WO1999064072A1 - Konjugat, bestehend aus einem lektin und einem blutgerinnungsfaktor - Google Patents

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WO1999064072A1
WO1999064072A1 PCT/AT1999/000150 AT9900150W WO9964072A1 WO 1999064072 A1 WO1999064072 A1 WO 1999064072A1 AT 9900150 W AT9900150 W AT 9900150W WO 9964072 A1 WO9964072 A1 WO 9964072A1
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wga
dox
cells
lectin
pharmaceutical preparation
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PCT/AT1999/000150
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Peter Turecek
Franz Gabor
Michael Wirth
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Baxter Aktiengesellschaft
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Definitions

  • Conjugate consisting of a lectin and a blood coagulation factor
  • the invention relates to pharmaceutical preparations comprising lectins and pharmaceutical active ingredients.
  • drug targeting is based on the fact that many drugs are not selective with regard to their uptake or action loci in the cells. Particularly in the field of chemotherapy for cancer, the effect of the drug substances used in non-target cells leads to serious undesirable side effects that can endanger successful therapy (1).
  • the realization of the targeted delivery of drug substances to the specific target cells has hitherto been hindered by great difficulties in finding suitable carrier molecules which can interact specifically with the affected (target) cell.
  • monoclonal antibodies (2) and recombinant proteins (3) which can bind specifically to certain loci, have been established as promising candidates for active and targeted drug delivery.
  • colloidal particles such as albumin or polystyrene microspheres have also been used for passive drug transport in certain compartments (4,5).
  • Lectins which play an important role in biological signaling, cell / cell and cell / matrix interactions, are another group of molecules believed to be used for targeted drug delivery. It is known that lectins that were originally identified as proteins in plant extracts are able to bind to certain oligosaccharide groups (6). Using this carbohydrate-specific interaction, it was proposed to use lectins in a targeted "drug delivery" system (7), since the glycosylation pattern of cells is changed after malignant transformation (8).
  • WGA Wheat germ agglutinin
  • WGA is a dimen- res, carbohydrate-free protein, which consists of two identical subunits with a molecular weight of 35 kDa. Each monomeric subunit contains two identical and independent binding sites for N-acetyl-D-glucosamine (9). Since wheat germ, which contains around 300 mg WGA per kg (10), is part of normal human nutrition, the oral toxicity is negligible. WGA specifically binds to structures containing N-acetyl-D-glucose amine. It was found by saturation analyzes with fluorescence-labeled lectin that the WGA binding capacity of colon carcinoma cells (Caco-2 cells) is around 13 times higher than that of human colonocytes (11).
  • a pharmaceutical preparation which comprises a lectin to which the protein that can be obtained from blood, in particular in the blood coagulation factor or its recombinant equivalent, is bound in an administration-stable manner.
  • a lectin which is of plant origin is preferably used as the lectin, it being possible in particular to use plant lectins which are known as familiar food sources of humans, such as, for example, wheat, soybeans, rice, beans, barley, rye, etc.
  • plant lectins which are known as familiar food sources of humans, such as, for example, wheat, soybeans, rice, beans, barley, rye, etc.
  • the specificity of lectins has already been sufficiently described for most known lectins (cf. Stryer, Biochemistry, 2nd edition (1994), pages 311 and 359; Römpp, Chemielexikon, 10th edition (1997), pages 2382 to 2384 ), but can also be analyzed (e.g. for newly discovered lectins or for modified lectins) using known methods. This applies in particular to the respective binding specificities for certain carbohydrate structures from selected target cells.
  • WGA has proven particularly useful, since it has practically no oral toxicity and a high specificity towards malignant cells. In particular due to the high specificity compared to colon carcinoma cells, it is particularly suitable for the targeted drug delivery into these cells.
  • WGA also means chemically modified WGA molecules or WGA derivatives which have the essential properties of the (native) WGA or in which the binding specificity has been changed in a targeted and controlled manner.
  • target compartments are understood to mean, for example, cells, tissue or parts of a tissue, in particular blood or tissue fluids.
  • the preparations according to the invention show a high antiproliferative ratative effect on the target cells, since the conjugated protein that can be obtained from blood is easily and effectively absorbed into the target cell or the target compartments. There is therefore an intracellular accumulation of the preparations according to the invention.
  • the acid-labile ice-aconityl compound allows the protein that can be obtained from blood to be released only in the lysosomal region of the target cell.
  • any blood protein or its recombinant equivalent which can bind to lectins is suitable as a blood-obtainable protein for use in the present invention.
  • This binding even if it is not possible with the native lectins, can be made possible by modifying certain binding sites or amino acid side chains.
  • derived blood proteins that are suitable for the present invention and that can bind to lectins can also be "designed".
  • the lectin "drug targeting" according to the invention is suitable excellent for administering cytostatic agents or other cancer treatment agents.
  • Examples of the invention used according to the blood protein include blood clotting factors such as prothrombin, or factor V, VII, VIII, IX, X, XI, XII or XIII, vWF, inhibitors such as ATIII, or heparin, Protein C, Protein S, a ⁇ acid glycoprotein, or Tissue factors, and possibly precursors of these proteins.
  • blood clotting factors such as prothrombin, or factor V, VII, VIII, IX, X, XI, XII or XIII, vWF
  • inhibitors such as ATIII, or heparin
  • Protein C Protein S
  • a ⁇ acid glycoprotein a ⁇ acid glycoprotein
  • Tissue factors and possibly precursors of these proteins.
  • DOX doxorubicin
  • WGA water-soluble prodrug
  • the cytostatic effect of the drug in conjugate form on carcinoma cells is at least 1.5 times higher than that of the free cytostatic.
  • the antiproliferative effect of DOX-WGA on lymphoblasts is 65% less than that of the free active substance.
  • the targeted delivery according to the invention enables an enormous reduction in the rate of side effects, be it through the lesser impairment of non-target cells or be it through a reduced use of the cytostatic (through dose reduction). Thereby the therapy of the tumor, e.g. the treatment of colon cancer by DOX-WGA, much more pleasant.
  • drug protein-based through the composite with the lectins in addition to the targeted administration also sometimes be significantly stabilized 'which can be very helpful in fragile protein drugs can with the inventive system by the coupling to lectins successful and targeted high molecular weight protein drugs such as blood clotting factors or other blood-recoverable proteins, such as inhibitors or cofactors, or their recombinant equivalents.
  • lectins successful and targeted high molecular weight protein drugs such as blood clotting factors or other blood-recoverable proteins, such as inhibitors or cofactors, or their recombinant equivalents.
  • the preparations according to the invention can therefore be administered orally, with only a conventional gastric juice-resistant coating layer being able to be provided, if appropriate, which further facilitates therapy.
  • the system according to the invention is also ideal for Administration of nucleic acids, for example for gene therapy or for antisense therapy.
  • the nucleic acid eg cDNA, antisense RNA, ... can be bound to the lectin like a normal blood protein. With WGA this can of course also be done via the acid labile binding site.
  • the preparations according to the invention are preferably provided in the customary administration forms which are favorable for the respective protein obtainable from blood.
  • the dosage can be based on the usual dosage for the protein, whereby, due to the more efficient administration, a dose reduction can be considered.
  • the usual, proven auxiliary substances for the medicament can also be used, but often an improved water solubility (due to the lectins) is associated with the formulation according to the invention, with which e.g. Solution brokers can be reduced or even omitted.
  • the increased stability of the preparations according to the invention can also avoid the use of large amounts of stabilizers.
  • Fig. 1 the in vitro release profile of DOX from DOX-WGA
  • Fig. 2 the line-bound fluorescence intensity of DOX-WGA
  • Fig. 3 Caco-2 cells, incubated with DOX-WGA
  • Fig. 4 the effect of F-WGA and WGA on Caco-2 cell growth
  • Fig. 5 the antiproliferative effect of WGA, DOX-WGA and DOX
  • Fig. 6 the effect of WGA, DOX-WGA and DOX on Caco-2 cell growth
  • Fig. 7 the fluorescence intensity of Caco-2 cells after incubation with labeled prothrombin and prothrombin-WGA.
  • Doxorubicin, cis-aconitic anhydride, N, N '-dicyclohexylcarbodimide, ⁇ -amino-n-caproic acid and N-hydroxysuccinimide were obtained from Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.); all other chemicals were purchased as analytical grade from Merck (Darmstadt, DE).
  • tissue culture reagents were from Biowhittaker (Workingham, UK), sets for XTT (EZ4U) and BrdU tests were purchased from Biomedica (Vienna, Austria) and Boehringer Mannheim (Vienna, Austria), respectively.
  • N-cis-aconityl-doxorubicin was prepared according to Yang and Reisfeld (12) with modifications. All reactions were carried out under light protection and monitored by TLC on KGF 254 using chloroform / methanol / water 9 + 9 + 1.8 or 8 + 10 + 2.5 (V / V / V) as the mobile phase.
  • DOX (1.79 ⁇ mol) was dissolved in 1.5 ml of methanol and stirred with an ethereal solution of cis-aconitic anhydride (5.2 ⁇ mol) for 1 hour at room temperature.
  • doxorubicin cis aconitate was activated by reaction with 7.2 ⁇ mol N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and 7.2 ⁇ mol N-hydroxysuccinimide.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours and at 4 ° C overnight.
  • Dicyclohexylurea was precipitated by adding 1 ml of 3% aqueous sodium bicarbonate solution and collected by centrifugation at 7500 rpm for 5 minutes. The remaining methanol was removed from the supernatant by evaporation.
  • the doxorubicin-cis-aconitat-N-hydroxysuccinimide ester was containing by dropwise addition of a solution 0.033 .mu.mol WGA aqueous in 500 .mu.l 3% sodium bicarbonate, pH 8.0, with WGA jugiert con- •. After incubation at 4 ° C. overnight, the conjugate (DOX-WGA) was dialyzed against 20 mM HEPES / NaOH buffer, pH 7.4 at 4 ° C. until no free drug was found by spectrophotometric examination of the dialysis Medium was detected at 468 nm (detection limit: 2 ⁇ g / ml DOX). After DC, DOX-WGA was the only fluorescent compound observed, indicating • that there was no detectable free DOX.
