WO1999046589A1 - Perfectionnements aux dispositifs d'electrophorese multicapillaires du type a detection en sortie des capillaires - Google Patents

Perfectionnements aux dispositifs d'electrophorese multicapillaires du type a detection en sortie des capillaires Download PDF

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WO1999046589A1
WO1999046589A1 PCT/FR1999/000538 FR9900538W WO9946589A1 WO 1999046589 A1 WO1999046589 A1 WO 1999046589A1 FR 9900538 W FR9900538 W FR 9900538W WO 9946589 A1 WO9946589 A1 WO 9946589A1
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capillaries
capillary
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outlet
molecules
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PCT/FR1999/000538
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Samuele Bottani
Rainer Siebert
Hans Rebscher
Maurice Cohen-Solal
Luc Valentin
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
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    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories

Definitions

  • the present invention relates to multicapillary electrophoresis devices.
  • multicapillary systems comprising a strip of several juxtaposed capillaries.
  • multicapillary electrophoresis systems have been proposed in which the laser beam of excitation of the molecules is sent thereon through the walls of the capillaries, along an axis in the plane of the bar along which said capillaries are distributed. Said axis is generally perpendicular to the direction in which the capillaries extend, the fluorescence of the molecules being observed by reception means having an optical axis perpendicular to the plane of the bar of the capillaries.
  • Multicapillary systems are also known in which the molecules which pass through the capillaries are excited by laser radiation which is sent, just at the outlet of the bar, in the plane of said bar and perpendicular to the direction in which the capillaries extend. .
  • the fluorescence of the molecules excited by this radiation is detected in particular by means of a CCD camera which is oriented with an axis perpendicular to the plane of the capillary strip.
  • H. Kambara US patent 56 67 656, variants 7 and 8
  • detection takes place in the small dimension space (0.5mm) arranged between the electrophoretic separation capillary and a second capillary facing it and serving for the passage of electric current.
  • Said detection space is located in a cavity filled with buffer and optically favorable.
  • the electric current flows into the detection space between the two capillaries so that the samples migrate from the first capillary to the second.
  • An object of the invention is therefore to propose a multicapillary electrophoresis device in which the excitation of the molecules and the detection of their fluorescence is carried out at the capillary outlet, which does not have the drawbacks of previous systems and which is particularly reliable, easy to use, and has performances allowing sequencing and genotyping at high throughput.
  • the invention provides a multicapillary electrophoresis device comprising a plurality of juxtaposed capillaries, means for generating inside the capillaries an electric field which ensures electrophoretic migration, at least one source for the emission of a beam intended to excite molecules at the outlet of the capillary, means for detecting the fluorescence of the molecules excited by said beam, characterized in that it comprises means for generating another electric field, called electric confinement field, which is distributed uniformly around said capillaries and which is substantially parallel thereto, this electric field confining the electrophoretic migration field and requiring the molecules to move substantially without diverging in the axis of said capillaries.
  • the device comprises at least one intermediate metal electrode directly juxtaposed to the capillaries in the vicinity of the outlet thereof, as well as a metal electrode which defines the electrophoretic field and which is arranged in line with the outlets of the capillaries, parallel to the intermediate electrode and perpendicular to the capillaries, these two electrodes imposing together, at the capillary outlet, an electric confining field;
  • the potential which is applied to this intermediate electrode is at a value between those of the potentials of the electrodes imposing an electric field between the ends of the capillaries;
  • It includes a detection cavity in which the capillaries are received at their end, the intermediate electrode being arranged outside this cavity;
  • the wall of said cavity which is opposite the intermediate electrode has orifices ensuring electrical contact between said intermediate electrode and the electrode which is arranged in line with the capillary outlets;
  • the capillaries are contiguous and only one capillary out of two is charged, the electric field at the outlet of a charged capillary being confined laterally by the electric confinement field at the outlet of the adjacent uncharged capillaries; - the potential difference applied to charged capillaries is different from that applied to uncharged capillaries;
  • the capillaries are distributed in bar (s) and in the direction perpendicular to the plane of the bar (s), the electric field at the outlet of the capillaries is further confined by the geometry of a cavity in which said capillaries are received;
  • a bar of capillaries is between dielectric blades which, at the outlet of the capillaries, have a recess and are spaced apart by a distance less than or equal to the external diameter of said capillaries;
  • It comprises, opposite the capillaries, a plurality of orifices which are aligned with said capillaries and in which the electric fields at the outlet of the capillaries in which the molecules migrate, are channeled;
  • the orifices are ends of other capillaries.
  • FIG. 1 is a schematic perspective representation with cutaway of a device according to a possible embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is a schematic representation from above of the containment arrangement of the device of Figure 1;
  • FIG. 3 is a schematic representation in top view illustrating the current lines according to which the molecules leaving the capillary move at the outlet of a capillary;
  • FIG. 4 is a schematic representation of another possible embodiment of the invention.
  • FIG. 5 is a representation similar to that of Figure 3 illustrating another possible embodiment of the invention.
