WO2000051634A1 - Preparations de vaccins contenant des acides gras comme composants - Google Patents

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virus
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Haruki Yamada
Hiroaki Kiyohara
Takayuki Nagai
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The Kitasato Institute
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Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant containing a hydroxyunsaturated fatty acid as an active ingredient, and a vaccine preparation comprising the same as a component and useful for preventing or treating human and animal diseases.
  • Vaccines have been used to prevent a variety of illnesses, and have produced a number of brilliant results against certain diseases, such as smallpox.
  • certain diseases such as smallpox.
  • the side effects of vaccines and their effects are not sufficient, and improvement is strongly desired.
  • most vaccines used for humans or animals use a pathogen or a part of the pathogen extracted and used as vaccine antigen material. Therefore, it cannot be ruled out that the components constituting the pathogen and the components of the medium for propagating the pathogen may be mixed in the vaccine. This can cause undesirable side effects during vaccination.
  • a side reaction may be induced.
  • Methods to avoid this and to produce or use vaccines with high safety include reducing the amount of vaccine, increasing the purity of vaccine antigens, and changing the route of vaccination. I have.
  • the immunity of the vaccine is likely to be reduced due to such a change.
  • the use of adjuvants has been practiced to prevent such a reduction in immunity.
  • improvements such as improving the effectiveness and safety of adjuvants. For example, many pathogenic microorganisms, such as the influenza virus, are transmitted through the respiratory tract mucosa, so a vaccine that induces more local immunity in the mucosa than in the blood is desirable to prevent morbidity at an early stage of infection. .
  • oral vaccination or nasal vaccination has been noted as an inoculation route other than injection. Injection must be performed by a medical technician, which can be difficult, for example, when a large number of people are vaccinated in a situation where medical facilities are not fully equipped.
  • oral or nasal vaccination it is expected that vaccinations will be possible without direct help under the guidance of experts if the vaccine preparation is transported.
  • Bacterial toxins such as cholera toxin.
  • Microbial or plant components such as BCG and muramyl peptides.
  • Site power-ins such as Interleukin.
  • the present inventors have found that some extracts of Chinese herbal medicine composed of several crude drugs have an adjuvant effect, and when used as a component of a nasally inoculated influenza vaccine, they were used in nasal washings and serum. It has been shown to increase the antibody titer to influenza virus in H. Yamada and T. Nagai, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 20 (3), 185-192, 1998. However, it was not yet clear which compound in the extract caused the adjuvant effect. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a new method for enhancing the immunity of a vaccine in order to produce a vaccine in which the immunity does not decrease even if the amount of the vaccine used is reduced or the route of inoculation is changed. More specifically, the aim is to find compounds with a simpler structure and high efficacy and safety from crude drugs, and to propose new adjuvants.
  • Chinese herbal medicine has been established in China, Japan, and other Asian countries for many years of clinical use, and its efficacy and safety have been established.
  • an object of the present invention is to provide a hydroxyunsaturated fatty acid and a derivative thereof as a novel adjuvant with high efficacy and safety, and to provide a vaccine containing these as a component, and to produce an effective and safe vaccine. It is to contribute to.
  • the present inventors have reported that the hot water extract of the Chinese herbal medicine “Shosei Ryuto” composed of eight kinds of crude drugs has an adjuvant effect, and It has been shown that oral administration of the vaccine increases the antibody titer to influenza virus in nasal washes and serum [H. Yajnad a and T. Nagai, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. , 20 (3), 185-192, 1998].
  • the present inventors orally administer each hot water extract of eight kinds of crude drugs constituting Shoseiryuto as an adjuvant, and then adjuvanted to nasal inoculation influenza vaccine.
  • a search for those showing activity was performed.
  • the extract of hot water extracted from the crude drug “Hangatsu” showed the highest adjuvant activity.
  • the present inventors have further advanced the separation and purification of the active ingredient in the extract of hot water extracted from Hange and the structural analysis thereof, and have found a strong immunopotentiating activity of a compound having a specific structure, thereby completing the present invention. That is, the means for achieving the above objects are realized by the following adjuvant of the present invention and a vaccine preparation using the adjuvant.
  • An unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a trihydroxy-monoene structure or a derivative thereof is represented by the following structure: 9,12,13-trihydroxy-10E-octanedecene S (9,12,13- The adjuvant according to (2), which is trihydroxy-10E-octadecenoic acid) or a derivative thereof.
  • R1 represents a hydroxyl group, or one or two alkyl groups or aryl groups.
  • hydroxy unsaturated fatty acid is a hydroxy unsaturated fatty acid prepared from a crude drug or a derivative thereof.
  • a vaccine preparation comprising the adjuvant according to any one of (1) to (4) as a component.
  • Influenza virus oral virus, measles virus, rubella virus, mumps virus, AIDS virus, pertussis, diphtheria, helicobacter pylori, hemorrhagic E. coli (EHEC), chlamydia Including antigens of one or more pathogenic microorganisms selected from the group consisting of protozoa, mycoplasma protozoa, malaria parasites, coccidial protozoa, and schistosomes,
  • the vaccine preparation according to any one of (5) to (7).
  • adjuvant refers to a substance that stimulates the immune system and enhances an immune response to an antigen.
  • a vaccine preparation containing an adjuvant as a component when used, other adjuvants that can constitute a vaccine preparation such as an immunizing antigen component may be used.
  • the adjuvant is mixed with the component, the case where the adjuvant is separated from other components that can constitute a vaccine preparation such as an immunogen component is also included.
  • the immunizing antigen component and the adjuvant exist as separate preparations and are administered to a living body by another route, they are collectively referred to as a vaccine preparation.
  • the adjuvant of the present invention is characterized in that it is a hydroxy unsaturated fatty acid or a derivative thereof.
  • the hydroxyunsaturated fatty acids used as adjuvants are preferably a series of compounds having 18 hydroxyl groups with 3 hydroxyl groups and 1 double bond (ie having a trihydroxy-monoene structure).
  • Such compounds are novel as fatty acid adjuvants in that they have a hydroxyl group and a double bond on the fatty acid.
  • the hydroxyl group and the double bond present on the fatty acid chain may be located at any position except for the carbon attributed to the carboxylic acid.
  • the hydroxyl groups When hydroxyl groups are bonded one by one to each carbon, the hydroxyl groups have a configuration represented by R or S, and any of these configurations may be used. Further, the configuration represented by E or Z is adopted depending on the bonding mode of the substituent to the double bond. In this case, any configuration may be adopted.
  • the positions of the hydroxyl group and the double bond which are desirable for the expression of the adjuvant activity are 9, 12, and 13 in the hydroxyl group, and the position of the double bond and its configuration are 10E.
  • Such compounds include, for example, 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid.
  • the adjuvant of the present invention includes derivatives in which various substituents are bonded to the hydroxyl group of the above-mentioned fatty acid and the sulfonic group of the carboxylic acid moiety.
  • examples thereof include an ester derivative in which a hydroxyl group is bonded to an acetyl group such as an acetyl group, a benzoyl group, a birubic acid group, and a succinic acid group, and an ether derivative in which an alkyl group such as an ethyl group or a methyl group is bonded. Is raised.
  • Examples of the substituent bonded to the carboxylic acid carbonyl group include a hydroxyl group, an alkyloxy group such as an ethyloxy group, an aryloxy group such as a benzyloxy group, a thioalkyl group such as a thioethyl group, or a thioaryl group, an amino group, a primary amine, or a secondary group. And the like.
  • Specific compounds include, for example,
  • Linoleic acid and arachidonic acid are known as compounds whose structures are known as fatty acids having adjuvant activity [HK Parmentier, MGB Nieuwl and MW Bardorf, RP Kwakkel and JW Schrama, Poultry Science, 76 (8), 1164-1171, 1997; DS Kelley, PC Taylor, GJ Nelson, PC Schmidt, BE ackey and D. Kyle, Lipids, 32 (4), 449-456, 1997].
  • linoleic acid has 18 carbon atoms, it differs from the compound of the present invention in that the double bond is two genic acids, and is clearly distinguished from the compound of the present invention also in that it has no hydroxyl group.
  • Arachidonic acid is a fatty acid having 20 carbon atoms and 4 double bonds, and also differs from the fatty acid of the present invention in that it does not have a hydroxyl group.
  • the present inventors have found that oral administration of Shoseiryu-to activates T lymphocytes of Peyer's patch, an inducing tissue of the intestinal mucosal immune system, and produces influenza virus-specific IgA antibody-producing cells in nasal region lymphocytes.
  • H. Yamada and T. Nagai Methods and Finding in Experimental and Clinical Pharmacology 20 (3), 185-192, 1998; T. Na gai and H. Yamada, Immunopharmac o 1 ogy and Immunotoxicology 20 (2), 267-281, 1998].
  • the mucosal immune system has a common mucosal immune mechanism, and any mucosa in the body It is known that when the immune system is activated, the mucosal immune system at other sites is also activated by remote immunization. Since the hydroxyunsaturated fatty acid which is the adjuvant of the present invention has been identified as the main adjuvant active substance of Shoseiryuto, it activates the intestinal mucosal immune system in the same manner as Shoseiryuto, so May promote the production of anti-influenza virus IgA antibodies and exhibit adjuvant activity. Production of hydroxy unsaturated fatty acids
  • the fatty acid used in the present invention can be extracted, separated, purified and produced by combining known methods using natural products such as animal tissues, medicinal plants such as crude drugs, seaweeds, microbial cultures and the like as raw materials. . It can also be produced by synthetic chemical means. An example is as follows.
  • Extract the fatty acid-containing crude drug, rhododendron (Rhizome excluding the cork layer of Pinellia ternata Breit.)
  • an organic solvent such as methanol or acetone
  • distill off the solvent from the extract and dissolve the residue in aqueous methanol.
  • a low-polar solvent such as n-hexane or petroleum ether
  • the solvent is distilled off from the aqueous methanol layer, and the residue is water, methanol, ethanol, chloroform, ether, ether.
  • a carrier such as Sephadex such as Sephadex LH-20, a porous polymer such as Diaion HP-20, alumina or silica gel, etc.
  • the product can be obtained by subjecting it to one or more applications of the column chromatography used, and performing fractionation while confirming the target component by thin-layer chromatography.
  • the aqueous extract may be purified by ethanol precipitation, fractionation with a porous polymer such as Diaion HP-20, and silica gel column chromatography. Further, in some cases, purification may be performed by recrystallization using an appropriate solvent such as acetone, methanol, or ethanol.
  • the compound obtained as described above may be combined with known chemical, biochemical, or genetic techniques as appropriate to obtain methylated, ethylated, acetyl And benzoylation to produce various derivatives.
  • Novel vaccine formulations are provided based on the adjuvant according to the invention.
  • the vaccine preparation in the present invention includes vaccines in a narrow sense and a broad sense. 1) Includes vaccines in a narrow sense that are effective against infections by viruses, bacteria, fungi, protozoa, and other microorganisms in humans and animals. Some examples are influenza vaccine, pertussis vaccine, pertussis diphtheria tetanus combination vaccine, Japanese encephalitis vaccine, hepatitis A vaccine, hepatitis B vaccine, oral and measles vaccine, measles vaccine, and wind shin.
  • Various vaccines such as a vaccine, a mumps vaccine, a measles rubella mixed vaccine, a measles rubella mixed vaccine, and a hemophilus influenza vaccine.
  • MRSA multi-drug resistant Staphylococcus aureus
  • H. pylori helicopaque Yuichi pylori
  • E HEC hemorrhagic Escherichia coli
  • salmonella vaccine chlamydia vaccine
  • mycoplasma vaccine mycoplasma vaccine
  • AIDS vaccines malaria vaccines
  • coccidial vaccines or schistosome vaccines.
  • vaccines include cancer vaccines, infertility vaccines, gastric ulcer vaccines, diabetes vaccines, and vaccines effective for the prevention and treatment of non-communicable diseases such as arteriosclerosis vaccines.
  • These vaccines include various vaccines classified according to manufacturing method. This includes live attenuated vaccines, inactivated vaccines, component vaccines, DNA-based vaccines, and so on.
  • Vaccines based on DNA include vaccines containing DNA fragments incorporated into carriers such as plasmids, as well as vaccines using ribozyme-antisense oligonucleotides in combination. These vaccines can be therapeutic or prophylactic.