  • the number of DOX molecules coupled per WGA molecule was calculated from the absorption at 468 nm with respect to WGA in 20 mM HEPES buffer, pH 7.4, using DOX for calibration (U-3000 UV -VIS spectrophotometer, Hitachi).
  • the total number of WGA amino groups that were accessible for derivatization was determined using a modified trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) / adipic acid dihydrazide (ADH) test (13). Briefly, 200 ul of a solution containing 125-175 ug WGA in 20 mM HEPES, pH 7.4, were mixed with 200 ul 0.02% TNBS in saturated sodium tetraborate / distilled water (1 + 1, v / v) and 10 min incubated for long at 70 ° C. After adding 100 ⁇ l of 0.5 M aqueous ADH solution and shaking gently on the vortex, the absorption of trinitrobenzene adipic acid dihydrazone was read off at 520 nm. The number of amino residues was calculated from a calibration curve using ⁇ -amino-n-caproic acid. The test enables a quantification of 80-680 nmol amino residues / ml.
  • the human colon carcinoma cell line Caco-2 and the human lymphoblast cell line MOLT-4 were obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, ML, USA). The cells were grown in a culture medium consisting of RPMI-1640 with 10% fetal calf serum, 4 mM L-glutamine and 75 ⁇ g / ml gentamycin in a humidified 5% CO 2 /95% air atmosphere at 37 ° C. and by trypsin Subcultivated treatment.
  • Human colonocytes were obtained from normal tissue adjacent to a resected colon carcinoma sample. The tissue was dissociated by incubation in collagenase solution (1000 U / ml medium) at 37 ° C. for about one hour until individual cells were released, as shown by light microscopy. The cells were washed repeatedly with PBS with 5 min centrifugation at 4 ° C at 1300 rpm. The pellet was resuspended in PBS and the preparation was analyzed using a Casyl DT cell counter and analyzer system (Scharf, DE).
  • the Zeil preparation consisted of lxlO 6 colonocytes / ml (diameter 7-10 ⁇ m), and 17xl0 6 cells / ml, which had a diameter of less than 7 ⁇ m, mainly red blood cells, as was observed by means of light microscopy.
  • Negative controls consisting of unlabeled cells were included in each experiment for the purpose of determining the autofluorescence. Each concentration was tested four times and repeated at least twice.
  • Flow cytometry measurements were performed on an Epics XL-MLC analysis flow cytometer (Coulter, FL, U.S.A.).
  • the labeled cells were analyzed using a "forward versus side scatter gate" to detect individual cell populations and exclude cell residues and cell aggregates. Fluorescence was detected at 575 nm (10 nm bandwidth), and the mean of the channel number of the logarithmic fluorescence intensities of individual peaks was used for further calculations.
  • the amplification of the fluorescence signals was set to place the autofluorescence signal of unlabeled cells in the first decade of the 4-decade log range. 5000 cells were accumulated for each measurement.
  • the cells were incubated for one hour with 100 ⁇ l cell suspension (2 ⁇ 10 6 / ml HEPES) with 100 ⁇ l of a solution of DOX-WGA (69 ⁇ g / ml HEPES) or fluorescein-labeled WGA (100 ⁇ g / ml HEPES) at 37 ° C colored.
  • the cells were centrifuged (5 min, 1000 rpm), washed twice as described above but using 150 ⁇ l HEPES and applied to a support for microscopy. Confocal images of cells labeled by fluorescence were taken using a confocal Obtained Zeiss Axiovert microscope. Transmission light and fluorescence images were obtained at 40x magnification, and intracellular DOX and fluorescein were detected by excitation at 488 nm and emission> 515 nm.
  • Cell proliferation was determined using the XTT and BrdU tests, which were carried out according to the manufacturer's instructions using colorless supplemented RPMI 1640 medium for cell culture.
  • the cytotoxic activity of DOX-WGA was determined as described above by means of the XTT test ', except that 10 M0LT 4-4- or Caco-2 cells / 100 ul RPMI 1640 medium and each 75 .mu.l of a solution containing DOX (0.15 or 0.10 ⁇ g), WGA (0.45 or 0.32 ⁇ g) or DOX-WGA (0.57 or 0.41 ⁇ g) were used.
  • the supernatant was discarded, and after the addition of 200 ⁇ l of FixDenat solution, the cells were fixed and the DNA is denatured. The supernatant was removed 30 minutes later and 100 ul BrdU antibody peroxidase was added. After incubation for 90 minutes, the cells were washed three times with 200 ul wash buffer and 100 ul substrate was added. After 10 min, the enzyme activity was stopped by adding 25 ul IM sulfuric acid, and the absorbance was measured at 450 nm against the blank, as described above, but omitting the cells.
  • the cytostatic agent was covalently bound to the protein in a two-step process.
  • the reaction resulted in N-cis-aconityl-DOX only in an anhydrous medium. Despite the formation of both the a and mono amide isomers, only one spot was observed after TLC.
  • the N-cis-aconitat-DOX was reacted with dicyclohexylcarbodiimide / N-hydroxysuccinimide to form an active ester intermediate before coupling (14).
  • the release profile of conjugated DOX at pH 4.0 was determined spectrophotometrically using a dialysis tube to exclude the conjugate.
  • 46 + 7% conjugated DOX was released from WGA; after a longer incubation, however, the release rate did not increase significantly, since the 168-hour exposure to DOX-WGA in an acidic environment led to a release of 51 + 6% conjugated DOX.
  • half of the available drug was released after 65 minutes (Fig. 1).
  • the conjugate binding was examined by setting the "forward versus side scatter gate" in order to exclusively record the cell population of ⁇ 7 ⁇ m. Since the mean relative fluorescence intensity of 0.3 covered the autofluorescence range of these cells, the DOX-WGA binding to erythrocytes can be neglected.
  • the DOX-WGA binding capacity of Caco-2 cells was 4, 6 + 0, 3 times higher than that of human colonocytes.
  • the amount of DOX-WGA bound to M0LT-4 cells was of the same order of magnitude as that of human colonocytes, only 10 ⁇ 3% higher.
  • the uptake of DOX-WGA was observed by confocal laser scanning microscopy of viable Caco-2 cells that had been preincubated with the conjugate (Fig. 3) . After incubation at 37 ° C for one hour, the fluorescent DOX-WGA conjugate accumulated near the core membrane of the dividing Caco-2 cell.
  • DOX was activated by a two-step mechanism via an acid-sensitive cis-aconitic acid -Binding coupled to WGA (12). Since WGA is a mixture of four isolectins (17), it was found that the number of amino residues on WGA was 24 ⁇ 1.4 for the evaluation of the coupling efficiency by combining the TNBS test with ADH. The coupling was confirmed qualitatively and quantitatively by UV / VIS difference spectroscopy and resulted in a conjugate free of detectable, non-covalently bound drug, which contained 24 mol DOX / mol WGA.
  • the N-acetylglucosamine-specific lectin retained its bioadhesive and cytoinvasive properties after conjugation of the cytostatic agent. Due to the acid sensitivity of the binding, an intralysosomal release of conjugated DOX is expected when DOX-WGA reaches the acidic environment of the lysosomal compartment. As a result of the derivatization, the intracellular distribution pattern of WGA was changed, which led to the accumulation of DOX-WGA near the core membrane of Caco-2 cells.
  • the binding specificity of the conjugate was assessed by means of flow cytometric determination of cell-bound fluorescence intensity, which comes from DOX-WGA. Regardless of the exposure time, DOX-WGA showed dose-dependent binding to target and non-target cells, although the extent was very different. On average, the binding capacity of the colon cancer cells Caco-2 exceeded that of the human colonocytes and lymphoblastic MOLT cells by a factor of 4.5. In addition, no binding of DOX-WGA to human erythrocytes was detected. These results are indicators of a high target specificity of the conjugate.
  • the decreasing ratio of binding to Caco-2 cells to human colonocytes could decrease from 13: 1 (F-WGA, 11) to 4: 1 (DOX-WGA) with a dense derivatization of the lectin by hydrophobic anti-cancer drugs related to that observed for immunoconjugates (18).
  • the contribution of the carrier protein of DOX-WGA to the antiproliferative effect of the conjugate on Caco-2 cells was, however, quite small, since the inhibitory activity of equivalent amounts of WGA and DOX-WGA was 6.7 + 3.3% and 39, respectively Was + 6.1%.
  • the cytostatic activity of DOX-WGA comes mainly from the conjugated drug and results in about 60% of the cytostatic activity from free DOX.
  • cell growth was inhibited by DOX-WGA in a dose-dependent form compared to free DOX (100%) to an extent of at best 35%. This decreasing antiproliferative activity of equivalent amounts of DOX on non-target cells may be due to the targeted delivery of the anti-cancer agent after conjugation with WGA.
  • the BrdU incorporation during the DNA synthesis was determined according to the number of cells dividing .
  • the carrier protein alone inhibited or stimulated Caco-2 cell growth only slightly, and the free drug showed 95% growth inhibition on average.
  • the antiproliferative effect of conjugated DOX had an average of 78%. If you only get a 50% release of assuming bound DOX in vitro, the cytostatic effect of DOX-WGA could be equal to or slightly higher than that of the free drug due to the site-specific efficiency of conjugated DOX.
  • Prothrombin - blood coagulation factor II - is a plasma protein from the group of vitamin K-dependent proteins with a molecular mass of 72,000 Daltons. Prothrombin is used therapeutically and is an essential component of prothrombin complex concentrates, which are used for the prophylaxis and therapy of bleeding due to congenital or acquired deficiencies in prothrombin complex factors.
  • Prothrombin Fact II was prepared from prothrombin complex concentrate according to Brummelhuis (23) by adsorption on calcium phosphate and elution with sodium phosphate, by anion exchange chromatography on DEAE-Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and by hydrophobic chromatography on phenyl-Sepharose .
  • a preparation was used for the following syntheses, which had a factor II content of 12.3 mg FH / ml citrate buffer (13.6 mM Na citrate, 137 mM NaCl, pH 7.0).
