WO1999031238A1 - Novel protein - Google Patents

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WO1999031238A1
WO1999031238A1 PCT/JP1998/005612 JP9805612W WO9931238A1 WO 1999031238 A1 WO1999031238 A1 WO 1999031238A1 JP 9805612 W JP9805612 W JP 9805612W WO 9931238 A1 WO9931238 A1 WO 9931238A1
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WO
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protein
kdr
dna
cdna
domain
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Application number
PCT/JP1998/005612
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Masabumi Shibuya
Naoyuki Yabana
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
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Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to a protein that induces KDR in the vascular endothelial thread fflSS3 ⁇ 43 ⁇ 4a ⁇ (VEGF) receptor-KDR (kinase insert domain-containing receptor; hereinafter, referred to as KDR).
  • VEGF vascular endothelial thread fflSS3 ⁇ 43 ⁇ 4a ⁇
  • KDR kinase insert domain-containing receptor
  • VPF Vascular permeability fector
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • OVLShibuya Advances in Cancer Research, 161, 281h 995
  • VPF / VEGF is a protein consisting of homodimers and having a molecular weight of about 40,000.
  • VEGF is known to be a high-level, high-sensitivity probe for tube sex [14. N. Ferrara et al .; Biochem.
  • Blocking VEGF can also prevent water and water.
  • Rt-l farnesoiase insert domain-containing receptor
  • mice Homologs of the mouse VEGF receptor KDR in mice are Plk-1 CWMatthews et al .; Proc. Natl. Acad. ScL USA, S8, 9026 991), A-Ullich et al .; W094 11499 Priolity Nov. 13 (1992), BJMillauer 12, 835 (1993)].
  • the fflW domain consists of seven imglobulin domains, and the domain within the thread has a tyrosinki ⁇ " zedomin.
  • a quantity of 180-200-kilodaltons ( ⁇ volume ⁇ ⁇ belongs to the tyrosinkinase family! VEGF specifically binds to nt-1 and KDR / Flk-1 at KD ifi ⁇ 20pM and 75pM, respectively Flt-1 and KDR / Flk-1 ⁇ ⁇ specifically expressed on vascular endothelial cells Natl. Acad. Sd. USA Q, 7533 (1993), RLKendaU et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 2Q, 8915 (1993)].
  • KDR When KDR is expressed in the blood vessels of the porcine artery, it becomes VEGF and proliferates and proliferates in the vein of the porcine artery.
  • lk tube ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J
  • F ⁇ fSt of this tyrosine chitose-type receptor pig is ligated with its ligand; It is thought that the tyrosine is released by re-entering the tyrosine, and this protein is initiated by the receptor self-redirecting TVr through another protein via the SH2 domain. It is thought that ff ⁇ c fSS ⁇ is performed by inducing a dripping.
  • the age of KDR also causes the TVr 3 ⁇ 4S to be subjected to GF ⁇ by VEGF in vascular endosperm [J Waltenberger et al., J. Biol.
  • the SH2 domain is also white, and PLC-, GAP (ras G Pase activating protein), PI3-kinase vphosphatidylinositol 3-kinase), and Nck are affected by the intravascular intravenous play, which has been diluted with VEGF. (D. Guo et al., J. Biol. Chem., 22Q, 6729 (1995)]. However, it has been reported as a domain within the KDR thread. Not done.
  • ⁇ induces ⁇ ff «3 ⁇ 4 of KDR by ⁇ to VEGF receptor KDR, and causes abnormalities such as HffM ⁇ im, fibril formation, and ⁇ ⁇ transportation, diabetes mellitus i4WM, m, dryness, etc. in old rheumatism.
  • abnormalities such as HffM ⁇ im, fibril formation, and ⁇ ⁇ transportation, diabetes mellitus i4WM, m, dryness, etc. in old rheumatism.
  • the inventors of the present invention have been eager to elaborate and, as a result, have isolated the cDNA encoding the protein that induces (7 ⁇ ⁇ ) as the domain within the KDR thread from the ⁇ cDNA library. , The Rooster E ⁇ ij decision and led to the present invention
  • a fflM receptor (VEGF) receptor consisting of one or several amino ⁇ deletions or added amino acids in the amino acid sequence of the protein (a)
  • KDR KDR insert domain-containing receptor
  • amino deletions or additions can be identified by the method of the specialty experiment, which is a preoperative technique, and one or several amino acids can be defined as the specialty modification.
