WO2000034528A1 - Procede et kit pour l'amplification, la detection et/ou la quantification de populations de genomes - Google Patents

Procede et kit pour l'amplification, la detection et/ou la quantification de populations de genomes Download PDF

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WO2000034528A1
WO2000034528A1 PCT/FR1999/003042 FR9903042W WO0034528A1 WO 2000034528 A1 WO2000034528 A1 WO 2000034528A1 FR 9903042 W FR9903042 W FR 9903042W WO 0034528 A1 WO0034528 A1 WO 0034528A1
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WO
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primers
amplification
seq
quantification
hiv
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Application number
PCT/FR1999/003042
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Inventor
Jean-Marie Andrieu
Louis Lu
Original Assignee
Microdiag
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Definitions

  • the present invention relates to the amplification, with a view to the detection and / or quantification, of populations of genomes, in particular populations of at least one target sequence of single- or double-stranded genome. It relates more particularly to the amplification, with a view to the detection and / or quantification, of all DNA and / or RNA fragments whose nucleotide sequence may be subject to variations, and more especially but not exclusively of DNA and / or RNA fragments of HIV, HBV, HCV and other DNA and / or RNA species or quasi-species.
  • the present invention relates more specifically to the amplification, with a view to detection and / or quantification, of populations of genomes or genome fragments, present in the same sample or in different samples, by means of minus three primers used simultaneously. It can be applied even when the nucleic acid sequences exhibit variability, provided that they have sequences allowing hybridization with the primers used.
  • nucleic acid sequences it can happen that even the most constant zones exhibit variability constituted by substitutions, additions and / or deletions of parts of sequence. However, this variability can induce sequence modifications which can prevent traditional hybridization by a pair of primers, if this variability occurs within the hybridization sequence of one and / or the other primer.
  • the invention relates to the amplification, detection and / or quantification in vitro or ex vivo of populations of genome fragments in a biological sample, which can be of human, animal or plant origin, but also populations of genome fragments present in gases or minerals.
  • the known detection and / or quantification methods are based on a technique making it possible to amplify, with a view to their detection and / or their quantification, a fragment of a target sequence, but provided that the sequence of hybridization of the fragment to the pair of primers used has neither deletion, nor addition, nor substitution of, in general, more than 10% or at most 30%. At most, an addition or deletion could only be tolerated at the nucleotide of the 5 'end of the sequence. In other words, hitherto the detection and / or quantification of nucleic acid fragments having a certain variability was not possible in all cases where the variability had an impact on the level of the attachment of the one and / or the other primer, which is quite common in virology.
  • NASBA DNA if transcribed into RNA
  • EP 0 630 973 Also known from EP 0 630 973 is a method for the amplification of multiple target DNAs (two or more), with the use of a fragment for each of them and by means of pairs of corresponding primers, one pair for each target DNA, in a single tube.
  • the problem to be addressed was that of entraining the amplified nucleic acids from a polymerase chain reaction (PCR) in Subsequent reactions of the same type, in which fresh mixtures from PCR reaction are used, with the consequence of the appearance of false positives during subsequent sample tests.
  • PCR polymerase chain reaction
  • A. T. Haase et al. In Proceedings of The National Academy of Sciences of USA, vol. 87, No. 13, July 1, 1990, pages 4971-4975, propose a sophisticated technique for additive amplification by successive primers in relay, aiming to carry out the amplification on small segments of DNA and with non-covalent bonds by cohesive ends to generate a sequence of greater length.
  • the cohesive ends mentioned are carried by segments of DNA which are alternately part of one and the other of the strands of said DNA.
  • the respective cohesive ends of two such segments then represent overlapping segments, which have the function of allowing the pairing of base pairs leading to the aforementioned non-covalent bonds.
  • the described technique relates to a coupling of an in situ hybridization with an amplification by PCR of specific sequences, inside the cells, so as to amplify and retain in them the DNA concerned.
  • window period an antibody-free period
  • the risk of viral transmission caused by a transfusion remains high enough to correspond to 1 per 5000 donors for HIV in the developing countries where there is a high incidence of HIV infection
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • SE serum-derived immunodeficiency virus virion
  • IC internal control
  • amplicons either in English “MUltiple PRimer-induced OVerlapping AMplification Assay", or in short MUPROVAMA.
  • the present invention therefore has as a first object a method for the amplification, with a view to the detection of the presence or absence and of the quantification in the case of presence in a sample, of a region of DNA genome or with RNA, the nucleic acid sequences of which may vary, said method being characterized in that it involves the use of at least three primers capable of simultaneously hybridizing each a specific nucleotide sequence within the region to amplifying a population of genome fragments, so as to give, after amplification, overlapping amplification products, each of which exhibits one of the said specific sequences mentioned above, and then, if desired, the detection and / or the quantification said amplification products. Each of the overlapping amplification products then contains at least one of the nucleic acid sequences thus hybridized.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • step (b) addition, either to the strand (s) of nucleic acids in the sample simultaneously with the primers for revelation in real time, or to the products of step (a) for post-amplification revelation, one or more oligonucleotide probes labeled for hybridization to the amplicons to be detected and / or quantified,
  • At least some, if not all, of the nucleotide sequences to which the above primers hybridize may themselves be overlapping.
  • At least one DNA or RNA genome fragment can comprise at least one region to be amplified having variability, in particular a variability which can exceed approximately
  • the amplified portion of overlapping fragments can be hybridized with a single probe or with two or more than two probes, depending on the nucleotide sequences of the overlapping region of the amplicons and / or the specificity of the probes used.
  • overlapping amplicons or amplification products is meant herein PCR amplification fragments or by any other amplification technique, such that the amplified fragments have at least one similar sequence in the region of interest.
  • the genome fragments to be detected and / or quantified according to the invention comprise a region of interest consisting of approximately 100-500 nucleotides.
  • the genome fragments tested can come from any animal, plant or microbiological species. They come from the same species, but may differ from each other due to the variability mentioned above.
  • the technique according to the invention is particularly advantageous for the amplification of different populations of genomes having homologous hybridization sequences which differ by a degree of substitution of the nucleic acids by more than 10% or even by more than 30% and which can range up to 100%, and / or by deletions or additions of several nucleic acids.
  • the primers used according to the invention must be chosen so as to give amplification products with overlapping sequences, in particular so that there is, if we compare the different amplification products with each other , at least about 40 and preferably less than about 300 nucleotides which overlap from one fragment to another.
  • Said primers are also advantageously chosen to hybridize under identical or almost identical conditions the maximum of sequences nucleotides within the same region.
  • the temperature then chosen to cause the primers to act is therefore advantageously such that each primer has an optimal hybridization temperature equal to ⁇ 2 ° C near the temperature at which the amplification is implemented.
  • each of said primers or at least one of them can hybridize with possibly several of the nucleotide sequences resulting from the variability of said population of genomes to be studied.
  • a choice of primers which are not competitive with each other and which are not complementary is particularly preferred.
  • the revelation probes can be either common to the part of the so-called overlapping region, or specific in the same overlapping region if the parts of overlapping region have sufficiently different nucleotide sequences, and they can be revealed jointly by a probe single or several probes for a global detection or quantification, or separately by several probes if one wishes to identify in this way what is due to each population or set of genomic populations.
  • the probes have their optimal efficiency at the same temperature to within ⁇ 2 ° C, in correlation or not with the temperature at which the primers each have an efficiency optimal.
  • the primers used are at least three in number, but may be as numerous as desired. For example, it is possible to use four primers, five primers or even more, without there being an upper limit, except for a voluntary limitation due to practical and / or economic considerations.
  • One embodiment of the invention which is very particularly preferred comprises the use of at least three primers, at least one of which is a forward primer and at least one of which is a reverse primer.
  • the probes can be placed after amplification (post-amplification) or simultaneously with the primers for revelation in real time, and in the latter case the length of the probe must be adapted to the conditions hybridization and amplification and the hybridization temperature of the probe should be similar to that of the priming hybridization.
