WO1999049080A1 - Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede - Google Patents

Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede Download PDF

Info

Publication number
WO1999049080A1
WO1999049080A1 PCT/FR1999/000691 FR9900691W WO9949080A1 WO 1999049080 A1 WO1999049080 A1 WO 1999049080A1 FR 9900691 W FR9900691 W FR 9900691W WO 9949080 A1 WO9949080 A1 WO 9949080A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
lesions
qualitative
repair
quantitative detection
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000691
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Salles
Patrick Calsou
Ruo-Ya Li
Original Assignee
Societe Française De Recherches Et D'investissements (S.F.R.I.)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe Française De Recherches Et D'investissements (S.F.R.I.) filed Critical Societe Française De Recherches Et D'investissements (S.F.R.I.)
Priority to EP99910424A priority Critical patent/EP1066409A1/fr
Publication of WO1999049080A1 publication Critical patent/WO1999049080A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting structural changes in DNA using the lesion / recognition and / or repair protein complex.
  • the invention also covers the elements allowing the implementation of said method.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • cell extract any partially purified cell extract, natural proteins or products produced by genetic engineering, purified or not.
  • DNA the carrier of genetic information
  • endogenous metabolic processes such as the alkylation or oxidation of bases, but more particularly by any exogenous genotoxic agent.
  • mutants Besides the cell death induced by these genotoxics, a mutagenesis process can be induced or result from poor repair of the lesions. The appearance of mutants is likely to cause cellular dysfunction and, in particular, to initiate tumor development.
  • Detection of lesions can relate to DNA preparations purified and treated in vitro with a genotoxic agent, but also cellular DNA from tissues taken by biopsy or whole organisms or cells in culture in vitro or ex vivo, after treatment. by any genotoxic agent.
  • the radioactivity incorporated into the damaged plasmids and the controlled plasmids can be measured after autoradiography of the agarose gel.
  • the percentage of lesions thus repaired in vitro by this mechanism is around 5%.
  • the incision-excision activity can be directly measured by modification of the test described above according to a protocol published by the authors of this patent (Calsou and Salles, 1 994, Biochem. Biophys. Res. Corn., 202,788 -795 and Calsou and Salles, 1 994, Nucleic. Acid Res., 22, 4937- 4942).
  • the method used to detect DNA lesions from the repair signal described in the aforementioned French patent application No. 95,03230 uses the property of extracts to carry out the repair stages, and makes it possible to detect these lesions from of the signal obtained during the resynthesis step which follows the excision. This process includes the following steps:
  • the test uses proteins capable of recognizing lesions produced in vitro on purified DNA or else from cells isolated ex vivo, with increased sensitivity, a possibility of studying first approximation of the repair system involved, a wider range of lesions detected and also a significant time saving.
  • the qualitative and quantitative detection according to the invention is carried out at the first recognition step, and not at the restorative synthesis step.
  • the conditions of interaction between proteins and damaged DNA can therefore be optimized without taking into account the biochemical parameters required for the entire repair reaction.
  • At least ten proteins are known to date which are suitable for this type of function in the context of nucleotide excision, at least as much as regards basic excision, as well as other proteins involved in recognition DNA breaks.
  • the method according to the present invention comprises the following steps:
  • composition comprising either a cell extract having at least one activity for recognizing and / or repairing lesions, or a purified protein with a known recognition spectrum, and
  • the method for qualitative and quantitative detection of lesions is characterized in that it consists in detecting directly on the injured DNA the repair proteins or any other recognition construct using antibodies or labeling systems. and to reveal by chemiluminescence the complexes formed.
  • Antibodies include primary and secondary antibodies.
  • a first embodiment consists in detecting the proteins linked to DNA damaged by a first specific antibody followed by an ELISA type revelation using a second antibody coupled to an enzymatic activity (for example HRP) allowing quantification in luminescence .
  • an enzymatic activity for example HRP
  • a variant which can be used for known lesions consists in directly using a purified protein for specific repair and / or recognition and in detecting by the ELISA technique using a primary antibody directed against the protein and then a secondary antibody coupled to enzymatic activity
  • the solid support is a well microtitration plate, or any system using beads, in order to increase the DNA capture surface, and the detection sensitivity. 6
  • the solid support is sensitized with substances having a very high affinity for DNA, so as to cause this DNA to be fixed by adsorption.
  • substances are chosen from cationic substances or proteins, at the pH used for the adsorption of the nucleic material.
  • the cationic substances are chosen from poly amino acids of polylysine or polyargine type, levorotatory, dextrorotatory or levogyre / dextrorotatory. In the case of polylysine, its retained molecular weight is in the fraction 1,500 to 30,000 Daltons.
  • the sensitization of the support is carried out by incubation in 10 mM phosphate buffer, 1 37 mM sodium chloride and a pH of between 6.5 and 8, more particularly 7.
  • the adsorbed DNA is genomic DNA obtained after lysis of cells treated or not treated with a genotoxic agent.
  • the invention also covers the elements necessary for implementing the method, that is to say:
  • the cell extract is beneficial for all the activities of detection and / or repair of this damaged DNA
  • the elements can comprise lysis buffers for on the one hand the desorption of the complexes, and on the other hand the lysis of the cells when the detection is carried out on cellular DNA after damage.
  • FIG. 1 represents a schematic view of the stages of the method according to the main mode and a variant
  • FIG. 2 represents a view of the repair reports
  • FIG. 3 represents the immunoreactivity of two repair proteins
  • FIG. 4 represents a diagram of the repair report obtained with a cell extract purified as a function of different types of injurious agents
  • FIG. 5 represents a diagram of the results obtained by the method according to the invention.
