WO2000011031A1 - Method for producing biostatin (tt-232 triacetate) and the analogs thereof - Google Patents

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Günther Braum
Axel Lifferth
Christian Birr
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Orpegen Pharma Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung, Entwicklung Und Produktion Mbh
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/6555—Somatostatins at least 1 amino acid in D-form
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Definitions

  • BIOSTATIN TT-232 triacetate
  • the present invention relates to a method for the synthesis of biostatin by means of solid phase synthesis.
  • the peptide biostatin (TT-232) is an analogue of somatostatin and has strong in vitro and in vivo antitumor activity.
  • Somatostatin is a naturally occurring tetradecapeptide that inhibits the formation of growth hormone and the secretion of other endocrine molecules, such as glucagon, insulin and gastrin. Somatostatin inhibits or regulates some cell functions and has also been found to display important endogenous antiproiiferative activity. An inhibitory effect of somatostatin and its analogues on tumors has also been shown. In the past few years, some somatostatin analogues have been developed which have longer action times than the native hormone and better anti-tumor activity. A great deal of effort was therefore devoted to developing tumor-selective somatostatin analogs, the ease of manufacture also playing a role in particular.
  • One of these analogs is a molecule with a 5-ring structure with the following sequence:
  • the molecule was called TT-232 or Biostatin.
  • This somatostatin analog has practically no inhibitory effect on growth hormone release, but shows strong antitumor activity in vivo and in vitro and induces apoptosis.
  • the compound inhibits the tyrosine kinase activity of various human intestinal tumor cell lines, this inhibition being in very good agreement with the observed inhibition of cell proliferation.
  • the solid phase synthesis used in the process according to the invention can be carried out in a manner known per se to the person skilled in the art.
  • the suitable solid phase materials, the required reagents, buffers, reaction conditions and protective groups to be used for the amino acids are known to the person skilled in the art.
  • the method according to the invention is based on the finding that the spatial separation of the reaction centers in the formation of the disulfide bridges in biostatin is sufficiently ensured if the oxidation takes place as long as the peptide is still bound to the solid phase.
  • oxidizing agents for oxidation, all oxidizing agents that have already been known for processes carried out in solution can be used. Suitable oxidizing agents are therefore known to the person skilled in the art. Examples of such oxidizing agents are silver, mercury or thallium salts, iodine, peroxides or oxygen. These oxidizing agents are used in the presence of a suitable solvent or solvent mixture.
  • iodine is particularly preferably used as the oxidizing agent, for example in acetic acid solution or in a solvent based on N, N-dimethylformamide.
  • the polymer-bound peptide is washed with various solvents or solvent mixtures.
  • solvents or solvent mixtures e.g. N, N-dimethylformamide, methanol, acetic acid and water or else solutions of complexing reagents or reducing agents, such as in particular thiosulfate or ascorbic acid, can be used.
  • the process according to the invention is advantageously carried out on a solid phase which has an acid labile anchoring bond (ALAB).
  • a polymer in particular polystyrene, is particularly preferably used as the solid phase. Modified resins such as aminomethyl polystyrene (AMPS), benzhydrylamine (BHA-PS) and methylbenzhydrolamino-polystyrene (MBHA-PS) can also be used advantageously.
  • the solid phase can be in the form customary for solid phase synthesis be used.
  • the solid phase is preferably used in the form of beads, so-called "beads".
  • Suitable anchor groups are anchors customary in solid-phase chemistry, which allow the peptide to be split off from the polymeric support in a simple manner. Within the scope of the invention, anchor groups are particularly preferred which enable the peptide to be split off as an amide.
  • Exemplary polymers derivatized with an acid labile anchor group (ALAB-P) are 5- (9-amino) xanthene-2yl-) oxyveryI-4'-methyl-benzhydrylamino-polystyrene and 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl) aminomethyl- phenoxyacetyl-4 "- methyl benzhydrylamino polystyrene.
  • anchor groups are also 4-hydroxymethylbenzoic acid (HBMA), 9-amino-xanthenyl-3-hydrol (Xant) or p [(R, 5) - - (1 - (9H-fluoren-9-yl) methoxyformamido] -2,4-dimethoxybenzyl] phenoxyacetic acid [MEOBP]
  • HBMA 4-hydroxymethylbenzoic acid
  • Xant 9-amino-xanthenyl-3-hydrol
  • MEOBP p [(R, 5) - - (1 - (9H-fluoren-9-yl) methoxyformamido] -2,4-dimethoxybenzyl] phenoxyacetic acid
  • MEOBP Most preferred in the context of the invention are the Xant and MEOBP groups.
  • the synthesis in the process according to the invention is preferably carried out using the Fmoc / tert. Butyl strategy carried out. This means that the amino acids required to build up the peptide have an Fmoc protecting group on the amino group and tert on the side chain groups. Butyl groups are derivatized.
  • the Fmoc protective group is a temporary protective group since it is split off during the formation of the peptide and only one Fmoc group remains at the N-terminus of the synthesized, solid-phase-bound peptide.
  • the sulfhydryl groups of the cysteines are advantageously derivatized with trityl or Acm protective groups. It is also particularly preferred to use the N-terminal last amino acid in the sequence structure as an N-alpha Boc-protected amino acid derivative.
  • the peptides are also cleaved from the polymeric support by methods known per se.
  • the cleavage is acidic, particularly preferably with concentrated or dilute trifluoroacetic acid.
  • the protective groups of the peptides detached from the solid phase are usually also cleaved by adding acid, preferably again using trifluoroacetic acid. After the peptides have been split off, further purification and / or concentration steps can be carried out, if desired. Cleaning can advantageously be carried out by means of preparative HPLC.
  • the synthesis according to the process according to the invention starts from Fmoc-threonine (tert.butyl ether) amide, which is covalently bound to a polystyrene solid phase via an acid-labile xanthenyl anchor grouping.
  • the individual protected amino acids are subsequently added to form a solid-phase-bound protected peptide.
  • the heptapeptide is then oxidized on the solid phase by adding iodine / N, N-dimethylformamide or acetic acid and the cyclized heptapeptide is detached from the support by acid treatment.
  • all protective groups on side chains of the peptide are split off.
  • the Fmoc protective group is split off as described in step 1, the initial swelling process being dispensed with in the DMF-moist resin.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a recoupling is carried out using the following solutions: 1 96.8 g (336 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml of N.N-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml of NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and free Amino groups examined. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a recoupling is carried out using the following solutions: 1 57.4 g (336 mmol) Fmoc-Lys (Boc) in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml N. N-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete turnover, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3. Stage 8, coupling of Fmoc-D-Trp
  • the following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 7): 286.8 g (672 mmol) of Fmoc-D-Trp in 500 ml of NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) of HOBt * H 2 0 in 250 ml of NN-dimethylformamide and 21 5.8 g of TBTU in 750 ml of NN-dimethylformamide.
  • the prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 7), then 228.7 ml DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 43.3 g (336 mmol) Fmoc-D-Trp in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml of NN-dimethylformamide and 107.9 g of TBTU in 375 ml of NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 54.4 g (336 mmol) Fmoc-Tyr (tBu) in 250 ml N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 96.8 g (336 mmol) of Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml of N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) of HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml N. N-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After 1 hour A reaction time sample is taken from a resin, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3
  • stage 1 During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 1) the following solutions are prepared: 1 78.3 g (672 mmol) Boc-D-Phe in 500 ml NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (stage 11), then 228.7 ml of DIEA are added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups.
  • the Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 89.1 g (336 mmol) Boc-D-Phe in 250 ml N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 400 ml NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete turnover, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
  • step 1 4 The product resulting from step 1 4 is mixed with 4 l of NN-dimethylformamide and agitated for 20 minutes. Then 400 g of Boc 2 0 are added, after 5 minutes, 3 portions of DIEA a 200 ml are added every 5 minutes. After 1,000 minutes, the product is suctioned off, followed by 5 DMF washing steps (see above) of 3 l and 3 analogous MeOH washing steps, each using 2.5 l of MeOH. After drying under high vacuum for 16 hours, 833 g of polymer-bound peptide are obtained.