  • the amino acid that can be deleted or added by the method is is ( ⁇ .
  • Proteins consisting of amino acids J with one or several amino acids deleted or added, and having the properties of the KDL domain of KDR, are described in J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), FMFrederick et al; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), MJ.ZoUer and M.Snith; Nucleic Acids Research, IQ , 6487 (1982),
  • the protein of the present invention may be referred to as a KDR resator " ⁇ protein.
  • the second (7) description of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned protein, a DNA having a rooster seed No. 1, 2 and 27 A protein that hybridizes under the stringent cow with DNA having ⁇ Sfi ⁇ j read at the seeding number of 2 and 27, and induces KDR as a domain within the thread of VEGF receptor KDR It is a DNA that is a DNA character.
  • the DNA obtained by using a filter is prepared by using a filter immobilized with plaque-derived DNA, using a filter with immobilized DNA, 0.7 ⁇ ; under L0M Nad, 65 ° C 0.1 X to 2 X SSC (saline-sodium citrate) [1 SSC descendant night (150 mM NaCl, 15 mM que ⁇ "trim); n X is n-density n times
  • SSC saline-sodium citrate
  • the DNA of Tori Ban No. 1, 2 and 27 can be selected from the following: Can include DNA having a homolog of 95% Rii.
  • a third aspect of the present invention is an Itoh vector containing the above DNA layer.
  • the fifth invention of the present invention relates to a method for producing a protein, comprising feeding the above-mentioned S-form in a culture medium, allowing the above-mentioned protein to be added during a period of difficulty, and listening to the protein from the outside. ! T3 ⁇ 43 ⁇ 4
  • the sixth (7) description of the present invention relates to the DNA
  • the oligonucleotide having the sequence-as the oligonucleotide for example, Two and twenty-seven strengths, an oligonucleotide having the same or different as the male or female: Can be
  • a seventh aspect of the present invention is an anti-C that recognizes the above protein.
  • the eighth (7) description of the present invention is the above-mentioned [white matter ⁇ ⁇ extraction method, in which a body is used.
  • the ninth aspect of the present invention relates to the above-mentioned ligoneucle; ⁇ or iiH3 ⁇ 4t body as an extreme component, abnormal blood ⁇
  • the 10th ⁇ i above of the present invention is a disease that is caused by abnormal vascular growth or a disease caused by abnormal ff $ giSt of KDR, using a lignonucleotide or ⁇ a a body ⁇ as a mechanical component. is there.
  • a method for screening the quality of KDR which comprises using the DNA of the eleventh (Mi) of the protein of the present invention.
  • the present invention will be described in detail below.
  • the cDNA of the protein of the present invention can be prepared by a twchhy rid method.
  • Examples of the one-hybrid method include, for example, the following: the one-brid method [S. Fields et al .; Nature, Q245 (1989)].
  • the Teng-to-Brid method is a method for producing a yeast protein in which a DNA domain and a transcription domain are separated, for example, a protein capable of forming a complex with a target protein using GAL4 and tH:
  • a vector capable of expressing a protein with two domains of GAL4, that is, protein X (in the present invention, the KDR domain) is used as a DNA DNA ⁇ domain (GAL domain) and a protein.
  • a vector to be expressed by ⁇ and a protein ′ (the protein S encoded by each cDNA in the cDNA library according to the present invention) and a ffi ⁇ protein (GAL4 S14f human domain)
  • the yeast clones that interact with protein X and protein X to form multiple copies are transcribed.
  • the dangling domain takes on the form of a DNA promoter, which is transcribed, and is expressed as a reporter. Then, using the reporter HI expression as a key, the cDNA ability of the protein that interacts with the domain within the thread; screening the contained form and extracting the plasmid from the transformed form to obtain the desired cDNA Clone itf.
  • a KDR cDNA clone can be obtained from a cDNA library by performing the following steps:
  • RNA from the KDR-expressing DNA or human, for example, human moon is shown.
  • Methods for steaming all EA include the thiosian guanidine-trifluorene g ⁇ t shim method [H. Okayama et al., Methods in En2ymology J, 397], the guanidine dithiocyanate phenol. Clonal form (AGPC) method [P. Chomczynski and N. Sacchi; Analytical Biochemista, J £ 2, 156 (1987)]. Use this total RNA
  • ⁇ mENA can be transferred after using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit [Invitrogen Co., Ltd., Quick Prep mENA Purification Kit [Pharmacia Co., Ltd. Liu].