  • FIG. 6 represents a diagram identical to that of FIG. 5, but with a different protein
  • FIG. 7 represents a diagram of the results obtained by the method according to the invention by considering the detection of DNA breaks.
  • FIG. 8 shows a diagram of the results obtained by the method according to the invention considering the detection of single-strand breaks in DNA.
  • the main mode which comprises steps A, B C and D1 corresponds to the direct detection by the ELISA technique of a protein repair / lesion complex, with detection in chemiluminescence.
  • the variant D2 also shown in FIG. 1 requires additional steps and is mainly used to control the results obtained by the reaction in D1.
  • This variant corresponds to the following sequence of steps: desorption of the recognition and / or repair proteins of the microplate, separation in SDS PAGE gel, transfer to nitrocellulose membranes, then detection by the immunoblotting technique.
  • step A which consists in fixing on a sensitized support DNA of plasmid origin purified and treated to generate lesions or cellular DNA, coming from cells treated with direct or indirect genotoxic agents, then lysed using a lysis buffer.
  • LB cell lysis buffer
  • the support can be a well microtiter plate or any other support using beads in order to increase the DNA capture surface and therefore the detection sensitivity in the lowest possible reaction volume.
  • the support is saturated for at least 15 minutes at 30 ° C. with a phosphate buffered saline solution, PBST, to which 0.025% acetylated bovine serum albumin is added.
  • PBST phosphate buffered saline solution
  • stage B the support is used in a repair reaction which consists of an incubation in the presence of purified cell extracts, for two hours at 30 ° C. to give an example, in the presence of inter alia a composition known to dNTP.
  • one of the nucleotides used is modified, for example biotin-21 -dUTP, and this is incorporated into biotin-1 1 -dUMP during the restorative synthesis step.
  • the incorporated amount of modified dUMP is a function of the repair activity and can be detected by chemiluminescence, as described in French patent application No. 95 03230.
  • the object of step C is no longer to detect the presence of dUMP biotinylated with extravidine, but to determine on the same support, the proteins present on the lesions which are specific to the repair.
  • FIG. 2 represents a view of repair reports, signal obtained for the damaged plasmid divided by the signal obtained for the untreated control plasmid, this as a function of part of the incubation time of the reaction, and of on the other hand, the number of lesions produced on DNA by ultraviolet light, and this for 3 different doses of irradiation.
  • the repair is carried out under normal conditions: temperature 30 ° C, 1 50 ⁇ g of purified cell extract, 40 ng of treated or untreated plasmid, adsorbed on the support.
  • FIG. 3 represents the immunoreactivity of two repair proteins which have been chosen as references for the recognition of ultraviolet DNA damage:
  • the expected correlation is noted between the number of lesions present by plasmids and the number of repair protein molecules involved in the early stages of the nucleotide excision reaction.
  • the method according to the invention consists either in: a) directly determining by immunodetection in the support, the level of repair and / or recognition proteins interacting specifically with lesions produced on DNA, step D1 of the figure 1.
  • a specific primary antibody is chosen, and the latter is incubated with shaking.
  • This antibody is for example directed against the protein XPA, or else against the protein p62, and diluted in a solution of PBS and of BSA according to the titer of the antibody used.
  • the supports are then washed using a PBST solution, and then 10
  • the desorption of repair proteins is carried out using a DB buffer: 62.5 mM tris-HCl, pH 6.8 4M urea, 10% glycerol, 2% SDS, 5% ⁇ -mercapto-ethanol, 0.003 % bromophenol blue.
  • This stage lasts approximately 30 minutes at 30 ° C, with stirring.
  • These proteins are then denatured by passage through heat, 80 ° C. to fix the order of magnitude for 20 min, and then agitation for 5 min at 30 ° C.
  • detection by immunoblotting is carried out by SDS-PAGE electrophoresis which makes it possible to separate the proteins according to their sizes, and to reveal, after transfer to membranes, the proteins of interest in the presence of specific antibodies.
  • the complexes obtained are revealed as above by luminescence.
  • FIG. 4 represents a diagram of the repair report obtained with a cell extract purified according to different types of injurious agents.
  • the changes produced by UVC light and the CDDP are recognized by the nucleotide excision system, while those induced by MMS are recognized by the basic excision system.
  • FIGS. 5 and 6 it is shown that when the proteins tested belong to the nucleotide excision system, as are XPA and - 1 1
  • TFIIH-p62 these are well found when lesions are recognized by this system, for example lesions by UVC light or CDDP, but are not found when DNA is damaged by an agent which induces unrecognized modifications by repair by excision of nucleotides, MMS for example.
  • FIGS. 7 and 8 it is shown that the proteins associated more specifically with double-strand or single-strand breaks in DNA can be detected.
  • a reactivity with respect to the Ku70 / Ku80 complex indicates the presence of double-strand breaks while the reactivity with respect to the poly-ribose polymerase protein, PARP, indicates the presence of single-strand breaks in DNA.
  • Another approach is to use not extracts of cells having all repair activities, but cells deficient in one of the systems, for example cells from patients with xeroderma pigmentosum, which are deficient in the early stages of nucleotide excision.
  • Another approach is to use a purified protein with a specific recognition spectrum for certain DNA lesions.
  • the invention also relates to all of the elements necessary for the implementation of this process, these elements possibly being advantageously grouped in a container suitable for marketing facilities.