  • the purified prothrombin was conjugated to WGA according to the following principle.
  • a disuccinimidyl succinate solution (pre-activated spacer) was prepared by incubating N-hydroxysuccinimide and succinic anhydride with carbodiimide and used to activate the prothrombin labeled with fluorescein (FITC).
  • FITC fluorescein
  • the derivatized prothrombin thus produced with active N-hydroxysuccinimide ester groups was then used for coupling to WGA. In this way, two different samples were prepared (synthesis according to approach 1 or 2)
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the pre-activated spacer was incubated by incubating 14 mg (125 ⁇ mol) N-hydroxysuccinimide, 5 mg (50 ⁇ mol) succinic anhydride and 96 mg (500 ⁇ mol) l-ethyl-3-dimethylaminopropyl-carbodiimide (EDAC) in 3 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) prepared for over 20 minutes with gentle shaking.
  • FITC-labeled prothrombin was activated by the following two reaction approaches. The mixtures were each incubated for one hour at room temperature with gentle shaking. Approach 1
  • the coupling with WGA was carried out by adding the solid lectin to the solution of the activated prothrombin at room temperature and shaking gently overnight.
  • HPLC analyzes All intermediate products of the syntheses were examined by means of HPLC analysis using an HPLC gel filtration column.
  • the method was used to estimate protein concentrations and to demonstrate changes in protein size during the reaction.
  • HPLC analysis for both end products shows only one signal in the exclusion volume of the gel filtration column, which indicates a molecular weight of greater than 150,000 Da. WGA and prothrombin could not be detected.
  • the cytoadhesive properties of the conjugate were determined by means of flow cytometry, where only cell-bound, fluorescent substances are detected.
  • the binding study was carried out at 4 ° C to exclude possible internalization processes caused by wheat lectin. In this temperature range, all energy-dependent transport processes are largely excluded, so that only the rate of binding to the cell surface of the colon carcinoma cells is recorded.
  • Caco-2 single cells whose differentiation pattern corresponds to human enterocytes and which are established as an in vitro model for the human small intestine and described above were used as the model for intestinal enterocytes.
  • the cell suspension showed no signal of cell-bound fluorescence. While fluorescence-labeled factor II showed an extremely low binding rate to Caco-2 cells (undiluted: 1.62, 1 + 4, diluted 2.57, medium cell-bound fluorescence intensity), the conjugate of fluorescence-labeled factor II and wheat lectin was extremely strongly bound to Caco 2 cells bound. The mean cell-bound fluorescence intensity was 311 (undiluted) and 103.4 (1 + 4 diluted).
  • Cis-aconityl spacer between daunomyein and macromolecular carriers a model of pH-sensitive linkage releasing drug from a lysosomotropic conjugate. Biochem. Biophys. Res. Comm. 102: 1048-1054 (1981).

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Abstract

Beschrieben wird ein pharmazeutisches Präparat, umfassend ein Lektin, an das ein aus Blut gewinnbares Protein verabreichungsstabil gebunden ist.

Description

KONJUGAT, BESTEHEND AUS EINEM LEKTIN UND EINEM BLUTGERINNUNGSFAKTOR
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Präparationen umfassend Lektine und pharmazeutische Wirkstoffe.
Das Konzept des "Drug Targeting" ist durch die Tatsache begründet, daß viele Arzneimittel in bezug auf deren Aufnahme- oder Wirkungsloci in den Zellen nicht selektiv sind. Besonders auf dem Gebiet der Chemotherapie bei Krebserkrankungen führt die Wirkung der eingesetzten Arzneimittelsubstanzen in Nicht-Zielzellen zu schweren unerwünschten Nebenwirkungen, die eine erfolgreiche Therapie gefährden können (1) . Die Verwirklichung der gezielten Zuführung von Arzneimittelsubstanzen zu den spezifischen Zielzellen wurde bislang durch große Schwierigkeiten bei der Auffindung geeigneter Carrier-Moleküle , die in eine spezifische Wechselwirkung mit der betroffenen (Ziel-) Zelle treten können, gehindert. Mit dem Fortschritt in der Biotechnologie wurden monoklonale Antikörper (2) und rekombinante Proteine (3) , welche spezifisch an bestimmte Loci binden können, als vielversprechende Kandidaten für aktive und zielgerichtete Arzneimittelzufuhr etabliert. Weiters wurden auch kolloidale Partikel, wie Albuminoder Polystyrol-Mikrokügelchen, für passiven Arzneimittel-Transport in bestimmte Kompartime te verwendet (4,5).
Lektine, die eine wichtige Rolle bei der biologischen Signalübermittlung, bei Zeil/Zeil- und Zell/Matrix-Wechselwirkungen spielen, sind eine weitere Gruppe von Molekülen, von denen man annimmt, daß sie zur zielgerichteten Arzneimittel-Verabreichung verwendet werden können. Es ist bekannt, daß Lektine, die ursprünglich als Proteine in Pflanzenextrakten identifiziert worden waren, in der Lage sind, an bestimmte Oligosaccharid-Gruppen zu binden (6) . Es wurde vorgeschlagen, unter Ausnutzung dieser Kohlehydrat-spezifischen Wechselwirkung Lektine in einem zielgerichteten "Drug Delivery" -System einzusetzen (7), da das Glyko- sylierungsmuster von Zellen nach maligner Transformation verändert ist (8) .
Weizenkeim-Agglutinin (wheat germ agglutinin; WGA) ist ein dime- res, Kohlehydrat-freies Protein, welches aus zwei identischen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 35 kDa besteht. Jede monomere Untereinheit enthält zwei identische und unabhängige Bindungsstellen für N-Acetyl-D-glukosamin (9) . Nachdem Weizenkeime, die rund 300 mg WGA pro kg enthalten (10) , zur normalen Ernährung des Menschen gehören, ist die perorale Toxizität zu vernachlässigen. WGA bindet spezifisch an N-Acetyl-D-glukos- amin-hältige Strukturen. Es wurde durch Sättigungsanalysen mit Fluoreszenz-markiertem Lektin gefunden, daß die WGA-Bindungskapazität von Colonkarzinom-Zellen (Caco-2 -Zellen) rund 13mal höher ist als die von menschlichen Colonozyten (11) .
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Präparation zur Verfügung zu stellen, mit welcher die Vorteile des Lektin-Systems bei der Zielzellenerkennung für die zielgerichtete Zufuhr von Arzneimitteln an spezifische Zielzellen ausgenützt werden können, ohne daß es dabei zu wesentlichen Nebenwirkungen, insbesondere zu toxischen Nebenwirkungen oder Nebenwirkungen, die durch Wirkung auf Nicht-Zielzellen hervorgerufen werden, kommt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein pharmazeutisches Präparat, welches ein Lektin, an das aus Blut gewinnbares Protein, insbesondere in Blutgerinnungsfaktor oder dessen rekom- binantes Äquivalent verabreichungsstabil gebunden ist, umfaßt.
Als Lektin wird bevorzugterweise ein Lektin verwendet, das pflanzlichen Ursprungs ist, wobei vor allem solche Pflanzenlek- tine verwendet werden können, die als gewohnte Nahrungsmittel- quellen des Menschen bekannt sind, wie z.B. auch Weizen, Soja, Reis, Bohnen, Gerste, Roggen, usw.. Die Spezifität von Lektinen ist für die meisten bekannten Lektine bereits ausreichend beschrieben (vgl. Stryer, Biochemistry, 2. Auflage (1994), Seiten 311 und 359; Römpp, Chemielexikon, 10. Auflage (1997), Seiten 2382 bis 2384), kann jedoch auch (z.B. für neu entdeckte Lektine oder für modifizierte Lektine) mit bekannten Methoden analysiert werden. Dies gilt insbesondere für die jeweiligen Bindungsspezi- fitäten für bestimmte Kohlehydratstrukturen von ausgewählten Zielzellen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kommen auch bevorzugt solche Lektine zum Einsatz, die lang bekannt und gut beschrieben sind, wie z.B. Concanavalin A, Abrin, Ricin, Phasin oder WGA, da bei diesen Systemen auch Modifikationen ohne größeren Aufwand bewerkstelligt werden können. Derartige Modifikationen (z.B. bezüglich der Bindungsstelle zum aus Blut gewinnbaren Protein oder im Erkennungsbereich für die KohlehydratStruktur der Zielzelle) können zwar auch bei weniger gut beschriebenen oder völlig neuen Lektinen mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, bewerkstelligt werden, jedoch ist dies meist arbeitsaufwendiger als bei bekannten Lektinen.
Erfindungsgemäß hat sich der Einsatz von WGA besonders bewährt, da dieses praktisch keinerlei perorale Toxizität aufweist und eine hohe Spezifität gegenüber malignen Zellen aufweist. Insbesondere aufgrund der hohen Spezifität gegenüber Colonkarzinom- Zellen ist es besonders bei der zielgerichteten Arzneimittelzufuhr in diese Zellen geeignet. Unter WGA werden erfindungsgemäß auch chemisch modifizierte WGA-Moleküle oder WGA-Derivate verstanden, die die wesentlichen Eigenschaften des (nativen) WGA aufweisen bzw. bei welchen die Bindungsspezifität gezielt und kontrolliert verändert worden ist.
Unter verabreichungsstabiler' Verbindung wird erfindungsgemäß eine Verbindung verstanden, die eine ausreichende Stabilität des erfindungsgemäßen Präparats bei der Lagerung, bei der Verabreichung und beim Weg im Patienten zum Ziellocus gewährt. Wesentlich ist aber auch, daß diese Verbindung zwischen Lektin und dem aus Blut gewinnbaren Protein im Zielkompartiment gespalten werden kann, oder der Arzneistoff auf andere Weise seine Wirkung entfalten kann. Demgemäß kommen beispielsweise eine säure- oder basenlabile Verbindung oder eine durch ein für die Zielkomparti- mente spezifisches Enzym, z.B. eine Protease oder Nuklease, spaltbare Verbindung zur Anwendung. Unter Zielkompartimenten werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise Zellen, Gewebe oder Teile eines Gewebes, insbesondere Blut oder Gewebsflüssigkeiten, verstanden.
