WO2000037673A1 - METHODE ET KIT D'IDENTIFICATION DE $i(PLASMODIUM FALCIPARUM) - Google Patents

METHODE ET KIT D'IDENTIFICATION DE $i(PLASMODIUM FALCIPARUM) Download PDF

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WO2000037673A1
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rapd
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Ludmel Urdaneta
Michel Tibayrenc
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the subject of the invention is a method and a diagnostic kit for the identification of Plasjn ⁇ dium falciparum in an isolate.
  • Plasmodlum falciparum the etiological agent of the most serious form of malaria, causes 1.5 to 2.7 million deaths each year, mainly in children under 5 in sub-Saharan Africa (WHO, 1997).
  • the incidence of malaria worldwide is estimated at 300-500 million clinical cases per year. It is estimated that around 2,300 million people live in areas where there is a risk of malaria. These endemic areas are found in 100 countries, including Venezuela.
  • Identification of the malaria parasite is usually done by traditional microscopic diagnosis, which is inexpensive and easy to use in the field. Nevertheless, the sensitivity of the method microscopy requires highly qualified examiners, and is time consuming when a large number of samples are to be examined. Such a method is therefore not suitable for large-scale epidemiological surveys.
  • RAPD markers have been widely used in the study of genetic diversity and population structure of several human pathogenic protozoa.
  • the RAPD technique consists in amplifying fragments of genomic DNA with a single short primer (10 bases in length in general) whose sequence is determined randomly. This method allows rapid detection of polymorphisms useful for the genetic identification of isolates and also makes it possible to establish a genomic mapping.
  • RAPD polymorphism is detected by the presence or absence of amplified bands in different parasite isolates, or by variations in size or intensity due to differences in site primer hybridization, caused by mutation, deletion or insertion of DNA sequences.
  • the invention therefore aims to provide a method and a kit for the identification of Plasmodlum falciparum in an isolate, and the establishment of a reliable diagnosis and easy implementation.
  • the method of identification of Plasmodlum falciparum which comprises the identification of genomic DNA amplicons originating from an isolate using RAPD markers, is characterized by the implementation of a limited set amplification primers, allowing discrimination of Plasmodlum falciparum compared to other Plasmodlum species.
  • primers capable of amplifying DNA fragments of Plasmodlum falciparum of approximately 1150 bases are thus used, as identified in electrophoresis for amplicons of Plasmodlum falciparum isolates with primers of sequence U10 5.
  • primers of sequence U10 5 'ACCTCGGCAC3' or R6 5 'GTCTACGGCA3 •, under the conditions described in the example section.
  • Such primers advantageously comprise 8 to 15 nucleotides, preferably 10 nucleotides.
  • the method according to the invention is more particularly characterized by the use of a set of 2 RAPD primers designated by U10 and R6, corresponding respectively to the sequences:
  • the RAPD primers chosen generate clear and very reproducible amplification profiles.
  • these primers are sufficient in themselves to identify all the strains of Plasmodlum falciparum.
  • the primers used according to the invention can be obtained by synthesis.
  • the RAPD technique provides specific DNA fragments which can be isolated and analyzed by sequencing. They therefore give the possibility of synthesizing either specific probes or specific primers for the development of PCR-diagnostics. Their sequencing makes it possible to verify their value as a synapomorphic marker.
  • the invention also relates to diagnostic kits or kits for the implementation of an identification method as defined above.
  • RAPD primers as defined above, in particular at least the 2 RAPD primers U10 and R6 with, where appropriate,
  • kits can be easily implemented routinely in the laboratory, allowing a rapid identification process to be carried out.
  • FIGS. 1 and 2 represent, respectively, the amplification profiles of natural isolates of Plasmodlum falciparum from different geographical origins, and other taxonomic groups, with primers according to the invention .
  • FIGS. 1 and 2 represent, respectively, the amplification profiles of natural isolates of Plasmodlum falciparum from different geographical origins, and other taxonomic groups, with primers according to the invention .
  • Plasmodlum falciparum isolates from Kenya two reference clones of Plasmodlum falciparum [3D7 (Africa) and HB3 (Honduras)], and 4 other species of Plasmodlum (P. clnomolgy, P. vivax, P. malarlae and P. chabaudl ) were included in the sample.
  • the freezing of the cultivated isolates was carried out by favoring samples having a moderate or high parasitaemia.
  • the isolate must have a large proportion of young stages (trophozoites), since the old forms (schizonts) are destroyed when thawed.
  • the pellet of parasitized red blood cells is resuspended in a volume of V / V freezing solution (28% glycerol; 3% sorbitol or mannitol; 0, 65% NaCl), sterilized by filtration on a 0.22 ⁇ m porosity membrane.