  • a solution of 41 6.5 g of iodine in 6 l of NN-dimethylformamide is added to 833 g of polymer-bound peptide (0.37 mmol of peptide / g of peptide-carrier conjugate) from stage 15. After 60 minutes, the product is filtered off with suction and mixed with 8 l of N.N-dimethylformamide. After 60 minutes, the product is suctioned off, followed by 4 DMF washing steps (see above) of 8 I. The following procedure is carried out 3 times: 8 I N. N-dimethylformamide and 2 I 1 0% Na 2 S 2 0 3 solution admitted.
  • a solution of 1 20 ml each of m-cresol and water in 6 l of trifluoroacetic acid (cleaving reagent) is added to 672.4 g of polymer-bound peptide from stage 1 6 and shaken at room temperature for 30 minutes. Then it is suctioned off and the resin is again mixed with a releasing reagent. The first post-splitting is aspirated after 30 minutes, followed by post-splitting lasting one or two hours. The respective filtrates are evaporated on a rotary evaporator at 30 ° C water bath temperature in a water jet vacuum. The residue is stirred with 3 l of ether, suction filtered through a P3 frit and washed 3 times with 1.5 l of ether. After 1 6 hourly drying in a high vacuum gives a total of 231.85 g of peptide.
  • the Fmoc protective group is split off as described in step 1, the initial swelling process being dispensed with in the DMF-moist resin.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • stage 9 During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 9), 2.76 g (6 mmol) of Fmoc-Tyr (tBu), 1, 1 2 g (7.2 mmol) HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 9), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out. Stage 1 1, splitting off the Fmoc protective group
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • the Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
  • a solution of 2.5 g of iodine in 50 ml of NN-dimethylformamide is added to 5 g of polymer-bound peptide (0.30 mmol of peptide / g of peptide-carrier conjugate) from stage 1 4.
  • the product is filtered off with suction and mixed with 50 ml of N. N-dimethylformamide.
  • the product is suctioned off, followed by 4 DMF washing steps (see above) of 50 ml.
  • the following procedure is carried out 3 times: 1 6 ml of NN-dimethylformamide and 4 ml of 10% Na 2 S 2 0 3 solution are added .
  • suction is carried out, followed by 3 DMF washing steps. It is then washed 3 times with water, methanol, water and methanol and dried overnight under high vacuum. Weigh out 4.1 g (0.34 mmol peptide / g peptide-carrier conjugate).
  • Example 3 Disulfide oxidation with thallium trifluoroacetate
  • 136 mg TI (TFA) 3 are dissolved in 1 ml NN-dimethylformamide (oxidation solution), 0.5 g polymer-bound peptide (0.38 mmol peptide / g peptide carrier conjugate) are mixed with 3 ml NN-dimethylformamide for 5 minutes shaken, then 0.725 ml of oxidizing solution are added.
  • 0.25 ml of triethylsilane is mixed with 10 ml of trifluoroacetic acid (cleavage reagent).
  • cleavage reagent Trifluoroacetic acid
  • 0.4 g of polymer-bound peptide is shaken for 30 minutes with 3 ml of cleavage reagent, then it is suctioned off and 2.5 ml of cleavage reagent is added.
  • the product is filtered off with suction and the resin is treated for 1 and 2 hours with 2.5 ml of cleaving reagent.
  • the filtrates are evaporated, triturated with 3 ml of ether each time, the precipitates obtained are suction filtered through a P3 frit and washed 3 times with 2 ml of ether each time. After drying in a high vacuum for 16 hours, a total of 119 mg of peptide are obtained.

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Abstract

The invention relates to a method for the synthesis of biostatin (TT 232) using solid phase synthesis in a polymeric support by gradually forming a peptide using amino acids derived with protecting groups, wherein the protecting groups are cleaved and the peptide is separated from the solid phase, wherein the disulfide bridge is closed by oxidation of the totally or partially formed peptide in the presence of an adequate solvent while the peptide is still bonded in the solid phase.

Description

Verfahren zur Herstellung von BIOSTATIN (TT-232 Triacetat) und seine Analoga Process for the preparation of BIOSTATIN (TT-232 triacetate) and its analogues
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Biostatin mittels Festphasensynthese.The present invention relates to a method for the synthesis of biostatin by means of solid phase synthesis.
Zur Synthese von Peptiden sind dem Fachmann verschiedene Verfahren bekannt. Es handelt sich dabei zum einen um Flüssigphasenmethoden, welche auf Shemyakin (Tetrahedron Lett. ( 1 965) , 2323 f.) zurückgehen, und zum anderen um Festphasenverfahren, welche erstmals von Merrifield (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 ( 1 963) 21 49) beschrieben wurden.Various methods are known to the person skilled in the art for the synthesis of peptides. On the one hand, these are liquid-phase methods, which can be traced back to Shemyakin (Tetrahedron Lett. (1 965), 2323 f.), And on the other hand, solid-phase methods, which were first developed by Merrifield (RB Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1 963) 21 49).
Die Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasensynthese sind seither weiterentwickelt und erheblich verbessert worden, es wird hierzu beispielsweise auf "Peptide, Chemie und Biologie", Hans Dieter Jakubke, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg-Berlin-Oxford, 1 996, ISBN 3-8274-0000-7 verwiesen. Dieses Lehrbuch beschreibt Methoden der klassischen als auch der Merrifield-Peptid-Synthese. Derzeit wird zur Peptidsynthese in erster Linie die Peptidsynthese in Lösung angewandt. Insbesondere bei der Synthese von Peptiden, welche mindestens eine Disulfidbrücke ausbilden sollen, besteht im Hinblick auf die Synthese in Lösung allerdings der der Methode inhärente Nachteil, daß diese Disulfidbrücke durch Oxidation in hoher Verdünnung gebildet werden muß. Dies ist im klassischen Verfahren der Peptidsynthese in Lösung nötig, um die erforderliche örtliche Trennung der einzelnen Reaktionszentren zu bewirken und damit eine effektive Cyclisierung zu ermöglichen.The methods of solid-phase and liquid-phase synthesis have since been further developed and significantly improved, for example, "Peptides, Chemistry and Biology", Hans Dieter Jakubke, Spectrum Academic Publishing House Heidelberg-Berlin-Oxford, 1 996, ISBN 3-8274-0000 -7 referenced. This textbook describes methods of classic as well as Merrifield peptide synthesis. Currently, peptide synthesis in solution is primarily used for peptide synthesis. Particularly in the synthesis of peptides which are to form at least one disulfide bridge, there is, however, the inherent disadvantage of the method with regard to synthesis in solution, that this disulfide bridge must be formed by oxidation in high dilution. In the classic method of peptide synthesis in solution, this is necessary in order to achieve the required local separation of the individual reaction centers and thus to enable effective cyclization.
Das Peptid Biostatin (TT-232) ist ein Analogon des Somatostatins und weist starke in vitro und in vivo Antitumoraktivität auf. Somatostatin ist ein natürlich vorkommendes Tetradecapeptid, welches die Bildung von Wachstumshormon und die Sekretion weiterer endokriner Moleküle, wie z.B. Glucagon, Insulin und Gastrin, inhibiert. Somatostatin inhibiert oder reguliert einige Zellfunktionen und es wurde darüber hinaus festgestellt, daß es wichtige endogene antiproiiferative Aktivität entfaltet. Es wurde außerdem ein inhibitorischer Effekt von Somatostatin und seinen Analoga auf Tumoren gezeigt. In den letzten Jahren wurden einige Somatostatinanaloga entwickelt, welche längere Wirkungszeiten als das native Hormon und bessere Antitumorwirksamkeit aufweisen. Es wurde daher viel Mühe aufgewandt, tumorselektive Somatostatinanaloga zu entwickeln, wobei insbesondere auch die leichte Herstellbarkeit eine Rolle spielt.The peptide biostatin (TT-232) is an analogue of somatostatin and has strong in vitro and in vivo antitumor activity. Somatostatin is a naturally occurring tetradecapeptide that inhibits the formation of growth hormone and the secretion of other endocrine molecules, such as glucagon, insulin and gastrin. Somatostatin inhibits or regulates some cell functions and has also been found to display important endogenous antiproiiferative activity. An inhibitory effect of somatostatin and its analogues on tumors has also been shown. In the past few years, some somatostatin analogues have been developed which have longer action times than the native hormone and better anti-tumor activity. A great deal of effort was therefore devoted to developing tumor-selective somatostatin analogs, the ease of manufacture also playing a role in particular.