  • Influenza vaccine a virus obtained by decomposing and purifying a virus grown by animal cell culture technology such as embryonated chicken eggs or Vero cells with ether or a surfactant, or a hemagglutinin obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), split vaccine containing matrix protein (M) or a part thereof, or nasal vaccination containing DNA fragments containing the genes of these proteins DNA vaccine.
  • HA hemagglutinin obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), split vaccine containing matrix protein (M) or a part thereof, or nasal vaccination containing DNA fragments containing the genes of these proteins DNA vaccine.
  • Pertussis vaccine An inactivated vaccine extracted from the culture broth or cells of a pertussis bacterium using salting out, ultracentrifugation, etc., and detoxified with formalin, or using genetic recombination technology or mutagen treatment
  • PT pertussis toxin
  • FHA hemagglutinin
  • 69K membrane protein or a partial peptide thereof obtained as an artificial mutant product induced by the above-mentioned method.
  • Pertussis diphtheria tetanus combination vaccine a triple vaccine containing a mixture of diphtheria toxoid (DT) and tetanus toxoid (TT) in the pertussis vaccine.
  • DT diphtheria toxoid
  • TT tetanus toxoid
  • Hepatitis B vaccine A plasma vaccine obtained by separating and purifying HBs antigen using salting out and ultracentrifugation using blood from a hepatitis B carrier as a raw material, or an antigen site obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis. Including recombinant vaccines.
  • Measles vaccine live attenuated virus vaccine grown by cell culture technology, such as chicken embryo cells or cultured cells such as chicken cells, or a part of the virus, or infection obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis Recombinant vaccine containing protective antigens.
  • Rubella vaccine cultured cells such as animal cells or human fetal cells, or viruses grown by established cell culture techniques such as vegetative cells, or a part thereof, or infections obtained by genetic recombination techniques or chemical synthesis Vaccines containing protective antigens.
  • Mumps vaccine A live attenuated vaccine containing a virus grown in cultured cells such as rabbit cells or embryonated chicken eggs, or a part thereof, or a protective antigen obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis.
  • Measles-rubella mixed vaccine measles-vaccine, rubella vaccine-mixed vaccine.
  • Measles wind shin mumps combination vaccine tri-mixed pectin mixed with measles vaccine, rubella vaccine, mumps vaccine.
  • Rota vaccine a vaccine containing a virus grown on cultured cells such as A104 cells, or a virus obtained from the stool of a patient, or a part thereof, or a protective antigen obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis.
  • AIDS vaccine virus propagated in cultured cells, virus obtained from patients, or a part thereof, or vaccine containing protective antigens obtained by genetic recombination technology or chemical synthesis, or DNA containing an effective DNA fragment vaccine.
  • H. pylori vaccine cultivated H. pylori cell lysate, or a bacterium isolated from H. pylori culture, which has antigens such as urease, heat shock protein, and toxin, or by genetic recombination technology Are these antigenic proteins produced? Injectable or oral or nasal vaccine.
  • the form of use of the adjuvant of the present invention as an active ingredient of a vaccine is not particularly limited. That is, various known suitable forms of use are possible, and they may be physically mixed, chemically bonded to an antigen protein, or included in a carrier such as a liposome.
  • the adjuvant of the present invention can be used simultaneously with one or more known adjuvants.
  • Known adjuvants to be combined with the adjuvant of the present invention can be empirically found in accordance with conditions to be considered, such as the type of the antigen to be used as the immunogen, the species to be inoculated, or safety. As a result, the amount of antigen can be reduced, the amount of the other adjuvant can be reduced, unwanted side reactions can be reduced, and the desired immune response can be enhanced.
  • the vaccine preparation of the present invention is prepared by separately preparing the immunogen and the adjuvant of the present invention, or by mixing them at a predetermined ratio.
  • the vaccine antigen (immunoantigen component) and the adjuvant of the present invention are separately prepared and formulated, and administered separately as shown in the Examples, or mixed at the time of use.
  • the effect can also be achieved by a method of inoculation after the inoculation. Preparations must be made strictly aseptically. Each raw material must be completely sterile. Needless to say, it is desirable that as much as possible no contaminants that are unnecessary other than the vaccine action and become a source of pyrogen II allergy are present. The necessary methods are known to the expert in this area.
  • the amount ratio between the vaccine antigen (immune antigen component) and the adjuvant in the vaccine preparation according to the present invention may be, for example, from 1: 0.0001 to 1: 10,000 (weight ratio). This range is only a general range and is suitable for the type of vaccine. The appropriate ratio is determined and used. The necessary methods are known to experts in this area.
  • the vaccine is provided in liquid or powder form.
  • the composition When the composition is in the form of a powder, it can be made into a powder preparation by a technique such as freeze-drying. Liquid preparations are often suitable for intranasal inoculation (intranasal spray, dropping, application, etc.), oral administration and injection. Alternatively, in the case of intranasal inoculation, a powder spray method is also possible.
  • the vaccine preparation according to the present invention may contain known stabilizers and preservatives.
  • the stabilizer gelatin-dextran of about 0.1 to 0.2%, sodium glutamate of 0.5 to 1, or lactose of about 5 or sorbitol of about 2% is used.
  • Known preservatives are about 0.01% thimerosal, about 0.1% /?-Propionolactone, and about 0.5% 2-phenoxyethanol.
  • Any known method of using the vaccine preparation according to the present invention can be used.
  • a vaccine antigen (immune antigen component) and an adjuvant component can be mixed and inoculated as a whole, or these components can be separately inoculated.
  • the inoculation is preferably performed orally or nasally.
  • the inoculation volume is 5 L to 50 L for mice, 0.05 to 0.5 mL orally, 0.1 to 1.0 mL for intranasal administration for humans, and l to 100 mL for oral administration for mice. Is preferred. These amounts can be varied as appropriate.
  • an immunizing antigen for example, in the case of the following immunizing antigens of pathogenic organisms, nasal vaccination or oral vaccination is desirable in terms of vaccine effect or inoculation operation.
  • Influenza virus oral virus, measles virus, rubella virus, Mumps virus, AIDS virus, pertussis, diphtheria, H. pylori, hemorrhagic Escherichia coli (EHEC), chlamydia, mycoplasma, malaria parasite, coccididium parasite, and schistosome.
  • EHEC hemorrhagic Escherichia coli
  • vaccine antigens may be administered alone or as a co-inoculation in the form of pertussis, diphtheria, tetanus triple vaccine, or measles, rubella dual vaccine. Can also be adopted. Nasal and oral vaccinations are preferred because the mucous membranes of the respiratory tract and gastrointestinal tract are the routes of infection. In order to induce an immune mechanism in the local mucosa, which is the route of infection, an adjuvant with a strong immunity-inducing activity suitable for it is desirable.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 1 H-NMR pattern of the adjuvant of the present invention, 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid. “CD 2 I10D” in the figure indicates a signal derived from the solvent.
  • the adjuvant of the present invention showing a pattern of 1 3 C-NMR of 9, 12, 13-trihydroxy- 10E-octadecenoic acid. “£ D 2 H0D” in the figure indicates a signal derived from the solvent.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of primary antibody production in serum when nasal inoculation of the vaccine preparation of the present invention using influenza vaccine as a vaccine.
  • the vertical axis indicates the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis indicates the type of adjuvant used.
  • Fig. 4 shows the results of secondary antibody production in nasal washings when nasal inoculation of the vaccine formulation of the present invention using influenza vaccine as a vaccine. It is rough.
  • the vertical axis indicates the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis indicates the type of adjuvant used.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of production of secondary antibodies in serum when nasal influenza vaccine was inoculated as a vaccine and an adjuvant was intranasally administered among the vaccine preparations of the present invention.
  • the vertical axis indicates the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis indicates the type of adjuvant used.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of secondary antibody production in lung lavage fluid when an influenza vaccine was inoculated intranasally as a vaccine and an adjuvant was administered intranasally among the vaccine preparations of the present invention.
  • the vertical axis indicates the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis indicates the type of adjuvant used.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of secondary antibody production in serum when influenza peptide was subcutaneously inoculated as a vaccine and the adjuvant was orally administered among the vaccine preparations of the present invention.
  • the vertical axis shows the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis shows the type of adjuvant used.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of secondary antibody production in nasal washings when influenza peptide was subcutaneously inoculated as a vaccine and orally administered with an adjuvant, out of the vaccine preparations of the present invention.
  • the vertical axis shows the antibody titer (ELISA unit), and the horizontal axis shows the type of adjuvant used.
  • 9,12,13-Trihydroxy-10E-octadecenoic acid was obtained as a colorless oily substance by using reversed phase high performance liquid chromatography. The yield was 10m.
  • the structure of this oily substance was determined by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), specific rotation of the original compound and its derivatives. The 1 H-NMR and 13 C-NMR patterns of this substance are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • the precipitate was further dialyzed against distilled water using a cellulose dialysis membrane having a molecular weight exclusion limit of 10,000, and then the inner dialysate was freeze-dried to obtain a non-dialyzable fraction (yield: 0.6). %) c Dissolve the non-dialysis fraction with water, stir with Diaion HP-20, The unadsorbed fraction was removed by washing the HP-20 with water. Diaion HP-20 elutes the adsorbed material by washing with a 20% (v / v), then 803 ⁇ 4 (v / v) -methanol-water mixture, and then adsorbs with methanol.
  • the fraction was eluted to obtain a methanol-eluted fraction (yield: 0.06).
  • the methanol eluted fraction was repeatedly fractionated using silica gel column chromatography to obtain 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid of the present invention.
  • the yield was 0.35m.
  • the methanol-soluble fraction (45.4 g) obtained by refluxing the extract of Hange's hot water was also dissolved in 200 mL of a methanol-water mixture (9: 1) and shaken with an equal volume of n-hexane. Then, a lower layer was obtained. After distilling off the solvent in the lower layer under reduced pressure, the mixture was stirred with DIAION HP-20 in an 80% methanol-water mixture, and the unadsorbed fraction was removed by washing DIAION HP-20 with the same solvent. . Further, Diaion HP-20 was eluted with methanol to obtain an adsorbed fraction. The adsorbed fraction was fractionated several times by silica gel column chromatography to obtain 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid (1.2 mg) of the present invention.
  • hydroxyunsaturated fatty acids have an activity of enhancing antibody production against various vaccines and are effective as adjuvants.
  • the lipid component was removed from purified influenza virus (A / PR / 8/34) by ether treatment to prepare an HA vaccine (protein amount: lmg / mL).
  • An aqueous solution of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid purified by the method described in Example 1 was prepared and used as a hydroxyunsaturated fatty acid solution.
  • the purity of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid used here was about 95% or more.
  • BALB / c mice female, 7 weeks old) were treated with this aqueous solution of hydroxyunsaturated fatty acids for 5 times per mouse body weight.
  • Gavage was performed by gavage using an oral probe at a dose of 0 mg / kg for 5 days.
  • the mice were anesthetized with sodium amobarbi sodium, and 10 ⁇ L of the vaccine was dropped into the right nasal cavity with a micropipette. Two weeks later, blood was collected from the fundus venous plexus of the mice to prepare serum. Serum anti-influenza virus IgA antibody titers were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Serum is applied to a protein G Sepharose column 4FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the column is washed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0). As a result, an unadsorbed fraction was obtained.
  • 4FF protein G Sepharose column 4FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the column is washed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0). As a result, an unadsorbed fraction was obtained.
  • the plate After leaving overnight at 4 ° C, the plate was washed with PBS-Tween 20, and a test sample diluted with a blocking solution at 100 / L was added to each well.
  • a protein G sepharose column unadsorbed fraction of serum was used as a sample.
  • the plate After leaving at room temperature for 2 hours, the plate was washed with PBS-Tween-20.
  • 100 ⁇ L of an alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgA heavy chain specific antibody (Zymmettra Laboratories) diluted with a blocking solution was added to each well. After standing at room temperature overnight, the plate was washed with PBS-Tween 20.
  • P-nitrophenylphosphoric acid (lmg / mL; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 10% diethanolamine buffer (pH 9.8) was added to each well to develop color. After standing at 37 ° C for 20 to 30 minutes, color development was measured by OD (405 nm) using a microplate reader.
  • Figure 3 shows the effect of 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid on the serum anti-influenza virus antibody titer.
  • the aqueous vehicle without adjuvant was administered orally, only low levels of antibody were detected.