  • Such a method can be used in particular in all applications where a genome fragment can be associated with a purpose for which the detection and / or the quantification prove useful or advantageous, in particular the detection and / or the quantification of any fragment of genome of a microorganism, as well as the detection and / or quantification of fragments of genomes of interest in the case of genetic or acquired diseases occurring in humans, animals and plants, but also in cases of polymorphism, including understood outside diseases, advantageously for genetic diagnosis, including prenatal or on cultured cells such as embryo cells, or for optimizing the administration of drugs and / or other substances .
  • the subject of the invention is also a kit or set of means for the amplification, for the detection and / or quantification in vitro or ex vivo, of populations of genomes in a biological sample, comprising: a set of primers oligonucleotides capable of giving overlapping amplification products, comprising at least three primers of which at least one is a so-called forward primer and at least one is a so-called reverse primer, and each of which is specific for a nucleic acid sequence to be detected and / or to be quantified, and at least one oligonucleotide probe capable of hybridizing at least one of the nucleic acid sequences of said amplification products, if such a sequence is present in said sample.
  • a set of primers oligonucleotides capable of giving overlapping amplification products, comprising at least three primers of which at least one is a so-called forward primer and at least one is a so-called reverse primer, and each of which is specific for a nucleic acid
  • the kit according to the invention advantageously further comprises, optionally: means constituting an external standard (SE) / internal control (CI) or an internal standard (SI) for the calibration of one or more of the operating phases for which the kit or set is designed, in particular the extraction and / or amplification and / or revelation of said genome, and / or a pair of specific primers of the CI, advantageously non-complementary and non-competitive with the primers used for the amplification of the target of interest, in the case where calibration means based on SE / CI are present, and / or - one or more agents for reverse transcription in the TR-ACP or at least three agents for an amplification of the NASBA type, and / or an oligonucleotide probe specific for the CI, if calibration by SE / CI is used, or specific to the SI, and advantageously unrelated to the hybridization probe (s) of the overlapping fragments.
  • SE external standard
  • CI internal control
  • SI internal standard
  • the invention comprises the implementation for the amplification, with a view to the detection and / or the quantification of HIV virus, of six primers consisting in practice of three forward primers and three reverse primers respectively ( abbreviated as F and R) having the respective nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and also advantageously the use of oligonucleotide probes having the respective nucleic acid sequences SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8.
  • Fig. 1 schematically illustrates an amplification, over the same number of cycles, of nucleic acid sequences (for example of a target region of the gag gene of an identified subtype of HIV) respectively with only one pair of primers according to a traditional method and with four primers (FI, F2, RI, R2) according to the process according to the invention.
  • Fig. 2 represents a diagram for the preparation of a set of primers and probes (oligonucleotides) for the detection and quantification of quasi-species of HIV according to the invention.
  • Each part below the corresponding strip of the legend represents a sequence similar to those located above and below it ( ⁇ 10% variation in base pairs).
  • a weakening of the tint in such a column indicates a variation of a magnitude from 10% to 30% compared to the consensus sequence ( ⁇ 10%) and a white rectangle indicates a variation greater than 30% in said sequence, hence the impossibility hybridization of the same primer to this sequence.
  • PI and P2 represent, respectively, under PI a probe hybridizing all of the overlapping fragments of the 11 subtypes of HIV-1 and under P2 the probe hybridizing HIV-2.
  • Fig. 3 represents the kinetics of amplification of HIV genotypes / sub-genotypes in a PCR amplification linked to a standard reverse transcription (TR) with the use of each of the sets of primers respectively Fl / R1 (A), F3 / R1 ( B), F2 / R2 (C) and F1 / R3 (D).
  • Fig. 4 represents the kinetics of amplification of a single target sequence (HIV-1 group M / subtype B) by an amplification technique according to the invention, with either 3 primers ( ⁇ ) or 5 primers (D) , by comparison with a standard TR-ACP (O).
  • Fig. 5 represents the amplification obtained with all the HIV genotypes / sub-genotypes by the technique according to the present invention with the use of 6 primers, namely FI, F2, F3, RI, R2, R3.
  • an amplification process was used for guidance with more than two primers giving overlapping amplification products (MUPROVAMA) according to the invention, using a polymerase chain reaction (PCR) linked to reverse transcriptase (TR) for single target amplification of all known subtypes of HIV-1 groups M and O, as well as HIV-2.
  • PCR polymerase chain reaction
  • TR reverse transcriptase
  • a total of 3 forward primers (F) having the respective nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1 (FI), SEQ ID NO: 2 (F2) and SEQ ID were thus selected.
  • primers Fl / Rl se have been found to be optimal for amplification of HIV group M type subtypes A, B, B ', C, D, E, F and G, they were suboptimal for HIV-2 and did not amplify HIV- 1 group M subtype A 'and HIV-1 group O (see Fig. 3 A).
  • the primers F3 / R1 were optimal for the amplification of the subtypes A ', B, C, D and E, but they were sub-optimal for HIV-1 group M subtypes A, B', F and G, and much less effective for HIV-2 (see Fig. 3B).
  • primers F2 / R2 were optimal for HIV-1 group O, suboptimal for HIV-1 group M, and did not amplify subtypes A 'and HIV-2.
  • the F1 / R3 primers were optimal for HIV-2 and did not amplify all HIV-1 genotypes (see Fig. 3D). Similar amplification kinetics were achieved for each of the HIV genotypes and sub-genotypes, provided that specific primers were used for certain genotypes or sub-genotypes (see Figs. 3 A to D).
  • MUPROVAMA The technique called MUPROVAMA described above was used to carry out an equivalent amplification of all the quasi-species of HIV, in order to detect and quantify all the variants of HIV in a single tube of amplification.
  • a target sequence (group M of HIV-1 / subtype B) was amplified either with the MUPROVAMA technique according to the invention (F1 / F2 / R1 or F1 / F2 / F3 / R1 / R2), or with the standard TR-ACP technique using a single pair of optimized primers (Fl / Rl).
  • the number of copies amplified after a fixed number of cycles was similar between the MUPROVAMA technique and the TR-ACP (see Fig. 4).
  • the standardized concentration of samples of inactivated isolates of different subtypes of HIV-1, as well as of HIV-2 (10 5 , 10 4 , 10 3 and 10 2 eq copies / ml of virion RNA) a was determined by Northern blot hybridization with a known number of copies of HIV RNA transcripts as a standard. This was done for HIV type 1 group M (subtypes A, A ', B, B', C, D, E, F, G) and group O, as well as for HIV type 2. These standardized concentrations were used for the evaluation of the amplification kinetics and the detection threshold of each of the sets of primers according to the invention in a standard TR-ACP protocol.
  • the viral RNA was extracted with an isolation solution by centrifugation (12,000 g at 4 ° C for 10 minutes) and then precipitated with isopropanol.
  • the RNA pellet was resuspended in RNAse-free buffer and was reverse transcribed and amplified with an enzyme mixture containing a reverse transcriptase from cloned avian myeloblastosis virus and native Taq DNA polymerase in an automated device producing thermal cycles (42 ° C, 25 min; 94 ° C, 5 min; 94 ° C / 40 s, 60 ° C / 45 s, 72 ° C / 60 s for 35 cycles; and finally 60 ° C, 5 min and 72 ° C, 5 min) in the presence of an excess (20 pmol of each primer) of a single pair of primers (conventional method) or of a set of primers
  • Tests according to the MUPROVAMA method in accordance with the invention were carried out as follows: First, 10 ml of RNA constituting an internal control (IC) were introduced into each of the 1.5 ml tubes, and mixed. with 600 ml of RNA isolation solution. Then the tubes received 100 ml of plasma for negative control (in triplicate), 100 ml of each of the respective concentrations of external standard (namely 10 5 , 10 4 , 10 3 and 10 2 copies eq / ml of RNA from HIV) and 100 ml of plasma samples respectively. The RNA was extracted by centrifugation and then precipitated with isopropanol.