Eines dieser Analoga ist ein Molekül mit einer 5-Ringstruktur mit der folgenden Sequenz:One of these analogs is a molecule with a 5-ring structure with the following sequence:
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2.D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH 2 .
Das Molekül wurde TT-232 bzw. Biostatin genannt. Dieses Somatostatin- analogon hat praktisch keinen inhibitorischen Effekt auf die Wachstumshor- monsfreisetzung, zeigt aber starke Antitumorwirksamkeit in vivo und in vitro und induziert die Apoptose. Die Verbindung inhibiert die Tyrosinkinase- Aktivität verschiedener menschlicher Darmtumorzellinien, wobei diese Inhibition sehr gut mit der beobachteten Inhibition der Zellproliferation übereinstimmte.The molecule was called TT-232 or Biostatin. This somatostatin analog has practically no inhibitory effect on growth hormone release, but shows strong antitumor activity in vivo and in vitro and induces apoptosis. The compound inhibits the tyrosine kinase activity of various human intestinal tumor cell lines, this inhibition being in very good agreement with the observed inhibition of cell proliferation.
Die Herstellung von Octa- bzw. Heptapeptid-Derivaten wird beispielsweise in der EP-A-0 505 680 beschrieben. Dort wird aber für eine effektive Cyclisierung über die beiden Cystein-reste das Peptid zuerst von der festen Phase abgetrennt, die Lösung stark verdünnt und dann die Oxidation bewirkt. Diese Art der Herstellung erfordert aber weitere Auf konzentrations- und Reinigungsschritte.The production of octa or heptapeptide derivatives is described for example in EP-A-0 505 680. There, however, for an effective cyclization via the two cysteine residues, the peptide is first separated from the solid phase, the solution is greatly diluted and then the oxidation is effected. However, this type of production requires further concentration and cleaning steps.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, durch welches Biostatin besonders leicht und mit besonders hoher Ausbeute an freigesetztem Peptidamid nach der Disulfidoxidation erhalten werden kann.CORRECTED SHEET (RULE 91) ISA / EP It was therefore an object of the present invention to provide a process by which biostatin can be obtained particularly easily and with a particularly high yield of peptide amide released after the disulfide oxidation.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Synthese von Biostatin (TT 232) mittels Festphasensynthese an einem polymeren Träger durch stufenweises Aufbau des Peptids unter Verwendung von mit Schutzgruppen derivatisierten Aminosäuren, wonach die Schutzgruppen abgespalten und das Peptid von der Festphase abgelöst wird, wobei die Disulfidbrücke durch Oxidation des vollständig oder teilweise aufgebauten Peptids in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels geschlossen wird solange das Peptid noch an die feste Phase gebunden vorliegt.This object is achieved according to the invention by a process for the synthesis of biostatin (TT 232) by means of solid phase synthesis on a polymeric support by stepwise construction of the peptide using amino acids derivatized with protective groups, after which the protective groups are split off and the peptide is detached from the solid phase, the Disulfide bridge is closed by oxidation of the fully or partially constructed peptide in the presence of a suitable solvent as long as the peptide is still bound to the solid phase.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandte Festphasensynthese kann in dem Fachmann an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die hierfür geeigneten Festphasenmaterialien, die benötigten Reagenzien, Puffer, Reaktionsbedingungen und einzusetzenden Schutz- gruppen für die Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.The solid phase synthesis used in the process according to the invention can be carried out in a manner known per se to the person skilled in the art. The suitable solid phase materials, the required reagents, buffers, reaction conditions and protective groups to be used for the amino acids are known to the person skilled in the art.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Feststellung, daß die örtliche Trennung der Reaktionszentren bei der Bildung der Disulfidbrücken in Biostatin in ausreichender Weise gewährleistet ist, wenn die Oxidation erfolgt, solange das Peptid noch an die feste Phase gebunden ist.The method according to the invention is based on the finding that the spatial separation of the reaction centers in the formation of the disulfide bridges in biostatin is sufficiently ensured if the oxidation takes place as long as the peptide is still bound to the solid phase.
Im Rahmen der Erfindung ist es sowohl möglich, direkt nach Synthese desjenigen Teils von Biostatin, welcher die zu verbrückenden Sulfhydryl- gruppen enthält, eine Oxidation und damit Ausbildung der Disulfidbrücke zu bewirken, und dann das Peptid fertig zu synthetisieren, als auch zuerst das vollständige Peptid zu synthetisieren und danach die Oxidation durchzufüh- ren. Maßgeblich ist jedoch, daß die Oxidation erfolgen muß, solange das Peptid festphasen-gebunden vorliegt.Within the scope of the invention, it is possible both to effect oxidation and thus formation of the disulfide bridge and then to completely synthesize the peptide directly after synthesis of that part of biostatin which contains the sulfhydryl groups to be bridged, and first to synthesize the complete peptide to synthesize and then carry out the oxidation Ren. It is essential, however, that the oxidation must take place as long as the peptide is bound to the solid phase.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die Oxidation vor Abspaltung der Schutzgruppen des Peptids durchzuführen.In the context of the present invention, it is preferred to carry out the oxidation before the protective groups of the peptide are split off.
Zur Oxidation können alle auch bisher bereits für in Lösung durchgeführte Verfahren bekannte Oxidationsmittel eingesetzt werden. Geeignete Oxidationsmittel sind dem Fachmann daher bekannt. Beispiele für derartige Oxidationsmittel sind Silber-, Quecksilber- oder Thalliumsalze, Jod, Peroxide oder Sauerstoff. Diese Oxidationsmittel werden in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches angewandt.For oxidation, all oxidizing agents that have already been known for processes carried out in solution can be used. Suitable oxidizing agents are therefore known to the person skilled in the art. Examples of such oxidizing agents are silver, mercury or thallium salts, iodine, peroxides or oxygen. These oxidizing agents are used in the presence of a suitable solvent or solvent mixture.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt als Oxidationsmittel Jod, beispielsweise in essigsaurer Lösung oder in einem Lösungsmittel auf Basis von N,N-Dimethylformamid eingesetzt.In the context of the present invention, iodine is particularly preferably used as the oxidizing agent, for example in acetic acid solution or in a solvent based on N, N-dimethylformamide.
