WO2000020563A1

WO2000020563A1 - Procede d'induction d'une immunite cellulaire et cellules possedant cette immunite

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Publication number: WO2000020563A1
Application number: PCT/JP1999/005378
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Shiku; Junzo Sunamoto
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corporation
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2000-04-13
Also published as: EP1126023A1; CN1321189A; AU5999899A; EP1126023A4; KR20020013470A; AU756260B2; NZ511118A

Description

明細書細胞性免疫の誘導方法及び細胞性免疫を誘導された細胞技術分野

本発明は、細胞性免疫の誘導方法及び細胞性免疫の誘導された細胞に関する。さらに詳細には、疎水化多糖類と抗原からなる複合体を抗原提示細胞に生体外で反応させることにより、従来のワクチンよりも細胞性免疫、特に抗原に特異的な細胞傷害性 T細胞（以下これを「CTL」と略称することがある）が活性化 '誘導される。背景技術

CTLは、癌細胞もしくはウィルス感染細胞をその T細胞レセプ夕一などを介して特異的に認識して破壊 ·傷害し、生体内での癌もしくはウィルスに対する生体防御機構として重要であることが知られている。さらに、 CTLの T細胞レセプ夕一は癌細胞もしくはウィルス感染細胞の表面に発現されている特異抗原を直接認識するのではなく、マクロファージ、樹状細胞といった抗原提示細胞や癌細胞もしくはウィルス感染細胞それ自身の表面に発現されている MH Cクラス I抗原及びそれに結合した特異抗原由来のオリゴペプチド（その特異抗原の「CTL ェピトープ」）の複合体を認識することが近年明らかになった。

そのような MHCクラス I抗原/特異抗原由来のォリゴぺプチド複合体 _は以下のようなプロセシング経路を経て生成されると考えられている。即ち、抗原蛋白質が細胞質内で合成された後、一部は細胞内のプロテアーゼ複合体（「プロテアゾ一ム」）によりオリゴぺプチドに分解される。その後、さらにその一部（9〜10 アミノ酸残基）が小胞体膜に存在す'る輸送タンパク質、 TAP (t r ans po r t e r i n ant i ge n p r o c e s s i ng) により細胞質力ら小胞体膜内に輸送され、その中で M H Cクラス I抗原との親和性の高いものが優先的に M H Cクラス I抗原と結合し、細胞表面に現われる。

そこで、癌細胞、ウィルス感染細胞または自己抗原反応性リンパ球を排除することによる癌、ウィルス疾患または自己免疫疾患の治療または予防を目的として、人為的に C T Lを活性化するためには、特異抗原を発現する癌細胞もしくはウイルス感染細胞それ自身で生体を免疫するか、または特異抗原またはそれ由来のォリゴぺプチドを抗原提示細胞の上記のプロセシング経路に導入して M H Cクラス I抗原との複合体として発現させることが必要である。 - 実際には、上記のような「C T L活性化ワクチン」を開発するため、 1 ) 特異抗原タンパク質をコードする遺伝子をウィルスベクターなどを用いて導入する、 2 ) いくつかの C T Lェピトープを含む、ある程度の大きさの特異抗原タンパク質を何らかの方法で細胞質内に導入する、 3 ) C T Lェピト一プとなりうる特異抗原由来 9〜 1 0アミノ酸のオリゴぺプチドを直接抗原提示細胞の M H Cクラス I抗原に結合させる、といったアプローチが試みられている。

このうち、 1 ) の方法はいわゆる遺伝子治療に相当し、一般的にその効果 -安全性については未だ評価の定まるところではない。また、 3 ) のアプローチについては動物実験等によって効果が確かめられてはいるものの、ヒ卜に応用することを考えた場合実際的な問題が生じると考えられる。即ち、患者一人一人の持つ M H Cクラス I抗原には様々な種類が存在するため、そのような多様性に対応して生じる C T Lェピトープの多様性をカバーする必要がある。つまり、各々の M H Cクラス I抗原に対する高親和性オリゴぺプチドのアミノ酸配列モチーフを明らかにし、さらに各々の M H Cクラス I抗原に対応するカスタム化を医薬品として実現せねばならず、その開発は現実的には極めて困難と想像される。

