WO2000034508A1 - Procede de detection de micro-organismes et support utilisable dans un tel procede - Google Patents

Procede de detection de micro-organismes et support utilisable dans un tel procede Download PDF

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WO2000034508A1
WO2000034508A1 PCT/FR1999/003003 FR9903003W WO0034508A1 WO 2000034508 A1 WO2000034508 A1 WO 2000034508A1 FR 9903003 W FR9903003 W FR 9903003W WO 0034508 A1 WO0034508 A1 WO 0034508A1
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beads
support
container
sterile
solid
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PCT/FR1999/003003
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English (en)
Inventor
Daniel Monget
Jean-Marc Roche
Original Assignee
Biomerieux S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the presence in a sample, contained in a sterile container, of at least one aerobic or anaerobic microorganism, the sample being in contact with a growth medium.
  • the invention also relates to a support which can be used in such a method.
  • document US-A-5,672,484 which relates to a container for detecting strict aerobic microorganisms in a sample, which comprises a chamber containing a culture medium therein, and defining a free space above the middle.
  • This document also relates to a method of manufacturing such a container and a method of growing strict aerobic microorganisms.
  • a non-toxic insert hydrated with said growth medium has a free surface which at least partially extends beyond the free space, in order to allow the supply of oxygen to the growth medium, and therefore to increase the oxygenation of the microorganisms introduced into the sample, and improve their metabolic process.
  • This insert is chosen from the following group of materials: sponge, cotton, glass fiber balls and resin.
  • this apparatus and method is limited to the detection of strict aerobic microorganisms. Moreover, and very explicitly, the need for increasing the oxygen exchanges between the support and the free and confined space of the container is mentioned. To do this, the insert is positioned at the interface constituted by the culture medium, on the one hand, and the free space, on the other hand. All these features
  • the present invention seeks to protect a process which is much more versatile, since it can be used with all microorganisms, whatever their respiratory metabolism.
  • the arrangement of the inserts or supports within the container does not have to follow a framework as restrictive as that which is necessary for the document of the state of the art.
  • the present invention relates to a method for detecting the presence in a sample, contained in a sterile container, of at least one microorganism, whatever its respiratory metabolism, the sample being in contact with a medium. growth, characterized in that it consists of:
  • the characteristic observed is due to a variation of at least one indicator added to the container before incubation, for example a colored or fluorescent indicator, and / or at least one physico-chemical or electrical parameter, for example the CO 2 production pressure, turbidity, redox potential and / or pH.
  • at least one indicator added to the container before incubation for example a colored or fluorescent indicator, and / or at least one physico-chemical or electrical parameter, for example the CO 2 production pressure, turbidity, redox potential and / or pH.
  • the sample is either biological, for example blood, cerebrospinal fluid, pleural fluids, urine, or non-biological, for example water, food products, pharmaceutical products.
  • biological for example blood, cerebrospinal fluid, pleural fluids, urine
  • non-biological for example water, food products, pharmaceutical products.
  • the variation of the indicator (s) is read optically through all or part of at least one of the walls of the container, which is transparent, and / or the modification of the parameter (s) is read.
  • (s) is carried out by means of physico-chemical (s) or electrical (s) sensor (s).
  • the method applies to microorganisms with anaerobic metabolism.
  • This process is used in a sterility check.
  • the present invention also relates to a solid, inert and sterile support, used in the process, defined above, which, in a second embodiment, is characterized by the fact that it consists of natural materials, for example:
  • the solid, inert and sterile support used in the above process consists of artificial materials, for example:
  • the solid, inert and sterile support used in the above process consists of an element of any shape made of polyethylene. Whatever the embodiment, this support consists of beads or grains with a diameter between 1 ⁇ m and 10 mm, and in particular between 0.1 mm and 5 mm.
  • the attached figures are given by way of explanatory example and have no limiting character. They will allow a better understanding of the invention. In each of these figures, curve 1 corresponds to the insertion of a cork support, curve 2 to the insertion of a polyethylene support, and curve 3 to the absence of support, thus serving as a reference .
  • FIG. 1 represents a curve of the growth kinetics in the case of Haemophilus influenzae.
