WO1999058668A1 - Nouveaux polypeptides, adn complementaires les codant et utilisation de ces polypeptides - Google Patents

Nouveaux polypeptides, adn complementaires les codant et utilisation de ces polypeptides Download PDF

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WO1999058668A1
WO1999058668A1 PCT/JP1999/002485 JP9902485W WO9958668A1 WO 1999058668 A1 WO1999058668 A1 WO 1999058668A1 JP 9902485 W JP9902485 W JP 9902485W WO 9958668 A1 WO9958668 A1 WO 9958668A1
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cdna
polypeptide
present
cells
activity
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PCT/JP1999/002485
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Daikichi Fukushima
Shiro Shibayama
Hideaki Tada
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Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel polypeptides, cDNAs encoding the polypeptides, and uses thereof.
  • secretory proteins such as growth differentiation factors (for example, various types of cytokines) and membrane proteins such as receptors thereof (hereinafter collectively referred to as secretory proteins and the like) are mostly N-terminal. Focusing on the fact that they have a sequence called a signal peptide, we have intensively studied a method for efficiently and selectively cloning cDNA having a sequence encoding a signal peptide.
  • the cDNA sequence provided by the present invention has been identified as clone ⁇ C001, OM237, OA004b, and based on information obtained using the yeast SST method, a human adult brain tissue and a cell line derived from brain tissue. (T 98 G, ATCC No. CRL-1690).
  • Clone OC 001, OM237, ⁇ A004b is a full-length cDNA containing a complete cDNA sequence encoding a membrane protein (herein represented as ⁇ C001, OM237, OA004b proteins, respectively).
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clone OAF075b, and based on the information obtained using the yeast SST method, an adult human bone marrow-derived cell line HAS 303 (human bone marrow stromal cell) was used. Strain: courtesy of Keiichi Toyama, Assistant Professor, Tokyo Medical University, and Shinsuke Aizawa, described in J. Cell. Physiol. 148, 245-251, 1991 and Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994)) Isolated from the library. Clone OAF 075b is a full-length cDNA containing the complete cDNA sequence encoding a secreted protein (herein designated as OAF 075b protein).
  • the present invention is a.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, or 12,
  • a cDNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10 or 13;
  • the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12 in a substantially pure form, a homolog thereof, a fragment of the sequence and a homolog thereof.
  • the invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides. More specifically, a cDNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, or 13, and a cDNA represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, 13, 3, 8, 11, or 14
  • the present invention relates to cDNA comprising a fragment that selectively hybridizes to a nucleotide sequence.
  • the hybridizing cDNA also includes a sequence complementary to the above sequence. Hybridization is preferably performed under stringent conditions.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12 in a substantially pure form generally means at least 90% of the polypeptide at the time of production, for example, 95, 98 Or means that 99% is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12. I do.
  • a homologue of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12 generally means at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 contiguous amino acid regions. And at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologs are hereinafter described as polypeptides of the present invention.
  • a fragment of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12, or a homolog fragment thereof is a fragment of at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example, 20, 25 , 30, 40, 50 or 60 amino acid moieties.
  • at least 20, preferably at least 20, cDNAs that selectively hybridize to the cDNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, 13, 3, 8, 11, or 14 Is at least 30, for example 40, 60 or 100 contiguous base sequence regions, at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, Such a cDNA is described below as the cDNA of the present invention.
  • a cDNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, 13, 3, 8, 11, or 14 is at least 10 bases, preferably at least 15 bases, e.g., 20, 25, It means a 30 or 40 base portion, and such fragments are also included in the cDNA of the present invention.
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector include a plasmid, a virus or a phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the above-mentioned cDNA, a regulator of the promoter, and the like.
  • Vectors contain one or more selectable marker genes, such as ampicillin-resistant genes. It may contain a gene.
  • the vector can be used in vitro, for example, for the production of RNA corresponding to cDNA and the transformation of host cells.
  • the present invention provides a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, 13, 13, 3, 8, 11, or 14 or a cDNA having an open reading frame thereof.
  • host cells transformed with a vector for replicating or expressing the cDNA of the present invention comprising Cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably carried out under conditions under which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • the antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of the vector as described above. Such antisense RNA can also be used to control the level of the polypeptide of the present invention in cells.
  • the present invention also includes the monoclonal or polyclonal antibodies of the polypeptides of the present invention. Further, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by the usual hybridoma technology using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. The polyclonal antibody can be produced by a usual method in which a host animal (for example, rat or egret) is inoculated with the polypeptide of the present invention, and immune serum is collected.
  • a host animal for example, rat or egret
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, an antibody thereof, a pharmaceutically acceptable excipient, and Z or a carrier.
  • polypeptide of the present invention SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or
  • amino acid sequence consisting of the amino acid sequence shown in 12 those lacking part (for example, the polypeptide consisting only of a part essential for the expression of a biological activity in SEQ ID NO: 1) and others
  • amino acid having similar properties those obtained by substituting with another amino acid (for example, those obtained by substituting with an amino acid having similar properties), and those obtained by adding or inserting another amino acid to the polypeptide of the present invention.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention specified by (2) includes all nucleotide sequence groups encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 or 12 of (1). By changing the nucleotide sequence, the productivity of the polypeptide may be improved.
  • the cDNA specified in (3) is one embodiment of the cDNA shown in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNA shown in (4) shows a sequence obtained by adding a natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
  • cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, 8, 11, or 14 is performed according to the following method.
  • invertase In order for yeast such as Saccharomyces cerevis ⁇ to use sucrose or raffinose as an energy or carbon source, invertase must be secreted into the culture medium (invertase is a raffinose). Sucrose into sucrose and melibiose, and sucrose into fructose and glucose.) Many known mammalian signal peptides are also found in yeast. It is known that invertase can be secreted. Based on these findings, this method was developed as a method for screening a novel signal peptide that enables the secretion of yeast invertase from a mammalian cDNA library using the growth of yeast on raffinose medium as an indicator. .
  • a non-secreted invertase gene, SUC2 (GENBANK accession No. V0131l), from which the translation start point ATG was deleted, was transformed into a yeast expression vector (expression promoter (ADH Promote Ichiichi) and terminator (ADH Terminator I)).
  • yeast origin of replication is 2 ori
  • yeast selection marker is TRP 1
  • E. coli replication origin is Co 1 E 1 ori
  • E. coli drug resistance marker is 1 In this case, ampicillin was used to prepare yeast SST vector pSUC2.
  • a yeast SST cDNA library was prepared by incorporating mammalian cDNAs upstream of the SUC2 gene. This library was transformed into a yeast deficient in secretory invertase. When the integrated mammalian cDNA encodes a signal peptide, it is considered that it also has a secretion effect on invertase expressed in yeast, and as a result, it can be grown on a roughinos medium. Therefore, yeast was cultured from the emerged colonies to prepare a plasmid, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined, thereby making the search for a novel signal peptide quick and easy.
  • step (1) After stimulating with a suitable stimulant from a target mammalian organ or cell line as necessary, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described. Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published in 1989 from the Cold Spring Harbor Laboratory Press) v. Current Protocol in Molecular Biology (ed. By FM Ausubel et al., John Wiley &
  • MRNA is isolated according to
  • the target cells were HAS 303 (human bone marrow stromal cell line: courtesy of Keiichi Toyama, Assistant Professor, Tokyo Medical University, and Shinsuke Aizawa. J. Cell. Physiol. 148, 245-251, 1991 and Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994), or the human glioblastoma cell line T98G (ATCC No. CRL-1690).
  • the tissue includes a human adult brain.
  • the synthesis of double-stranded cDNA using a random primer is performed by a known method.
  • the restriction enzyme (enzyme I) site to be connected to the adapter and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • XhoI is used as enzyme I
  • EcoRI is used as enzyme ⁇ .
  • step (2) the ends are blunted with T4 DNA polymerase, and the enzyme is digested with enzyme I, followed by digestion with enzyme I and fractionation of 300-800 bp cDNA by agarose electrophoresis (AGE).
  • Enzyme II may be anything that is different from enzyme I as described above.
  • Step (3) is a step of transforming E. coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the invertase gene from which the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector has been deleted.
  • various yeast expression plasmid vectors are known.
  • YEp24 which also functions in E. coli, is used.
  • UC 2 is used.
  • E. coli strains for transformation are already known and are preferably DH10B competent cells.
  • the transformation may be performed by any known method, but is preferably performed by electroporation.
  • the transformant is cultured by a conventional method, and a cDNA library for yeast SST is obtained.
  • the cDNA library must be prepared by removing the yeast Saccharomyces cerevisiae (Saccharnmycs er.visiae) (for example, strain YT455) or a strain in which the invertase gene has been artificially deleted. Then, the cDNA library is introduced, and a fragment having a sequence encoding a signal peptide is screened.
  • the yeast is transformed by a known method, for example, the lithium acetate method. After the transformants are grown on a selective medium, they are transferred to a medium containing raffinose as a carbon source, viable colonies are selected, and the plasmid is recovered. The fact that the yeast grew using raffinose as a carbon source indicates that a signal peptide of some secreted protein was incorporated into the library.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone was determined, and for cDNA that was found to encode an unknown protein, a full-length clone was isolated using it as a probe, and the full-length nucleotide sequence was determined. Can be determined. These operations are performed in a manner known to those skilled in the art.
  • CDNAs encoding DNAs or homologs and subsets of the proteins of the invention can be obtained.
  • synthesizing an oligonucleotide having an appropriate nucleotide sequence and using it to hybridize from a mammalian cDNA library or mRNA to the PCR method, or by hybridizing a fragment having an appropriate nucleotide sequence as a probe A cDNA encoding another mammalian type of the protein can be obtained from the mammalian cDNA library or the genomic library.
  • the cDNA thus obtained contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that the signal peptide is coded. It is clear that the cDNA is full-length, or nearly full-length (the signal peptide is encoded at the 5 'end of the open reading frame of the cDNA, due to the fact that the signal peptide is without exception at the N-terminus of the protein).