  • Figures 6a and 6b are schematic representations in axial and transverse section illustrating the means used to achieve confinement in the direction perpendicular to the plane of a bar of capillaries with a device of the type of that illustrated in Figure 5;
  • Figures 7 and 8 are schematic representations similar to those of Figures 3 and 5 illustrating other embodiments still possible for the invention.
  • the device which is illustrated in Figures let 2 comprises:
  • a metal anode 5 which is arranged in the channel of the container 1 downstream from the other end of the capillary strip 2 and which extends perpendicular to the capillaries, at the level of the latter,
  • an intermediate electrode 7 which is arranged in the channel of the container 1 upstream from the end of the bar 2, in the vicinity of this end and which is juxtaposed with the capillaries,
  • means 8 for imposing given potential differences between the cathode 4 and the anode 5, as well as between the intermediate electrode 7 and the anode 5.
  • the channel 1a is filled with a polymer buffer solution identical to that of the electrophoretic separation medium in the capillaries.
  • the solution filling the channel is a viscous solution reducing the diffusion of molecules and convection movements.
  • the solution filling the channel is a solution of polymers which prevents the electroosmotic flow, for example a solution in buffer of 5% of Poly (vinylpyrrolidone).
  • the solution filling the channel is filled with a gel or also with a solution of heat-sensitive polymers which gels at high temperature.
  • the intermediate electrode 7 is a metal electrode perpendicular to the capillaries of the bar 2 and parallel to the anode 5.
  • This electrode 7 is for example a metal wire placed on the bar 2 of capillaries, transversely with respect to the latter.
  • the electrode 7 may consist of two metallic wires of this type, arranged transversely on the bar 2, on either side of the latter.
  • it can be constituted by a metal plate pierced with holes through which the capillaries of the bar 2 pass.
  • many other embodiments may also be suitable.
  • the electrodes 5 and 7 are immersed in the solution with which the channel 1a is filled.
  • the potential which is applied to this intermediate electrode 7 is at a value between that of the potential applied to the anode 5 and that of the potential applied at cathode 4, so as to generate around the bar 2 of capillaries an electric field which is uniformly distributed around said bar 2 and which is substantially parallel to said capillaries.
  • the intermediate electrode 7 makes it possible, with the electrode 5, to generate at the outlet of the capillaries 2a another electric field which, instead of being divergent as is generally the case, is substantially parallel to the axes of the capillaries, as illustrated by the arrows in FIG. 2 which symbolize the direction of the current lines between the electrodes 5 and 7.
  • This electric field is called “confinement field” because it confines the electrophoretic migration field generated between the electrodes 4 and 5
  • the fields at the outlet of the capillaries diverge strongly: they are equivalent to that of a radial point charge.
  • the value of the potential of the electrode 7 is preferably chosen so that the lines along which the molecules to be analyzed move are, at the outlet of the capillary 2a, of the type of those illustrated by the arrows leaving the capillaries in the figure 3.
  • the cavity 6 has a restricted cross section which contributes to the confinement of the field in the direction perpendicular to the strip 2, and further limits the intensity of the current of the confinement field and consequently the resulting Joule effect.
  • this cavity 6 is defined by two plates between which the end of the capillary strip is received.
  • the electrode 7 is preferably placed outside of the cavity 6, so that the gas emissions generated by said electrode do not disturb the detection zone.
  • the wall of the cavity 6 which is opposite this intermediate electrode 7 then advantageously has orifices ensuring contact between said electrode 7 and the electrode 5, by means of the electrolyte solution.
  • These orifices are, for example, holes with a diameter of the same order of magnitude as those of the capillaries, inserted between said capillaries.
  • the container 1 is made of Plexiglas® and is 1 cm high, 1.5 cm wide and 12 cm long.
  • the detection cavity 6 is arranged on the bottom of the channel la. It is rectangular in shape and has a section adjusted to that of the bar 2 of capillaries. It consists of two Teflon® plates of thickness equal to the external diameter of the capillaries used (of 360 ⁇ m), of length substantially equal to 2 cm, placed on the bottom of the main container and between which spacers are interposed. The width of these spacers (approximately equal to 0.5 cm) is adjusted so that the depth of the cavity corresponds to that of the row of capillaries. A 2 mm thick glass microscope slide pressed on the separators serves as a cover for the cavity 6.
  • the capillaries 2a are coated with polyimide to their ends.
  • the molecules are excited in the cavity 6 at the outlet of the capillaries 2a by a beam which is perpendicular to the axis of said capillaries and which is either in the plane in which said capillaries 2a are distributed, or perpendicular to this plane.
  • the width of the bar 2 of capillaries is limited by the natural divergence of the laser beam, but the whole beam is used to excite the molecules in all the capillaries.
  • an elliptical beam is used for example, the long axis of which is of a length corresponding to the width of the bar of the capillaries 2a. Only a fraction of the beam is actually used to excite the signal. The fluorescence can be detected perpendicular to the plane of the capillary strip.
  • a laser beam (at a wavelength of 488 nm and emitted with a power of 10 W) burst over a width of approximately 1 cm was focused perpendicular to the axis of the capillaries, at an adjustable distance from the ends.
  • the fluorescence light was collected by a camera fitted with a macro objective and a SCHOTT colored filter cutting the laser light, placed vertically over the detection zone.