一方、 2 )のアプローチについてはいくつかの具体的な実施例が知られており、効果 ·安全性の点で満足でき、かつ様々な患者に対して適用可能な C T L活性化ワクチン開発に結びつく可能性がもっとも高いと考えられる。実際に、特異抗原タンパク質をポリべプチドのまま生体に投与して特異的 C T Lを活性化する場合、何らかのアジュバントとの混合物として投与することが多い。例えば、イスコム (I S COM) (Takahashi et al.， Nature, M4， 873-875, 1990)、 Q S - 21 (Newman et al.， J. Immunol., 148， 2357-2362, 1992)、マンナン被覆リポソ一ム（WO 92/4887公報）、 AF(Raychaudhuri etal., Pro Natl. Acad. Sci. USA, S9, 8308-8312， 1992)といったものが知られている。

ところで、多糖類—コレステロール誘導体に関しては、リボソームの多糖被覆剤として使用できること（特開昭 6 1— 6980 1号公報)、脂肪乳剤被覆剤（特開昭 63— 3 19046号公報）として使用できることが知られている。また、 - 前述のようにマンノースを含む多糖類で被覆された癌細胞抗原またはウィルス抗原一リボソーム複合体、すなわち（抗原）タンパク質をリボソーム化または脂肪乳剤化したのち、多糖類ーコレステロ一ル誘導体で被覆するものが、 CTL誘導活性を有することも知られている（W 092/4887公報参照）。

また、多糖類一コレステロール誘導体と（抗原）タンパク質のみからなる複合体に関しても、さらに有用なワクチンとなりうることが知られている（W098 /9650公報参照）。発明の開示

本発明者らは、より効率的に細胞性免疫を誘導させる方法について鋭意検討した。その結果、天然多糖にアルキル基またはコレステロール基を導入した疎水化多糖類と抗原タンパク質との複合体を、生体外で抗原提示細胞に反応させることで、効率良く細胞性免疫が活性化され生体防御反応をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、疎水化多糖類と抗原との複合体を抗原提示細胞に生体外で反応させることにより細胞性免疫が誘導された細胞が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、抗原提示細胞が樹状細胞（d end r i t i c c e l l) である上記の細胞；疎水化多糖類が、アルキル基またはステロール残基が導入された多糖類であることを特徴とする上記の細胞；疎水化多糖類が、多糖類を構成する糖単位 100個あたり平均 0. 5〜 5個の糖単位の 1級水酸基が式： —0— (CH₂) _mCONH (CH₂) _nNH— CO— 0— R

(式中、 Rはアルキル基またはステロ一ル残基を、 mは 0または 1を、 nは任意の正の整数をそれそれ示す）で表される基を有することを特徴とする多糖類である上記の細胞；ステロール残基が、コレステロール残基であることを特徴とする上記の細胞；多糖類が、プルランまたはマンナンであることを特徴とする上記の細胞；抗原が、 MHCクラス I抗原にオリゴペプチドとして提示され、細胞障害性 T細胞を惹起するタンパク質であることを特徴とする上記の細胞；抗原が、癌細胞抗原、ウィルス抗原または自己抗原反応性 T細胞レセプ夕一である上記の細胞；抗原が、 E r bB— 2タンパク質であることを特徴とする上記の細胞；及び非経口投与剤として用いる上記細胞が提供される。

別の観点からは、本発明により、疎水化多糖類と抗原との複合体を生体外で抗原提示細胞に反応させることを特徴とする細胞性免疫の誘導化方法が提供されるこの発明の好ましい態様によれば、疎水化多糖類と抗原との複合体が細胞性免疫を誘導するのに十分な量であることを特徴とする上記の方法；生体内から抗原提示細胞を取り出し、疎水化多糖類と抗原との複合体を抗原提示細胞に反応させた後、再び生体内に戻す方法；及び非経口投与により生体内に戻す上記の方法が提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、マウスから取り出した CD 4陽性 T細胞群及び CD 8陽性 T細胞群の増殖を示す図である。たて軸は各々 C HP— HER 2、 CHP— CABで処理した、及び無処理のマウス樹状細胞群を示し、よこ軸は ³ Hチミジンのとりこみ量を示す。

第 2図は、正常人から得られた樹状細胞を CHP— HER 2、 CHP— CAB で処理したときの CTLクローンによる細胞障害活性を示す図である。たて軸の上 2段は HLA— A 2402を有する正常人由来の樹状細胞を、下 2段は HLA -AO 20 1を有する正常人由来の樹状細胞を各々 CHP— HER 2、 CHP— CABで処理したものを示し、よこ軸は C r ⁵¹遊離試験での CT Lクローンによる細胞傷害活性を示す。