  • the serum anti-influenza virus IgA antibody titer was strongly increased. The above results indicate that oral administration of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid enhances the production of antibodies in the blood against the nasally inoculated influenza HA vaccine.
  • Example 4 Influenza HA pectin promotes antibody production against secondary immunity
  • aqueous solution of the influenza HA vaccine and 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid was prepared in the same manner as described in Example 3.
  • the sample solution was orally administered to female, 7-week-old BALB / c mice by oral gavage using an oral probe at a dose of 50 ⁇ g / kg per mouse body weight for 1 to 5 days.
  • mice were anesthetized with intraperitoneal injection of amobarbi-yuni lunatrium and the vaccine 10 zL (l-5 ⁇ g / mouse) ) was inoculated intranasally into mice.
  • mice After breeding the mice for about 3 weeks, they received a second intranasal vaccination with the vaccine alone or a second vaccination with the vaccine and orally administered hydroxy fatty acids. After breeding for another 2 weeks, a nasal wash was prepared. Nasal washes were collected from the left and right nasal cavities of mice by perfusion with 2 mL of PBS containing 0.1% BSA. The anti-influenza virus IgA antibody titer in the nasal washings was measured by ELISA.
  • Figure 4 shows the effect of secondary response of 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid on the production of anti-influenza virus IgA antibodies in nasal washes.
  • C vaccine was administered intranasally and no adjuvant was administered. At that time, only low levels of anti-influenza virus IgA antibodies were detected.
  • the group that received 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid orally increased the anti-influenza virus IgA antibody titer in nasal washings strongly.
  • adjuvant-specific antibodies IgG, IgA
  • IgE adjuvant-specific antibodies
  • the combination of hydroxyunsaturated fatty acids and the carrier protein bovine serum albumin The solution was prepared and 100 ⁇ l of this solution (l / g / ml) was first coated on each well of a 96-well EIA plate. Next, in order to suppress non-specific reactions, each well of the plate was coated with 300% blocking solution (PBS containing 5% skim milk) for 1 hour. Thereafter, 100/1 diluted specimens (nasal washings) diluted to various concentrations were added to each well, an antigen-antibody reaction was performed for 1 hour, and the cells were washed three times with PBS-0.05% Tween 20.
  • the results of the 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid raised the anti-influenza virus IgA antibody titer, indicating that the 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was orally administered at the time of primary vaccination of the vaccine.
  • 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid has an effect of strongly inducing a memory effect on the HA vaccine.
  • the hydroxy fatty acids used had low immunogenicity, suggesting low side reaction inducing properties.
  • the hydroxy unsaturated fatty acid (1) (9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid) prepared in Example 1 and the methyl ester derivative (2) (methyl 9,12,13-trihydroxy-lOE -octadecenoate) ⁇ triacetyl derivative (3) (9,12,13-triacetoxy-10E-octadecenoic acid), triacetyl methyl ester derivative (4) (met hyl 9,12,13-triacetoxy-lOE-octadecenoate) was administered to mice to investigate acute toxicity.
  • the chemical structural formulas of the compounds (1) to (4) are shown below in order.
  • Compound (2) (methyl 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoate) is obtained by dissolving compound (1) (9, 12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid) in ether, A methane-ether solution was added and reacted for several minutes at room temperature. The solvent was distilled off from the reaction solution to obtain (2).
  • Compound (3) (9,12,13-triacetoxy-10E-octadecenoic acid) is obtained by converting compound (1) (9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid) to about 1% in acetic anhydride in the presence of sodium acetate. After refluxing for an hour, the reaction product was partitioned and extracted with water and form water, and (3) was obtained from the liquid form layer.
  • the compound (4) (methyl 9, 12, 13-triacetoxy-10E-octadecenoate) was obtained by conversion using the method of synthesizing (3).
  • the compounds (1) to (4) showed no signs of toxicity at the intraperitoneal administration of 30 mg / kg and the oral administration of 100 mg / kg.
  • Example 6 Pertussis diphtheria tetanus combination vaccine (nasal)-hydroxyunsaturated fatty acid (oral) formulation
  • the vaccine was prepared to contain 50 g of pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine as protein nitrogen in ZO JLL. Separately, it was prepared so that 10 mL of 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid dissolved in PBS and sterilized by filtration was contained in 0.5 mL. An antiseptic (0.005% thimerosal) was added to these, and the mixture was dispensed into containers to obtain a pertussis diphtheria tetanus mixed bacterium (nasal) -hydroxyunsaturated fatty acid (oral) inoculant. This product was stored in a cool, dark place at 10 C or lower.
  • the pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine prepared as described above was inoculated intranasally into mice, and 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was orally administered before and after that. Four weeks later, the same amount of vaccine was additionally administered, and antibody production was examined. According to the test results, in the control mice inoculated with only pertussis diphtheria tetanus mixed pectin, anti-pertussis toxin (PT) -IgG antibody in blood contained 156 ELISA units, anti-diphtheria toxoid (DT).
  • the anti-PT-IgA antibody in the nasal wash was 6 ELISA units
  • the anti-DT-IgA antibody was 3 E LISA units
  • the anti-TT-IgA antibody was 4 ELISA units, compared to 9,
  • 14 ELISA units for anti-PT-IgA antibody in the nasal washings 11 ELISA units for anti-DT-IgA antibody, and 11 anti-TT-IgA antibodies was 11 ELISA units.
  • a measles rubella combination vaccine was prepared to contain 7 ⁇ g of virus particles in 20 ⁇ L of each vaccine. Further, it was prepared so that 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid, which was dissolved in PBS and sterilized by filtration, contained 2.5 / g in 0.5 mL. Stabilizers (0.2% pork gelatin, 0.1 sodium glutamate, 5 lactose) were added to these, and the mixture was dispensed into containers to give measles-like shin vaccine mixed with nasal hydroxyunsaturated fatty acids and oral preparations. This product was stored in a cool, dark place at 10 ° C or less.
  • the measles rubella mixed vaccine prepared as described above was administered to mice twice at three-week intervals, and 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was orally administered only before and after the first inoculation to obtain blood. Antibody production was observed. Based on the test results, the ELISA antibody titers produced when the vaccine alone was inoculated were 0.14 and 0.09 for measles and rubella, whereas the 9,12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid combination vaccine was They were 0.30 and 0.29, respectively.
  • the oral vaccine was prepared so as to contain virus particles equivalent to 3.3 g. Also, the methyl ester derivative (2) (methyl 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoate) used in Example 5 was dissolved in PBS, prepared to contain 10 ⁇ g in 0.5 mL, and sterilized by filtration. did. This was dispensed into containers to make rota vaccine-hydroxy unsaturated fatty acid oral and nasal drops. This product was stored in a cool, dark place at 10 ° C or less. Mice were inoculated twice with the oral vaccine prepared as described above at three-week intervals, and methyl ester derivatives were orally administered only before and after the first inoculation, and antibody production in the blood was observed.
  • the methyl ester derivative (2) methyl 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoate
  • the ELISA antibody titer produced when the vaccine alone was inoculated was 0.089 in the case of intranasal vaccination of the vaccine, whereas that of the methyl ester derivative-combined vaccine was 0.38. Also, in the case of oral inoculation, the value was 0.018 in the mice without the adjuvant control and 0.27 in the mice inoculated with the methyl ester derivative-added mice.
  • Mycoplasma vaccine 2.0 ⁇ 10 1 G CFU colony forming unit
  • 912,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid dissolved in PBS and sterilized by filtration was prepared so as to contain 10 zg in 0.5 mL.
  • These were dispensed into containers to give a mycoplasma vaccine-hydroxyunsaturated fatty acid preparation nasal spray and oral preparation. This product was stored in a cool, dark place at 10 ° C or less.
  • the mycoplasma vaccine prepared as described above was intranasally administered to mice three times at two-week intervals, and 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was orally administered only before and after the first vaccination.
  • the lesion was observed after the challenge. From the test results, lesions were observed in all 10 mice in the control group that received only peptide, whereas 3/10 mice combined with 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid Only one animal showed lesions.
  • the average number of lesions was 302 for the vaccine alone, while 178 for the 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid combination vaccine.
  • an influenza HA vaccine (protein amount: 0.1 mg / mL) was prepared. To this, mix an equal volume of the sample PBS solution (0.1 mg / mL). And the inoculum was prepared.
  • Female, 7-week-old BALB / c mice were anesthetized by intraperitoneal administration of amobarbi illuminum intraperitoneally, and 10 ⁇ L of the inoculum was inoculated into both nasal cavities. After breeding the mice for 3 weeks, a second intranasal inoculation of the mixture of the vaccine and the sample was performed. After breeding for an additional 16 days, serum and lung washes were prepared.
  • Lung washes were collected by injecting 2 mL of PBS containing 0.1 BSA from the trachea of exsanguinated mice and perfusing the lungs twice.
  • Anti-influenza virus IgG antibody titers in serum and lung lavage were measured by ELISA.
  • anti-mouse IgG monoclonal antibody (mAb) diluted with coating buffer (10 mM carbonate-sodium bicarbonate buffer pH9.6 containing 10 ⁇ g / mL BSA)
  • coating buffer 10 mM carbonate-sodium bicarbonate buffer pH9.6 containing 10 ⁇ g / mL BSA
  • the plate was washed with PBS-Tween 20 and a test sample diluted with a blocking solution at 100 // L was added to each hole. After standing at room temperature overnight, the plate was washed with PBS-Tween 20. Next, 100 ⁇ L of the biotin-labeled HA vaccine (1 zg / mL) diluted with the blocking solution was added to each well. After leaving at room temperature for 1 hour while shaking, the plate was washed with PBS-Tween 20. Next, 100 ⁇ L of streptavidin-?-Galactosidase diluted with a blocking solution was added to each well.
  • Figure 5 shows the secondary response of 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid to serum 1 shows the effect of anti-influenza virus on IgG antibody production.
  • 9, 12, 13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid increased the serum anti-influenza virus IgG antibody titer in the is dose per mouse compared to the HA vaccine alone.
  • Figure 6 shows the effect of secondary response of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid on anti-influenza virus IgG antibody production in lung lavage fluid.
  • the vaccine alone was administered intranasally, only low levels of anti-influenza virus IgG antibodies were detected.
  • the group vaccinated with 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octad ecenoic acid significantly increased the anti-influenza virus IgG antibody titer in lung lavage fluid at a dose of 1 zg per mouse. I let it.
  • Example 1 Effect of oral administration on antibody production for secondary immunization by subcutaneous inoculation of influenza HA vaccine
  • Example 3 In the same manner as described in Example 3, an aqueous solution of Influenza HA vaccine (protein amount: 10 ⁇ g / mL) and a sample was prepared.
  • Female, 7-week-old BALB / c mice were orally administered a sample solution at a dose of 1 / g per mouse by oral gavage using an oral probe and inoculated subcutaneously in the abdomen with O.lmL of vaccine. .
  • the samples were similarly administered orally and the vaccine was subcutaneously inoculated.
  • serum and nasal washes were prepared.
  • Anti-influenza virgilus IgA antibody titers in serum and nasal washings were measured by ELISA.
  • ELISA for quantification of anti-influenza virus IgA antibody was performed in the same manner as in Example 10 except that anti-mouse IgA niAb (Pharmingen) was used as the capture antibody.
  • Figure 7 shows the effect of secondary response of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid on the production of anti-influenza virus IgA antibodies in serum.
  • 9, 12,13-Trihydroxy-lO-octadecenoic acid increased the anti-influenza virus IgA antibody titer in the serum at a dose per mouse significantly more than that of the HA vaccine alone.
  • the adjuvant activity of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was similar to that of the same dose of CTB used as a positive control.
  • Figure 8 shows the effect of secondary response of 9,12,13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid on the production of anti-influenza virus IgA antibodies in nasal washes.
  • the vaccine alone was administered subcutaneously and no adjuvant was administered, only low levels of anti-influenza virus IgA antibodies were detected.
  • the anti-influenza virus IgA antibody titer in the nasal washings was significantly increased at a dose of 1 US per mouse. Raised.
  • the adjuvant activity of 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid was similar to that of the same dose of CTB used as a positive control.
  • the adjuvant of the present invention composed of hydroxyunsaturated fatty acids enhances the production of antibodies against nasal or subcutaneously inoculated influenza HA vaccine or the like by oral administration.
