STRUCTURE A TIGENIQUE MEMBRA AIRE INDUISANT L'ARRET DE LA PROLIFERATION ET L1 APOPTOSE DE LYMPHOCYTES T ACTIVES
Objet de l'invention
La présente invention est relative à une nouvelle structure antigénique membranaire induisant l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose de lymphocytes T activés.
La présente invention est relative également à tout agoniste ou antagoniste de cette structure antigénique membranaire induisant ou inhibant l'arrêt de la prolifération des cellules sanguines, en particulier des lymphocytes T activés.
La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant ladite structure antigénique, ledit agoniste ou antagoniste et un véhicule pharmaceutique adéquat pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une prolifération anormale de lymphocytes T activés, ainsi qu'à une méthode d'identification (screening) de molécules connues ou non connues, agonistes ou antagonistes, de ladite structure antigénique membranaire de l'invention.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention
L' homéostasie d'un organisme multicellulaire est assurée non seulement par la prolifération et la différenciation cellulaires mais également par la mort cellulaire programmée encore appelée apoptose. L' apoptose
est une forme de mort cellulaire qui se distingue de la nécrose par une condensation du cytoplasme, la formation de protubérances au niveau de la membrane plasmique, une condensation de la chromatine nucléaire en périphérie du noyau et une fragmentation internucléosomique de l'ADN.
La mort cellulaire par apoptose joue un rôle majeur au cours de la maturation et du contrôle de la prolifération des lymphocytes T. Les précurseurs des lymphocytes T CD4+CD8+ originaires de la moelle, migrent dans le thymus où ils subissent une maturation en lymphocytes CD4+ ou en lymphocytes CD8+. Enfin, 1 ' apoptose joue un rôle déterminant dans la diminution du nombre de lymphocytes T spécifiques d'un antigène après une réponse immune. Ce mécanisme assure le contrôle de la réponse immune et empêche la persistance dans l'organisme d'un trop grand nombre de lymphocytes T activés (Cohen et al . , 1992, Janeway, 1994) .
Il a été montré que l'élimination des lymphocytes T périphériques activés est en grande partie dépendante du système des couples de ligand/récepteur membranaire dont les prototypes sont Fas ligand/Fas et TNF-α/récepteur de type I du TNF-α (TNFRI) (Sytwu et al . , 1996) . Fas et le récepteur de type I du TNF-α font partie d'une superfamille de récepteurs qui se caractérisent par la présence de motifs riches en cystéine dans leur domaine extracellulaire. Au sein de cette famille, certains récepteurs contiennent dans leur partie intracellulaire un domaine de mort cellulaire (death domain) qui transmet le signal d' apoptose. C'est le cas des récepteurs CARI, TRID, DR3, DR4, DR5 , NGFR, Fas, et TNFRI. D'autres membres de cette superfamille peuvent induire l' apoptose sans posséder un tel domaine de mort cellulaire. L'expression pléiotrope de TNFRI et de Fas ne permet pas d'envisager l'utilisation de ces molécules comme cibles d'agents pouvant induire sélectivement 1 ' apoptose d'une classe particulière de
cellules du système immunitaire. Cependant, une telle possibilité serait extrêmement intéressante puisqu'elle offrirait le moyen de traiter des pathologies liées à la prolifération anormale d'un type particulier de cellules.
Buts de l'invention
La présente invention vise à fournir un nouveau type de structure antigénique membranaire comparable aux récepteurs susmentionnés et dont l'induction ou l'inhibition provoque l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose des lymphocytes T activés ou favorise la prolifération et la survie de lymphocytes T activés.
La présente invention vise également à fournir un procédé d'identification d'agonistes ou d'antagonistes de ladite structure antigénique membranaire destinée à des applications thérapeutiques et/ou prophylactiques de différentes pathologies, en particulier dans la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une prolifération anormale de lymphocytes T activés, en particulier les myelomes à lymphocytes T, les éosinophilies à lymphocytes T, les maladies auto-immunes , les processus de rejets de greffe et les leucémies induites par certains rétrovirus, en particulier par les virus HTLV et HIV.
Eléments caractéristiques de l'invention
La présente invention est relative à une nouvelle "structure antigénique membranaire" (dénommée ci- après 14C1) , en particulier une glycoprotéine membranaire susceptible d'être spécifiquement reconnue par un ou plusieurs anticorps, cette dite structure présentant un poids moléculaire de 75 KD (identifiée par Western blot dans des conditions non réductrices telles qu'illustrées dans la Fig. 1) et est de nature glycoprotéique (degradable par des protéases, en particulier par la papaïne et la protéinase K, et partiellement degradable par un inhibiteur
de glycosylation tel que la tunikamycine) ; ladite
"structure antigénique membranaire" étant exprimée
- dans les cellules APC (Antigen Presenting Cells) , les lignées lymphoblastoïdes Daudi et Namalwa, et certaines lignées promyélocytaires, en particulier les cellules HL60 et K562,
- dans les monocytes CD14+ de sang périphérique en réponse à un traitement de type inflammatoire (notamment induit par des lipopolysaccharides (LPS) ) , - dans des lymphocytes T (CD3+) (en particulier en réponse à des traitements par les agents PHA et PMA, seul ou en association avec un ionophore de calcium) , dans des sous -populations cellulaires exprimant le marqueur CD20 spécifique des lymphocytes B, et - dans les cellules dendritiques .
La structure antigénique membranaire de l'invention est également identifiable par une reconnaissance spécifique au moyen d'un agoniste de cette structure antigénique membranaire qui est l'anticorps monoclonal 14C1 dont l'hybridome porte le numéro d'accès LMBP 1666CB.
Les caractéristiques et les profils d'expression de ladite structure antigénique membranaire dans la lignée cellulaire sont également résumés dans le tableau 1.
La structure antigénique de l'invention est également caractérisée par sa cinétique d'expression illustrée dans l'exemple 10, ainsi que par le phénotype des lymphocytes T activés exprimant ladite structure antigénique membranaire et dont l' activation (par exemple par un agoniste) induit l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose desdits lymphocytes T activés.
L ' apoptose des cellules est un phénomène cellulaire bien connu de mort cellulaire programmée. Ladite structure antigénique membranaire de l'invention peut être
isolée de sa membrane par des techniques bien connues de l'homme de métier, ou produite par génie génétique et éventuellement délétée de une ou plusieurs de ses portions, (en particulier de ses portions hydrophobes nécessaires pour son intégration dans des membranes cellulaires) et ensuite utilisée sous une forme suffisamment purifiée directement en tant qu'agent actif vaccinal ou en tant qu'adjuvant de vaccination pour induire une réponse immunitaire locale humorale ou cellulaire favorisant l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose de lymphocytes T activés pour des applications pharmaceutiques, en particulier celles mentionnées ci-dessous.
Un autre aspect de la présente invention est relatif à un ligand agoniste de ladite structure antigénique membranaire susceptible d'induire l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose des lymphocytes T activés.