  • antibodies are directed against certain proteins with a narrower recognition spectrum such as glycosylases or proteins for recognition of DNA breaks.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'objet de l'invention est un procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur l'ADN comprenant les différentes étapes suivantes: préparation de l'ADN; traitement endommageant cet ADN, et fixation de cet ADN lésé sur un support solide sensibilisé, ou préparation de l'ADN; fixation de cet ADN non lésé sur un support solide sensibilisé, et traitement endommageant l'ADN, ou traitement des cellules lyse et capture de l'ADN cellulaire, caractérisé en ce qu'il consiste à: faire agir sur cet ADN lésé une composition comprenant au moins un extrait cellulaire ou une protéine purifiée possédant au moins une activité de reconnaissance et/ou de réparation des lésions, et à détecter sur l'ADN lésé, directement ou indirectement, la présence des protéines de reconnaissance et/ou de réparation des lésions produites, toutes les étapes étant séparées par au moins une étape de lavage. L'invention concerne aussi les éléments pour la mise en oeuvre de ce procédé.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE LESIONS DE L'ADN AU MOYEN DE COMPLEXES DE PROTEINES ET ELEMENTS PERMETTANT LA MISE EN
OEUVRE DU PROCEDE
La présente invention concerne un procédé de détection de modifications structurales de l'ADN en utilisant le complexe lésion/protéines de reconnaissance et/ou de réparation.
L'invention couvre aussi les éléments permettant la mise en oeuvre dudit procédé.
Pour la suite de la description, et pour les revendications, on appelle :
• "produit lésant", tout agent chimique pur spécifique, tout mélange artificiel d'agents chimiques, ou toute composition naturelle d'agents chimiques ou encore, tout agent physique tel que les rayonnements, notamment les rayonnements ionisants et ultraviolets, tout agent biologique tel que virus et protéines exogènes.
• "support sensibilisé" : tout support notamment solide ayant été traité par des substances présentant une très forte affinité pour les acides nucléiques (ADN ou ARN) ; • "extrait cellulaire" : tout extrait cellulaire partiellement purifié, protéines naturelles ou produites par génie génétique, purifiées ou non.
On sait que l'ADN, support de l'information génétique, peut être lésé par des processus métaboliques endogènes, tels que l'alkylation ou l'oxydation des bases, mais plus particulièrement par tout agent génotoxique exogène 2
(xénobiotique, agents physiques et chimiques) ayant des conséquences évidentes sur la viabilité cellulaire si les lésions ne sont pas réparées.
Outre la mort cellulaire induite par ces genotoxiques, un processus de mutagenèse peut être induit ou résulter d'une mauvaise réparation des lésions. L'apparition de mutants est susceptible d'entraîner un dysfonctionnement cellulaire et, en particulier, d'initier un développement tumoral.
Il est donc important d'analyser et de détecter toute modification structurale de l'ADN qui peut être à l'origine de mutations. La détection de lésions peut concerner des préparations d'ADN purifiées et traitées in vitro par un agent génotoxique mais aussi l'ADN cellulaire provenant de tissus prélevés par biopsie ou d'organismes entiers ou de cellules en culture in vitro ou ex vivo, après traitement par tout agent génotoxique.
Ainsi, dans l'industrie du médicament, on peut avoir besoin de déterminer qualitativement et quantitativement soit le pouvoir génotoxique, soit le potentiel protecteur vis à vis d'un effet génotoxique, d'un composé ou d'un mélange de composés. De plus, on peut s'intéresser aux capacités de réparation des lésions suite à un traitement génotoxique dans un type cellulaire donné. Une telle détermination est utile pour des cellules en culture, ou bien isolées ex vivo. Des applications de ce type de détermination sont par exemple la détection de xénobiotiques genotoxiques, le suivi de patients traités par chimiothérapie, ou bien le suivi de personnes travaillant en milieu pollué par des substances genotoxiques.
On connaît différents tests concernant l'ADN, et notamment la demande de brevet EP 0.472.482, qui concerne le dosage de microquantités d'ADN extracellulaire présent dans un liquide biologique, notamment dans le plasma sanguin.
On connaît, par la demande de brevet français N ° 95 03230, un procédé pour déterminer la présence de lésions d'ADN à partir d'un signal de réparation. Ce procédé utilise l'étape de synthèse réparatrice qui survient après toute excision d'une lésion présente dans l'ADN.
Cette synthèse, aussi appelée UDS (Unscheduled DNA Synthesis) a été utilisée pour détecter au niveau cellulaire après incorporation de nucléotides 3
marqués dans l'ADN endommagé et réparé, la présence de lésions sur l'ADN, ainsi que l'activité de réparation des cellules étudiées. Cette synthèse réparatrice a été d'autre part utilisée dans un test décrit par Wood et col. (Cell 1 988, 53, 97-106), qui utilisait deux plasmides purifiés, de tailles différentes, l'un endommagé, l'autre non endommagé, en tant que référence, incubés en présence d'un extrait cellulaire purifié. En présence d'une concentration déterminée de dNTP, d'ATP et de magnésium, la réaction d'excision des lésions a pu être reproduite en totalité, allant de la reconnaissance, en passant par l'incision-excision resynthèse jusqu'à la ligation. Après purification, et séparation des ADN plasmidiques sur gel d'agarose, la radioactivité incorporée dans les plasmides endommagés et les plasmides contrôlés peut être mesurée après autoradiographie du gel d'agarose. Le pourcentage de lésions ainsi réparées in vitro par ce mécanismes est de l'ordre de 5 % .