  • the cell suspension is gently homogenized and distributed in batches of 1 ml in freezing tubes. The aliquots are immediately frozen by immersion in liquid nitrogen.
  • genomic DNA of the parasite is extracted from infected red cells.
  • the parasitic pellet is taken up in a volume of 150 ⁇ l of sterile water added in small volumes.
  • the solution is homogenized by successive pipetting.
  • the parasites are lysed by adding 450 ⁇ l of lysis buffer (Tris-HCL pH 8, 50 mM, EDTA pH 8, 50 mM, 100 mM NaCl, 1% SDS) in the presence of 200 ⁇ g of Proteinase K® (Boehringer Mannheim, Germany ).
  • the solution is mixed by gently shaking the tube by hand and then incubated at 42 ° C for 45 min.
  • the RNA is digested in the presence of 2 ⁇ g of RNase at 37 ° C for 15 min.
  • the proteins are then extracted twice with 600 ⁇ l of saturated and buffered phenol, then with phenolchloroform (V / V) and finally with chloroform.
  • the concentration and purity of the DNA are checked by measuring the absorbance of the extracted DNA.
  • DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.
  • Nuclelc Aclds Research 18, 6531-6535, 80 ng of parasitic DNA were amplified in a reaction buffer containing 0.2 ⁇ g of primer (Operon Technologies), 4 x 100 ⁇ m dNTP, 1.5 mM MgCl 2 in the presence of 3 U of Taq polymerase® (Boehringer Mannheim, Germany).
  • the primers U 10 and R6 of sequence are used:
  • Amplification cycles are carried out on a PTC-100 or PTC-200 thermocycler (MJ Research Inc.)
  • the amplification program includes an initial denaturation of the DNA (5 min at 95 ° C), followed by 45 cycles of. 1 min at 94 ° C. 1 min at 36 ° C, " and. 2 min at 72 ° C.
  • the final extension is 7 min at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragments are separated according to their molecular weight by electrophoresis on an agarose gel at 1.6% in the TAE migration buffer (40 mM Tris- (acetate, 1 mM EDTA). 20 ⁇ l of each sample are mixed with 3 ⁇ l of loading buffer (0.25% bromophenol blue, 0, 25% xylene cyanol 40% w / v sucrose, then deposited in a well of the gel, migration is carried out for 5 h at a voltage of 3.2 volts per cm, the gel is then stained in a TAE bath containing ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ml), viewed under UV (234 nm) and photographed.
  • TAE migration buffer 40 mM Tris- (acetate, 1 mM EDTA). 20 ⁇ l of each sample are mixed with 3 ⁇ l of loading buffer (0.25% bromophenol blue, 0, 25% xylene cyanol 40% w / v sucrose, then deposited in
  • FIGS. 1 and 2 bring together a sample of the amplification profiles obtained with the primers U-10 and R6, respectively.
  • the amplification by each primer was made on the DNA of Plasmodlum falciparum from Kenya (lines 1 to 6), T. cruzl, P. vivax, P. malarlae, P. cynomolgl, P. chabaudl (lines 7 to 11 respectively), reference clones of Plasmodlum falclpairum (3D7 and HB3) and Plasmodlum falciparum from Venezuela (lines 12 to 17).
  • Lines M correspond to molecular weight markers.

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Abstract

L'invention vise une méthode d'identification de Plasmodium falciparum comprenant l'identification d'amplicons d'ADN génomique provenant d'un isolat à l'aide de marqueurs RAPD. Cette méthode est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limitée d'amorces d'amplification, discriminant pour la caractérisation de l'ensemble des formes de Plasmodium falciparum (réalisation de la méthode à l'aide de kits ou trousses de diagnostic renfermant les amorces d'amplification).

Description

Méthode et kit d'identification
de Plasmodlum falclpaxτim
L'invention a pour objet une méthode et un kit de diagnostic pour l'identification de Plasjnσdium falciparum dans un isolât.
Plasmodlum falciparum, agent étiologique de la forme la plus grave du paludisme, cause de 1,5 à 2,7 millions de décès chaque année, principalement chez des enfants de moins de 5 ans en Afrique sub-saharienne (OMS, 1997) . L'incidence du paludisme dans le monde est estimée à 300-500 millions de cas cliniques par an. On estime qu'environ 2300 millions de personnes habitent dans des zones où existe un risque de paludisme. Ces zones endémiques se trouvent dans 100 pays, le Venezuela inclus .