De préférence, cet agoniste est l'anticorps monoclonal 14C1 produit par l'hybridome portant le numéro d'accès LMBP 1666CB ou un anticorps polyclonal ou monoclonal chimérique ou humanisé et développé à partir de l'anticorps monoclonal 14C1 ou d'un fragment de cet anticorps .
La présente invention concerne également l'hybridome produisant ledit anticorps. Un autre aspect de la présente invention est relatif à un ligand antagoniste d'une molécule agoniste vis-à-vis de ladite structure antigénique membranaire, en particulier un anticorps inhibant les phénomènes d'arrêt de prolifération des lymphocytes T et/ou inhibant 1 ' apoptose desdits lymphocytes T activés, de manière à induire une activation du système immunitaire et à pouvoir être utilisés en tant qu'adjuvants de vaccin.
Ces dits agonistes ou antagonistes peuvent être également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou
des fragments d'anticorps dirigés spécifiquement contre certains épitopes.
On entend par fragments d'anticorps les portions hypervariables Fab, Fd, Fv, dAb, Fab ' , F(ab')2,... desdits anticorps qui peuvent être en particulier des immunoglobulines de type IgGl .
Lesdits agonistes ou antagonistes de l'invention peuvent être également des cellules, un ou plusieurs morceaux de membrane de cellules, tels que des récepteurs cellulaires susceptibles d'induire ou d'inhiber les mécanismes susmentionnés.
Un autre aspect de la présente invention concerne des anti-agonistes ou des anti-antagonistes, tels que des anticorps anti-idiotypiques ou des fragments d'anticorps anti-idiotypiques susceptibles d'être incorporés dans des dispositifs de diagnostic ou de suivi des pathologies susmentionnées pour caractériser et quantifier l'effet d'une éventuelle i muno-thérapie basée sur l'utilisation des agonistes ou antagonistes de 1 ' invention.
Un tel dispositif de diagnostic ou du suivi comprend les différents éléments (éventuellement marqués) de l'invention, en particulier ladite structure antigénique membranaire de l'invention (éventuellement sous forme d'une cellule entière ou sous forme de fragments membranaires de cette cellule incorporant ladite structure membranaire de l'invention) présente en solution ou fixée sur un support solide, les agonistes ou antagonistes de l'invention ainsi que différents moyens et milieux destinés à quantifier et qualifier la réaction entre lesdits agonistes ou antagonistes et la structure antigénique membranaire de 1 ' invention.
Un autre aspect de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un véhicule ou diluant pharmaceutique adéquat, ladite
structure antigénique membranaire de l'invention, un agoniste ou un antagoniste de ladite structure antigénique membranaire, en particulier une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de pathologies liées à une prolifération anormale de lymphocytes T activés, en particulier les myelomes à lymphocytes T, les éosinophilies à lymphocytes T, les maladies auto-immunes , en particulier les pathologies choisies parmi le groupe constitué par les infections liées au SLE (Systemic Lupus Erythematosus disease) , le syndrome Gougerot-Sjôgren (ou pathologie Sjôgren), la polyarthrite rhumatoïde, ainsi que les pathologies du type sarcoïdosis et 1 ' ostéopenie , la spondylarthrite, le scleroderma, la sclérose en plaques, la sclérose amyotrophique latérale, 1 ' hyperthyroïdisme, la maladie d'Addison, l'anémie auto-immune hémolytique, la maladie de Crohn, le syndrome de Goddpasture, la maladie de Graves, la thyroidie de Hashimoto, 1 ' idiopathic purpura haemorrhagica, les diabètes insulino-dépendants , la myasthénie, le pemphigus vulgaris, l'anémie pernicieuse, le poststreptococcal glomerulonephritis , le psoriasis et la stérilité spontanée, les processus de rejet de greffe
(cellules, tissus ou organes de type hôte vs/greffe et greffe vs/hôte) et les leucémies induites par certains rétrovirus, en particulier les virus HTLV et HIV. Dans la composition pharmaceutique de l'invention, le véhicule ou diluant pharmaceutique adéquat peut être tout support, solide, liquide, ... non toxique adapté pour être administré ( in vi vo ou ex vivo) au patient
(y compris l'humain) selon la voie d'administration choisie, qu'elle soit de type orale, intraveineuse, intra- péritonéale, intradermique, etc.
Les véhicules pharmaceutiques adéquats de l'invention sont des véhicules ou adjuvants communs, bien connus de l'homme du métier, qui peuvent également comporter des éléments immunostimulateurs ou
immunoinhibiteurs susceptibles d'induire ou de supprimer une réponse immunitaire de type locale, cellulaire ou humorale, de manière à améliorer les propriétés de la composition pharmaceutique de l'invention. Le pourcentage de produit actif (structure antigénique membranaire, agoniste, antagoniste/véhicule pharmaceutique) peut varier selon des très larges gammes, limitées uniquement par la tolérance et par le niveau d'acceptation de la composition pharmaceutique selon l'invention par le patient. Les limites sont en particulier déterminées par la fréquence d'administration et les éventuels effets secondaires.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la composition pharmaceutique selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des pathologies susmentionnées, en particulier des pathologies impliquant la prolifération anormale de lymphocytes T. Ces pathologies ou maladies sont en particulier choisies parmi le groupe constitué par les myelomes à lymphocytes T, les éosinophilies à lymphocytes T, les maladies auto-immunes liées à l' apoptose, les processus de rejets de greffe et les leucémies induites par certains rétrovirus, en particulier par les virus HTLV-I ou HIV.
La présente invention concerne également un procédé de traitement thérapeutique ou prophylactique d'un animal, y compris l'humain, comportant l'administration de la composition pharmaceutique selon 1 ' invention audit animal (y compris humain) .
Un dernier aspect de la présente invention concerne un procédé d'identification (de screening de molécules agonistes ou antagonistes de ladite structure antigénique membranaire de l'invention comprenant la mise en contact de ladite molécule susceptible d'être un agoniste ou un antagoniste avec ladite structure antigénique membranaire de l'invention, l'identification du
mécanisme biochimique induit par cette mise en contact (en particulier de la modification du phénotype d'un lymphocyte T activé et comprenant cette structure antigénique membranaire), et l'identification de ladite molécule en tant qu' agoniste ou antagoniste en fonction du mécanisme biochimique provoqué par ladite mise en contact .
Un dernier aspect de la présente invention concerne les molécules agonistes ou antagonistes identifiées par le procédé (de screening) de l'invention. La présente invention sera décrite en détail dans les exemples non limitatifs repris ci -dessous.
Brève description de la figure
La figure 1 représente l'expression de l'antigène de l'invention détecté par Western Blot dans des conditions non réductrices à partir d'un extrait de cellule HL-60 traitée au PMA.