  • This mENA is converted into cDNA, and a suitable vector is introduced into Sukutadashi to produce a cDNA library.
  • Encouraging cDNA Libraries ⁇ See J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A
  • a phage vector, a plasmid vector or the like can be used as long as it can be used in the MK12 strain.
  • ZAP Express [Stratagene II, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescriptn SK (+) [NucleicAcids Research, 12, 9494 (1989)]
  • Lambda ZAP II (Stratagene Bye, gtlO, gtll [DNA Cloning, APracticalApproach, 1, 49 (1985)]
  • XTViplEx clone-tech crane, XExCeU (Fano! ⁇ Shea recitation, pT7T318U (Fano-shear crane, pcD2
  • Ruko ⁇ a can: Specifically, Escherichia mli XLl-Blue certificate F [Stratagene II, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coH CeOO [R Appleyard; Genetics, 22, 440 (1954)],
  • Sacoharomvffis visiae ability and suitable trait has a marker, for example, TRP1, LEU2, etc., and the promoter U expressed at» is a promoter of the bulcono hydrogenase (ADH) promoter, such as GAL. It is a vector that can express a DNA domain. For insertion of this ⁇ , KDR cDNA, there is an appropriate control site in the portion corresponding to the C-terminal side of the DNA binding domain, and it can also be formed with w ⁇ , -m bacteria such as fflM of vector DNA. ⁇ I 1 or the like; ⁇ traits Ma in ⁇ - is desired arbitrary one with the force scratch.
  • ADH bulcono hydrogenase
  • vectors examples include pGBT9 (Clontech ⁇ ), pASl [T. Durfee et al., Genes & Development,?, 555/993], pAS2-l (Clontech ⁇ ), and the like.
  • the domain fragment in the thread of the KDR cDNA obtained in (1-1) was purified to obtain the DNA binding domain. Insert the protein into the control site at the end so that the protein hood fits.
  • a fragment of the KDR cDNA thin domain can be cut out using an appropriate control such as Asp 8C) 6 (77i at the EamHI site based on i, or a primer from the Rooster IJ that only ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ in the intracellular domain.
  • PCR [MJMcPherson et al .; PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)] to fight “f” (2) ⁇
  • a protein library for inverting D4f human domains and a cDNA library The yeast can be made from yeast Saccha drawing vcfis occidental visiae and has a suitable marker H »5 ⁇ , such as RP1, LEU2, etc., and a promoter expressed in gfS, such as ADH promoter Yanagi, GAL4, etc. It is a vector that can express the ⁇ 14 ⁇ domain. There is a suitable site on the C-terminal side of the ⁇ , inverted ⁇ 3 ⁇ 4ttf domain, and ⁇ ⁇ ⁇ and large ⁇ bacteria, such as; ⁇ , in vector DNA, and fungi such as ampicillin ftH4 » In ⁇ what has the marker power s desired ,.
  • Such vectors include pGAD [CT, Chien et al .; Proc NatLAca ScL USASa SSTS iiggiW, pGAD424 (Clontech tt) and pACT [T. Durfee et al .; Genes & Development, 2, 555 (1993)], pACT2-l ( Black
  • KDR The protein interacting with the Dm domain is considered to be expressed in the same fflSM position as KDR. Therefore, (1-1) and! Transfer cDNA from ⁇ and insert it into the control site at the C-terminus of the! ⁇ Protein fragment conversion domain described above to save the cDNA library. Due to the orientation of the domain and the fume, the # ⁇ represents the age protein between the transgenic domain and the protein encoded by the cDNA. Zhao's library that can be used on shelves, for example, the MATCHMAKER cDNA library (Clontech) can also be used.
  • HIS3 was used as a reporter " ⁇ ", and was used as a reporter for lacZ as a reporter, when it was fed on a minimal medium without His, and lacZ was used as a reporter. Look at all the colonies.
  • the colony contains two kinds of plasmids, KDR ( ⁇ plasmid intracellular domain protein expression plasmid and protein-discovered cDNA plasmid).
  • KDR ⁇ plasmid intracellular domain protein expression plasmid and protein-discovered cDNA plasmid.
  • the method is as follows. Then, the cDNA clone is obtained by ⁇ R of the transformant based on the marker of the protein 3 ⁇ 4 cDNA plasmid, and the plasmid DNA is obtained from the obtained 3 ⁇ fungus [D. Rickwood and BDHames; DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press 995), C.-T. Chien et al .; Proc. Natl. Acad. ScL, S8, 9578 999)]).
