809A1 JP 0002544 W JP0002544 W JP 0002544W WO 0062809 A1 WO0062809 A1 WO 0062809A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
activin
androgen
substance
independent
fgf
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/002544
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Tanaka
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to CA002365449A priority Critical patent/CA2365449A1/en
Priority to AU38394/00A priority patent/AU777783B2/en
Priority to EP00917362A priority patent/EP1174149A1/en
Publication of WO2000062809A1 publication Critical patent/WO2000062809A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention relates to an androgen-independent tumor growth inhibitor, a therapeutic and diagnostic agent for androgen-independent tumor, a diagnostic method for androgen-independent tumor, and a method for screening an androgen-independent tumor growth inhibitor.
  • Prostate cancer is the second most frequent mortality rate of malignant tumors in adult males in Europe and the United States, and is increasing year by year in Japan. It can be said that prostate cancer is a frequent disease [Hideyuki Akaza, Cancer and Chemotherapy, 23s 401 (1996)]. Prostate cancer is known for having a special biological property called androgen dependence. Therefore, anti-androgen therapy is the main treatment in treating prostate cancer patients, and this therapy is effective in 80 to 90% of prostate cancer patients.
  • Shionogi carcinoma 115 a mouse breast cancer
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • Autocrine growth factors are substances that act on cells that produce growth factors themselves. Immunohistochemical staining of clinical tissue specimens using anti-FGF-8 antibody detects FGF-8 in human prostate cancer tissues at a high rate, indicating that FGF-8 is involved in hormone-dependent human prostate cancer. [Tanaka, A. et al., Cancer Research, 58, 2053 (1998)]. It has been reported that removing androgen from androgen-dependent mouse breast cancer cells Shionogi carcinoma 115 produces androgen-independent tumors [Kitamura, Y. et al., Cancer Research, 39, 4713 (1979)]. Furthermore, mouse breast cancer cells CAD021 [Noguchi, S.
  • Activin was discovered as a follicle-stimulating hormone FSH secretagogue that acts on the pituitary gland [Vale, W., et al., Nature, 231, 776 (1986)].
  • Activin consists of a 14-kilodalton activin / subunit dimer and is a growth factor belonging to TGF-superfamily because of its similarity in protein primary structure.
  • activin has been reported to include the promotion of pituitary FSH secretion, induction of erythroid differentiation, bone formation, maintenance of neurons, and promotion of insulin production [Vale, W., et al., Peptide growth factors and their receptors II, Editor Sporn, MB & Roberts, AB, published by Springer (1990)], but there is no known growth-promoting effect of androgen-independent tumors. Not.
  • Foristin is a FSH secretion inhibitor isolated from mammalian ovaries [Ueno, N. et al., Proceeding of National Academy of Science USA, 84, 8282 (1987)].
  • Foristin has binding properties to activin [Nakamura, T., et al., Science, 247, 836 (1990)], and has been reported to have an effect of neutralizing activin activity [Kogawa, K. ., Et al., Endocrinology, 128, 1434 (1991)].
  • it is not known to have an inhibitory effect on the growth of androgen-independent tumors.
  • the present inventors found that androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CAD021, which were derived from androgen-dependent mouse breast cancer cells, promoted proliferation of fibroblasts NIH3T3 and androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4.
  • Producing activin which is a growth factor that promotes, among three types of activin (activin A: / 3A / 3A, activin B: / 33B, activin AB:? A?
  • activin B is a growth inhibitor for androgen-independent tumors by inhibiting the substance, and completed the present invention.
  • FGF-8 which is known as an autocrine growth factor for androgen-dependent tumors
  • FGF-8 has a growth promoting effect not only on androgen-dependent tumors but also on androgen-independent tumors.
  • activin has an effect of promoting the growth of androgen-independent tumors in cooperation with FGF-8, and completed the present invention.
  • the present invention provides a growth inhibitor for androgen-independent cancer cells and an androgen. It relates to the diagnosis or treatment of independent tumors. That is, the present invention relates to the following (1) to (27).
  • androgen-independent tumors include prostate cancer and breast cancer.
  • the substance that suppresses the growth of an androgen-independent tumor is at least one selected from a substance having an activin inhibitory activity and a substance having a fibroblast growth factor-18 (FGF-8) inhibitory activity.
  • FGF-8 fibroblast growth factor-18
  • activin inhibitory activity Any substance having activin inhibitory activity may be used as long as it can inhibit the promotion of growth of androgen-independent tumors by activin.
  • activin neutralizing antibodies [DePaolo, LV, et al., Endocrinology, 130, 1741 (1991)]
  • activin receptor neutralizing antibodies follistin [Nakamura, T., et al., Science, 247, 836
  • substances having FGF-8 inhibitory activity include anti-FGF-8 neutralizing antibodies [Japanese Patent Laid-Open No. 9-271391; Tanaka, A. et al., Cancer Research, 58, 2053 (1998)], anti-FGF-8 receptor Neutralizing antibody, FGF-8 antisense RNA / DNA, FGF-8 binding protein, small molecule that can inhibit FGF-8 expression, low molecule that binds to FGF-8 and inhibits FGF-8 function Molecule, FGF-8 antagonists and their derivatives.
  • an anti-FGF-8 neutralizing antibody more preferably, an anti-FGF-8 neutralizing antibody KM1334 (FEBP-5451) is used.
  • the substance having activin inhibitory activity is a substance selected from anti-activin neutralizing antibody, anti-activin receptor neutralizing antibody, activin-binding protein and antisense DNA / RNA of activin, wherein (2) or ( 3) The inhibitor of androgen-independent tumor growth according to the above.
  • a therapeutic agent for androgen-independent tumors comprising as an active ingredient a substance that suppresses the growth of androgen-independent tumors.
  • the substance that suppresses the growth of an androgen-independent tumor is at least one selected from a substance having an activin inhibitory activity and a substance having a fibroblast growth factor-18 (FGF-8) inhibitory activity.
  • FGF-8 fibroblast growth factor-18
  • the substance having fibroblast growth factor-1 (FGF-8) inhibitory activity is selected from anti-FGF-8 neutralizing antibody, anti-FGF-8 receptor neutralizing antibody, and FGF-8 antisense DNA / RNA.
  • (21) Diagnosis of conversion from androgen-dependent cells to androgen-independent cells using a substance selected from anti-activin antibodies, activin-binding proteins, activin DNA / RNA, anti-FGF-8 antibodies and FGF-8 DNA / RNA Method.
  • An androgen-independent tumor diagnostic agent comprising as an active ingredient a substance selected from an anti-activin antibody, an activin-binding protein, an activin DNA / RNA, an anti-FGF-8 antibody and an FGF-8 DNA / MA.
  • (25) A method for screening an androgen-independent tumor growth inhibitor using a androgen-independent tumor growth agent.
  • a substance that inhibits the activity of promoting the growth of androgen-independent tumor cells can be screened.
  • Suitable growth factors for androgen-independent tumors include activin, FGF-8 and the like.
  • Screening methods include the MTT method and the 3H-TdR incorporation method described below.
  • the method comprises screening for an agent that inhibits the growth of androgen-independent cells.
  • Can be The substance obtained by the screening is useful as a therapeutic agent for androgen-independent tumor cells.
  • Proliferating substances of androgen-independent tumors can be isolated by the following method.
  • the androgen-independent tumor may be any androgen-independent cell capable of proliferating in an androgen-independent manner.
  • androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 androgen-independent mouse breast cancer cells CAD02U androgen-independent human prostate cancer cells DU145 (ATCC HTB-81), PC3 (ATCC CRL-1435) and the like.
  • a substance that proliferates an androgen-independent tumor which is produced by an androgen-independent tumor, can be obtained from a culture solution obtained by culturing tumor cells in an appropriate medium, or a cell lysate.
  • Isolation and purification of proliferative substances from androgen-independent tumors include solvent extraction, fractional precipitation with organic solvents, salting out, centrifugation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration, mouth chromatography, and hydrophobic chromatography. Separation operations such as affinity chromatography, reverse phase chromatography, crystallization, and electrophoresis can be performed alone or in combination.
  • the growth substance of androgen-independent tumor cells is identified by adding the growth substance to androgen-independent cells, culturing the cells, and measuring the number of proliferated cells by the MTT method (Tanaka, A.
  • activin [Vale, W. et al., Nature, 321, 76 (1986); Ling N., et al., As a growth substance of androgen-independent tumors produced by androgen-independent tumors. , Nature, 321, 779 (1986)], but activin can also be obtained using known gene recombination techniques (Molecular Cloning, 2nd edition). Wear.
  • the drug containing the substance inhibiting the activin activity of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually administered together with one or more pharmacologically acceptable carriers. It is desirable to mix and provide a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical arts.
  • intravenous administration can be preferably mentioned.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-hydroxybenzoic acid. It can be produced using preservatives such as acid esters and flavors such as bevel flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy It can be produced using a binder such as provyl cellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a protein, peptide or antibody can be freeze-dried according to a conventional method, and sodium chloride can be added thereto to prepare a powder injection.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the propellant is prepared using the compound itself or a carrier which does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption. Made.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the compound and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 mg / kg to 20 mg / kg per adult per day.
  • Detection or quantification of activin a proliferative substance produced by an androgen-independent tumor found in the present invention, is useful for diagnosis of an androgen-independent tumor.
  • a method for detecting or quantifying activin the following methods using an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin can be used.
  • Methods for detecting or quantifying activin in cells or tissues include immunological immunoassays such as immunofluorescence, immunoenzymatic immunoassay (ELISA), radiolabeled immunoassay (RIA), immunohistochemistry, and immunohistochemistry.
  • the fluorescent antibody method is an anti-activin antibody obtained by reacting activin present in cells or tissues with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then lapel with a fluorescent substance such as fluorescin-isothiosinate (FITC).
  • FITC fluorescin-isothiosinate
  • the immunoenzyme-linked immunosorbent assay is a reaction of activin present in cells or tissues with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and then enzymatic labeling such as veloxidase and biotin. This is a method in which a colored dye is measured with an absorptiometer after reacting with the applied antibody to anti-activin antibody or anti-forisutin antibody or a binding fragment thereof.
  • Radioactive substance-labeled immunoassay is an antibody to radioactively labeled anti-activin antibody, which reacts activin present in cells or tissues with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin. Or anti-fuori After reacting with antibodies or their binding fragments, measurement is performed using a scintillation counter or the like.
  • Immune cell staining and immunohistochemical staining refer to the reaction of activin present in cells or tissues with an activin-binding protein such as an anti-activin antibody or follistatin, and a fluorescent substance such as FITC, peroxidase, This is a method of reacting with an antibody against an anti-activin antibody labeled with an enzyme such as biotin or an anti-foris-u-tin antibody or a binding fragment thereof, and then observing with a microscope.
  • an activin-binding protein such as an anti-activin antibody or follistatin
  • a fluorescent substance such as FITC, peroxidase