  • FIG. 2 represents a curve of the growth kinetics in the case of Kingella denitrificans.
  • FIG. 3 represents a curve of the growth kinetics in the case of
  • FIG. 4 represents a curve of the growth kinetics in the case of Bactero ⁇ des fragilis.
  • FIG. 5 represents a curve of the growth kinetics in the case of Veillonella parvula.
  • FIG. 6 represents a curve of the growth kinetics in the case of Clostridium sporogenes.
  • the present invention relates to a method for detecting the presence in a sample, contained in a sterile container, of at least one aerobic or anaerobic microorganism, the sample being in contact with a growth medium.
  • the supports added in a single container may consist of a mixture of at least two artificial or natural supports, mentioned above, or else of a mixture of at least one artificial support and of at least one natural support, mentioned above.
  • bottles are then placed under vacuum and gassed so as to reconstitute an atmosphere adapted to the type of broth concerned (aerobic for NITAL AER or anaerobic for NITAL A ⁇ A). They are then capped and capped to be ready for use.
  • NITAL AER and A ⁇ A bottles without support underwent the same manufacturing process, except for the preparation and the addition of the support. .
  • the microorganisms studied are previously cultivated on an appropriate growth medium such as an agar, generally a Columbia agar with 5% sheep blood. For each of them, a suspension is made in distilled water by removing one or more colonies. This suspension is calibrated at 10 8 cells / ml and diluted to a millionth. Using a sterile syringe, one milliliter of this dilution is introduced into each NITAL bottle with or without support previously inoculated with 5 ml of horse blood or human blood. Thus, about one hundred microorganism cells are introduced per bottle.
  • an agar generally a Columbia agar with 5% sheep blood.
  • the bottles, containing the sample to be analyzed, are placed in the NITAL brand system (ref .: 99105, 99106 or 99122 from bioMérieux) which plays the role of both an incubator and a reader.
  • This system incubates the vials at an appropriate temperature.
  • the kinetics of the indicator are followed by an optical measurement through the transparent glass wall of the bottles. If the sample initially contains microorganisms, these will multiply during incubation and the modification of the indicator, present in the reaction medium, will reflect the presence of said microorganisms in the sample.
  • the effectiveness of a support will be assessed by comparing the detection times obtained using bottles with and without support.
  • Table 1 Detection time in hours and time saving in% of the use of flasks with supports compared to flasks without support in the case of aerobic, optional anaerobic microorganisms
  • This table 1 above indicates a gain in detection time compared to the flasks without support of between 22.1 to 45.9% depending on the strains in the presence of polyethylene beads. This range ranges from 20.1 to 66.3% depending on the strains in the presence of cork particles.
  • FIG. 1 The effect of the supports can be visualized on the growth kinetics presented in FIG. 1 in the case of Haemophilus influenzae, in FIG. 2 in the case of Kingella denitrificans and in FIG. 3 in the case of Staphylococcus saprophyticus.
  • Example 2 Detection of Microorganisms with a Strict Anaerobic Metabolism The test was carried out under the following conditions:
  • Table 2 Detection time in hours and time saving in% of the use of flasks with supports compared to flasks without support in the case of anaerobic microorganisms Table 2 above indicates a gain in detection time compared to flasks without support from 39 to 69.6% depending on the strains, in the presence of polyethylene beads, and from 16.3 to 63.4% depending on the strains , in the presence of cork particles.
  • Example 1 there is therefore a marked reduction in detection times which reflects the positivity of the bottles containing a support, which is the result of a faster turn of the indicator, and this for both microorganisms with aerobic metabolism and anaerobic metabolism.
  • Example 3 Complementary study on the detection of different microorganisms with aerobic metabolism, facultative anaerobic (AAF)
  • the AAF strains used are either bacteria or yeasts.
  • several analyzes were carried out for each species studied. They belong to the following different species or genera:
  • Yeasts Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida guillermondii,
  • the polypropylene support is not of interest because it slows the detection times in a good number of cases, that is to say that the value is greater than the value of 100% obtained for the reference as regards bottles without support. This value can even reach 174.3% for Pseudomonas.