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe according to a known method.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the cDNA of the present invention can be obtained. Furthermore, the required amount of cDNA can be obtained by introducing the vector-containing cDNA containing the cDNA of the present invention into an appropriate host and growing it.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of cDNA encoding the mature protein, and the resulting cDNA is cloned into a suitable promoter (eg, trp promoter, lac promoter).
  • a suitable promoter eg, trp promoter, lac promoter.
  • connect downstream of the ⁇ L promoter, ⁇ 7 promoter, etc. and insert into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) to produce an expression vector.
  • Escherichia coli for example, E. Coli DH1, E. Coli JMl09, E. Coli HB101 strain, etc. transformed with this expression vector is cultured in an appropriate medium, and the target cells are transformed from the cells.
  • a peptide can be obtained.
  • the use of a bacterial signal peptide allows the secretion of the target polypeptide during periplasm. In addition, it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • a cDNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, 8, 11, or 14 may be replaced with an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, a papilloma virus vector, Create an expression vector by inserting it into the downstream of an appropriate promoter (eg, SV40 promoter, LTR promoter, meta-oral thionine promoter, etc.) in the vaccinia virus vector, SV40-based vector, etc. .
  • an appropriate promoter eg, SV40 promoter, LTR promoter, meta-oral thionine promoter, etc.
  • appropriate mammalian cells for example, monkey COS-7 cells, —Human hamster CH ⁇ cells, mouse L cells, etc.
  • fusion * protein (fusion protein) can also be produced by linking to other polypeptides, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of an antibody.
  • the protein of the present invention is a membrane protein
  • the desired polypeptide is expressed on the cell membrane.
  • a deletion lacking the transmembrane region of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, 10, or 13 is inserted into the above-described vector, and used to transform an appropriate mammalian cell.
  • the desired soluble polypeptide is secreted into the culture solution.
  • fusion of a cDNA fragment encoding the deletion form lacking the transmembrane region and another polypeptide, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody results in fusion.
  • a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody results in fusion.
  • 'Can also produce protein (fusion protein).
  • polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Industrial applicability
  • polypeptides of the present invention and the cDNA encoding them will exhibit one or more effects or biological activities, including those associated with Atsushi listed below.
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the present invention may be attributed to the administration or use of the protein, or the administration or use of a cDNA encoding the protein (eg, a vector suitable for gene therapy or cDNA transfer).
  • the protein of the present invention has a cytodynamic activity and cell proliferation (induction or inhibition)
  • proteins of the present invention also exhibit immunostimulatory and immunosuppressive activities. Certain proteins may also regulate (stimulate or inhibit) the growth and proliferation of, for example, T and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations.
  • T and / or B lymphocytes T and / or B lymphocytes
  • cytotoxic activity of NK cells and other populations By giving the compound, it is considered to be effective for the treatment of various immunodeficiencies and diseases V severe combined immunodeficiency (SCID).
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • These immunodeficiencies can be hereditary or can be caused by viruses such as HIV, as well as bacterial or mold infections. Alternatively, it may come from an autoimmune disease.
  • various molds such as HIV, hepatitis viruses, herpes viruses, mycobacteria, leshmania, malaria and Candida It is believed that the causes of infectious diseases caused by viruses, bacteria, molds or other infections, including infections, can be treated by using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention is considered to be effective in places where it is generally suggested that the immune system is enhanced, that is, in the treatment of cancer.
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. I want immunosuppression Other conditions, including, for example, asthma and related respiratory diseases, could be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may be, for example, inflammatory bowel disease such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), Crohn's disease, or TNF which has been demonstrated to be effective by IL-11. It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections resulting from overproduction of cytokines such as IL-1 and IL-11.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • TNF TNF which has been demonstrated to be effective by IL-11. It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections resulting from overproduction of cytokines such as IL-1 and IL-11.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or lymphoid cells deficiency. Even weak biological activities, with the help of colony forming cells or factor-dependent cell lines, suggest that they may be involved in the control of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to one or all of the following examples.
  • erythroid progenitors alone, or in combination with other cytokines, and suggests their efficacy, e.g., treating various anemias, or stimulating production of erythroid progenitors and / or erythrocytes
  • Radiation therapy used in combination with Z chemotherapy supports the growth and proliferation of myeloid cells such as granulocytes and monocytes / macrophages (ie, classical CSF activity), and prevents myelosuppression associated with chemotherapy Combination with chemotherapy; during platelet transfusion to support the growth and proliferation of megakaryocytes and the subsequent growth and proliferation of platelets, thereby preventing and treating various platelet disorders such as thrombocytopenia; Complementary general use; growth and expansion of hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the above hematopoietic cells Has a therapeutic effect on various stem cell disorders (including, but not limited to, aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, such as those commonly treated
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used in any of bone, cartilage, tendons, ligaments, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and / or bone or any growth in an environment that does not form bone normally have application in the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals. It is considered that the preparation using the protein of the present invention can be used prophylactically for reduction of closed fracture as well as open fracture and improvement of fixation of artificial joint. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the restoration of craniofacial defects induced by congenital, traumatic, carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs are thought to provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the proteins of the present invention may be used to stimulate osteoporosis and / or cartilage by stimulating the repair of bone and / or cartilage, or by inhibiting the process of inflammation or tissue destruction mediated by the inflammatory process (collagenase activity or osteoclast activity). It is considered effective for treating osteoarthritis.
  • tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon z Ligament formation.
  • the protein of the present invention induces the formation of tendon / ligament-like tissue or other tissues in an environment where such tissue is not normally formed, although tendon / ligament tears, malformations, and other Applicable for healing of tendon / ligament disorders.
  • Formulations that use proteins that induce tendon / ligament-like tissue can be used to improve the fixation of tendon Z ligaments to bone or other tissues and to repair tendon / ligament tissue defects, as well as tendons or ligaments Preventive use may be considered to protect against damage.
  • Neoplastic tendon / ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin. It is also effective in cosmetic plastic surgery in which tendons or ligaments are attached or repaired. It is believed that the constructs of the present invention provide an environment that attracts the tendon ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate. Alternatively, they induce tendon ligament cells or their progenitors in ex vivo for return to in vivo for tissue repair.
  • the compositions of the invention are also effective in treating tendinitis, Carpal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the compositions also include sequestering agents well known to those skilled in the art, as well as suitable matrices and carriers.
  • the protein of the present invention may be used for the growth of nerve cells and regeneration of nerve and brain tissue, ie, central and peripheral nerves as well as mechanical and traumatic disorders including degeneration, death, or trauma to nerve cells or nerve tissue. It may also be effective in treating systemic and neurological disorders.
  • certain proteins are diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral disease ( It is thought to be effective in treating central nervous system disorders such as amyotropic lateral) and Shy-Drager syndrome.
  • Further conditions that can be treated in accordance with the present invention include cerebrovascular disease such as spinal cord injury, head trauma, and stroke.
  • mechanical and traumatic disorders such as Peripheral neuropathy resulting from chemotherapy or other treatments can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention has an activity of producing other tissues such as, for example, knee, liver, intestine, kidney, skin, organs including endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular tissues including vascular endothelium, or the like. It is also expected to exhibit the activity of promoting the proliferation of cells constituting such tissues. Some of the desired effects may also be mediated by the inhibition of fibrous scarring, which regenerates normal tissue.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective for gastrointestinal tract protection or regeneration, and for treatment of conditions caused by fibrosis of lung or liver, reperfusion injury of various tissues, and systemic site force-in disorder. .
  • the protein of the present invention is considered to show activity related to activin inhibin.
  • Activin is characterized by its activity in stimulating the release of follicle-stimulating hormone (FSH)
  • inhibin is characterized by its activity in inhibiting the release of follicle-stimulating hormone (FSH). Therefore, the protein of the present invention is a heterodimer alone or in a heterodimer with a member of the inhibin a family, which reduces the fertilization rate of female mammals and contraception based on the activity of inhibin which reduces spermatogenesis in males. It is believed to be effective as a modulator. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin b group, and is a therapeutic dimer based on the activity of an activin molecule that stimulates FSH release from cells of the pituitary gland. It is believed to be effective as a fertility inducer (see US Patent No. 4,798,885).
  • the proteins of the present invention are believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs. Can be
  • the protein of the present invention can be used, for example, for chemotaxis acting as a chemokine on monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or mammalian cells containing any of them. It is thought to have sex Z chemokinetic activity.
  • Chemotactic chemokinetic proteins can be used to immobilize or attract the desired cell population to the desired site of the reaction.
  • Chemotactic Z chemokinetic proteins offer special advantages in the treatment of wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may improve the immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell. Whether a particular protein retains chemotactic activity for a population of cells can be readily determined using such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay. it can.
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including genetic disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds caused by trauma, surgery or other causes.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in dissolving or inhibiting the formation of thrombus, and in treating and preventing conditions caused by thrombus or stroke.
  • the protein of the present invention may be a receptor, a receptor Z ligand or a receptor / ligand. It may be active as an inhibitor or agonist.
  • receptors and ligands include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, and receptors associated with cell-cell interactions (Selecting integrins). ) And its ligands, cell adhesion molecules including receptor kinases) and its ligands, and combinations of receptors / ligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and development of cellular and humoral immune responses. Receptors and ligands are also effective in screening for possible peptide or small molecule inhibitors of their interaction. Including but not limited to fragments) Evening inhibitors of the interaction of the body receptor Z ligand is considered to be effective as an.
  • the proteins of the present invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: Kills infectious substances, including bacteria, viruses, molds, and other parasites; It has the effect of suppressing or promoting body characteristics such as height, weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation, or organ size such as, for example, breast gain or weight loss; Affects the degradation of proteins or carbohydrates; Affects behavioral characteristics, including appetite, libido, stress, cognition (cognitive impairment), depression, and violent behavior; Affects analgesia or other pain-reducing effects Provide; promote the differentiation and proliferation of embryonic stem cells to other lineages other than the hematopoietic lineage; and, in the case of enzymes, supplement the deficiency of the enzymes and treat related disorders.