L'activité d'incision-excision peut être directement mesurée par modification de l'essai décrit ci-dessus suivant un protocole publié par les auteurs du présent brevet (Calsou et Salles, 1 994, Biochem. Biophys. Res. Corn., 202,788-795 et Calsou et Salles, 1 994, Nucleic. Acid Res., 22, 4937- 4942). Le procédé utilisé pour détecter des lésions de l'ADN à partir du signal de réparation décrit dans la demande de brevet français précitée N °95 03230, utilise la propriété des extraits de réaliser les étapes de réparation, et permet de détecter ces lésions à partir du signal obtenu lors de l'étape de resynthèse qui suit l'excision. Ce procédé comprend les différentes étapes suivantes :
• préparer l'ADN, par une méthode qui consiste :
- soit à fixer de l'ADN cible sur un support solide sensibilisé, puis à soumettre cet ADN à l'action d'au moins un agent lésant,
- soit à soumettre les cellules directement à l'action d'un produit lésant, à lyser ces cellules dans une solution, puis à fixer l'ADN sur un support solide sensibilisé,
• soumettre cet ADN lésé fixé à l'action réparatrice d'un extrait cellulaire, cet extrait comprenant un marqueur,
• révéler directement ou indirectement l'incorporation de ce marqueur dans l'ADN réparé. 4
Dans le but de se soustraire à toute condition biochimique dépendant de la synthèse d'ADN, d'améliorer la sensibilité de détection, d'obtenir d'autres informations sur le système de réparation qui prend en charge les lésions étudiées, d'élargir la gamme de lésions d'ADN détectables, on utilise la capacité des protéines de reconnaissance et/ou de réparation, d'interagir avec tout type de lésion.
En effet, le test, selon la présente invention, utilise des protéines capables de reconnaître des lésions produites in vitro sur de l'ADN purifié ou bien à partir de cellules isolées ex vivo, avec une sensibilité accrue, une possibilité d'étudier en première approximation le système de réparation mis en jeu, une plus large gamme de lésions détectées et également un gain de temps important.
En effet, la détection qualitative et quantitative selon l'invention, s'effectue au niveau de la première étape de reconnaissance, et non pas sur l'étape de synthèse réparatrice. Les conditions d'interaction entre les protéines et l'ADN lésé peuvent donc ainsi être optimisées sans tenir compte des paramètres biochimiques requis pour l'ensemble de la réaction de réparation.
On connaît à ce jour au moins une dizaine de protéines adaptées à ce type de fonction dans le cadre de l'excision de nucléotides, au moins autant pour ce qui concerne l'excision de base, ainsi que d'autres protéines impliquées dans la reconnaissance des cassures de l'ADN.
Le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
- préparation de l'ADN,
- traitement endommageant cet ADN, et - fixation de cet ADN lésé sur un support solide sensibilisé, ou
- préparation de l'ADN,
- fixation de cet ADN non lésé sur un support solide sensibilisé, et
- traitement endommageant l'ADN, ou
- traitement des cellules ,
- lyse et capture de l'ADN cellulaire, 5
et se caractérise en ce qu'il consiste à :
- faire agir sur cet ADN lésé une composition comprenant soit un extrait cellulaire possédant au moins une activité de reconnaissance et/ou de réparation des lésions, soit une protéine purifiée avec un spectre de reconnaissance connu, et
- à détecter sur l'ADN lésé, directement ou indirectement, la présence des protéines de reconnaissance et/ou de réparation des lésions produites,
Toutes les étapes étant séparées par au moins une étape de lavage si nécessaire.
Plus particulièrement le procédé de détection qualitative et quantitative de lésions, se caractérise en ce qu'il consiste à détecter directement sur l'ADN lésé les protéines de réparation ou toute autre construction de reconnaissance à l'aide d'anticorps ou de systèmes de marquage et à révéler par chimioluminescence les complexes formés.
Les anticorps comprennent des anticorps primaires et secondaires. Un premier mode de mise en oeuvre consiste à détecter les protéines liées à l'ADN lésé par un premier anticorps spécifique suivi d'une révélation de type ELISA utilisant un second anticorps couplée à une activité enzymatique (par exemple HRP) permettant une quantification en luminescence.
On peut aussi détecter dans le surnageant la présence des protéines de réparation après séparation sur gel et immunoblotting et/ou à étudier la diminution de concentration de ces protéines en fonction d'un nombre croissant de lésions sur l'ADN. Une variante utilisable pour des lésions connues consiste à utiliser directement une protéine purifiée de réparation et/ou de reconnaissance spécifique et à détecter par la technique ELISA à l'aide d'un anticorps primaire dirigé contre la protéine puis d'un anticorps secondaire couplé à une activité enzymatique De façon préférentielle, le support solide est une plaque de microtitration à puits, ou bien tout système utilisant des billes, afin d'augmenter la surface de capture de l'ADN, et la sensibilité de détection. 6
On sensibilise le support solide par des substances présentant une très forte affinité vis à vis de l'ADN, de façon à provoquer une fixation de cet ADN par adsorption. Ces substances sont choisies parmi les substances cationiques ou les protéines, au pH utilisé pour l'adsorption du matériel nucléique. Les substances cationiques sont choisies parmi les polyacides aminés de type polylysine ou polyargine, lévogyres, dextrogyres ou levogyres/dextrogyres. Dans le cas de la polylysine, son poids moléculaire retenu se situe dans la fraction 1 5 000 à 30 000 Daltons.
La sensibilisation du support est réalisée par incubation en tampon phosphate 1 0 mM, chlorure de sodium 1 37 mM et un pH compris entre 6,5 et 8, plus particulièrement 7.