Un diagnostic précoce et un traitement rapide et approprié de la maladie sont indispensables pour prévenir la mortalité.
L'identification du parasite du paludisme est habituellement effectuée par le diagnostic microscopique traditionnel, qui est peu coûteux et d'utilisation facile sur le terrain. Néanmoins, la sensibilité de la méthode microscopique exige des examinateurs très qualifiés, et prend beaucoup de temps quand un grand nombre d'échantillons doit être examiné. Une telle méthode n'est donc pas appropriée pour des aperçus épidémiologiques à grande échelle .
D'autres méthodes de diagnostic du paludisme sont utilisées actuellement, parmi lesquelles : la technique d'orange d'acridine, le Quantitative Buffy Coat (QBC) , les méthodes immunologiques pour la détection d'anticorps anti- Plasmodlum et d'antigènes plasmodiaux dans le sang total et les techniques d'identification moléculaire de l'ADN parasitaire.
Les marqueurs RAPD ont été largement utilisés dans l'étude de la diversité génétique et de la structure de population de plusieurs protozoaires pathogènes pour 1 •homme .
La technique RAPD consiste à amplifier des fragments d'ADN génomique avec une amorce courte unique (10 bases de longueur en général) dont la séquence est déterminée aléatoirement . Cette méthode permet de détecter rapidement des polymorphismes utiles pour l'identification génétique d'isolats et permet aussi d'établir une cartographie génomique.
Le polymorphisme RAPD est détecté par la présence ou 1 ' absence des bandes amplifiées dans différents isolats de parasite, ou par des variations de taille ou d'intensité dues aux différences dans le site d'hybridation de l'amorce, provoquées par mutation, délétion ou insertion de séquences d'ADN.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à mettre en évidence que l'utilisation d'un nombre limité de marqueurs RAPD pertinents était suffisant pour identifier Plasmodlum falciparum dans un isolât donné, quelle que soit sa variabilité génétique.
L'invention a donc pour but de fournir une méthode et un kit, pour l'identification de Plasmodlum falciparum dans un isolât, et l'établissement d'un disgnostic fiable et de mise en oeuvre aisée.
La méthode d'identification de Plasmodlum falciparum selon l'invention, qui comprend l'identification d'amplicons d'ADN génomique provenant d'un isolât à l'aide de marqueurs RAPD, est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'amorces d'amplification, permettant la discrimination de Plasmodlum falciparum par rapport aux autres espèces de Plasmodlum.
Conformément à l'invention, on utilise ainsi des amorces capables d'amplifier des fragments d'ADN de Plasmodlum falciparum de 1150 bases environ, tels qu'identifiés en électrophorèse pour des amplicons d'isolats de Plasmodlum falciparum avec des amorces de séquence U10 5 'ACCTCGGCAC3 ' ou R6 5 ' GTCTACGGCA3 • , dans les conditions décrites dans la partie exemple. De telles amorces comportent avantageusement 8 à 15 nucléotides , de préférence 10 nucléotides .
La méthode selon 1 ' invention est plus spécialement caractérisée par l ' utilisation d ' un j eu de 2 amorces RAPD désignées par U10 et R6 , répondant respectivement aux séquences :
U10 5 ΑCCTCGGCAC3 '
R6 5 ' GTCTACGGCA3 '
Avantageusement, les amorces RAPD choisies génèrent des profils d'amplification nets et très reproductibles .
De manière remarquable, ces amorces sont suffisantes a elles seules pour identifier toutes les souches de Plasmodlum falciparum.
De manière générale, les amorces utilisées selon l'invention peuvent être obtenues par synthèse.
Selon un aspect avantageux, la technique RAPD fournit des fragments d'ADN spécifiques pouvant être isolés et analysés par sequençage. Ils donnent donc la possibilité de synthétiser soit des sondes spécifiques, soit des amorces spécifiques pour l'élaboration de PCR- diagnostics. Leur sequençage permet de vérifier leur valeur en tant que marqueur synapomorphe . L'invention vise également des kits ou trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre d'une méthode d'identification telle que définie ci-dessus.
Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent :
- un jeu d'amorces RAPD tel que défini ci- dessus, en particulier au moins les 2 amorces RAPD U10 et R6 avec, le cas échéant,
- les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils électrophorétiques, et
- une notice d'utilisation.
De tels kits peuvent être aisément mis en oeuvre en routine au laboratoire, en permettant d'effectuer un processus rapide d'identification.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans l'exemple ci-après avec la description de modes de réalisation et d'application de 1 'invention.