Die erfindungsgemäßen Präparate zeigen einen hohen antiprolife- rativen Effekt auf die Zielzellen, da das konjugierte aus Blut gewinnbare Protein leicht und effektiv in die Zielzelle bzw. die Zielkompartimente aufgenommen wird. Es kommt daher zu einer intrazellulären Akkumulation der erfindungsgemäßen Präparate. Im WGA-System ermöglicht die säurelabile eis-Aconityl-Verbindung eine Freisetzung des aus Blut gewinnbaren Proteins erst im lyso- somalen Bereich der Zielzelle.
Als aus Blut gewinnbares Protein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist prinzipiell jedes Blutprotein oder dessen rekombinantes Äquivalent geeignet, das eine Bindung mit Lektinen eingehen kann. Diese Bindung kann auch, wenn sie mit den nativen Lektinen nicht möglich ist, durch Modifikation von bestimmten Bindungsstellen oder Aminosäure-Seitenketten ermöglicht werden. Auch können, ausgehend von bekannten aus Blut gewinnbaren Proteinen, speziell für die vorliegende Erfindung geeignete abgeleitete Blutproteine "designed" werden, die eine Bindung mit Lektinen eingehen können. Aufgrund der abnormen Veränderung der Gly- kocalyx '(die gewebsspezifische Polysaccharidschicht , die jede Eukaryonten-Zelle umgibt und aus membranständigen Glykoproteinen und Glykolipiden aufgebaut ist) , die oft mit einer malignen Transformation verbunden ist, eignet sich das erfindungsgemäße Lektin- "Drug-Targeting" hervorragend zur Verabreichung von Zyto- statika oder anderen Krebs-Behandlungsmitteln.
Beispiele für erfindungsgemäß einzusetzendes Blutprotein umfassen Blutgerinnungsfaktoren wie Prothrombin oder die Faktoren V, VII, VIII, IX, X, XI, XII oder XIII, vWF, Inhibitoren wie ATIII, oder Heparin, Protein C, Protein S, aχ -saures Glykoprotein, oder Gewebefaktoren, sowie gegebenenfalls Vorstufen dieser Proteine.
Diese Substanzen, z.B. Doxorubicin (DOX) , können vorteilhafterweise über eine säurelabile Bindung (z.B. die cis-Aconityl- Brücke an WGA) gebunden werden und können als Modellbeispiel ebenfalls zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung herangezogen werden. Es zeigte sich, daß eine Zweischritt-Kopplungsreaktion (siehe Beispiele) von DOX an WGA ein wasserlösliches Prodrug (DOX-WGA) mit einem Substitutionsgrad von 24 mol DOX/mol WGA ergibt. Dieses Prodrug ist im neutralen Milieu stabil, bei pH 4,0 werden jedoch innerhalb von 24 Stunden 46+7% des WGA-gebundenen DOX freigesetzt. Damit wird das Zytostatikum erst im intralysosomalen, sauren Milieu verfügbar. Die DOX-WGA-Bin- dungskapazität von Colonkarzinom-Zellen ist zumindest 4 , 5mal höher als jene von humanen Colonozyten und lymphoblastischen MOLT-4 -Zellen, eine Bindung an Erythrozyten ist nicht meßbar.
Unter Berücksichtigung der Freisetzungsrate des Arzneistoffes aus dem Konjugat ist die zytostatische Wirkung des Arzneistoffes in Konjugatform auf Karzinomazellen zumindest l,5mal höher als jene des freien Zytostatikums. Die antiproliferative Wirkung von DOX-WGA auf Lymphoblasten ist hingegen um 65% geringer als jene des freien Wirkstoffes. Im Gegensatz zum freien Wirkstoff wird aber durch die erfindungsgemäße zielgerichtete Zuführung eine enorme Verringerung der Nebenwirkungsrate ermöglicht, sei es durch die geringere Beeinträchtigung von Nicht -Zielzellen oder sei es durch einen verringerten Einsatz des Zytostatikums (durch Dosisreduktion). Damit wird die Therapie des Tumors, z.B. die Therapie des Colonkarzinoms durch DOX-WGA, um vieles angenehmer.
Da Arzneimittel auf Proteinbasis, durch den Verbund mit den Lektinen zusätzlich zur zielgerichteten Verabreichung auch z.T. erheblich stabilisiert werden,' was bei fragilen Proteinarzneimitteln sehr hilfreich sein kann, können mit dem erfindungsgemäßen System durch die Kopplung an Lektine erfolgreich und gezielt hochmolekulare Proteinarzneimittel, wie Blutgerinnungsfaktoren oder andere aus Blut gewinnbare Proteine, wie Inhibitoren oder Cofaktoren, oder deren rekombinante Äquivalente verabreicht werden .
Da die meisten Lektine, insbesondere pflanzliche, wie WGA, ga- strointestinal stabil sind, können daher die erfindungsgemäßen Präparate peroral verabreicht werden, wobei lediglich gegebenenfalls eine übliche magensaftresistente Hüllschicht vorgesehen werden kann, was zu einer weiteren Erleichterung der Therapie führt .
Das erfindungsgemäße System eignet sich auch hervorragend zur Verabreichung von Nukleinsäuren, beispielsweise zur Gentherapie oder für Antisense-Therapie. Hierbei kann die Nukleinsäure, z.B. cDNA, Antisense-RNA, ... , wie ein normales Blutprotein an das Lektin gebunden werden. Bei WGA kann dies selbstverständlich auch über die säurelabile Bindungsstelle erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Präparate werden bevorzugterweise in den üblichen und für das jeweilige aus Blut gewinnbare Protein günstigen Verabreichungsformen zur Verfügung gestellt. Die Dosierung kann sich an der üblichen Dosierung für das Protein orientieren, wobei, bedingt durch die effizientere Verabreichung, eine Dosisreduktion in Erwägung gezogen werden kann. Auch können die üblichen, bewährten Hilfssubstanzen für das Medikament verwendet werden, oft ist aber mit der erfindungsgemäßen Formulierung eine verbesserte Wasserlöslichkeit (bedingt durch die Lektine) verbunden, womit z.B. Lösungsvermittler reduziert oder sogar weggelassen werden können. Auch kann durch die erhöhte Stabilität der erfindungsgemäßen Präparate die Verwendung großer Mengen an Stabilisatoren vermieden werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und den Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: das in vitro-Freisetzungsprofil von DOX aus DOX-WGA
Fig. 2: die Zeil-gebundene Fluoreszenz-Intensität von DOX-WGA
Fig. 3: Caco-2-Zellen, inkubiert mit DOX-WGA
Fig. 4: die Wirkung von F-WGA und WGA auf Caco-2-Zellwachstum
Fig. 5: die antiproliferative Wirkung von WGA, DOX-WGA und DOX
Fig. 6: die Wirkung von WGA, DOX-WGA und DOX auf Caco-2-Zell- wachstum Fig. 7: die Fluoreszenzintensität von Caco-2-Zellen nach Inkubation mit markierten Prothrombin und Prothrombin-WGA.
B e i s p i e l e :
Materialien und Methoden Chemikalien
Weizenkeim-Agglutinin aus Tri ticum vulgäre und sein Fluorescein- markiertes Analogon (Molverhältnis Fluorescein/Protein = 3,2) wurde von Vektor Laboratories (Burlingame, U.S.A.) erworben. Doxorubicin, cis-Aconitsäureanhydrid, N, N' -Dicyclohexylcarbodi- imid, ε-Amino-n-capronsäure und N-Hydroxysuccinimid wurden von Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.) erhalten; alle anderen Chemikalien wurden als analytisch rein ("analytical grade") von Merck (Darmstadt, DE) erworben. Die Gewebskulturreagentien stammten von Biowhittaker (Workingham, UK) , Sets für XTT- (EZ4U) und BrdU- Test wurden von Biomedica (Wien, Österreich) bzw. Boehringer Mannheim (Wien, Österreich) erworben.
Konjugation von Doxorubicin mit WGA
N-cis-Aconityl-doxorubicin wurde gemäß Yang und Reisfeld (12) mit Modifikationen hergestellt. Alle Reaktionen wurden unter Lichtschutz durchgeführt und mittels DC auf KGF254 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser 9+9+1,8 oder 8+10+2,5 (V/V/V) als mobile Phase überwacht. DOX (1,79 μmol) wurden in 1,5 ml Methanol gelöst und mit einer etherischen Lösung von cis- Aconitinsäureanhydrid (5,2 μmol) 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen auf 500 μl wurde Doxorubicin-cis-aco- nitat durch Umsetzung mit 7,2 μmol N,N' -Dicyclohexylcarbodiimid und 7,2 μmol N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Die Reaktionsmischung wurde 2 h lang bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C gerührt. Dicyclohexylharnstoff wurde durch Zugabe von 1 ml 3% wässeriger Natriumbicarbonat-Lösung ausgefällt und durch 5minü- tige Zentrifugation bei 7500 U/min gesammelt. Das restliche Methanol wurde aus dem Überstand durch Abdampfen entfernt.
Der Doxorubicin-cis-aconitat-N-hydroxysuccinimid-ester wurde durch tropfenweise Zugabe einer Lösung enthaltend 0,033 μmol WGA in 500 μl 3% wässerigem Natriumbicarbonat , pH 8,0, mit WGA kon- • jugiert. Nach Inkubation bei 4°C über Nacht wurde das Konjugat (DOX-WGA) gegen 20 mM HEPES/NaOH-Puffer, pH 7,4, bei 4°C dialy- siert, bis kein freies Arzneimittel mittels spektrophotometri- scher Untersuchung des Dialyse-Mediums bei 468 nm nachgewiesen wurde (Detektionsgrenze : 2 μg/ml DOX) . Nach DC war DOX-WGA die einzige fluoreszierende Verbindung, die beobachtet wurde, was • darauf hinweist, daß kein detektierbares freies DOX vorhanden war.