De façon préférentielle, l'ADN adsorbé est de l'ADN génomique obtenu après lyse de cellules traitées ou non traitées par un agent génotoxique.
L'invention couvre aussi les éléments nécessaires à la mise en oeuvre du procédé, c'est à dire :
- des ADN modifiés,
- l'extrait cellulaire proficient pour toutes les activités de détection et/ou réparation de cet ADN lésé,
- les tampons d'incubation et de lavage, et - la microplaque sensibilisée par adsorption d'ADN plasmide et cellulaire.
En outre, les éléments peuvent comprendre des tampons de lyse pour d'une part la désorption des complexes, et d'autre part la lyse des cellules lorsque la détection est menée sur de l'ADN cellulaire après endommagement. L'invention est maintenant décrite en regard des dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 représente une vue schématique des étapes du procédé selon le mode principal et une variante,
- la figure 2 représente une vue des rapports de réparation,
- la figure 3 représente l'immunoréactivité de deux protéines de réparation, 7
- la figure 4 représente un diagramme du rapport de réparation obtenu avec un extrait cellulaire purifié en fonction de différents types d'agents lésants,
- la figure 5 représente un diagramme des résultats obtenus par le procédé selon l'invention,
- la figure 6 représente un diagramme identique à celui de la figure 5, mais avec une protéine différente,
- la figure 7 représente un diagramme des résultats obtenus par le procédé selon l'invention en considérant la détection des cassures de l'ADN, et
- la figure 8 représente un diagramme des résultats obtenus par le procédé selon l'invention en considérant la détection des cassures simple-brin de l'ADN.
Sur la figure 1 , le mode principal qui comprend les étapes A, B C et D1 , correspond à la détection directe par la technique ELISA d'un complexe protéines de réparation/lésions, avec détection en chimioluminescence.
La variante D2 montrée aussi sur la figure 1 , requiert des étapes additionnelles et elle est principalement utilisée pour contrôler les résultats obtenus par la réaction en D1 . Cette variante correspond à la succession d'étapes suivantes : désorption des protéines de reconnaissance et/ou de réparation de la microplaque, séparation en gel PAGE SDS, transfert sur membranes de nitrocellulose, puis détection par la technique d'immunoblotting.
On a représenté une étape A qui consiste à fixer sur un support sensibilisé de l'ADN d'origine plasmidique purifié et traité pour générer des lésions ou bien de l'ADN cellulaire, provenant de cellules traitées par des agents genotoxiques directs ou indirects, puis lysés à l'aide d'un tampon de lyse.
On peut citer un exemple de tampon de lyse cellulaire dit LB qui comprend au moins :
- 1 0 mM de tampon phosphate
- 1 0 % d'urée 8
- 1 % de détergent
- 1 0 mM EDTA, pH8
- 1 00 //g/ml Rnase A
- H2O distillée. L'ADN est ensuite immobilisé directement et sans purification sur le support comme cela est décrit dans la demande de brevet français N ° 95 03230.
Le support peut être une plaque de microtitration à puits ou tout autre support mettant en oeuvre des billes afin d'augmenter la surface de capture de l'ADN et donc la sensibilité de détection dans un volume réactionnel le plus faible possible.
Le support est saturé pendant au moins 1 5 minutes à 30°C avec une solution tampon phosphate saline, PBST, à laquelle on ajoute 0,025 % de sérum albumine bovine acétylée. Au cours de l'étape B, le support est utilisé dans une réaction de réparation qui consiste en une incubation en présence d'extraits cellulaires purifiés, pendant deux heures à 30° C pour donner un exemple, en présence entre autres d'une composition connue de dNTP.
Pendant l'étape de réparation, un des nucléotides utilisé est modifié, par exemple le biotine-21 -dUTP, et celui-ci est incorporé en biotin-1 1 -dUMP pendant l'étape de synthèse réparatrice.
La quantité incorporée de dUMP modifié est fonction de l'activité de réparation et peut être détectée par chimioluminescence, ainsi qu'il a été décrit dans la demande de brevet français N ° 95 03230. L'objet de l'étape C est non plus de détecter la présence de dUMP biotinylé avec l'extravidine, mais de déterminer sur le même support, les protéines présentes sur les lésions qui sont spécifiques de la réparation.
Dans le cas de l'étude de l'activité réparatrice, on obtient des résultats, ainsi qu'il est mentionné en figure 2, c'est à dire les capacités de réparation de l'ADN en fonction du temps, suivant le nombre de lésions produites par la lumière ultraviolette. 9
Ainsi, la figure 2 représente une vue de rapports de réparation, signal obtenu pour le plasmide endommagé divisé par le signal obtenu pour le plasmide contrôle non traité, ceci en fonction d'une part du temps d'incubation de la réaction, et d'autre part du nombre de lésions produites sur l'ADN par la lumière ultraviolette, et ce pour 3 doses différentes d'irradiation.
La réparation est conduite dans les conditions normales : température 30°C, 1 50 μg d'extrait cellulaire purifié, 40 ng de plasmide traité ou non traité, adsorbés sur le support.
La figure 3 représente l'immunoréactivité de deux protéines de réparation qui ont été choisies comme références pour la reconnaissance des lésions ultraviolettes de l'ADN :
- XPA, protéine intervenant dans la reconnaissance des lésions, et
- p62, protéine du facteur de transcription TFIIH, intervenant dans le complexe de préincision. La présence de ces protéines est suivie à l'aide d'anticorps spécifiques sur le plasmide traité et non traité, dans les conditions de la réaction de la figure 2, après deux heures d'incubation avec les plasmides traités à 3 doses différentes d'irradiation en lumière ultraviolette.