Description détaillée de l'invention L'objet de l'invention est basé sur la découverte d'un anticorps monoclonal, dénommé ci -après "anticorps 14C1", qui, par interaction avec une protéine membranaire, est capable d'induire sélectivement l'arrêt de la prolifération et 1 ' apoptose de lymphocytes T activés. L'antigène membranaire reconnu par cet anticorps monoclonal est de nature glycoprotéique et est exprimé par un nombre restreint de types cellulaires tels que les lymphocytes B, les cellules dendritiques, les monocytes traités au LPS et les lymphocytes T activés soit par des agents tels que le PMA et la PHA soit au cours d'une réaction lymphocytaire mixte. Le profil d'expression de l'antigène 14C1 indique qu'il ne correspond à aucun récepteur membranaire induisant l' apoptose déjà connu. Du fait de sa spécificité d'action, cet anticorps est un outil potentiellement très intéressant dans le traitement de
pathologies impliquant la prolifération anormale de lymphocytes T.
La version humanisée de cet anticorps 14C1 peut être obtenue selon les protocoles d'immunothérapies pour ces pathologies comme l'est par exemple l'anticorps humanisé dirigé contre la sous-unité α du récepteur de l'IL-2 dans le traitement des leucémies induites par le virus HTLV-I (Waldmann et al . 1993).
L'anticorps monoclonal 14C1 est issu de la fusion entre des splenocytes de souris immunisées avec des cellules Daudi traitées à l'IFN-α et des cellules de myélome Sp2/0 (voir procédures expérimentales) . Cet anticorps est une immunoglobuline de type IgGl . Il a été utilisé pour déterminer le spectre d'expression de l'antigène correspondant.
EXEMPLES
Procédures expérimentales Lignées cellulaires et trai tement par les interférons
Les cellules Daudi, Raj i et Namalwa sont des lignées cellulaires humaines lymphoblastoïdes de type B (Lymphome de Burkitt) . La lignée DIF8 est une lignée résistante aux effets des IFNs, dérivant de la lignée Daudi (Dron et al . , 1983) . Les lignées Jurkat , H9 et CEM sont des lignées lymphoblastoïdes T humaines. Les cellules K562 dérivent d'un myélome de leucémie chronique. Les cellules HL-60 sont de type promyélocytique . Les cellules U937 sont des cellules humaines de type monocytaire . Toutes ces lignées cellulaires sont cultivées en suspension a 37 °C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 , dans du milieu
RPMI-1640 (Gibco) complémenté avec 10% de FCS (Myoclone, Gibco) , 10 mM Hepes pH 7 , , 1 mM de Na pyruvate, 50 u/ml de pénicilline, 50 mg/ml de streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels.
La lignée cellulaire HeLa dérive d'un carcinome du col utérin humain, est cultivée à 37 °C dans un atmosphère humidifié contenant 5% de CC>2. Ces cellules sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine, 50 u/ml de pénicilline et 50 mg/ml de streptomycine. Les traitements aux IFNs sont effectués avec de l'IFN-α2 et de l'IFN-γ humains recombinants (provenant de la firme Boehringer Ingelheim) à une dose de 1000 unités/ml pendant 24 heures. La différenciation des cellules HL-60 en macrophages est effectuée en incubant ces cellules à une densité de 2.105 cellules/ml en présence de 3,3.10"8 M de PMA (Phorbol myristate acétate, Sigma) pendant 48 heures, ou en présence de 5.10"7 M de 1 , 25-dihydroxyvitamine D3 (VitD3) pendant 4 jours. Le cas échéant, ces cellules différenciées sont lavées 3 fois avec du PBS et sont remises en culture pour 24 heures en présence de 1000 u/ml d'IFN-α.
Préparation des thymocytes : Les cellules en suspension sont obtenues à partir de fragments de thymus normal provenant d'un adulte féminin au cours d'une intervention chirurgicale cardiaque.
Production d ' anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines membranaires indui tes par 1 ' interféron - α
Des souris Balb/c ont été immunisées par injection intrapéritonéale de cellules Daudi traitées à l'IFN-α selon le protocole décrit dans un travail précédent (Deblandre et al . , 1995). Toutefois, la méthode a été adaptée de manière à diminuer la proportion d'hybridomes sécrétant des anticorps -dirigés contre des protéines membranaires constitutives des cellules Daudi. Ainsi, avant d'immuniser les souris avec des cellules Daudi traitées à l'IFN-α, elles
ont été soumises à une procédure d ' îmmunosuppression. Celle-ci a consisté en injections répétées de cellules Daudi non traitées immédiatement suivies d'injections de cyclophosphamide . Cette drogue tue sélectivement les cellules qui se divisent et a été utilisée dans le but d'éliminer les lymphocytes B capables de reconnaître des épitopes constitutifs des cellules Daudi.
Les surnageants d'hybridomes obtenus ont été criblés sur base de leur capacité à réagir différentiellement avec des cellules Daudi traitées ou non à l'IFN-α. Ce criblage a été réalisé par immunofluorescence indirecte et analyse par cytométπe de flux. Les hybridomes positifs ont été clones par des dilutions limites successives en présence de 100 U/ml d'IL-6 recombinante munne pour maintenir la sécrétion des îmmunoglobulmes . Cette procédure a permis d'isoler 5 hybridomes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines mductibles par 1 ' IFN-α à la surface des cellules Daudi.
Préparation de populations de cellules à partir de sang périphérique
Préparation de cellules mononuclées
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) sont préparées de la manière suivante. Le sang veineux de donneurs sains est centrifugé sur une lymphoprep (Nycomed) pendant 30 minutes à 2000 rp . L'interface contenant les PBMCs est reprise et lavée 3 fois avec du PBS . Après le premier lavage, les cellules sont centrifugées à une vitesse de 2000 rpm pendant 10 mm, et lors des deux derniers lavages, elles sont centrifugées à une vitesse de 1500 rpm pendant 15 min. Les PBMCs sont ensuite étalées sur une boîte en plastique pendant 2 heures à 37 °C . Les cellules non adhérentes sont principalement composées de lymphocytes B et T, alors que les cellules adhérentes sont essentiellement composées de monocytes.
Préparation de cellules dendritiques (DCs)
Des PBMCs sont étalées dans des puits de plaques à 6 puits à une densité de 2.107 cellules/puits dans 3 ml de milieu RPMI-1640 complet contenant 50 μM de mercaptoéthanol . Après une incubation de 2 heures, les cellules non adhérentes sont éliminées et les cellules adhérentes sont lavées 4 fois avec du milieu de culture et remises en culture dans 3 ml de milieu contenant 800u/ml de GM-CSF (R&D System) et 1000 u/ml d'IL-4 humains recombinants (Genzyme) . Tous les deux jours, 300 μl de milieu sont prélevés et remplacés par le même volume de milieu frais contenant 2400 U de GM-CSF et 1500 U IL-4. Après 7 jours de traitement, la culture est essentiellement composée de cellules dendritiques telle que le démontre l'analyse par cytometrie de flux des cellules non adhérentes. La fraction enrichie en DC contient moins de 10% de cellules d'un autre type (cellules B ,T et NK) .