  • the capillaries 2a were inserted 1.5cm inside the detection cavity 6; the intermediate electrode 7 was a simple electric wire of diameter 1mm placed at 2cm from the ends (outside the cavity 6) and simply pressed against the capillaries 2a; the anode 5 was an identical wire placed opposite the capillaries 2a, outside of the detection cavity 6, 2 cm from the extremities.
  • the electrodes 4, 5 and 7 were in electrical contact through the polymer solution (Hydroxylpropylcellulose at 0.5% in solution in TBE OJX buffer) which fills the cavity 6 and the capillaries 2a.
  • the assembly was energized by two power supplies in series: a first high-voltage stage, between the cathode 4 at the inlet of the capillaries 2a and the electrode 5 ensured the potential difference in the capillaries 2a for electrophoretic migration (corresponding at a field of 35 to 70 N / cm); a second stage, at a lower voltage, between the intermediate electrode 7 and the anode 5, imposes the electric field in the detection cell that constitutes the cavity 6 (field of the order of 75 N / cm).
  • the potential of the intermediate electrode 7 was fixed to ground. It was found that the currents coming from the capillaries 2a were confined and that the bands leaving the capillaries 2a were separated. These bands are all the more confined as the external field is intense. Other embodiments than the one just described are of course conceivable.
  • the capillaries 2a are immersed in a cathode tank 3a, while the capillaries 2b are immersed in a cathode tank 3b.
  • the cathode tank 3a receives an electrode 4 which, with the anode 5 immersed in the detection cavity 6, generates an electrophoretic migration field inside the analysis capillaries 2a.
  • the cathode tank 3b receives an electrode 7 which is at an intermediate potential between that of the cathode 4 and that of the anode 5
  • the capillaries 2a and 2b have sufficiently small thicknesses and internal diameters so that, when said capillaries 2a, 2b are arranged contiguously, the lateral widening of the field is limited by the spacing 10
  • 2a, 2b is preferably less than their internal diameter.
  • the capillaries 2b not loaded with samples can be of internal and external diameter or of length different from those of the analysis capillaries 2a.
  • the electric field in the uncharged capillaries 2b may be different from that in the analysis capillaries 2a.
  • FIGS. 6a and 6b illustrates a configuration in which the bar 2 of capillaries 2a is taken between blades 9 made of dielectric materials, said blades 9 extending beyond said capillaries.
  • the distance between the blades 9 is preferably less than or equal to the external diameter of the capillaries. To this end, the blades 9 have a setback at the outlet of the capillaries.
  • the current lines are then more confined.
  • This confinement can be further reinforced by having capillaries 10 only opposite the loaded capillaries 2a. As illustrated in FIG. 8, this configuration makes it possible to channel into the capillaries 10 the field lines of the charged capillaries 2a and of the intermediate capillaries 2b.
  • the proposed devices allow easy filling of the capillaries, the viscous polymer solution can be injected from the outlet container, once the capillaries in place.
  • the samples can be loaded therein by hydraulic pressure, while in laminar flow devices, only electrokinetic injection is possible. Also, the device proposed by the invention allows greater tolerance on the alignments of the capillaries. The manufacturing of the device is simplified.

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Abstract

Dispositifs d'électrophorèse multicapillaires comportant une pluralité de capillaires (2a) juxtaposés, des moyens (4, 5) pour générer à l'intérieur des capillaires (2a) un champ électrique qui assure la migration électrophorétique, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules en sortie du capillaire, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (5, 7) pour générer un autre champ électrique, appelé champ électrique de confinement, qui est réparti de façon uniforme autour desdits capillaires et qui est sensiblement parallèle à ceux-ci, ce champ électrique confinant le champ de migration électrophorétique et imposant aux molécules de se déplacer sensiblement sans divergence dans l'axe desdits capillaires (2a).

Description

PERFECTIONNEMENTS AUX DISPOSITIFS D'ELECTROPHORESE MULTICAPILLAIRES DU TYPE A DETECTION EN SORTIE DES
CAPILLAIRES
La présente invention est relative aux dispositifs d'électrophorèse multicapillaires.
On sait que les techniques classiques d'électrophorèse en gel, dans lesquelles ori injecte différents échantillons sur une pluralité de pistes définies dans un gel compris entre deux plaques, ne sont pas satisfaisantes, étant donné d'une part qu'elles nécessitent un certain nombre d'opérations manuelles et d'autre part qu'elles ne permettent pas des vitesses de migration et donc des débits de traitement très importants.
Or les grands programmes de séquençage et de génotypage nécessitent un débit très élevé de séparation et d'identification des molécules d'ADN.
On connaît par ailleurs des techniques d'électrophorèse utilisant pour la migration un capillaire rempli de gel ou d'une autre matrice de séparation présentant l'avantage d'être particulièrement maniable, facile à charger et de permettre un fonctionnement sensiblement automatique, avec des vitesses de séparation plus élevées que dans l'électrophorèse en plaques de gel grâce à un champ électrique applicable important.