  • IC internal control
  • RNA pellet was used in an amplification by TR-ACP in the presence of a number of multiple primers always greater than two, giving overlapping amplification products, specific for the RNA of HIV and of a couple. specific primers of the RNA of the CI, giving a specific amplification product and without any relation to the above overlapping products. After amplification over approximately 30 cycles, 20 ml of each amplification product or amplicon were distributed in two separate wells
  • the concentration of HIV RNA was calculated using the standard calibration curve (which follows a log-log regression model in the range of 10 ⁇ -10 ⁇ eq copies / ml of HIV RNA ) generated from signals from four standard HIV RNA concentrations.
  • a quantitative result was obtained when the signal from a well was greater than the mean optical density (OD) + 2 standard deviations (SD) of the negative controls, while the wells having an OD equal to or less than the mean OD + 2 AND negative controls were considered to include an undetectable amount or the absence of the target to be identified.
  • the technique according to the present invention developed by way of example in accordance with the experimental protocol described above, makes it possible to establish that the severe limitation of the techniques for amplification of a target nucleic acid sequence in the field of molecular diagnosis can be overcome by means of a strategy called MUPROVAMA based on a general means consisting essentially of more than two suitable primers, giving overlapping amplification products.
  • the improved clinical sensitivity and the precision of the detection and quantification system based on the technique according to the invention for an equivalent amplification of quasi-species represent significant progress, as illustrated here in the molecular diagnosis of viral infections. It is clear that this technique can then receive many and varied applications, since it allows the detection and / or quantitative determination of any target gene, possibly subject to variability, in the fields of research as well as diagnosis, gene therapy and others.
  • the method and the means according to the invention make it possible to reach a threshold for detecting populations of genomes or fragments of genomes, for example of viruses, of 10 equivalent copies per milliliter of biological fluid analyzed, which represents a significant improvement in the sensitivity of detection of the same quasi-species by comparison with the conventional methods currently practiced.
  • the method and the means according to the invention can be combined with an assay system using a universal external standard consisting of known numbers of copies of HIV RNA, advantageously further comprising means internal control essentially composed of a constant concentration of an artificial transcript RNA to allow real-time calibration and control of the test process in each test tube.
  • the method and the means according to the invention can be used both in research and in laboratories, in particular for clinical evaluations and follow-ups, as well as for the detection of all the genotypes and sub-genotypes of HIV, and are particularly useful.
  • for viral detection of blood and blood products in a single tube both in relation to blood banks and for newborn babies of infected mothers; more generally, in these applications, they provide effective means for the precise and reliable detection and / or quantification of quasi-species, in particular of viral quasi-species such as HIV, HBV and HCV.
  • the method and means according to the present invention can also make it possible, with judicious use of suitable primers and probes, to quickly and reliably identify certain viral subtypes or certain genomic populations of interest.

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Abstract

L'invention concerne un procédé et un kit ou ensemble pour l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification de populations de génomes ou de fragments de génome. On met en oeuvre au moins trois amorces oligonucléotidiques donnant des produits d'amplification chevauchants, lesdites amorces comportant au moins une amorce dite avant et au moins une amorce dite inverse, pour les séquences à amplifier. Application à la détection et/ou la détermination quantitative d'un gène cible, éventuellement sujet à variabilité, dans les domaines de la recherche, du diagnostic, de la thérapie génique, entre autres.

Description

PROCÉDÉ ET KIT POUR L'AMPLIFICATION, LA DÉTECTION ET/OU LA QUANTIFICATION DE POPULATIONS DE GÉNOMES
La présente invention concerne l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification, de populations de génomes, notamment de populations d'au moins une séquence cible de génome mono- ou double brin. Elle concerne plus particulièrement l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification, de tous fragments d'ADN et/ou d'ARN dont la séquence nucléotidique peut être l'objet de variations, et plus spécialement mais non exclusivement des fragments d'ADN et/ou d'ARN de VIH, VHB, VHC et autres espèces ou quasi-espèces à ADN et/ou ARN.
La présente invention a trait plus précisément à l'amplification, en vue de la détection et/ou de la quantification, de populations de génomes ou de fragments de génome, présentes dans un même échantillon ou dans des échantillons différents, au moyen d'au moins trois amorces utilisées simultanément. Elle peut s'appliquer même lorsque les séquences d'acides nucléiques présentent une variabilité, pour autant qu'elles possèdent des séquences permettant l'hybridation avec les amorces utilisées.
Dans les séquences d'acides nucléiques, il peut arriver que même les zones les plus constantes présentent une variabilité constituée par des substitutions, des additions et/ou des délétions de parties de séquence. Or, cette variabilité peut induire des modifications de séquences pouvant empêcher l'hybridation traditionnelle par une paire d'amorces, si cette variabilité survient au sein de la séquence d'hybridation de l'une et/ou de l'autre amorce.
D'une manière générale, l'invention concerne l'amplification, la détection et/ou la quantification in vitro ou ex vivo de populations de fragments de génomes dans un échantillon biologique, qui peut être d'origine humaine, animale ou végétale, mais également de populations de fragments de génomes présents dans des gaz ou des minéraux.
Pour la simplification de l'exposé, l'invention est décrite ci-après en référence, sauf exceptions, à des virus et en particulier au VIH, mais il est clair qu'elle n'est en aucune manière limitée à celui-ci, ni même seulement aux espèces et quasi-espèces virales. L'homme du métier peut, avec ses connaissances propres et à la lumière des enseignements généraux contenus dans la présente description, procéder aux essais de routine ou autres essais préparatoires lui permettant d'appliquer le procédé et les moyens selon l'invention à de multiples domaines et de multiples circonstances, sans qu'il ait pour cela à faire oeuvre d'invention. Jusqu'à présent, les méthodes de détection et/ou de quantification connues reposent sur une technique permettant d'amplifier, en vue de leur détection et/ou de leur quantification, un fragment d'une séquence cible, mais à condition que la séquence d'hybridation du fragment à la paire d'amorces utilisée n'ait ni délétion, ni addition, ni substitution de, en général, plus de 10% ou au grand maximum 30%. On ne pouvait tout au plus tolérer qu'une addition ou une délétion au niveau du nucléotide de l'extrémité 5' de la séquence. En d'autres termes, jusqu'ici la détection et/ou la quantification de fragments d'acides nucléiques ayant une certaine variabilité n'était pas possible dans tous les cas où la variabilité avait une incidence au niveau de l'accrochage de l'une et/ou l'autre amorce, ce qui est assez fréquent en virologie.
L'importance de l'invention sera encore mieux perçue si l'on rappelle que, dans le domaine du diagnostic viral, une détection ou une quantification virale est à ce jour effectuée dans la grande majorité des laboratoires de diagnostic au moyen de deux méthodes moléculaires devenues conventionnelles: - la première repose sur l'hybridation d'un couple d'amorces suivie d'une technique d'amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en anglais PCR), poul¬ ies séquences nucléotidiques à ADN, ou en couplage avec une transcription réverse (TR) pour les séquences nucléotidiques à ARN. Cette amplification est étalonnée avec un étalon compétitif interne constitué d'une concentration unique d'un plasmide (ADN) ou d'un transcrit d'ARN produit in vitro à partir d'ADNc viral mutant (brevet
US-A-4.683.202, brevet EP-A-0.201.184, demande de brevet WO-A-91/02817, entre autres, et Mulder et al., "Rapid and simple PCR assay for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection", J. Clin. Microbiol., 32:292-300, 1994), et - la seconde repose sur l'utilisation d'une technique d'amplification de l'ARN
(ou de l'ADN s'il est transcrit en ARN) (NASBA) étalonnée avec un étalon compétitif interne constitué de trois transcrits d'ARN distincts (Van Gemen et al., "A one-tube quantitative HIV-1 RNA NASBA nucleic acid amplification assay using electrochemiluminescent (ECL) labeled probes", J. Virol. Methods, 49:157-68, 1994).