.Maturation des DCs La maturation des DCs a été réalisée selon la voie de CD40 ou par une stimulation au LPS de E. coli (Sigma) ou par le TNF-α (PeproTech EC, USA) .
Des cellules 3T6 transfectées avec le gène codant pour CD40L (Graf et al . , Eur. J. Immunol . 1992) ont été utilisées comme source de CD40L pour induire les DCs par leur récepteur CD40. Les cellules 3T6 non transfectées ont été utilisées comme contrôle négatif. Les cellules 3T6
(5.104) ont été cultivées en présence de 2.105 DCs dans un puits d'une plaque à 24 puits dans 1 ml de milieu de culture. Après 3 jours de culture, les cellules sont analysées pour l'expression d'antigènes de surface.
2.10^ DCs sont cultivées dans un puits de plaque à 24 puits dans 1 ml de milieu en présence ou non de
LPS (10 ng/ml) ou de TNF-α (10 ng/ml) . Après 3 jours de culture, la production d' IL-12 est mesurée dans les
surnageants par ELISA et l'expression des molécules à la surface des cellules est analysée par cytometrie de flux.
Dans le cas de la maturation des DCs en présence de l'anticorps 14C1, 2.105 DCs sont incubées en présence de 20 μg/ml d'anticorps 14C1 ou d'une IgGl contrôle dans 1 ml de milieu de culture dans un puits d'une plaque à 24 puits. Dans certaines expériences, on a mesuré l'effet de l'anticorps 14C1 sur les DCs en présence de LPS ou de CD40L. Pour le dosage de l'IL-12, on a utilisé le
Kit ELISA fourni par Biosource Europe qui détecte aussi bien la forme héterodimérique (p70) que la forme homodimérique (p40-p40) .
Analyse par cytometrie de flux
L'expression de protéines membranaires peut être mesurée par immunofluorescence indirecte et analyse par cytometrie de flux. 2.105 cellules sont lavées 3 fois avec du PBS. Ensuite, elles sont incubées sur glace dans 50 μl de PBS contenant 0,5% BSA, 0,01% NaN3 , en présence d'un excès d'anticorps, pendant 30 min. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et incubées pour une seconde période de 30 min en présence de 100 μl de GAMIg-FITC (Goat anti-mouse Ig conjugué à la fluorescéine) à une concentration de 10 mg/ml (Sigma) . Dans chaque expérience, un anticorps contrôle négatif est substitué aux anticorps d'intérêt pour mesurer le niveau basai de la fluorescence des cellules.
Dans les doubles colorations, la première coloration suit les mêmes étapes comme décrit plus haut, et est suivie d'une seconde coloration par des anticorps conjugués à la phycoérythrine (PE) .
Les anticorps utilisés au cours de cette étude sont les suivants. Anti-leu6 (CDla) , antiLeu-4 (CD3) conjugués à la FITC, anti Leu-lla (CD16) , anti Leu-12
(CD19)-PE IgGl, anti Leu-M3 (CD14)-PE IgG2b, anti Leu-4
(CD3)-PE, anti-Leu 15 (CDllb) -PE, anti BB-1/B7 (CD80)-PE, et HB-7 (CD38) IgGl. Tous ces anticorps ont été achetés à la firme Becton Dickinson. Les anticorps Anti-B7-2-PE (CD86) , anti-CD40-FITC et anti-CD83 ont été respectivement obtenus chez PharMingen et Biosource international . Les isotypes contrôles ont été obtenus chez Sigma. L'anticorps anti-HLA-DR a été obtenu à partir d'un hybridome provenant de la même fusion qui a généré l'anticorps 14C1 décrit ci-dessus.
Traitement de cellules par des proteases ou de la tunikami cyne
La sensibilité de l'antigène 14C1 aux proteases a été testée par incubation des cellules HL-60 induites au PMA dans du PBS contenant lOOμg/ml de protéinase K ou de Papaïne (Sigma) pendant 1 heure à 37 °C . Ensuite, les cellules sont lavées au PBS et incubées en présence d'anticorps 14C1 et puis d'un GAM-FITC. Les cellules sont alors mises en présence d' iodure de propidium, et seules les cellules vivantes sont analysées par cytometrie de flux pour l'expression de l'antigène 14C1. La même procédure expérimentale a été utilisée pour déterminer si l'antigène 14C1 est glycosylé, sauf que les cellules ont été traitées par de la tunikamicyne (10 μg/ml) pendant 40 heures avant d'être analysées par cytometrie de flux avec l'anticorps 14C1. Purification de lymphocytes T à partir de PBMCs
Sur le culot de 15.106 PBMCs, on ajoute 800 μl de lymphokwik (R&D System) , et la préparation est ncubée à 37 °C avec une légère agitation. Après 30 minutes, les cellules sont lavées deux fois avec du milieu complet pour se débarrasser des cellules lysées . Le reste (1/3 des cellules engagées) des cellules est
essentiellement composé de lymphocytes, ce qui est confirmé par analyse cytométrique .
L' activation des lymphocytes T a été effectuée en les incubant à 10^ cellules/ml en présence des activateurs suivants: PMA : 10 ng/ml, PHA : 10 μg/ml, A12387 : 100 ng/ml (Sigma) .
Réaction lymphocytaire mixte (MLR)
2.105 lymphocytes T purifiés sont cultivés avec 2.104 DCs irradiées (3000 rad) en présence ou non de l'anticorps 14C1 à une concentration de 20μg/ml dans des puits de plaques à 96 puits. Les expériences sont toutes réalisées en triplicate. Après 5 jours de culture à 37 °C, la prolifération cellulaire est mesurée par incorporation de [3H] thymidine (0,5 μ Ci/puits pendant les 16 dernières heures) . Les surnageants de culture sont prélevés et les concentrations en IL-2 et IFN-γ sont mesurées en utilisant les Kits provenant de Medgenix (Fleurus, Belgique) et Chromogenix (Môlndal, Suède) .
Effet de l ' anticorps 14C1 sur l ' expression de protéines m embran aires
Les cellules Jurkat sont traitées au PMA à une concentration de 10 ng/ml en présence ou non de l'anticorps 14C1 à une dose de 20 μg/ml. Après une nuit d'incubation, les cellules sont lavées et analysées pour l'expression du récepteur de l'IL-2 (CD25) et de la molécule d' activation CD69. Les 2 anticorps reconnaissant ces protéines sont fournis par Becton Dickinson.
Mesure de la prolifération des lymphocytes T
Les lymphocytes T purifiés et les lignées cellulaires Jurkat et CEM sont activés ou non par du PMA et mis en culture dès le début de l'expérience en présence
d'une concentration de 20 μg/ml d'anticorps 14C1 ou d'une même quantité d' IgGl contrôle pendant 72 heures à 37 °C . La prolifération cellulaire est mesurée par la capacité des cellules à incorporer la [3H] thymidine ajoutée pendant les 16 dernières heures d'incubation. Ces expériences sont réalisées en tπplicate.