  • Oral administration of the adjuvant of the present invention and inoculation of the vaccine antigen by the nasal or subcutaneous route enhances local (nasal) antibody production as well as blood antibody production. That is, by using the adjuvant of the present invention, the amount of vaccine antigen to be inoculated can be reduced, which leads to a reduction in side reactions.
  • Vaccines with adjuvants are highly safe vaccines.
  • the vaccine preparation containing the adjuvant according to the present invention as a component is expected to be an effective drug for preventing or treating viral and bacterial infections caused by the vaccine.

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Description

明細 ^ 脂肪酸を構成成分とするワクチン製剤 技術分野
本発明は、 ヒドロキシ不飽和脂肪酸を有効成分とするアジュバント、 及びこれ を構成成分とするヒトおよび動物の病気の予防または治療に有用なワクチン製剤 に関するものである。 背景技術
ワクチンは、 種々の疾病の予防に用いられ、 天然痘のような特定の疾患に対し ては数々の輝かしい成果をあげてきた。 しかしながら、 ワクチンの副反応や、 ま た効果が充分でないという例も多くあって、その改善が強く望まれている。現在、 人体用または動物用に使用されているワクチンの多くは、 病原体あるいは病原体 の一部を取り出し、 ワクチンの抗原材料として用いる。 従って、 病原体を構成す る成分や病原体を増殖させる媒体の成分がワクチンに混入する可能性を否定でき ない。 これはワクチン接種の際、 望ましくない副反応を引き起こす原因となりう る。 また、 免疫賦与に働く抗原部位そのものも多量に接種されると副反応を誘発 する場合もある。
このようなことをできるだけ避け、 安全性に優れたワクチンを製造または使用 する方法として、 ワクチンの接種量を減少させることや、 ワクチン抗原の純度を 高めること、 接種ルートを変えることなどが行われている。 しかし、 一般的には、 このような変更に伴いワクチンの免疫力が低下しやすい問題点がある。 このよう な免疫力の低下を防ぐために、 アジュバントを用いることが実施されてきた。 し かし、 ここでも、 アジュバントの有効性と安全性の向上など、 改善すべき課題が 残っている。 例えば、 インフルエンザウイルスなど、 多くの病原微生物は気道粘膜を介して 感染するので、 感染初期段階で罹患を阻止するためには、 血中よりも粘膜での局 所免疫を強力に誘発するワクチンが望ましい。 このためにも局所免疫を誘発しや すくするアジュバントが求められている。 一方、 注射以外の接種ルートとして注 目されるのが、 経口接種、 あるいは経鼻接種である。 注射は医療技術者が行わな ければならないので、 例えば医療施設が完備されていない状況で多数の人にヮク チン接種を進めるときには困難を伴いやすい。 これに対して経口接種、 あるいは 経鼻接種では、 ワクチン製剤さえ運搬すれば、 専門家の指導の下に、 直接の助け がなくとも接種が可能であると期待される。 しかし、 注射用ワクチンを別の接種 ルートで接種すると一般的には充分な免疫刺激を得にくいため、 やはり接種ルー 卜に適したアジュバントが必要となる。
すなわち、 有効かつ安全で、 必要な部位で免疫を誘発しやすくする優れたアジ ュバントを開発することは、 ワクチン開発にとって重要な課題である。
従来、 ワクチンにはアジュバントとしてアルミニウム化合物 （硫酸アルミニゥ ム、 水酸化アルミニウムなど）、 リン酸化合物 （リン酸カルシウム、 リン酸アルミ ニゥムなど） が広く用いられて来た。 これらの化合物のゲルは、 現在、 人体用ヮ クチンに用い得るほとんど唯一のアジュバントである。 しかし、 これらのアジュ バントにはいくつかの問題点があり、 改善が求められている。 それらを例示すれ ば、 1 ) 製法、 及び取り扱い上の問題として、 製造のロットごとに品質が異なり やすいので、 大量生産に不向きであり、 加えてカラム操作に馴染みにくい等取り 扱い上も不便である、 2 ) 効果上の問題として、 液性免疫の誘発力に優れている ものの、 細胞性免疫の誘発力が低いので、 用いる抗原に限界がある、 などが挙げ られる。
これらの改善を目的として、 新しいアジュバントの研究、 開発が進められてい る。 それらを例示すれば次のものが挙げられる （J. C. Cox et al .， Vaccine 15, 248 一 256, 1997)。 . サポニン等、 界面活性作用物質。
. コレラトキシン等、 細菌毒素。
. B C G、 ムラミルペプチド等、 微生物または植物成分。
. インタ一ロイキンなど、 サイ ト力イン類。
5. 合成ポリア二オン、 ポリカチオンなど。
6. マイクロキヤリアなど。
本発明者らは、 数種の生薬から構成されている漢方薬の抽出液のあるものがァ ジュバント作用を有し、 経鼻接種したインフルエンザワクチンの構成成分として 用いた場合、 鼻腔洗液中および血清中でィンフルェンザウィルスに対する抗体価 を上昇させることを明らかにしてきた [H. Yamada and T. Nagai , Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 20 (3) , 185 - 192， 199 8]。 しかし、 アジュバント作用が抽出液中のいかなる化合物によってもたらされ ているのかについては、 未だに明らかにされていなかった。 発明の開示
本発明の課題は、 ワクチンの使用量を減らしたり接種ルートを変えても免疫力 が低下しないようなワクチンを製造するため、 ワクチンの免疫力を増強させる新 しい方法を提供することにある。 より具体的には、 生薬中から、 より単純な構造 で有効性と安全性の高い化合物を見い出し、 新規アジュバントとして閧発するこ とにある。 漢方薬は中国、 日本やアジア各国で長年の臨床使用を通じて有効性と 安全性が確立されているので、 本課題の材料として優れて好適である。
すなわち、 本発明の課題は、 効果と安全性の高い新規なアジュバントとして、 ヒドロキシ不飽和脂肪酸およびその誘導体を提供し、 かつ、 これらを構成成分と するワクチンを提供し、 有効で安全なワクチンの製造に貢献することである。 本発明者らは、 8 種の生薬から構成されている漢方薬 「小青竜湯 （しょうせい りゅうとう）」の熱水抽出液がアジュバント作用を有し、絰鼻接種のインフルェン ザワクチンとともに経口投与した場合、 鼻腔洗液中および血清中でィンフルェン ザウィルスに対する抗体価を上昇させることを既に明らかにしている [H. Yajnad a and T. Nagai, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharma cology, 20 (3) , 185-192, 1998]。
そこで本発明者らは、 上記課題の達成を目的として、 小青竜湯を構成する 8種 の生薬の個々の熱水抽出エキスをアジュバントとして経口投与し、 経鼻接種ィン フルェンザワクチンに対するアジュバント活性を示すものの検索を行なった。 そ の結果、 生薬「半夏（ハンゲ）」の熱水抽出エキスが最も高いアジュバント活性を 示すことを見い出した。 更にハンゲの熱水抽出エキス中の有効成分の分離精製と 構造解析を進め、 特定の構造を持った化合物に強力な免疫増強活性を見い出して 本発明を完成させた。 すなわち、 上記の課題を達成する手段は、 以下の本発明の アジュバント、並びにこのアジュバントを用いたワクチン製剤により実現される。
( 1 ) ヒドロキシ不飽和脂肪酸またはその誘導体を含むアジュバント。
( 2 ) ヒドロキシ不飽和脂肪酸またはその誘導体が、 トリヒドロキシーモノエ ン構造を有する炭素数 18の不飽和脂肪酸またはその誘導体である、 （ 1 ) に記載 のアジュバント。
( 3 ) トリヒドロキシーモノエン構造を有する炭素数 18の不飽和脂肪酸または その誘導体が下記の構造で示される 9, 12， 13-トリヒドロキシ -10E-ォク夕デセン S (9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid)またはその誘導体である、 ( 2 ) に記載のアジュバント。
Figure imgf000006_0001
[式中、 R1 は水酸基、 あるいは 1個または 2個のアルキル基またはァリール基が 1個の酸素、 硫黄、 または窒素原子に結合した構造の置換基であり、 R2、 R3、 お よび R4は同一または異なっていてもよい水素、 アルキル基、 またはァシル基を示 す。 ]
(4) ヒドロキシ不飽和脂肪酸が生薬より調製したヒドロキシ不飽和脂肪酸ま たはその誘導体である、 （ 1) 〜 （3) のいずれかに記載のアジュバント。
(5) ( 1) 〜 （4) のいずれかに記載のアジュバントを構成成分とするワク チン製剤。
(6) ワクチン製剤中のアジュバントが免疫抗原成分と別に経口接種に用いら れる、 （5) に記載のワクチン製剤。
(7) ワクチン製剤中の免疫抗原成分が経鼻接種、 皮下接種、 経口接種、 また は筋肉内接種およびその他の粘膜を介した接種に用いられる、 （6)に記載のワク チン製剤。
(8) 免疫抗原成分として、 インフルエンザウイルス、 口夕ウィルス、 麻しん ウィルス、 風しんウィルス、 おたふくかぜウィルス、 エイズウイルス、 百日せき 菌、 ジフテリア菌、 へリコパクター · ピロリ菌、 出血性大腸菌 (EHEC)、 クラミジ ァ原虫、 マイコプラズマ原虫、 マラリア原虫、 コクシジゥム原虫、 および住血吸 虫で構成される群から選択される単一または複数の病原微生物の抗原を含む、
(5) から （7) のいずれかに記載のワクチン製剤。
(9) ワクチン製剤中のアジュバントを免疫抗原成分と別に経口投与する、 (5) に記載のワクチン製剤の投与方法。
( 10) 免疫抗原成分を経鼻接種、 皮下接種、 経口接種、 筋肉内接種、 または その他の粘膜を介して接種する、 （9) に記載のワクチン製剤の投与方法。
なお、 本発明において 「アジュバント」 とは、 免疫系を刺激して、 抗原に対す る免疫反応を高める物質を指す。
また、 本発明において 「アジュバントを構成成分とするワクチン製剤」 といつ た場合 は、 アジュバン卜が免疫抗原成分などのワクチン製剤を構成しうる他の 成分と混合されている場合のみならず、 アジュバントが免疫抗原成分などのワク チン製剤を構成しうる他の成分と分離されている場合も含まれる。 例えば、 免疫 抗原成分とアジュバントが別々の製剤として存在し、 これらを別の経路で生体に 投与する場合であっても、 これらを併せてワクチン製剤と称する。
本発明のアジュバントは、 ヒドロキシ不飽和脂肪酸またはその誘導体であるこ とを特徴とする。 アジュバントとして用いるヒドロキシ不飽和脂肪酸は、 好まし くは、 水酸基が 3個および二重結合 1個を有する （即ち、 トリヒドロキシーモノ ェン構造を有する）炭素数 18の一連の化合物である。 このような化合物は、脂肪 酸上に水酸基および二重結合を有する点において脂肪酸アジュバントとして新規 である。 脂肪酸鎖上に存在する水酸基および 2重結合はカルボン酸に帰属される 炭素を除くいずれの位置にあってもよい。 また、 水酸基が各々の炭素上に一個ず つ結合する場合には、 水酸基は Rもしくは Sで表示される立体配置をとるがその いずれの場合でもよい。 さらに、 二重結合に対する置換基の結合様式により Eも しくは Zで表示される立体配置をとるが、 この場合もいずれの立体配置をとつて もよい。
アジュバント活性発現のための望ましい水酸基および二重結合の位置を例示す るならば、 水酸基ではその位置が 9, 12, 13であり、 二重結合の位置およびその立 体配置が 10Eである。 このような化合物としては、 例えば、 9， 12, 13-トリヒドロ キシ -10E-ォク夕デセン酸（9，12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid)が含ま れる。 公表された文献上、 本化合物についてはアンジォテンシン変換酵素に対す る阻害活性やイネに対するフアイ トァレキシン作用が報告されただけで、 ヮクチ ンにおけるアジュバント活性は報告されていない （（M. Maruno, J. Traditional
Medicines, 14, 81-88, 1997; T. Kato, ， Y. Yamaguchi , T. Uyehara, T. Yokoy ama, T. Namaiand S. Yamanaka, Naturwissenschaften, 70, 200， 1983; T. Kat o， Y. Yamaguchi jN. Abe, T. Uyehara, T. Namai , M. Kodama and Y. Shiobara,