Ermittlung der Kopplungsrate
Die Anzahl von DOX-Molekülen, die pro Molekül WGA gekoppelt sind, wurde aus der Absorption bei 468 nm in bezug auf WGA in 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, errechnet, wobei DOX zur Eichung verwendet wurde (U-3000 UV-VIS Spektrophotometer, Hitachi) .
Bestimmung von A ino-Resten an WGA
Die Gesamtanzahl von WGA-Aminogruppen, die einer Derivatisierung zugänglich waren, wurde mittels eines modifizierten Trinitro- benzolsulfonsäure (TNBS) /Adipinsäure-dihydrazid (ADH) -Tests (13) bestimmt. Kurz gesagt wurden 200 μl einer Lösung enthaltend 125- 175 μg WGA in 20 mM HEPES, pH 7,4, mit 200 μl 0,02% TNBS in gesättigtem Natriumtetraborat/destilliertem Wasser (1+1, V/V) gemischt und 10 min lang bei 70°C inkubiert. Nach der Zugabe von 100 μl 0,5 M wässeriger ADH-Lösung und sanftem Schütteln am Vortex wurde die Absorption von Trinitrobenzol-adipinsäure-dihydra- zon bei 520 nm abgelesen. Die Anzahl von Amino-Resten wurde aus einer Eichkurve unter Verwendung von ε-Amino-n-capronsäure berechnet. Der Test ermöglicht eine Quantifizierung von 80-680 nmol Amino-Resten/ml .
In vitro-Freisetzung von konjugiertem Doxorubicin.
Untersuchungen betreffend die in vi tro-Freisetzung von DOX aus dem Konjugat wurden bei 37°C unter Lichtschutz durchgeführt. Ein kleiner Dialyse-Schlauch (MW cut-off 12 kDa) enthaltend 250 μl DOX-WGA, entsprechend 7,5 μg DOX, wurde in ein Schraubröhrchen, gefüllt mit 1,5 ml 0,1 M Phosphat/Citrat-Puffer, pH 4,0, gegeben. Um eine ungestörte Diffusion von freigesetztem DOX zu gewährleisten, wurden Luftblasen sorgfältig von der Oberfläche der Membran entfernt. Während das Dialyse-Medium gerührt wurde, wurden 500 μl Aliquots in regelmäßigen Abständen entnommen und sofort nach dem Ablesen der Absorption bei 468 nm in das Gefäß zurückgegeben. Die Menge des DOX, die vom Konjugat freigesetzt worden war, wurde aus einer DOX-Eichkurve errechnet.
Zellen und Kulturbedingungen
Die humane Colonkarzinom-Zellinie Caco-2 und die humane Lympho- blasten-Zellinie MOLT-4 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, ML, U.S.A.) erhalten. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium bestehend aus RPMI-1640 mit 10% fötalem Kälberserum, 4 mM L-Glutamin und 75 μg/ml Gentamycin in einer angefeuchteten 5% C02 /95% Luft-Atmosphäre bei 37°C gezüchtet und durch Trypsin-Behandlung subkultiviert.
Humane Colonozyten wurden aus normalem Gewebe angrenzend an eine resezierte Colonkarzinom-Probe erhalten. Das Gewebe wurde durch etwa einstündige Inkubation in Kollagenase-Lösung (1000 E/ml Medium) bei 37°C dissoziiert, bis einzelne Zellen freigesetzt waren, wie mittels Lichtmikroskopie gezeigt. Die Zellen wurden wiederholt mit PBS mit 5minütiger Zentrifugation bei 4°C bei 1300 U/min gewaschen. Das Pellet wurde in PBS resuspendiert, und das Präparat wurde unter Verwendung eines Casyl DT-Zellzähler- und Analysator-Systems (Schärfe, DE) analysiert. So bestand das Zeil-Präparat aus lxlO6 Colonozyten/ml (Durchmesser 7-10 μm) , und 17xl06 Zellen/ml, die einen Durchmesser von weniger als 7 μm aufwiesen, hauptsächlich rote Blutkörperchen, wie mittels Lichtmikroskopie beobachtet wurde .
Bindung von DOX-WGA an humane Colonozyten, Caco-2 und MOLT-4- Zellen
Unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 50 μl Zellsuspension (5xl04 Colonozyten oder Lymphoblasten) in PBS, 100 μl 20 mM HEPES, pH 7,4, und 50 μl einer Lösung enthaltend 3,6, 1,8 oder 0 , 9 μg DOX-WGA in HEPES 1 h, 2 h oder 12 h lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert (1000 U/min, 5 min, 4°C), und 120 μl des Überstands wurden verworfen. Nach Zugabe von 120 μl HEPES wurde der Wasch-Schritt auf dieselbe Weise wiederholt. Die Zellen wurden in 1,8 ml Cell Pack resuspendiert und mittels Durchfluß-Zytometrie untersucht.
Bei jedem Experiment wurden negative Kontrollen bestehend aus unmarkierten Zellen zwecks Bestimmung der Autofluoreszenz inklu- diert . Jede Konzentration wurde vierfach getestet und mindestens zweimal wiederholt .
Durchfluß-Zytometrie
Die Durchfluß-Zytometrie-Messungen wurden an einem Epics XL-MLC- Analyse-Durchfluß-Zytometer (Coulter, FL, U.S.A.) durchgeführt. Die markierten Zellen wurden unter Verwendung eines "Forward versus side scatter gate" zum Erfassen einzelner Zellpopulationen und Ausschluß von Zellrückständen und Zellaggregaten analysiert. Fluoreszenz wurde bei 575 nm nachgewiesen (10 nm Bandbreite) , und der Mittelwert der Kanalzahl der logarithmischen Fluoreszenz-Intensitäten einzelner Peaks wurde für weitere Berechnungen verwendet. Die Amplifikation der Fluoreszenz-Signale wurde eingestellt, um das Autofluoreszenz-Signal unmarkierter Zellen in die erste Dekade des 4-Dekaden umfassenden log-Be- reichs zu stellen. Für jede Messung wurden 5000 Zellen akkumuliert .
Konfokale Mikroskopie
Die Zellen wurden durch einstündige Inkubation von 100 μl Zeil- Suspension (2xl06/ml HEPES) mit 100 μl einer Lösung von DOX-WGA (69 μg/ml HEPES) oder Fluorescein-markiertem WGA (100 μg/ml HEPES) bei 37°C gefärbt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (5 min, 1000 U/min) , zweimal wie oben beschrieben jedoch unter Verwendung von 150 μl HEPES gewaschen und zwecks Mikroskopie auf einen Träger aufgebracht. Konfokale Bilder von mittels Fluoreszenz markierten Zellen wurden unter Verwendung eines konfokalen Zeiss Axiovert-Mikroskops erhalten. Transmissionslicht und Fluoreszenz-Bilder wurden in 40-facher Vergrößerung erhalten, und intrazelluläres DOX sowie Fluorescein wurden durch Erregung bei 488 nm und Emission >515 nm nachgewiesen.
Zellproliferationstests
Die Zeilproliferation wurde mit dem XTT- und dem BrdU-Test bestimmt, welche gemäß den Vorschriften der Hersteller unter Verwendung von farblosem supplementierten RPMI 1640-Medium für Zellkultur durchgeführt wurden.
Um den Einfluß von WGA und F-WGA auf die Zellproliferation von Caco-2 zu errechnen, wurden 100 μl Zeil-Suspension (2xl04 Zellen) und 75 μl je einer Verdünnungsserie von WGA und F-WGA (0, 0,06, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 1,5, 3, 6 und 30 μg) unter Ge- webskulturbedingungen für 3 Tage inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 20 μl XTT-Reagens-Lösung. Die Absorption des gebildeten Formazans wurde bei 450 nm (Anthos ELISA Reader 2001) gegen eine negative Kontrolle, bestehend aus Medium und XTT-Reagens-Lösung, bestimmt .
Die zytotoxische Aktivität von DOX-WGA wurde mittels des XTT- Tests, wie oben beschrieben,' bestimmt, wobei jedoch 104 M0LT-4- oder Caco-2-Zellen/100 μl RPMI 1640-Medium und je 75 μl einer Lösung enthaltend DOX (0,15 oder 0,10 μg) , WGA (0,45 oder 0,32 μg) bzw. DOX-WGA (0,57 oder 0,41 μg) verwendet wurden.
Außerdem wurde die Zellproliferation von Caco-2-Zellen, die mit DOX-WGA vorbehandelt worden waren, untersucht, wobei ein colori- metrischer Immuntest, der BrdU-Test, verwendet wurde. Je 75 ml einer Lösung enthaltend WGA (0,6, 0,43, 0,30 μg) , DOX (0,15, 0,11, 0,075 μg) oder DOX-WGA (0,57, 0,41, 0,285 μg) in HEPES wurden in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, die 100 μl Zeil-Suspension (5xl03 Caco-2-Zellen) enthielt, zugegeben. Nach 96stündiger Inkubation unter Zellkulturbedingungen wurden 20 μl BrdU-Markierungslösung zugegeben, gefolgt von einer weiteren 14- stündigen Inkubation. Der Überstand wurde verworfen, und nach Zugabe von 200 μl FixDenat-Lösung waren die Zellen fixiert und die DNA denaturiert. Der Überstand wurde 30 min später entfernt, und 100 μl BrdU-Antikörper-Peroxidase wurden zugegeben. Nach 90- minütiger Inkubation wurden die Zellen dreimal mit 200 μl Wasch- Puffer gewaschen, und 100 μl Substrat wurden zugegeben. Nach 10 min wurde die Enzymaktivität durch Zugabe von 25 μl IM Schwefelsäure gestoppt, und die Absorption wurde bei 450 nm gegen den Leerwert, hergestellt wie oben beschrieben, doch unter Auslassung der Zellen, gemessen.
Alle Tests wurden vierfach durchgeführt und mindestens zweimal wiederholt. Außerdem wurden in jedem Experiment positive Kontrollen durch Auslassen der untersuchten Substanzen inkludiert .