Afesure de l ' apoptose
Les cellules Jurkat traitées ou non au PMA sont incubées en présence ou non d'anticorps 14C1
(20 μg/ml) pendant 48 heures ou en présence d'anticorps anti-Fas (100 ng/ml, Pharmmgen) pendant 5 heures. Le profil de granulosité et la capacité de fixation de l'anexme par les cellules sont analysés. La phosphatidyl serine est reconnue spécifiquement par l'anexme. Ensuite, les cellules sont lavées et colorées en ajoutant 10 μl d'anex e couplée au FITC et 10 μl d' îodure de propidium
(Kit R&D System) . Le mélange est incubé 30 mm à 1 heure et les cellules colorées sont analysées par FACS (Becton Dickmson) .
Exemple 1 : Profil d'expression de l'antigène 14C1
Les types cellulaires capables d'exprimer l'antigène reconnu par l'anticorps 14C1 ont été déterminés par cytometrie de flux. Cet antigène est exprimé à la surface de lignées cellulaires telles que les cellules
Daudi, Namalwa, HL60 et K562 alors qu'il n'est pas détecté sur les cellules épithéliales (HeLa) ou lymphocytaires T
(CEM, Jurkat et H9) testées. Son ductibilité par les IFNs semble être spécifique à la lignée lymphocytaire Daudi pour laquelle on a observé une induction claire en réponse à 1' IFN-α.
Vu la faible expression de l'antigène 14C1 sur les cellules HL-60, son taux d'expression a été déterminé après différenciation de ces cellules par un
traitement au PMA ou à la vitamine D3. En effet, les cellules de la lignée promyéiocytique HL-60 peuvent se différencier en macrophages en réponse à un traitement par le PMA (phorbol-12 myristate-13 ) acétate et par la 1,2 dihydroxyvitamine D3 (VitD3). Les cellules différenciées changent de morphologie et de phénotype . Elles deviennent adhérentes au plastique et augmentent l'expression de molécules d'adhésion telles que les protéines de la famille des integrines CDlla (LFA-1) et CDllb (MAC-1) (Pedrinaci et al . , 1989, Back et al . , 1992). D'un point de vue fonctionnel, ces cellules différenciées acquièrent la capacité de phagocytose. De plus, après activation par l'IFN-γ, elles acquièrent le potentiel de transmettre un signal co-stimulateur aux lymphocytes T (Shinbori et al . , 1992) . L'addition de PMA ou de vitamine D3 à une culture de cellules HL-60 induit la surexpression de l'antigène 14C1 après 48h de traitement. De plus, un traitement supplémentaire de ces cellules HL60 différenciées par les IFNs α ou γ augmente encore légèrement le nombre de molécules d'antigène 14C1 à la surface des cellules. La différenciation des cellules HL60 en macrophages est vérifiée par la mesure de la surexpression du marqueur myéloïde CDllb (Murao et al . , 1994).
Exemple 2 : Nature chimique de l'antigène 14C1
Dans le but de déterminer si l'antigène 14C1 est de nature protéique, des expériences ont été réalisées dans lesquelles des cellules HL-60 différenciées par le PMA ont été traitées par deux proteases, la papaïne et la protéinase K. Après ces traitements proteolytiques, le taux d'antigène 14C1 à la surface des cellules a été mesuré par cytometrie de flux. Le traitement des cellules à la papaïne ou à la protéinase K abolit la reconnaissance de l'antigène par l'anticorps 14C1. De même, un traitement des cellules par la tunikamicyne, un inhibiteur de glycosylation, réduit
partiellement la reconnaissance de l'antigène 14C1 par 1 ' anticorps .
Exemple 3 : Profil d'expression de l'antigène 14C1 par les cellules du sang périphérique
Comme l'antigène 14C1 n'est exprimé que par un nombre restreint de types cellulaires, les populations cellulaires du sang périphérique exprimant l'antigène 14C1 ont été déterminées. Le sang périphérique est centrifugé sur une lymphoprep pour séparer les cellules mononuclées
(PBMC) , des globules rouges. Ces PBMC sont formées essentiellement de lymphocytes B, T et monocytes. Les différentes populations de leucocytes circulants sont caractérisées par l'expression de marqueurs membranaires spécifiques. Par double coloration des cellules avec un de ces marqueurs spécifiques et l'anticorps 14C1, il est possible de mesurer l'expression de l'antigène 14C1 dans les différentes populations cellulaires du sang périphérique par cytometrie de flux. Ainsi, la sous- population exprimant le marqueur CD20 spécifique des lymphocytes B, exprime l'antigène 14C1. Le taux d'expression de l'antigène 14C1 par les lymphocytes B est du même ordre de grandeur que celui trouvé dans les cellules Daudi. Cependant, un traitement des lymphocytes B par l'IFN-α ou l'IFN-γ n'augmente pas l'expression de l'antigène 14C1.
Les autres sous -populations de sang périphérique, les lymphocytes T (CD3+) et les monocytes
(CD14+) n'expriment pas l'antigène 14C1 à un taux détectable par cytometrie de flux. De même, un traitement par les IFNs ne semble pas augmenter l'expression de l'antigène. Par ailleurs, aucune augmentation du taux d'expression de l'antigène 14C1 n'a été observée suite à l' activation des cellules B par l'IL-4, le PMA ou le SAC, alors qu'une induction de l'expression de FcεRIl/CD23 a
bien été observée, conformément aux données de la littérature (Defrance et al . , 1987, Clark et al . , 1989, Law et al . , 1990) .
Le traitement des monocytes (CD14+) de sang périphérique par des lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 heures induit l'expression de l'antigène 14C1. De même, l'expression de l'antigène 14C1 est induite dans les lymphocytes T (CD3+) en réponse à des traitements par différents agents comme la PHA, le PMA, seul ou en association avec un ionophore du calcium.
Exemple 4 : Expression de l'antigène 14C1 par les cellules dendritiques
Comme décrit plus haut, l'antigène 14C1 est exprimé par les lymphocytes B, les macrophages activés par un traitement au LPS, et les lymphocytes T activés. Ces cellules possèdent la caractéristique commune d'être des cellules présentatrices d'antigène (cellules accessoires). Les cellules dendritiques sont également spécialisées dans cette fonction de présentation d'antigène. A partir de cellules adhérentes provenant du sang périphérique, incubées en présence des cytokines IL-4 et GM-CSF pendant 7 jours, on a différencié des cellules dendritiques (Romani et al . 1994) qui constituent une population morphologiquement homogène. De plus, ces cellules sont toutes dans le même état de maturation (Romani and Steiman 1994, Salusto and Lanzavecchia 1994) .