  • strains used are anaerobic bacteria belonging to the following genera: * Bacteroids, * Clostridium, 12
  • This table 4 above indicates a gain in detection time compared to the flasks without support of between 2.7 and 72.4% depending on the anaerobic species tested.
  • This process essentially consists of four or five successive stages.
  • the parameter (s) can be observed by sensors which, for example measure the pressure, the production of CO 2 , the turbidity, the redox potential or the pH. This list is not exhaustive, and it may contain any physico-chemical or electrical characteristic which may vary with the metabolic activity of a microorganism.
  • incubation temperature As regards the appropriate incubation temperature, mentioned in the above process, this varies depending on the family, species or genus of the microorganism tested. Thus, this variation is very wide and is between substantially 0 and 100 ° C depending on the microorganism. These temperatures are however well known to those skilled in the art and / or present no difficulty in being determined.
  • This method can also be used, in addition to the analysis of samples in which we want to highlight the presence of microorganisms, in the search for sterility (biological fluids: blood, cerebrospinal fluid, pleural fluids, urine , etc., non-biological samples such as water, food or pharmaceutical products).
  • biological fluids blood, cerebrospinal fluid, pleural fluids, urine , etc., non-biological samples such as water, food or pharmaceutical products.
  • the presence of a support according to the invention significantly improves the speed of detection of the presence of microorganisms in a sample, whatever its metabolism, aerobic or anaerobic. Such a result was obtained without having to seek the effect of better oxygenation or better exposure of microorganisms to the oxygen that may be present in the medium.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme, quel que soit son métabolisme respiratoire (aérobie ou anaérobie), l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance. L'invention concerne également un support pouvant être mis en oeuvre dans un tel procédé. Le procédé consiste à: ajouter au sein du récipient au moins un support solide, inerte et stérile; incuber à une température appropriée, et observer une variation d'au moins une caractéristique liée à la présence du ou des micro-organismes à détecter au sein dudit récipient. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

Procédé dε détection de micro-organismes et support utilisable dans un tel procédé DESCRIPTION
La présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme, aérobie ou anaérobie, l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance. L'invention concerne également un support pouvant être mis en oeuvre dans un tel procédé.
// est connu que les micro-organismes aérobies (bactéries, levures) adhèrent et colonisent la majorité des surfaces qui leur sont offertes. Cette fixation améliore les échanges nutritionnels et donc le niveau de croissance des micro-organismes. Ainsi, la présence d'une phase solide influence bon nombre de processus métaboliques, comme la fixation d'azote, l'oxydation alcoolique, la nitrification et la dénitrification, etc. Cette particularité est largement utilisée en microbiologie industrielle.
Ainsi, l'état de la technique peut être défini par le document US-A-5,672,484 qui a pour objet un récipient pour détecter des micro-organismes aérobies stricts dans un échantillon, qui comprend une chambre contenant un milieu de culture en son sein, et définissant un espace libre au-dessus du milieu. Ce document concerne également une méthode de fabrication d'un tel récipient et une méthode de croissance de microorganismes aérobies stricts. Un insert non toxique hydraté avec ledit milieu de croissance possède une surface libre qui déborde au moins partiellement dans l'espace libre, afin de permettre l 'approvisionnement en oxygène du milieu de croissance, et donc augmenter l'oxygénation des micro-organismes introduits dans l'échantillon, et améliorer de leur processus métabolique. Cet insert est choisi dans le groupe des matériaux suivants : éponge, coton, billes défibres de verre et résine.
Toutefois, cet appareil et ce procédé sont limités à la détection des microorganismes aérobies stricts. D'ailleurs, et de manière très explicite, il est fait état de la nécessité d'augmenter les échanges en oxygène entre le support et l'espace libre et confiné du récipient. Pour ce faire, l'insert est positionné à l'interface constituée par le milieu de culture, d'une part, et l'espace libre, d'autre part. Toutes ces caractéristiques
COPIE DE C0NFIR ATI0W ne pouvaient que détourner l'homme du métier de l'intérêt d'utiliser, au sein dudit récipient, un support solide, inerte et stérile, même dans des conditions d'anaérobiose.