Nach abgeschlossener Oxidation erfolgen Waschungen des polymergebundenen Peptids mit verschiedenen Lösungmitteln bzw. Lösungsmittelgemi- sehen. Hierzu können z.B. N,N-Dimethylformamid, Methanol, Essigsäure und Wasser oder aber auch Lösungen von komplexierenden Reagenzien oder Reduktionsmitteln, wie insbesondere Thiosulfat oder Ascorbinsäure eingesetzt werden.After the oxidation is complete, the polymer-bound peptide is washed with various solvents or solvent mixtures. For this, e.g. N, N-dimethylformamide, methanol, acetic acid and water or else solutions of complexing reagents or reducing agents, such as in particular thiosulfate or ascorbic acid, can be used.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft an einer festen Phase durchgeführt, welche eine säurelabile Ankergruppe (aeid labile anchoring bond, ALAB) aufweist. Besonders bevorzugt wird als feste Phase ein Polymer, insbesondere Polystyrol, eingesetzt. Vorteilhaft können auch modifizierte Harze verwendet werden, wie Aminomethylpolystyrol (AMPS), Benzhydrylamin-(BHA-PS) und Methylbenzhydrolamino-polystyrol (MBHA- PS) . Die feste Phase kann dabei in für die Festphasensynthese üblicher Form eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Festphase in Form von Kügelchen, sogenannter "Beads", eingesetzt.The process according to the invention is advantageously carried out on a solid phase which has an acid labile anchoring bond (ALAB). A polymer, in particular polystyrene, is particularly preferably used as the solid phase. Modified resins such as aminomethyl polystyrene (AMPS), benzhydrylamine (BHA-PS) and methylbenzhydrolamino-polystyrene (MBHA-PS) can also be used advantageously. The solid phase can be in the form customary for solid phase synthesis be used. The solid phase is preferably used in the form of beads, so-called "beads".
Geeignete Ankergruppen sind in der Festphasenchemie übliche Anker, welche die Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger in einfacher Weise erlauben. Besonders bevorzugt sind im Rahmen der Erfindung Ankergruppen, welche die Abspaltung des Peptids als Amid ermöglichen. Beispielhafte mit einer säurelabilen Ankergruppe derivatisierte Polymere (ALAB-P) sind 5-(9-amino)xanthen-2yl-)oxyveryI-4'-methyl-benzhydrylamino- polystyrol und 4-(2',4'-dimethoxyphenyl)-aminomethyl-phenoxyacetyl-4"- methyl benzhydrylamino-polystyrol.Suitable anchor groups are anchors customary in solid-phase chemistry, which allow the peptide to be split off from the polymeric support in a simple manner. Within the scope of the invention, anchor groups are particularly preferred which enable the peptide to be split off as an amide. Exemplary polymers derivatized with an acid labile anchor group (ALAB-P) are 5- (9-amino) xanthene-2yl-) oxyveryI-4'-methyl-benzhydrylamino-polystyrene and 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl) aminomethyl- phenoxyacetyl-4 "- methyl benzhydrylamino polystyrene.
Besonders bevorzugte Ankergruppierungen sind desweiteren 4-Hydroxyme- thyl-benzoesäure (HBMA) , 9-Amino-xanthenyl-3-hydrol (Xant) oder p[(R, 5)- -( 1 -(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxy- essigsäure [MEOBP]. Am meisten bevorzugt sind im Rahmen der Erfindung die Xant- und die MEOBP-Gruppierung.Particularly preferred anchor groups are also 4-hydroxymethylbenzoic acid (HBMA), 9-amino-xanthenyl-3-hydrol (Xant) or p [(R, 5) - - (1 - (9H-fluoren-9-yl) methoxyformamido] -2,4-dimethoxybenzyl] phenoxyacetic acid [MEOBP] Most preferred in the context of the invention are the Xant and MEOBP groups.
Die Synthese wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt mit der Fmoc-/tert. Butyl-Strategie durchgeführt. Dies bedeutet, daß die zum Aufbau des Peptids benötigten Aminosäuren an der Aminogruppe mit einer Fmoc-Schutzgruppe und an den Seitenkettengruppierungen mit tert. Butylgruppen derivatisiert sind . Die Fmoc-Schutzgruppe ist dabei eine temporäre Schutzgruppe, da sie bei der Ausbildung des Peptids abgespalten wird, und lediglich eine Fmoc-Gruppe am N-Terminus des synthetisierten, festphasengebundenen Peptids verbleibt.The synthesis in the process according to the invention is preferably carried out using the Fmoc / tert. Butyl strategy carried out. This means that the amino acids required to build up the peptide have an Fmoc protecting group on the amino group and tert on the side chain groups. Butyl groups are derivatized. The Fmoc protective group is a temporary protective group since it is split off during the formation of the peptide and only one Fmoc group remains at the N-terminus of the synthesized, solid-phase-bound peptide.
Die Sulfhydrylgruppen der Cysteine werden vorteilhaft mit Trityl- oder Acm- schutzgruppen derivatisiert. Es ist außerdem besonders bevorzugt, die N- terminal letzte Aminosäure im Sequenzaufbau als N-alpha Boc-geschütztes Aminosäurederivat einzusetzen. Im Rahmen des erfindungegemäßen Syntheseverfahrens werden die folgenden Schritte durchlaufen:The sulfhydryl groups of the cysteines are advantageously derivatized with trityl or Acm protective groups. It is also particularly preferred to use the N-terminal last amino acid in the sequence structure as an N-alpha Boc-protected amino acid derivative. The following steps are carried out in the context of the synthesis method according to the invention:
1 . Beladung des polymeren Tragers mit dem Anker und/oder dem ersten Aminosäurederivat1 . Loading of the polymeric carrier with the anchor and / or the first amino acid derivative
2. Aufbau der Peptidsequenz2. Structure of the peptide sequence
3. Knüpfung der Disulfidbrücke3. Formation of the disulfide bridge
4. Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger und/oder der Schutzgruppenabspaltung 5. Schutzgruppenabspaltung (sofern nicht bereits unter 4. erfolgt) .4. Cleavage of the peptide from the polymeric carrier and / or the deprotection 5. Cleavage of the protecting group (if not already under 4.).
Zur Abspaltung der im synthetisierten Peptid enthaltenen Schutzgruppen können literaturbekannte Methoden, z.B. Zugabe von verdünnter Piperidinlö- sung, angewandt werden.To remove the protective groups contained in the synthesized peptide, methods known from the literature, e.g. Add diluted piperidine solution.
Die Abspaltung der Peptide vom polymeren Träger erfolgt ebenfalls nach an sich bekannten Methoden. Im Fall der säurelabilen Ankergruppen erfolgt die Abspaltung sauer, besonders bevorzugt mit konzentrierter oder verdünnter Trifluoressigsäure.The peptides are also cleaved from the polymeric support by methods known per se. In the case of the acid-labile anchor groups, the cleavage is acidic, particularly preferably with concentrated or dilute trifluoroacetic acid.
Die Abspaltung der Schutzgruppen der von der Festphase gelösten Peptide erfolgt in der Regel ebenfalls durch Säurezugabe, bevorzugt wiederum mittels Trifluoressigsäure. Nach der Abspaltung der Peptide können gewünschtenfalls weitere Reinigungs- oder/und Konzentrationsschritte durchgeführt werden. Eine Reinigung kann hierbei vorteilhaft mittels präparativer HPLC erfolgen.The protective groups of the peptides detached from the solid phase are usually also cleaved by adding acid, preferably again using trifluoroacetic acid. After the peptides have been split off, further purification and / or concentration steps can be carried out, if desired. Cleaning can advantageously be carried out by means of preparative HPLC.
Die Synthese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von Fmoc-Threonin(tert.butyl- ether)amid aus, welches kovalent an eine Polystyrol-Festphase über eine säurelabile Xanthenyl-Ankergruppierung gebunden ist. In der Folge werden die einzelnen geschützten Aminosäuren zugegeben unter Bildung eines Festphasen-gebundenen geschützten Peptids. Zur Ausbildung der Disulfidbrücke wird das Heptapeptid sodann an der Festphase durch Zugabe von Jod/N, N-Dimethylformamid oder Essigsäure oxidiert und das cyclisierte Heptapeptid durch Säurebehandlung vom Träger abgelöst. Gleichzeitig werden alle Schutzgruppen an Seitenketten des Peptids abgespalten.In a particularly preferred embodiment, the synthesis according to the process according to the invention starts from Fmoc-threonine (tert.butyl ether) amide, which is covalently bound to a polystyrene solid phase via an acid-labile xanthenyl anchor grouping. The individual protected amino acids are subsequently added to form a solid-phase-bound protected peptide. To form the disulfide bridge, the heptapeptide is then oxidized on the solid phase by adding iodine / N, N-dimethylformamide or acetic acid and the cyclized heptapeptide is detached from the support by acid treatment. At the same time, all protective groups on side chains of the peptide are split off.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.The following examples are intended to explain the invention further.