Les cellules dendritiques (ou DCs) expriment à forte densité les molécules du CMH de classes I et II et sont caractérisées par l'expression de molécules co-stimulatrices telles que B7-1 et B7-2. Leur fonction majeure est la capacité de stimuler les lymphocytes T par présentation d'antigène, étudiée par des expériences dans lesquelles la prolifération de lymphocytes T est mesurée suite à leur incubation en présence de DCs préalablement
irradiées. Ce type d'expérience est appelé une MLR pour "Mixed Lymphocyte Reaction" .
Des DCs générées selon le protocole décrit par Romani et al . ont un profil phénotypique correspond à celui des cellules dendritiques (à savoir l'expression des molécules du CMH de type HLA-DR ainsi que des protéines co- stimulatrices B7-1, B7-2 et CDla) et une identification de la protéine MHC cll-like.
Les cellules dendritiques générées selon cette méthode constituent une population de cellules dendritiques immatures, qui ont la fonction de présenter des antigènes plutôt que de stimuler la prolifération des lymphocytes T. Leur maturation peut être induite en les incubant en présence de LPS, de TNF-α ou de CD40L (Sallusto and Lanzavecchia 1995) . En réponse à ces stimuli, les cellules surexpriment les molécules co-stimulatrices nécessaires à l' activation des lymphocytes T (Sallusto et al . , 1995, Caux et al . 1994).
L'antigène 14C1 est exprimé par ces cellules dendritiques.
L'expression de l'antigène 14C1 en présence de TNF-α ou de LPS pendant 24 heures ne semble pas être modifiée suite à ces traitements, alors qu'ils induisent la surexpression des molécules B7-1 et HLA-DR et réduisent celle de la protéine MHC cll-like CDla (Sallusto et Lanzavecchia, 1995) .
L' interaction des DCs exprimant la protéine CD40, membre de la famille du récepteur du TNF, avec des cellules T exprimant le ligand de CD40 (CD40L) permet également la maturation des DCs (Caux et al . 1994) . La culture de DCs en présence de cellules 3T6 exprimant le ligand de CD40 permet d'activer les DCs par la voie CD40. Dans les expériences, des DCs générées selon le protocole de Romani (1994), ont été cultivées en présence de cellules fibroblastiques exprimant ou non le CD40L. Ces populations
de DCs ont ensuite été testées pour mesurer leur différence phénotypique pour les marqueur CDla, B7-1, HLA-DR et l'antigène 14C1.
La maturation des DCs par la voie CD40 ne semble pas moduler le nombre de molécules d'antigène 14C1 à la surface des cellules dendritiques. Alors que les molécules HLA-DR et B7 sont surexprimées, le marqueur CDla semble être sous-exprimé après la maturation des cellules, comme rapporté auparavant dans la littérature (Caux et al . 1994, Sallusto et Lanzavecchia, 1995) .
Comme l'antigène 14C1 présente une similitude dans son profil d'expression avec les molécules de la famille CD1 (CDla, CDlb, CDlc) (Calabri et al . , 1991, Small et al . , 1987) et comme les molécules CD1 sont exprimées sur les thymocytes (Martin et al . , 1987), l'expression de ces molécules a été comparée à celle de l'antigène 14C1 sur des thymocytes doublement positifs CD4+/CD8+. Contrairement aux molécules CD1 , l'antigène 14C1 n'est pas exprimé dans les thymocytes .
Exemple 5 : Effet de l'anticorps 14C1 dans une réaction allogenique mixte
La réaction lymphocytaire mixte (MLR) est unilatérale au sens ou l'une des deux populations (la population stimulante) est inactivée par irradiation. La MLR se distingue des réactions antigéniques classiques par le fait que ce sont des molécules du CMH de classe I et II exprimées à la surface des cellules stimulatrices qui jouent le rôle d'antigènes. D'une certaine manière, les molécules du CMH allogenique mimeraient la présentation d'un motif antigénique dans un contexte de CMH autologue.
Des populations de lymphocytes T purifiées ont donc été mises en présence de cellules dendritiques irradiées, stimulatrices de la réaction allogenique, en présence ou non de l'anticorps 14C1. La prolifération des
lymphocytes T résultant de cette activation allogenique a été évaluée par incorporation de thymidine traitée pendant les 15 dernières heures de culture. Ces expériences montrent que l'anticorps 14C1 bloque dans une large mesure (jusqu'à 56%) la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par les cellules dendritiques.
Ces résultats suggèrent que l'anticorps 14C1 interférerait dans la mise en place du signal d' activation des lymphocytes T.
Exemple 6 : Action de l'anticorps 14C1 sur les cellules lymphoblastoïdes
L'étude de l'effet inhibiteur de l'anticorps
14C1 sur l' activation des lymphocytes T a ensuite été réalisée en utilisant des lignées lymphocytaires leucémiques telles que les cellules Jurkat et CEM.
Les cellules T du sang périphérique sont activées en plusieurs étapes. Les premiers événements de
1' activation permettent l'expression du récepteur de l'IL-2 et la production d'IL-2, les événements plus tardifs permettent de faire sortir les cellules de leur phase de quiescence .
La croissance des cellules Jurkat mime probablement uniquement les premières étapes de 1 ' activation. Ces lignées cellulaires n'expriment l'antigène 14C1 qu'après activation.
L' activation des cellules a été induite par un traitement au PMA seul ou en association soit avec
1' ionophore de calcium A12387, soit avec la PHA. La prolifération des cellules suite à leur activation a été mesurée par incorporation de thymidine tritiée après 3 jours de culture en présence ou non de l'anticorps 14Cl."Ce type d'expérience montre que lorsque les cellules activées sont mises en présence de l'anticorps 14C1, elles cessent de proliférer, contrairement aux cellules activées mises en
présence d'un anticorps IgGl contrôle, qui continuent à proliférer de la même manière qu'en absence d'anticorps. Il faut noter que l' activation des cellules s'accompagne d'une diminution de l'ordre de 30% de leur prolifération. Ceci résulte d'un phénomène de mort cellulaire induit par activation aussi appelée AICD pour "Activation-Induced Cell Death" . Cette AICD résulte de l'incubation des cellules T en présence de différents stimuli tels que des lectines mitogènes comme la phytohématoglutinine (PHA) ou un anticorps anti-CD3 dirigé contre le complexe TCR, qui engage les lymphocytes T à entrer en phase de mort cellulaire (Kabelitz et al . , 1993).
Les expériences indiquent que l'anticorps 14C1 est capable de bloquer l' activation de la prolifération des lymphocytes T activés quel que soit le mode d' activation de ces cellules. L'anticorps 14C1 n'a pas d'effet sur les lymphocytes T non activés, ce qui corrèle avec le fait que ces cellules n'expriment pas l'antigène 14C1 en absence d' activation. L'effet de l'anticorps a été étudié sur des cellules qui expriment l'antigène 14C1 de manière constitutive telles que les cellules Daudi, et sur des cellules qui l'expriment à forte densité telle que la lignée promyélocytique HL-60 après différenciation en macrophages. Dans les différentes conditions d'incubation testées, l'anticorps 14C1 n'a pas d'effet sur les cellules Daudi traitées ou non par les IFN α ou γ. De même, l'anticorps 14C1 n'induit aucune diminution de la prolifération des cellules HL-60 après leur différenciation. Ces résultats indiquent que l'expression de l'antigène 14C1 n'est pas suffisante pour observer l'effet anti-prolifératif de l'anticorps 14C1.