  • Proteins having the above activities include, for example, proliferation or cell death of B cells, T cells, mast cells, class-specific induction by promoting immunoglobulin class switches, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursor cells Growth or differentiation, cell death, Monocyte 'macrophage progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, neutrophil, monocyte / macrophage, eosinophil, basophil proliferation or hyperfunction, cell death, megakaryocyte progenitor cell proliferation or cell death, favorable Proliferation or differentiation of neutrophil precursor cells, cell death,
  • B or T progenitor cells Proliferation or differentiation of B or T progenitor cells, cell death, promotion of erythrocyte production, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, basophil, monocyte, macrophage, mast cell, megakaryocyte progenitor cell proliferation support, neutrophil Promotion of migration of spheres, monocytes, macrophages, B cells or T cells, thymocyte proliferation or cell death, suppression of adipocyte differentiation, proliferation or cell death of natural killer cells, proliferation or cell death of hematopoietic stem cells, stem cells And proliferation of various hematopoietic progenitor cells, promotion or proliferation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and chondrocytes, cell death, or activation of osteoclasts and differentiation of monocytes to osteoclasts It is thought that the effect of promoting bone resorption by promotion is exerted only by the present polypeptide, through the binding between the ligand and the receptor, or by acting synergistically
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death, promotes glial cell proliferation or cell death, Extension, ganglion cell survival or cell death, astrocyte proliferation or differentiation promotion or cell death, peripheral nerve proliferation or survival maintenance, cell death, Schwann cell proliferation or cell death, motor nerve proliferation or survival It is also thought that there is an effect of maintenance and cell death.
  • polypeptide of the present invention is used in the developmental process of the early embryo during the development of the early embryo, such as formation of the epidermis, brain, spine, and nerve by the action of inducing ectoderm; Promotes or inhibits the formation of cells, heart, kidney, gonads, or the formation of gastrointestinal organs (stomach, intestine, liver, Teng) and respiratory system (lung, trachea) by endoderm induction It is thought to have a proliferative effect, and also has an effect of suppressing the growth or growth of the above organs in a living body.
  • the polypeptides of the present invention may themselves be immune or nervous or Are diseases related to decreased or increased function of bone metabolism, or impaired or abnormal growth of hematopoietic cells, such as inflammatory diseases (rheumatism, ulcerative colitis, etc.), decreased hematopoietic stem cells after bone marrow transplantation, cancer Depletion of leukocytes, platelets, B cells or T cells, anemia, infectious diseases, cancer, leukemia, AIDS (AIDS), abnormal bone metabolism (osteoporosis, etc.) after irradiation or chemotherapy for leukemia It is expected to be used as a preventive or therapeutic agent for diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.) or nerve damage.
  • the polypeptide of the present invention is considered to have an action of dividing or proliferating ectoderm, mesoderm, or endoderm-derived organs, the polypeptide (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine, It is also expected to be used as a tissue repair agent for liver, kidney, lung, trachea, etc.).
  • polypeptide of the present invention can be quantified in vivo using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody of the polypeptide, whereby the polypeptide can be used for studying the relationship between the polypeptide and a disease or diagnosing a disease.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by a conventional method using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
  • an affinity column is prepared, and a known or unknown protein (ligand) that binds to the polypeptide of the present invention.
  • polypeptide of the present invention preferably a polypeptide of its transmembrane domain or intracellular domain
  • the cDNA of the present invention preferably, the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention it is also possible to screen for the inhibitor of the polypeptide receptor of the present invention, an agonist, an antagonist and a receptor-signaling molecule.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and essential type II for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have great utility, but also the diagnosis and treatment of genetic diseases (gene deficiency). Or the treatment by stopping the expression of polypeptide by antisense DNA (RNA). Further, genomic DNA can be separated by using the cDNA of the present invention as a probe. Similarly, it is possible to isolate a gene for a human-related polypeptide highly homologous to the cDNA of the present invention and a gene for a polypeptide highly homologous to the polypeptide of the present invention in an organism other than mouse. It is.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • Dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is generally within the range of 100 g to 100 mg / day for each adult. It is orally administered once to several times, or parenterally once per adult, in the range of 10 g to 100 mg once or several times a day.
  • a dose smaller than the above-mentioned dose may be sufficient in some cases, or may be required beyond the range.
  • solid compositions, liquid compositions and other compositions for oral administration, injections for parenteral administration, external preparations, suppositories, etc. used.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, dulose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch). , Polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, etc.).
  • the composition is prepared according to a conventional method using additives other than an inert diluent, for example, a lubricant (eg, magnesium stearate), a disintegrant (eg, calcium cellulose glycolate), a stabilizer (eg, human serum albumin, lactose, etc.). ), Solubilizing agents (arginine, aspartic acid, etc.).
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc., if necessary, or with two or more layers. Good. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • This composition contains, in addition to the inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • Method for producing spray agent are described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, and polysorbate 80 (registered trademark).
  • compositions may also contain preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents (eg, human serum albumin, lactose, etc.), solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain various adjuvants.
  • Example 1 Preparation of p o 1 y (A) + RNA
  • Random 9mer 5-with XhoI site linked to the above poly (A) + RNA NNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 15) was used as a primer and the double-stranded cDNA was purified using the Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (trade name, sold by GffiCOBRL). Synthesis was performed. EcoR I adapter (sold by GIBCO BRL) was used for DNA ligation 'kit Ver. 2 (DNA ligation kit ver.2, trade name, sold by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • a plasmid of this cDNA library is prepared, and the yeast YT ⁇ 12 strain is transformed by the lithium acetate method (see Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1), and a yeast transformant not containing tributofan (T rp) is obtained. After plating on a plate of selective medium (CMD-Trp medium) and incubating at 30 for 48 hours, obtain using Accutran Replica Plater (trade name, sold by Schleicher & Schuell). Replicas of the colonies (transformants) were placed on YPR plates using roughinos as a carbon source and incubated at 30 for 14 days.
  • CMD-Trp medium selective medium
  • Accutran Replica Plater trade name, sold by Schleicher & Schuell
  • each colony that has emerged is again struck one at a time on a YPR plate and incubated at 30 ° C for 48 hours. After incubating for 48 hours in, a plasmid was prepared. Subsequently, two types of primers of both ends of the pSUC2 closing site (the sense strand is PCR is performed according to a known method using Ima-1) to amplify the insert cDNA, and then, using Dynabeads (trade name, sold by DYNAL), purify the biotinylated single-stranded cDNA and purify the nucleotide sequence. A decision was made.
  • the nucleotide sequence is determined by DNA sequencing kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction), trade name, Applied Biosystems Inc. Fluorescence dye using Applied Biosystems Inc. And the reading was performed using an automatic DN ⁇ Sequencer 373 (Applied Biosystems Inc.) (hereinafter, all the nucleotide sequences were determined by this method).
  • Cloning of the full-length cDNA was performed using the 3 'RACE (Rapid Amplification of cDNA End) method using the Marathon cDNA Amplification Kit (trade name, sold by Clontech). .
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, po1y (A) + RNA of human adult brain tissue. Based on the nucleotide sequence information obtained by SST, putative translation start site 27mer primer upstream of ATG region OC O
  • AA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) was prepared, and PCR was performed using the adapter and the primer attached to the kit.
  • the cDNA amplified specifically to clone ⁇ C001 was fractionated by agarose gel electrophoresis, ligated into pT7Blue-2T—Vector (trade name, sold by Novagen), and transformed into E. coli DH5 ⁇ . plus A mid was prepared.
  • the nucleotide sequence on the 5 'side was determined to confirm that the nucleotide sequence of OC001 SST cDNA was present.
  • the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
  • the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 4, and 5.
  • clone OC001 region between amino acid sequences 12 to 344 of SEQ ID NO: 1 and neurotrimin (neurotnmm [Rattus norvegicus]) ( Genbank Accession U1684D non-acid sequence 9-344) and opioid-binding cell adhesion molecule [Homo sapiens] (Genbank Accession L L4c4 / no acid sequence 9- (A region between 345).
  • clone OC001 has at least the same activity as the neuronal cell adhesion factor family, to which neurotrimin and opioid-binding cell adhesion molecules belong. Expected to retain.
  • Example 5 Cloning of full length cDNA of clone OM2337 and determination of base sequence
  • the embodiment relating to the clone OM237 of the present invention uses the same method as that of OC001. Was used, but differed only in the following points.
  • T-3 ′ (SEQ ID NO: 17) was prepared, and PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to clone OM237 was recloned in the same manner as for OC001, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 8 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7.
  • GIBCOBRL GENETRAPPER cDNA Positive Selection System
  • a plasmid that specifically hybridizes with the biotinylated primer is recovered from the above cDNA library according to the method of the GeneTrapper kit and transformed into Escherichia coli DH10B. did. Furthermore, using a random primer DNA labeling kit (Random Primer DNA Labeling kit, trade name, sold by Takara Shuzo) as a probe, colony hybridization is performed by a known method using OA004 SST cDNA labeled with 32 P-dCTP as a probe. One shot was performed, positive clones were isolated, and plasmids were prepared.
  • a random primer DNA labeling kit Random Primer DNA Labeling kit, trade name, sold by Takara Shuzo
  • BLASTN for known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database
  • BLASTP for amino acid sequences of known polypeptides registered on the amino acid sequence database by FASTA and FASTA. No sequence matched the coding nucleic acid sequence. Further, analysis of the obtained amino acid sequence by a hydrophobicity plot showed that the polypeptide of the present invention had a transmembrane region.
  • polypeptide of the present invention was found to be a new membrane protein.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA found that clone OAO04b (the region between amino acid sequences 171-131 of SEQ ID NO: 9) and 52.8 kD protein (Hypothetical 52.8 kD protein [Caenorhabdtis elegans ]) (SwissProt Accession YJ95—the amino acid sequence of CAEEL between 299 and 453).
  • clone OAO04b ((between amino acids 194 and 277 of SEQ ID NO: 9) and no!
  • SEQ ID NO: 19 was prepared, and PCR was performed with the adapter-one primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to the clone OAF 075 B was recloned by the same method as that for ⁇ C 001, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 14 was obtained. . Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 12 and 13.