  • Western blotting is a method in which activin present in cells or tissues is fractionated by SDS-Polyacrynoreamidogene electrophoresis [Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • Anti-activin antibody or anti-activin binding protein such as follistatin is allowed to react with the membrane and the membrane is reacted with a fluorescent substance such as FITC, and enzyme labeled with peroxidase and biotin.
  • FITC fluorescent substance
  • enzyme labeled with peroxidase and biotin This is a method in which an antibody against an activin antibody, an anti-fluorescein antibody, or a binding fragment thereof is reacted and then confirmed.
  • the dot blotting method is a method in which activin present in cells or tissues is plotted on a nitrocellulose membrane, and the membrane is reacted with an activin-binding protein such as an anti-activin antibody or follistatin, and a fluorescent substance such as FITC is used.
  • an activin-binding protein such as an anti-activin antibody or follistatin
  • a fluorescent substance such as FITC
  • Immunoprecipitation is a method of reacting activin present in cells or tissues with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose. To precipitate the antigen-antibody complex.
  • Northern blotting (New Cell Engineering Experimental Protocol, Shujunsha 1993), PCR (PCR Protocols, Academic Press, 1990), in situ analysis using DNA or RNA encoding activin, or oligonucleotides.
  • Northern blotting can detect or quantify activin in tissues or cells by genetic methods such as the hybridization method (in situ hybridization method, interdisciplinary project 1992). MRNA or total RNA is extracted from the tissue, fractionated by agarose gel electrophoresis (Molecular Cloning 2nd report), etc. After blotting the membrane on a nitrocellulose membrane, etc., and reacting the whole or part of the activin cDNA labeled with radiation or the like as a probe, it is present in cells or tissues by autoradiography etc. This is a method for confirming the activin iiiRNA.
  • the PCR method is to extract mRNA or whole MA from cells or tissues, add primers and polymerase designed based on the base sequence of activin, amplify the activin cDNA fragment, and confirm by agarose gel electrophoresis etc. How to
  • the in situ hybridization method is a reaction of activin mRNA present in cells or tissues with the full length or a part of activin cDNA labeled with biotin or the like as a probe, followed by enzyme-labeled avidin. This is a method of observing using a microscope after reacting the above.
  • FGF-8 and activin have an additional growth-promoting effect on androgen-independent tumors.Factor-dependent tumors and activin have different growth substances produced by non-independent tumors.
  • FGF-8 By detecting or quantifying FGF-8 alone or simultaneously, the conversion of an androgen-dependent tumor into an androgen-independent tumor can be monitored. Specifically, activin or FGF-8 present in cells or tissues is reacted with an anti-activin antibody or an activin-binding protein such as follistatin, and an anti-FGF-8 antibody, and by the various immunological methods described above, It can be performed by detection or quantification.
  • DNA or RNA encoding activin or FGF-8, or an oligonucleotide can be used to detect or quantify activin and FGF-8 alone simultaneously by the above-described genetic engineering technique.
  • FIG. 1 shows the growth promoting activity of androgen-independent mouse breast cancer cell SC-4 and CAD021 culture supernatant on mouse fibroblast NIH3T3.
  • Fig. 2 shows growth-promoting activity on mouse fibroblast NIH3T3 of the fraction obtained by purifying the culture supernatant of CAD021 androgen-independent mouse breast cancer cell CAD021 with a heparin sepharose column.
  • Fig. 3 Growth-promoting activity of fraction purified by heparin column and purified activin on mouse fibroblast NIH3T3 Shows an inhibitory effect.
  • Fig. 4 shows the results of detection of activin /? A in the fraction purified by a copper-chelating column by Western blotting.
  • FIG. 5 shows the growth promoting activity of purified activin A, activin B, activin AB, and a mixture of activin A and activin B on mouse fibroblast NIH3T3.
  • FIG. 6 shows the growth promoting activity of purified activin A, activin B, activin AB, and a mixture of activin A and activin B on androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4.
  • Fig. 7 shows the growth-promoting activity of purified activin A, activin B, activin AB, and a mixture of activin A and activin B in the presence of FGF-8 alone and in the presence of FGF-8 on androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 Show.
  • Fig. 8 Androgen-unstimulated mouse breast cancer cell SC-3 cells (lane 1), androgen-stimulated mouse breast cancer cell SC-3 cells (lane 2), androgen-unstimulated mouse breast cancer cell SC-4 cells (lane 3), androgen-stimulated Mouse breast cancer cells SC-4 cells (lane 4), androgen-unstimulated mouse breast cancer cells CAD021 cells (lane 5), androgen-stimulated mouse breast cancer cells CAD021 cells (lane 6), activin /? B, FGF-8 and G3PDH The result which detected mRNA by RT-PCR method is shown.
  • Androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 [Nonomura, N., et al., Cancer Research, 48, 4904 (1988)] and androgen-independent mouse breast cancer cells CAD021 [Noguchi, S. et al., Journal of Steroid Biochemistry, 32, 479 (1989)], to obtain growth factors produced by androgen-independent mouse mammary carcinoma cells SC-4 and CAD021, using mouse fibroblast cell line NIH3T3
  • the following analysis was performed using the growth promotion activity of cells [Tanaka, Ari et al., FEBS Letters, 363, 226 (1995)] as an index.
  • Parachlein growth factors are substances that act on other forms of cells adjacent to or near cells that produce growth factors.
  • DMEM Ham's F-12 (l: l, v / v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 2% fetal serum (FBS). They were cultured in 2 incubator scratch. The next day, the culture medium was replaced with a DMEM: Hajn's F-12 (l: l, v / v manufactured by Nissui Pharmaceutical Co.) medium without FBS. After further culturing for 48 hours, a total of 2 liters of the culture supernatant was collected.
  • NIH3T3 cells were suspended in DMEM: Ham, s F-12 (l: l, v / v Nissui Pharmaceutical) medium containing 2 ⁇ l of FBS treated with dextran charcoal, and 3 x 10 cells were added to each well of a 96-well plate. 3 cells / 100 ⁇ ⁇ 1 each were added and cultured. On the next day, the culture medium was removed, and 1% FBS-containing DMEM: Hajn's F-12 (l: l, v / v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing the test sample was added and cultured.
  • DMEM Ham's F-12 (l: l, v / v, Nissui Pharmaceutical) medium supplemented with 1% FBS was added. Two days later, the number of cells in the culture solution was measured using the MTT Atssay system according to the method described in the literature [Tanaka, A., et al., Cancer Research, 58, 2053 (1998)].
  • the culture supernatant of the and-orogen-independent mouse breast cancer cell SC-4 and the culture supernatant of the androgen-independent mouse breast cancer cell CAD021 shown in 1 above were used in the literature [Tanaka, A. et al., Proceeding of National Academy of Science USA, 89, 8928 (1992)], concentration operation was performed using Pellicon-Labocassette (manufactured by Millipore) for removing molecules having a molecular weight of 10 kDa or less. According to the method described in the literature [Tanaka, A.
  • the growth-promoting active substances in the androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CAD021 culture supernatant were eluted with 0.3 M NaCl in the purification using the heparin column described in the above (2).
  • the growth factor of FGF family has a high affinity for heparin [Burgess, WH et al., Annual Review of Biochemistry, 58, 575 (1989)], but the eluted growth promoting substance is heparin. Since it has a very low affinity for FGF, it was not considered to belong to the growth factor of FGF family.
  • the above-mentioned active substance was estimated to be a substance belonging to TGF (Transforming Growth Factor) -superfamily 1 because it has a growth promoting activity on fibroblast NIH3T3 cells.
  • TGF Transforming Growth Factor
  • the following analysis focusing on the activin [Munier, H. et al., Proceeding of National Academy of Science USA, 85, 247-251 (1988)], which is frequently expressed in endocrine organs in TGF-? Superfamily was done.
  • Add to recombinant cell-based Atsushi system, and further add recombinant ⁇ Human Phoristin (provided by Dr. Palow of National Hormone & Pituitary Program, USA: Journal of Endocrinology, 154, 535 (1997)) to final concentration ⁇ was added as follows.
  • Foristin is an activin-binding protein and has the ability to neutralize activin activity.
  • activin ⁇ (? Chain homodimer: /? A ⁇ B) [Hasegawa, Y., et al. 5 Hormone Research, 41 (supplement 1), 55 (1994)] and recombinant human inhibin A ( The growth promoting activity on NIH3T3 cells was examined by the method described in 1 above using a heavy chain /? Chain heterodimer: human A ⁇ B) (manufactured by National Hormone & Pituitary Program, USA). The results are shown in FIG. All three types of purified activin showed growth-promoting activity of NIH3T3 cells in a concentration-dependent manner.
  • inhibin A did not show any growth promoting activity on NIH3T3 cells. Therefore, it was clarified that the growth-promoting activity on NIH3T3 cells was specifically possessed by the homodimer of the chains (? 3 ⁇ , ⁇ , ⁇ 3 ⁇ ).
  • the androgen-independent mouse mammary carcinoma cells SC-4 were suspended in a DMEM: Ham's F-12 (l: l, v / v Nissui Pharmaceutical) medium containing 2% of FBS treated with dextran charcoal. 1.5 ⁇ 10 3 cells / 100 ⁇ 1 were added to each well of the rate and cultured. On the next day, the culture medium was removed, and 0.1% BSA-containing DMEM: Ham's F-12 (l: l, v / v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing the test sample was added and cultured.
  • DMEM Ham's F-12 (l: l, v / v, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing the test sample was added and cultured.
  • the culture medium was replaced, and after culturing for another day, the culture medium was cultured using the MTT assay system according to the method described in the literature [Tanaka, A., et al., Cancer Research, 58, 2053 (1998)]. The number of cells in was measured.
  • FGF-8 found as an autocrine-proliferating substance in androgen-dependent mouse breast cancer cells Shionogi carcinoma 115, is important as a proliferating substance in androgen-dependent tumors. Although reported to be present [Tanaka, A. et al., Proceeding of the National Academy of Science USA, 89, 8928 (1992)], no association with androgen-independent tumors is known. Thus, the effect of FGF-8 on the growth-promoting activity of purified activin B, a substance that proliferates androgen-independent cells, was examined in the same manner as described above.
  • activin B is a growth-promoting substance for androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4, and that FGF-8 has not only androgen-dependent cell growth activity but also androgen-independent mouse breast cancer cells SC- It was also revealed that FACT-8 also had a growth promoting activity, and that the activity of FGF-8 to promote the growth of androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 was further enhanced by activin B.
  • FGF-8 and activin mRNA in androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3 and androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CAD021 were detected and their expression fluctuations were examined by RT-PCR.
  • a primer set (Mouse G3PDH Control Amplimer Set) for detection of mouse G3PDH gene (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), which is a control gene usually used for studying gene expression levels, was purchased from Clonetech.
  • activin / -B chain mRNA was detected regardless of androgen stimulation.
  • activin-B chain mRNA was not detected in androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3 regardless of androgen stimulation.
  • FGF-8 mRNA was detected only in androgen-stimulated androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3, and in androgen-unstimulated androgen-dependent mouse breast cancer cells SC-3 and androgen-independent mouse breast cancer cells SC-4 and CAD021. Not detected.
  • the present invention is useful for treating and diagnosing an androgen-independent tumor, an androgen-independent tumor growth inhibitor, a therapeutic and diagnostic agent for an androgen-independent tumor, a method for diagnosing an androgen-independent tumor, androgen-independent
  • a method for screening for a substance that suppresses the growth of sexual tumor cells is provided.
  • SEQ ID NO: 2 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 3 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Description