Beispiel 1 :Example 1 :
Stufe 1 , Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe vom LinkerStage 1, separation of the Fmoc protecting group from the linker
395g Fmoc-MEOBP-MBHA-Harz (Beladung 0,84 mmol/g) werden unter Verwendung von 1 , 5 I N. N-Dimethylformamid in ein mit einer Bodenfritte versehenes Reaktionsgefäß überführt und durch Taumeln gemischt; nach 5 Minuten wird abgesaugt. Die Taumelbewegung wird während aller Wasch- und Reaktionsschritten aufrechterhalten. Es folgt ein DMF-Waschschritt, dazu werden 1 ,5 I N. N-Dimethylformamid in das Reaktionsgefäß gefüllt, nach 5 Minuten wird das N. N-Dimethylformamid abgesaugt. Es werden 1 ,5 I 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt und erneut 1 , 5 I 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 30 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt und erneut 1 , 5 L 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt, anschließend werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.395 g of Fmoc-MEOBP-MBHA resin (loading 0.84 mmol / g) are transferred into a reaction vessel provided with a bottom frit using 1.5 l of N.N-dimethylformamide and mixed by tumbling; after 5 minutes it is suctioned off. The tumbling motion is maintained during all washing and reaction steps. A DMF washing step follows, 1.5 l of N.N-dimethylformamide are poured into the reaction vessel, and after 5 minutes the N.N-dimethylformamide is suctioned off. 1.5 l of 50% piperidine in N. N-dimethylformamide (v / v) are added. After 5 minutes, the piperidine solution is suctioned off and again 1.5 l of 50% piperidine in N. N-dimethylformamide (v / v) are added. After 30 minutes, the piperidine solution is suctioned off and 1.5 L of 50% piperidine in N. N-dimethylformamide (v / v) is added again. After 5 minutes, the piperidine solution is suctioned off, then 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 2, Kupplung von Fmoc-Thr(tBu)Stage 2, coupling of Fmoc-Thr (tBu)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1 ) werden folgende Lösungen vorbereitet: 267, 1 g (672 mmol) Fmoc-Thr(tBu) in 375 ml N.N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N.N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 ) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc elimination (stage 1): 267.1 g (672 mmol) of Fmoc-Thr (tBu) in 375 ml NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) HOBt * H 2 0 in 250 ml NN-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 1), then 228.7 ml DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete turnover, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 3, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 3, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 1 beschrieben abgespalten, wobei bei dem DMF-feuchten Harz auf den einleitenden Quellvorgang verzichtet wird.The Fmoc protective group is split off as described in step 1, the initial swelling process being dispensed with in the DMF-moist resin.
Stufe 4, Kupplung yon Fmoc-Cys(Trt)Stage 4, coupling of Fmoc-Cys (Trt)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 3) werden folgende Lösungen vorbereitet: 393,6 g (672 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 375 N.N-Dimethylformamid, 104,4g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N. N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 3) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 1 96,8 g (336 mmol) Fmoc-Cys(Trt) in 250 ml N.N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 1 25 ml N. N-Dimethylformamid und 1 07,9 g TBTU in 375 ml N.N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunde Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 3): 393.6 g (672 mmol) of Fmoc-Cys (Trt) in 375 NN-dimethylformamide, 104.4 g (672 mmol) of HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml N. N-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (stage 3), then 228.7 ml DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a recoupling is carried out using the following solutions: 1 96.8 g (336 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml of N.N-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml of NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and free Amino groups examined. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 5, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 5, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 6, Kupplung von Fmoc-Lys(Boc)Stage 6, coupling of Fmoc-Lys (Boc)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 5) werden folgende Lösungen vorbereitet: 31 4,9 g (672 mmol) Fmoc-Lys(Boc) in 500 ml N. N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt* H20 in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N. N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 5) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 1 57,4 g (336 mmol) Fmoc-Lys(Boc) in 250 ml N.N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt* H20 in 1 25 ml N.N-Dimethylformamid und 1 07,9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 5): 31 4.9 g (672 mmol) of Fmoc-Lys (Boc) in 500 ml of N.N-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml N. N-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 5), then 228.7 ml DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a recoupling is carried out using the following solutions: 1 57.4 g (336 mmol) Fmoc-Lys (Boc) in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml N. N-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete turnover, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 7, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 7, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten. Stufe 8, Kupplung von Fmoc-D-TrpThe Fmoc protecting group is split off as described under stage 3. Stage 8, coupling of Fmoc-D-Trp
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 7) werden folgende Lösungen vorbereitet: 286,8 g (672 mmol) Fmoc-D-Trp in 500 ml N.N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N.N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 7) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 1 43,3 g (336 mmol) Fmoc-D-Trp in 250 ml N.N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 1 25 ml N.N-Dimethylformamid und 107,9 g TBTU in 375 ml N.N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 7): 286.8 g (672 mmol) of Fmoc-D-Trp in 500 ml of NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) of HOBt * H 2 0 in 250 ml of NN-dimethylformamide and 21 5.8 g of TBTU in 750 ml of NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 7), then 228.7 ml DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 43.3 g (336 mmol) Fmoc-D-Trp in 250 ml NN-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml of NN-dimethylformamide and 107.9 g of TBTU in 375 ml of NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 9, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeLevel 9, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 1 0, Kupplung von Fmoc-Tyr(tBu)Stage 1 0, coupling of Fmoc-Tyr (tBu)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 9) werden folgende Lösungen vorbereitet: 308,8 g (672 mmol) Fmoc-Tyr(tBu) in 500 ml N.N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 9) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 1 54,4 g (336 mmol) Fmoc-Tyr(tBu) in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 1 25 ml N.N-Dimethylformamid und 1 07,9 g TBTU in 375 ml N.N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 9): 308.8 g (672 mmol) of Fmoc-Tyr (tBu) in 500 ml of NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) of HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 9), then 228.7 ml DIEA. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 54.4 g (336 mmol) Fmoc-Tyr (tBu) in 250 ml N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 1 1 , Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 1 1, splitting off the Fmoc protective group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 1 2, Kupplung von Fmoc-Cys(Trt)Stage 1 2, coupling of Fmoc-Cys (Trt)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufel 1 ) werden folgende Lösungen vorbereitet: 393,6 g (672 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 500 ml N.N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 1 ) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 1 96,8 g (336 mmol) Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 1 25 ml N.N-Dimethylformamid und 1 07,9 g TBTU in 375 ml N. N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.The following solutions are prepared during the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 1): 393.6 g (672 mmol) of Fmoc-Cys (Trt) in 500 ml of NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) of HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (stage 11), then 228.7 ml of DIEA are added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 1 96.8 g (336 mmol) of Fmoc-Cys (Trt) in 250 ml of N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) of HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 375 ml N. N-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After 1 hour A reaction time sample is taken from a resin, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 1 3, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeLevel 1 3, removal of the Fmoc protective group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespaltenThe Fmoc protecting group is split off as described under stage 3