Dans cet exemple, il est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent, respectivement, les profils d'amplification d'isolats naturels de Plasmodlum falciparum de différentes origines géographiques, et d'autres groupes taxonomiques, avec des amorces selon 1 'invention. Exemple : Marqueurs pour l'identification de Plasmodlum falciparum dans des Isolats
On rapporte ci-après les résultats d'études par la technique RAPD, effectuées sur des stocks de Plasmodlum falciparum.
1 - Echantillon étudié
Les échantillons de sang ont été prélevés dans plusieurs communes de l'état de Bolivar, région d'endémie majeure du paludisme au VENEZUELA. Soixante-quinze isolats frais de Plasmodlum falciparum ont été rassemblés.
Ces échantillons de sang proviennent de mineurs et d'Amérindiens infectés, présentant une parasitémie modérée détectée par microscopie et n'ayant pas reçu de traitement pendant les 14 jours précédents. Les parasites ont été cultivés pendant 24 à 36 heures sur le terrain
(Trager et Jensen, 1976, Human malaria parasites in continous cultures, Science 1.93, 673-675) afin d'augmenter la parasitémie et ont été cryoprêservés immédiatement .
Sur les 75 échantillons initiaux de Plasmodlum falciparum du Venezuela, 59 ont été sélectionnés. Tous ceux qui montraient des infections mixtes par les marqueurs génétiques (MSP-1, MSP-2, RESA et CSP) ont été éliminés, ainsi que ceux qui ne donnaient pas de bons signes d'amplification aux RAPD.
13 isolats de Plasmodlum falciparum provenant du Kenya, deux clones de référence de Plasmodlum falciparum [3D7 (Afrique) et HB3 (Honduras)], et 4 autres espèces de Plasmodlum (P. clnomolgy, P. vivax, P. malarlae et P. chabaudl) ont été Inclus dans l 'échantillon.
La congélation des isolats cultivés a été effectuée en privilégiant les prélèvements ayant une parasitémie modérée ou élevée. L'isolât doit présenter une grande proportion de stades jeunes (trophozoites) , car les formes âgées (schizontes) sont détruites à la décongélation. Après centrifugation (500 g pendant 5 min à 4°C) , le culot d'hématies parasitées est remis en suspension dans un volume de solution de congélation V/V (28 % de glycérol ; 3 % de sorbitol ou de mannitol ; 0,65 % de NaCl) , stérilisé par filtration sur une membrane de 0,22 μm de porosité. La suspension cellulaire est délicatement homogénéisée et répartie en lots de 1 ml dans des tubes de congélation. Les aliquots sont congelés immédiatement par immersion dans l'azote liquide.
2. - Technique d'amplification aléatoire de l'ADN (RAPD)
. Extraction de l'ADN génomique L'ADN génomique du parasite est extrait à partir des hématies infectées . Le culot parasitaire est repris dans un volume de 150 μl d'eau stérile ajoutée par petits volumes.
La solution est homogénéisée par pipetages successifs. Les parasites sont lysés en ajoutant 450 μl de tampon de lyse (Tris-HCL pH 8, 50 mM, EDTA pH 8, 50mM, NaCl 100 mM, SDS 1 %) en présence de 200 μg de Protéinase K® (Boehringer Mannheim, Allemagne) . La solution est mélangée en agitant doucement le tube à la main puis incubée à 42 °C pendant 45 min. L'ARN est digéré en présence de 2 μg de RNase à 37°C pendant 15 min. Les protéines sont ensuite extraites 2 fois avec 600 μl de phénol saturé et tamponné, puis avec du phénolchloroforme (V/V) et enfin avec du chloroforme. L'ADN est précipité en présence de NaCl 0,1 M avec 2 volumes d'êthanol absolu à -20°C pendant une nuit. Il est centrifugé à 15800 g, et le culot est lavé 2 fois à l'êthanol à 70 %. Il est ensuite remis en solution et sa concentration est mesurée par spectrophotométrie (DO 260 nm x 50 x facteur de dilution = Concentration d'ADN en μg/ml ou ng/μl) . La quantité d'ADN obtenue varie entre 1,25 et 31 μg. Les stocks d'ADN sont alors conservés à -80°C.
La concentration et la pureté de l'ADN sont vérifiés par mesure de l'absorbance de l'ADN extrait.
. Amplification
Les réactions d'amplification ont été conduites dans un volume final de 60 μl selon le protocole communiqué par Williams et al (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers . Nuclelc Aclds Research 18, 6531-6535, 80 ng d'ADN parasitaire ont été amplifiés dans un tampon de réaction contenant 0,2 μg d'amorce (Operon Technologies), 4 x 100 μm dNTP, 1,5 mM MgCl2 en présence de 3 U de Taq polymérase® (Boehringer Mannheim, Allemagne) .