Les résultats obtenus par la demanderesse lors de ces travaux d'étude étaient donc inattendus.
La présente invention cherche à protéger un procédé qui est bien plus polyvalent, car utilisable avec tous les micro-organismes, quel que soit leur métabolisme respiratoire. De plus, la disposition des inserts ou supports au sein du récipient n'a pas à suivre un cadre aussi contraignant que ce qui est nécessaire pour le document de l'état de la technique.
A cet effet, la présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro- organisme, quel que soit son métabolisme respiratoire, l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance, caractérisé en ce qu'il consiste à :
- ajouter au sein du récipient au moins un support solide, inerte et stérile,
- incuber à une température appropriée, et
- observer une variation d'au moins une caractéristique liée à la présence du ou des micro-organismes à détecter au sein dudit récipient. La caractéristique observée est due à une variation d'au moins un indicateur, ajouté dans le récipient avant l'incubation, par exemple un indicateur coloré ou fluorescent, et/ou d'au moins un paramètre physico-chimique ou électrique, par exemple la production de CO2 la pression, la turbidité, le potentiel d'oxydoréduction et/ou le pH.
Dans tous les cas de figure, l'échantillon est soit biologique, par exemple sang, liquide céphalo-rachidien, liquides pleuraux, urine, soit non biologique, par exemple eau, produits alimentaires, produits pharmaceutiques.
La lecture de la variation du ou des indicateur(s) s'effectue de manière optique au travers de toute ou partie d'au moins une des parois du récipient, qui est transparente, et/ou la lecture de la modification du ou des paramètre(s) s'effectue par l'intermédiaire de capteur(s) physico-chimique(s) ou électrique(s). Préférentiellement, le procédé s'applique aux micro-organismes à métabolisme anaérobie.
Ce procédé est utilisé dans un contrôle de stérilité.
La présente invention concerne également un support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé, défini précédemment, qui, dans un second mode de réalisation, est caractérisé par le fait qu'il est constitué de matériaux naturels, par exemple :
- billes de silice,
- billes de verre de petite taille (pleines, creuses ou poreuses),
- particules de quartz, - grains de sable ,
- grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath,
- laine de verre et/ou de roche,
- billes d'argile, et
- particules de liège. Selon un second mode de réalisation, le support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé ci-dessus, est constitué de matériaux artificiels, par exemple :
- billes de polystyrène,
- billes de polyéthylène,
- billes de polypropylène, - billes de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables,
- supports de croissance sous forme de billes de petite taille utilisés en culture cellulaire,
- billes de late ,
- billes revêtues de gélatine, et
- grains de résine. Selon un troisième mode de réalisation, le support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé ci-dessus est constitué d'un élément de toute forme en polyéthylène. Quel que soit le mode de réalisation, ce support est constitué de billes ou grains d'un diamètre compris entre 1 μm et 10 mm, et notamment entre 0,1 mm et 5 mm. Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif Elles permettront de mieux comprendre l'invention. Sur chacune de ces figures, la courbe 1 correspond à l'insertion d'un support en liège, la courbe 2 à l'insertion d'un support en polyéthylène, et la courbe 3 à l'absence de support, servant ainsi de référence.
La figure 1 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de Haemophilus influenzae.
La figure 2 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de Kingella denitrificans. La figure 3 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de
Staphylococcus saprophyticus.
La figure 4 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de Bacteroïdes fragilis.
La figure 5 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de Veillonella parvula.
Enfin, la figure 6 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de Clostridium sporogenes.
La présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme, aérobie ou anaérobie, l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance.
Cette détection est en fait accélérée par le fait que l'on introduit dans le récipient un support solide, inerte et stérile.
La liste ci-dessous regroupe des supports permettant d'accélérer le temps de détection de micro-organismes présents dans un échantillon. Cette liste n'est bien entendu pas limitative.