Toutefois, l'utilisation d'un seul capillaire ne permet pas d'atteindre les mêmes débits que ceux que permettent les techniques d'électrophorèse en plaques qui possèdent de nombreuses pistes en parallèle, même si néanmoins les champs électriques qui peuvent être appliqués à un capillaire, et donc les vitesses de migration obtenues, sont plus importants.
C'est pourquoi il a également été proposé des systèmes dits multicapillaires comportant une barrette de plusieurs capillaires juxtaposés. En particulier, il a été proposé des systèmes d'électrophorèse multicapillaires dans lesquels le faisceau laser d'excitation des molécules est envoyé sur celles-ci au travers des parois des capillaires, selon un axe dans le plan de la barrette selon laquelle lesdits capillaires sont répartis. Ledit axe est généralement perpendiculaire à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent, la fluorescence des molécules étant observées par des moyens de réception présentant un axe optique perpendiculaire au plan de la barrette des capillaires.
On pourra par exemple à cet égard se référer à la publication : " A capillary Array Gel Electrophresis System Using Multiple Laser Focusing for DNA Sequencing " - T. Anazawa, S. Ta ahashi, H. Kambara - Anal. Chem. - Vol. 68, N° 15, - 1er Août 1996 - p. 2699-2704.
Toutefois, une telle technique est peu satisfaisante compte tenu du bruit de détection résultant de l'interaction de la lumière d'excitation et de la fluorescence des parois du capillaire. En outre, le faisceau laser perd en intensité au fur et à mesure qu'il traverse les capillaires, de sorte que les molécules qui se trouvent dans les capillaires les plus éloignés de la source laser sont moins excitées que celles qui se déplacent dans les premiers capillaires. Pour résoudre ce problème, il a également été proposé, notamment dans :
"Capillary Array Electrophoresis Using Laser-Excited Confocal Fluorescence Détection"- X. Huang, M. Quesada, R. Mathies - .Anal. Chem. 1992, 64, 967-972, d'utiliser un faisceau d'excitation émis perpendiculairement par rapport au plan de la barrette et de réaliser une détection de la fluorescence par des moyens optiques dont l'axe est confondu avec celui du faisceau, cet axe et le faisceau d'excitation étant déplacés successivement dans le temps de capillaire en capillaire.
Mais cette technique n'est pas non plus satisfaisante étant donné qu'elle nécessite des moyens mécaniques complexes et qu'en outre le déplacement des moyens de détection d'un capillaire à un autre induit beaucoup de temps mort.
On connaît par ailleurs des systèmes multicapillaires dans lesquels les molécules qui traversent les capillaires sont excitées par un rayonnement laser qui est envoyé, juste en sortie de la barrette, dans le plan de ladite barrette et perpendiculairement à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent. La fluorescence des molécules excitées par ce rayonnement est détectée au moyen notamment d'une caméra CCD qui est orientée avec un axe perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires.
Un système de ce type est par exemple présenté dans la publication: " Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis. " - C. Heller - p. 236 à 254 - Editions Vieweg - 1997.
L'excitation des molécules et la détection de la fluorescence en dehors des capillaires assure un niveau de signal sur bruit supérieur à celui accessible dans les schémas de détection classiques, où l'excitation et la détection a lieu directement au travers des parois des capillaires. Toutefois, un tel système oblige à prévoir des moyens empêchant que les molécules en sortie des différents capillaires ne divergent de façon trop importante.
Ceci est généralement réalisé au moyen de flux laminaires de tampon, ce qui nécessite pour la cuvette dans laquelle les capillaires sont reçus une réalisation mécanique de haute précision dans du verre. En particulier, le dispositif devra permettre d'éviter toute bulle de gaz venant perturber le flux.
Comme on l'aura compris, une telle technique présente l'inconvénient majeur d'être très onéreuse. En outre, elle ne permet pas à l'opérateur de manier aisément les capillaires qui demandent une grande précision d'alignement.
Par ailleurs, elle nécessite des volumes importants de solution utilisée pour les flux.
Et on constate dans la pratique que cette technique est difficilement utilisable autrement que par des spécialistes.