第 3図は、正常人から得られた樹状細胞を CHP— HER 2、 HER 2、 CH P_CAB、 CAB, HER 2 p 63— 7 1で処理したときの CT Lクローンの増殖を示す図である。たて軸は各々 CHP— HER 2、 HER2、 CHP-CA B、 CAB、 HER 2 p 63— 71 (ポジティブコント口一ル）で処理もしくは無処理の樹状細胞を示し、よこ軸は C T Lクローン（HER 2 p 63— 71) の増殖能を示す。

第 4図は、ヒト E rbB— 2発現マウス腫瘍細胞 CMS 7 HEを接種したマウスに、コレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒト E rbB— 2夕ンパク質との複合体などで処理した樹状細胞群を免疫した場合の、各個体の腫瘍細胞の増殖曲線を示したものである。たて軸は腫瘍の長径および短径を測定し、算出した腫瘍サイズ（mm² ) を、よこ軸は腫瘍接種後の日数を示す。図中、 DC (CHP — HER2)、 DC (CHP— CAB) (対照群）および D Cはそれそれ C H P _ E r bB 2、 CHP— CAB処理および無処理の樹状細胞群を免疫したマウスのデータを、 No treatment は非免疫マウスのデータを示す。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を詳細に説明する。なお、本発明において「アジュバンド」とは、抗原に対する免疫応答を修飾する目的で抗原とともに用いられる物質を意味するものであり、通常は抗体産生や細胞性免疫の強化に用いられるが、場合により免疫応答の負的変化として用いられるものも包含するものである。

( 1) 抗原

本発明における抗原としては、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、グリコプ口ティン、核酸等の免疫を惹起する物質を指す。病理学的標的そのものの一部であってもよく、または新生物組織またはウィルス感染細胞等の病んだ組織が発現する抗原であってもよい。本発明においては、抗原タンパク質、なかでも MHC クラス I抗原にォリゴぺプチドとして提示され、 C T Lを惹起するタンパク質が用いられる。

抗原タンパク質は、そのような抗原決定基を含んでいれば特に起源、純度にこだわるものではない。望ましくは遺伝子組み換え法により作製したものが好適である。抗原タンパク質の分子量は、抗原決定基を含めば特に限定されないが、一般的に 500- 100, 000、好ましくは 2， 000〜 100， 000である。ペプチド断片としては、アミノ酸数が 30個以上のものが好適に用いられる。具体例としては、癌遺伝子産物、 E rbB— 2 (HER 2と略することもある）夕ンパク質、 r a s p 2 1タンパク質、癌抑制遺伝子産物 p 53タンパク質、ゥィルス由来タンパク質または T細胞レセプ夕一、例えば自己抗原反応性（自己免疫疾患惹起） T細胞レセプ夕一等の全体ならびにそれらの部分配列を含むタンパク質などが挙げられる。

( 2 ) 疎水化多糖類

疎水化多糖類の作製法並びに疎水化多糖類集合体微粒子の作製方法については秋吉らの方法（Akiyoshi et al., Macromolecules, 2 &, 3062-3068 (1993)， Akiyoshi et al., J. Proc. Japan. Acad., II, 71B, 15 (1995)、特開昭 6 1 - 69801号公報、特開平 3— 29230 1号公報、特開平 7— 97333号公報）を用いることができる。

疎水化多糖類における多糖類としては、単糖残基が互いにグリコシド結合してできた高分子をいい、糖類成分は、単糖類、例えば、グルコース、マンノース、ガラクト一ス、フコース等から、または二糖類またはオリゴ糖類からも誘導できる。糖類単位は 1， 2—、 1， 3—、 1 , 4一または 1 , 6—グリコシド結合していてもよい。さらに、ひ一または /?—型結合のいずれであってもよい。鎖は直鎖上でも枝分かれしていても良い。糖類成分はグルコースであるものが好ましく、具体的には、天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミ口べクチン及びマンナンが挙げられ、好ましくはマンナンまたはプルランが用いられる。本発明においては、上記のような多糖類に疎水基を導入して疎水化多糖類を作成する。疎水化多糖類としては、特開平 7— 97333号公報に記載のようなリンカ一を介して結合しているものであってもよい。