  • polypeptide of the present invention did not have a transmembrane region.
  • the polypeptide of the present invention is a novel secretory protein.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA found that clone OAF075b (the region between amino acid sequences 1 to 359 of SEQ ID NO: 12) and prepro Preprocarboxypeptidase A2 (Homo sapiens)
  • clone OAF 075b is expected to retain at least the same activity as preprocarboxypeptidase A2 (Homo sapiens) described above. .

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Description

明細書 新規なポリぺプチド、 そのポリぺプチドをコ一ドする c D N A、 およびその用途 技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする c D NA、 およびその用途に関する。 背景技術
従来、 ある特定のポリペプチドまたはそれをコードする c D N Aを得よう とする場合、 組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、 次いでポ リペプチドの単離精製を経て、 遺伝子をクロ一ニングするという方法、 ある いはその生物活性を指標として遺伝子を発現クロ一ニングする方法が一般的 に用いられてきた。 しかし、 生体内生理活性ポリペプチドは、 多様な生物活 性を有している場合が多いので、 あるひとつの活性を指標にして遺伝子をク ローニングした結果、 それが既知のポリぺプチドと同一であることが後にな つて判明するという事例が増えている。 また、 微量しか産生されなかったり、 特別な生理的条件でのみ発現する因子も多く、 そのことが単離、 精製および 生物活性の確認を困難なものとしている。
近年、 c D N Aの作製技術やシークェンス技術は急速に発展し、 大量の c D NAのシークェンスを迅速に行なうことができるようになった。 そこで これらの技術を利用して、 様々な細胞や組織から c D N Aライブラリ一を作 製し、 ランダムに c D N Aをクロ一ニングして塩基配列を決定し、 新規なポ リペプチドをコードする遺伝子を単離する方法が発展している。 この方法は、 生化学的、 遺伝学的な解析を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、 そ の塩基配列の情報を得ることができるという特徴を有しているが、 目的とす る遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。 発明の開示
本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のク ローニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイト力 イン等） のような分泌蛋白質やそのレセプターのような膜蛋白質 （以下、 こ れらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。）の大部分がその N末端にシグナルぺプ チドと呼ばれる配列を有していることに着目して、 シグナルペプチドをコー ドする配列を有する c DN Aを効率よくかつ選択的にクロ一ニングする方法 を鋭意検討した。 その結果、 動物細胞を用いて、 シグナルペプチドの有無を 簡単に選別できる方法 （シグナルシークェンストラップ （SST) 法） を見 出した （特開平 6-315380号参照)。 さらに同じ概念のもとに、 酵母を用いて さらに効率よくかつ簡便にシグナルペプチドをコードする遺伝子を単離する 方法 （酵母 SST法） も開発された （米国特許第 5,536,637号参照)。
本方法を用いて、 治療、 診断、 あるいは研究上有益な新規な因子 （ポリべ プチド）、特に分泌シグナルを有する分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそ れを見出すべく、 鋭意検討を行なった。 その結果、 多種多様な分泌蛋白およ び膜蛋白を産生していると予想される細胞株および組織、 例えばヒト成人の 脳組織および脳組織由来の細胞株、 およびヒト骨髄由来の細胞株が産生して いる新規な分泌蛋白質あるいは膜蛋白質、 およびそれをコードする c DNA を見出すことに成功し、 本発明を完成した。
本発明が提供する cDN A配列は、 クローン〇C 001， OM237, O A 004 bとして同定され、 上記酵母 S S T法を使用して得た情報を基にヒ ト成人脳組織および脳組織由来の細胞株（T 98 G， ATCC No. CRL -1690) から作製した cDNAライブラリ一より単離された。 クローン OC 001， OM237, 〇A004 bは膜蛋白質 （ここではそれぞれ〇C 00 1， OM237, OA004 b蛋白として表わされる） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド〇C 001, OM237, OA0 04 bおよびそれぞれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 さ らに得られたァミノ酸配列の疎水性プロットによる解析から本発明のポリべ プチドは膜貫通領域を持つことが予想された。 これらのことから、 本発明の ポリペプチド OC 001, OM237, 〇 A 004 bは新規な膜蛋白質であ ることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OAF 075 bとして同定さ れ、 上記酵母 S ST法を使用して得た情報を基に成人のヒト骨髄由来の細胞 株 HAS 303 (ヒト骨髄ストローマ細胞株：東京医科大学第一内科外山圭 助教授、 相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol. 148, 245-251, 1991 および Experimental Hematol.22， 482-487， 1994に記載） )から作製した cDNAライブ ラリーより単離された。 クローン OAF 075 bは分泌蛋白質 （ここでは OAF 075 b蛋白として表わされる） をコードする完全な c DNA配列を 含む全長鎖 cDNAである。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド OAF 075 bおよびそれをコー ドする核酸配列と一致する配列はなかった。 さらに得られたアミノ酸配列の 疎水性プロットによる解析から本発明のポリペプチドは膜貫通領域を持たな いことが予想された。 これらのことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な 分泌蛋白質であることが判明した。
本発明は、
(1) 配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されるアミノ酸配列からなる ポリペプチド、
(2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする cDNA、
(3) 配列番号 2、 5、 7、 10または 13で示される塩基配列からなる c DNA、
(4) 配列番号 3、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列からなる cDNAに関する。 詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6、 9または 12で 示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 その配列の フラグメントおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらに、 それらのポリペプチドをコードする c DNAに関する。 より具体的には、 配列番号 2、 5、 7、 10または 13で示される塩基配列 からなる cDNA、 および配列番号 2、 5、 7、 10、 13、 3、 8、 1 1 または 14で示される塩基配列に選択的にハイプリダイズするフラグメント からなる c DN Aに関する。 ハイブリダィズする c DNAには、 上記配列の 相補配列も含まれる。 ハイブリダィズは、 ストリンジェン卜な条件で行なう ことが好ましい。
実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されるァ ミノ酸配列からなるポリペプチドとは、 一般に、 生産時のポリペプチドの 90 %以上、 例えば、 95、 98または 99 %が配列番号 1、 4、 6、 9 または 12で示されるァミノ酸配列からなるポリペプチドであることを意味 する。
配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチドのホモローグとは、 一般に少なくとも 20個、 好ましくは少なくと も 30個、 例えば 40、 60または 100個の連続したアミノ酸領域で、 少 なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95 %以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグは、 以下本発明 のポリぺプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されるアミノ酸配列から なるポリペプチドのフラグメント、 またはそれらのホモローグのフラグメン トとは、 少なくとも 10アミノ酸、 好ましくは少なくとも 15アミノ酸、 例 えば 20、 25、 30、 40、 50または 60アミノ酸部分を意味する。 配列番号 2、 5、 7、 10、 13、 3、 8、 1 1または 14で示される塩 基配列からなる cDN Aに選択的にハイブリダィズする c DN Aとは、 一般 に、 少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも 30個、 例えば 40、 60ま たは 100個の連続した塩基配列領域で、 少なくとも 70%、 好ましくは少 なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95 %以上相同性であるもので あり、 そのような cDNAは、 以下本発明の c DNAとして記載される。 配列番号 2、 5、 7、 10、 13、 3、 8、 11または 14で示される塩 基配列からなある cDNAのフラグメントとは、 少なくとも 10塩基、 好ま しくは少なくとも 15塩基、 例えば 20、 25、 30または 40塩基部分を 意味し、 そのようなフラグメントも本発明の c DNAに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明の cDNAからなる複製または発現ベクター が含まれる。 ベクタ一としては、 例えば、 o r i領域と、 必要により上記 c DNAの発現のためのプロモーター、 プロモーターの制御因子などからな るプラスミド、 ウィルスまたはファ一ジベクターが挙げられる。 ベクターは ひとつまたはそれ以上の選択的マーカ一遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺 伝子を含んでいてもよい。 ベクターは、 イン . ビトロ （in vitro) において、 例えば c D NAに対応する R N Aの製造、 宿主細胞の形質転換に用いること ができる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2、 5、 7、 1 0、 1 3、 3、 8、 1 1ま たは 1 4で示される塩基配列、 またはそれらのオープンリーディングフレー ムを有する c D NAを含む本発明の c D NAを複製または発現させるための ベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。 細胞としては、 例えば細菌、 酵母、 昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプチドの製造方法 も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造さ れる条件下で行なわれることが好ましい。
本発明の c D N Aは、 上記のようなべクタ一のアンチセンス領域に挿入す ることでアンチセンス R N Aを製造することもできる。 このようなアンチセ ンス R N Aは、 細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用 いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリぺプチドのモノク口一ナルまたはポリ クローナル抗体も含む。 さらに本発明におけるポリぺプチドのモノクローナ ルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。 モノクローナル抗体は、 本 発明のペプチドまたはその断片を抗原として用い、 通常のハイプリ ドーマの 技術により製造することができる。 ポリクローナル抗体は、 宿主動物 （例え ば、 ラットやゥサギ等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清を回収 する、 通常の方法により製造することができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形 剤および Zまたは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
( 1 ) の本発明のポリペプチドとしては、 配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されたアミノ酸配列からなるもの以外に、 その一部が欠損したもの (例えば、 配列番号 1中、 生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリべ プチド等）、 その一部が他のアミノ酸と置換したもの （例えば、 物性の類似し たアミノ酸に置換したもの）、および本発明のポリペプチドに他のアミノ酸が 付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6 種類 （例えば、 Me tは 1種類、 Leuは 6種類） 知られている。 従って、 ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DNAの塩基配列を変える ことができる。
(2) で特定される本発明の cDN Aには、 （1) の配列番号 1、 4、 6、 9または 12で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含 まれる。 塩基配列を変えることによって、 ポリペプチドの生産性が向上する ことがある。
(3) で特定される cDNAは、 （2) で示される c DNAの一態様であり、 天然型配列を表わす。
(4) に示される cDNAは、 （3) で特定される cDNAに天然の非翻訳 部分を加えた配列を示す。
配列番号 3、 8、 1 1または 14で示される塩基配列を有する c DNAの 作製は、 以下の方法に従って行なわれる。