On constate la corrélation attendue entre le nombre de lésions présentes par plasmides et le nombre de molécules de protéines de réparation intervenant dans les étapes précoces de la réaction d'excision de nucléotides.
Selon la présente invention, on utilise une approche différente de celle de la synthèse réparatrice.
En effet, le procédé selon l'invention consiste soit à : a) déterminer directement par immunodétection dans le support, le taux de protéines de réparation et/ou de reconnaissance interagissant spécifiquement avec des lésions produites sur l'ADN, étape D1 de la figure 1 .
Dans ce mode principal de détermination, on choisit un anticorps primaire spécifique, et on incube celui-ci sous agitation. Cet anticorps est par exemple dirigé contre la protéine XPA, ou bien contre la protéine p62, et dilué dans une solution de PBS et de BSA selon le titre de l'anticorps utilisé. Les supports sont ensuite lavés à l'aide d'une solution de PBST, puis on procède à 10
l'incubation d'un anticorps secondaire conjugué par exemple avec la peroxydase et dilué en fonction de l'anticorps utilisé. Les supports sont de nouveau lavés. La révélation et la quantification sont réalisées par chimioluminescence. ou b) à déterminer le taux de protéines après avoir réalisé une étape de désorption dans une solution adaptée, et à détecter par immunoblotting sur filtre de nitrocellulose. Cette étape D2 de la figure 1 sert en quelque sorte de contrôle de la réaction D 1 qui est d'une utilisation beaucoup plus facile et automatisable.
Par exemple, la désorption des protéines de réparation est réalisée en utilisant un tampon DB : 62,5 mM tris-HCI, pH 6,8 4M urea, 1 0 % glycérol, 2 % SDS, 5 % β-mercapto-ethanol, 0,003 % bleu de bromophenol. Cette étape dure 30 minutes environ à 30°C, sous agitation. Ces protéines sont ensuite dénaturées par passage à la chaleur, 80°C pour fixer l'ordre de grandeur pendant 20 mn, et ensuite agitation 5 mn à 30°C. Plus particulièrement la détection par immunoblotting est réalisée par une électrophorèse SDS-PAGE qui permet de séparer les protéines en fonction de leurs tailles, et de révéler, après transfert sur membranes, les protéines d'intérêt en présence d'anticorps spécifiques. Les complexes obtenus sont révélés comme précédemment par luminescence.
La figure 4 représente un diagramme du rapport de réparation obtenu avec un extrait cellulaire purifié en fonction de différents types d'agents lésants. Les modifications produites par la lumière UVC et le CDDP sont reconnues par le système d'excision de nucléotides, alors que celles induites par le MMS sont reconnues par le système d'excision de base.
Quel que soit l'agent lésant, un rapport de réparation est obtenu signifiant la présence de lésions sur l'ADN, ainsi qu'il avait déjà été obtenu par le procédé de quantification de synthèse réparatrice de l'art antérieur.
Sur les figures 5 et 6, on montre que lorsque les protéines testées appartiennent au système d'excision de nucléotides, comme le sont XPA et - 1 1
TFIIH-p62, celles-ci sont bien retrouvées lorsque les lésions sont reconnues par ce système, par exemple lésions par la lumière UVC ou le CDDP, mais ne sont pas retrouvées lorsque l'ADN est lésé par un agent qui induit des modifications non reconnues par la réparation par excision de nucléotides, MMS par exemple.
Ces résultats indiquent la spécificité de la réaction de réparation, et on obtiendra une image inverse si l'on utilise des anticorps dirigés contre des glycosylases spécifiques des agents alkylants, lesquels donneront un signal avec l'utilisation de plasmides lésés par le MMS par exemple, alors qu'elles ne donneront aucun signal lorsque le plasmide sera lésé par la lumière UVC ou le CDDP.
Sur les figures 7 et 8, on montre que l'on peut détecter les protéines associées plus spécifiquement aux cassures double-brin ou simple-brin dans l'ADN. Ainsi, une réactivité vis à vis du complexe Ku70/Ku80 indique la présence de cassures double-brin alors que la réactivité vis à vis de la protéine poly-ribose polymérase, PARP, indique la présence de cassures simple-brin dans l'ADN.
Outre la simplicité et la sensibilité de détection de protéines de réparation, selon l'anticorps utilisé, on peut discriminer le système de réparation impliqué dans la réparation de lésions inconnues, et ainsi orienter les conclusions de l'étude vers la nature chimique probable de la lésion.
Une autre approche consiste à utiliser non pas des extraits de cellules possédant toutes les activités de réparation, mais des cellules déficientes dans l'un des systèmes, par exemple des cellules provenant de patients atteints de xeroderma pigmentosum, lesquelles sont déficientes dans les étapes précoces d'excision de nucléotides.
Par exemple, en utilisant des extraits provenant de cellules XPA, on n'obtient aucun signal avec l'anticorps XPA, puisque cette protéine n'est pas produite par la cellule, mais on n'obtient également aucun signal avec l'anticorps TFIIH-p62 puisqu'il faut d'abord concrétiser l'étape de reconnaissance par XPA. En effet cette étape de reconnaissance est nécessaire à la fixation des autres protéines du complexe de réparation. 12
On peut réaliser des expérimentations avec des mutants du système d'excision de base, ou des mutants d'autres protéines de réparation de lésions telles que des cassures de l'ADN simple ou double-brin.
Une autre approche consiste à utiliser une protéine purifiée présentant un spectre de reconnaissance spécifique de certaines lésions de l'ADN.