疎水基としては、通常、アルキル基またはステロール基等が挙げられるが、好ましくはステロール残基である。疎水化率としては、例えばアルキル基またはステロール残基を 100単糖あたり平均 0. 5〜5個、好ましくは平均 1〜5個であり、また重量比で 5%以下のものが望ましいが、特にこれに限定されるわけではなく、封入される抗原の分子量ゃ等電点に応じて封入率のよいものを用いることができる。なお、ステロール残基としては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、シトステロ一ル、ラノステロ一ル、エルゴステロ一ル残基などが挙げられ、好ましくは、コレステロール残基である。また、アルキル基としては、例えば、ラウリル基、ステアリル基、パルミチル基などが挙げられ、特に、炭素数 20以下、好ましくは炭素数 10〜18のものが挙げられる。アルキル基は直鎖又は分岐鎖の、ずれであってもよい。

本発明における疎水化多糖類は、多糖類の 1級水酸基と上述した疎水基とが任意の連結基を介して結合したものであるが、この連結基としては、例えば下式のような連結基が挙げられる。なお、多糖類の水酸基 1つ当たり、 2つ以上のステロール残基またはアルキル基が結合したものでもよい。一 (CH₂) _mCONH (CH₂) _nNH— CO— 0 -

(式中、 mは 0または 1、 nは任意の整数、好ましくは 1〜8の整数を示す。） (3) 疎水化多糖類による抗原の封入方法

疎水化多糖類と抗原との複合体は、例えば疎水化多糖類の集合体微粒子と抗原とを室温で混合した後に、ゲルクロマトグラフ法で処理することにより単離 -精製できる (Nishikawa, Macromolecules, Z7, 7654-7659 (1994))。

例えば次の 2文献（J. Am. Chem. Soc, IIS, 6110-6115 (1996), Macromolecules, 21, 7654-7659 (1994))に記載のように疎水化多糖類：抗原 =0. 1〜 1 00 ： 1 の重量比で混合することにより、直径約 5〜 50 nmの粒径を持つ複合体を作製することができる。

このようにして得られた疎水化多糖類と抗原との複合体はそのまま本発明に用いることができるが、必要に応じて常法に応じて滅菌等の操作を施すことも可能である。

( 4 ) 抗原提示細胞 - 抗原提示細胞とは、生体に侵入した異物の情報をリンパ球に伝えその活動を促す物質のことを指し、これをきつかけにして免疫系が動き出す。例えば、樹状細胞（dend r i t i c c e l l), マクロファージ（貧食細胞）、 B細胞、肝臓のクッパー細胞、胸腺上皮細胞などが挙げられる。これらの細胞には主要組織適合抗体（MHC) クラス Iに加えて主要組織適合抗体（MHC) クラス IIが発現されている。該抗原提示細胞としては、例えば脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト由来の細胞が挙げられる。

樹状細胞を得る方法については、以下の例に限定されないが、例えば動物細胞

(例えばマウス）から骨髄細胞を取り出し、抗体等で調製後骨髄幹細胞群を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM—CSF) 等の存在下数日間培養することにより得ることができる。また、例えばヒトの末梢血単核球をフイコールコンレイ法等により分離培養し、付着細胞を GM—CS F及びィン夕一ロイキン（ I L一 4 ) 等の存在下数日間培養することにより得ることができる。

(5) 複合体と抗原提示細胞（樹状細胞）を反応させる方法

上記（4) のようにして得られた樹状細胞に、上記（3) の疎水化多糖類と抗原との複合体の懸濁液を、好ましくは 100〃g/mlタンパク濃度に加え、培養温度は約 1〜 50 °C、好ましくは 37 °C付近で、約 1時間〜 48時間程度培養することで反応させることができる。

( 6 ) 細胞性免疫の誘導化

上記複合体が樹状細胞と反応することで、細胞性免疫が誘導される。その際、細胞性免疫を誘導するのに十分な量の上記複合体を反応させればよい。細胞性免疫が誘導されているかについては、樹状細胞と T細胞群（例えば CD 4陽性 T細胞群、 CD 8陽性 T細胞群、ペプチドを認識するように作成された CTLクローン（例えば MHCクラス Iに特異的に作用することが知られている HER 2の 6 3-71番めのアミノ酸配列を有するぺプチドを認識するように作成された HE R 2 p 63— 7 1という CTLクローン）等）と混合培養させることで、 T細胞群の樹状細胞の殺傷力や刺激 ·増殖力をラジオァイソトープ等を用いて確認することができる。