Stufe 1 4, Kupplung von Boc-D-PheStage 1 4, coupling of Boc-D-Phe
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufel 1 ) werden folgende Lösungen vorbereitet: 1 78,3 g (672 mmol) Boc-D-Phe in 500 ml N.N-Dimethylformamid, 1 04,4 g (672 mmol) HOBt*H20 in 250 ml N. N-Dimethylformamid und 21 5,8 g TBTU in 750 ml N.N-Dimethylformamid. Die vorbereiteten Lösungen werden in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 1 ) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 228,7 ml DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt unvollständigen Umsatz, es wird eine Nachkupplung unter Verwendung folgender Lösungen durchgeführt: 89, 1 g (336 mmol) Boc- D-Phe in 250 ml N. N-Dimethylformamid, 52,2 g (336 mmol) HOBt*H20 in 1 25 ml N.N-Dimethylformamid und 1 07,9 g TBTU in 400 ml N.N-Dimethylformamid. Diese Lösungen werden in das Reaktionsgefäß gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 1 1 4,3 ml DIEA. Nach 1 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 4 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 1) the following solutions are prepared: 1 78.3 g (672 mmol) Boc-D-Phe in 500 ml NN-dimethylformamide, 1 04.4 g (672 mmol) HOBt * H 2 0 in 250 ml N. N-dimethylformamide and 21 5.8 g TBTU in 750 ml NN-dimethylformamide. The prepared solutions are added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (stage 11), then 228.7 ml of DIEA are added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows incomplete conversion, a subsequent coupling is carried out using the following solutions: 89.1 g (336 mmol) Boc-D-Phe in 250 ml N. N-dimethylformamide, 52.2 g (336 mmol) HOBt * H 2 0 in 1 25 ml NN-dimethylformamide and 1 07.9 g TBTU in 400 ml NN-dimethylformamide. These solutions are added to the reaction vessel, then 1 1 4.3 ml DIEA is added. After a reaction time of 1 hour, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete turnover, 4 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 1 5, Umsetzung mit Boc20Level 1 5, implementation with Boc 2 0
Das aus Stufe 1 4 resultierende Produkt wird mit 4 I N.N-Dimethylformamid versetzt und 20 Minuten agititiert. Dann werden 400 g Boc20 zugegeben, nach 5 Minuten werden in 5 Minuten Abstand 3 Portionen DIEA a 200 ml zugegeben. Nach 1 000 Minuten wird abgesaugt, es folgen 5 DMF-Waschschritte (s.o.) a 3 l und 3 analoge MeOH-Waschschritte wobei jeweils 2,5 I MeOH eingesetzt werden. Nach 1 6 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden 833 g polymergebundenes Peptid erhalten.The product resulting from step 1 4 is mixed with 4 l of NN-dimethylformamide and agitated for 20 minutes. Then 400 g of Boc 2 0 are added, after 5 minutes, 3 portions of DIEA a 200 ml are added every 5 minutes. After 1,000 minutes, the product is suctioned off, followed by 5 DMF washing steps (see above) of 3 l and 3 analogous MeOH washing steps, each using 2.5 l of MeOH. After drying under high vacuum for 16 hours, 833 g of polymer-bound peptide are obtained.
Stufe 1 6, Knüpfung der DisulfidbrückeLevel 1 6, formation of the disulfide bridge
Zu 833 g polymergebundenem Peptid (0,37 mmol Peptid/g Peptid-Träger- konjugat) aus Stufe 1 5 wird eine Lösung von 41 6, 5 g Jod in 6 I N.N-Dimethylformamid gegeben. Nach 60 Minuten wird abgesaugt und mit 8 I N. N-Dimethylformamid versetzt. Nach 60 Minuten wird abgesaugt, es folgen 4 DMF-Waschschritte (s.o.) a 8 I. Folgende Prozedur wird 3 mal durchgeführt: Es werden 8 I N. N-Dimethylformamid und 2 I 1 0 %ige Na2S203-Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten wird abgesaugt, es folgen 3 Waschschritte mit einer Mischung aus 8 I N.N-Dimethylformamid und 2 I Wasser sowie 2 DMF-Waschschritte a 8 I. Anschließend wird je 3 mal mit Wasser, Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 672,4 g (0,45 mmol Peptid/g Peptid- Trägerkonjugat) .A solution of 41 6.5 g of iodine in 6 l of NN-dimethylformamide is added to 833 g of polymer-bound peptide (0.37 mmol of peptide / g of peptide-carrier conjugate) from stage 15. After 60 minutes, the product is filtered off with suction and mixed with 8 l of N.N-dimethylformamide. After 60 minutes, the product is suctioned off, followed by 4 DMF washing steps (see above) of 8 I. The following procedure is carried out 3 times: 8 I N. N-dimethylformamide and 2 I 1 0% Na 2 S 2 0 3 solution admitted. After 5 minutes, the product is filtered off with suction, followed by 3 washing steps with a mixture of 8 l of NN-dimethylformamide and 2 l of water and 2 DMF washing steps of 8 l each High vacuum dried. Weigh out 672.4 g (0.45 mmol peptide / g peptide-carrier conjugate).
Stufe 1 7, Abspaltung vom PolymerStage 1 7, cleavage from the polymer
Zu 672,4 g polymergebundenem Peptid aus Stufe 1 6 wird eine Lösung von je 1 20 ml m-Cresol und Wasser in 6 I Trifluoressigsäure (Abspaltreagenz) gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach saugt man ab und versetzt das Harz erneut mit Abspaltreagenz. Die erste Nachspaltung wird nach 30 Minuten abgesaugt, es folgen Nachspaltungen von einer bzw. zwei Stunden Dauer. Die jeweiligen Filtrate werden am Rotationsverdampfer bei 30 ° C Wasserbadtemperatur im Wasserstrahlvakuum eingedamft. Der Rückstand wird mit 3 I Ether verrührt, über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 1 , 5 I Ether gewaschen. Nach 1 6 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden insgesamt 231 ,85 g Peptid erhalten.A solution of 1 20 ml each of m-cresol and water in 6 l of trifluoroacetic acid (cleaving reagent) is added to 672.4 g of polymer-bound peptide from stage 1 6 and shaken at room temperature for 30 minutes. Then it is suctioned off and the resin is again mixed with a releasing reagent. The first post-splitting is aspirated after 30 minutes, followed by post-splitting lasting one or two hours. The respective filtrates are evaporated on a rotary evaporator at 30 ° C water bath temperature in a water jet vacuum. The residue is stirred with 3 l of ether, suction filtered through a P3 frit and washed 3 times with 1.5 l of ether. After 1 6 hourly drying in a high vacuum gives a total of 231.85 g of peptide.
Ausbeute: 1 3,4% d.Th. über alle Stufen, 14,8% bezogen auf die Abspal- tungYield: 1 3.4% of theory across all levels, 14.8% related to the spin-off
Beispiel 2:Example 2:
Stufe 1 , Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe vom LinkerStage 1, separation of the Fmoc protecting group from the linker
3,64 g Fmoc-XANT-Harz (Beladung 0,55 mmol/g) werden unter Verwendung von 25 ml N.N-Dimethylformamid in ein mit einer Bodenfritte versehenes Reaktionsgefäß überführt, geschüttelt; nach 5 Minuten wird abgesaugt. Das Schütteln wird während allen Wasch- und Reaktionsschrit- ten aufrechterhalten. Es folgt ein DMF-Waschschritt, dazu werden 25 ml N.N-Dimethylformamid in das Reaktionsgefäß gefüllt, nach 5 Minuten wird das N. N-Dimethylformamid abgesaugt. Es werden 25 ml 50 % Piperidin in N. N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt und erneut 25 ml 50 % Piperidin in N.N-Dimethylform- amid (v/v) zugegeben. Nach 25 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt und 25 ml 50 % Piperidin in N.N-Dimethylformamid (v/v) zugegeben. Nach 5 Minuten wird die Piperidinlösung abgesaugt, anschließend werden 5 DMFWaschschritte (s.o.) durchgeführt.3.64 g of Fmoc-XANT resin (loading 0.55 mmol / g) are transferred into a reaction vessel provided with a bottom frit using 25 ml of N.N-dimethylformamide, shaken; after 5 minutes it is suctioned off. The shaking is maintained during all washing and reaction steps. A DMF washing step follows, 25 ml of N.N-dimethylformamide are poured into the reaction vessel, and after 5 minutes the N.N-dimethylformamide is suctioned off. 25 ml of 50% piperidine in N. N-dimethylformamide (v / v) are added. After 5 minutes, the piperidine solution is suctioned off and 25 ml of 50% piperidine in N.N-dimethylformamide (v / v) are added again. After 25 minutes, the piperidine solution is suctioned off and 25 ml of 50% piperidine in N.N-dimethylformamide (v / v) are added. After 5 minutes, the piperidine solution is suctioned off, then 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 2, Kupplung von Fmoc-Thr(tBu)Stage 2, coupling of Fmoc-Thr (tBu)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1 ) werden 2,39 g (6 mmol) Fmoc-Thr(tBu) , 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU in 1 5 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 ) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 1), 2.39 g (6 mmol) of Fmoc-Thr (tBu), 1.12 g (7.2 mmol) HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 1), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken and washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 3, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 3, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 1 beschrieben abgespalten, wobei bei dem DMF-feuchten Harz auf den einleitenden Quellvorgang verzichtet wird.The Fmoc protective group is split off as described in step 1, the initial swelling process being dispensed with in the DMF-moist resin.