On connaît par ailleurs également, d'après le document EP 0 630 973, un procédé pour l'amplification d'ADNs cibles multiples (deux ou plus), avec mise en oeuvre d'un fragment pour chacun d'eux et au moyen de paires d'amorces correspondantes, à raison d'une paire pour chaque ADN cible, dans un tube unique. Le problème à traiter était celui de l'entraînement des acides nucléiques amplifiés provenant d'une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (ACP) dans des réactions suivantes du même type, dans lesquelles on utilise des mélanges frais issus de réaction par ACP, avec pour conséquence l'apparition de faux positifs lors des tests d'échantillons ultérieurs.
Le document WO 97/03207 décrit des moyens pour la détection de séquences d'acides nucléiques amplifiées, reposant sur une hapténisation bifonctionnelle et l'utilisation de microparticules colorées. La technique proposée dans ce document concerne ainsi de nouveaux moyens de révélation post-amplification, mais aucune spécificité concernant l'amplification.
D'autre part, A. T. Haase et al., dans Proceedings of The National Academy of Sciences of USA, vol. 87, No. 13, 1er juillet 1990, pages 4971-4975, proposent une technique sophistiquée pour une amplification additive par amorces successives en relais, visant à effectuer l'amplification sur de petits segments d'ADN et avec des liaisons non-covalentes par bouts cohésifs pour générer une séquence d'une longueur plus importante. Les extrémités cohésives évoquées sont portées par des segments d'ADN qui font partie alternativement de l'un et de l'autre des brins du dit ADN. Les extrémités cohésives respectives de deux tels segments représentent alors des segments en recouvrement, qui ont pour fonction de permetϋ-e les appariements de paires de bases conduisant aux liaisons non-covalentes susdites. La technique décrite concerne un couplage d'une hybridation in situ avec une amplification par ACP de séquences spécifiques, à l'intérieur des cellules, de façon à amplifier et retenir dans celles-ci l'ADN concerné.
Mais, du fait des grandes variations du génome viral, - ce qui aboutit, dans un tube ou d'un prélèvement à l'autre, à la présence d'un nombre plus ou moins grand de sous-types viraux -, ces systèmes qui utilisent une paire d'amorces (aussi bien pour l'ACP que pour le NASBA), ne sont capables de détecter/quantifier qu'une population virale ou un ensemble de populations ayant des zones 3' et 5' auxquelles l'amorce peut hybrider dans les conditions évoquées plus haut, ce qui était susceptible de conduire dans les tableaux cliniques de l'infection à VIH, soit à une fausse négativité (Alaeus et al., "Subtype- spécifie problems with quantification of plasma HIV-1 RNA", AIDS, 11:859-65, 1997; Coste et al., "Comparative évaluation of three assays for the quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma", J. Med. Virol., 50:293-302, 1996; Barlow et al., "Performance of the amplicor human immunodeficiency virus type 1 PCR and analysis of spécimens with false-negative results", J. Clin. Microbiol., 35:2846-53, 1997; Debyser et al., "Failure to quantify viral load with two of the three commercial methods in a pregnant woman harboring an HIV type 1 subtype G sϋ-ain", AIDS Res. Hum. Retroviruses, 14:453-9, 1998) dans les cas où les amorces ne sont pas capables d'hybrider, soit à une sous-estimation de la charge virale dans les cas où l'hybridation ne s'effectue dans des conditions idéales que pour une partie des populations présentes. Un tel phénomène de restriction à des sous-types viraux a très fortement limité l'application des techniques d'amplification d'acides nucléiques dans le diagnostic moléculaire des affections transmises par des micro-organismes, lorsque ces micro-organismes présentent des variations nucléotidiques chez un même individu ou d'un individu à l'autre. Pourtant, la mesure de la charge virale circulante sur une base moléculaire s'est avérée être un indicateur précieux pour l'évaluation du pronostic des infections virales et pour le suivi des thérapies antivirales (voir, notamment, Mellors et al., "Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma", Science, 272:1167-70, 1996; Shearer et al., "Viral load and disease progression in infants infected with HIV type 1", N. Engl. J. Med., 336: 1337-42, 1997; Lu W. et Andrieu JM. "Early identification of human immunodeficiency virus-infected asymptomatic subjects susceptible to zidovudine by quantitative viral coculture and reverse transcription-linked polymérase chain reaction", J. Infect. Dis., 167:1014-20, 1993; Busch MP., "Residual risks of viral transmission by transfusions and projected yields of additional screening tests",. Transfus. Clin. Biol, 3:7-11, 1996 ; Brown et al.,
"Viral RNA in the resolution of human immunodeficiency virus type 1 diagnostic serology", Transfusion, 37:926-9, 1997). Par ailleurs, la détection virale sur une base moléculaire peut jouer un rôle déterminant dans le diagnostic des infections virales. Etant donné que les anticorps circulants spécifiques du VIH (virus de l'immunodeficience humaine) d'une mère infectée par le VIH passent dans le sang des enfants et y demeurant après la naissance pendant une durée pouvant aller jusqu'à 18 mois (Ugen et al., "Diagnosis and prédiction of pédiatrie HIV-1 infection and AIDS: current status", J. Clin. Lab. Anal., 8:309-14, 1994), une détection moléculaire directe du virus, au lieu d'un test visant à révéler les anticorps, est nécessaire pour le diagnostic de l'infection par VIH des nouveau-nés. En outre, du fait que l'apparition des anticorps spécifiques du virus suivant l'infection est précédée par une période exempte d'anticorps (classiquement dénommée "période fenêtre") qui s'étale approximativement, en général, entre 4 et 12 semaines dans le cas d'une infection par VIH, avec les tests de dépistage d'anticorps effectués de manière connue le risque de transmission virale provoquée par une transfusion demeure assez élevé pour correspondre à 1 pour 5000 donneurs pour le VIH dans les pays en développement où il existe une incidence élevée de l'infection par VIH (Chiewsilp et al., "Risk of transmission associated AIDS by séronégative blood in Thailand: a multicenter report", Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 24 (Suppl): 139-40, 1993). Ce risque est probablement beaucoup plus élevé pour le virus de l'hépatite B (VHB) et celui de l'hépatite C (VHC) dans les mêmes pays (Schmunis et al., "Risk for transfusion-transmitted infectious disease in Central and South America", Emerg. Infect. Dis., 4:5-11, 1998). Par conséquent, un dépistage direct du virus par des moyens moléculaires s'impose également pour permettre de maîtriser la transmission des virus de l'hépatite par transfusion. Un système d'étalonnage perfectionné utilisant un standard externe universel
(SE) constitué d'un nombre connu de copies d'ARN de VIH sans activité infectieuse a été élaboré récemment (voir document EP-A-0 594 822, et Lu W. et Andrieu JM., "Use of the human immunodeficiency virus virion as a universal standard for viral RNA quantification by reverse transcription-linked polymérase chain reaction", J. Infect. Dis., 167:1498-99, 1993), avec en son sein un contrôle interne (CI) formé d'une concentration constante d'un ARN de transcrit artificiel, sans relation aucune avec la séquence nucléotidique cible, pour étalonnage en temps réel et contrôle du processus de dosage dans chacun des tubes à essai (voir document FR-A-2 740 782). Une telle combinaison d'un standard externe et d'un contrôle interne permet une performance optimale de n'importe laquelle des techniques d'amplification, telles que l'ACP, la TR-ACP, le NASBA ou toute autre méthode d'amplification en termes de seuil de détection, de spécificité et de reproductibilité.
Il y avait cependant encore un besoin pour une technique d'amplification d'acides nucléiques qui permette une détection et/ou une quantification virale sensible, notamment pour le pronostic des maladies, le diagnostic moléculaire des infections virales, ainsi que le pilotage des thérapies au sens large.