L' activation des lymphocytes T par les esters de phorbol induit l'expression très rapide de molécules telles que le marqueur précoce de lymphocytes T activés
Leu-23 (CD69) et la sous-unité α du récepteur de l'IL-2 (CD25) (Pimentel-Muinos et al . , 1994).
La présence de l'anticorps 14C1 dans la culture inhibe dans une large mesure l'induction de l'expression de la sous-unité α du récepteur de l'IL-2 (CD25) . De même, la surexpression de CD69 est également abolie par l'anticorps 14C1. Ces résultats indiquent que l'anticorps 14C1 bloque des mécanismes précoces de 1' activation des lymphocytes T. En effet, il empêche leur passage d'une phase de quiescence à une phase d' activation qui nécessite l'expression du récepteur IL-2, étape-clé de 1' activation des lymphocytes T.
Exemple 7 : L'anticorps 14C1 induit 1 ' apoptose des cellules Jurkat traitées par le PMA
L'entrée d'une cellule en apoptose se caractérise notamment par un changement de la polarité de sa membrane plasmique (Martin et al . , 1995). Ce changement de polarité de la membrane plasmique se manifeste par une externalisation de phosphatidylsérine (PS) . Cette modification au niveau de la membrane cellulaire peut être visualisée par cytometrie de flux en colorant les cellules avec de 1 ' anexine fluorescente qui a la propriété d' interagir spécifiquement avec la phosphatidylsérine. Des cellules Jurkat traitées par le PMA ont été testées en présence ou en absence de l'anticorps 14C1 pendant 48 heures. En parallèle, des cellules Jurkat traitées par le PMA ont été mises en présence d'un anticorps agoniste dirigé contre Fas, un membre de la famille des récepteurs du TNF capable d'induire l' apoptose des cellules par liaison de son ligand (Oehm et al . , 1992) . Ces cellules ont été colorées par de 1 ' anexine couplée au FITC et analysées par cytometrie de flux. L'incubation des cellules Jurkat activées en présence de l'anticorps 14C1 et des cellules Jurkat non activées en présence de l'anticorps anti -Fas
entraînent l'apparition d'une population (environ 70% des cellules) capable de fixer l'anexme alors qu'en absence de traitement des cellules par le PMA ou en absence de l'anticorps 14C1, les cellules ne fixent pas l'anexme. Cependant, alors que l'anticorps anti -Fas induit une augmentation de la granulosité des cellules Jurkat non activées, ce changement n'apparaît en réponse à l'anticorps 14C1 qu'après activation des cellules par le PMA. L'incubation des cellules Jurkat en présence de l'anticorps 14C1 sans agent d' activation n'mduit pas le changement de la granulosité cellulaire, ce qui est en corrélation avec le fait que les cellules non activées n'expriment pas l'antigène 14C1.
L'entrée des cellules en apoptose s'accompagne également d'une permeabilisation de la membrane cellulaire. Cette permeabilisation peut être évaluée par la capacité des cellules à internaliser l'iodure de propidium, agent qui s'intercale entre les deux brins d'ADN. Lorsque des cellules Jurkat sont traitées au PMA en présence de l'anticorps 14C1, on observe l'apparition d'une population de cellules colorées par l'iodure de propidium. Cependant, la permeabilisation des cellules Jurkat activées et mises en présence de l'anticorps 14C1 présente une cinétique significativement plus lente que celle provoquée par l'anticorps anti -Fas. En effet, alors que la permeabilisation des cellules induite par l'anticorps anti-Fas se manifeste après une incubation de 5 heures en présence de cet anticorps, la permeabilisation induite par l'anticorps 14C1 nécessite une incubation d'au moins 48 heures. L'ensemble de ces résultats indique que l'anticorps 14C1 est capable de bloquer la prolifération des lymphocytes T activés et dans une phase plus tardive, d'induire leur entrée en apoptose.
Exemple 8 : Effet de l'anticorps 14C1 sur les lymphocytes T du sang périphérique
Des lymphocytes T ont été purifiés à partir de PBMCs de donneurs sains adultes, et ensuite stimulées par un traitement à la PHA ou au PMA en combinaison avec l' ionophore de calcium (en présence ou en absence de l'anticorps 14C1 pendant 24 heures).
La prolifération des cellules ainsi que leur production d'IL-2 et d'IFN-γ, deux cytokines dont la synthèse est induite en réponse à l' activation des lymphocytes T, ont été mesurées. La présence de l'anticorps 14C1 dans le milieu de culture induit une diminution très importante de la prolifération des lymphocytes T en réponse aux deux traitements. De même, la production des deux cytokines induite par un traitement des cellules à la PHA est fortement inhibée par l'anticorps 14C1 (90% d'inhibition pour l'IL-2 et 73% pour l'IFN-γ).
Exemple 9 : Effet de l'anticorps 14C1 sur les cellules dendritiques
L' activation des lymphocytes T requiert non seulement le signal formé par le complexe de l'antigène en association avec une molécule du CMH mais aussi un signal co-stimulateur médié par les molécules "co-stimulatrices" appelées B7-1 et B7-2.
L'action de l'anticorps 14C1 sur l'expression des molécules B7-1, B7-2 et du marqueur d' activation des DCs, le CD83, (Zhou et al . , 1995) dans les cellules dendritiques a été étudiée. Des cellules dendritiques ont été générées à partir de cellules adhérentes du sang périphérique incubées pendant 7 jours en présence d' IL-4 et de GM-CSF. Ces cellules ont ensuite été incubées pendant 3 jours en présence ou en absence de l'anticorps 14C1. Comme le montrent les analyses de coloration et de cytometrie de
flux, l'anticorps 14C1 induit une surexpression des molécules co-stimulatrices B7-1 et B7-2 ainsi que des molécules CD40 et induit une surexpression du marqueur d' activation CD83. Cette surexpression des différentes molécules est comparable à celle observée au cours d'une maturation des DCs selon la voie CD40 ou LPS.
L'anticorps 14C1 ne provoque pas une augmentation supplémentaire de l'expression des molécules B7-1, B7-2, CD40 ou CD83 dans les DCs après stimulation par les voies LPS ou CD40, probablement en raison du fait que l'expression de ces molécules est déjà maximale après l' activation des DCs.
On peut conclure de ces résultats que l'interaction de l'anticorps 14C1 avec son antigène stimule la maturation des cellules dendritiques de manière comparable à la maturation de ces cellules par d'autres voies d' activation. Cette maturation se manifeste par une augmentation de l'expression des molécules co- stimulatrices, des molécules du comlexe majeur d ' histocompatibilité et du marqueur d' activation des DCs, le CD83.