Dans le cas de supports dits naturels, on peut utiliser :
- des billes de silice,
- des billes de verre de petite taille qui peuvent être pleines, creuses ou poreuses, - des particules de quartz,
- des grains de sable , - des grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath,
- de la laine de verre ou de roche,
- des billes d'argile, et
- des particules de liège. Dans le cas de supports dits artificiels, on peut utiliser :
- des billes de polystyrène,
- des billes de polyéthylène,
- des billes de polypropylène,
- des billes de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables,
- des supports de croissance sous forme de billes, de petite taille, utilisés en culture cellulaire de marque déposée CYTODEX de type 1 et 3,
- des billes de latex,
- des billes recouverte de gélatine, et - des grains de résine di-éthyl-amino-éthyle (DEAE) pour les résines échangeuses d'anions ou de marque déposée SEPHADEX (CM = Carboxy Méthyl cellulose) pour les résines échangeuses de cations.
Bien entendu, les supports ajoutés dans un seul récipient peuvent être constitués d'un mélange d'au moins deux supports artificiels ou naturels, ci-dessus mentionnés ou bien d'un mélange d'au moins un support artificiel et d'au moins un support naturel, ci- dessus mentionnés.
Mise en œuvre :
La mise en œuvre présentée concerne un mode particulier de réalisation, il existe bien d'autres possibilités. Cette mise en oeuvre ne peut donc être considérée comme limitant la portée de la protection recherchée.
1. Préparation des flacons Tous les supports ont été stérilisés par un chauffage de 15 minutes (mn) à 120 degrés Celsius (°C). Après séchage pendant 24 heures à 37°C, ils ont été répartis stérilement dans les flacons. La quantité introduite par flacon dépend du support utilisé et est ajustée de façon à obtenir une couche de matériau dont la surface soit sensiblement équivalente à la section des flacons. Les flacons contenant les supports sont à nouveau chauffés 15 mn à 120°C puis reçoivent stérilement 40 ml de bouillon nutritif aérobie NITAL AER (Réf. 52511 de bioMérieux) ou de bouillon nutritif anaérobie NITAL AΝA (Réf. 52512 de bioMérieux) contenant le traceur de croissance microbienne ou indicateur, tel que décrit et revendiqué dans le brevet EP-B-0.424.293 de la demanderesse.
Les flacons sont ensuite mis sous vide et gazés de manière à reconstituer une atmosphère adaptée au type de bouillon concerné (aérobie pour NITAL AER ou anaérobie pour NITAL AΝA). Us sont ensuite bouchonnés et capsulés pour être prêts à l'emploi.
Afin de pouvoir comparer les performances de l'adjonction des supports selon la présente invention sur des milieux, des flacons NITAL AER et AΝA sans support ont subi le même processus de fabrication, à l'exception de la préparation et de l'addition du support.
2. Analyse des échantillons :
Les flacons, tels que préparés ci-dessus, reçoivent ensuite stérilement un échantillon (biologique ou non) dans lequel on veut rechercher la présence de micro- organismes.
Dans le cas d'une simulation d'hémocultures positives comme cela a été le cas au laboratoire, il a été procédé de la façon suivante. Premièrement, les micro-organismes étudiés sont préalablement cultivés sur milieu de croissance adapté tel qu'une gélose, généralement une gélose Columbia avec 5% de sang de mouton. Pour chacun d'eux, une suspension est réalisée en eau distillée en prélevant une ou plusieurs colonies. Cette suspension est calibrée à 108 cellules/ml et diluée au millionième. A l'aide d'une seringue stérile, un millilitre de cette dilution est introduit dans chaque flacon NITAL avec ou sans support préalablement inoculé par 5 ml de sang de cheval ou de sang humain. Ainsi, environ cent cellules de micro-organisme sont introduites par flacon.
Les flacons, contenant l'échantillon à analyser, sont placés dans le système de marque NITAL (réf. : 99105, 99106 ou 99122 de bioMérieux) qui joue le rôle à la fois d'un incubateur et d'un lecteur. Ce système assure une incubation des flacons à une température appropriée. La cinétique de l'indicateur est suivie par une mesure optique à travers la paroi en verre transparente des flacons. Si l'échantillon contient au départ des micro-organismes, ceux-ci vont se multiplier au cours de l'incubation et la modification de l'indicateur, présent dans le milieu réactionnel, traduira la présence desdits microorganismes dans l'échantillon.