On a maintenant trouvé un procédé nouveau d'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification, de populations de génomes permettant d'atteindre ces objectifs, ainsi que d'autres, et comportant la mise en oeuvre simultanée d'amorces multiples aptes à produire des produits d'amplification se recouvrant, ci- après dénommés "amplicons" (soit en anglais "MUltiple PRimer-induced OVerlapping AMplification Assay", soit en abrégé MUPROVAMA).
On a en effet trouvé de façon inattendue qu'un tel procédé mettant en oeuvre plusieurs amorces aptes à hybrider simultanément chacune une séquence nucléotidique spécifique au sein de la région à amplifier d'une population de fragments de génomes procure un nombre de produits d'amplification se chevauchant, dont le nombre est en pratique comparable au nombre de fragments que l'on obtiendrait par l'amplification résultant de la mise en oeuvre traditionnelle d'un couple d'amorces optimisées.
La présente invention a par conséquent pour premier objet un procédé pour l'amplification, en vue de la détection de la présence ou de l'absence et de la quantification en cas de présence dans un échantillon, d'une région de génome à ADN ou à ARN, dont les séquences d'acides nucléiques peuvent présenter une variation, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte la mise en oeuvre d'au moins trois amorces aptes à hybrider simultanément chacune une séquence nucléotidique spécifique au sein de la région à amplifier d'une population de fragments de génomes, de façon à donner après amplification des produits d'amplification chevauchants, dont chacun présente l'une des dites séquences spécifiques susdites, et ensuite, si on le souhaite, la détection et/ou la quantification desdits produits d'amplification. Chacun des produits d'amplification chevauchants contient alors au moins une des séquences d'acides nucléiques ainsi hybridées.
Dans une forme de réalisation préférée, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes:
(a) séparation ou libération des brins d'acides nucléiques dans l'échantillon et traitement de l'échantillon avec un excès molaire d'au moins trois amorces oligonucléotidiques aptes à donner des produits d'amplification chevauchants, lesdites amorces comportant au moins une amorce dite avant (en anglais "forward") et au moins une amorce inverse (en anglais "reverse"), pour lesdites séquences, et réalisation de cycles d'amplification selon l'une quelconque des méthodes d'amplification connues, telles que ACP, TR-ACP, NASBA, TMA ou autres,
(b) addition, soit au(x) brin(s) d'acides nucléiques de l'échantillon simultanément avec les amorces pour une révélation en temps réel, soit aux produits de l'étape (a) pour une révélation post-amplification, d'une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques marquées pour l'hybridation aux amplicons à détecter et/ou quantifier,
(c) détermination de ce que le processus d'amplification puis d'hybridation des amplicons a eu lieu ou non, et en option la quantification du signal de ladite hybridation si elle a eu lieu, avantageusement au moyen soit d'un système d'étalonnage avec standard externe/contrôle interne, soit d'un système d'étalonnage avec standard interne. L'invention s'applique plus avantageusement à des techniques d'amplification par ACP ou par TR-ACP.
Dans une forme de réalisation , au moins certaines, voire la totalité, des séquences nucléotidiques auxquelles s'hybrident les amorces susdites peuvent être elles-mêmes chevauchantes.
Dans une forme de mise en oeuvre avantageuse de ce procédé, au moins un fragment de génome à ADN ou à ARN peut comporter au moins une région à amplifier ayant une variabilité, notamment une variabilité qui peut excéder environ
10% ou même 30% et peut atteindre 100% par substitution, ou une variabilité par addition ou délétion.
Dans ce procédé, la partie de fragments chevauchants amplifiée peut être hybridée avec une seule sonde ou avec deux ou plus de deux sondes, selon les séquences nucléotidiques de la région chevauchante des amplicons et/ou la spécificité des sondes mises en oeuvre. Par amplicons ou produits d'amplification chevauchants on entend ici des fragments d'amplification par ACP ou par toute autre technique d'amplification, tels que les fragments amplifiés ont au moins une séquence similaire dans la région d'intérêt.
Selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, les fragments de génome à détecter et/ou quantifier selon l'invention comportent une région d'intérêt constituée d'environ 100-500 nucleotides.
Les fragments de génome testés peuvent être issus de toutes espèces animales, végétales ou microbiologiques. Ils proviennent d'une même espèce, mais peuvent différer entre eux du fait de la variabilité évoquée plus haut. La technique selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'amplification de différentes populations de génomes ayant des séquences homologues d'hybridation qui diffèrent par un degré de substitution des acides nucléiques de plus de 10% ou même de plus de 30% et pouvant aller jusqu'à 100%, et/ou par des délétions ou des additions de plusieurs acides nucléiques. Les amorces mises en oeuvre selon l'invention doivent être choisies de façon à donner des produits d'amplification à séquences chevauchantes, en particulier de façon à ce qu'il y ait, si l'on compare les différents produits d'amplification entre eux, au minimum environ 40 et avantageusement moins d'environ 300 nucleotides qui se chevauchent d'un fragment à l'autre. Lesdites amorces sont en outre avantageusement choisies pour hybrider dans des conditions identiques ou quasi identiques le maximum de séquences nucléotidiques au sein d'une même région. La température alors choisie pour faire agir les amorces est donc avantageusement telle que chaque amorce ait une température d'hybridation optimale égale à ± 2°C près à la température à laquelle est mise en oeuvre l'amplification. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux, chacune des dites amorces ou au moins l'une d'entre elles peut s'hybrider avec éventuellement plusieurs des séquences nucléotidiques issues de la variabilité de ladite population de génomes à étudier.
Un choix d'amorces non compétitives entre elles et non complémentaires est particulièrement préféré.
Quant aux sondes de révélation, elles peuvent être soit communes à la partie de la région dite chevauchante, soit spécifiques dans la même région chevauchante si les parties de région chevauchante ont des séquences nucléotidiques suffisamment différentes, et elles peuvent être révélées en commun par une sonde unique ou plusieurs sondes pour une détection ou quantification globale, ou séparément par plusieurs sondes si l'on souhaite identifier ainsi ce qui revient à chaque population ou ensemble de populations génomiques.
Selon une forme de mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, les sondes ont leur efficacité optimale à la même température à ± 2°C près, en corrélation ou non avec la température à laquelle les amorces ont elles-mêmes chacune une efficacité optimale.
On recommande en pratique d'utiliser soit une seule sonde si les régions chevauchantes des sous-populations amplifiées sont suffisamment similaires, soit deux ou plus de deux sondes si les régions chevauchantes des produits d'amplification ont des séquences significativement différentes.
Selon la présente invention, les amorces mises en oeuvre sont au minimum au nombre de trois, mais peuvent être aussi nombreuses qu'on le souhaite. Par exemple, il est possible de mettre en oeuvre quatre amorces, cinq amorces ou même plus, sans qu'il y ait de limite supérieure, hormis une limitation volontaire tenant à des considérations pratiques et/ou économiques.
Une forme de mise en oeuvre de l'invention qui est tout particulièrement préférée comporte l'utilisation d'au moins trois amorces dont au moins une est une amorce avant et au moins une est une amorce inverse.
Dans la pratique, les sondes peuvent être mises après l'amplification (post- amplification) ou simultanément avec les amorces pour révélation en temps réel, et dans ce dernier cas la longueur de la sonde doit être adaptée aux conditions d'hybridation et d'amplification et la température d'hybridation de la sonde doit être similaire à celle de l'hybridation des amorces.
Pour une partie chevauchante, on peut utiliser avec profit une sonde commune si elle est capable d'hybrider la totalité des fragments chevauchants, et même dans ce cas on peut utiliser deux ou plus de deux sondes de forte spécificité dans le but d'identifier deux ou plus de deux populations d'intérêt.
Les différentes expressions des résultats du procédé selon l'invention peuvent être choisies à convenance par l'homme du métier et aisément mises en oeuvre par celui-ci, sur la base de ses connaissances et de ses choix concernant les différents marqueurs connus des amorces nucléotidiques et des sondes apparentées.