Tetrahedron Lett.，26, 2357-2360, 1985 )。 本発明のアジュバントには、 上記脂肪酸の水酸基ならびにカルボン酸部分の力 ルポニル基に種々の置換基が結合した誘導体が含まれる。 その例としては、 水酸 基にはァセチル基、 ベンゾィル基、 ビルビン酸基、 コハク酸基などのァシル基が 結合したエステル誘導体が、 また、 ェチル基やメチル基などのアルキル基が結合 したエーテル誘導体があげられる。 また、 カルボン酸性カルボニル基に結合する 置換基の例としては水酸基、 ェチルォキシ基などアルキルォキシ基、 ベンジルォ キシ基などァリールォキシ基、 チォェチル基などチォアルキル基、 またはチオア リール基、 アミノ基、 一級ァミン、 あるいは二級ァミンなどが挙げられる。 具体的な化合物としては、 例えば、
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および
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が挙げられる。
トリヒドロキシ—モノエン構造を有するヒドロキシ不飽和脂肪酸が強いアジュ バント活性を有することは、 公知の文献には記載が無く、 本発明者らの長年の研 究によって初めて明らかにされた新しい知見である。 また、 次のとおり、 先行文 献の記述からは予測されないことである。
アジュバント活性を有する脂肪酸として構造が明らかとなっている化合物とし ては、リノール酸（linoleic acid)およびァラキドン酸（arachidonic acid)が公知 である [H.K. Parmentier, M. G. B. Nieuwl and, M.W. Barwegen, R.P. Kwakkel and J.W. Schrama, Poultry Science, 76 (8) , 1164-1171, 1997; D. S. Kelley, P. C. Taylor, G.J. Nelson, P. C. Schmidt, B. E. ackey and D. Kyle, Lipids, 32 (4), 449-456, 1997]。 まず、 リノール酸は炭素数 18であるが、 二重結合が 2個のジェン酸である点で本発明の化合物と異なり、 水酸基を持たない点でも本 発明の化合物とは明確に区別される。 ァラキドン酸は炭素数 20、 二重結合が 4個 の脂肪酸であり、 また水酸基を持たない点でも本発明の脂肪酸とは異なる。
本発明のヒドロキシ不飽和脂肪酸が強いアジュバント活性を発揮するメカニズ ムは、 現在不明である。 但し、 本発明者らは、 漢方薬の小青竜湯を経口投与する ことにより、 絰鼻接種したィンフルェンザワクチンに対して鼻腔中で抗ィンフル ェンザウィルス IgA抗体価を上昇させるアジュバント活性を示すことを明らかに している [T. Nagai, M. Urata and H. Yamada, I mmunopharmaco 1 ogy and Immun otoxicology 18(2)， 193-208, 1996]。さらに本発明者らは、小青竜湯の経口投与 により腸管の粘膜免疫系の誘導組織であるパイエル板の Tリンパ球が活性化され、 鼻腔領域リンパ球中のインフルエンザウイルス特異的 IgA抗体産生細胞数を増加 させることを明らかとしている [H. Yamada and T. Nagai, Methods and Findin gs in Experimental and Clinical Pharmacology 20( 3) , 185-192, 1998; T. Na gai and H. Yamada, I mmunopharmac o 1 ogy and Immunotoxicology 20(2) , 267-28 1， 1998]。 粘膜免疫系には共通粘膜免疫機構が存在し、 生体内のいずれかの粘膜 免疫系が活性化されると、 遠隔免疫により他の部位の粘膜免疫系も活性化される ことが知られている。 本発明のアジュバントであるヒドロキシ不飽和脂肪酸は、 小青竜湯のアジュバント活性本体として同定されたものであることから、 小青竜 湯と同様に腸管粘膜免疫系を活性化することにより、 鼻腔中での抗ィンフルェン ザウィルス IgA抗体産生を促進し、アジュバント活性を示す可能性が考えられる。 ヒドロキシ不飽和脂肪酸の製造
本発明に用いる脂肪酸は、 天然物、 例えば動物組織、 生薬などの薬用植物、 海 藻、 微生物培養物などを原料として公知の方法を組み合わせて、 抽出、 分離、 精 製し、製造することができる。また合成化学的手段により製造することもできる。 その例を示せば次の通りである。
脂肪酸含有生薬であるハンゲ（Pinell ia ternata Breit.のコルク層を除いた根 茎） をメタノールあるいはアセトンなどの有機溶媒で抽出し、 抽出液より溶媒を 留去し、 その残留物を含水メタノールに溶解し、 これを n-へキサン、 石油ェ一テ ル等の低極性溶媒で抽出した後、 含水メタノール層から溶媒を留去し、 その残留 物を水、 メタノール、 エタノール、 クロ口ホルム、 エーテル、 n-へキサン、 ベン ゼン、 酢酸ェチルから選ばれる少なくとも一つを溶出溶媒として、 セフアデック ス LH- 20などのセフアデヅクス、 ダイアイオン HP-20などの多孔性ポリマ一、 ァ ルミナまたはシリカゲル等を担体に用いたカラムクロマトグラフィーに 1回また は複数回付し、 薄層クロマトグラフィ一で目的成分を確認しながら分画すること により得ることができる。 また、 ハンゲを水などで抽出後、 その水抽出液をエタ ノ一ル沈殿やダイアイオン HP-20などのような多孔性ポリマーによる分画ならび にシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどにより精製してもよい。 また場合に よってはアセトン、 メタノール、 エタノール等の適当な溶媒を用いて再結晶する ことにより精製してもよい。
さらに上記のようにして得られた化合物を必要に応じて、 公知の化学的、 また は生物化学的、 遺伝学的手法を適宜組み合わせてメチル化、 ェチル化、 ァセチル 化やベンゾィル化し、 種々の誘導体を作成できる。
本発明の化合物の構造解析の方法としては、 質量分析、 核磁気共鳴スペクトル などの公知の方法 [W. Herz and P. Kulanthaivel, Phytochemistry, 24 ( 1 ), 8 9-91, 1985 ; S. Ohnuma, T. Uehara, T. Namai, . Kodama, Y. Shiobara, Chem istry Letters, 577-580 ( 1986 ) ; M. Hamberg, Lipids, 26， 407-415 ( 1991 ) ; I . Ohtani, T. Kusumi, Y. Kashman, H. Ka isawa, J. American Chemical Societ y, 113, 4092-4096 ( 1991 ) ; K, Kouda, T. Ooi, K. Kaya, T. Kusumi, Tetrahed ron Letters, 37, 6347-6350 ( 1996 ) ; M. Kobayashi, T. Tawara, T. Tsuchida, H. itsuhashi, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 38， 3169-3171 ( 1990)]を 用いることができる。
ワクチン
本発明によるアジュバントに基づいて、 新規なワクチン製剤が提供される。 本 発明におけるワクチン製剤は、 狭義と広義のワクチンを含む。 すなわち、 1 ) ヒ ト及び動物におけるウィルス、 細菌、 真菌、 原虫、 その他の微生物による感染症 に有効な狭義のワクチンを含む。 その一部を例示すれば、 インフルエンザヮクチ ン、 百日せきワクチン、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン、 日本脳炎ワク チン、 A型肝炎ワクチン、 B型肝炎ワクチン、 口夕ワクチン、 麻しんワクチン、 風 しんワクチン、おたふくかぜワクチン、麻しん風しんおたふくかぜ混合ワクチン、 麻しん風しん混合ワクチン、 及びへモフィルスインフルエンザワクチン等の各種 ワクチンが挙げられる。 さらには、 多剤耐性黄色ブドウ状球菌（MRSA) ワクチン、 へリコパク夕一ピロリ （以下 H. ピロリと省略する） ワクチン、 出血性大腸菌 （E HEC) ワクチン、 サルモネラワクチン、 クラミジァワクチン、 マイコプラズマワク チン、 エイズワクチン、 マラリアワクチン、 コクシジゥムワクチン、 あるいは住 血吸虫ワクチンを含む。 2 ) さらに広義のワクチンとして、 がんワクチン、 不妊 ワクチン、 胃潰瘍ワクチン、 糖尿病ワクチン及び動脈硬化症ワクチンなど非感染 症の予防や治療に有効なワクチンを含む。 これらのワクチンは製造方法により分類される種々のワクチンを含む。 すなわ ち、 弱毒化生ワクチン、 不活化ワクチン、 コンポーネントワクチン、 DNA に基づ くワクチンなどを含む。 DNA に基づくワクチンの中には、 プラスミ ドなどのキヤ リヤーに組み込んだ DNA断片を含むワクチンのほか、 リボザィムゃアンチセンス オリゴヌクレオチドなどを併用するワクチンが含まれる。 これらのワクチンは、 治療用でも予防用でも良い。 また、 ワクチンの効果にとって有効な抗原成分を遺 伝子組み換え技術を応用して組み換え生物細胞に生産させたものを用いる組み換 えワクチンも含まれる。 これらのワクチンは単味ワクチンでも混合ワクチンでも 良い。 これらのワクチンの製造方法や使用形態を例示すれば次の通りである。 インフルエンザワクチン；発育鶏卵、 または、 ベロ細胞など動物細胞培養技術 により増殖させたウィルスをエーテル、 界面活性化剤などで分解精製して得られ る、あるいは遺伝子組み換え技術や化学合成によって得られる赤血球凝集素（HA)、 ノィラミニダ一ゼ （NA)、 核蛋白質 （NP)、 マトリヅクス蛋白質 （M) あるいはその 一部などを含むスプリットワクチン、 または、 これらの蛋白質の遺伝子を含む DN A断片をふくむ経鼻接種用 DNAワクチン。
百日せきワクチン；百日せき菌を培養した培養液あるいは菌体より塩析、 超遠 心分離などを用いて抽出し、 ホルマリンで無毒化した不活化ワクチン、 または、 遺伝子組み換え技術や変異剤処理で誘起した人工変異株生産物として得られる変 異体の百日せき菌毒素 （PT)、 赤血球凝集素 （FHA)、 69K膜タンパク質、 あるいは、 その部分べプチドなどを含むワクチン。
百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン；百日せきワクチンにジフテリアトキ ソィ ド （DT) および破傷風トキソィ ド （TT) を混合した三種混合ワクチン。
日本脳炎ワクチン；マウス脳内で増殖したウィルス、 またはべ口細胞など動物 細胞培養技術により増殖したウィルスを超遠心分離あるいはエチルアルコールな どを用いてウィルス粒子を精製した後、 ホルマリンで不活性化したもの、 あるい は遺伝子組み換え技術や化学合成などによって得た抗原蛋白質を含むワクチン。 B型肝炎ワクチン； B型肝炎キャリアの血液を原材料とし、 塩析、超遠心分離を 用いて HBs抗原を分離精製したプラズマワクチン、 あるいは遺伝子組み換え技術 や化学合成などによつて得た抗原部位などを含む組み換えワクチン。
麻しんワクチン；ニヮトリ胚細胞などの培養細胞、 またはべ口細胞など株化細 胞培養技術により増殖させた弱毒ウィルス生ワクチン、 あるいは、 ウィルスの一 部、 または、 遺伝子組み換え技術や化学合成によって得た感染防御抗原を含む組 み換えワクチン。
風しんワクチン；動物細胞またはヒト胎児細胞などの培養細胞、 またはべ口細 胞など株化細胞培養技術により増殖させたウィルス、 あるいは、 その一部、 また は、 遺伝子組み換え技術や化学合成によって得た感染防御抗原を含むワクチン。 おたふくかぜワクチン；家兎細胞などの培養細胞あるいは発育鶏卵で増殖させ たウィルス、 または、 その一部、 あるいは、 遺伝子組み換え技術や化学合成によ つて得た感染防御抗原を含む弱毒生ワクチン。
麻しん風しん混合ワクチン；麻しんワクチン、 風しんワクチンを混合した二種 混合ワクチン。
麻しん風しんおたふくかぜ混合ワクチン；麻しんワクチン、 風しんワクチン、 おたふくかぜワクチンを混合した三種混合ヮクチン。
ロタワクチン； A104細胞など培養細胞で増殖させたウィルス、 または患者の 糞便中より得たウィルス、 または、 その一部、 あるいは遺伝子組み換え技術や化 学合成により得た感染防御抗原を含むワクチン。
エイズワクチン ；培養細胞で増殖させたウィルス、 または患者より得たウィル ス、 または、 その一部、 あるいは遺伝子組み換え技術や化学合成により得た感染 防御抗原を含むワクチン、 あるいは有効な DNA断片を含む DNAワクチン。
H. ピロリワクチン；培養した H. ピロリ菌体の破砕物、 または、 H. ピロリ培 養物から分離したゥレア一ゼ、 熱ショック蛋白質、 トキシンなどを抗原とするヮ クチン、 あるいは、 遺伝子組み換え技術により生産されたこれらの抗原蛋白質か らなる注射用あるいは経口、 経鼻接種用ワクチン。
アジュバントの使用形態
本発明のアジュバントをワクチンの有効成分として用いる使用形態は特に限定 されない。 すなわち、 公知の種々の適切な使用形態が可能であり、 物理的混合や 抗原蛋白との化学的結合物でもよいし、 リポソ一ムなどのキヤリァ一に内包させ てもよい。