Les cellules dendritiques matures sont capables de produire la cytokine IL- 12 (Macatonia et al . , 1995) , qui agit sur les lymphocytes T et les cellules NK, en augmentant leur production en cytokines, leur prolifération et leur cytotoxicité . Pour vérifier que l'anticorps 14C1 induit une maturation des DCs, leur production d'IL-12 en présence ou non d'anticorps 14C1 a été mesurée. On observe qu'en l'absence de traitement, l'anticorps 14C1 induit une production détectable d'IL-12. De plus, l'anticorps 14C1 provoque une augmentation significative de la production d'IL-12 par des DCs stimulées par les voies LPS ou CD40. Ces résultats indiquent que la liaison de l'anticorps 14C1 sur les DCs
facilite leur maturation et induirait un changement fonctionnel des cellules.
Exemple 10 : Analyse de la cinétique d'expression de l'antigène 14C1 dans les lignées cellulaires Jurkat et HL- 60
L'expression de l'antigène 14C1 à la surface des cellules T peut être induite par différents agents comme les esters de phorbol, la phytohémaglutinine (PHA), mais aussi lors d'une réaction lymphocytaire mixte en présence de cellules dendritiques irradiées. La cinétique d'expression de la protéine 14C1 a été étudiée afin de déterminer si l'apparition de cette protéine à la surface des lymphocytes T est un événement précoce ou tardif lors de 1 ' activation.
Par cytometrie de flux, on mesure l'apparition de la protéine 14C1 à la surface des cellules Jurkat au cours du temps, suite à un traitement par du PMA (lOng/ml) et des anticorps agonistes anti-CD3 ou CD-28. Ces expériences montrent que la protéine 14C1 est détectable après une heure de stimulation et est exprimée à son taux maximal après 4 heures de traitement . Ultérieurement, sa synthèse décroît pour atteindre un niveau constant mais faible qui est maintenu jusqu'à 48 heures de stimulation. L'expression de l'antigène 14C1 est induite avec la même cinétique par des anticorps agonistes anti-CD3 et anti-CD28.
L'ensemble de ces résultats indique que l'expression de l'antigène 14C1 est un événement précoce lors de l' activation des lymphocytes T.
L'analyse du profil d'expression de la protéine membranaire 14C1 avait montré que des cellules promyélomonocytiques HL-60 accumulent des quantités importantes de la protéine 14C1 à leur surface suite à leur differentiation par un traitement au PMA pendant 72 heures.
L'expression maximale de la protéine a lieu après 48 heures d'incubation des cellules en présence de PMA.
Exemple 11 : Détection de l'expression de l'antigène 14C1 par la technique de Western Blot.
L'expression de l'antigène est détectable par Western Blot uniquement lorsque l'expérience est réalisée dans des conditions non réductrices. Comme le montre la Fig . 1, une bande à un poids moléculaire de 75 kDa apparaît dans les fractions du bas d'un gradient, obtenues à partir d'un extrait de cellules HL-60 (n°ATCC: CCL240) lysées avec du NP-40 (2%) et qui est ensuite fractionné sur gradient de saccharose, lesdites cellules HL-60 étant traitées au PMA pendant 48 heures .
Aucun signal n'est détectable dans la piste correspondant à l'extrait de cellules HL-60 non traitées.
Lorsque le Western blot est révélé avec une IgGl contrôle, aucun signal spécifique n'est observé.
L'anticorps de l'invention est avantageusement produit par un hybridome ayant fait l'objet d'un dépôt de micro-organisme selon le Traité de Budapest et ayant été déposé le 07/07/1998 auprès de la Collection LMBP (BCCM-LMBP Plasmid Collection, Laboratorium voor Moléculaire Biologie, Universiteit Gent KL, Ledenganckstraat , 35 B-9000 Gent) sous le numéro d'accès LMBP 1666CB.
Expression et inductibilite de l'antigène 14C1 sur lignées cellulaires établies.
Analyses par cytometrie de flux
Lignées cellulaires Inducteurs
NI IFN-α IFN-γ PMA anti-CD3 anti-CD28
(1000 Ul/ml, 24h) (1000 Ul/ml, 24 )
Lignées lymphoblastoïdes B Raji ND ND ND Daudi + + + ND ND Namalwa (+) + (+) ND ND ND DIF8 ND ND ND
Lignées lymphoblastoïdes T CEM ND ND
Jurkat + ++ ++
H9 ND ND ND
Lignées promyélomonocytiques HL60 (+) (+) (+) ++ ND ND
CESS ND ND ND U937 ND ND ND K562 (+) (+) (+) ND ND ND
Lignée de carcinome utérin HeLa ND ND ND
(-) coπcspond à une fluorescence indétectable, (-1 ) à une fluorescence d'une valeur entre 3 et 10, -1 à une valeur entre 10 et 20, 1 ( 1 ) à une valeur entre 20 et 30 et ++ à une valeur supérieure à 30. Dose de PMA utilisée: 10 ng/ml sauf pour les IIL-60: 50 ng/ml. Temps de traitement: 4 heures sauf pour les 111,-60 (48 heures) et les CEM (24 heures).
Expression et inductibilite de l'antigène 14C1 sur des cellules primaires.
Analyses par cytometrie de flux
Inducteurs
NI IFN-α IFN-γ PMA PHA SAC LPS TNF CD40L
(1000 UI/ml, 24 ) (1000 Ul/ml, 24 ) ( 10 ne ιnl> πOμg ml, ( 100ng/nιl, 72 ) ( 10 ng/ml,481ι) (20ng/ιιιl,40lι)
24 ) 24h)
Lymphocytes B ND ND ND ND
Lymphocytes T (+) (+) ND ND ND ND
Monocytes ND ND ND ND ND
Cellules dendritiques ND ND ND ND ND + +
Thymocytes ND ND ND ND ND ND ND ND
(-) coi i spotul à une fluorescence indétectable, ( I ) à une fluorescence d'une valeur entre 3 et 1 , i à une valeur entre 10 cl 20, i ( ι ) à une valeui entre 20 et 30 et -i + à une valeur supérieure à 30. ND: not determined. La maturation des cellules dendritiques par CD40L est réalisée par une incubation avec des cellules T6 exprimant le CD40L.
Modulation de l'expression de certains marqueur des cellules dendritiques par l'anticorps 14C1.
Traitement des cellules
NI* LPS lgG1 Am14C1 CD40L
B7-1 + ++ + +(+) +++
B7-2 ++ +++ ++ ++ +++
CD40 + + + + +(+)
CD83 (+) + (+) + +
Les DC sont cultivées en présence des inducteurs suivants (LPS (10ng/ml), CD40L, 14C1 (20μg/ml). Après 72h de culture, les cellules sont lavées et analysées par cytometrie de flux pour leur expression des molécules de surface indiquées dans le tableau. NI* : cellules non traitées
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