上記複合体による細胞性免疫の誘導化機構については、明らかではないが、〔0 003〕で述べたような c onvent i ona lな MHCクラス I抗原/抗原オリゴぺプチド複合体プロセシング経路を経ていると推定される。このことは、例えば、下記方法のような該経路の各ステツプを選択的に阻害するような薬剤を同時処理することにより伺うことができる。

1 ) 能動的 P hago yt o s i sを阻害する Cyt o cha l a s i n D (例えば 30 g/ml)、 2)プロテオソーム阻害剤 L a c t ac ys t i n (例えば 100 M)、 3) MHCクラス I抗原の新たな生合成を阻害する Cyc 1 o hex imi d e (例えば 10〃g/ml)、 4)蛋白質の小胞体（ER) からゴルジ体への移行を阻害する B r e f e 1 d i n A (例えば 5〃g/ml) のような薬剤で樹状細胞を 1から 3時間前処理、さらに複合体反応時にも同様に処理しておくことにより、上記 T細胞群の殺傷能力が無処理群に比べて減弱することから該経路を経ていると推定することができる。また、同時に複合体の代わりに直接抗原ェピト一プとなるオリゴぺプチドを樹状細胞と反応させた場合には上記阻害剤の効果が見られないというような対照実験も可能である。

さらに、このような T細胞群の殺傷能力は 5 ) 受動的 ma c r op i no c y t o s i sを阻害する Ami 1 o r i d e (例えば 0. 2 mM) 及び 6 ) end o s ome内で蛋白質が分解されてできたオリゴぺプチドの MHCクラス II 抗原への結合を阻害する Ch 1 o r o qu i ne (例えば 30〃M) 処理によっては阻害を受けないことから、上記複合体による細胞性免疫の誘導化機構が、単に上記複合体の蛋白質徐放作用による c onve nt i ona lな経路以外の経路を経ていることによるものではないと推定することができる。

また上記（5) で得られた細胞は、生体内に戻すことにより、生体内での細胞性免疫を誘導することができる。

例えば、細胞性免疫を誘導された樹状細胞はその活性化を維持した状態（例えば通常用いられる緩衝液や血液成分等を含む溶液中）で、生体内（例えば血中や骨髄中）に注射等の方法で戻すことができる。例えば次の 3文献（NATURE MEDICINE, 4(3), 328-332 (1998)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92， 8078-8082 (1995), Canser Res., 56， 2479-2483 (1996)) に記載の方法等により生体内に戻すことができる。

本発明に係る細胞性免疫の誘導された細胞は、通常緩衝液（例えば HB S S、 PB S等）、生理食塩水、血液成分等を含む溶液と共に非経口投与することができる。投与方法としては、主に非経口投与である注射や点滴等が挙げられるが必ずしもこれらに限定されるものではない。

また、本発明に係る細胞性免疫の誘導された細胞の投与量は、患者の年令、体重、症状、疾患の重篤度等により変動する為、最終的には臨床医によって決定されるべきものであるが、一般的には患者 1人に対して細胞数として約 10³個〜 10^{1 Q}個を数日および/または数週間ごとに 1回ないし数回投与する。実施例

以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。実施例 1

コレステロ一ル化マンナンまたはプルランと癌遺伝子産物 E r b B _ 2夕ク質との複合体の調製疎水化多糖は秋吉らの方法（Akiyoshi et al., Macromolecules, £, 3062-3068 (1993))によって合成した。その結果、コレステロール化マンナン（以下、「CH M- 5 5 - 2. 3」と略記する）としては、分子量約 5 5， 0 0 0のマンナン（シグマ社製）に 1 0 0単糖当たり平均約 2. 3個のコレステロール残基が導入された。また、コレステロール化プルラン（以下、「CHP— 1 0 8— 0. 9」と略記する）としては、分子量約 1 0 8 , 0 0 0のプルラン（林原生物化学研究所製）に 1 0 0単糖当たり平均約 0. 9個のコレステロール残基が導入された。水溶液中では、 1つの集合体当たり平均 7分子のコレステロール残基が会合して形成された疎水性ドメインが約 7個含まれるものとなった。

上記疎水化多糖を DM S 0に溶解した後、 P B S (p H 7. 9 ) に透析し、さらにプロ一ブ型のソニケ一夕一（トミー精ェ製 URP) を用い、 40Wで 1 0分間超音波処理した。このものを 1. 2 zm、 0. 4 5〃m、 0. 2〃mの順でフィル夕一濾過することによって疎水化多糖微粒子水溶液を得た。各溶液の疎水化多糖濃度をフヱノール硫酸法で定量した結果、 CHP— 1 0 8— 0. 9は 9. 6 2mg/ml、 CHM- 5 5 - 2. 3は 6. 9 7mg/m lであった。