Stufe 4, Kupplung von Fmoc-Cys(Trt)Stage 4, coupling of Fmoc-Cys (Trt)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 3) werden 3, 51 g (6 mmol) Fmoc-Cys (Trt), 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU in 1 5 ml N. N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 3) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 3), 3.51 g (6 mmol) of Fmoc-Cys (Trt), 1.12 g (7.2 mmol) of HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU dissolved in 1 5 ml N. N-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 3), then 2.04 ml (1 2 mmol) of DEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 5, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 5, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 6, Kupplung von Fmoc-Lys(Boc)Stage 6, coupling of Fmoc-Lys (Boc)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 5) werden 2,81 g (6 mmol) Fmoc-Lys(Boc), 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6,6 mmol) TBTU in 1 5 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 5) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04mL ( 1 2mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 5), 2.81 g (6 mmol) of Fmoc-Lys (Boc), 1.12 g (7.2 mmol) HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6.6 mmol) of TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 5), then 2.04 ml (1 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken and washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 7, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeStage 7, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 8, Kupplung von Fmoc-D-TrpStage 8, coupling of Fmoc-D-Trp
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 7) werden 2, 56 g (6 mmol) Fmoc-D-Trp, 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6,6 mmol) TBTU in 1 5 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 7) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 7), 2.56 g (6 mmol) of Fmoc-D-Trp, 1.12 g (7.2 mmol) of HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6.6 mmol) of TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 7), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 9, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeLevel 9, splitting off the Fmoc protecting group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 1 0, Kupplung von Fmoc-Tyr(tBu)Stage 1 0, coupling of Fmoc-Tyr (tBu)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 9) werden 2,76 g (6 mmol) Fmoc-Tyr (tBu), 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU in 1 5 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 9) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt. Stufe 1 1 , Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeDuring the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 9), 2.76 g (6 mmol) of Fmoc-Tyr (tBu), 1, 1 2 g (7.2 mmol) HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6, 6 mmol) TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 9), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out. Stage 1 1, splitting off the Fmoc protective group
Die Fmoc-Schutzrruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 1 2, Kupplung von Fmoc-Cys(Trt)Stage 1 2, coupling of Fmoc-Cys (Trt)
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1 1 ) werden 3,51 g (6 mmol) Fmoc-Cys(Trt), 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6,6 mmol) TBTU in 1 5 ml N. N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 1 ) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt.During the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 11), 3.51 g (6 mmol) of Fmoc-Cys (Trt), 1.12 g (7.2 mmol) of HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6.6 mmol) of TBTU dissolved in 1 5 ml of N. N-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 1 1), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out.
Stufe 1 3, Abspaltung der Fmoc-SchutzgruppeLevel 1 3, removal of the Fmoc protective group
Die Fmoc-Schutzgruppe wird wie unter Stufe 3 beschrieben abgespalten.The Fmoc protecting group is split off as described under stage 3.
Stufe 14, Kupplung von Boc-D-PheStage 14, coupling of Boc-D-Phe
Während der letzten DMF-Waschschritte der Fmoc-Abspaltung (Stufe 1 3) werden 1 ,59 g (6 mmol) Boc-D-Phe, 1 , 1 2 g (7,2 mmol) HOBt*H20 und 2, 1 2 g (6,6 mmol) TBTU in 1 5 ml N.N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird in das Reaktionsgefäß zu dem deblockierten Linkerpolymer (Stufe 1 3) gegeben, dann erfolgt die Zugabe von 2,04 ml ( 1 2 mmol) DIEA. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird eine Harzprobe entnommen, gewaschen und auf freie Aminogruppen untersucht. Der Kaisertest zeigt vollständigen Umsatz, es werden 5 DMF-Waschschritte (s.o.) durchgeführt. Stufe 1 5, Knüpfung der DisulfidbrückeDuring the last DMF washing steps of the Fmoc cleavage (stage 1 3), 1.59 g (6 mmol) of Boc-D-Phe, 1.12 g (7.2 mmol) of HOBt * H 2 0 and 2, 1 2 g (6.6 mmol) of TBTU dissolved in 1 5 ml of NN-dimethylformamide. This solution is added to the reaction vessel to the deblocked linker polymer (step 1 3), then 2.04 ml (1 2 mmol) DIEA is added. After a reaction time of 2 hours, a resin sample is taken, washed and examined for free amino groups. The Kaisertest shows complete conversion, 5 DMF washing steps (see above) are carried out. Level 1 5, formation of the disulfide bridge
Zu 5 g polymergebundenem Peptid (0,30 mMol Peptid/g Peptid-Trägerkon- jugat) aus Stufe 1 4 wird eine Lösung von 2,5 g Jod in 50 ml N.N-Dimethyl- formamid gegeben. Nach 60 Minuten wird abgesaugt und mit 50 ml N. N-Dimethylformamid versetzt. Nach 60 Minuten wird abgesaugt, es folgen 4 DMF-Waschschritte (s.o.) a 50 ml. Folgende Prozedur wird 3 mal durchgeführt: Es werden 1 6 ml N.N-Dimethylformamid und 4 ml 1 0 %ige Na2S203-Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten wird abgesaugt, es folgen 3 DMF-Waschschritte. Anschließend wird je 3 mal mit Wasser, Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 4, 1 g (0,34 mmol Peptid/g Peptid-Trägerkonjugat) .A solution of 2.5 g of iodine in 50 ml of NN-dimethylformamide is added to 5 g of polymer-bound peptide (0.30 mmol of peptide / g of peptide-carrier conjugate) from stage 1 4. After 60 minutes, the product is filtered off with suction and mixed with 50 ml of N. N-dimethylformamide. After 60 minutes, the product is suctioned off, followed by 4 DMF washing steps (see above) of 50 ml. The following procedure is carried out 3 times: 1 6 ml of NN-dimethylformamide and 4 ml of 10% Na 2 S 2 0 3 solution are added . After 5 minutes, suction is carried out, followed by 3 DMF washing steps. It is then washed 3 times with water, methanol, water and methanol and dried overnight under high vacuum. Weigh out 4.1 g (0.34 mmol peptide / g peptide-carrier conjugate).
Stufe 1 6, Abspaltung vom Polymer und anschließende Abspaltung der SchutzgruppenStage 1 6, elimination from the polymer and subsequent elimination of the protective groups
1 g polymergebundenes Peptid werden 1 0 mal für je 1 0 Minuten mit jeweils 5 ml 1 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan versetzt. Anschließend wird 3 mal mit 5 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgespalten. Die Abspaltlösungen werden gepoolt, eingedampft und 30 Minuten in 2, 5 ml Trifluoressigsäure gerührt. Dann wird in 20 ml Ether präzipitiert, über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 1 0 ml Ether gewaschen. Nach 1 6 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden 332 mg Peptid erhalten.1 g of polymer-bound peptide is mixed with 5 ml of 1% trifluoroacetic acid in dichloromethane 10 times for 10 minutes each. It is then split off 3 times with 5% trifluoroacetic acid in dichloromethane. The cleavage solutions are pooled, evaporated and stirred in 2.5 ml of trifluoroacetic acid for 30 minutes. Then it is precipitated in 20 ml of ether, suction filtered through a P3 frit and washed 3 times with 10 ml of ether each time. After drying under high vacuum for 16 hours, 332 mg of peptide are obtained.