本発明のアジュバントは、 公知のアジュバン卜の 1種以上と同時に使用するこ とができる。 本発明のアジュバントと組み合わせるべき公知のアジュバントは、 免疫原となる抗原の種類、 接種する動物種、 あるいは安全性等の考慮すべき条件 に合わせて、 好適な組み合わせを経験的に見い出すことができる。 その結果、 抗 原の量を低下させたり、 もう一方のアジュバントの量を低下させ、 望ましくない 副反応を低下させ、 望ましい免疫反応を増強することができる。
アジュバン卜の混合法
本発明のワクチン製剤は、 上記免疫原と本発明のアジュバン卜をそれそれ別々 に調製するか、 または所定の量比で混合することにより調製される。 本発明のヮ クチン製剤は、 ワクチン抗原 （免疫抗原成分） と本発明のアジュバントをそれそ れ別々に調製、 製剤化しておき、 実施例に示す通り、 別々に投与するか、 または、 用時に混合してから接種するという方法によっても、 効果を発揮させることがで きる。 調製は厳密に無菌的に行なわなければならない。 それそれの原材料も完全 に無菌的でなければならない。 勿論、 ワクチン作用以外に必要のないパイロジェ ンゃアレルギー源となるような夾雑物質は可能な限り存在しない方が望ましい。 その為に必要な方法は、 この領域の専門家にとって公知である。
アジュバントの量比
本発明によるワクチン製剤におけるワクチン抗原 （免疫抗原成分） とアジュバ ントの量比としては、 例えば 1 : 0. 0001〜1 : 10，000 (重量比） を例示することがで きる。 この範囲はあくまでも一般的な範囲であり、 ワクチンの種類に応じて好適 な比率を決定して用いる。 その為に必要な方法は、 この領域の専門家にとって、 公知である。
ワクチンの性状
上記ワクチンは液状または粉末状で提供される。 粉末状とする場合には、 凍結 乾燥等の手法により、 粉末製剤とすることができる。 液状製剤であれば、 鼻腔内 接種（鼻腔内スプレー、 滴下、 塗布など)、 経口投与や注射に適している場合が多 い。 あるいは鼻腔内接種の場合は、 粉末スプレー方式も可能である。 また本発明 によるワクチン製剤には、 公知の安定剤や防腐剤を配合することができる。 安定 剤には、 0. 1〜0.2%程度のゼラチンゃデキストラン、 0.5〜1 のグルタミン酸ナト リウム、あるいは約 5 の乳糖や約 2%のソルビトール等が用いられる。防腐剤とし ては、 0.01%程度のチメロサールや 0.1%程度の/?—プロピオノラクトン、 0.5%程 度の 2-フエノキシエタノールが公知である。
ワクチン製剤の接種法
本発明によるワクチン製剤の使用方法は公知のどの方法も使用できる。
本発明のワクチン製剤においては、 ワクチン抗原 （免疫抗原成分） とアジュバ ント成分と混合して、 全体として接種することもできるし、 また、 これら成分を 別々に接種することもできる。 接種は、 好ましくは経口または経鼻で行われる。 これら成分を別々に接種する場合には、 例えば、 ワクチン抗原 （免疫抗原成分） を経鼻接種し、 アジュバント成分を経口投与しても、 免疫増強効果を発揮させる ことができる。
接種量はマウスの場合、 鼻腔内で 5 L〜50〃L、 経口で 0.05〜0.5mL、 ヒ卜の場 合は鼻腔内投与の場合は 0. 1〜1.0mL、 経口の場合は l〜100mLが好適である。 こ れらの量は適宜変更し得る。 また、 免疫抗原との組み合わせについては、例えば、 次に示す様な病原生物の免疫抗原では、 ワクチン効果の点で、 あるいは接種操作 の点で、 経鼻接種や経口接種が望ましいとされている。
インフルエンザウイルス、 口夕ウィルス、 麻しんウィルス、 風しんウィルス、 おたふくかぜウィルス、 エイズウイルス、 百日せき菌、 ジフテリア菌、 H. ピロリ 菌、 出血性大腸菌（EHEC)、 クラミジァ、 マイコプラズマ、 マラリア原虫、 コクシ ジゥム原虫、 および住血吸虫。
これらのワクチン抗原 （免疫抗原成分） は、 単独で接種される場合もあるし、 百日せき ·ジフテリア ·破傷風三種混合ワクチン、 あるいは麻しん ·風しん二種 混合ワクチンのような形で同時接種の形を採用することもできる。 経鼻接種や経 口接種が望ましい理由は、 いずれも気道や消化管の粘膜が感染ルートとなってい るためである。感染ルートである局所粘膜における免疫機構を誘導するためには、 それに適した免疫誘導活性の強いアジュバントが望ましい。 あるいは、 マラリア 原虫ワクチンのように必ずしも充分な医療設備の期待できない地域で使用される 機会が多いワクチンについては、 医師や看護婦といった専門の技術者でなくても 接種が可能な経鼻接種や経口接種といった接種ルートが望まれる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のアジュバント、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の1 H-NMRのパターンを示す図である。図中の「CD2I10D」は溶媒由来のシグナルを 示す。
図 2は、 本発明のアジュバント、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の1 3 C- NMRのパターンを示す図である。 図中の 「£D2H0D」 は溶媒由来のシグナル を示す。
図 3は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを用いたものを経鼻接種したときの血清中の一次抗体産生の結果を示すグラフ である。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用したアジュバントの 種類を示す。
図 4は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを用いたものを絰鼻接種したときの鼻腔洗液中の二次抗体産生の結果を示すグ ラフである。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用したアジュバン 卜の種類を示す。
図 5は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを経鼻接種し、 アジュバントを経鼻投与したときの血清中の二次抗体産生の結 果を示すグラフ。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用したアジュ バントの種類を示す。
図 6は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを絰鼻接種し、 アジュバントを経鼻投与したときの肺洗液中の二次抗体産生の 結果を示したグラフ。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用したァ ジュバン卜の種類を示す。
図 7は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを皮下接種し、 アジュバントを経口投与したときの血清中の二次抗体産生の結 果を示したグラフ。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用したアジ ュバン卜の種類を示す。
図 8は、 本発明のワクチン製剤のうち、 ワクチンとしてインフルエンザヮクチ ンを皮下接種し、 アジュバントを経口投与したときの鼻腔洗液中の二次抗体産生 の結果を示したグラフ。 図中、 縦軸は抗体価 （ELISA単位） を、 横軸は使用した アジュバン卜の種類を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を示すが、 本発明は何らこれらに限定されるものではな い。
実施例 1 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸の調製— 1
9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acidは公開特許公報 （特開平 3— 2587 75 号公報、 「脂肪酸化合物類および該脂肪酸化合物類を有効成分とする抗圧剤」） に記載される方法に準じて製造した。 ハンゲ lkgをメタノールで加熱抽出し、 抽出液から溶媒を減圧留去し、 メ夕ノ —ルエキス 21.2gを得た。このメ夕ノールエキスを 90 (v/v)メ夕ノ一ル-水混液 1 OOmLに溶解した後、 分液ロートに移し、 n-へキサン 50mLを加えて軽く振り混ぜ た後、 静置した。 下層を分取し、 半量まで濃縮した後、 これをダイアイオン HP- 2 0 (三菱化成製） カラムを用いた疎水性クロマトグラフィーに付し、 最初に水、 次 いで 50%(v/v)メタノール-水混合液、 最後にメタノールで溶出を行った。 このメ 夕ノール溶出部 530mgをセフアデックス LH- 20 (アマシャムフアルマシアバイオ テク社製） カラムクロマトグラフィー、 次いでシリカゲルを用いた順相カラムク 口マトグラフィ一、 / - Bondapak C18 (ウォーターズ社製）カラムを用いた逆相高 速液体クロマトグラフィーを用いて 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic ac i dを無色油状物質として得た。収量は 10m であった。本油状物質の構造は原化合 物およびその誘導体の質量分析や核磁気共鳴スペクトル （NMR)、 比旋光度などに より決定した。本物質の1 H-NMRおよび1 3 C-NMRのパ夕一ンを図 1および 2に各々 示す。
実施例 2 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸の調製— 2
本発明の 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid をハンゲの熱水抽出ェ キスから調製した実施例を示す。
ハンゲ 500gを水 10Lを用いて液量が半量となるまで煎出し、抽出液をろ取した。 残渣については再度同様の方法により煎出し、 抽出液を合わせて凍結乾燥するこ とにより熱水抽出エキスを得た （収率： 19.8%)。 本熱水抽出エキスをメタノール 2.5Lを用いて還流し、 メタノール可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分に ついて同様の操作を 2回繰り返した。メタノール不溶性画分を再度水に溶解後、 4 倍容量のエタノールを加えて一晩撹拌した後、 沈殿と上清を分取した。 沈殿はさ らに分子量排斥限界 10 , 000 のセルロース製透析膜を用いて蒸留水に対して透析 し、 その後透析内液を凍結乾燥することにより非透析性画分を得た （収率： 0.6%)c この非透析性画分を水で溶解し、 ダイアイオン HP- 20と共に撹袢後、 ダイアイォ ン HP-20を水で洗浄することにより未吸着画分を除去した。 ダイアイオン HP- 20 はさらに 20%(v/v)、次いで 80¾(v/v)-メ夕ノール-水混液で順次洗浄することによ り吸着物質を溶出させた後、 メタノールを用いて吸着画分を溶出させ、 メタノー ル溶出画分を得た （収率： 0.06 )。 このメタノール溶出画分をシリカゲルカラム クロマトグラフィーを用いて繰り返し分画することにより本発明の 9, 12，13-tri hydroxy - 10E - octadecenoic acidを得た。 収量は 0.35m であった。
また、 ハンゲ熱水抽出エキスのメタノール還流で得られたメタノール可溶性画 分 （45.4 g ) についても 200mLのメタノール—水混液 （9 : 1) で溶解後、 等量の n -へキサンで振とう抽出し、 下層を得た。 この下層の溶媒を減圧留去後、 80%メ 夕ノール一水混液中でダイアイオン HP- 20と撹拌し、同溶媒でダイアイオン HP-2 0を洗浄することにより未吸着画分を除去した。 さらにダイアイオン HP-20をメ 夕ノールを用いて溶出させることにより吸着画分を得た。 本吸着画分をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィ一により数回分画することにより本発明の 9, 12，13-t rihydroxy - 10E- octadecenoic acid (1.2mg) を得た。
ヒドロキシ不飽和脂肪酸がアジュバントとして有効であることを、 公知の生物 学的方法により確認した。 ヒドロキシ不飽和脂肪酸が各種ワクチンに対し、 抗体 産生増強活性を有し、 アジュバントとして有効であることを確認した実施例を以 下に示す。
実施例 3 .鼻腔内接種されたインフルエンザ HAヮクチンの一次免疫に対する抗体 産生促進作用
精製インフルエンザウイルス（A/PR/8/34)よりエーテル処理によって脂質成分 を除去して HAワクチン （タンパク質量として lmg/mL) を調製した。 実施例 1に 記載した方法で精製した 9, 12, 13- trihydroxy-10E- octadecenoic acid の水性溶 液を調製し、 ヒドロキシ不飽和脂肪酸溶液とした。 なお、 ここで用いた 9, 12, 13- trihydroxy-10E-octadecenoic acidの純度は、 約 95%以上であった。 BALB/cマ ウス （雌性、 7週齢） に本ヒドロキシ不飽和脂肪酸水溶液をマウスの体重当たり 5 0〃g/kgの用量で 5 日間経口ゾンデを用いて胃内強制投与した。 ヒドロキシ不飽 和脂肪酸の経口投与開始 3日目にマウスをァモバルビ夕一ルナトリウムで麻酔し、 右側鼻腔にマイクロピペットで 10〃Lのワクチンを滴下した。 2週間後、 マウス の眼底静脈叢より採血し、 血清を調製した。 血清中の抗インフルエンザウイルス IgA抗体価は酵素免疫測定法 （ELISA) により測定した。 血清は 20mM リン酸ナト リウム緩衝液 （pH 7.0) で平衡化したプロテイン Gセファロ一スカラム 4FF (ァ マシャムフアルマシアバイオテク社製）にのせ、カラムを 20mMリン酸ナトリウム 緩衝液 （pH 7.0) で洗浄することにより未吸着画分を得た。