一方、癌原遺伝子ヒト E r bB— 2タンパク質のアミノ酸の 1番目から 1 4 7 番目に相当するポリペプチド（Coussens et al. , Science, ΖΜ^ 1132, 1985)の Ν末端にヒスチジン ·へキサマーを融合させた紐み換えタンパク質を大腸菌を用いて発現させ、抗原タンパク質として用いた。即ち、下記に示すオリゴヌクレオチド ·プライマ一 2本を用いて、ヒト E r bB— 2夕ンパク質のアミノ酸の 1番目から 1 47番目に相当するポリぺプチドをコ一ドする部分を含む c DNAを P CR法にて増幅した。

T S 1 ： 5 ' -GGAT C CATATGGC T GGCGGC C T- 3 ' (配列表の配列番号 1 )

T S 2 ： 5 ' -CGAC T GGAT C C TAT GTGAGAC T T C- 3 ' (配列表の配列番号 2 ) 得られた 449 bpのDNA断片を制限酵素Nd e Iおよび B amH Iで切断した。さらに発現プラスミドベクタ一 pET 1 5 b (No va gen社）を制限酵素 Nd e Iおよび B amH Iで切断した。このようにして作製された p E T 1 5 b由来の約 5. 7 kbpの Nde l— B amH I断片に上記ヒト e r bB_ 2 cDNAの PCR DNA断片をライゲーシヨン 'キット（宝酒造製）を用いて連結し、大腸菌 BL 2 1 (DE 3) (Nova gen社）を形質転換した。アンピシリン耐性のクローンを選別した後、添付された N o V a g e n社マニュアルにしたがって、組み換えタンパク質を精製した。通常 1リットルの培地で培養した組み換え体から、およそ 2 Omgの組み換えタンパク質を得た。

上記のようにして得た、疎水化多糖水溶液にヒト ErbB— 2組み換えタンパク質溶液（PB S/6M尿素中にタンパク質 2. Omg/mlを含む）を加え、混合することで、無色透明の疎水化多糖と抗原との複合体を含有する水溶液（C HMまたは CHP Smg /ml ヒト E r b B— 2組み換えタンパク質 0. 25 mg/m 1 ) を得た。これについて DLS (D i nami c L i ght S c at t e r i ng) 測定を行った結果、粒径約 250 nm、 k 2/k 12 = 0. 156の複合体微粒子を得たと考えられた。以下、かくして得られたコレステロ —ル化マンナンと E r bB— 2タンパク質との複合体を「CHM— E rbB 2」、コレステロール化プルランと E rbB— 2夕ンパク質との複合体を「 C H P— E r bB 2」と略記する。

一方、疎水化多糖が存在しない同一緩衝液を用いた条件では、ヒト E r bB— 2組み換えタンパク質は全て不溶化し、沈殿として析出した。

免疫実験の陰性対照としては、 C a r b o n i c Anhy d r a s e II(シグマ社製、以下「CAB」と略記する）を用いて疎水化多糖とタンパク質との複合体を作製した。以下、コレステロール化マンナンと CABとの複合体を「CH M—CAB」と、コレステロール化プルランと CABとの複合体を「CHP— C AB」と略記する。実施例 2

コレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒト E rbB— 2タンパク質との複合体で処理した樹状細胞群の T細胞活性化に対する効果（ T細胞増殖刺激活性）

5匹のメス B ALB/cマウスに実施例 1で調製した CHP _E r bB 2の懸濁液をタンパク質として、 1匹あたり 20〃gを 1週間間隔で 2回皮下免疫した。最終免疫から 1週間後に免疫細胞より脾臓細胞を取り出しナイロンウールカラムを用いて T細胞を選択的に選り分けた。得られた T細胞群を抗 CD 4モノクロ一ナル抗体、抗 CD 8モノクローナル抗体及び補体源としての家兎血清を用い、抗体及び補体にて処置し、 CD 4陽性 T細胞群、 CD 8陽性 T細胞群及び CD 4と CD 8 T細胞の混合群を調整した。