Un tel procédé peut être employé notamment dans toutes les applications où un fragment de génome peut être associé à une finalité pour laquelle la détection et/ou la quantification s'avèrent utiles ou intéressantes, notamment la détection et/ou la quantification de tout fragment de génome de micro-organisme, ainsi que la détection et/ou la quantification de fragments de génomes d'intérêt dans le cas des maladies génétiques ou acquises survenant chez les humains, les animaux et les végétaux, mais également dans des cas de polymorphisme, y compris hors maladies, avantageusement en vue d'un diagnostic génétique, y compris prénatal ou sur des cellules en culture telles que des cellules d'embryon, ou en vue de l'optimisation de l'administration de médicaments et/ou d'autres substances.
L'invention a également pour objet un kit ou ensemble de moyens pour l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification in vitro ou ex vivo, de populations de génomes dans un échantillon biologique, comprenant: un ensemble d'amorces oligonucléotidiques capables de donner des produits d'amplification chevauchants, comportant au moins trois amorces dont au moins une est une amorce dite avant et au moins une est une amorce dite inverse, et dont chacune est spécifique pour une séquence d'acides nucléiques à détecter et/ou à quantifier, et au moins une sonde oligonucléotidique capable d'hybrider au moins l'une des séquences d'acides nucléiques desdits produits d'amplification, si une telle séquence est présente dans ledit échantillon.
Le kit selon l'invention comprend en outre avantageusement, en option: des moyens constituant un standard externe (SE)/contrôle interne (CI) ou un standard interne (SI) pour l'étalonnage de l'une ou plusieurs des phases opératoires pour lesquelles le kit ou ensemble est conçu, notamment l'extraction et/ou l'amplification et/ou la révélation dudit génome, et/ou une paire d'amorces spécifiques du CI, avantageusement non complémentaires et non compétitives avec les amorces utilisées pour l'amplification de la cible d'intérêt, dans le cas où sont présents des moyens d'étalonnage sur base de SE/CI, et/ou - un ou plusieurs agents pour la transcription réverse dans la TR-ACP ou au moins trois agents pour une amplification de type NASBA, et/ou une sonde oligonucléotidique spécifique du CI, si un étalonnage par SE/CI est mis en oeuvre, ou spécifique du SI, et avantageusement sans relation avec la ou les sondes d'hybridation des fragments chevauchants. Selon une forme de réalisation préférée, l'invention comporte la mise en oeuvre pour l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification de virus VIH, de six amorces constituées en pratique de trois amorces avant et trois amorces inverse respectivement (en abrégé F et R) ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6, et également avantageusement la mise en oeuvre de sondes oligonucléotidiques ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:7 et/ou SEQ ID NO:8.
Selon l'invention, on peut ainsi réaliser une amplification chevauchante de fragments homologues appartenant à des populations non identiques, avantageusement dans un seul tube à essai, et on obtient une cinétique d'amplification équivalente pour tous les fragments de génome amplifiés, en particulier pour tous les fragments qui sont homologues mais ont des séquences pouvant être largement différentes, par exemple des types et sous-types de virus VIH ou autres. L'invention est décrite plus concrètement ci-après en référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels:
Fig. 1 illustre schématiquement une amplification, sur un même nombre de cycles, de séquences d'acides nucléiques (par exemple d'une région cible du gène gag d'un sous-type identifié de VIH) respectivement avec seulement un couple d'amorces selon une méthode traditionnelle et avec quatre amorces (FI, F2, RI, R2) selon le procédé conforme à l'invention.
Fig. 2 représente un schéma d'élaboration d'un ensemble d'amorces et de sondes (oligonucléotides) pour la détection et la quantification de quasi-espèces de VIH selon l'invention. Chaque partie située en dessous de la bande correspondante de la légende représente une séquence similaire à celles situées au-dessus et au dessous d'elle (<10% de variation dans les paires de bases). Un affaiblissement de la teinte dans une telle colonne indique une variation d'une ampleur de 10% à 30% par rapport à la séquence consensus (<10%) et un rectangle blanc indique une variation supérieure à 30% dans ladite séquence, d'où l'impossibilité d'hybridation d'une même amorce à cette séquence. PI et P2 représentent, respectivement, sous PI une sonde hybridant la totalité des fragments chevauchants des 11 sous-types de VIH-1 et sous P2 la sonde hybridant VIH-2.
Fig. 3 représente des cinétiques d'amplification de génotypes/sous-génotypes de VIH dans une amplification par ACP liée à une transcription réverse (TR) standard avec utilisation de chacun des ensembles d'amorces respectivement Fl/Rl (A), F3/R1 (B), F2/R2 (C) et F1/R3 (D).
Fig. 4 représente la cinétique d'amplification d'une séquence cible unique (VIH-1 groupe M/sous-type B) par une technique d'amplification selon l'invention, avec soit 3 amorces (Δ ), soit 5 amorces (D), par comparaison avec une TR-ACP standard (O).
Fig. 5 représente l'amplification obtenue avec tous les génotypes/sous- génotypes de VIH par la technique selon la présente invention avec utilisation de 6 amorces, soit FI, F2, F3, RI, R2, R3.
Ainsi que cela se trouve illustré sur ces dessins, on a mis en oeuvre à titre indicatif un procédé d'amplification avec plus de deux amorces donnant des produits d'amplification chevauchants (MUPROVAMA) selon l'invention, utilisant une amplification en chaîne par polymérase (ACP) liée à une transcriptase réverse (TR) pour une amplification à cible unique de tous les sous-types connus de virus VIH-1 groupes M et O, ainsi que VIH-2.
Exemples
Elaboration d'amorces et de sondes spécifiques de types/sous-types de VIH
Des amorces spécifiques de types/sous-types de virus VIH ont été élaborées sur la base de l'identification des séquences consensus de différents génotypes et/ou sous-génotypes (base de données GeneBank) et on a optimisé le choix en ne retenant que celles ayant des températures d'annelage étroitement assorties. Cette optimisation a été effectuée avec l'aide d'un logiciel informatique approprié (GeneWorks 2.3.1, de IntelliGenetics, Inc., Londres, Royaume-Uni).
On a ainsi sélectionné un total de 3 amorces avant (F) ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:l (FI), SEQ ID NO:2 (F2) et SEQ ID
NO:3 (F3), et de 3 amorces inverse ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:4 (RI), SEQ ID NO:5 (R2), SEQ ID NO:6 (R3), sur une région cible conservée (de 366 pb) du gène gag de VIH pour amplifier du virus VIH de type 1 groupe M (incluant les sous-types A, A', B, B', C, D, E, F, G), groupe O, groupe non M/O, et du virus VIH de type 2. On a par ailleurs élaboré deux sondes spécifiques SEQ ID NO:7 et SEQ ID
NO: 8 pour le virus VIH de type 1 et le virus VIH de type 2, respectivement. Ces sondes servaient à capturer les produits amplifiés spécifiques.
Optimisation des amorces spécifiques d'un type/sous-type de VIH En utilisant les 6 oligonucléotides spécifiques de types/sous-types de VIH (3 amorces avance et 3 amorces réverse), on a constaté que les d'amorces Fl/Rl se sont avérées expérimentalement optimales pour l'amplification de VIH de type groupe M sous-types A, B, B', C, D, E, F et G, elles étaient sous-optimales pour VIH-2 et n'amplifiaient pas VIH-1 groupe M sous-type A' et VIH-1 groupe O (voir Fig. 3 A). Les amorces F3/R1 étaient optimales pour l'amplification des sous-types A', B, C, D et E, mais elles étaient sous-optimales pour VIH-1 groupe M sous-types A, B', F et G, et encore nettement moins efficaces pour VIH-2 (voir Fig. 3B). Comme le montre la Fig. 3C, les amorces F2/R2 étaient optimales pour VIH-1 groupe O, sous- optimales pour VIH-1 groupe M, et n'amplifiaient pas le sous-type A' et VIH-2. Enfin, les amorces F1/R3 étaient optimales pour VIH-2 et n'amplifiaient pas tous les génotypes de VIH-1 (voir Fig. 3D). Une cinétique d'amplification similaire a été atteinte pour chacun des génotypes et sous-génotypes de VIH, à la condition que l'on ait utilisé des amorces spécifiques pour certains génotypes ou sous-génotypes (voir Figs. 3 A à D).