La conception même de cet essai montre son extrême flexibilité, et adaptabilité à partir du moment où l'on dispose des anticorps d'intérêts, les études pouvant être croisées avec des extraits cellulaires provenant de mutants déficients dans telle ou telle activité de réparation, ou avec des protéines purifiées et/ou recombinantes présentant une affinité vis-à-vis d'une lésion ou d'une gamme de lésions spécifiques dans l'ADN.
L'invention a également pour objet l'ensemble des éléments nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé, ces éléments pouvant être avantageusement regroupés dans un contenant adapté pour des facilités de commercialisation.
Ainsi parmi les éléments nécessaires, on trouve les anticorps primaires et secondaires, la nature des anticorps primaires pouvant varier suivant l'étude envisagée. Ainsi dans le cas des éléments de base, il est prévu de fournir des anticorps dirigés contre une protéines de réparation du système d'excision de nucléotides, système reconnaissant la quasi-totalité des modifications de l'ADN.
Dans un cas plus spécifique, il est prévu des anticorps dirigés contre certaines protéines avec un spectre de reconnaissance plus étroit que sont les glycosylases ou des protéines de reconnaissance des cassures de l'ADN .

Claims

1 3R E V E N D I C A T I O N S
1 . Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions sur l'ADN comprenant les différentes étapes suivantes :
- préparation de l'ADN,
- traitement endommageant cet ADN, et - fixation de cet ADN lésé sur un support solide sensibilisé, ou
- préparation de l'ADN,
- fixation de cet ADN non lésé sur un support solide sensibilisé, et
- traitement endommageant l'ADN, ou
- traitement des cellules,
- lyse et capture de l'ADN cellulaire, caractérisé en ce qu'il consiste à :
- faire agir sur cet ADN lésé une composition comprenant au moins un extrait cellulaire ou une protéine purifiée possédant au moins une activité de reconnaissance et/ou de réparation des lésions, et
- à détecter sur l'ADN lésé, directement ou indirectement, la présence des protéines de reconnaissance et/ou de réparation des lésions produites, toutes les étapes étant séparées par au moins une étape de lavage.
2. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il consiste à détecter directement sur l'ADN les protéines de réparation ou tout autre construction de reconnaissance à l'aide d'anticorps ou de systèmes de marquage et par révélation des complexes formés par chimioluminescence.
3. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions de la revendication 2, caractérisé en ce que les anticorps comprennent des anticorps primaires et secondaires. 14
4. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les protéines liées à l'ADN lésé après désorption des complexes par analyse de type immunoblotting.
5. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter dans le surnageant la présence des protéines de réparation après séparation sur gel et immunoblotting.
6. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter dans le surnageant la présence des protéines de réparation et à étudier la diminution de concentration de ces protéines en fonction d'un nombre croissant de lésions sur l'ADN.
7. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise comme support solide, une plaque de microtitration à puits, ou tout système utilisant des billes, afin d'augmenter la surface de capture de l'ADN et la sensibilité de détection.
8. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on sensibilise le support solide par des substances présentant une très forte affinité vis à vis de l'ADN, de façon à provoquer une fixation de cet ADN par adsorption.
9. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendications 8, caractérisé en ce qu'on choisit les substances parmi les substances cationiques ou les protéines, au pH utilisé pour l'adsorption du matériel nucléique.
10. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on choisit les substances cationiques parmi les polyacides aminés de type polylysine ou polyargine, lévogyres, dextrogyres ou levogyres/dextrogyres. 1 5
1 1 . Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon la revendication 1 0, caractérisé en ce que, dans le cas de la polylysine, on retient un poids moléculaire situé dans la fraction 1 5 000 à 30 000 Daltons.
1 2. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon l'une des quelconques revendications 9, 10 ou 1 1 , caractérisé en ce qu'on réalise la sensibilisation du support par incubation en tampon phosphate 10 mM, chlorure de sodium 1 37 mM et un pH compris entre 6,5 et 8, plus particulièrement 7.
1 3. Procédé de détection qualitative et quantitative de lésions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ADN adsorbé est de l'ADN génomique obtenu après lyse de cellules traitées ou non traitées par un agent génotoxique.
1 4. Eléments pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils comprennent : - des ADN modifiés,
- l'extrait cellulaire proficient pour toutes les activités de détection et/ou réparation de cet ADN lésé, ou bien une protéine purifiée de réparation et/ou de reconnaissance,
- les tampons d'incubation et de lavage, et - la microplaque sensibilisée pour l'adsorption d'ADN plasmide ou cellulaire.
1 5. Eléments selon la revendication 1 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre des tampons de lyse pour d'une part la désorption des complexes, et d'autre part la lyse des cellules lorsque la détection est menée sur de l'ADN cellulaire après endommagement.