一方 6匹のメス B ALB/cマウスより骨髄細胞を取り出し、抗 CD 4抗体、抗 CD 8抗体、抗 B細胞抗体及び補体源としての家兎血清を用いて処置し、骨髄幹細胞群を調製した。得られた細胞群を GM— CSF ( 1 00 un i t p e r ml) の存在下にて 6日間培養を行い、骨髄由来樹状細胞群を調製した。得られた樹状細胞群に CHP— E rbB 2の懸濁液または CHP— CABの懸濁液を夕ンパク質にて 100〃g/mlの濃度にて加え、 3時間混合培養した後に樹状細胞群を洗浄し、さらに 18時間培養を続けた。

その後、先に述べた C HP— E rbB 2の懸濁液にて免疫されたマウスより得られた CD 4陽性 T細胞群、 CD 8陽性 T細胞群及びその混合細胞群と、マイトマイシン Cにて処置した前述の樹状細胞群と混合培養し、 Ί 2時間後に Hチミジンを加えて T細胞群の増殖を観察した。

その結果、第 1図に見られる如く、 CHP_E rbB 2の懸濁液により免疫された CD 4陽性 T細胞群、 CD 8陽性 T細胞群及びその混合細胞群は、いずれもが CHP— E rbB 2により処理された樹状細胞群とのみ反応し細胞増殖を示したが、 C H P— C AB懸濁液にて処理された樹状細胞群及び全く未処置の樹状細胞群による T細胞群の増殖刺激は認められなかった。尚、図中では E rbB 2を HER 2として表してある。実施例 3

コレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒト E rbB— 2タンパク質との複合体の健常人末梢血由来樹状細胞の抗原提示能に対する効果（細胞傷害活性）

HLA— A2402 (HER2 p 63-7 1を認識する）又は HLA— AO 2 0 1を有した正常人末梢血単核球をヒコ一ルコンレイ法により分離した。細胞をプラスチックプレート上で 2時間培養した後に、浮遊細胞を除去し、付着細胞を GM-C S F ( l O O Oun i t p e r m 1 ) 及び I L一 4 ( 100 u n i t pe r ml) 存在下にて 10日間培養した。培養後、浮遊細胞を回収し、骨髄由来樹状細胞として使用した。

得られた樹状細胞に CHP_E rbB 2懸濁液又は C H P _ C A B懸濁液を何れもタンパク量 100〃g/mlの最終濁度にて 3時間培養した。細胞を 2回洗浄後、さらに 1 6時間培養した後に S od ium Cr⁵¹ (50 1 ： 100m C i) にて標識し、細胞傷害性試験を行った。エフェクター細胞としては、 HL A-A2402を有した正常人末梢血リンパ球を E r bB 2 p 63 - 7 1ぺプチドにてパルスした自家樹状細胞で感作して誘導樹立した C D 8陽性 H L A— A 2 402拘束性で同ぺプチドを認識する CTLクローンを用いた。

その結果、第 2図に示される如く、 CTLクロ一ンは、 CHP— E rbB 2懸濁液にて処理された HLA— A 2402由来の樹状細胞を優位に殺傷したが、同一人由来で CHP_ CAB懸濁液で処置された樹状細胞や HLA— A 2402を有していない（HLA— A0201を有する）健常人より調製された樹状細胞を CHP-E r bB 2懸濁液で処置したもの及び同樹状細胞を C H P— C A B懸濁液で処置した細胞に対しては傷害活性を示さなかった。実施例 4

コレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒト E rbB_2タンパク質との複合体で処理した健常人末梢血由来樹状細胞の C T Lクローン活性化に対する効果 (CTLクローン増殖刺激活性）

HLA-A 2402を有した健常人末梢血単核球より前述の如く調整された樹状細胞を、 CHP— E r bB 2懸濁液、 E r b B 2タンパク質のみ、 CHP— C AB懸濁液、 CABタンパク質のみにて各々タンパク質量 100 g/ml濃度にて 3時間共培養した後に洗浄後、さらに 15時間培養を続けた。

これらの樹状細胞および E r bB 2 p 63 - 7 1ぺプチドにてパルスした词一人由来樹状細胞を刺激細胞とし、先に述べた E rbB 2 p 63— 7 1ぺプチド特異的 CD 8陽性 HLA— A 2402拘束性の C T Lクローンに対する刺激能を検言寸した。