L'efficacité d'un support sera appréciée en comparant les temps de détection obtenus en utilisant des flacons avec et sans support.
Exemples selon l'invention :
Exemple 1 : Détection de micro-organismes à métabolisme aérobie
L'essai a été effectué dans les conditions suivantes :
- flacons NITAL AER avec et sans support, préparés selon le processus décrit dans le paragraphe "Préparation des flacons",
- supports étudiés : billes de polyéthylène et particules de liège,
- souches testées :
• Haemophilus influenzae (réf. bioMérieux : JHI 8006064),
• Kingella denitrificans (réf. bioMérieux : JKD 8311002), et • Staphylococcus saprophyticus (réf. bioMérieux : MSA 54677), - milieu d'isolement des souches : gélose Columbia bioMérieux additionnée par 5% de sang de mouton,
- simulation d'hémocultures positives comme indiqué dans le paragraphe « Analyse des échantillons », avec addition stérile d'environ cent micro-organismes et de 5 ml de sang de cheval par flacon,
- détermination des temps de positivité des flacons par le système NITAL (marque déposée), et
- tracé de cinétique de croissance pour chaque flacon.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 1 qui suit.
Figure imgf000010_0001
Tableau 1 : Temps de détection en heures et gain de temps en % de l'utilisation des flacons avec supports par rapport aux flacons sans support dans le cas de micro-organismes aérobies, anaérobies facultatifs
Ce tableau 1 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux flacons sans support compris entre 22,1 à 45,9 % selon les souches en présence de billes de polyéthylène. Cette fourchette s'échelonne entre 20,1 à 66,3 % selon les souches en présence de particules de liège.
L'effet des supports peut être visualisé sur les cinétiques de croissance présentées sur la figure 1 dans le cas de Haemophilus influenzae, sur la figure 2 dans le cas de Kingella denitrificans et sur la figure 3 dans le cas de Staphylococcus saprophyticus.
Exemple 2 : Détection de micro-organismes à métabolisme anaérobie strict L'essai a été effectué dans les conditions suivantes :
- flacons NITAL AΝA avec et sans support, préparés selon le processus décrit dans le paragraphe "Préparation des flacons",
- supports étudiés : billes de polyéthylène et particules de liège,
- souches testées :
• Bacteroïdes fragilis (réf. bioMérieux : HBF 358),
• Veillonella parvula (réf. bioMérieux : JKD 8311002), et
• Clostridium sporogenes (réf. bioMérieux : ACO 100651),
- milieu d'isolement des souches : gélose Columbia bioMérieux additionnée par 5% de sang de mouton incubée en anaérobiose,
- simulation d'hémocultures positives comme indiqué dans le paragraphe "Analyse des échantillons", avec addition stérile d'environ cent micro-organismes et de 5 ml de sang de cheval par flacon,
- détermination des temps de positivité des flacons par le système NITAL, et
- tracé de cinétique de croissance pour chaque flacon.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 2 qui suit.
Figure imgf000011_0001
Tableau 2 : Temps de détection en heures et gain de temps en % de l'utilisation des flacons avec supports par rapport aux flacons sans support dans le cas de micro-organismes anaérobies Le tableau 2 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux flacons sans support de 39 à 69,6 % selon les souches, en présence de billes de polyéthylène, et de 16,3 à 63,4 % selon les souches, en présence de particules de liège.
L'effet des supports peut être visualisé sur les cinétiques de croissance présentées sur la figure 4 dans le cas de Bacteroïdes fragilis, sur la figure 5 dans le cas de Veillonella parvula et sur la figure 6 dans le cas de Clostridium sporogenes.
Que l'on se reporte à l'exemple 1 ou à l'exemple 2, on constate donc une nette diminution des temps de détection qui traduit la positivité des flacons contenant un support, qui est le résultat d'un virage plus rapide de l'indicateur, et cela aussi bien pour les micro-organismes à métabolisme aérobie qu'à métabolisme anaérobie.