PCT/FR1999/000691 1998-03-26 1999-03-25 Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede WO1999049080A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99910424A EP1066409A1 (fr) 1998-03-26 1999-03-25 Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9804064A FR2776670B1 (fr) 1998-03-26 1998-03-26 Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede
FR98/04064 1998-03-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999049080A1 true WO1999049080A1 (fr) 1999-09-30

Family

ID=9524752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1999/000691 WO1999049080A1 (fr) 1998-03-26 1999-03-25 Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1066409A1 (fr)
FR (1) FR2776670B1 (fr)
WO (1) WO1999049080A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2849058A1 (fr) * 2002-12-20 2004-06-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
FR2887261A1 (fr) * 2005-06-20 2006-12-22 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993024837A1 (fr) * 1992-05-22 1993-12-09 Applied Genetics Inc. Procedes de recherche de o6-methylguanine-adn methyltransferase
WO1996028571A1 (fr) * 1995-03-15 1996-09-19 Societe Francaise De Recherches Et D'investissements (S.F.R.I.) Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
WO1996041192A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 The Johns Hopkins University Detection par anticorps de proteines de reparation d'erreurs d'appariement
WO1998053099A1 (fr) * 1997-05-20 1998-11-26 Genolife Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993024837A1 (fr) * 1992-05-22 1993-12-09 Applied Genetics Inc. Procedes de recherche de o6-methylguanine-adn methyltransferase
WO1996028571A1 (fr) * 1995-03-15 1996-09-19 Societe Francaise De Recherches Et D'investissements (S.F.R.I.) Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
WO1996041192A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 The Johns Hopkins University Detection par anticorps de proteines de reparation d'erreurs d'appariement
WO1998053099A1 (fr) * 1997-05-20 1998-11-26 Genolife Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRIT P. ET AL.,: "Ku70/Ku80 protein complex inhibits the binding of nucleotide excision repair proteins on linear DNA in vitro", J. MOLECULAR BIOLOGY, vol. 284, no. 4, - 11 December 1998 (1998-12-11), pages 963 - 973, XP002109336 *
PARK M. S. ET AL.,: "Ultraviolet-induced movement of the human DNA repair protein, Xeroderma pigmentosum type G, in the nucleus", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 93, - August 1996 (1996-08-01), pages 8368 - 8373, XP002087082 *
SALLES B ET AL: "A CHEMILUMINESCENT MICROPLATE ASSAY TO DETECT DNA DAMAGE INDUCED BYGENOTOXIC TREATMENTS", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 232, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 37 - 42, XP002054956, ISSN: 0003-2697 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2849058A1 (fr) * 2002-12-20 2004-06-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
WO2004059004A2 (fr) * 2002-12-20 2004-07-15 Commissariat A L'energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
WO2004059004A3 (fr) * 2002-12-20 2004-08-19 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
CN100455674C (zh) * 2002-12-20 2009-01-28 法国原子能委员会 定量评价至少一种生物培养基总的和特定的dna修复能力的方法及其应用
US9617580B2 (en) 2002-12-20 2017-04-11 Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives Method for the quantitative assessment of global and specific DNA repair capacities of at least one biological medium, and the applications therefor
FR2887261A1 (fr) * 2005-06-20 2006-12-22 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
WO2006136686A1 (fr) * 2005-06-20 2006-12-28 Commissariat A L'energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
US8785118B2 (en) 2005-06-20 2014-07-22 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for fixing a supercoiled DNA and the use for analyzing the DNA repair

Also Published As

Publication number Publication date
EP1066409A1 (fr) 2001-01-10
FR2776670A1 (fr) 1999-10-01
FR2776670B1 (fr) 2000-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0097664B1 (fr) Procede faisant intervenir une sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et permettant de detecter et de caracteriser une sequence d'adn homologue
Niemeyer et al. Oligonucleotide-directed self-assembly of proteins: semisynthetic DNA—streptavidin hybrid molecules as connectors for the generation of macroscopic arrays and the construction of supramolecular bioconjugates
EP0158758B1 (fr) Sonde contenant un acide nucléique modifié et reconnaissable par des anticorps spécifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps spécifiques pour détecter et caractériser une séquence d' ADN homologue
Isik et al. The SUMO pathway is required for selective degradation of DNA topoisomerase IIβ induced by a catalytic inhibitor ICRF-193
WO2006049289A1 (fr) Procede de detection de substances cibles
CA2263756A1 (fr) Procede de mise en evidence d'un materiel biologique cible, phase de capture, phase de detection et reactif les contenant
WO1999049080A1 (fr) Procede de detection de lesions de l'adn au moyen de complexes de proteines et elements permettant la mise en oeuvre du procede
WO2003080864A1 (fr) Histone deacetylase: nouvelle cible moleculaire de la neurotoxicite
EP1576191B1 (fr) Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications.
FR2666096A1 (fr) Nouveau procede de dosage d'acide desoxyribonucleique present en position extracellulaire dans un milieu.
EP1283911B1 (fr) Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
EP1899485A1 (fr) Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
Gong et al. A chromogenic assay for screening large antibody libraries
FR2731711A1 (fr) Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
EP1137801B1 (fr) Methode de diagnostic basee sur la fonction d'une proteine produite dans un systeme acellulaire a partir d'un echantillon d'acides nucleiques
Lloyd et al. Forensic analysis
Hwang et al. The use of electrophoretic mobility shift assays to study DNA repair
Coux et al. The protein of Mr 21 000 constituting the prosome‐like particle of duck erythroblasts is homologous to apoferritin
WO1991006671A1 (fr) Moyens pour la detection de cellules hautement proliferatives
FR2652901A1 (fr) Complexes biologiques a base de nucleosomes, et leurs applications, notamment dans le domaine du diagnostic in vitro du lupus erythemateux dissemine (led).
JP2806964B2 (ja) 高分子コンジュゲート
WO2000009747A1 (fr) Procede de separation et de caracterisation des fonctions potentiellement presentes dans un echantillon biologique contenant des acides nucleiques
EP2430163B1 (fr) Procede de production d'une proteine d'interet grace a une proteine de fusion
JPH01285858A (ja) 抗酸菌の核酸配列測定用試薬およびこの試薬を用いる核酸配列測定法
WO2002077273A1 (fr) Methode de genotypage sans extraction de l'adn

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999910424

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999910424

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09936559

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999910424

Country of ref document: EP