その結果、第 3図に示される如く、 CHP— E r bB 2の懸濁液にて処置された樹状細胞および E r b B 2由来 p 63— 7 1ぺプチドをパルスした樹状細胞は、無処理樹状細胞に比して優位に CTLクローンを刺激し、増殖させた。このことより CHP— E rbB 2タンパク質は樹状細胞に ErbB 2タンパク質を取り込ませた後、同タンパク質に由来する p 63-7 1ぺプチドを樹状細胞上の HL A -A2402分子と共に提示するべく機能することが明らかとなった。実施例 5

コレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒト E rbB— 2タンパク質との複合体で処理した樹状細胞群の制癌効果

骨髄由樹状細胞群は実施例 2に述べた方法で調整した。得られた樹状細胞群に実施例 1で調整した CHP— E rbB 2の懸濁液または C H P— CABの懸濁液をタンパク質量として 75〃 g/m 1の濃度で加えて 3時間混合培養した後に樹状細胞群を洗浄し、さらに 18時間培養した。

1群 4匹のメス BALB/cマウスに、同系のマウス繊維芽肉腫細胞株（Deleo et al.， J. Exp. Med., 146, 720, 1977参照）に常法により選択マーカ一の n e o遺伝子とヒト E rbB— 2を発現させた組換え細胞 C M S 7 HEを皮下に接種した。腫瘍細胞接種後 10日目より、先に述べた方法で処理した樹状細胞群 4 X 10⁵個を 1週間間隔で皮下に免疫した。

接種した腫瘍の大きさを経時的に測定したところ、第 4図に見られるように、 CHP-E rbB 2で処理した樹状細胞群で免疫されたマウスでは、 4匹中 4匹とも腫瘍の増殖抑制および完全退縮が観察された（第 4図の DC (CHP-HE R 2))。一方、 C HP— CABで処理した樹状細胞群や無処理の樹状細胞群で免疫されたマウスでは、腫瘍の増殖抑制効果はほとんど観察されず（第 4図の D C (CHP— CAB)および DC)、この免疫操作の生体内での抗原特異性および制癌効果が示唆された。産業上の利用可能性

本発明の細胞性免疫を誘導された抗原提示細胞は、従来のワクチンよりも効率良く細胞性免疫が誘導されており、細胞治療法としても極めて有用となりうる。

Claims

請求の範囲

1. 疎水化多糖類と抗原との複合体を抗原提示細胞に生体外で反応させることにより細胞性免疫が誘導された細胞。

2. 抗原提示細胞が樹状細胞（dend r i t i c c e l l) である請求の範囲第 1項に記載の細胞。

3. 疎水化多糖類が、アルキル基またはステロール残基が導入された多糖類であることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載の細胞。

4. 疎水化多糖類が、多糖類を構成する糖単位 100個あたり平均 0. 5〜5個の糖単位の 1級水酸基が式：

—〇一 (CH₂) _mCONH (CH₂) _nNH— CO— O— R (式中、 Rはアルキル基またはステロール残基を、 mは 0または 1を、 nは任意の正の整数をそれそれ示す）で表される基を有することを特徴とする多糖類である請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載の細胞。

5. ステロール残基が、コレステロール残基であることを特徴とする請求の範囲第 3項又は第 4項に記載の細胞。

6. 多糖類が、プルランまたはマンナンであることを特徴とする請求の範囲第 1 項ないし第 5項のいずれか 1項に記載の細胞。

7. 抗原が、 MHCクラス I抗原にオリゴペプチドとして提示され、細胞傷害性 T細胞を惹起するタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれか 1項に記載の細胞。 ―

8. 抗原が、癌細胞抗原、ウィルス抗原または自己抗原反応性 T細胞レセプ夕一である請求の範囲第 7項に記載の細胞。

9. 抗原が、 E rbB— 2タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第 8項に記載の細胞。

10. 非経口投与剤として用いることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 9 項のいずれか 1項に記載の細胞。

1 1 . 疎水化多糖類と抗原との複合体を生体外で抗原提示細胞に反応させることを特徴とする細胞性免疫の誘導化方法。

1 2 . 疎水化多糖類と抗原との複合体が細胞性免疫を誘導するのに十分な量であることを特徴とする請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載の方法。

1 3 . 生体内から抗原提示細胞を取り出し、疎水化多糖類と抗原との複合体を抗原提示細胞に反応させた後、再び生体内に戻すことを特徴とする、生体内細胞性免疫の誘導方法。 -

1 4 . 非経口投与により抗原提示細胞を生体内に戻す請求の範囲第 1 3項に記載の方法。