¾ . アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤
技術分野
本発明は、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤、 アンドロゲン非依存性腫瘍の 治療薬および診断薬、 アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法、 ならびにアンドロゲン 非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法に関する。
背：景技術
前立腺癌は、 欧米の成人男子の悪性腫瘍の死亡率では第 2位、 日本においても年々 増加しており、頻度の高い疾患といえる [赤座英之、癌と化学療法、 23s 401 ( 1996) ]。 前立腺癌は、 アンドロゲン依存性という特殊な生物学的特性を有することで知られて いる。 そのため、 前立腺癌患者の治療方法としでは、 抗アンドロゲン療法が治療の主 体をなしており、 該療法が前立腺癌患者の 8 0〜9 0 %の症例に奏効する。
しかし、 抗アンドロゲン療法の最大の問題点は、 患者に対し、 抗アンドロゲン療法 を継続していくと、 いずれ該療法が無効になることである。 多くの場合、 抗アンド口 ゲン療法を開始した後、 数ケ月から数年で患者はアンドロゲン非依存性となり、 いつ たんアンドロゲン非依存性に陥ると、 6 ~ 1 8ヶ月で癌死に至る。
アンドロゲン非依存性腫瘍 （再燃癌ともいう） の有効な治療法はなく、 有効な治療 法が強く望まれている [赤座英之、 癌と化学療法、 、 401 (1996) ；平尾佳彦、 癌 と化学療法、 、 418 (1996) ] 。 また、 アンドロゲン依存性腫瘍かアンドロゲン非 依存性腫瘍かを適確に診断する方法、 およびアンドロゲン依存性より非依存性への変 化をモニタ一する診断方法も強く望まれている。
アンドロゲン依存性腫瘍からアンドロゲン非依存性腫瘍が誘導されるメカニズム はほとんど解明されていないが、以下に示すモデル実験系を利用した解析が試みられ ている。
マウス乳癌である Shionogi carcinoma 115は、 生理的な濃度のアンドロゲン存在 下で、 アンドロゲン依存性に増殖が見られることから、 ホルモン依存性の乳癌および 前立腺癌の実験モデルとして好適である [Koga, M. et al.， Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 54, 1 ( 1995) ]。 Shionogi carcinoma 115 腫瘍由来のアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 SC-3 より、 線維芽細胞増殖因子 (Fibroblast Growth Factor 以下、 FGF と略記する） フアミリーの増殖因子である FGF-8が単離され、 FGF-8はアンドロゲン依存性マゥス乳癌細胞 SC-3のオートクライ ン増殖因子であることが明らかとなった [Tanaka, A. etal., Proceeding of National Academy of Science USA, 89, 8928 (1992) ] 。 オートクライン増殖因子とは、 増殖 因子を産生する細胞自身に作用する物質である。抗 FGF-8抗体を用いた臨床組織標本 の免疫組織染色により、 ヒト前立腺癌組織には高率に FGF-8が検出されることから、 FGF-8 はホルモン依存的なヒト前立腺癌への関与が示唆されている [Tanaka, A. et al.， Cancer Research, 58, 2053 (1998) ] 。 アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 Shionogi carcinoma 115からアンドロゲンを除去することにより、 アンドロゲン非依 存性腫瘍を生じることが報告されている [Kitamura, Y. etal., Cancer Research, 39, 4713 (1979)] 。 さらに、 該アンドロゲン非依存性腫瘍からマウス乳癌細胞 CAD021 [Noguchi, S. et al.， Journal of Steroid Biochemistry, ， 479 (1989) ] およ びアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4 [Nonomura, N.， et al.， Cancer Research, ， 4904 (1988) ] が樹立されている。 しかしながら、 アンドロゲン非依 存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021の産生する増殖因子については解明されてい ない。
以上のように、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖に関与する増殖因子については、 解明されておらず、 アンドロゲン非依存性腫瘍に有効な診断および治療方法は確立さ れていない。
ァクチビンは、脳下垂体に働く卵胞刺激ホルモン FSH分泌促進因子として発見され た [Vale, W.， et al.， Nature, 231, 776 (1986) ] 。 ァクチビンは 14キロダルト ンのァクチビン/?サブュニッ卜のダイマ一よりなり、 タンパク質の一次構造上の類似 性から TGF- ?スーパ一フアミリーに属する増殖因子である。 ァクチビン/?サブュ ニヅトには/? Aおよび/? Bの 2種類が存在しているが、 3種類のダイマー/? A ?A、 3B ?B、 ?A ?Bが報告され、 それぞれァクチビン A (/3A/3A) 、 ァクチビン B
(/3 /3B) 、 ァクチビン AB (/3Αβ ) と命名されている [Vale, W., et al.， Peptide growth factors and their receptors II， Editor Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer社刊 (1990) ]。
これまでにァクチビンの機能としては、 脳下垂体 FSH分泌促進、 赤芽球分化誘導、 骨形成、神経細胞の維持、 ィンスリン生産促進作用等が報告されている [Vale, W.， et al. , Peptide growth factors and their receptors II, Editor Sporn, M.B. & Roberts, A. B.， Springer社刊 （1990) ] が、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖促進作用は知ら れていない。
フォリス夕チンは、 哺乳動物の卵巣より単離された F S H分泌抑制因子である [Ueno, N. et al . , Proceeding of National Academy of Science USA, 84, 8282 (1987) ] 。 フォリス夕チンはァクチビンに結合性を示し [Nakamura, T.， et al .， Science, 247, 836 ( 1990) ] 、 ァクチビン活性を中和する作用を示すことが報告さ れている [Kogawa, K.， et al . , Endocrinology, 128, 1434 ( 1991) ] 。 しかしなが ら、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制作用を有することについては、 知られてい ない。
発明の開示
アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖に関与する増殖因子の同定および当該増殖を抑 制するアンドロゲン非依存性腫瘍増殖抑制剤、 ならびに、 アンドロゲン非依存性腫瘍 に有効な診断薬および治療薬が求められている。 また、 アンドロゲン依存性腫瘍なら びに非依存性腫瘍を適確に診断する方法、 アンドロゲン依存性細胞よりアンドロゲン 非依存性細胞への変化をモニターする診断方法が望まれている。
本発明者らは、 アンドロゲン依存性マゥス乳癌細胞より誘導されたアンドロゲン非 依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021が、 繊維芽細胞 NIH3T3およびアンドロゲ ン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4細胞の増殖を促進する増殖因子であるァクチビンを 産生すること、 3種のァクチビン （ァクチビン A： /3 A /3 A , ァクチビン B ： /3 3 B、 ァクチビン A B ： ? A ? B ) の中で、 とくにァクチビン Bおよびァクチビン Aと ァクチビン B との混合物がアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC- 4細胞の増殖を 促進すること、 およびァクチビン阻害剤であるフォリス夕チンがアンドロゲン非依存 性乳癌細胞の産生する増殖促進活性物質を阻害することからフォリス夕チンがアン ド口ゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤となることを見出し、 本発明を完成させた。
さらに、 本発明者らは、 アンドロゲン依存性腫瘍のオートクライン増殖因子として 知られていた FGF- 8が、 アンドロゲン依存性腫瘍だけでなくアンドロゲン非依存性腫 瘍に対しても増殖促進作用を示すこと、 さらにァクチビンが FGF-8と協同してアンド ロゲン非依存性腫瘍の増殖促進作用を有することなども見出し、本発明を完成させた 本発明は、 アンドロゲン非依存性癌細胞の増殖抑制剤およびアンドロゲン非依存性腫 瘍の診断または治療に関する。 即ち本発明は以下の （ 1 ) 〜 （27) に関する。
( 1 ) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有する、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
アンドロゲン非依存性腫瘍としては、 具体的には、 前立腺癌、 乳癌などがあげられ る。
(2) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質および線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質から選ば れる少なくとも 1種である、 上記（ 1 )記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制 剤。
ァクチビン阻害活性を有する物質としては、ァクチビンによるアンドロゲン非依存 性腫瘍の増殖促進を阻害できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、 ァ クチビン中和抗体 [DePaolo, L. V.， et al. , Endocrinology, 130, 1741 (1991) ] 、 ァクチビン受容体中和抗体、フォリス夕チン [Nakamura, T.， etal . , Science, 247, 836
(1990) ； Kogawa, K. 5 et al. , Endocrinology, 128, 1434 ( 1991) ] 等のァクチ ビン結合蛋白質、 ァクチビンのアンチセンス RNA/DNA [Demura R, et al. , Endocrine Journal, 43, 403 (1996) ] 、 ァクチビンの発現を阻害することができる低分子、 ァ クチビンに結合してァクチビンの機能を阻害する低分子、 ァクチビンのアン夕ゴニス トおよび、 それらの誘導体等があげられる。好ましくは、 フォリス夕チンがあげられ 。
FGF-8阻害活性を有する物質としては、抗 FGF-8中和抗体 [特開平 9-271391 ;Tanaka， A. et al . , Cancer Research, 58， 2053 (1998) ] 、 抗 FGF-8受容体中和抗体、 FGF-8 のアンチセンス RNA/DNA、 FGF-8結合蛋白質、 FGF-8の発現を阻害することができる低 分子、 FGF-8に結合して FGF-8の機能を阻害する低分子、 FGF-8のアン夕ゴニストお よび、 それらの誘導体等があげられる。 好ましくは、 抗 FGF-8中和抗体、 より好まし くは、 抗 FGF-8中和抗体 KM1334(FE BP-5451 )があげられる。
上述のァクチビン阻害活性を有する物質および FGF-8阻害活性を有する物質は、単 独でもアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制するが、 ァクチビン阻害活性を有する 物質と FGF-8阻害活性を有する物質とを併用すれば、 より効果的にアンドロゲン非依 存性腫瘍の増殖を抑制することができる。
(3) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質である、 上記 （1 ) または （2 ) 記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖 抑制剤。 (4) ァクチビン阻害活性を有する物質が、 抗ァクチビン中和抗体、 抗ァクチビン 受容体中和抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビンのアンチセンス DNA/RNAか ら選ばれる物質である、上記 (2 )または ( 3 )記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑 制剤。
(5 ) ァクチビン結合蛋白質が、 フォリス夕チンである、 上記 （4 ) 記載のアンド 口ゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
(6 ) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質である、 上記 （ 1 ) または （2 ) 記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
(7) 線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質が、 抗 FGF-8中和 抗体である、 上記 （2 ) または （6 ) 記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
(8) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有する、 アンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
( 9) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質および線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質から選ば れる少なくとも 1種である、 上記 （8) 記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
( 10) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質である、 上記 （8) または ( 9 )記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
( 11 ) ァクチビン阻害活性を有する物質が、 抗ァクチビン中和抗体、 抗ァクチビン 受容体中和抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビンのアンチセンス DNA/RNAか ら選ばれる物質である、 上記 （9) または（10 )記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療 薬。
( 12) ァクチビン結合蛋白質が、 フォリス夕チンである、 上記 （11) 記載のアンド ロゲン非依存性腫瘍治療薬。
( 13) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質である、 上記 （8) または（9 )記載のアンドロゲン 非依存性腫瘍治療薬。
( 14) 線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質が、 抗 FGF-8 中和 抗体、 抗 FGF-8受容体中和抗体および FGF-8アンチセンス DNA/RNAから選ばれる物質 である、 上記 （7) または（13)記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。 (15) 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビン MA/RNAから選 ばれる物質を用いる、 ァクチビンの検出方法。