Exemple 3 : Etude complémentaire sur la détection de différents microorganismes à métabolisme aérobie, anaérobie facultatif (AAF)
Dans cet exemple, les souches AAF utilisées sont soit des bactéries soit des levures. De plus, plusieurs analyses ont été réalisées pour chaque espèce étudiée. Elles appartiennent aux différentes espèces ou genres suivants :
• Neisseria, * Brucelles ,
• Levures : Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida guillermondii,
• Staphylococcus,
• Pseudomonas, et
• Autres souches appartenant à : Haemophilus, Kingella, Eikenella et Micrococcus.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 3 qui suit. Toutes les valeurs exposées correspondent aux temps de détection en présence de supports exprimés en pourcentage par rapport aux temps de détection obtenus avec des flacons sans support et considérés comme ayant une valeur de 100 %.
Figure imgf000013_0001
Tableau 3 : Influence de la nature des supports sur la détection de plusieurs micro-organismes aérobies
Ce tableau 3 indique clairement que le support de polyéthylène permet de réduire significativement les temps de détection de l'ensemble des espèces ou genres testés, ces temps variant de 60,8 % à 83,6 % par rapport aux temps obtenus avec les flacons sans support (100 %).
Le support de polypropylène n'offre pas d'intérêt car il ralentit les temps de détection dans bon nombre de cas, c'est-à-dire que la valeur est supérieure à la valeur de 100 % obtenue pour la référence en ce qui concerne les flacons sans support. Cette valeur peut même atteindre 174,3 % pour Pseudomonas.
Exemple 4 : Etude de l'influence du support de polyéthylène sur la détection de micro-organismes à métabolisme anaérobie
Dans cet exemple, les souches utilisées sont des bactéries anaérobies appartenant aux genres suivants : * Bacteroïdes , * Clostridium, 12
* Veptostreptococcus ,
* Veillonella, et
* Fusobacterium.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 4 qui suit.
Toutes les valeurs exposées sont des pourcentages qui, comme pour le tableau 3, correspondent aux temps de détection en présence de support, exprimés en pourcentage par rapport aux temps de détection sans support rapportés à 100 %.
Figure imgf000014_0001
Tableau 4 : Influence du support sur la détection de plusieurs micro-organismes anaérobies
Ce tableau 4 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux flacons sans support compris entre 2,7 et 72,4 % selon les espèces anaérobies testées.
Ainsi, comme le montrent les exemples ci-dessus, l'efficacité du procédé est avérée. Ceci est vrai pour les procédés utilisés dans des hémocultures (recherche de micro-organismes dans le sang), mais également pour d'autres applications basées sur la culture de micro-organismes.
Ce procédé consiste essentiellement en quatre ou cinq étapes successives.
Premièrement, il convient d'ajouter l'échantillon à analyser au sein du récipient et un milieu de croissance. Deuxièmement, il faut également ajouter au sein dudit récipient au moins un support solide, inerte et stérile. Troisièmement et éventuellement, on peut sceller le récipient. Quatrièmement, on incube à une température appropriée. Enfin et cinquièmement, on observe une variation d'une caractéristique en relation avec la présence, la croissance et/ou le métabolisme d'un micro-organisme à détecter. Cette caractéristique peut généralement être de deux natures différentes.
D'une part, il peut s'agir d'un indicateur chimique, par exemple coloré, fluorescent, chromogène, qui est ajouté dans le récipient avant l'incubation. D'autre part, il peut s'agir d'un paramètre physico-chimique ou électrique, qui est modifié par la simple croissance des micro-organismes à détecter. Dans ce dernier cas, il n'est pas nécessaire d'ajouter de substance pour permettre l'établissement d'une variation de ce paramètre. Cette observation d'une variation d'une caractéristique peut être manuelle, c'est-à-dire visuelle, ou bien automatique. Dans le cas d'une observation automatique, le ou les paramètres peuvent être observés par des capteurs qui, par exemple mesurent la pression, la production de CO2, la turbidité, le potentiel d'oxydoréduction ou le pH. Cette énumération n'est pas limitative, et elle peut contenir toute caractéristique physico-chimique ou électrique pouvant varier avec l'activité métabolique d'un microorganisme.