Amplification équivalente de tous les génotypes de VIH par la technique MUPROVAMA
On a utilisé la technique dénommée MUPROVAMA décrite plus haut pour effectuer une amplification équivalente de toutes les quasi-espèces de VIH, afin de détecter et quantifier tous les variants de VIH dans un tube unique d'amplification.
En premier lieu une séquence cible (groupe M de VIH- 1/sous-type B) a été amplifiée soit avec la technique MUPROVAMA selon l'invention (F1/F2/R1 ou F1/F2/F3/R1/R2), soit avec la technique de TR-ACP standard utilisant une seule paire d'amorces optimisées (Fl/Rl). Bien que de multiples fragments aient été amplifiés simultanément dans une telle séquence cible par la technique selon l'invention, le nombre des copies amplifiées après un nombre de cycles fixe était similaire entre la technique MUPROVAMA et la TR-ACP (voir Fig. 4). Deuxièmement, lorsque les 6 amorces hautement sélectives susdites étaient employées ensemble dans un même tube à essai ayant reçu des concentrations de saturation en amorces, une cinétique d'amplification équivalente, soit un même nombre de copies obtenues après un nombre de cycles fixe, a été atteinte par la technique selon l'invention pour tous les génotypes ou sous-génotypes de VIH (Fig. 5).
Protocole expérimental Sources de virus
La concentration standardisée d'échantillons d'isolats inactivés de différents sous-types de VIH-1, ainsi que de VIH-2 (105, 104, 103 et 102 copies éq./ml d'ARN de virion) a été déterminée par hybridation par transfert de type Northern (Northern blot) avec un nombre connu de copies de transcrits d'ARN de VIH comme moyen d'étalonnage. Cela a été fait pour les de VIH type 1 groupe M (sous-types A, A', B, B', C, D, E, F, G) et de groupe O, ainsi que pour le VIH de type 2. Ces concentrations standardisées ont été utilisées pour l'évaluation de la cinétique d'amplification et le seuil de détection de chacun des ensembles d'amorces selon l'invention dans un protocole de TR-ACP standard.
Protocole de TR-ACP
L'ARN viral a été extrait avec une solution d'isolement par centrifugation (12.000 g à 4°C pendant 10 minutes) et ensuite précipité avec de l'isopropanol. Le pellet d'ARN a été remis en suspension dans du tampon exempt d'ARNase et a été rétro-transcrit et amplifié avec un mélange enzymatique contenant une transcriptase réverse de virus de myéloblastose aviaire clone et une ADN polymérase de Taq native dans un appareil automatisé produisant des cycles thermiques (42°C, 25 min; 94°C, 5 min; 94°C/40 s, 60°C/45 s, 72°C/60 s pendant 35 cycles; et finalement 60°C, 5 min et 72°C, 5 min) en présence d'un excès (20 pmol de chaque amorce) d'une paire unique d'amorces (méthode conventionnelle) ou d'un ensemble d'amorces
(ici 3 à 6) spécifiques des gènes gag des types/sous-types de VIH. Après amplification, 10 ml de chaque produit amplifié (dénommé amplicon) ont été distribués dans le puits d'une plaque de microtitrage préalablement revêtu avec des sondes spécifiques de VIH-1 et VIH-2 et les hybrides ont été capturés par un anticorps anti-ADN double brin monoclonal de souris. Un anticorps anti-souris conjugué avec de la phosphatase alcaline a ensuite été ajouté. La réaction colorimétrique de la phosphatase alcaline avec son substrat a été évaluée par photométrie utilisant une analyse par régression linéaire incorporée sur deux longueurs d'onde (405 et 450 nm). Une extension de la plage linéaire de densité optique (DO) de 0,1 jusqu'à 10 a ainsi été obtenue.
Essais de quantification d'ARN de VIH de plasma de patients
Des essais selon la méthode MUPROVAMA conforme à l'invention ont été mis en oeuvre comme suit: On a d'abord introduit 10 ml d'ARN constituant un contrôle interne (CI) dans chacun des tubes de 1,5 ml, on a mélangé avec 600 ml de solution d'isolement d'ARN. Ensuite les tubes ont reçu 100 ml de plasma pour contrôle négatif (en triple), 100 ml de chacune des concentrations respectives de standard externe (à savoir 105, 104, 103 et 102 copies éq./ml d'ARN de VIH) et 100 ml d'échantillons de plasma respectivement. L'ARN a été extrait par centrifugation et ensuite précipité avec de l'isopropanol. Le pellet d'ARN a été utilisé dans une amplification par TR-ACP en présence d'un nombre d'amorces multiples toujours supérieur à deux, donnant des produits d'amplification chevauchants, spécifiques pour l'ARN de VIH et d'un couple d'amorces spécifiques de l'ARN du CI, donnant quant à lui un produit d'amplification spécifique et sans aucune relation avec les produits chevauchants susdits. Après amplification sur environ 30 cycles, 20 ml de chaque produit d'amplification ou amplicon ont été répartis dans deux puits séparés
(10 ml par puits) d'une plaque de microtitrage revêtue au préalable avec des sondes spécifiques pour le VIH d'une part et le CI d'autre part. Un protocole standardisé pour le test ELISA en relation avec une hybridation a été mis en oeuvre au moyen d'un système automatisé (DIAS, Dynex Technologies, INC, Chantilly, VA, USA). Le signal optique de chaque puits contenant les produits d'amplification chevauchants du VIH a été corrigé systématiquement par la différence entre le signal du puits contenant le produit d'amplification du CI correspondant et la moyenne du total des signaux du CI. La concentration de l'ARN de VIH a été calculée au moyen de la courbe d'étalonnage standard (qui suit un modèle de régression log-log dans l'intervalle de ÎO^-IO^ copies éq./ml d'ARN de VIH) générée à partir des signaux de quatre concentrations standard d'ARN de VIH. Un résultat quantitatif a été obtenu lorsque le signal d'un puits était supérieur à la densité optique (DO) moyenne + 2 écarts-types (ET) des témoins négatifs, tandis que les puits présentant une DO égale ou inférieure à la DO moyenne + 2 ET des témoins négatifs ont été considérés comme comportant une quantité non détectable ou l'absence de la cible à identifier. Discussion
La technique selon la présente invention, élaborée à titre d'exemple conformément au protocole expérimental décrit ci-dessus, permet d'établir que la sévère limitation des techniques d'amplification d'une séquence cible d'acides nucléiques dans le domaine du diagnostic moléculaire peut être surmontée au moyen d'une stratégie dénommée MUPROVAMA reposant sur un moyen général consistant essentiellement en plus de deux amorces appropriées, donnant des produits d'amplification chevauchants.
Par conséquent, la sensibilité clinique améliorée et la précision du système de détection et de quantification reposant sur la technique selon l'invention pour une amplification équivalente de quasi-espèces (c'est-à-dire de matériels biologiques non restreints à un génotype ou à un sous-génotype lorsqu'il s'agit par exemple du VIH) représentent un progrès significatif, tel qu'illustré ici dans le diagnostic moléculaire d'infections virales. Il est clair que cette technique peut alors recevoir des applications nombreuses et variées, puisqu'elle permet la détection et/ou la détermination quantitative de n'importe quel gène cible, éventuellement sujet à variabilité, dans les domaines aussi bien de la recherche que du diagnostic, de la thérapie génique et autres.