(16) ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 上記 （15) 記載のァクチビ ンの検出方法。
( 17) 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビン MA/RNAから選 ばれる物質を用いる、 ァクチビンの定量方法。
(18) ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 上記 （ 1 6 ) 記載のァクチ ビンの定量方法。
( 19) 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/ A、 抗 FGF-8 抗体および FGF-8 DNA/RNAから選ばれる物質を用いる、 アンドロゲン非依存性腫瘍の 診断方法。
(20) ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 上記 （19) 記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍の診断方法。
(21) 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/RNA、 抗 FGF-8 抗体および FGF-8 DNA/RNAから選ばれる物質を用いる、 アンドロゲン依存性細胞から アンドロゲン非依存性細胞への転換の診断方法。
(22) ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 上記 （21) 記載の診断方法 c
(23) 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/RNA、 抗 FGF - 8 抗体および FGF- 8 DNA/MAから選ばれる物質を有効成分として含有する、 アンドロゲ ン非依存性腫瘍診断薬。
(24) ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 上記 （23) 記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍診断薬。
(25) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質を用いた、 アンドロゲン非依存性腫瘍 の増殖抑制物質のスクリ一ニング方法。
本発明で見出されたアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖因子を用いて、 アンドロゲン 非依存性腫瘍細胞の増殖促進活性を阻害する物質のスクリーニングを行うことがで きる。 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖因子の好適なものとしては、 ァクチビン、 FGF-8等をあげることができる。
スクリーニング方法としては、後述する MTT法、 3H- TdR取り込み法などがあげられ る。該方法により、 アンドロゲン非依存性細胞の増殖を阻害する薬剤をスクリーニン グすることができる。 スクリーニングにより取得される物質は、 アンドロゲン非依存 性腫瘍細胞の治療薬として有用である。
(26) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質がァクチビンである、 上記 （25) 記載 のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
(27) アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質が線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) である、 上記 （25) 記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニン グ方法。
1 . アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質の単離および精製
アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質は以下に示す方法により単離することがで ぎる。
アンドロゲン非依存性腫瘍としては、 アンドロゲン依存性細胞より誘導された、 ァ ンドロゲン非依存性に増殖可能な細胞であればいかなるものでもよい。具体的には、 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4、 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD02U アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞 DU145 (ATCC HTB-81)、 PC3 (ATCC CRL-1435) 等があげられる。
アンドロゲン非依存性腫瘍の産生するアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質は、腫 瘍細胞を適当な培地中で培養することにより得られる培養液、 あるいは、 細胞の破砕 液より取得することができる。
アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質の単離 ·精製は、 溶媒抽出、 有機溶媒による 分別沈殿、 塩析、 遠心分離、 限外濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過ク 口マトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 結晶化、 電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わ せて行うことができる。 アンドロゲン非依存性腫瘍細胞の増殖物質の特定は、 アンド ロゲン非依存性細胞に該増殖物質を添加し培養後、 増殖した細胞数を M T T法 「Tanaka, A. et al .， Cancer Research, 58, 2053 (1998) j、 3 H-TdR取り込み法 [Tanaka, A. et al. , Proceeding of National Academy of Science USA, 89， 8928 (1992) ] 等で測定することにより行うことができる。
上記の方法により、 アンドロゲン非依存性腫瘍が産生するアンドロゲン非依存性腫 瘍の増殖物質として、 ァクチビン [Vale， W. et al . , Nature, 321, 76 ( 1986) ; Ling N.， et al . , Nature, 321, 779 ( 1986 )] が取得できるが、 ァクチビンは、 公知の遺 伝子組換え技術（モレキュラークロ一ニング 第 2版） 等を用いて取得することもで きる。
2 . アンドロゲン非依存性腫瘍の診断薬および治療薬
本発明のァクチビン活性を阻害する物質を含有する医薬は、治療薬として単独で投 与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担 体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造し た医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげる ことができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆 粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等 の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 スト 口ベリ一フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造で きる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等 の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロビルセルロース、 ゼラチ ン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤と して用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて 調製される。 または、 蛋白質、 ペプチドまたは抗体を常法に従って凍結乾燥し、 これ に塩化ナトリウムを加えることによつて粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤は該化合物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せ ず、 かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調 製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該化合物および用いる担 体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これら の非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。 投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重 等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10〃g/kg〜20mg/kgである。
3 . アンドロゲン非依存性腫瘍の診断方法
本発明で見出されたアンドロゲン非依存性腫瘍の産生する増殖物質であるァクチ ビンを検出または定量することは、 アンドロゲン非依存性腫瘍の診断に有用である。 ァクチビンの検出または定量方法としては、抗ァクチビン抗体またはフォリス夕チン などのァクチビン結合蛋白質などを用いた、 以下の方法等を用いることができる。 細胞または組織でのァクチビンの検出または定量方法としては、 蛍光抗体法、 免疫 酵素抗体法 （ELISA) 、 放射性物質標識免疫抗体法 （RIA) 、 免疫組織染色法、 免疫細 胞染色法などの免疫組織化学染色法 （ABC法、 CSA法等） 、 ウエスタンブロッテイン グ法、 ドットブロッティング法、 免疫沈降法 [単クローン抗体実験マニュアル （講談 社サイェンティフィック、 1987年）、 続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法（東京 化学同人、 1986年） ] などがあげられる。
蛍光抗体法とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 抗ァクチビン抗体また はフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質と反応させ、 さらにフルォレシン ·ィ ソチオシァネート （FITC) などの蛍光物質でラペルした抗ァクチビン抗体に対する抗 体あるいは抗フォリス夕チン抗体またはそれらの結合断片と反応させた後、蛍光色素 をフローサイ トメ一夕一で測定する方法である。
免疫酵素抗体法 （ELISA) とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 抗ァク チビン抗体またはフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質と反応させ、 さらにべ ルォキシダ一ゼ、 ビォチンなどの酵素標識などを施した抗ァクチビン抗体に対する抗 体あるいは抗フォリス夕チン抗体またはそれらの結合断片と反応させた後、発色色素 を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法 （RIA) とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 抗ァクチビン抗体またはフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質と反応させ、 さ らに放射線標識を施した抗ァクチビン抗体に対する抗体あるいは抗フオリ 抗体またはそれらの結合断片と反応させた後、 シンチレ一シヨンカウン夕一などで測 定する方法である。
免疫細胞染色法、 免疫組織染色法とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 抗ァクチビン抗体またはフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質と反応させ、 さ らに FITCなどの蛍光物質、 ペルォキシダ一ゼ、 ピオチンなどの酵素標識を施した抗 ァクチビン抗体に対する抗体あるいは抗フォリス夕チン抗体またはそれらの結合断 片と反応させた後、 顕微鏡を用いて観察する方法である。
ウエスタンブロッテイング法とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 SDS- ポリアクリノレアミ ドゲノレ電気永動 [Antibodies— A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ] で分画した後、 該ゲルを PVDF膜あるいはニトロセル口 —ス膜にブロッテイングし、該膜に抗ァクチビン抗体またはフォリス夕チンなどのァ クチビン結合蛋白質を反応させ、 さらに FITCなどの蛍光物質、 ペルォキシダーゼ、 ピオチンなどの酵素標識を施した抗ァクチビン抗体に対する抗体あるいは抗フオリ ス夕チン抗体またはそれらの結合断片を反応させた後、 確認する方法である。
ドットブロッテイング法とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 ニトロセ ルロース膜にプロッティングし、該膜に抗ァクチビン抗体またはフォリス夕チンなど のァクチビン結合蛋白質を反応させ、 さらに FITCなどの蛍光物質、 ペルォキシダー ゼ、 ピオチンなどの酵素標識を施した、 抗ァクチビン抗体に対する抗体あるいは抗フ オリス夕チン抗体またはそれらの結合断片を反応させた後、 確認する方法である。 免疫沈降法とは、 細胞または組織に存在するァクチビンを、 抗ァクチビン抗体また はフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質と反応させ、 プロテイン G—セファロ ース等のィムノグロプリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体 を沈降させる方法である。
また、 ァクチビンをコードする D NAあるいは R NA、 またはオリゴヌクレオチド を用いて、 ノーザンプロット法（新細胞工学実験プロトコール 秀潤社 1993年）、 PCR法 （PCR Protocols, Academic Press, 1990年）、 インサイッハイブリダィゼ一 シヨン法 （in situハイブリダィゼ一シヨン手法 学際企画 1992年） 等の遺伝子ェ 学的手法により、組織または細胞内のァクチビンを検出または定量することができる ノーザンプロット法とは、 細胞または組織より mRNAあるいは全 RNAを抽出し、 ァ ガロースゲル電気泳動 （モレキュラークロ一ニング 第 2報） 等で分画した後、 該ゲ ルをニトロセルロース膜等にブロッテイングし、該膜に放射線などの標識を施したァ クチビン cDNAの全長あるいは一部をプローブとして反応させた後、 オートラジオグ ラフィ一等により、 細胞あるいは組織に存在するァクチビンの iiiRNAを確認する方法 である。
PCR法とは、細胞または組織より mRNAあるいは全 MAを抽出し、 ァクチビンの塩基 配列に基づいて設計したプライマ一およびポリメラ一ゼ等を添加し、ァクチビン cDNA 断片を増幅し、 ァガロースゲル電気泳動等で確認する方法である。
ィンサイツハイブリダィゼーシヨン法とは、細胞または組織に存在するァクチビン mRNAに、 ピオチンなどの標識を施したァクチビン cDNAの全長あるいは一部をプロ一 ブとして反応させた後、 酵素標識したアビジン等を反応させた後、 顕微鏡を用いて観 察する方法である。
さらに、 FGF-8とァクチビンはアンドロゲン非依存性腫瘍に対して付加的増殖促進 作用を有しており、 さらに、 ホルモン依存性腫瘍と非依存性腫瘍が産生する増殖物質 が異なることから、 ァクチビンと FGF- 8とを単独あるいは同時に検出または定量する ことにより、 アンドロゲン依存性腫瘍からアンドロゲン非依存性腫瘍への変換をモニ 夕一することができる。 具体的には、 細胞または組織に存在するァクチビンまたは FGF-8を、 抗ァクチビン抗体あるいはフォリス夕チンなどのァクチビン結合蛋白質、 および抗 FGF-8抗体と反応させ、 上述した各種免疫学的方法により、 検出または定量 することにより行うことができる。
または、 ァクチビンまたは FGF-8をコードする DNAあるいは RNA、 またはオリゴヌ クレオチドを用いて、. 上述の遺伝子工学的手法によっても、 ァクチビンおよび FGF-8 を単独ある t、は同時に検出または定量することができる。