En ce qui concerne la température d'incubation appropriée, mentionné dans le procédé ci-dessus exposé, celle-ci varie en fonction de la famille, de l'espèce ou du genre du micro-organisme testé. Ainsi, cette variation est très large et est comprise entre sensiblement 0 et 100 °C selon le micro-organisme. Ces températures sont toutefois bien connues de l'homme du métier et/ou ne présentent aucune difficulté à être déterminée.
Ce procédé peut également être utilisé, en plus de l'analyse des échantillons dans lequel on veut mettre en évidence la présence de micro-organismes, dans la recherche de la stérilité (liquides biologiques : sang, liquide céphalo-rachidien, liquides pleuraux, urine, etc., échantillons non biologiques tels que l'eau, les produits alimentaires ou pharmaceutiques) . Les résultats présentés dans les exemples ci-dessus permettent de démontrer l'impact des supports de croissance sur les temps de détection de micro-organismes aussi bien aérobies et qu' anaérobie (ces derniers exigeant pour leur croissance une atmosphère N2/CO2 sans O2). La majorité des temps de détection a été diminuée de façon significative.
Les exemples se limitent à l'utilisation de certains supports et à l'étude de leur impact sur la détection de certains micro-organismes. Mais, des résultats similaires ont d'ores et déjà été obtenus avec d'autres supports et en étendant l'étude à d'autres microorganismes. La portée de la présente invention n'est donc pas limitée aux espèces et aux supports étudiés.
En conclusion, la présence d'un support selon l'invention améliore de façon significative la rapidité de détection de la présence de micro-organismes dans un échantillon, quel que soit son métabolisme, aérobie ou anaérobie. Un tel résultat a été obtenu sans avoir à rechercher l'effet d'une meilleure oxygénation ou d'une meilleure exposition des micro-organismes à l'oxygène pouvant être présent dans le milieu.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de la présence dans un échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme, quel que soit son métabolisme respiratoire, l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance, caractérisé en ce qu'il consiste à :
- ajouter au sein du récipient au moins un support solide, inerte et stérile,
- incuber à une température appropriée, et - observer une variation d'au moins une caractéristique liée à la présence du ou des micro-organismes à détecter au sein dudit récipient.
2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la caractéristique observée est due à une variation d'au moins un indicateur chimique, ajouté dans le récipient avant l'incubation par exemple un indicateur coloré ou fluorescent, et/ou d'au moins un paramètre physico-chimique ou électrique par exemple la production de CO2, la pression, la turbidité, le potentiel d'oxydoréduction et/ou le pH.
3. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon est biologique, par exemple sang, liquide céphalo-rachidien, liquides pleuraux, urine, ou non biologique, par exemple eau, produits alimentaires, produits pharmaceutiques.
4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lecture de la variation du ou des indicateur(s) s'effectue de manière optique au travers de toute ou partie d'au moins une des parois du récipient, qui est transparente, et/ou la lecture de la modification du ou des paramètre(s) s'effectue par l'intermédiaire de capteur(s) physico-chimique(s) ou électrique(s).
5. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il s'applique aux micro-organismes à métabolisme anaérobie.
6. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est utilisé dans un contrôle de stérilité.
7. Support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé, défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il est constitué de matériaux naturels, par exemple :
- billes de silice,
- billes de verre de petite taille (pleines, creuses ou poreuses), - particules de quartz,
- grains de sable ,
- grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath,
- laine de verre et/ou de roche,
- billes d'argile, et - particules de liège.
8. Support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé, défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il est constitué de matériaux artificiels, par exemple : - billes de polystyrène,
- billes de polyéthylène,
- billes de polypropylène,
- billes de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables,
- supports de croissance sous forme de billes de petite taille utilisés en culture cellulaire, - billes de latex ,
- billes revêtues de gélatine, et
- grains de résine.
9. Support solide, inerte et stérile, utilisé dans le procédé, défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'un élément de toute forme en polyéthylène.
10. Support, selon l'une quelconque des revendications 7 ou 9, caractérisé par le fait qu'il est constitué de billes ou grains d'un diamètre compris entre 1 μm et 10 mm et notamment entre 0, 1 mm et 5 mm.
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