Ergebnisse
Herstellung und Charakterisierung von eis-Aconityl-gebundenem Doxorubicin-WGA (DOX-WGA)
Zur Verwendung von WGA als Carrier-Protein zur gezielten Pro- drug-Zuführung von DOX wurde das zytostatische Mittel in einem zweistufigen Verfahren kovalent an das Protein gebunden. Zuerst wurde das Arzneimittel quantitativ in das entsprechende Carbonsäure-Derivat durch Umsetzen des freien Amino-Restes von Daunos- amin mit cis-Aconitinsäureanhydrid übergeführt (Rfprodukt=0 ' 21' RfDOX=0,14; Chloroform/Methanol/Wasser, 9+9+1,8 (V/V/V) ) . Anders als in der Literatur beschrieben (12) , ergab die Umsetzung N- cis-Aconityl-DOX nur in wasserfreiem Medium. Trotz der Bildung von beidem, dem a- und dem -Monoamid-Isomer, wurde nach DC nur ein Fleck beobachtet.
Um eine Quervernetzung von WGA durch Voraktivierung des Proteins zu vermeiden, wurde das N-cis-Aconitat-DOX mit Dicyclohexylcar- bodiimid/N-Hydroxysuccinimid umgesetzt, um ein aktives Ester- Zwischenprodukt vor der Kopplung (14) zu bilden. Wie mittels DC (Chloroform/Methanol/Wasser 8+10+2,5 (V/V/V)) angezeigt, wurde das N-cis-Aconityl-Derivat (Rf=0,24) in den korrespondierenden N-Hydroxysuccinimid-Ester (Rf=0,88) in einem Ausmaß von etwa 75% übergeführt. Unter Beteiligung des aktiven Esters entweder des ß- oder des γ-Carboxyl-Rests von cis-Aconitat-Doxorubicin wurde das Arzneimittel mit den zugänglichen Amino-Resten von WGA konjugiert, wobei eine Amid-Bindung gebildet wurde. UV-Differenzspektroskopie des gereinigten Konjugats bestätigte eine kovalen- te Bindung von DOX am Carrier-Protein, was zu einer Konjugationszahl von etwa 24 mol DOX/mol WGA führt. Da WGA eine Mischung von Isolektinen enthaltend 24+1,53 Aminogruppen (Mittelwert+SD, n=6) darstellt, wie mittels TNBS/ADH-Test bestimmt, ergab die Kopplungsreaktion dicht beschichtetes Lektin, das jedoch noch immer frei wasserlöslich ist.
Da vom cis-Aconityl-Spacer berichtet worden war, daß er eine pH- empfindliche Bindung (15) für die intralysosomale Freisetzung des konjugierten Arzneimittels sei, wurde das Freisetzungs-Profil von konjugiertem DOX bei pH 4,0 in vi tro spektrophotome- trisch bestimmt, wobei ein Dialyseschlauch zum Ausschließen des Konjugats verwendet wurde. Innerhalb von 24 h Inkubation bei einem pH-Wert von 4,0 wurden 46+7% konjugiertes DOX von WGA freigesetzt; nach einer längeren Inkubation stieg jedoch die Freisetzungsrate nicht deutlich an, da die 168stündige Einwirkung von saurem Milieu auf DOX-WGA zu einer Freisetzung von 51+6% konjugiertem DOX führte. Wie durch das Freisetzungs-Profil angezeigt, war die Hälfte des verfügbaren Arzneimittels nach 65 min freigesetzt (Fig. 1) .
Bindung von DOX-WGA an Caco-2-Zellen, humane Colonozyten und Lymphoblasten
Zur Bestimmung der Konjugat-Bindungskapazität von Ziel- und Nicht-Zielzellen ließ man zunehmende Mengen von DOX-WGA mit einer bestimmten Anzahl von Zellen verschiedenen Ursprungs in Wechselwirkung treten und untersuchte sie mittels Durchfluß- Zytometrie. Diese Technik ermöglicht eine Quantifizierung nur der an Zellen gebundenen Fluoreszenz -Intensität (16) . Caco-2- Zellen wurden als Vertreter für maligne transformierte Zellen verwendet, während humane Colonozyten und die humanen lympho- blastischen MOLT-4 -Zellen als Modell für nicht beeinflußte bzw. Stammzellen inkludiert wurden. Im Vergleich zur Autofluoreszenz der Zellen (0,6±0,1) nahm der Mittelwert der an Zellen gebundenen Fluoreszenz-Intensität der Caco-2 -Zellen nach Zugabe von DOX-WGA deutlich zu und ergab 11,8±0,7 - 37,9+0,1 relative Fluoreszenz-Intensität gleichzeitig mit einer zunehmenden Konzentration des Konjugats. Dagegen führte die Bindung zunehmender Mengen von DOX-WGA an Nicht-Zielzellen zu einer eher geringen und wenig ansteigenden, an Zellen gebundenen Fluoreszenz-Intensität im Bereich von 2,4+0,05 bis 8,5+1,0 (humane Colonozyten) bzw. 2,5+0,07 bis 9,3+0,1 (MOLT-4). Da der Mittelwert der an Zellen gebundenen Fluoreszenz-Intensität nach Zugabe zunehmender Mengen von DOX-WGA zunahm, könnte die Bindung an die untersuchten Zell- linien einer spezifischen Wechselwirkung zugeschrieben werden (Fig. 2) .
Da die Präparation humaner Colonozyten 94% Zellen verschiedener Art enthielt, hauptsächlich Erythrozyten, wurde die Konjugat- Bindung durch Einstellen des "Forward versus side scatter gate" untersucht, um auschließlich die Zeil-Population von <7 μm aufzuzeichnen. Da die mittlere relative Fluoreszenz-Intensität von 0,3 den Autofluoreszenz-Bereich dieser Zellen abdeckte, kann die DOX-WGA-Bindung an Erythrozyten vernachlässigt werden.
Im allgemeinen war die DOX-WGA-Bindungskapazität von Caco-2-Zel- len 4, 6+0, 3 -mal höher als jene humaner Colonozyten. Die Menge des an M0LT-4-Zellen gebundenen DOX-WGA war in derselben Größenordnung wie die von humanen Colonozyten, nur 10±3% höher. Nicht nur die Bindung an die Caco-2 -Membran, sondern auch die Aufnahme von DOX-WGA wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von lebensfähigen Caco-2-Zellen, die mit dem Konjugat vorinkubiert worden waren, beobachtet (Fig. 3). Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C sammelte sich das fluoreszierende DOX-WGA-Konjugat in der Nähe der Kernmembran der sich teilenden Caco-2-Zelle an. Dagegen wurde, wenn Caco-2 -Zellen mit Fluorescein-markiertem WGA unter denselben Bedingungen gefärbt wurden, das Lektin über das Zytoplasma verteilt, wobei einige intensiv gefärbte granuläre Bereiche vorlagen, was eine vesikuläre Akkumulation anzeigt. Somit folgt auf die Zellbindung des Konjugats die Aufnahme des Prodrugs, wobei jedoch das intrazelluläre Verteilungsmuster von der für die Konjugation verwendeten Substanz abhängig ist. Antiproliferative Wirkungen von DOX-WGA auf Tumorzellen und Lymphoblasten
Die Wirkung von WGA, F-WGA, DOX und DOX-WGA auf das Wachstum von Tumorzellen wurde mittels des XTT-Tests untersucht. Bei diesem Test wird das Tetrazol-Salz XTT durch lebensfähige Zellen meta- bolisch reduziert, die das lösliche, stark gefärbte Formazan ergeben, das ein Indikator für die Zellproliferation ist. Obwohl WGA die Proliferation von Caco-2-Zellen in Dosis-abhängiger Weise inhibierte und eine 50% Hemmung des Zellwachstums (IC ) bei 530+40 ng WGA/2xl04 Caco-2-Zellen zeigte, wie aus einer sigmoi- dalen Kurve nach Boltzman errechnet, hatten WGA-Konzentrationen von <60 ng/Vertiefung keinen wesentlichen Einfluß auf das Zellwachstum (Fig. 4) . Dagegen veränderte eine Markierung von WGA unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat die Hemmaktivität des Lektins und führte zur IC_ 0 = 623±84 ng F-WGA/2xl04 Caco-2- Zellen. Außerdem stimulierte nach Zugabe geringerer Mengen als 54 ng F-WGA das markierte Lektin die Proliferation von Caco-2- Zellen.
Unter Berücksichtigung des Einflusses des nicht-modifizierten Carrier-Proteins auf die Hemmaktivität von DOX-WGA waren die Konzentrationen von WGA und DOX, die im XTT-Test angewendet wurden, gleich dem Konjugat, um' eine Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten vorzusehen. Während WGA das Caco-2 -Zellwachstum in einem Ausmaß von 40,3±14,6% (bei 450 ng WGA/104 Zellen) und 6,7+3,3% (bei 320 ng WGA/104 Zellen) hemmte, nahm die zytosta- tische Aktivität von DOX-WGA auf Caco-2-Zellen zu bei einer gleichzeitigen Abnahme der WGA-Konzentrationen um 14,3+8,3% bzw. 34,0+6,1% (Fig. 5A) . Anderseits ergaben äquivalente Mengen von DOX-WGA 63% oder 46% der antiproliferativen Wirkung von DOX.
Im Vergleich zu Caco-2-Zellen übten gleiche Mengen der untersuchten Substanzen einen geringeren Einfluß auf die Lebensfähigkeit lymphoblastischer MOLT-4-Zellen aus (Fig. 5B) . Während DOX das Zellwachstum in einem Ausmaß von etwa 13+5,2% hemmte, betrug die Hemmaktivität von DOX-WGA auf MOLT-4-Zellen 9,4+3,2% (bei 450 ng/104 Zellen) bzw. 5,0±2,6% (bei 320 ng/104 Zellen). Im Gegensatz zum XTT-Test war der Einfluß des Carrier-Proteins alleine auf die Proliferation von Caco-2 -Zellen ein ganz anderer, wie mittels Quantifizierung des DNA-Gehalts durch den BrdU- Test bestimmt. Während die Konzentration des Carrier-Proteins von 600 auf 300 ng WGA/5000 Zellen abnahm, wurde anfänglich keine wesentliche Hemmwirkung (4,6±12,3%) beobachtet, doch wurde diese Wirkung in eine zunehmende Stimulation des Caco-2 -Zellwachstums umgewandelt (Fig. 6) . Anderseits zeigten im Vergleich zu DOX-WGA, äquivalente Mengen des freien Arzneimittels eine hohe zytostatische Aktivität, was zu einer Wachstumshemmung von durchschnittlich 95,2+2,1% führte. Nach Vorinkubation von Caco- 2 -Zellen mit DOX-WGA nahm die antiproliferative Aktivität äquivalenter Dox-Mengen um 20+5,6% ab.