はじめに酵母 SST法 （米国特許 No.5，536，637に記載） の概要について説 明する。
サッカロミセス 'セレピシェ (Saccharomy es cerevis^ ) などの酵母がショ 糖またはラフイノースをエネルギー源や炭素源として利用するためにはイン ベル夕ーゼを培地中に分泌しなければならない （インベルタ一ゼはラフィノ ースをショ糖とメリビオースに、 ショ糖をフルクト一スとグルコースに分解 する酵素である。）。 また数多くの既知の哺乳類のシグナルべプチドは酵母の インベルターゼを分泌させうることが知られている。 これらの知見から、 酵 母のィンベルターゼの分泌を可能にする新規のシグナルべプチドを哺乳類の cDN Aライブラリーからラフイノース培地上での酵母の生育を指標にスク リーニングする方法として本方法は開発された。 翻訳開始点 AT Gを削除し た非分泌型のインベルターゼ遺伝子 S U C 2 (GENBANK accession No.V0131l) を酵母の発現ベクター （発現用プロモーター （ADHプロモ一夕 一） およびターミネ一ター （ADHターミネータ一） は AAH5プラスミド (Gammerer, Methods in Enzymol.101,192-201,1983) 由来で、 酵母複製起点は 2 o r i、 酵母選択マーカ一には TRP 1、 大腸菌複製起点は C o 1 E 1 o r i、 大腸菌薬剤耐性マーカ一にはアンピシリンが使用されている） に組 み込んで酵母 S ST用ベクター p SUC 2を作製した。 その SUC 2遺伝子 の上流に哺乳類の cDN Aを組み込んで、酵母 SST cDNAライブラリー を調製した。 このライブラリ一を分泌型インベル夕ーゼを欠損している酵母 に形質転換した。 組み込まれた哺乳類 c DN Aがシグナルペプチドをコード している場合、 酵母で発現されたインベルターゼに対しても分泌作用をもつ と考えられ、 その結果ラフイノ一ス培地上での生育が可能となる。 よって出 現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製し、 インサート cDN Aの塩基配列を決定することによって、 新規シグナルペプチドの検索を迅速 かつ容易にした。
酵母 SST c DN Aライブラリ一の作製は
(1) 対象となる細胞より mRNAを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I) サイトを連結したランダムプライマ一を用いて二本鎖 cDNAを合成し、
(2) 酵素 Iとは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイトを含むアダプタ 一を連結して、 酵素 Iで消化した後、 適当なサイズで分画し、
(3) 酵母発現べクタ一内のシグナルペプチドを削除したインベルタ一ゼ 遺伝子の上流に得られた c D N A断片を連結し、形質転換する工程よりなる。 各工程を詳しく説明すると、 工程 （1) では、 対象となる哺乳類の臓器や 細胞株などより、 必要により適当な刺激剤で刺激した後、 公知の方法 （以下、 公知の方法は特に記載がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J.， Fritsch, E. F. および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊） また vよ Current Protocol in Molecular Biology(F. M. Ausubelら編、 John Wiley &
Sons，Incより発刊） に記載の方法に従って行なわれる。） に従って mRNAの 単離が行なわれる。
対象となる細胞としては、 HAS 303 (ヒト骨髄ストローマ細胞株：東 京医科大学第一内科外山圭助教授、 相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol.148， 245-251, 1991および Experimental Hematol.22, 482-487, 1994に記載）、 または ヒトグリア芽腫細胞株 T98 G (ATCCNo.CRL-1690) が挙げられる。 また組 織としては、 ヒト成人脳が挙げられる。 ランダムプライマ一を用いる二本鎖 c DN Aの合成は公知の方法により行なわれる。
アダプターに連結される制限酵素 （酵素 I) サイトと次の工程 （2) で用 いられる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用い てもよい。 好ましくは、 酵素 Iとして X ho I、 酵素 Πとしては Ec oR I が用いられる。
工程 （2) では T4DNAポリメラーゼで末端を平滑化し、 酵素 Πァダプ 夕一を連結した後、 酵素 Iで消化し、 ァガロース電気泳動 （AGE) により 300〜800 b pの c DNAを分画する。 酵素 IIは、 前記したように酵素 Iと異なるものなら何でもよい。
工程 （3) は、 酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルぺプ チドを削除したインベルターゼの遺伝子の上流に （2) で得られた cDNA 断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。 ここで酵母発現用ブラ スミドベクターとしては種々のものが知られている。 例えば、 大腸菌内でも 機能する YEp 24などが用いられるが、 好適には前述したプラスミド p S UC 2が用いられる。
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 好ま しくは DH10Bのコンビテントセルである。 また形質転換方法は公知のい ずれを用いてもよいが、 好ましくはエレクトロボレ一ション法により行なわ れる。 形質転換体は常法により培養され、 酵母 SST用の cDNAライブラ リーが得られる。
この c DNAライブラリーでは、 すべてのクローンに c DNA断片が導入 されている訳ではないし、 またすべてが未知の （新規な） シグナルペプチド をコードする遺伝子断片とは限らない。 そこで、 次にこのライブラリ一から 未知のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニングする必要 がある。
そのためには、 c DN Aライブラリ一をィンベルタ一ゼ遺伝子をもたない 酵母サッカロミセス 'セレピシェ (Saccharnmycs er.visiae) (例えば YT45 5株など） またはインベルターゼ遺伝子を人為的に欠損させた株 （公知の方 法に従い作製可能） に、 該 CDNAライブラリーを導入し、 シグナルべプチ ドをコードする配列を有する断片のスクリーニングを行なう。
酵母の形質転換は公知の方法、例えば酢酸リチウム法によって行なわれる。 形質転換体を選択培地で生育後、 ラフイノースを炭素源とする培地に移し、 生育可能なコロニーを選択し、 プラスミドを回収する。 ラフイノースを炭素 源として酵母が生育したということは、 ライブラリ一中に何らかの分泌蛋白 質のシグナルぺプチドが組み込まれていたことを示している。
次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 未知の蛋白質 をコードすることが明らかになった c DN Aについては、 それをプローブと して全長クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定することができる。 これ らの操作は、 当業者にとってすベて公知の方法で行なわれる。
配列番号 2、 5、 7、 10または 13で示される塩基配列が、 一部、 好ま しくは全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の蛋白質をコードする C
DNAもしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブセットをコ一ドする c DN Aを得ることができる。 適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを 合成し、 それを用いて、 哺乳類由来の c DNAライブラリーあるいは mRN Aから PC R法により、 あるいは適当な塩基配列の断片をプローブとしてハ イブリダィズさせることにより、 他の哺乳類 c DNAライブラリーあるいは 該ゲノムライブラリ一から、 他の哺乳類型の当該蛋白質をコードする c DN Aを得ることができる。
このようにして得られた c DNAが、 S STで得られた c DNA断片の塩 基配列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルペプチドをコー ドしていることになるので、 該 cDNAが全長、 またはほぼ全長であること は明らかである （シグナルペプチドは例外なく蛋白質の N末端に存在するこ と力 ら、 c DNAのオープンリーディングフレームの 5 '末端にコードされ ている。）。
さらに公知の方法に従い、 該 c DNAをプローブとしてノザン （Northern) 解析によって全長の確認してもよい。 ハイブリダィズしたバンドから得られ る mRNAのサイズと該 c DNAのサイズを比較し、 ほぼ同じであれば該 c DNAはほぼ全長であると考えられる。
配列番号 2、 5、 7、 10または 13で示される塩基配列が一旦確定され ると、 その後は、 化学合成によって、 あるいは該塩基配列の断片を化学合成 し、 これをプローブとしてハイブリダィズさせることにより、 本発明の cD NAを得ることができる。 さらに、 本発明の c DNAを含有するべクタ一 c DNAを適当な宿主に導入し、 これを増殖させることによって、 目的とする cDNAを必要量得ることができる。
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
( 1 ) 生体または培養細胞から精製単離する方法、 (2) ペプチド合成する方法、 または
( 3 ) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系 （宿主 一ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細 胞の発現系が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードする cDN Aの 5 '末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた cDNAを、 適当 なプロモータ一 （例えば、 t r pプロモーター、 l a cプロモー夕一、 λΡ Lプロモーター、 Τ 7プロモータ一等） の下流に接続し、 大腸菌内で機能す るベクター （例えば、 pBR322、 pUC 18、 pUC 19等） に揷入し て発現ベクターを作製する。
次に、 この発現ベクターで形質転換した大腸菌 （例えば、 E.Coli DH1、 E. Coli JMl 09、 E. Coli HB 101株等） を適当な培地で培養して、 その 菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 バクテリアの シグナルペプチド （例えば、 p e 1 Bのシグナルペプチド） を利用すれば、 ペリブラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。 さらに、 他のポリペプチドとのフュージョン ·プロテイン （fusion protein) を生産する こともできる。
また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 3、 8、 1 1または 14で示される塩基配列をコードする c DNAを適当なベクタ一 (例えば、 レトロウイルスベクター、 パピローマウィルスベクター、 ヮクシ ニァウィルスベクタ一、 S V40系べクタ一等）中の適当なプロモー夕一（例 えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 メタ口チォネインプロ モーター等） の下流に挿入して発現べクタ一を作製する。 次に、 得られた発 現ベクターで適当な哺乳動物細胞 （例えば、 サル COS— 7細胞、 チヤィニ —ズハムスター C H〇細胞、 マウス L細胞等） を形質転換し、 形質転換体を 適当な培地で培養することによって、 本発明の蛋白が分泌蛋白の場合と膜蛋 白の場合で、 次のように発現される。
本発明の蛋白が分泌蛋白の場合、 その細胞上清中に目的とするポリべプチ ドが発現される。 さらに、 その他のポリペプチド、例えば抗体の定常領域（F c portion) をコードする c D NA断片と連結することによって、 フユ一ジョ ン *プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
一方、 本発明の蛋白が膜蛋白の場合、 その細胞膜上に目的とするポリぺプ チドが発現される。 また配列番号 2、 5、 7、 1 0または 1 3で示される塩 基配列の膜貫通領域を欠いた欠失体を上記ベクターに挿入し、 これを用いて 適当な哺乳類動物細胞を形質転換することによって、 その培養液中に目的と する可溶性ポリペプチドが分泌される。 さらにその膜貫通領域を欠いた欠失 体をコードする c D N A断片とその他のポリぺプチド、 例えば抗体の定常領 域 （F c portion) をコードする c D N A断片を連結することによって、 フユ —ジョン 'プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
以上のようにして得られたポリぺプチドは、 一般的な生化学的方法によつて 単離精製することができる。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドおよびそれをコードする c D N Aは、 一つあるいは それ以上の効果あるいは生物活性 （以下に列挙するアツセィに関連するもの を含む） を示すことが考えられる。 本発明の蛋白に関して記述される効果あ るいは生物活性は、 その蛋白の投与あるいは使用により、 あるいはその蛋白 をコードする c D N Aの投与あるいは使用 （例えば、 遺伝子療法や c D N A 導入に適したベクター） により、 提供される。
[サイトカイン活性および細胞増殖 分化活性] 本発明の蛋白は、 サイト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻害）
Z分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団に他 のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。 全ての既知の サイト力インを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子は、 因子に依存 した一つあるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、活性を示してきたので、 それらのアツセィは、 サイト力イン活性の便利な確認法として機能する。 本 発明の蛋白の活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の細胞増殖アツセィ のうちのいずれかによつて証明され得る。
[免疫刺激ノ抑制活性]