図面の簡単な説明
第 1図 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021培養上清のマウ ス繊維芽細胞 NIH3T3に対する増殖促進活性を示す。
第 2図 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021培養上清をへパリンセファ ロースカラムで精製した画分のマウス繊維芽細胞 NIH3T3 に対する増殖促進活性を示 す。
第 3図 へパリンカラムで精製した画分および精製ァクチビンのマウス繊維芽細胞 NIH3T3 に対する増殖促進活性および各々の増殖促進活性に対するフォリス夕チンの 阻害効果を示す。
第 4図 Copper- chelating カラムで精製した画分中のァクチビン/? Aをウェス夕 ンブロット法により検出した結果を示す。
第 5図 精製ァクチビン A , ァクチビン B、 ァクチビン A B、 およびァクチビン A とァクチビン Bとの混合物のマウス繊維芽細胞 N IH3T3に対する増殖促進活性を示す。 第 6図 精製ァクチビン A， ァクチビン B、 ァクチビン A B、 およびァクチビン A とァクチビン Bとの混合物のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4に対する増 殖促進活性を示す。
第 7図 FGF-8単独、 および FGF-8存在下における精製ァクチビン A， ァクチビン B、 ァクチビン A B、 およびァクチビン Aとァクチビン Bとの混合物のアンドロゲン 非依存性マウス乳癌細胞 SC- 4に対する増殖促進活性を示す。
第 8図 アンドロゲン無刺激マウス乳癌細胞 SC-3細胞 （レーン 1 ) 、 アンドロゲ ン刺激マウス乳癌細胞 SC-3細胞 （レーン 2 ) 、 アンドロゲン無刺激マウス乳癌細胞 SC-4細胞 （レーン 3 ) 、 アンドロゲン刺激マウス乳癌細胞 SC- 4細胞 （レーン 4 ) 、 アンドロゲン無刺激マウス乳癌細胞 CAD021細胞 （レーン 5 ) 、 アンドロゲン刺激マ ウス乳癌細胞 CAD021細胞（レーン 6 )の、ァクチビン/? B、 FGF-8および G3PDHの mRNA を RT-PCR法により検出した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
1 . アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021培養上清中のマウス 線維芽細胞 NIH3T3細胞に対する増殖促進作用
アン ドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4 [Nonomura, N. ， et al. ， Cancer Research, 48, 4904 ( 1988) ] およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021 [Noguchi, S. et al. ， Journal of Steroid Biochemistry, 32, 479 (1989) ] のォ —トクラインおよびパラクラィン増殖因子を取得する目的で、 アンドロゲン非依存性 マウス乳癌細胞 SC-4 および CAD021 の産生する増殖物質を、 マウス繊維芽細胞株 NIH3T3細胞 [Tanaka, Aリ et al. ， FEBS Letters, 363, 226 (1995) ] の増殖促進活 性を指標として、 以下のように解析した。 パラクライン増殖因子とは、 増殖因子を産 生する細胞に隣接または近傍の他の形態の細胞に作用する物質である。
0.5 X 106個のアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4または 0.8 x lO6個のアン ドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021 を、 デキストランチヤ一コール処理した牛 胎児血清 （FBS) を 2%含む DMEM:Ham' s F-12 (l : l、v/v 日水製薬社製） 培地にそれぞ れ懸濁して 100-雇ディッシュに加え、 37°C C02インキュベータ一中で培養した。 翌 日、 培養培地を FBSを含まない DMEM:Hajn' s F-12 (l : l、v/v 日水製薬社製） 培地に交 換した。 さらに 48時間培養後、 培養上清を計 2リットルずつ回収した。
NIH3T3細胞に対する増殖促進活性の評価
NIH3T3細胞をデキストランチャーコール処理した FBSを 2¾含む DMEM:Ham， s F-12 (l : l、v/v 日水製薬社製） 培地に懸濁し、 96ゥエルプレートの各ゥエルに 3 X 103細 胞 /100〃 1ずつ加え培養した。翌日、培養培地を除去し、被検サンプルを含む 1%FBS 添加 DMEM:Hajn' s F-12 (l : l、v/v 日水製薬社製） 培地 100 1を加え培養した。 さら に 2日間培養した後に、 培養培地を除去し、 1%FBS添加 DMEM:Ham' s F-12 (l : l、v/v 日 水製薬社製)培地 100 z lを加えて培養した。 2日後に文献 [Tanaka， A. , et al.， Cancer Research, 58, 2053 (1998) ] に記載の方法に従い、 MTTアツセィ系により培養液中 の細胞数を測定した。
その結果を第 1図に示した。被検サンプルとして上記アンド口ゲン非依存性マゥス 乳癌細胞 SC- 4培養上清をそれぞれ 50%、 100%添加すると、 NIH3T3細胞に対する増殖 促進活性は 132.5±11.3%、 158.8±3.1%であった。 また、 アンドロゲン非依存性マ ウス乳癌細胞 CAD021培養上清をそれぞれ 50%、 100%添加すると、 NIH3T3細胞に対す る増殖促進活性は 156.3±2.5%、 153.1±2.5%であった。以上より、 アンドロゲン非 依存性細胞の培養上清には、 NIH3T3細胞に対する増殖促進効果が認められた。
2 . アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4培養上清中のマウス繊維芽細胞 NIH3T3細胞に対する増殖促進活性物質の精製
上記 1に示したアンド口ゲン非依存性マゥス乳癌細胞 SC-4の培養上清およびアン ドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021 の培養上清を、 文献 [Tanaka, A. etal. , Proceeding of National Academy of Science USA, 89， 8928 (1992) ] 記載の方法 に従い、分子量 10キロダルトン以下の分子を除去する Pellicon-Labocassette (ミリ ポア社製） を用いて濃縮操作を行った。 文献 [Tanaka, A. et al.， Proceeding of National Academy of Science USA, 89, 8928 (1992) ] 記載の方法に従い、 得られ た濃縮培養上清を 0.1M NaCl、 0.1% CHAPS {3- [(3-cholamidopropyl )dimethylanimonio] -1-propanesulfonate和光純薬工業社製 }、 2 Μ フエ二ルメチルスルフォニルフルォ ライ ド， 200〃 g/ml ロイぺプチンを含む lOmM Tris/HCl緩衝液 （pH7.5) (以下、 平衡化緩衝液と記す） で平衡化したへパリンセファロ一スカラム （ゲル容積 1ml：ァ マシャムフアルマシアバイオテク社製） にのせた。
上記平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、 NaCl濃度 0.3M、 0.6M、 2Mを含む平衡化緩衝 液を各 10mlずつカラムに流し、 カラム吸着タンパクを 1mlずつ計 10本順次溶出した c へパリンカラム溶出画分の活性は、 上記 1に示した NIH3T3細胞を用いた増殖アツセ ィ系において溶出フラクション （最初の各 5本） を被検サンプルとして各 2 %添加し て検討した。
アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021培養上清を精製した結果を第 2図に 示した。 NIH3T3細胞の増殖促進活性物質は 0.3 NaCl溶出画分に回収された。 アンド ロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4培養上清についても、 NIH3T3細胞の増殖促進活 性物質は、 第 1表に示したように、 0.3MNaCl溶出画分に回収された。 第 1 表
サンブル NIH3T3細胞増殖活性
SC- 培養上清 +
\ノ リンカラム
0.3 NaCl溶出画分 +
0.6 M NaCl溶出画分
2 NaCl溶出画分
アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021培養上清については、 0.3M NaCl溶 出画分を回収し、 上記平衡化緩衝液で平衡化した Copper- chelatingカラム （ゲル容 量 0.8ml：フアルマシア社製） にのせた。平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、 2 mM、 5mM、 10mM、 20πιΜ イミダゾ一ルを含む平衡化緩衝液を各 5mlずつカラムに流し、 カラムに 吸着したタンパク質を順次溶出した。 溶出画分の活性は、 上記 1に示した NIH3T3細 胞を用いた増殖アツセィ系において溶出フラクションを被検サンプルとして各 2 % 添加して検討した。
その結果を第 2表に示した。 NIH3T3細胞の増殖促進活性は lOmM ィミダゾール溶 出画分に回収された。 先 2 表 サンプル NIH3T3細胞増殖活性 ヘメペ、リンカラム 0.3M NaCl溶出画分 4- し oppe「chelatingカラム
2m イミダゾ一ル溶出画分
5mM イミダゾ一ル溶出画分
10mM イミダゾ一ル溶出画分
20m イミダゾ一ル溶出画分
3 . アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4培養上清中の NIH3T3細胞増殖促進 活性物質の同定
アンドロゲン非依存性マゥス乳癌細胞 SC-4および CAD021培養上清中の増殖促進活 性物質は上記 2のへパリンカラムを用いた精製において 0.3M NaClで溶出された。 通常、 FGFフアミリ一の増殖因子は、へパリンへの親和性が高いが [Burgess, W. H. et al.， Annual Review of Biochemistry, 58, 575( 1989)] 、 溶出された増殖促進活性 物質はへパリンへの親和性が非常に弱いことから、 FGF フアミリーの増殖因子に属す るものではないと考えられた。
さらに、 上記活性物質は、 繊維芽細胞 NIH3T3細胞に対する増殖促進活性を有して いることから、 TGF (Transforming Growth Factor) - ?スーパ一ファミリ一に属する 物質と推定された。 TGF- ?スーパーフアミリーの中で内分泌系の臓器での発現が多い ァクチビン [Munier, H. et al. , Proceeding of National Academyof Science USA, 85, 247-251 (1988) ] に注目して以下の解析を行った。
上記 2で得られた NIH3T3細胞の増殖を促進する活性を有するアンドロゲン非依存 性マウス乳癌細胞 CAD021培養上清のへパリンカラムを用いた精製画分を 1 %となる ように、 上記 1で示した NIH3T3細胞を用いた増殖アツセィ系に添加し、 さらに組換 ぇヒトフオリス夕チン [米国 National Hormone & Pituitary Programの Palow博士 よりの供与： Journal of Endocrinology, 154, 535 (1997) ] を終濃度 ΙΟηΜになる ように添加した。 フォリス夕チンはァクチビン結合タンパク質であり、 ァクチビン活 性を中和する能力を有している。
その結果を第 3図に示した。 ヒトフオリス夕チンは終濃度 ΙΟηΜにおいて、 NIH3T3 細胞の増殖に対して効果を示さなかったが、へパリンカラムを用いて精製された画分 の有する NIH3T3細胞の増殖を促進する活性を阻害する作用を示した。 また、 陽性コ ントロールとして用いた精製したゥシァクチビン A ( ?鎖ホモ二量体： A ? A) [Hasegawa, Y. , et al. , Hormone Research, 41 (supplement 1 )，55 (1994) 」 は 10、 100ng/mlにおいて NIH3T3細胞の増殖を促進すること、 およびフオリス夕チンは ΙΟηΜ においてァクチビン Aの活性を阻害することが確認された。
アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 CAD021細胞の培養上清中の NIH3T3細胞に対 する増殖促進活性はフォリス夕チンにより阻害されたことから、 フォリス夕チン結合 因子として報告されているァクチビンの存在が示唆された。 そこで、 上記 2で示した、 Copper-chelatingカラムにより精製した NIH3T3細胞に対する増殖促進活性画分のァ クチビンの有無を、抗ァクチビン^ Aモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッ ト法を用いて以下のようにして検討した。
文献 [Tanaka, A.， et al. , Cancer Research, 58, 2053 (1998) ] の方法に従い、 10〜20%グラジェントポリアクリルアミ ドゲル （第一化学社製） を用いた SDS-PAGEを 以下のようにして行った。
上記 2で取得した Copper-chelating力ラムで精製した画分の 10分の 1量をゲルの レーンにのせた後電気泳動し、 泳動後、 該ゲルを PVDF膜 （バイオラッド社製） に転 写した。これに 10万倍希釈の抗ァクチビン/? Aモノクローナル抗体 [Miyamoto, K. et al. , BBRC, 136, 1103-1109 (1986) ] を反応させ、 ECL Plus detection kit (アマ シャム社製） を用いて添付プロトコ一ルに従い、 ァクチビン5 Aを検出した。
その結果を第 4図に示した。 Copper-chelatingカラムで精製した画分中に、抗ァク チビン/? Aモノクローナル抗体に反応する分子量約 14.8キロダルトン付近のバンド が検出された。 また、 バンドの移動度は陽性コントロールのヒト組換えインヒビン A [ァクチビン/? A鎖 （分子量 18キロダルトン） とインヒビンひ （分子量 18キロダル トン） のへテロダイマ一] 中のァクチビン/? Aのバンドと一致した。 従って、 Copper-chelatingカラムで精製した画分中にはァクチビン/? Aが含まれることが明 らかとなつた。 ァクチビンが NIH3T3細胞の増殖促進活性物質であることを確認する目的で、 精製 したゥシァクチビン A ( /5鎖ホモ二量体： ? A ? A)、ァクチビン B ( 3鎖ホモ二量体：
B B)、ァクチビン ΑΒ ( ?鎖ホモ二量体：/? A β B) [Hasegawa, Y.， et al.5 Hormone Research, 41 (supplement 1), 55 (1994) ] および組換えヒトインヒビン A (ひ鎖/? 鎖へテロ二量体： ひ A ^ B) (米国 National Hormone & Pituitary Program製） を用 いて、 上記 1に示した方法により NIH3T3細胞に対する増殖促進活性を検討した。 その結果を第 5図に示した。 3 種の精製ァクチビンは、 全て濃度依存的に NIH3T3 細胞の増殖促進活性を示した。 一方、 インヒビン Aは NIH3T3細胞に対する増殖促進 活性を全く示さなかった。従って、 NIH3T3細胞に対する増殖促進活性は、 鎖のホモ 二量体 （ ? Α 3 Α、 β , ? Α 3 Β) が特異的に有することが明らかとなった。
4 . アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4に対するァクチビンの増殖促進効 果
ァクチビンのアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4の増殖に対する効果につ いて、 上記 3で示した精製したゥシァクチビン Α、 ァクチビン Βおよびァクチビン ΑΒ を用いて検討した。
アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4をデキストランチャ一コール処理した FBSを 2¾含む DMEM:Ham' s F-12 (l : l、v/v 日水製薬社製） 培地で懸濁し、 96ゥエルプ レートの各ゥエルに 1.5 X 103細胞/ 100〃1ずつ加え培養した。 翌日、 培養培地を除 去し被検サンプルを含む 0.1%BSA添加 DMEM:Ham' s F-12 (l : l、v/v日水製薬社製） 培 地 100 1加え培養した。 2日後に培養培地を交換し、 さらに 1日間培養した後に文 献 [Tanaka, A.， et al. , Cancer Research, 58, 2053 (1998) ] に記載の方法に従 レヽ MTTアツセィ系により培養液中の細胞数を測定した。
結果を第 6図に示した。ァクチビン Bおよびァクチビン Aとァクチビン Bの混合物 を 100ng/mlの濃度で添加すると、 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4の増殖 は無添加に比べて、 それぞれ 145t 138%になった。 一方、 ァクチビン Aおよびァクチ ビン ABを添加した場合の増殖は無添加に比べて、 それぞれ 110%、 100%であった。 従 つて、 3種のァクチビンの中でも、 ァクチビン Bのアンドロゲン非依存性マウス乳癌 細胞 SC-4に対する増殖促進活性が最も高いことが明らかとなった。
アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 Shionogi carcinoma 115のオートクライン増 殖物質として見出された FGF-8は、 アンドロゲン依存性腫瘍の増殖物質として重要で あると報告されてレヽる [Tanaka, A. et al . , Proceeding of National Academy of Science USA, 89, 8928 ( 1992) ] が、 アンドロゲン非依存性腫瘍での関連について は知られていない。 そこで、 アンドロゲン非依存性細胞の増殖物質である精製ァクチ ビン Bの増殖促進活性に及ぼす FGF-8の効果について、 上記に示した方法と同様に検 討した。
その結果を第 7図に示した。 精製 FGF- 8 [Tanaka, A. , et al . , FEBS Letters, 363, 226 ( 1995) ]は、 50 ng/mlにおいて単独でアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4 の増殖を促進する活性を有していた。 さらに、 ァクチビン Bおよびァクチビン Aとァ クチビン Bとの混合物は、 100ng/mlの濃度において FGF-8の有するアンドロゲン非依 存性マウス乳癌細胞 SC-4増殖促進活性をさらに増強する作用を示した。 ァクチビン Aおよびァクチビン ABには FGF-8による増殖促進活性を増強する作用は認められな かった。
以上の結果から、 ァクチビン Bがアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4の増 殖促進物質であること、 FGF-8はアンドロゲン依存性細胞増殖活性のみならずアンド ロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4に対しても増殖促進活性を有すること、 および FGF-8の有するアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4増殖促進活性はァクチビ ン Bによりさらに増強されることが明らかとなった。
5 . RT-PCR法によるアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 SC-3、 アンドロゲン非依 存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021における FGF-8およびァクチビン mRNAの検 出
アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 SC-3、 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021における、 FGF-8およびァクチビンの mRNAの検出および発現変動 を、 RT-PCR法により検討した。
アンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 SC-3、 アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4 および CAD021 細胞へのアンドロゲン刺激は、 文献 [Tanaka, A. et al . , Proceeding of National Academy of Science USA, 89， 8928 ( 1992) ] 記載の方法 に従い行った。細胞からの全 RNAの調製および RT- PCR法は、文献 [Tanaka, A. , et al .， FEBS Letters, 363, 226 ( 1995) ] 記載の方法に従い行った。 RT-PCR法は上述の文献 記載の方法で 4 8時間行い、 また、 用いたプライマーは、 マウスァクチビン/? B検出 プライマ一セットとして、 配列番号 1および 2記載の合成 DM、 マウス FGF-8検出用 プライマ一セットとして、 配列番号 3および 4記載の合成 DNAをそれぞれ用いた。遺 伝子の発現量の検討のために通常用いられるコントロール遺伝子であるマウス G3PDH 遺伝子 ( Glyceraldehyde - 3 - phosphate Dehydrogenase )検出用プライマ一セッ卜 (Mouse G3PDH Control Amplimer Set) はクローンテック社より購入した。
その結果を第 8図に示した。 コントロール遺伝子 G3PDHの PCRバンドが全て同等で あることから、実験に用いたアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞 SC-3、 アンドロゲン 非依存性マウス乳癌細胞 SC- 4および CAD021の mRNA量は同等であることが確認され た。
アンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021では、 アンドロゲン刺激 および無刺激に関わらずァクチビン/? B鎖 mRNAが検出された。 一方、 アンドロゲン 依存性マウス乳癌細胞 SC-3ではアンドロゲン刺激および無刺激に関わらずァクチビ ン ? B鎖 mRNAは検出されなかった。 FGF-8 mRNAはアンドロゲン刺激したアンドロゲ ン依存性マウス乳癌細胞 SC-3のみに検出され、 アンドロゲン無刺激アンドロゲン依 存性マウス乳癌細胞 SC- 3 およびアンドロゲン非依存性マウス乳癌細胞 SC-4および CAD021では検出されなかった。
以上の結果から、 アンドロゲン依存性腫瘍は、 アンドロゲン刺激下で FGF-8を産生 するが、 ァクチビン を産生しないことが明らかとなった。 また、 アンドロゲン非 依存性腫瘍は FGF-8を産生しないが、 ァクチビン/? B鎖を産生することが明らかとな つた。 この結果は、 アンドロゲン依存性から非依存性に変換する際に細胞は FGF-8産 生能を失い、 ァクチビン 3 B産生能を獲得することを示している。 従って、 細胞の FGF-8およびァクチビン/? B鎖の産生能を検出することにより、 アンドロゲン依存性 細胞から非依存性細胞への変換を診断することができる。
産業上の利用可能性
本発明によりアンドロゲン非依存性腫瘍の治療および診断に有用なアンドロゲン 非依存性腫瘍の増殖抑制剤、 アンドロゲン非依存性腫瘍の治療薬および診断薬、 アン ドロゲン非依存性腫瘍の診断方法、 アンドロゲン非依存性腫瘍細胞の増殖抑制物質の スクリーニング方法が提供される。
「配列表フリ一テキスト」
配列番号 1一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 2—人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 3—人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 4一人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
1. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有する、 アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
2. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質および線維芽細胞増殖因子— 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質から選ば れる少なくとも 1種である、請求項 1記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
3. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質である、請求項 1または 2記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
4. ァクチビン阻害活性を有する物質が、 抗ァクチビン中和抗体、 抗ァクチビン 受容体中和抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビンのアンチセンス DM/RNAか ら選ばれる物質である、 請求項 2または 3記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑 制剤。
5. ァクチビン結合蛋白質が、 フォリス夕チンである、 請求項 4記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
6. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質である、 請求項 1または 2記載のアンドロゲン非 依存性腫瘍の増殖抑制剤。
7. 線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質が、 抗 FGF- 8中和抗 体、 抗 FGF-8受容体中和抗体および FGF- 8アンチセンス DNA/RNAから選ばれる物質で ある、 請求項 2または 6記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制剤。
8. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質を有効成分として含有する、 アンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
9. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質および線維芽細胞増殖因子一 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質から選ば れる少なくとも 1種である、 請求項 8記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
10. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 ァクチビン阻害活性を 有する物質である、 請求項 8または 9記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
11. ァクチビン阻害活性を有する物質が、 抗ァクチビン中和抗体、 抗ァクチビン 受容体中和抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビンのアンチセンス DNA/RNAか ら選ばれる物質である、 請求項 9または 10記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
12. ァクチビン結合蛋白質が、 フォリス夕チンである、 請求項 11記載のアンド ロゲン非依存性腫瘍治療薬。
13. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖を抑制する物質が、 線維芽細胞増殖因子— 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質である、 請求項 8または 9記載のアンドロゲン非 依存性腫瘍治療薬。
14. 線維芽細胞増殖因子— 8 (FGF-8) 阻害活性を有する物質が、 抗 FGF-8 中和 抗体、 抗 FGF-8受容体中和抗体および FGF-8アンチセンス DNA/MAから選ばれる物質 である、 請求項 7または 13記載のアンドロゲン非依存性腫瘍治療薬。
15. 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビン DNA/MAから選 ばれる物質を用いる、 ァクチビンの検出方法。
16. ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 請求項 15記載のァクチビ ンの検出方法。
17. 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質およびァクチビン DNA/MAから選 ばれる物質を用いる、 ァクチビンの定量方法。
18. ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 請求項 1 6記載のァクチビ ンの定量方法。
19. 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/MA、 抗 FGF-8 抗体および FGF-8 DNA/RNAから選ばれる物質を用いる、 アンドロゲン非依存性腫瘍の 診断方法。
20. ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 請求項 19記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍の診断方法。
21. 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/RNA、 抗 FGF-8 抗体および FGF-8 DNA/RNAから選ばれる物質を用いる、 アンドロゲン依存性細胞から アンドロゲン非依存性細胞への転換の診断方法。
22. ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 請求項 21記載の診断方法。
23. 抗ァクチビン抗体、 ァクチビン結合蛋白質、 ァクチビン DNA/RNA、 抗 FGF-8 抗体および FGF-8 DNA/MAから選ばれる物質を有効成分として含有する、 アンドロゲ ン非依存性腫瘍診断薬。
24. ァクチビン結合蛋白質がフォリス夕チンである、 請求項 23記載のアンド口 ゲン非依存性腫瘍診断薬。
25. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質を用いた、 アンドロゲン非依存性腫瘍 の増殖抑制物質のスクリ一ニング方法。
26. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質がァクチビンである、 請求項 25記載 のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
27. アンドロゲン非依存性腫瘍の増殖物質が線維芽細胞増殖因子— 8 (FGF-8) である、 請求項 25記載のアンドロゲン非依存性腫瘍の増殖抑制物質のスクリーニン グ方法。
PCT/JP2000/002544 1999-04-19 2000-04-19 Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes WO2000062809A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002365449A CA2365449A1 (en) 1999-04-19 2000-04-19 Inhibitor of the growth of androgen-independent tumor
AU38394/00A AU777783B2 (en) 1999-04-19 2000-04-19 Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
EP00917362A EP1174149A1 (en) 1999-04-19 2000-04-19 Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11102699 1999-04-19
JP11/111026 1999-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000062809A1 true WO2000062809A1 (fr) 2000-10-26