Un système de détection en sortie des capillaires sans flux laminaire et qui évite ces inconvénients a été proposé par H. Kambara (brevet US 56 67 656, variantes 7 et 8). Dans ce système la détection a lieu dans l'espace de faible dimension (0.5mm) aménagé entre le capillaire de séparation électrophorétique et un second capillaire lui faisant face et servant au passage du courant électrique. Ledit espace de détection se trouve dans une cavité remplie de tampon et optiquement favorable. Le courant électrique passe dans l'espace de détection entre les deux capillaires de telle sorte que les échantillons migrent du premier capillaire au second. Selon le brevet de H. Kambara, comme l'écart entre les capillaires est réduit, ces molécules devraient faiblement diverger dans la cavité de détection. Or, les calculs d'électrostatique montrent clairement que le champ électrique diverge au contraire latéralement dans l'intervalle entre les capillaires. Et on constate dans la pratique que tout système avec une dispersion latérale résiduelle n'est pas applicable, car il entraîne des pertes de résolution et des contaminations entre voies d'analyse. En outre, des expériences montrent clairement une dispersion latérale des molécules dans l'intervalle entre deux capillaires causant la perte de résolution d'analyse. Comme on l'aura compris, un tel système n'est donc pas performant. En outre, il est délicat d'utilisation car il demande un alignement précis de capillaires face à face faiblement espacés. Un but de l'invention est donc de proposer un dispositif d'électrophorèse multicapillaires dans lequel l'excitation des molécules et la détection de leur fluorescence sont réalisées en sortie des capillaires, qui ne présente pas les inconvénients des systèmes antérieurs et qui est particulièrement fiable, facile d'utilisation, et présente des performances permettant un séquençage et un génotypage à haut débit. A cet effet, l'invention propose un dispositif d'électrophorèse multicapillaires comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, des moyens pour générer à l'intérieur des capillaires un champ électrique qui assure la migration électrophorétique, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules en sortie du capillaire, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour générer un autre champ électrique, appelé champ électrique de confinement, qui est réparti de façon uniforme autour desdits capillaires et qui est sensiblement parallèle à ceux-ci, ce champ électrique confinant le champ de migration électrophorétique et imposant aux molécules de se déplacer sensiblement sans divergence dans l'axe desdits capillaires.
Un tel dispositif est avantageusement complété par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles :
- le dispositif comporte au moins une électrode métallique intermédiaire directement juxtaposée aux capillaires au voisinage de la sortie de ceux-ci, ainsi qu'une électrode métallique qui définit le champ électrophorétique et qui est disposée au droit des sorties des capillaires, parallèlement à l'électrode intermédiaire et perpendiculairement aux capillaires, ces deux électrodes imposant ensemble, au niveau de la sortie des capillaires, un champ électrique de confinement ;
- le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire est à une valeur entre celles des potentiels des électrodes imposant un champ électrique entre les extrémités des capillaires ;
- il comporte une cavité de détection dans laquelle les capillaires sont reçus à leur extrémité, l'électrode intermédiaire étant disposée en dehors de cette cavité ;
- la paroi de ladite cavité qui est en regard de l'électrode intermédiaire présente des orifices assurant le contact électrique entre ladite électrode intermédiaire et l'électrode qui est disposée au droit des sorties des capillaires ;
- les capillaires sont contigus et seul un capillaire sur deux est chargé, le champ électrique en sortie d'un capillaire chargé étant confiné latéralement par le champ électrique de confinement en sortie des capillaires non chargés adjacents ; - la différence de potentiel appliquée aux capillaires chargés est différente de celle appliquée aux capillaires non chargés ;
- les capillaires sont répartis en barrette(s) et dans la direction perpendiculaire au plan de la (ou des) barrette(s), le champ électrique en sortie des capillaires est en outre confiné par la géométrie d'une cavité dans laquelle lesdits capillaires sont reçus ;
- une barrette de capillaires est comprise entre des lames diélectriques qui, en sortie des capillaires, présentent un décrochement et sont espacées d'une distance inférieure ou égale au diamètre externe desdits capillaires ; - il comporte en regard des capillaires une pluralité d'orifices qui sont alignés avec lesdits capillaires et dans lesquels les champs électriques en sortie des capillaires dans lesquels les molécules migrent, sont canalisés ;
- les orifices sont des extrémités d'autres capillaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description qui suit. Cette description est purement illustrative et non limitative. Elle doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 est une représentation schématique en perspective avec arraché d'un dispositif conforme à un mode de réalisation possible de l'invention ;
- la figure 2 est une représentation schématique en vue de dessus du montage de confinement du dispositif de la figure 1 ;
- la figure 3 est une représentation schématique en vue de dessus illustrant les lignes de courant selon lesquelles les molécules sortant du capillaire se déplacent en sortie d'un capillaire ;
- la figure 4 est une représentation schématique d'un autre mode de réalisation possible de l'invention ;
- la figure 5 est une représentation semblable à celle de la figure 3 illustrant un autre mode de réalisation possible de l'invention ;
- les figures 6a et 6b sont des représentations schématiques en vue en coupe axiale et transversale illustrant les moyens utilisés pour réaliser un confinement selon la direction perpendiculaire au plan d'une barrette de capillaires avec un dispositif du type de celui illustré sur la figure 5 ;
- les figures 7 et 8 sont des représentations schématiques semblables à celles des figures 3 et 5 illustrant d'autres modes de réalisation encore possibles pour l'invention. Le dispositif qui est illustré sur les figures let 2 comporte :
- un récipient 1 dans lequel est défini un canal la, - une barrette 2 de capillaires 2a qui s'étend en partie dans le canal dudit récipient 1,
- une cuve 3 dans laquelle ladite barrette de capillaires 2 est reçue à une extrémité et dans laquelle est disposée une cathode métallique 4,
- une anode métallique 5 qui est disposée dans le canal du récipient 1 en aval de l'autre extrémité de la barrette de capillaires 2 et qui s'étend perpendiculairement aux capillaires, au droit de ceux-ci,
- une cavité de détection 6 dans laquelle ladite extrémité de la barrette 2 de capillaires est reçue,
- une électrode 7 intermédiaire qui est disposée dans le canal du récipient 1 en amont de l'extrémité de la barrette 2, au voisinage de cette extrémité et qui est juxtaposée aux capillaires,
- des moyens 8 pour imposer des différences de potentiel données entre la cathode 4 et l'anode 5, ainsi qu'entre l'électrode intermédiaire 7 et l'anode 5.