  • KDR yarn! Use the DNA domain of the inner domain for expression of the age protein, and in the vector, the domain of the KDR thread MS When both cDNA clones are introduced into the inn, It is possible to bear that the protein encoded by the obtained cDNA specifically binds to the intracellular domain of KDR.
  • the obtained cDNA clone is left as is, and the cDNA portion is cut out with an appropriate IW3 ⁇ 4 and pUCU8 etc. (3 ⁇ 41 After subcloning into a suitable cloning vector, the salt is used for normal SIE ⁇ Zhe method, for example, Sanger Natl Acad. Sd. ⁇ JS. 24, 5463 (1977)] Alternatively, the DNA sequence is determined by using a DNA sequence 1 ⁇ from Perkin Elmer or Fanare Masia.
  • cDNA ⁇ is a new rooster
  • a homology ⁇ program such as WLAST, BLAST, etc.
  • a database such as GenBank, EMBL and DDBJ
  • the obvious homology, which is considered to be [?] In the source, can be obtained by the ⁇ f ⁇ S system.
  • Examples of the cDNA encoding the novel protein serving as an intracellular domain of KDR obtained as in m include a cDNA clone having a rooster 5 or 6.
  • KDR receptor protein DNA DNA encoding the protein that functions as the intracellular domain of KDR.
  • the cDNA of the protein of the present invention obtained in (3), and the mEA plasmid obtained in Northern blotting (4), The ⁇ which is not expected to be obtained can be used to obtain the cDNA of the protein of the present invention by the following method.
  • the novel amino translation of the protein of the present invention can be confirmed by examining amino translation databases such as GenPept, PIR and Swiss-Prot using a homology search program such as FASTA or Framesearch.
  • a homology search program such as FASTA or Framesearch.
  • a cDNA clone having a suitable roto-ban ffi «EffiE ⁇ from rooster seed Nos. 1, 2 and 27 can be mentioned.
  • the cDNA of the present invention is considered to be a protein, and the cDNA is substituted in the same manner as in (1-1), and adapters are added to both ends of the cDNA. Salts of the cDNA clones obtained in (3) PCR Perform PCR with primers in the row P. 5'-RACE and 3'-RACE
  • a primer based on fflE ⁇ of the cDNA was used to express the protein of the present invention.
  • ⁇ is considered to be the same as (1-1) and the cDNA converted to [ ⁇ ] is to be subjected to PCR [MJMcPherson et al .; PCR ⁇ ApracticalApproac Oxford University Press (1991)] as a cDNA library.
  • PCR MJMcPherson et al .; PCR ⁇ ApracticalApproac Oxford University Press (1991)] as a cDNA library.
  • DNA encoding the target protein of the present invention can be linked.
  • the DNA encoding the target protein of the present invention can be obtained by chemically synthesizing the DNA with DNA.
  • a DNA strand is used to synthesize an oligonucleotide such as an oligonucleotide and a sense oligonucleotide having a part of the rooster IJ of the DNA of the present invention using a DNA fiber.
  • an oligonucleotide such as an oligonucleotide and a sense oligonucleotide having a part of the rooster IJ of the DNA of the present invention using a DNA fiber.
  • oligonucleotide examples include a DNA having the same rooster as that of the fibrous 10 to 50 in the DNA contained in the DNA or a DNA having a rooster with the DNA. No. 1, 2 and 27
  • the rooster selected by the ⁇ ⁇ 1 1 if fi fi fi fi DNA 1 ⁇ ⁇ ⁇ DNA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ DNA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA
  • the oligonucleotide is also an oligonucleotide of the present invention.
  • oligonucleotides can also be mentioned as the oligonucleotide of the present invention.
  • Words ⁇ Conductive DNA Derivatives in which diesteno phosphate in DNA is converted to phosphoric acid carbonate ⁇ DNA, Diesteno phosphate in DNA is converted to N 3 '-P 5' phosphoamidate Derivative DNA, Derivative DNA in which ribose and riiesteno in DNA are converted to peptides, Derivative DNA in which peracyl in DNA is fiberized with C-5 propynyl peracyl, Peracyl in DNA is C_5 thiazolyl peracyl Fiber-derivative DNA, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with C-5 propynylcytosine, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with phenoxazine-modified cytosine, ribose in DNA is 2 '— O-propylribose-derived DNA, or 2'-me
  • Any lodging can be used as long as it can express the target ⁇ ⁇ , such as m.