Diskussion
Um einen Vorteil aus der sehr verschiedenen WGA-Bindungskapazität von Caco-2-Zellen und humanen Colonozyten für die zielgerichtete Zufuhr von Arzneimitteln zu Colonkarzinom-Zellen in vi tro (11) zu ziehen, wurde DOX durch einen zweistufigen Mechanismus über eine säureempfindliche cis-Aconitinsäure-Bindung ko- valent an WGA gekoppelt (12) . Da WGA eine Mischung aus vier Iso- lektinen (17) darstellt, wurde für die Bewertung der Kopplungs- effizienz durch eine Kombination des TNBS-Tests mit ADH festgestellt, daß die Anzahl der Amino-Reste an WGA 24±1,4 ist. Die Kopplung wurde qualitativ und quantitativ durch UV/VIS-Diffe- renz-Spektroskopie bestätigt und ergab ein Konjugat frei von nachweisbarem, nicht-kovalent gebundenem Arzneimittel, das 24 Mol DOX/Mol WGA enthielt. Trotz einer Derivatisierung fast aller zugänglichen Amino-Reste von WGA wurde die Wasserlöslichkeit von DOX-WGA beibehalten. Gemäß der Literatur (15) war die cis-Aconi- tyl-Bindung zwischen dem Arzneimittel und WGA pH-empfindlich, wobei sie bei pH 7 , 0 stabil war, und wies eine Halbwertszeit von 1 h bei pH 4,0 auf. Innerhalb von 168 h wurden jedoch nur 50% des Arzneimittelgehalts aus DOX-WGA freigesetzt, im Vergleich zu einer fast 100% Freisetzung des mit einem Antikörper konjugierten Daunomycin bei einem pH-Wert von 3,0 (14) . Bei unserer Arbeit wurde N-cis-Aconityl-Doxorubicin in aprotischen Milieu aktiviert, was vermutlich gleiche Mengen des N-Hydroxy-Succinimid- esters von sowohl ß- als auch γ-Carboxyl ergab. Da eine freie eis-Carbonsäure-Funktion eine Voraussetzung für eine pH-Empfindlichkeit der Bindung ist (15) , kann die Freisetzung von lediglich der Hälfte des konjugierten DOX der Bildung einer Amid-Bin- dung zwischen WGA und dem -Carboxyl des α-Monoamid-Isomers von N-cis-Aconityl-Doxorubicin zuzuschreiben sein.
Wie mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie von F-WGA und DOX-WGA bestätigt wurde, behielt das N-Acetylglucosamin-spezi- fische Lektin seine bioadhäsiven und cytoinvasiven Eigenschaften nach Konjugation des zytostatischen Mittels bei. Infolge der Säureempfindlichkeit der Bindung wird eine intralysosomale Freisetzung von konjugiertem DOX erwartet, wenn DOX-WGA das saure Milieu des lysosomalen Kompartiments erreicht. Als Folge der Derivatisierung wurde das intrazelluläre Verteilungsmuster von WGA verändert, was zur Akkumulation von DOX-WGA nahe der Kernmembran von Caco-2 -Zellen führte.
Die Bindungs-Spezifität des Konjugats wurde mittels durchfluß- zytometrischer Bestimmung von zellgebundener Fluoreszenz-Intensität, die von DOX-WGA stammt, bewertet. Unabhängig von der Einwirkungszeit zeigte DOX-WGA eine Dosis -abhängige Bindung an Ziel- und Nicht-Zielzellen, wobei jedoch das Ausmaß sehr verschieden war. Im Durchschnitt überstieg die Bindungskapazität der Colonkarzinom-Zellen Caco-2 jene der humanen Colonozyten und lymphoblastischen MOLT- -Zellen um ein 4, 5 -Faches. Außerdem wurde keine Bindung von DOX-WGA an humane Erythrozyten nachgewiesen. Diese Ergebnisse sind Indikatoren für eine hohe Ziel-Spezifität des Konjugats. Unter Berücksichtigung des hohen Ausmaßes der Kopplung könnte das abnehmende Verhältnis der Bindung an Caco-2-Zellen gegenüber humanen Colonozyten von 13:1 (F-WGA, 11) auf 4:1 (DOX-WGA) mit einer dichten Derivatisierung des Lektins durch das hydrophobe Anti-Krebs-Arzneimittel in Verbindung stehen, wie sie für Immunkonjugate beobachtet wurde (18) .
Als die Auswirkungen von WGA und F-WGA auf die Mitose untersucht wurden durch Bestimmung der mitochondrialen Dehydrogenase-Aktivität, wurden gemäß Ryder et al . (19) reversierende Wirkungen auf das Zellwachsum von Caco-2 beobachtet: bei vergleichbaren Konzentrationen zeigte das native Lektin eine Dosis-abhängige Hemmung des Caco-2 -Zellwachstums , doch nach Konjugation des Fluoresceins kehrte sich diese Hemmwirkung um in eine Stimulation bei Konzentrationen von <54 ng F-WGA/2xl04 Zellen. Wie von Kawamoto et al . (20) beobachtet, hemmte der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF) die Proliferation von epidermoiden A431-Karzinom-Zellen im nM-Bereich, hatte jedoch eine mitogene Wirkung im pM-Bereich. Da die Tyrosin-Kinase-Akti- vität des EGF-Rezeptors durch WGA in einem ähnlichen Ausmaß aktiviert wurde wie die durch den epidermalen Wachstumsfaktor induzierte Verbesserung (21) , ist diese Wirkung möglicherweise auf eine EGF-Rezeptor-Bindung von WGA zurückzuführen.
Der Beitrag des Carrier-Proteins von DOX-WGA zur antiprolifera- tiven Wirkung des Kojugats auf Caco-2-Zellen war jedoch ziemlich gering, da die Hemmaktivität äquivalenter Mengen von WGA und DOX-WGA 6,7+3,3% bzw. 39+6,1% betrug. Somit stammt die zytosta- tische Aktivität von DOX-WGA haupsächlich vom konjugierten Arzneimittel und ergibt etwa 60% der zytostatischen Aktivität von freiem DOX. Bei Durchführung des XTT-Tests mit lymphoblastischen MOLT-4-Zellen als Modell für Nicht-Zielzellen wurde das Zellwachstum durch DOX-WGA in Dosis-abhängiger Form im Vergleich zu freiem DOX (100%) in einem Ausmaß von bestenfalls 35% gehemmt. Diese abnehmende antiproliferative Aktivität äquivalenter Mengen von DOX auf Nicht-Zielzellen könnte der zielgerichteten Zuführung des Anti-Krebs-Mittels nach Konjugation mit WGA zuzuschreiben sein.
Da ein unbeeinträchtigtes Wachstum von mit äquivalenten Mengen des Carrier-Proteins vorinkubierten Caco-2 -Zellen für eine eindeutige Berechnung der antiproliferativen Aktivität von DOX-WGA notwendig ist, wurde die BrdU- Inkorporierung während der DNA- Synthese entsprechend der Anzahl der sich teilenden Zellen bestimmt. Bei äquivalenten Konzentrationen von WGA und DOX im Vergleich zu DOX-WGA, hemmte das Carrier-Protein alleine das Caco- 2 -Zellwachstum nur geringfügig oder stimulierte es, und das freie Arzneimittel zeigte im Durchschnitt eine 95% Wachstumshemmung. Die antiproliferative Wirkung von konjugiertem DOX hatte einen Mittelwert von 78%. Wenn man eine nur 50% Freisetzung von gebundenem DOX in vi tro annimmt, könnte die zytostatische Wirkung von DOX-WGA infolge der Stellen-spezifischen Effizienz von konjugiertem DOX gleich oder etwas höher sein als jene des freien Arzneimittels.
Herstellung eines WGA-Prothrombin-Konjugates
Prothrombin - Blutgerinnungsfaktor II - ist ein Plasmaprotein aus der Gruppe der Vitamin K-abhängigen Proteine mit einer Molekülmasse von 72.000 Dalton. Prothrombin wird therapeutisch angewendet und ist essentieller Bestandteil von Prothrombinkomplex- konzentraten, welche zur Prophylaxe und zur Therapie von Blutungen bedingt durch angeborene oder erworbene Mängel an Prothrom- binkomplexfaktoren eingesetzt werden.
Prothrombin (Faktor II) wurde aus Prothrombinkomplexkonzentrat hergestellt nach Brummelhuis (23) durch Adsorption an Calcium- phosphat und Elution mit Natriumphosphat, durch Anionenaus- tauschchromatographie an DEAE-Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Schweden) sowie durch hydrophobe Chromatographie über Phenyl- Sepharose gereinigt. Für die folgenden Synthesen wurde eine Präparation verwendet, die einen Faktor II-Gehalt von 12,3 mg FH/ml Citratpuffer (13,6 mM Na-Citrat, 137 mM NaCl, pH 7,0) aufwies .
Das gereinigte Prothrombin wurde gemäß dem folgenden Prinzip mit WGA konjugiert.