Le canal la est rempli d'une solution tampon de polymères identique à celle du milieu de séparation électrophorétique dans les capillaires.
Avantageusement, la solution remplissant le canal est une solution visqueuse diminuant la diffusion des molécules et des mouvements de convection.
Avantageusement, la solution remplissant le canal est une solution de polymères qui empêche le flux électroosmotique, par exemple une solution dans du tampon de 5% de Poly(vinylpyrrolidone).
Avantageusement, la solution remplissant le canal est remplie d'un gel ou encore d'une solution de polymères thermosensible qui se gélifie à haute température.
L'électrode intermédiaire 7 est une électrode métallique perpendiculaire aux capillaires de la barrette 2 et parallèle à l'anode 5.
Cette électrode 7 est par exemple un fil métallique placé sur la barrette 2 de capillaires, transversalement par rapport à celle-ci. En variante, l'électrode 7 peut être constituée de deux fils métalliques de ce type, disposés transversalement sur la barrette 2, de part et d'autre de celle-ci. En variante encore, elle peut être constituée par une plaque métallique percée de trous traversés par les capillaires de la barrette 2. Bien entendu, de nombreuses autres réalisations peuvent également convenir.
Les électrodes 5 et 7 baignent dans la solution dont le canal la est rempli. Le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire 7 est à une valeur entre celle du potentiel appliqué à l'anode 5 et celle du potentiel appliqué à la cathode 4, de façon à générer autour de la barrette 2 de capillaires un champ électrique qui est réparti de façon uniforme autour de ladite barrette 2 et qui est sensiblement parallèle auxdits capillaires.
Ainsi, l'électrode intermédiaire 7 permet, avec l'électrode 5, de générer en sortie des capillaires 2a un autre champ électrique qui, au lieu d'être divergent comme c'est généralement le cas, est sensiblement parallèle aux axes des capillaires, comme l'illustre les flèches de la figure 2 qui symbolisent le sens des lignes de courant entre les électrodes 5 et 7. Ce champ électrique est appelé « champ de confinement » car il confine le champ de migration électrophorétique généré entre les électrodes 4 et 5. Avec les répartitions classiquement utilisées pour les capillaires, en l'absence d'un tel champ de confinement, les champs en sortie des capillaires divergent fortement : ils sont équivalents à celui d'une charge ponctuelle radiale. Avec le champ de confinement imposé par l'électrode intermédiaire 7 et l'électrode 5, le mouvement des molécules analysées se poursuit quasiment linéairement au delà des capillaires 2a.
Plus précisément, la valeur du potentiel de l'électrode 7 est préférentiel lement choisie pour que les lignes selon lesquelles les molécules à analyser se déplacent soient, en sortie du capillaire 2a, du type de celles illustrées par les flèches sortant des capillaires sur la figure 3. Avantageusement, la cavité 6 présente une section transversale restreinte qui contribue au confinement du champ dans la direction perpendiculaire à la barrette 2, et limite en outre l'intensité du courant du champ de confinement et par conséquent l'effet Joule qui en résulte. Par exemple, cette cavité 6 est définie par deux plaques entre lesquelles l'extrémité de la barrette de capillaires est reçue. Par ailleurs, l'électrode 7 est préférentiellement disposée en dehors de la cavité 6, de façon à ce que les dégagements gazeux générés par ladite électrode ne perturbent pas la zone de détection.
La paroi de la cavité 6 qui est en regard de cette électrode 7 intermédiaire présente alors avantageusement des orifices assurant le contact entre ladite électrode 7 et l'électrode 5, par l'intermédiaire de la solution électrolyte. Ces orifices sont par exemple des trous d'un diamètre d'un même ordre de grandeur que ceux des capillaires, intercalés entre lesdits capillaires.
A titre d'exemple, les différents éléments constitutifs du dispositif qui vient d'être décrit peuvent présenter les caractéristiques suivantes. Le récipient 1 est en plexiglas® et est d'une hauteur de 1 cm, d'une largeur de 1.5 cm et d'une longueur de 12cm. La cavité de détection 6 est disposée sur le fond du canal la. Elle est de forme rectangulaire et présente une section ajustée à celle de la barrette 2 de capillaires. Elle est constituée de deux plaques en téflon® d'épaisseur égale au diamètre externe des capillaires utilisés (de 360μm), de longueur sensiblement égale à 2cm, posés sur le fond du récipient principal et entre lesquels sont interposés des espaceurs. La largeur de ces espaceurs (environ égale à 0.5cm) est ajustée pour que la profondeur de la cavité corresponde à celle de la rangée de capillaires. Une lamelle de m-icroscope en verre de 2mm d'épaisseur pressée sur les séparateurs sert de couvercle à la cavité 6. Les capillaires 2a sont revêtus de polyimide jusqu'à leurs extrémités.