. Amorces :
On utilise les amorces U 10 et R6 de séquence :
U10 5 'ACCTCGGCAC3 '
R6 5 'GTCTACGGCA3 ' ; . Cycles d'amplification : Les amplifications sont réalisées sur un thermocycleur PTC-100 ou PTC-200 (MJ Research Inc.)
Le programme d'amplification comprend une dénaturation initiale de l'ADN (5 mn à 95°C) , suivie de 45 cycles de . 1 min à 94°C . 1 min à 36°C," et . 2 min à 72°C.
L'êlongation finale est de 7 min à 72°C.
. Révélation
Les fragments d'ADN amplifiés sont séparés selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,6 % dans le tampon de migration TAE (40 mM Tris- (acétate, 1 mM EDTA) . 20 μl de chaque échantillon sont mélangés avec 3 μl de tampon de charge (0,25 % de bleu de bromophénol, 0,25 % de xylène cyanol 40 % p/v de sucrose, puis déposés dans un puits du gel. La migration est effectuée pendant 5 h sous une tension de 3,2 volts par cm. Le gel est ensuite coloré dans un bain de TAE contenant du bromure d'éthidium (0,5 μg/ml) , visualisé sous UV (234 nm) et photographié.
3. Résultats
Les figures 1 et 2 réunissent un échantillon des profils d'amplification obtenus avec les amorces U-10 et R6, respectivement. L'amplification par chaque amorce a été faite sur de l'ADN de Plasmodlum falciparum du Kenya (lignes 1 à 6) , T. cruzl , P. vivax, P. malarlae , P. cynomolgl , P. chabaudl (lignes 7 à 11 respectivement) , clones de référence de Plasmodlum falclpairum (3D7 et HB3) et Plasmodlum falciparum du Venezuela (lignes 12 à 17) . Les lignes M correspondent aux marqueurs de poids moléculaire.
L'examen de ces résultats montre que les amorces U-10 et R-6 donnent des profils identiques dans toutes les souches étudiées de Plasmodlum falciparum.
Avec l'amorce U-10, toutes les souches de Plasmodlum falciparum ont donné le même profil génétique, mettant en évidence la bande d'environ 1150 pb, indépendamment de l'origine géographique de la souche, tandis que les autres parasites étudiés ont montré des profils génétiques très variables et complètement différents de ceux générés par Plasmodlum falciparum. Ce même phénomène a été observé avec l'amorce R-6.
Les résultats des produits d'amplification avec ces amorces, suggèrent qu'elles amplifient des régions très conservées hautement répétées dans le génome de Plasmodlum falciparum provenant des isolats vénézuéliens et kenyans .
Ces résultats mettent en évidence le caractère spécifique des amorces U-10 et R-6 vis-à-vis de Plasmodlum falciparum, quelle que soit son origine géographique et permettent aussi d'identifier spécifiquement les différents groupes taxonomiques étudiés .
Ces résultats peuvent être avantageusement exploités pour rechercher et identifier la séquence génétique des fragments spécifiques générés par ces amorces (U-10 et R-6) dans le génome de Plasmodlum falciparum. Le clonage et le sequençage de ces fragments de RAPD, permettra alors de développer des méthodes diagnostics de PCR spécifiques de cette espèce parasitaire.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Méthode d'identification de Plasmodlum falciparum caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification d'amplicons d'ADN génomique provenant d'un isolât à l'aide de marqueurs RAPD, est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'amorces d'amplification, permettant la discrimination de Plasmodlum falciparum par rapport aux autres espèces de Plasmodlum.
2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise des amorces capables d'amplifier des fragments d'ADN de Plasmodlum falciparum de 1150 pb environ, tels qu'identifiés sur des profils électrophorétiques d'amplicons résultant de l'amplification de fragments d'ADN génomique de Plasmodlum falciparum avec des amorces de séquence U10 5' ACCTCGGCAC3' ou R6 5 'GTCTACGGCA3 ' .
3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'on utilise un jeu de 2 amorces répondant aux séquences 5 ' ACCTCGGCAC3 ' et 5 •GTCTACGGCA3 ' . 4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisée en ce que les amorces comportent de 8 à 15 nucletotides, de préférence 10 nucléotides .
5/ Kits ou trousses de diagnostic caractérisés en ce qu'ils comprennent :
- un jeu d'amorces RAPD selon la revendication 1 ou 2, en particulier les 2 amorces RAPD selon la revendication 3, avec, le cas échéant,
- les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils electrophoretiques, et
- une notice d ' utilisation.
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