本発明の蛋白は、免疫刺激活性および免疫抑制活性をも示すと考えられる。 また、 ある蛋白は、 例えば、 Tリンパ球および Bリンパ球あるいはどちらか 一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様に N K 細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免疫 不全および疾患 V severe combined immunodeficiency ( S C I D) ¾ s.む) の治療 に効果を示すと考えられる。 これらの免疫不全は遺伝性である場合もあるし、 例えば H I Vのようなウィルスや、 同様に細菌やカビの感染が原因で起こる 場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患から由来する可能性もある。 具体的に は、 H I V、肝炎ウイルス（hepatitis viruses)、ヘルぺスウイルス（herpes viruses)、 マイコバクテリア （mycobacteria) , リーシュマニア （leshmania)、 マラリア (malaria) およびカンジダ （Candida) のような様々なカビ感染を含む、 ウイ ルス、 細菌、 カビあるいは他の感染による感染症の原因を、 本発明の蛋白を 用いることによって治療できると考えられる。 もちろん、 この関連より、 本 発明の蛋白は、免疫システムが増大していることが一般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所において効果を示すと考えられる。
本発明の蛋白は、 アレルギー反応および喘息や他の呼吸器系疾患のような 状況の治療に効果にも効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるような 他の状態 （例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む） にも、 本発明の蛋白を用 いて治療できると考えられる。
本発明の蛋白は、 例えば、 敗血病性のショックあるいは全身性炎症反応症 候群 （S I R S ) のような炎症性大腸炎、 クローン病、 あるいは I L一 1 1 により効果が証明されたような T N Fや I L一 1のようなサイトカインの過 剰産生から由来するような感染に関連した慢性あるいは急性の炎症を抑制す る可能性もある。
[造血細胞制御活性]
本発明の蛋白は、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞ある いはリンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コロ 二一形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性で さえも、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次に 挙げる例の全てあるいはそのいずれかでたとえられるようなものに係わるも のである。 赤血球前駆細胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサイ トカインとの組み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血 の治療、 あるいは赤血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生 を刺激する放射線療法 Z化学療法と組み合わせての使用；顆粒球および単球 /マクロファージのような骨髄球の成長および増殖を支持 （すなわち、 古典 的な C S F活性）、化学療法に伴う骨髄抑制を防ぐための化学療法との併用； 巨核球の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 それによつて血小板減少症のような様々な血小板障害を防御および治療を可 能とする血小板輸血の際あるいは相補的に一般的使用；上記造血細胞の幾つ かあるいは全ての細胞へ成熟可能な造血幹細胞の成長および増殖の支持、 従 つて、 様々な幹細胞障害 （限定はされないが、 再生不良性貧血および発作性 夜間血色素尿症を含む、 移植で一般的に治療されるようなもの） に治療的効 果を示し、 また正常細胞あるいは遺伝子療法のため遺伝的に操作された細胞 をイン ·ビトロ （in-vitro) あるいはェクス ·ビボ （ex-vivo) (すなわち、 骨髄 移植に伴う） どちらかで、 放射線療法 Z化学療法後の幹細胞分画の再構築を 行なうことも同様である。
種々の造血幹細胞株の増殖と分化に対する適切なァッセィは、 上記に記載 されている。
本発明の蛋白は、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが可能 である。
[組織生成/修復活性]
本発明の蛋白は、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 および潰 瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに使用されると考えられる。
骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋白は、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷あ るいは欠損の治癒に適用される。 本発明の蛋白を使用している製剤は、 開放 骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良にも予防的にも使 用できると考えられる。 骨形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天性、 外傷性、 癌切除術により誘発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 また、 美容形成外科分野にも有効である。
本発明の蛋白は、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用されると考 えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺 激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 本発明 の蛋白は、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを通して、 あるいは炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナーゼ活性や破 骨細胞の活性） の過程を阻止することにより、 骨粗鬆症および骨関節炎の治 療に有効と考えられる。
本発明の蛋白に起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリ一は腱 z靭帯形成である。 本発明の蛋白は、 腱 靭帯様組織あるいは他の組織が正 常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒト および他の動物における腱/靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱/靭帯の障害 の治癒に適用できる。腱/靭帯様組織を誘導する蛋白を使用している製剤は、 骨あるいは他の組織への腱 Z靭帯の固定の改良、 および腱/靭帯組織の欠損 の修復での使用はもちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対して予防的使 用も考えられる。 本発明の構成物により誘導された新生腱/靭帯様組織形成 は、 先天性、 外傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭帯欠損の修復に貢献す る。 また、 腱あるいは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも有効 である。 本発明の構成物は、 腱ノ靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖 を刺激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あ るいは、 組織修復を果たすためイン · ビボ （in vivo) への返還に備えてェク ス · ビポ （ex vivo) で腱 靭帯細胞あるいはその前駆細胞を誘導する。 該発 明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症候群 （Carpal tunnel syndrome)、 および 他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有効である。 該構成物には、 適当なマト リックスおよびキャリアーと同様に当業者に良く知られているシークエス夕 リング （Sequestering) 剤も含まれる。
本発明の蛋白は、 神経細胞の増殖、 および神経および脳組織の再生、 すな わち神経細胞あるいは神経組織に対する変性、 死、 あるいは外傷を含む機械 的および外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療 に対しても効果を示すと考えられる。 具体的には、 ある蛋白は、 末梢神経障 害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疾患、 およびァ ルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側策症 (amyotropic lateral) , およびシャイ · ドレーガ一 （Shy-Drager) 症候群のよう な中枢神経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 更に本発明に応じて 治療され得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および脳卒中等の脳血管疾患 のような機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あるいは他の治療から起 因する末梢神経症も本発明の蛋白を用いて治療可能である。
本発明の蛋白は、 例えば膝臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓器、 平滑、 骨格あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような他の 組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を促進 する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正常組織を再 生させる繊維性瘢痕 （scarring) の阻害によっても担われると考えられる。 本発明の蛋白は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊維 化、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイト力イン障害に起因する状 態に対する治療にも有効であると考えられる。
[ァクチビン Zィンヒビン活性]
本発明の蛋白は、 ァクチビン インヒビンに関連した活性を示すと考えら れる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を刺激する活性によ つて特徵づけられるが、 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出 を阻害する活性によって特徴づけられる。 よって、 本発明の蛋白は、 単独あ るいはインヒビン aファミリーのメンバ一とのへテロダイマ一で、 哺乳類動 物の雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるインヒビンの活性に 基づく避妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のインヒビン の投与によって、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。 一方、 本発明の蛋白は、 インヒビン bグループの他の蛋白サブュニットとのホモダイマ一あるいはへ テ口ダイマーで、 前脳下垂体の細胞から F S H放出を刺激するァクチビン分 子の活性に基づいた治療的な不妊誘導として有効であると考えられる （米国 特許第 4，798，885号を参照。）。 本発明の蛋白は、 牛、 羊、 および豚のような家 畜の生涯出産能力可能な期間を延ばすために、 性的に未熟なほ乳類動物にお ける妊娠開始を早めることに有効であると考えられる。
[走化性 化学運動性活性] 本発明の蛋白は、 例えば、 単球、 好中球、 T細胞、 マスト細胞、 好酸球、 および内皮細胞、 あるいはそのいずれかを含む哺乳動物の細胞に対して、 例 えばケモカインとして働く走化性 Z化学運動性活性を有すると考えられる。 走化性ノ化学運動性蛋白は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団を固 定化あるいは引き寄せるため使用されることが可能である。 走化性 Z化学運 動性蛋白は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別な優 位性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍あるいは 感染部位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答を改 善する結果となると考えられる。
蛋白やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接に特殊な細胞集団に対し て指示された方向あるいは運動を刺激可能であれば、 そのような細胞集団に 対する走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白やペプチドは、 細 胞の指示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。 特別な蛋白がある 集団の細胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 既知のどのような細胞走 化性のアツセィ法にそのような蛋白あるいはペプチドを使用しても容易に決 定できる。
[凝血および血栓活性]
本発明の蛋白は、 凝血あるいは血栓活性をも示すと考えられる。 結果とし て、 そのような蛋白は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含む） の治療に有効であると予期される。 あるいは、 外傷、 手術あるいは他の原因 により生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させること が予期される。 本発明の蛋白は、 血栓の形成の溶解あるいは阻害、 および血 栓あるいは卒中等により生じる状態の治療および予防にも効果があると考え られる。
[受容体/リガンド活性]
本発明の蛋白は、 受容体、 受容体 Zリガンドあるいは受容体/リガンドの インヒビ夕一あるいはァゴニストとしての活性を示す可能性もある。 そのよ うな受容体およびリガンドの例として、 サイトカイン受容体およびそのリガ ンド、 受容体キナーゼおよびそのリガンド、 受容体フォスファターゼおよび そのリガンド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （セレクチン （Selecting ィ ンテグリン （Integurin) およびそのリガンド、 受容体キナーゼを含む細胞接着 分子等） およびそのリガンド、 および抗原提示、 抗原認識、 および細胞性お よび液性免疫反応の発達に係わる受容体/リガンドの組み合わせが挙げられ るが、 本発明を制限するものではない。 受容体およびリガンドは、 その相互 作用に対する可能なペプチドあるいは小分子のインヒビ夕一のスクリーニン グにも有効である。 本発明の蛋白 （受容体およびリガンドの断片を含むが、 制限されるものではない） は、 それ自身受容体 Zリガンドの相互作用のイン ヒビ夕一として有効であると考えられる。