抗インフルエンザウイルス IgA抗体の定量の際には、 コ一ティング緩衝液 （10 mM炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液 pH 9.6) に懸濁した HAワクチン （5〃g/ml) 10 0 1で、 先ず 96穴の EIAプレートの各孔 （well) をコートした。 室温に 2時間 放置後、リン酸緩衝生理食塩水 ( PBS ) - 0.05%ツイ一ン 20でプレートを洗浄した。 次に、 非特異反応を抑制する目的で、 ブロッキング溶液 [1%牛血清アルブミン（B SA)および 0. 1% NaN3を含む PBS] 300〃Lで各孔をコ一トした。 4°Cに一晩放置後、 PBS -ツイーン 20で洗浄し、 各孔に 100//Lずつプロッキング溶液で希釈した検査 試料を加えた。 抗インフルエンザウイルス IgA抗体の定量の際には、 血清のプロ ティン Gセファロ一スカラム未吸着画分を試料として用いた。 室温に 2時間放置 後、 PBS-ツイ一ン 20でプレートを洗浄した。次に各孔にブロッキング溶液で希釈 したアルカリホスファタ一ゼ標識山羊抗マウス IgAひ鎖特異抗体 （ザィメットラ ボラトリーズ社製） を 100〃Lずつ加えた。 室温に一晩放置後、 PBS -ツイ一ン 20 で洗浄した。 最後に、 各孔に 10%ジエタノールァミン緩衝液 （pH 9.8) に溶解し た P-ニトロフヱニルリン酸 （lmg/mL；和光純薬工業株式会社製） を加えて発色さ せた。 37°Cで 20〜30分放置後、 発色をマイクロプレートリーダ一で O. D. (405nm) を測定した。
図 3は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の血清中の抗インフルェ ンザウイルス抗体価に対する影響を示したものであるが、ワクチンを絰鼻接種し、 アジュバントを含まない水性溶媒を経口投与した場合には、 低いレベルの抗体し か検出されなかった。 しかし、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acidを経 口投与した場合、 強く血清中の抗ィンフルェンザウィルス IgA抗体価を上昇させ た。以上の結果は、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acidの経口投与によ り、経鼻接種したインフルエンザ HAワクチンに対する血中での抗体産生が増強さ れることを示している。
実施例 4 . インフルエンザ HAヮクチンの二次免疫に対する抗体産生促進作用
実施例 3に記載した方法と同様にしてインフルエンザ HAワクチンと 9， 12, 13-t rihydroxy-lOE-octadecenoic acidの水性溶液を調製した。雌性、 7週齢の BALB/ cマウスに試料溶液をマウスの体重当たり 50〃g/kgの用量で 1〜5 日間経口ゾン デを用いて胃内強制投与により経口投与した。 9， 12, 13-trihydroxy-10E-octadec enoic acidの経口投与開始当日もしくは 3日目にマウスにァモバルビ夕一ルナト リウムを腹腔内投与して麻酔し、 ワクチン 10 zL (l-5〃g/マウス） をマウスに経 鼻接種した。 マウスを約 3週間飼育後、 ワクチンのみをさらに二次経鼻接種する かもしくは、 ワクチンを二次接種し、 ヒドロキシ脂肪酸を経口投与した。 さらに 2 週間飼育後、 鼻腔洗液を調製した。 鼻腔洗液は、 マウスの左右の鼻腔より 2mL の 0.1% BSAを含む PBSを灌流することによって回収した。鼻腔洗液中の抗インフ ルェンザウィルス IgA抗体価は ELISAにより測定した。
図 4は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の二次応答による鼻腔洗 液中の抗ィンフルェンザウィルス IgA抗体産生に対する影響を示したものである c ワクチンを経鼻接種し、 アジュバント無投与のときには、 低いレベルの抗インフ ルェンザウィルス IgA抗体しか検出されなかった。これに対し 9，12，13- trihydro xy-10E-octadecenoic acid を経口投与したグループでは強く鼻腔洗液中の抗ィ ンフルェンザウィルス IgA抗体価を上昇させた。
次に、 アジュバント特異的抗体 （IgG, IgA) および IgEの検出を行った。 ヒド ロキシ不飽和脂肪酸とキヤリアタンパク質である牛血清アルブミンとの結合物を 調製し、 この溶液（l /g/ml) 100〃1で、 先ず 96穴の EIAプレートの各孔（well) をコートした。 次いで、 非特異的反応を抑制する目的で、 ブロヅキング溶液（5% スキムミルクを含む PBS) 300〃1でプレー卜の各孔を 1時間コートした。その後、 種々の濃度に希釈した検体（鼻腔洗液） 100 / 1を各孔に添加して 1時間抗原抗体 反応を行い、 PBS-0.05%ツイーン 20で 3回洗浄した。これに二次抗体としてペル ォキダーゼ標識抗マウス IgG、 IgAまたは IgE抗体（1 : 1000) 100 i lを添加して 1 時間反応させた。 PBS-ツイーン 20で 3回洗浄後、 基質溶液（0.003% 過酸化水素 水、 ABTS 0.3mg/mlを含む 0. 1Mクェン酸緩衝液 pH4) 100 lを加え、 15分間ィ ンキエべ一トして発色させた。 マイクロプレートリーダーを用いて O.D . (405nm) を測定した。 その結果、 ヒドロキシ不飽和脂肪酸を絰鼻投与したマウスと投与し ていないコントロールマウスで、 鼻腔洗液において吸光度に差は認められなかつ た。 この結果より、 アジュバント特異的抗体 （IgG, IgA) および IgEは検出され なかった。
上記のように、 9, 12, 13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acidにより抗インフル ェンザウィルス IgA抗体価が上昇した結果は、 ワクチンの一次接種時に経口投与 された 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic ac idが、ワクチンの二次接種によ る気道における抗体産生を強く誘導する作用があることを示している。 即ち、 9， 12, 13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acidが HAワクチンに対するメモリ一効果 を強く誘導する作用があることを示している。 用いたヒドロキシ脂肪酸は低分子 化合物であることから予想されるとおり、 免疫原性は低く、 副反応惹起性が低い ことが示唆された。
実施例 5 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸の毒性
実施例 1で調製したヒドロキシ不飽和脂肪酸 ( 1 ) ( 9, 12，13- trihydroxy- 10E- oc tadecenoic acid), およびこれから調製したメチルエステル誘導体 (2 ) (methyl 9, 12， 13-trihydroxy- lOE-octadecenoate)ヽ トリァセチル誘導体（ 3 ) ( 9, 12, 13-tri acetoxy- 10E- octadecenoic acid)、 トリァセチルメチルエステル誘導体 (4) (met hyl 9,12,13- triacetoxy-lOE-octadecenoate) をマウスに投与し、 急性毒性を調 ベた。 （1)〜(4)の化合物の化学構造式を順に以下に示す。
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000024_0004
化合物（2)(methyl 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoate)は、化合物（1)(9, 12,13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid) をエーテルに溶解後、 過剰量のジァ Vメタン—エーテル溶液を加えて数分間室温で反応させた。 反応溶液から溶媒を 留去し（2)を得た。 化合物（3)(9，12，13- triacetoxy-10E- octadecenoic acid)は、 化合物（1 )( 9， 12， 13-trihydroxy- 10E- octadecenoic acid)を酢酸ナトリゥム存在下、無水酢酸中で 約 1時間還流後、 反応生成物をクロ口ホルム一水で分配抽出し、 クロ口ホルム層 より（3)を得た。
化合物（1 )より化合物 (2)を合成後、（3)を合成する方法を用いて変換し、化合物 (4) (methyl 9, 12, 13 - triacetoxy - 10E - octadecenoate)を得た。
( 1 )〜(4)の化合物（純度 95%以上）は 30mg/kgの腹腔投与と 100mg/kgの経口投 与において毒性の兆候を示さなかった。
実施例 6 .百日せきジフテリァ破傷風混合ワクチン（経鼻）—ヒドロキシ不飽和脂 肪酸 （経口） 製剤
ZO JLL 中に百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンを蛋白質窒素として 50 g 含むように調製した。 また、 PBSに溶解し濾過滅菌した 9, 12, 13-trihydroxy-lOE -octadecenoic acid 10 gを 0.5mL中に含むように調製した。これらに防腐剤（0. 005%チメロサール） を加え、 容器に分注して、 百日せきジフテリア破傷風混合ヮ クチン （経鼻） —ヒドロキシ不飽和脂肪酸 （経口） 接種剤とした。 本品は 10 C以 下の冷暗所に保存した。
上記のように調製した百日せきジフテリァ破傷風混合ワクチンをマウスの鼻腔 内に接種し、 9, 12， 13-trihydroxy-10E- octadecenoic acidをその前後に経口投与 した。 さらに 4週間後に同量のワクチンを追加接種し、 抗体産生を調べた。 試験 成績から、 百日せきジフテリァ破傷風混合ヮクチンのみを接種された対照群のマ ウスでは、 血中の抗百日せき毒素 （PT) -IgG抗体は、 156 ELISA単位、 抗ジフテ リアトキソィ ド （DT) -IgG抗体は、 11 ELISA単位、 抗破傷風トキソィ ド （TT) - IgG抗体は、 13 ELISA単位であつたのに対し、 9, 12， 13- trihydroxy- 10E- octadec enoic acid を併用経口投与したものでは、 血中の抗 PT- IgG抗体は、 442 ELISA 単位、 抗 DT- IgG抗体は、 70 ELISA単位、 抗 TT- IgG抗体は、 75 ELISA単位であつ た。 また、 百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンのみを接種された対照群のマ ウスでは、 鼻腔洗液中の抗 PT-IgA抗体は、 6 ELISA単位、 抗 DT- IgA抗体は、 3 E LISA単位、 抗 TT- IgA抗体は、 4 ELISA単位であつたのに対し、 9, 12, 13-trihydr oxy-10E-octadecenoic acidを併用したワクチンでは、鼻腔洗液中の抗 PT- IgA抗 体は、 14 ELISA単位、 抗 DT- IgA抗体は、 11 ELISA単位、 抗 TT- IgA抗体は、 11 ELISA単位であった。
実施例 7 . 麻しん風しん混合ワクチン （経鼻） —ヒドロキシ不飽和脂肪酸（経口） 製剤
麻しん風しん混合ワクチンを、 20〃L中に各々のワクチン 7〃g相当量のウィル ス粒子を含むように調製した。 また、 PBSに溶解し濾過滅菌した 9, 12, 13- trihyd roxy-lOE-octadecenoic acidを 0.5mL中に 2.5/ g含むように調製した。 これら に安定剤 （0.2%豚製ゼラチン、 0.1 グルタミン酸ナトリウム、 5 乳糖） を加え、 容器に分注して、 麻しん風しん混合ワクチン—ヒドロキシ不飽和脂肪酸点鼻、 経 口剤とした。 本品は 10°C以下の冷暗所に保存した。
上記のように調製した麻しん風しん混合ワクチンを 3週間隔で 2回マウスに投 与し、 1回目の接種の前後にだけ 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acidを 経口投与して、 血中の抗体産生をみた。 試験成績から、 ワクチンのみを接種した 場合に産生される ELISA抗体価は麻しん、 風しんのそれそれは、 0.14、 0.09であ つたのに対し、 9, 12, 13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acid併用ワクチンは、 各々 0.30、 0.29であった。
実施例 8 . 口夕ワクチンーヒドロキシ不飽和脂肪酸エステル製剤（経口、 点鼻剤） の調製