Eine Disuccinimidylsuccinatlösung (voraktivierter Spacer) wurde durch Inkubation von N-Hydroxysuccinimid und Bernsteinsäureanhydrid mit Carbodiimid hergestellt und zur Aktivierung des mit Fluorescein (FITC) markierten Prothrombins eingesetzt. Das so hergestellte, derivatisierte Prothrombin mit aktiven N-Hydroxy- succinimidester-Gruppierungen wurde anschließend zur Kupplung an WGA verwendet. Auf diese Weise wurden zwei verschiedene Proben hergestellt (Synthese gemäß Ansatz 1 bzw. 2)
Markierung von Faktor II mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Zur Markierung von Faktor II mit Fluorescein wurde FITC in einer Mischung aus Faktor II-Lösung und Reaktionspuffer (25 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 8,0) gelöst und über 5 Stunden (Ansatz 1) bzw. über Nacht (Ansatz 2) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Die angegebenen molaren Verhältnisse wurden auf der Basis von 29 freien Aminogruppen des Prothrombins (N-Termi- nus und Lysinreste) kalkuliert.
Ansatz 1 (2 Mol FITC/Mol NH_ )
2,9 mg FITC (V, 5 μMol)
750 μl FII-Lösung (9,2 mg FIl/0,13 μMol)
750 μl Puffer
Ansatz 2 (0,3 Mol FITC/Mol NH_ )
0,45 mg FITC (1,16 μMol)
750 μl FII-Lösung (9,2 mg FIl/0,13 μMol)
750 μl Puffer
Zur Abtrennung des Reagens vom markierten Faktor II wurde über Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in DMSO/Hepes-Puffer, pH 8,0; 1+1-Mischung) chromatographiert. Die Fraktionen im Ausschlußvolumen (ca. 2,0 ml) wurden gesammelt und für die weitere Synthese eingesetzt.
Synthese des voraktivierten Spacers
Der voraktivierte Spacer wurde durch Inkubation von 14 mg (125 μMol) N-Hydroxysuccinimid, 5 mg (50 μMol) Bernsteinsäureanhydrid und 96 mg (500 μMol) l-Ethyl-3-dimethylaminopropyl-carbodiimid (EDAC) in 3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) über 20 Minuten unter leichtem Schütteln hergestellt.
Aktivierung von FITC-markiertem Prothrombin
Die Aktivierung von FITC-markiertem Prothrombin erfolgte durch die folgenden beiden Reaktionsansätze. Die Gemische wurden jeweils über eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert . Ansatz 1
300 μl variabler Spacer
2.7 ml DMSO
2,0 ml FITC-markiertes Prothrombin
Ansatz 2
75 μl variabler Spacer
2,925 ml DMSO
2,0 ml FITC-markiertes Prothrombin
Nach der Reaktion wurde in jeweils zwei Durchgängen über Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (in DMSO/Hepes- Puffer = 1 + 1) chromatographiert; Puffersystem: 25 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 8,0. Dazu wurden jeweils 2 , 5 ml auf die Säule aufgetragen. Die Fraktionen im Ausschlußvolumen wurden vereinigt und für die Konjugation mit WGA eingesetzt.
Umsetzung des aktivierten Prothro bin-Derivates mit WGA
Die Kupplung mit WGA (Fa. Vector) erfolgte durch Zugabe des festen Lektins zur Lösung des aktivierten Prothrombins bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln über Nacht.
Ansatz 1 1,25 mg WGA
1.8 ml Lösung aktiviertes Prothrombin
Ansatz 2 1 , 7 mg WGA
3,7 ml Lösung aktiviertes Prothrombin
Abschließend wurde jedem Ansatz 5 mg Glycin zugesetzt und über eine Sephadex G-25-Säule in 0,9 %iger NaCl-Lösung (Ansatz 1) bzw. 25 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7 , 2 (Ansatz 2) chromatographiert. Die Chromatographie wurde für Ansatz 2 in 2 Säulenläufen durchgeführt .
HPLC -Analysen Sämtliche Zwischenprodukte der Synthesen wurden mittels HPLC- Analyse unter Verwendung einer HPLC-Gelfiltrationsäule untersucht .
HPLC-System: Bio-Rad Model 8441 AT mit Model 1790 UV/VIS-Monitor Säule: Bio-Rad Bio-Sil SEC 125, 300 x 7,8 mm (Trennbereich: ca.
5.000-150.000 Da) Elution: PBS-Puffer, pH 7,2 Flußrate: 0,5 ml/min Messung der UV-Absorption bei 280 nm
Die Methode wurde für die Abschätzung der Proteinkonzentrationen und zum Nachweis der Änderung der Proteingröße während der Reaktion verwendet.
Charakterisierung der Endprodukte
Die HPLC-Analyse für beide Endprodukte zeigt nur ein Signal im Ausschlußvolumen der Gelfiltrationssäule an, das auf ein Molekulargewicht von größer als 150.000 Da hindeutet. WGA und Prothrombin konnten nicht nachgewiesen werden.
Die SDS-Gelelektrophorese mit einem nicht reduzierenden 12,5 %- igen Gel und anschließender Silberfärbung zeigt für die beiden Proben die folgende Banden:
Probe 1
Kein WGA nachweisbar
Schwache Faktor II-Bande bei ca. 70.000
Diskrete Doppelbande (schwach) bei ca. 250.000 Da
Größter Teil des Proteins an der Auftragstelle (> 1 x 10δ Da)
Probe 2
Schwache WGA-Bande bei ca. 30.000 Da nachweisbar Deutliche Faktor II-Bande bei ca. 70.000 Da erkennbar Konjugate von ca. 150.000 bis > 1 x 106 Da (sehr starke Banden) erkennbar . Über beide Syntheseansätze konnte also eine Konjugation des Pro- thrombins mit WGA erreicht werden, wobei der Derivatisierungs- grad durch die Wahl der Reaktionsbedingungen und den Aktivierungsgrad der Kupplungspartner gesteuert werden konnte .
Charakterisierung der cytoadhäsiven Eigenschaften des Fluores- cein-markierten Prothrombin-WGA-Konjugates
Die Bestimmung der cytoadhäsiven Eigenschaften des Konjugates (Ansatz 1) erfolgte mittels Durchflußzytometrie, wo ausschließlich zellgebundene, fluoreszierende Stoffe erfaßt werden. Die Bindungsstudie wurde bei 4°C durchgeführt, um mögliche durch Weizenlektin verursachte Internalisationsprozesse auszuschlies- sen. In diesem Temperaturbereich werden alle energieabhängigen Transportprozesse weitgehend ausgeschlossen, so daß nur die Bindungsrate an die Zelloberfläche der Coloncarcinomzellen erfaßt wird.
Als Modell für intestinale Enterozyten wurden Caco-2 Einzelzellen verwendet, deren Differenzierungsmuster humanen Enterozyten entspricht und die als in vitro-Modell für den humanen Dünndarm etabliert und oben beschrieben sind.
Durchführung
50 μl Caco-2-Zellsuspension (6 Millionen/ml) wurden mit 50 μl Konjugatlösung (unverdünnt, 1+4 verdünnt) und 100 μl PBS-Puffer (Ca und Mg-hältig) 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Danach wurde die Zellsuspension zentrifugiert (1000 rpm) und 130 μl Überstand abgehoben und durch PBS ersetzt. Nach zweimaligem Waschen wurden 1000 μl PBS (partikelfrei) zugesetzt und im Flow-Cytometer analysiert .
Als Leerwert diente eine entsprechende Zellsuspension in PBS, als Vergleich eine analog bereitete Präparation mit fluoreszenz- markiertem Prothrombin. Ergebnis
Die Zellsuspension zeigte kein Signal einer zellgebundenen Fluoreszenz. Während fluoreszenzmarkierter Faktor II eine äußerst geringe Bindungsrate an Caco-2-Zellen zeigte (unverdünnt: 1,62, 1+4, verdünnt 2,57, mittlere zellgebundene Fluoreszenzintensität) , wurde das Konjugat aus fluoreszenzmarkiertem Faktor II und Weizenlektin äußerst stark an Caco-2-Zellen gebunden. Die mittlere zellgebundene Fluoreszenzintensität betrug 311 (unverdünnt) bzw. 103,4 (1+4 verdünnt).
Demnach wurde fluoreszenzmarkiertes Prothrombin erst durch die Kopplung an Weizenlektin an die Oberfläche von Caco-2-Zellen gebunden (siehe Fig. 7) . Die dargestellten Ergebnisse zeigen, daß durch selektives Drug Targeting der Blutgerinnungsfaktor Prothrombin einem Zielkompartiment, im Fall der gezeigten Experimente einer Modell zelle für das Dünndarmepithel, zugeführt werden kann. Weizenlektin vermittelt demzufolge cytoadhäsive Eigenschaften, die für eine mögliche Resorbierbarkeit von Faktor II Voraussetzung sind. Durch die Anlagerung an die Zelloberfläche könnte einerseits durch unspezifische Endocytose, andererseits allein durch lokale Erhöhung des Konzentrationsgradienten zwischen Extrazellulär- und Intrazellulärraum eine erhöhte Diffusion und damit eine Resorbierbarkeit nach peroraler Applikation möglich sein.
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Pharmazeutisches Präparat, umfassend ein Lektin, an das ein aus Blut gewinnbares Protein, insbesondere ein Blutgerinnungs- faktor, oder dessen rekombinantes Äquivalent verabreichungsstabil gebunden ist.
2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin ein pflanzliches Lektin ist.
3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin ausgewählt ist aus Concanavalin A, Abrin, Ricin, Phasin oder WGA, insbesondere WGA.
4. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichungsstabile Bindung zwischen Lektin und dem Protein eine säurelabile, kovalente Bindung ist .
5. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichungsstabile Bindung zwischen Lektin und dem Protein durch eine Protease, die spezifisch für Zielkompartimente ist, gespalten wird.
6. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin ein modifiziertes Lektin ist.
7. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin ein an seinem Zielkom- partiment zum Arzneimittel modifiziertes Lektin ist.
8. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lektin ein an seiner Bindungs- stelle zu Zielkompartimenten modifiziertes Lektin ist.
9. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es zur peroralen Verabreichung kon- fektioniert ist und gegebenenfalls eine magensaftresistente Hüllschicht aufweist.
10. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das WGA ist und das Protein über die säurelabile eis-Aconityl-Bindung verbunden ist.
11. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Prodrug-Formulierung vorliegt .
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