Family

ID=14550524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/002544 WO2000062809A1 (fr) 1999-04-19 2000-04-19 Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1174149A1 (ja)
AU (1) AU777783B2 (ja)
CA (1) CA2365449A1 (ja)
WO (1) WO2000062809A1 (ja)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003057251A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Remedes contre l'arthrite
JP2010518006A (ja) * 2007-02-01 2010-05-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US9138459B2 (en) 2004-07-23 2015-09-22 Acceleron Pharma Inc. ACTRIIB-FC polynucleotides, polypeptides, and compositions
US9163075B2 (en) 2005-11-23 2015-10-20 Acceleron Pharma Inc. Isolated polynucleotide that encodes an ActRIIa-Fc fusion polypeptide
US9181533B2 (en) 2009-06-12 2015-11-10 Acceleron Pharma, Inc. Truncated ACTRIIB-FC fusion protein
US9353356B2 (en) 2007-09-18 2016-05-31 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists for treating a follicle-stimulating horomone-secreting pituitary tumor
US9399669B2 (en) 2007-02-02 2016-07-26 Acceleron Pharma Inc. Variants derived from ActRIIB
US9480742B2 (en) 2005-11-23 2016-11-01 Acceleron Pharma Inc. Method of promoting bone growth by an anti-actriia antibody
US9493556B2 (en) 2010-11-08 2016-11-15 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
US9505813B2 (en) 2008-08-14 2016-11-29 Acceleron Pharma Inc. Use of GDF traps to treat anemia
US9572865B2 (en) 2005-11-23 2017-02-21 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating multiple myeloma
US9790284B2 (en) 2009-06-08 2017-10-17 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US9850298B2 (en) 2014-06-13 2017-12-26 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating ulcers in thalassemia syndrome with an ActRIIB polypeptide
US9932379B2 (en) 2008-08-14 2018-04-03 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleotide sequences encoding GDF traps
US10093707B2 (en) 2006-12-18 2018-10-09 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of activin-ActRIIa and uses for increasing red blood cell levels
US10195249B2 (en) 2012-11-02 2019-02-05 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating bone and other disorders
US11471510B2 (en) 2014-12-03 2022-10-18 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating anemia
US11813308B2 (en) 2014-10-09 2023-11-14 Celgene Corporation Treatment of cardiovascular disease using ActRII ligand traps