中に口夕ワクチン 3.3 g相当量のウィルス粒子を含むように調製した。 また、 実施例 5で用いたメチルエステル誘導体 (2) (methyl 9, 12, 13-trihydroxy -10E-octadecenoate) を PBSに溶解し、 0.5mL中に 10〃g含むように調製し、 瀘 過滅菌した。 これを容器に分注して、 ロタワクチンーヒドロキシ不飽和脂肪酸経 口、 点鼻剤とした。 本品は 10°C以下の冷暗所に保存した。 上記のように調製した口夕ワクチンを 3週間隔で 2回マウスに接種し、 1回目 の接種の前後にだけメチルエステル誘導体を経口投与して、 血中の抗体産生をみ た。 試験成績から、 ワクチンのみを接種した場合に産生される EL I SA抗体価は、 ワクチン点鼻接種の場合、 0.089 であったのに対し、 メチルエステル誘導体併用 ワクチンは、 0.38であり、 また、 ワクチンも経口接種の場合、 アジュバント無接 種対照群マウスでは 0. 018であったのに対し、 メチルエステル誘導体添加ヮクチ ン接種群では、 0.27であった。
実施例 9 . マイコプラズマワクチン—ヒドロキシ不飽和脂肪酸製剤 （点鼻、 経口 剤） の調製
Z ju 中にマイコプラズマワクチン 2. 0 x l0 1 G CFU (コロニー形成単位） 相当 量のウィルス粒子を含むように調製した。また、 PBSに溶解し濾過滅菌した 9, 12， 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acidを 0. 5mL中に 10 zg含むように調製した。 これらを容器に分注して、 マイコプラズマワクチンーヒドロキシ不飽和脂肪酸製 剤点鼻、 経口剤とした。 本品は 10°C以下の冷暗所に保存した。
上記のように調製したマイコプラズマワクチンを 2週間隔で 3回マウスに経鼻 投与し、 1回目の接種の前後にだけ 9， 12, 13- trihydroxy- 10E-octadecenoic ac id を経口投与して、 マイコプラズマ感染攻撃後病変をみた。 試験成績から、 ヮクチ ンのみを投与された対照群のマウスは 10匹すべてに病変が認められたのに対し、 9, 12, 13- trihydroxy- 10E-octadecenoic acidを併用したものでは 10匹当たり 3 匹のみに病変が認められた。 病変数の平均値では、 ワクチンのみでは 302であつ たのに対し、 9， 12, 13- trihydroxy- 10E-octadecenoic acid併用ワクチンでは 178 であった。
実施例 1 0 .インフルエンザ HAワクチンの経鼻接種による二次免疫に対する経鼻 投与による抗体産生促進作用
実施例 3に記載した方法と同様にしてィンフルェンザ HAワクチン（タンパク質 量として O . lmg/mL) を調製した。 これに、 試料の PBS溶液 （0. 1mg/mL) を等量混 合し、 接種材料を調製した。 雌性、 7週齢の BALB/cマウスにァモバルビ夕一ルナ トリゥムを腹腔内投与して麻酔し、両側の鼻腔に接種材料を 10〃Lずつ接種した。 マウスを 3週間飼育後、 ワクチンと試料の混合液をさらに二次経鼻接種した。 さ らに 16日間飼育後、 血清および肺洗液を調製した。肺洗液は、放血後のマウスの 気管から 2mLの 0. 1 BSAを含む PBSを注入し、肺を 2回灌流することによって回 収した。 血清および肺洗浄液中の抗インフルエンザウイルス IgG抗体価は ELISA により測定した。
抗インフルエンザウイルス IgG抗体の定量の際には、 コーティング緩衝液 （BS A 10〃g/mLを含む 10mM炭酸-重炭酸ナトリウム緩衝液 pH9.6)で希釈した抗マウ ス IgGモノクローナル抗体 （mAb) (ファーミンジェン社製） 100〃Lで、 先ず 96 穴の EIAプレートの各孔 （wel l ) をコートした。 37°Cで 3時間放置後、 各孔の液 を捨て、 非特異的結合を抑制する目的で、 ブロッキング溶液 （1 スキムミルクお よび 0. 1%NaN3を含む PBS) 300〃Lで各孔をコートした。 37°Cで 1時間放置後、 PB S-ツイ一ン 20で洗浄し、 各孔に 100//Lずつプロヅキング溶液で希釈した検査試 料を加えた。室温に一晩放置後、 PBS-ツイーン 20でプレートを洗浄した。次に各 孔にブロッキング溶液で希釈したピオチン標識 HAワクチン （1 zg/ mL) を 100〃 Lずつ加えた。振蕩しながら室温に 1時間放置後、 PBS-ツイーン 20で洗浄した。 次に、 各孔にブロッキング溶液で希釈したストレブトアビジン- ? -ガラクトシダ ーゼを 100 ^Lずつ加えた。 振蕩しながら室温に 1時間放置後、 PBS-ツイ一ン 20 で洗浄した。 さらに、 各孔に 0. 1M NaCK lmM MgCl2、 0. 1% BSAおよび 0. 1% NaN3 を含む 10 mM リン酸ナトリゥム緩衝液 （pH7.0) に溶解した O. lmM 4-メチルゥン ベリフェリル- ? -ガラクトシド （シグマ社製） を 100〃Lずつ加え、 37°Cで 2時間 放置した。 最後に、 各孔に 0. 1Mグリシン- NaOH緩衝液 （pH10.3) を 100〃Lずつ 加え、 蛍光プレートリーダ一（フロウラボラトリーズ社製）で蛍光（Ex. 355 nm、 Em. 460 nm)を測定した。
図 5は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic ac id の二次応答による血清中 の抗インフルエンザウイルス IgG抗体産生に対する影響を示したものである。 9, 12, 13-trihydroxy-lOE-octadecenoic acidはマウス 1匹当り i sの用量で血清 中の抗ィンフルェンザウィルス IgG抗体価を HAワクチン単独の場合よりも上昇さ せた。
図 6は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の二次応答による肺洗液 中の抗ィンフルェンザウィルス IgG抗体産生に対する影響を示したものである。 ワクチンのみを鼻腔内接種したときには、 低いレベルの抗ィンフルェンザウィル ス IgG抗体しか検出されなかった。 これに対し、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octad ecenoic acid とワクチンを接種したグループではそれそれマウス 1匹当り 1 zg の用量で肺洗液中の抗インフルエンザウイルス IgG抗体価を有意に上昇させた。 これらの結果は、アジュバントとして用いられた 9，12, 13- trihydroxy-10E-oct adecenoic acidが、経鼻投与においても血清中および肺中で抗体産生を誘導する 作用があることを示している。
実施例 1 1 .インフルエンザ HAワクチンの皮下接種による二次免疫に対する経口 投与による抗体産生促進作用
実施例 3に記載した方法と同様にしてィンフルェンザ HAワクチン（タンパク質 量として 10〃g/mL) と試料の水性溶液を調製した。雌性、 7週齢の BALB/cマウス に試料溶液をマウス 1匹当たり l//gの用量で経口ゾンデを用いて胃内強制投与に より経口投与し、 ワクチン O. lmLを腹部に皮下接種した。マウスを 2週間飼育後、 同様に試料を経口投与し、 ワクチンを二次皮下接種した。さらに 10日間飼育後、 血清および鼻腔洗液を調製した。 血清および鼻腔洗浄液中の抗ィンフルェンザゥ ィルス IgA抗体価は ELISAにより測定した。 抗インフルエンザウイルス IgA抗体 の定量の ELISAはキヤプチヤ一抗体として抗マウス IgA niAb (ファーミンジェン 社製） を用いた以外は実施例 1 0と同様にして行なった。
図 7は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid の二次応答による血清中 の抗インフルエンザウイルス IgA抗体産生に対する影響を示したものである。 9， 12，13- trihydroxy-lOE- octadecenoic ac idはマウス 1匹当り の用量で血清 中の抗ィンフルェンザウィルス IgA抗体価を HAワクチン単独の場合よりも有意に 上昇させた。 また、 9，12，13-trihydroxy-10E- octadecenoic acidのアジュバント 活性は陽性対照として用いた同用量の CTBと同程度であった。
図 8は 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic ac id の二次応答による鼻腔洗 液中の抗ィンフルェンザウィルス IgA抗体産生に対する影響を示したものである。 ワクチンのみを皮下接種し、 アジュバント無投与のときには、 低いレベルの抗ィ ンフルェンザウィルス IgA抗体しか検出されなかった。 これに対し、 9 , 12 , 13 - tr i hydroxy- 10E- oc tadec eno i c acidを経口投与したグループではマウス 1匹当り 1 USの用量で鼻腔洗液中の抗ィンフルェンザウィルス IgA抗体価を有意に上昇さ せた。 また、 9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic ac idのアジュバント活性は 陽性対照として用いた同用量の CTBと同程度であった。
これらの結果は、アジュバントとして用いられた 9, 12, 13-trihydroxy-lOE-oct adecenoic ac idが、 経口投与により皮下接種ワクチン （現行ワクチン） に対して も血清中および鼻腔中で抗体産生を誘導する作用があることを示している。 産業上の利用の可能性
以上の実施例により、 本発明の効果として、 次のことが明らかである。
1 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸で構成される本発明のアジュバントは、経口投与す ることにより経鼻接種や皮下接種したィンフルェンザ HA ワクチン等に対する抗 体産生を増強する。
2 . 本発明のアジュバントを経口投与し、ワクチン抗原を鼻腔や皮下ルートで接 種すると、 血中の抗体産生と共に局所 （鼻腔） の抗体産生も増強される。 すなわ ち、 本発明のアジュバントを使用することによって、 ワクチン抗原の接種量を減 少させることができ、 副反応の軽減につながる。
3 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸の毒性は低く、 また免疫原性も低いので、本発明の アジュバントを併用するワクチンは、 安全性の高いワクチンである。
以上に説明したように、 本発明によるアジュバントを構成成分とするワクチン 製剤は、 ワクチンによるウィルスおよび細菌感染の予防あるいは治療に有効な薬 剤として期待される。

Claims

請求の範囲
1 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸またはその誘導体を含むアジュバント。
2 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸またはその誘導体が、 トリヒドロキシ一モノエン 構造を有する炭素数 18の不飽和脂肪酸またはその誘導体である、請求項 1に記載 のアジュバント。
3 . トリヒドロキシーモノエン構造を有する炭素数 18の不飽和脂肪酸またはそ の誘導体が下記の構造で示される 9, 12, 13-トリヒドロキシ -10E-ォク夕デセン酸
(9, 12, 13-trihydroxy-10E-octadecenoic acid) またはその誘導体である、 請求 項 2に記載のアジュバント。
R
Figure imgf000032_0001
[式中、 M は水酸基、 あるいは 1個または 2個のアルキル基またはァリール基が 1個の酸素、 硫黄、 または窒素原子に結合した構造の置換基であり、 R2、 R3, お よび R4は同一または異なっていてもよい水素、 アルキル基、 またはァシル基を示 す。 ]
4 . ヒドロキシ不飽和脂肪酸が生薬より調製したヒドロキシ不飽和脂肪酸また はその誘導体である、 請求項 1〜3のいずれかに記載のアジュバント。
5 . 請求項 1〜4のいずれかに記載のアジュバントを構成成分とするワクチン 製剤。
6 . ワクチン製剤中のアジュバントが免疫抗原成分と別に経口接種に用いられ る、 請求項 5に記載のワクチン製剤。
7 . ワクチン製剤中の免疫抗原成分が経鼻接種、 皮下接種、 経口接種、 筋肉内 接種、 またはその他の粘膜を介した接種に用いられる、 請求項 6に記載のヮクチ ン製剤。
8 . 免疫抗原成分として、 インフルエンザウイルス、 口夕ウィルス、 麻しんゥ ィルス、 風しんウィルス、 おたふくかぜウィルス、 エイズウイルス、 百日せき菌、 ジフテリア菌、 へリコパク夕一 'ピロリ菌、 出血性大腸菌（EHEC)、 クラミジァ原 虫、 マイコプラズマ原虫、 マラリア原虫、 コクシジゥム原虫、 および住血吸虫で 構成される群から選択される単一または複数の病原微生物の抗原を含む、 請求項 5から 7のいずれかに記載のワクチン製剤。
9 . ワクチン製剤中のアジュバントを免疫抗原成分と別に経口投与する、 請求 項 5に記載のヮクチン製剤の投与方法。
1 0 . 免疫抗原成分を経鼻接種、 皮下接種、 経口接種、 筋肉内接種、 またはそ の他の粘膜を介して接種する、 請求項 9に記載のワクチン製剤の投与方法。
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