L'excitation des molécules dans la cavité 6 est réalisée en sortie des capillaires 2a par un faisceau qui est perpendiculaire à l'axe desdits capillaires et qui est soit dans le plan dans lequel lesdits capillaires 2a sont répartis, soit perpendiculaire à ce plan.
Dans le premier cas, la largeur de la barrette 2 de capillaires est limitée par la divergence naturelle du faisceau laser, mais tout le faisceau est exploité pour exciter les molécules dans tous les capillaires.
Dans le deuxième cas, on utilise par exemple un faisceau elliptique dont le grand axe est d'une longueur correspondant à la largeur de la barrette des capillaires 2a. Seule une fraction du faisceau sert effectivement à l'excitation du signal. La détection de la fluorescence peut être réalisée perpendiculairement au plan de la barrette des capillaires.
Les inventeurs ont testé un dispositif de ce type en y faisant migrer en continu de la fluoresceine. Un faisceau laser (à une longueur d'onde de 488 nm et émis avec une puissance de lOmW) éclaté sur une largeur d'environ 1cm était focalisé perpendiculairement à l'axe des capillaires, à une distance réglable des extrémités.
La lumière de fluorescence était collectée par un appareil photographique muni d'un objectif macro et d'un filtre coloré SCHOTT coupant la lumière laser, placé à la verticale de la zone de détection.
Pour cette expérience, les capillaires 2a étaient insérés de 1.5cm à l'intérieur de la cavité de détection 6 ; l'électrode intermédiaire 7 était un simple fil électrique de diamètre 1mm placé à 2cm des extrémités (à l'extérieur de la cavité 6) et simplement pressé contre les capillaires 2a ; l'anode 5 était un fil identique placé en regard des capillaires 2a, en dehors de la cavité de détection 6, à 2cm des extrémités. Les électrodes 4, 5 et 7 étaient en contact électrique au travers de la solution de polymère (Hydroxylpropylcellulose à 0.5% en solution dans du tampon TBE OJX) qui remplit la cavité 6 et les capillaires 2a.
Le montage était mis sous tension par deux alimentations en série : un premier étage, haute tension, entre la cathode 4 à l'entrée des capillaires 2a et l'électrode 5 assurait la différence de potentiel dans les capillaires 2a pour la migration électrophorétique (correspondant à un champ de 35 à 70 N/cm) ; un second étage, à plus faible tension, entre l'électrode intermédiaire 7 et l'anode 5, impose le champ électrique dans la cellule de détection que constitue la cavité 6 (champ de l'ordre de 75 N/cm).
Le potentiel de l'électrode intermédiaire 7 était fixé à la masse. Il a été constaté que les courants issus des capillaires 2a étaient confinés et que les bandes en sortie des capillaires 2a étaient séparées. Ces bandes sont d'autant plus confinées que le champ extérieur est intense. D'autres modes de réalisation que celui qui vient d'être décrit sont bien entendu envisageables.
En particulier, il est en fait possible, dans une géométrie réduite, de confiner les lignes de champ sortant des capillaires sans électrode intermédiaire en chargeant un capillaire sur deux avec des échantillons à analyser. C'est ce qui a été illustré sur la figure 4, sur laquelle les capillaires chargés ont été référencés par 2a, tandis que les capillaires non chargés d'échantillons à analyser ont été référencés par 2b.
A leur extrémité opposée à la cavité de détection 6, les capillaires 2a sont plongés dans une cuve de cathode 3a, tandis que les capillaires 2b sont plongés dans une cuve de cathode 3b.
La cuve de cathode 3a reçoit une électrode 4 qui avec l'anode 5 plongée dans la cavité de détection 6 génère un champ de migration électrophorétique à l'intérieur des capillaires d'analyse 2a.
La cuve de cathode 3b reçoit une électrode 7 qui est à un potentiel intermédiaire entre celui de la cathode 4 et celui de l'anode 5
Sur la figure 4, les deux sources permettant d'appliquer les différences de potentiel entre l'électrode 4 et l'électrode 7 d'une part et l'électrode 7 et l'électrode 5 d'autre part ont été référencées par 8.
Les capillaires 2a et 2b présentent des épaisseurs et des diamètres internes suffisamment faibles pour que, lorsque lesdits capillaires 2a, 2b sont disposés de façon contiguë, l'élargissement latéral du champ soit limité par l'entre- 10
axe entre lesdits capillaires. Les molécules issues d'un capillaire 2a, qui suivent les lignes de champ, sont isolées de celles des autres capillaires 2a par les lignes de champ de confinement en sortie des capillaires 2b adjacents. C'est ce qui a été illustré sur la figure 5. Dans cette configuration, l'épaisseur des parois desdits capillaires
2a, 2b est préférentiellement inférieure à leur diamètre interne.
En variante, les capillaires 2b non chargés d'échantillons peuvent être de diamçtre interne et externe ou de longueur différents de ceux des capillaires d'analyse 2a. Comme on l'aura compris également, le champ électrique dans les capillaires non chargés 2b peut être différent de celui dans les capillaires d'analyse 2a.