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20020191A1 (it) * 2002-04-08 2003-10-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso della pentraxina lunga ptx3 per la preparazione di un medicamentoper il trattamento di patologie tumorali associate ad una alterata att
AU2002953327A0 (en) * 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
RS52537B (en) 2006-12-18 2013-04-30 Acceleron Pharma Inc. ACTIVIN-ACTRII ANTAGONISTS AND USES FOR ANEMIA TREATMENT
CA2729100C (en) 2008-06-26 2018-01-02 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
US8138142B2 (en) 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
US10010498B2 (en) 2014-06-04 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis with follistatin fusion proteins
BR112016028520A2 (pt) 2014-06-04 2017-10-24 Acceleron Pharma Inc métodos e composições para o tratamento de transtornos com polipeptídeos de folistatina
JP2018510637A (ja) 2015-03-26 2018-04-19 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド フォリスタチン関連融合タンパク質およびその使用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994006456A1 (en) * 1992-09-16 1994-03-31 Genentech, Inc. Protection against liver damage by hgf
WO1994019455A1 (en) * 1993-02-23 1994-09-01 Genentech, Inc. In vitro maturation of oocytes with inhibin, activin or inhibin/activin combinations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994006456A1 (en) * 1992-09-16 1994-03-31 Genentech, Inc. Protection against liver damage by hgf
WO1994019455A1 (en) * 1993-02-23 1994-09-01 Genentech, Inc. In vitro maturation of oocytes with inhibin, activin or inhibin/activin combinations

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MCPHERSON S.J. ET AL.: "Growth inhibitory response to activin A and B by human prostate tumor cell lines, LNCaP and DU145", J. ENDOCRINOL., vol. 154, no. 3, 1997, pages 535 - 545, XP002929639 *
SCHMITT J.F. ET AL.: "Expression of fibroblast growth factor-8 in adult rat tissues and human prostate carcinoma cells", J. STEROID BIOCHEM. MOL. BIOL., vol. 57, no. 3/4, 1996, pages 173 - 178, XP002929640 *
YING SHAO-YAO ET AL.: "Expression of activin and activin receptors in PC3 human prostatic cancer cells", INT J. ONCOL., vol. 6, no. 3, 1995, pages 601 - 606, XP000912104 *

Cited By (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100389826C (zh) * 2001-12-28 2008-05-28 协和发酵工业株式会社 关节炎的治疗药
US7708999B2 (en) 2001-12-28 2010-05-04 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Remedies for arthritis
WO2003057251A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Remedes contre l'arthrite
US9138459B2 (en) 2004-07-23 2015-09-22 Acceleron Pharma Inc. ACTRIIB-FC polynucleotides, polypeptides, and compositions
US10071135B2 (en) 2005-11-23 2018-09-11 Acceleron Pharma Inc. Method of identifying an agent that promotes bone growth or increases bone density
US9480742B2 (en) 2005-11-23 2016-11-01 Acceleron Pharma Inc. Method of promoting bone growth by an anti-actriia antibody
US10239940B2 (en) 2005-11-23 2019-03-26 Acceleron Pharma Inc. Method of promoting bone growth by an anti-actriia antibody
US9163075B2 (en) 2005-11-23 2015-10-20 Acceleron Pharma Inc. Isolated polynucleotide that encodes an ActRIIa-Fc fusion polypeptide
US9572865B2 (en) 2005-11-23 2017-02-21 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating multiple myeloma
US11129873B2 (en) 2005-11-23 2021-09-28 Acceleron Pharma Inc. Method for promoting bone growth using activin-actriia antagonists
US10093707B2 (en) 2006-12-18 2018-10-09 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of activin-ActRIIa and uses for increasing red blood cell levels
JP2010518006A (ja) * 2007-02-01 2010-05-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
US9526759B2 (en) 2007-02-01 2016-12-27 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
JP2017031217A (ja) * 2007-02-01 2017-02-09 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
JP2013177390A (ja) * 2007-02-01 2013-09-09 Acceleron Pharma Inc 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
US10259861B2 (en) 2007-02-02 2019-04-16 Acceleron Pharma Inc. Variants derived from ActRIIB and uses therefor
US9399669B2 (en) 2007-02-02 2016-07-26 Acceleron Pharma Inc. Variants derived from ActRIIB
US9353356B2 (en) 2007-09-18 2016-05-31 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists for treating a follicle-stimulating horomone-secreting pituitary tumor
US11155791B2 (en) 2008-08-14 2021-10-26 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating anemia in a subject in need thereof
US10377996B2 (en) 2008-08-14 2019-08-13 Acceleron Pharma Inc. Methods of identifying ActRIIB variants
US11168311B2 (en) 2008-08-14 2021-11-09 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating anemia in a subject in need thereof
US11162085B2 (en) 2008-08-14 2021-11-02 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating anemia in a subject in need thereof
US10889626B2 (en) 2008-08-14 2021-01-12 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US10829533B2 (en) 2008-08-14 2020-11-10 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US9932379B2 (en) 2008-08-14 2018-04-03 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleotide sequences encoding GDF traps
US10829532B2 (en) 2008-08-14 2020-11-10 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US9505813B2 (en) 2008-08-14 2016-11-29 Acceleron Pharma Inc. Use of GDF traps to treat anemia
US10689427B2 (en) 2008-08-14 2020-06-23 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
US9790284B2 (en) 2009-06-08 2017-10-17 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US10968282B2 (en) 2009-06-08 2021-04-06 Acceleron Pharma Inc. Methods for screening compounds for increasing thermogenic adipocytes
US11066654B2 (en) 2009-06-12 2021-07-20 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions for reducing serum lipids
US10358633B2 (en) 2009-06-12 2019-07-23 Acceleron Pharma Inc. Method for producing an ActRIIB-Fc fusion polypeptide
US9181533B2 (en) 2009-06-12 2015-11-10 Acceleron Pharma, Inc. Truncated ACTRIIB-FC fusion protein
US9745559B2 (en) 2009-06-12 2017-08-29 Acceleron Pharma Inc. Method for decreasing the body fat content in a subject by administering an ActRIIB protein
US9617319B2 (en) 2009-11-17 2017-04-11 Acceleron Pharma Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US10968262B2 (en) 2009-11-17 2021-04-06 Acceleron Pharma Inc. Methods of increasing sarcolemmal utrophin
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US9493556B2 (en) 2010-11-08 2016-11-15 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
US10195249B2 (en) 2012-11-02 2019-02-05 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating bone and other disorders
US10487144B2 (en) 2014-06-13 2019-11-26 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating ulcers in a hemoglobinopathy anemia with a soluble actRIIB polypeptide
US9850298B2 (en) 2014-06-13 2017-12-26 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating ulcers in thalassemia syndrome with an ActRIIB polypeptide
US11260107B2 (en) 2014-06-13 2022-03-01 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions for treating ulcers
US11813308B2 (en) 2014-10-09 2023-11-14 Celgene Corporation Treatment of cardiovascular disease using ActRII ligand traps
US11471510B2 (en) 2014-12-03 2022-10-18 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating anemia

Also Published As

Publication number Publication date
CA2365449A1 (en) 2000-10-26
EP1174149A1 (en) 2002-01-23
AU777783B2 (en) 2004-10-28
AU3839400A (en) 2000-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2000062809A1 (fr) Inhibiteur de proliferation cellulaire pour tumeurs androgeno-independantes
EP1414477B1 (en) Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic interventions
KR101828290B1 (ko) 자궁내막암 마커
US7361511B2 (en) Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
KR101617497B1 (ko) Slit3의 lrr2 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN109517898B (zh) 一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及rnd2基因的应用
JP2002517244A (ja) 前立腺癌において示差的に調節される遺伝子および遺伝子発現産物
KR102216590B1 (ko) 췌장 신경내분비종양의 진단을 위한 조성물
KR102180982B1 (ko) 갑상선암 진단 또는 예후 예측용 adm2 유전자 마커 및 이의 용도
NZ544456A (en) Treatment and diagnosis of neoplasms using thymic stromal lymphopoietin
CA2991076A1 (en) Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using slit2
EP1385993B1 (en) Method of detecting and treating tuberous sclerosis complex associated disorders
JP2008507261A (ja) 肺癌診断のための新規のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびにそのアッセイおよび使用方法
KR20200086542A (ko) 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물
EP2307561A2 (en) Interferon epsilon (ifne1) as a marker for targeted cancer therapy
WO2005093063A1 (ja) 固形癌診断キット及び固形癌治療用医薬
US20070298022A1 (en) Identification of Phospholipase A2 as Target in Cancer Treatment, with Special Emphasis on Colorectal Cancer and Its Mechanism of Action
US6833241B2 (en) Mammary gland chemokine
AU2008201989A1 (en) Method of Detecting and Treating Tuberous Sclerosis Complex Associated Disorders
JP2005224188A (ja) 骨代謝異常疾患に関連した転写因子に制御される遺伝子の選抜法とその利用
JP2004000079A (ja) アルツハイマー病マーカー及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2000 611945

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2365449

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2365449

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 38394/00

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000917362

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000917362

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 38394/00

Country of ref document: AU