Ausbeute: 23,9 % d.Th. über alle Stufen,Yield: 23.9% of theory across all levels,
33,0 % bezogen auf die Abspaltung33.0% related to the spin-off
Beispiel 3: Disulfid-Oxidation mit Thallium-trifluoracetatExample 3: Disulfide oxidation with thallium trifluoroacetate
Zunächst wird eine Festphasensynthese wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch an einem BHA-PS (Beladung 1 mmol/g) das mit MEOBP-Linker beladen wird. Es wird FmocCys(Acm) statt Fmoc-Cys(Trt) verwendet.First, a solid phase synthesis is carried out as described in Example 1, but with a BHA-PS (loading 1 mmol / g) MEOBP linker is loaded. FmocCys (Acm) is used instead of Fmoc-Cys (Trt).
136 mg TI(TFA)3 werden in 1 ml N.N-Dimethylformamid gelöst (Oxidations- lösung), 0,5 g polymergebundenes Peptid (0,38 mmol Peptid/g Peptid-Trä- gerkonjugat) werden 5 Minuten mit 3 ml N.N-Dimethylformamid geschüttelt, dann werden 0,725 ml Oxidationslösung zugegeben. Nach 30 minütigem Schütteln bei 25 °C wird abgesaugt, und mit je 5 ml der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 3x N.N-Dimethylformamid, 3x MeOH, 1 x 10% HAc in N.N-Dimethylformamid, 1 x 5 % EDTA in H20, 1 x 10 % HAc in N.N-Dimethylformamid, 1 x 5 % EDTA in H20, 1 x 10 % HAc in N.N-Dimethylformamid, 1 x 5 % EDTA in H20, 1 x H20, 3x 10 % HAc in MeOH, 3 x 10 % HAc in H20, 3 x N.N-Dimethylformamid, 3 x MeOH, 3 x H20, 3 x MeOH. Es wird über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Auswaage 420 mg (0,40 mmol Peptid/g Peptid-Trägerkonjugat).136 mg TI (TFA) 3 are dissolved in 1 ml NN-dimethylformamide (oxidation solution), 0.5 g polymer-bound peptide (0.38 mmol peptide / g peptide carrier conjugate) are mixed with 3 ml NN-dimethylformamide for 5 minutes shaken, then 0.725 ml of oxidizing solution are added. After shaking at 25 ° C for 30 minutes, the product is filtered off with suction and washed with 5 ml of the following solvents: 3x NN-dimethylformamide, 3x MeOH, 1 x 10% HAc in NN-dimethylformamide, 1 x 5% EDTA in H 2 0, 1 x 10% HAc in NN-dimethylformamide, 1 x 5% EDTA in H 2 0, 1 x 10% HAc in NN-dimethylformamide, 1 x 5% EDTA in H 2 0, 1 x H 2 0, 3x 10% HAc in MeOH, 3 x 10% HAc in H 2 0, 3 x NN-dimethylformamide, 3 x MeOH, 3 x H 2 0, 3 x MeOH. It is dried overnight under high vacuum. Weigh 420 mg (0.40 mmol peptide / g peptide-carrier conjugate).
Es werden 0,25 ml Triethylsilan mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt (Abspaltreagenz).0,4 g polymergebundenes Peptid werden 30 Minuten mit 3 ml Abspaltreagenz geschüttelt, dann wird abgesaugt und 2,5 ml Abspaltreagenz zugegeben. Nach 30 minütigem Schütteln wird abgesaugt, und das Harz noch 1 und 2 Stunden mit je 2,5 ml Abspaltreagenz behandelt. Die Filtrate werden eingedampft, mit je 3 ml Ether verrieben, die dabei anfallenden Niederschläge werden über eine P3-Fritte abgesaugt und 3 mal mit je 2 ml Ether gewaschen. Nach 16 stündigem Trocknen im Hochvakuum werden insgesamt 119 mg Peptid erhalten.0.25 ml of triethylsilane is mixed with 10 ml of trifluoroacetic acid (cleavage reagent). 0.4 g of polymer-bound peptide is shaken for 30 minutes with 3 ml of cleavage reagent, then it is suctioned off and 2.5 ml of cleavage reagent is added. After shaking for 30 minutes, the product is filtered off with suction and the resin is treated for 1 and 2 hours with 2.5 ml of cleaving reagent. The filtrates are evaporated, triturated with 3 ml of ether each time, the precipitates obtained are suction filtered through a P3 frit and washed 3 times with 2 ml of ether each time. After drying in a high vacuum for 16 hours, a total of 119 mg of peptide are obtained.
Ausbeute: 8,6 % d.Th. über alle Stufen,Yield: 8.6% of theory across all levels,
8,6 % bezogen auf die Abspaltung 8.6% based on the spin-off

Claims

Patentansprüche claims
1 . Verfahren zur Synthese von Biostatin (TT 232) mittels Festphasensynthese an einem polymeren Träger durch stufenweises Aufbau des Peptids unter Verwendung von mit Schutzgruppen derivatisierten Aminosäuren, wonach die Schutzgruppen abgespalten und das Peptid von der Festphase abgelöst wird, wobei die Disulfidbrücke durch Oxidation des vollständig oder teilweise aufgebauten Peptids in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels geschlossen wird solange das Peptid noch an die feste Phase gebunden vorliegt.1 . Process for the synthesis of biostatin (TT 232) by means of solid phase synthesis on a polymeric carrier by stepwise construction of the peptide using amino acids derivatized with protective groups, after which the protective groups are cleaved off and the peptide is detached from the solid phase, the disulfide bridge being completely or partially oxidized constructed peptide is closed in the presence of a suitable solvent as long as the peptide is still bound to the solid phase.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation nach Aufbau des vollständigen Peptids bewirkt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the oxidation is effected after the complete peptide has been built up.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation vor Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the oxidation takes place before the protective groups are split off.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Oxidation ein Silber-, Quecksilber- oder Thalliumsalz, Jod, ein Peroxid oder Sauerstoff, und insbesondere Jod in essigsaurer Lösung oder N, N-Dimethylformamid verwendet.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a silver, mercury or thallium salt, iodine, a peroxide or oxygen, and in particular iodine in acetic acid solution or N, N-dimethylformamide is used for the oxidation.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet. daß man als Festphase ein eine säurelabile Ankergruppierung aufweisendes Polystyrol verwendet.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized. that a polystyrene having an acid-labile anchor group is used as the solid phase.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die säurelabile Ankergruppierung eine Xanthyl- oder eine MEOBP- Gruppe umfaßt.6. The method according to claim 5, characterized in that the acid-labile anchor group comprises a xanthyl or a MEOBP group.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Synthese Aminosäuren verwendet, die durch eine Fmoc- Gruppierung an der Aminogruppe und durch tertiäre Butylgruppen an den Seitenketten geschützt sind.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that amino acids are used for the synthesis, which are protected by an Fmoc group on the amino group and by tertiary butyl groups on the side chains.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Sulfhydryl-Gruppen enthaltende Aminosäuren ebenfalls mit Schutzgruppen versehen verwendet.8. The method according to claim 7, characterized in that amino acids containing sulfhydryl groups are also provided with protective groups.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abspaltung des Peptids vom Polymer und die Abspaltung der Schutzgruppen gleichzeitig bewirkt.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cleavage of the peptide from the polymer and the cleavage of the protective groups is effected simultaneously.
1 0. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aufreinigung des hergestellten Peptids nach Abtrennung von der Festphase durchgeführt wird. 1 0. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a purification of the peptide produced is carried out after separation from the solid phase.
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