Dans la direction perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires, l'élargissement peut être limité par une géométrie étroite de la cavité de détection 6, ajustée au diamètre des capillaires 2a. C'est ce qu'on a illustré sur les figures 6a et 6b, qui illustre une configuration dans laquelle la barrette 2 de capillaires 2a est prise entre des lames 9 en des matériaux diélectriques, lesdites lames 9 se prolongeant au delà desdits capillaires.
La distance entre les lames 9 est préférentiellement inférieure ou égale au diamètre externe des capillaires. A cet effet, les lames 9 présentent un décrochement en sortie des capillaires.
Il peut en outre être prévu que les extrémités des capillaires 2a de séparation électrophorèse font face à une série d'orifices dans lesquels le champs électrique est canalisé, ces orifices pouvant avantageusement être constitués par des capillaires 10 placés dans l'alignement des capillaires 2a (figure 7).
Les lignes de courant sont alors d'avantage confinées. Ce confinement peut encore être renforcé en disposant des capillaires 10 uniquement en regard des capillaires 2a chargés. Comme l'illustre la figure 8, cette configuration permet de canaliser dans les capillaires 10 les lignes de champ des capillaires 2a chargés et des capillaires 2b intermédiaires.
Les dispositifs qui viennent d'être décrits présentent de nombreux avantages par rapport aux dispositifs de détection hors capillaires connus à ce jour, et notamment par rapport aux dispositifs à flux laminaire.
Notamment, ils présentent une haute sensibilité et permettent une grande dynamique de détection.
Ils sont d'une grande facilité d'utilisation. 11
Ils permettent également de faire baigner les capillaires dans des solutions visqueuses de polymère, alors que les techniques à flux capillaire nécessitaient des capillaires remplis de gel et un flux de tampon.
En outre, les dispositifs proposés permettent un remplissage aisé des capillaires, la solution visqueuse de polymère pouvant être injectée à partir du récipient de sortie, une fois les capillaires en place.
Par ailleurs, les échantillons peuvent y être chargés par pression hydraulique,, alors que dans les dispositifs à flux laminaire, seule une injection électrocinétique est possible. Egalement, le dispositif proposé par l'invention permet une tolérance plus importante sur les alignements des capillaires. La fabrication du dispositif est simplifiée.
Enfin, les stiuctures qui viennent d'être décrites présentent l'avantage de pouvoir être utilisées avec des capillaires répartis matriciellement, selon plusieurs barrettes supeiposées.

Claims

12REVENDICATIONS
1. Dispositif d'électrophorèse multicapillaires comportant une pluralité de capillaires (2a) juxtaposés, des moyens (4, 5) pour générer à l'intérieur des capillaires (2a) un champ électrique qui assure la migration électrophorétique, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules en sortie du capillaire, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par .ledit faisceau, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (5, 7) pour générer un autre champ électrique, appelé champ électrique de confinement, qui est réparti de façon uniforme autour desdits capillaires et qui est sensiblement parallèle à ceux-ci, ce champ électrique confinant le champ de migration électrophorétique et imposant aux molécules de se déplacer sensiblement sans divergence dans l'axe desdits capillaires (2a) .
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une électrode métallique intermédiaire (7) directement juxtaposée aux capillaires au voisinage de la sortie de ceux-ci, ainsi qu'une électrode métallique qui définit le champ électrophorétique et qui est disposée au droit des sorties des capillaires, parallèlement à l'électrode intermédiaire et perpendiculairement aux capillaires, ces deux électrodes imposant ensemble, au niveau de la sortie des capillaires, un champ électrique de confinement.
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire est à une valeur entre celles des potentiels des électrodes imposant un champ électrique entre les extrémités des capillaires (2a).
4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une cavité de détection (6) dans laquelle les capillaires sont reçus à leur extrémité, l'électrode intermédiaire étant disposée en dehors de cette cavité.
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la paroi de ladite cavité (6) qui est en regard de l'électrode intermédiaire (7) présente des orifices assurant le contact électrique entre ladite électrode intermédiaire et l'électrode qui est disposée au droit des sorties des capillaires.
6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les capillaires (2a) sont contigus et en ce que seul un capillaire sur deux est chargé, le champ électrique en sortie d'un capillaire chargé étant confiné latéralement par le 13
champ électrique de confinement en sortie des capillaires (2b) non chargés adjacents.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que la différence de potentiel appliquée aux capillaires chargés (2a) est différente de celle appliquée aux capillaires non chargés.
8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les capillaires (2a) sont répartis en barrette(s) et en ce que dans la direction perpendiculaire au plan de la (ou des) barrette(s), le champ électrique en sortie des capillaires (2a) est en outre confiné par la géométrie d'une cavité dans laquelle lesdits capillaires (2a) sont reçus.
9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'une barrette de capillaires est comprise entre des lames diélectriques qui, en sortie des capillaires, présentent un décrochement et sont espacées d'une distance inférieure ou égale au diamètre externe desdits capillaires.
10. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en regard des capillaires (2a) une pluralité d'orifices (10) qui sont alignés avec lesdits capillaires et dans lesquels les champs électriques en sortie des capillaires (2a) dans lesquels les molécules migrent, sont canalisés.
1 1. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que les orifices sont des extrémités d'autres capillaires (10).
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