[その他の活性]
本発明の蛋白は、 以下に示す付加的な活性あるいは効果の一つあるいはそ れ以上を示すと考えられる： 細菌、 ウィルス、 カビ、 および他の寄生虫を含 む感染性の物質を殺傷する；身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の 組織の色素沈着、 あるいは例えば胸部増量あるいは減量等の器官の大きさ等 の身体的特徴を抑制あるいは促進する効果を及ぼす；食餌脂肪、 蛋白、 ある いは炭水化物の分解に効果を及ぼす；食欲、 性欲、 ストレス、 認識 （認識障 害）、 鬱病、 暴力行動を含む行動特徴に効果を及ぼす；鎮痛効果あるいは他の 痛みを減少させる効果を提供する；胚性幹細胞の造血系以外の他の系統への 分化および増殖を促進する；および酵素の場合、 その酵素の欠失を補い、 ま た関連疾患を治療する。
上記活性を有する蛋白は、 例えば、 B細胞、 T細胞、 肥満細胞の増殖また は細胞死、 免疫グロブリンのクラススィッチ促進によるクラス特異的誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、 顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 単球 'マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球 · マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球 前駆細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、
Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球，マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆 細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 B細胞または T細胞の遊 走促進、 胸腺細胞の増殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラー細胞の増殖または細胞死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞およ び各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞へ の分化促進または増殖、 細胞死、 あるいは破骨細胞の活性化や単球から破骨 細胞への分化促進による骨吸収の促進の作用を本ポリペプチドのみで、 また リガンドーレセプター間の結合を介して、 あるいは他の分子と相乗的に働く ことにより有すると考えられる。
また本発明のペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各種 神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または細胞 死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞の生 存維持または細胞死、 ァストロサイ卜の増殖または分化促進または細胞死、 末梢神経の増殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細胞死、 運動神経の増殖または生存維持、 細胞死の作用もあると考えられる。
さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導 作用による表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結 合組織 （骨、 筋肉、 腱）、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 あるい は内胚葉誘導作用による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝臓、 滕臓)、 呼吸器系 （肺、 気管） の形成に促進的または抑制的に作用すると考えられ、 生体においても 上記器官の増殖あるいは増殖抑制作用を有すると考えられる。
従って、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系もしく は骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発育不 全または異常増殖、 例えば、 炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等）、 骨髄 移植後の造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または化学 療法剤投与後の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染 症、 ガン、 白血病、 エイズ （A I D S )、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等）、 各種変 性疾患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等）、 あるいは神経損傷の予防また は治療薬として用いることが期待される。
また本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の分 化または増殖作用を有すると考えられるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 鹧臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用いる ことも期待される。
また、 本発明のポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル 抗体を用いて、 生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、 これによつて 該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用すること ができる。 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチド あるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。 また本発明のポリぺプチド （好ましくはその細胞外ドメインのポリぺプチ ド） を用いることにより、 例えばァフィ二ティーカラムを作製して、 本発明 のポリペプチドと結合する既知または未知の蛋白 （リガンド） の同定、 精製 あるいはその遺伝子クロ一ニングを行なうことができる。
また本発明のポリぺプチド （好ましくはその膜貫通領域または細胞内ドメ インのボリペプチド） を用いて、 例えばウェスト一ウエスタン法により、 ま たは本発明の c D N A (好ましくは本発明のポリべプチドの膜貫通領域また は細胞内ドメインをコードする c D N A) を用いて、 例えば酵母 2—八イブ リッド法により本発明のポリペプチドと細胞質内で相互作用する下流のシグ ナル伝達分子の同定、 遺伝子クロ一ニングを行なうこともできる。 さらに本発明のポリべプチドを用いることによって、 本発明のポリぺプチ ドレセプ夕一ァゴニスト、 アン夕ゴニストおよび受容体一シグナル伝達分子 間の阻害剤等のスクリーニングを行なうこともできる。
本発明の c D N Aは、 多大な有用性が期待される本発明のポリべプチドを 生産する際の重要かつ必須の铸型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺 伝子欠損症の治療またはアンチセンス D N A ( R N A) によって、 ポリぺプ チドの発現を停止させることによる治療等） に利用できる。 また、 本発明の c D N Aをプローブとしてジエノミック （genomic) D N Aを分離できる。 同 様にして、本発明 c D N Aと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、 またマウス以外の生物における本発明ポリぺプチドと相同性の高いポリぺプ チドの遺伝子を分離することも可能である。
[医薬品への適用]
前記の疾患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに対する抗体は通常、 全身的又は局所的に、 一般的には経口ま たは非経口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および脳 室内投与である。
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 1 0 0 gから 1 0 O m gの 範囲で、 一日一回から数回経口投与されるかまたは、 成人一人あたり、 一回 にっき、 1 0 gから 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。
もちろん前記したように、 投与量は種々の条件により変動するので、 上記 投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合も ある。
本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成 物およびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等とし て用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニトール、 ダル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ リビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば潤滑剤 （ス テアリン酸マグネシウム等）、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム等）、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラクトース等）、 溶解補助剤 （アルギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、 また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、 不活性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2,868,691号および同第 3,095,355号明細書に詳しく記 載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水 性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な 希釈剤と混合される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生 理食塩水が挙げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールの ようなアルコール類、 ポリソルベート 80 (登録商標） 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラクト一ス等）、 溶解補助剤 （例えば、 アル ギニン、 ァスパラギン酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明のクローン OC 001に関する実施例を挙げて本発明をより 具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 1 ： p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TR I z O 1試薬 (TRIzol reagent，登録商標、 GEBCOBRL より販売） を用いて全 RNAを抽出し、 mRNAピユリフィケーシヨン ·キ ット （mRNA Purification Kit, 商品名、 Pharmaciaより販売） を用いて po l y (A) +RNAを精製した。 実施例 2 :酵母 SST cDNAライブラリ一の調製
上記の po l y (A) +RNAを铸型に Xh o I部位を連結したランダム 9 me r ： 5 - NNNNNNNN-3 ' (配列番号 15 ) をプライマ一として、 スーパ一ス クリフ卜'フラスミド 'システム（Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning, 商品名、 GffiCOBRLより販売） を用いて 2本鎖 c D N A の合成を行なった。 Ec oR Iアダプター （GIBCOBRLより販売） を DNA ライゲーション 'キット Ve r. 2 (DNA ligation kit ver.2, 商品名、 宝酒造 (株） より販売。 以下、 cDNAの連結はすべて本キットを使用した。） を用 いて連結した後、 Xho lで消化し、 ァガロース電気泳動で 300〜800 bpの cDNAを切り出して分画し、 PSUC2 (米国特許第 5536637号参 照） の E c o R I ZNo t I部位に連結し、 大腸菌 DH 10 B株にエレクト 口ポレーション法で形質転換して酵母 S ST用の c DNAライブラリ一を得 た。 実施例 3 ： S STによるスクリーニングおよび S ST陽性クローンの塩基配 列の決定
この c DNAライブラリ一のプラスミドを調製し、酢酸リチウム法（Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1を参照）により酵母 Y T Κ 12株を形質転 換し、 トリブトファン （T r p) を含まない酵母形質転換体の選択培地 （C MD— T r p培地） のプレート上にまき、 30 で 48時間インキュベート した後、 アキュトラン · レプリカ ·プレ一夕一 （Accutran Replica Plater, 商品 名、 Schleicher &Schuellより販売） を用いて得られたコロニー （形質転換体） のレプリカをラフイノ一スを炭素源とする Y PRプレートにとり、 30でで 14日間インキュベートした。 3日目以降、 出現してきた各々のコロニーを 一つずつ再度 Y PRプレートにストリ一クして 30°Cで 48時間インキュべ —トした後、 シングルコロニーを YPD培地に植菌し、 30でで 48時間ィ ンキュペートした後、 プラスミドを調製した。 続いて p SUC 2のクロー二 ングサイトの両端の配列の 2種類のプライマー （センス鎖はピオチン化ブラ イマ一） を用いて公知の方法に従って PCRを行い、 インサート cDNAを 増幅した後、 ダイナビーズ （Dynabeads, 商品名、 DYNALより販売） を用い てピオチン化 1本鎖 cDN Aを精製し、 塩基配列の決定を行なった。 塩基配 列の決定は DNAシーケンシング 'キット（DNA Sequencing kit(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction), 商 ea名、 Applied Biosystems Inc.より Ικ売ノ を用いた蛍光ダイ夕一ミネ一夕一サイクルシークェンス法で反応を行い、 自 動 DN Αシークェンサ一373 (Applied Biosystems Inc.)で読み取りを行なつ た （以下、 塩基配列決定はすべて本方法で行なった。）。
得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列についてデータベースと の相同性検索を行い、 データベースに登録されていない新規の c DNAであ ることが明らかとなったクローンについて、 全長 c DNAのクローニングを 試みた。 実施例 4 ：クローン〇C 001の全長 c DNAのクローニングおよび塩基配 列の決定