Le procédé et les moyens selon l'invention permettent d'atteindre un seuil de détection de populations de génomes ou de fragments de génomes, par exemple de virus, de 10 copies équivalent par millilitre de fluide biologique analysé, ce qui représente une amélioration importante de la sensibilité de détection des mêmes quasi-espèces par comparaison avec les méthodes conventionnelles actuellement pratiquées. Dans une forme de mise en oeuvre particulièrement préférée, le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être combinés avec un système de dosage utilisant un standard externe universel constitué de nombres connus de copies d'ARN de VIH, comportant en outre avantageusement un moyen de contrôle interne essentiellement composé d'une concentration constante d'un ARN de transcrit artificiel pour permettre l'étalonnage en temps réel et le contrôle du processus de test dans chaque tube à essai.
Le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être employés aussi bien en recherche que dans des laboratoires, notamment pour des évaluations et des suivis cliniques, ainsi que pour la détection de la totalité des génotypes et sous-génotypes du VIH, et particulièrement utile pour la détection virale du sang et des produits du sang dans un seul tube, tant en relation avec les banques du sang que pour les nouveau-nés de mères infectées; plus généralement, ils procurent dans ces applications des moyens efficaces pour la détection et/ou la quantification précises et sûres de quasi-espèces, notamment de quasi-espèces virales telles que VIH, VHB et VHC.
Le procédé et les moyens selon la présente invention peuvent également permettre, avec une utilisation judicieuse d'amorces et de sondes appropriées, d'identifier rapidement et avec une grande fiabilité certains sous-types viraux ou certaines populations génomiques d'intérêt.

Claims

Revendications
1. Procédé pour l'amplification, en vue de la détection de la présence ou de l'absence et de la quantification en cas de présence dans un échantillon, d'une région de génome à ADN ou à ARN, dont les séquences d'acides nucléiques peuvent présenter une variabilité, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte la mise en oeuvre d'au moins trois amorces aptes à hybrider simultanément chacune une séquence nucléotidique spécifique au sein de la région à amplifier d'une population de fragments de génomes, de façon à donner après amplification des produits d'amplification chevauchants, et ensuite, si on le souhaite, la détection et/ou la quantification desdits produits d'amplification.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
(a) séparation ou libération des brins d'acides nucléiques dans l'échantillon et traitement de l'échantillon avec un excès molaire d'au moins trois amorces oligonucléotidiques aptes à donner des produits d'amplification chevauchants, lesdites amorces comportant au moins une amorce dite avant et au moins une amorce dite inverse, pour lesdites séquences, et réalisation de cycles d'amplification selon l'une quelconque des méthodes d'amplification connues, telles que ACP, TR-ACP, NASBA, TMA ou autres,
(b) addition, soit au(x) brin(s) d'acides nucléiques de l'échantillon simultanément avec les amorces pour une révélation en temps réel, soit aux produits de l'étape (a) pour une révélation post-amplification, d'une ou plusieurs sondes oligo-nucléotidiques marquées pour l'hybridation aux amplicons à détecter et/ou quantifier,
(c) détermination de ce que ladite hybridation a eu lieu ou non, et en option quantification du signal de ladite hybridation si elle a eu lieu.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on amplifie une région commune à différentes populations de génomes, ayant au sein de ladite région à amplifier des séquences homologues d'hybridation qui diffèrent par un degré de substitution des acides nucléiques de plus de 10% ou même de plus de 30% et pouvant aller jusqu'à 100%, et/ou par des délétions ou des additions de plusieurs acides nucléiques.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la quantification du signal de ladite hybridation, si elle a eu lieu, est réalisée au moyen soit d'un système d'étalonnage avec standard externe/contrôle interne, soit d'un système d'étalonnage avec standard interne.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les fragments de génome à détecter et/ou quantifier comportent une région d'intérêt constituée d'environ 100-500 nucleotides.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les fragments de génome proviennent d'une même espèce et diffèrent entre eux du fait d'une variabilité.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on regroupe des fragments de génomes en vue de leur amplification simultanée, en pratique dans un même tube.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on choisit les amorces de façon à avoir des produits d'amplification à séquences chevauchantes, et de préférence, si l'on compare les différents produits d'amplification entre eux, de façon à obtenir une longueur de chevauchement d'au minimum environ 40 et avantageusement de moins d'environ 300 nucleotides qui se chevauchent d'un fragment à l'autre.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que chaque amorce a une température d'hybridation optimale égale à ± 2°C près à la température à laquelle est mise en oeuvre l'amplification.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les amorces sont non compétitives entre elles et non complémentaires.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on utilise des sondes soit communes à la partie de région chevauchante, soit spécifiques dans la même région chevauchante.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on effectue la révélation des séquences en commun par une sonde unique ou plusieurs sondes pour une détection ou quantification globale, ou séparément par plusieurs sondes pour identifier ce qui revient à chaque population ou ensemble de populations génomiques.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre, pour l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification de virus VIH, de six amorces constituant en pratique trois amorces avant et trois amorces inverse respectivement (en abrégé F et R) ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:l, SEQ ID
NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6.
14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 aux fins de détection et/ou de quantification de tout micro-organisme, ainsi que de fragments de génomes d'intérêt, dans le cas des maladies génétiques ou acquises survenant chez les humains, les animaux et les végétaux.
15. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans des cas de polymorphisme, y compris hors maladies, avantageusement en vue d'un diagnostic génétique, y compris prénatal ou sur des cellules en culture telles que des cellules d'embryon.
16. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en vue de l'optimisation de l'administration de médicaments et/ou d'autres substances.
17. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection et/ou la quantification in vitro ou ex vivo de populations de fragments de génomes dans un échantillon biologique, qui peut être d'origine humaine, animale ou végétale, ainsi que de populations de fragments de génomes présents dans des gaz ou des minéraux.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, dans laquelle on met en oeuvre, pour l'amplification, en vue de la détection et/ou la quantification de virus VIH, six amorces constituant en pratique trois amorces avant et trois amorces inverse respectivement (en abrégé F et R) ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ
ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6.
19. Kit ou ensemble de moyens pour l'amplification in vitro ou ex vivo, de populations de génomes dans urt échantillon biologique, comprenant: - un ensemble d'amorces oligonucléotidiques capables de donner des produits d'amplification chevauchants, comportant au moins trois amorces dont au moins une est une amorce dite avant et au moins une est une amorce dite inverse, et dont chacune est spécifique pour une séquence d'acides nucléiques à détecter et/ou à quantifier, et - au moins une sonde oligonucléotidique capable d'hybrider au moins l'une des séquences d'acides nucléiques desdits produits d'amplification, si une telle séquence est présente dans ledit échantillon.
20. Kit ou ensemble selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, en option:
- des moyens constituant un standard externe (SE)/contrôle interne (CI) ou un standard interne (SI) pour l'étalonnage de l'une ou plusieurs des phases opératoires pour lesquelles le kit ou ensemble est conçu, notamment l'extraction et/ou l'amplification et/ou la révélation dudit génome, et/ou - une paire d'amorces spécifiques du CI dans le cas où sont présents des moyens d'étalonnage sur base de SE/CI, et/ou
- un ou plusieurs agents pour la transcription réverse dans la TR-ACP ou au moins trois agents pour une amplification de type NASBA, et/ou
- une sonde oligonucléotidique spécifique du CI, dans le cas d'un étalonnage par SE/CI.
21. Kit ou ensemble selon la revendication 20, caractérisé en ce que les amorces de la paire d'amorces spécifiques du CI sont non complémentaires et non compétitives avec les amorces utilisées pour l'amplification de la cible d'intérêt, et/ou la sonde oligonucléotidique spécifique du CI est sans relation avec la ou les sondes d'hybridation des fragments chevauchants.
22. Kit ou ensemble selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que, pour l'amplification, en vue de la détection et ou la quantification de virus VIH, il comporte six amorces constituées en pratique de trois amorces avant et trois amorces inverse respectivement (en abrégé F et R) ayant les séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6.
23. Amorces oligonucléotidiques pour l'hybridation à des fragments de génome de types et sous-types du VIH, caractérisées en ce qu'elles comprennent respectivement les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6.
24. Sondes oligonucléotidiques pour la révélation de types et sous-types du VIH, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO:7 et/ou SEQ ID NO:8.
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