全長 c DN Aのクロ一ニングはマラソン c DNAアンプリフィケーショ ン ·キット （Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名、 Clontech社より販売） による 3 ' RACE (Rapid Amplification of cDNA End) 法を用いて行なった。 2本鎖 c DNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の p o 1 y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域より上流の 27me rのプライマー O C O
AA- 3 ' (配列番号 16) を作製して、 該キットに添付されたアダプタ一 プライマーとで PCRを行なった。 クローン〇C 001に特異的に増幅され た c DN Aをァガロース電気泳動で分画後、 pT7Blue— 2 T— Vector (商 品名、 Novagen より販売） に連結し、 大腸菌 DH 5 αに形質転換してプラス ミドを調製した。 初めに 5 '側の塩基配列を決定して O C 0 0 1 S S T c D N Aの塩基配列が存在することを確認した後、 全塩基配列を決定し、 配列 番号 3に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 1、 2、 4および 5に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド O C 0 0 1およびそれをコードす る核酸配列と一致する配列はなかった。 さらに得られたアミノ酸配列の疎水 性プロットによる解析から本発明のポリペプチドには C末端に膜貫通領域が 存在し G P Iアンカー型であることが予想された。 これらのことから、 本発 明のポリペプチドは、 新規の膜蛋白質であることが判明した。 さらに相同性 検索の結果、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クロ一ン O C 0 0 1 (配 列番号 1のアミノ酸配列 1 2〜 3 4 4間の領域） とニューロ トリミン (neurotnmm[Rattus norvegicus]) (Genbank Accession U1684Dのノ ノ酸配列 9〜3 4 4間の領域）およびォピオイド結合細胞接着因子（opioid-binding cell adhesion molecule [Homo sapiens]) (Genbank Accession L ύ 4 c 4の/ ノ 酸配列 9〜 3 4 5間の領域） との間に有為な相同性があることを示した。 こ れらの相同性に基づいて、 クローン O C 0 0 1は、 少なくともニューロトリ ミン （neurotrimin) およびォピオイド結合細胞接着因子 （opioid-binding cell adhesion molecule)が属する神経細胞接着因子フアミリーと同様な活性を保持 すると期待される。 実施例 5 ：クローン OM 2 3 7の全長 c D NAのクロ一ニングおよび塩基配 列の決定
本発明のクローン OM 2 3 7に関する実施例は、 O C 0 0 1と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
全長 c DN Aのクローニングはマラソン c DN Aアンプリフィケ一ショ ン 'キット （Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名、 Clontech社より販売） による 3 ' RACE法を用いて、 〇C 001と同様の方法で行なった。 2本 鎖 cDNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の p o 1 y (A) +RNAをより作製した。 SSTで得られた塩基配列の情報に基づ いて推定翻訳開始点 AT G領域より上流の 27 me rのプライマー OM23
T- 3 ' (配列番号 17) を作製して、 該キットに添付されたアダプタープ ライマーとで P CRを行なった。 クローン OM237に特異的に増幅された cDNAを、 OC 001と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決 定し、 配列番号 8に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレーム を決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 6および 7に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド OM 237およびそれをコードす る核酸配列と一致する配列はなかった。 さらに得られたアミノ酸配列の疎水 性プロットによる解析から本発明のポリペプチドには膜貫通領域が存在する ことが予想された。 これらのことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の膜 蛋白質であることが判明した。 実施例 6 ： クローン OA 004 bの全長 c DNAのクローニングおよび塩基 配列の決定
本発明のクロ一ン OA004 bに関する実施例は、 OC001と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。 [p o l y (A) +RNAの調製]
ヒトダリァ芽腫細胞株 T 98 G (ATCC No.CRL-1690) より TRIzol reagent (登録商標、 GIBCOBRLより販売） を用いて全 RNAを抽出し、 mRNAピ ュリフィケーション ·キット （mRNA Purification Kit, 商品名、 Pharmaciaよ り販売） を用いて p o l y (A) +RNAを精製した。
[全長 cDN Aのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DNAのクロ一ニングはジーントラッパ一 c DNAポジティブセレ ク シヨ ンシステム （ GENETRAPPER cDNA Positive Selection System (GIBCOBRL)) を用いて行なった。 まずスーパースクリプト ·プラスミド ·シ スァム (Superscript Plasmid Svstem for cDNA Svnthesis and Plasmid Cloning, 商 品名、 GIBCOBRL) を用いてヒトグリア芽腫細胞株 T 98 Gの p o 1 y (A) + RNAよりプラスミド PSPORT1 (GIBCOBRL) をベクターとして dT— primed c D N Aライブラリ一を作製した。 つぎに S S Tで得られた塩基配列 の情報に基づいて 27me rのピオチン化プライマー ΟΑ004— F 1 ： 5
(配列番号 18) を作製した後、 ジーントラッパ一 （GeneTrapper) キットの 方法にしたがってピオチン化プライマ一と特異的にハイブリダィズするブラ スミドを上記の c DNAライブラリ一から回収し、 大腸菌 DH 10 Bに形質 転換した。 さらにランダムプライマー DNAラベリングキッ ト （Random Primer DNA Labeling kit, 商品名、 宝酒造より販売） を用いて32 P— dCTP でラベルした OA004 S ST c DNAをプローブとして、 公知の方法に よりコロニーハイブリダィゼ一シヨンを行い、 陽性クローンを単離して、 プ ラスミドを調製した。 全塩基配列を決定し、 配列番号 1 1に示す配列を得た ので、 それぞれ〇A004 bと名付けた。 さらにオープンリーディングフレ ームを決定し、アミノ酸に翻訳して配列番号 9および 1 0に示す配列を得た。 核酸配列デ一タベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド〇 AO 04 bおよびそれぞれをコ ードする核酸配列と一致する配列はなかった。 さらに得られたァミノ酸配列 の疎水性プロットによる解析から本発明のポリペプチドには膜貫通領域が存 在することが予想された。 これらのことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規の膜蛋白質であることが判明した。 しかし、 相同性検索の結果、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OAO 04b (配列番号 9のアミノ酸配 列 1 7 1〜 3 1 1間の領域） と 52.8 k D蛋白質 （Hypothetical 52.8kD protein[Caenorhabdtis elegans]) (SwissProt Accession YJ95— CAEELのアミノ酸 配列 299〜453間の領域） の間に有意な相同性があることを示した。 ま た、 クローン OAO 04b (配列番号 9のアミノ酸配列 194〜277間の ¾¾) とノレ！^二リノ一 2 (presenilin-2[Homo sapiens]) (Genbank Accession A56993のアミノ酸配列 340〜416間の領域）の間にも有為と考えられる 相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クロ一ン OA00 4 bは、 少なくともプレセ二リン （presenilin) ファミリ一と同様な活性を保 持すると期待される。 実施例 7 ： クローン OAF 075 bの全長 c DNAのクローニングおよび塩 基配列の決定
本発明のクローン OAF 075 bに関する実施例は、 OC 001と同様な 手法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
[po l y (A) +RNAの調製]
ヒト骨髄ストローマ細胞株 HAS 303 (東京医科大学第一内科外山圭助 教授、 相沢信助手より供与） より TR I z o 1試薬 （登録商標、 GIBCOBRL より販売） を用いて全 RNAを抽出し、 mRNAピユリフィケ一シヨン ·キ ット （mRNA Purification Kit, 商品名、 Pharmaciaより販売） を用いて po l y (A) +RNAを精製した。
[全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定]
全長 c DN Aのクローニングはマラソン c DNAアンプリフィケーショ ン 'キット （Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名、 Clontech社より販売） による 3 ' RACE法を用いて、 OC 001と同様の方法で行なった。 2本 鎖 cDNAを調製には、 各クローンの由来、 すなわち HAS 303の p o 1 y (A) +RNAより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて 推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマー OAF 075— F
' (配列番号 19) を作製して、 該キットに添付されたアダプタ一プライマ —とで PC Rを行なった。 クローン OAF 075 Bに特異的に増幅された c DNAを〇C 001と同様な手法でリクローニングし、全塩基配列を決定し、 配列番号 14に示す配列を得たので、 OAF 075 bと名付けた。 さらにォ —プンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 12お よび 13に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知 のポリペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド OAF 075 b、 およびそれぞれ をコードする核酸配列と一致する配列はなかった。
さらに得られたァミノ酸配列の疎水性プロットによる解析から本発明のポ リぺプチドには膜貫通領域が存在しないことが予想された。 これらのこと力、 ら、 本発明のポリペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明した。 さ らに相同性検索の結果、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OA F 075 b (配列番号 12のアミノ酸配列 1〜 359間の領域） とプレプロ カ レポキシぺプチタ一ゼ A 2 ( preprocarboxypeptidase A2[Homo sapiens] )
(Genbank Accession U19977のァミノ酸配列 1〜 3 5 5間の領域）の間に有為 な相同性があることを示し、 カルボキシぺプチダーゼ Aファミリ一であると 考えられた。 これらの相同性に基づいて、 クローン O A F 0 7 5 bは、 少な くとも上記のプレブロカルポキシぺプチ夕ーゼ A 2 (preprocarboxypeptidase A2[Homo sapiens]) と同様な活性を保持すると期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6、 9または 1 2で示される アミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 そのフラグメントま たはそのフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
2 . 配列番号 1、 4、 6、 9または 1 2で示されるアミノ酸配列からなる請 求の範囲第 1項記載のポリぺプチド。
3 . 請求の範囲第 1項に記載されたポリペプチドをコードする c D NA。
4. 配列番号 2、 5、 7、 1 0または 1 3で示される塩基配列からなる請求 の範囲第 3項記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズす るフラグメントからなる c D NA。
5 . 配列番号 3、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列からなる請求の範 囲第 3項記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズするフ ラグメントからなる c D NA。
6 . 請求の範囲第 3項から第 5項のいずれかの項に記載の c D NAからなる 複製または発現ベクター。
7 . 請求の範囲第 6項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主 細胞。
8 · 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドを発現させる ための条件下で請求の範囲第 7項記載の宿主細胞を培養することからなる該 ポリペプチドの製造方法。
9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドのモノクロ一 ナルまたはポリクロ一ナル抗体。
1 0 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドまたは請求 の範囲第 9項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および Zまたは担 体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
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