  • an expression vector that can be used in the above-mentioned inns, or that can be used in the body, and that has a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
  • ⁇ is a protein expression vector according to the present invention.
  • Source is capable of self-organization in a nucleus, as well as a promoter and a ribosome; i ⁇ fE a DNA of the present invention; It is preferable that the vector is composed of wm & xiao ⁇ vector:
  • the promoter is ⁇ ⁇ - ⁇ .
  • expression vectors include ⁇ 233-2 (Pharmacia ft), pSE280 (Invitrogen ⁇ , pGEMEX-l [Promega tt], pQE-8 (QIAGEN) tt, pKYPIO
  • the promoter may be any promoter that can be expressed in a host such as a fungus.
  • a promoter one P ⁇ rp
  • lac_ promoter P L promoter one
  • P R promoter one coater P S E promoter, such as T7 promoter
  • promoter one terpolymer derived from ⁇ Ya fur ⁇ , SPO l promoter , SP02 promoter pen P promoter and the like.
  • artificially modified promoters such as a promoter (P ⁇ rp XS), a tail promoter, a lacT7 promoter, an let promoter, and the like, which are obtained by combining two promoters, can also be used.
  • the ribosome, ⁇ g ij may be any as long as it can be expressed in the spores of the fungus, etc., but it is necessary to divide the Shine-Dalgarno rooster E ⁇ J and the initiation codon.
  • a suitable ⁇ for example, 6 to 18 fibers of plasmid; preferred).
  • transcription is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, and transcription sia is distributed to sr of « ⁇ 3 ⁇ 4. Les ,.
  • the original organisms include those belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevipacterium, Pseudomonas, and Batinoles, such as Escherichia mliXLl-Blu Escherichia coli XL2-B1UR. Escherichia coli DHL Escherichia MC Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Esdierichia coli JM109, Escherichia coli HBim. Escherichia ooli No.49. Escherichia coli W3110. Escherichia coli NY49, Bacillus sbilis.
  • ATCC13870 Micmhac ⁇ rium ammoniaphilum ATCC1 and the like can be mentioned.
  • DNA can be introduced into the above-mentioned host cells: Method using calcium ion [S. Cohen et al .; Proc. Natl. Acad ScL US ⁇ £ 2, 2110 (1972)], arotoplast method (63-2483942), electrotrophic method, or Gene, II, 107 (1982 and Molecular & General Genetics, J £ S, Ulhi 979 ) And the like.
  • the promoter may be any one that can be expressed in a bacterial strain, or may be one that is out of alignment.
  • a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, a gal promoter, or a gal promoter may be used.
  • promoters such as heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, and CUP1 promoter.
  • S ⁇ S strains include Saocharomyces cerevisae. Schizasaccharomyces pomhe,
  • Klyveromyces lactis Trichosporon ullulans. Sdiwanniomyces aUuvius. I can do it.
  • the method As a method for introducing a delicate vector, if the method is to introduce DNA into the accessory, it can be used to adjust the displacement.
  • the electroporation I ⁇ method (DJVl. Beckerand L. Guarente; Methods. Enzymol. , 124, 182 (1990)]
  • the spheroplast method [D. Shortle et al., Proc. NatLAcai ScL USA SI. 4889 (1984)]
  • the lithium method H. Ito et al., Journal of Bacteriology 153, 163 (1983)]. Natl. Acad. Sci. US 15, 1929 (1978).
  • a spore as a host, as an expression vector, for example, pAGE107 [JP-A-3-22979; H. Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 (Paragraph 2- 227075), pCDM8 [B. Seed; Nature, 229, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogenenne, pREP4 (Invitrogen ⁇ , pAGE103 [T Mizukami et al .; Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987) )] And so on.
  • any of the promoters that can be expressed in ft «shelves can be used.
  • the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE immediate early
  • ⁇ ⁇ the promoter of the cytomegalovirus
  • the SV40 promoter One example is a metallotionin motor, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, an SR promoter, and the like.
  • the vesicles are human ⁇ , Luba (Namalwa), and monkey thread MS, COS. «, CHO thread of Chinese hamster! ⁇ , HBT5637 (Showa 63-299).
  • a method for introducing DNA into Soitoshima can be used.
  • the 7-rhd method (Parahei 2-227075), the lipofection method [P.LFelgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4, 7413h 987)]
  • ⁇ includes, for example, DR O'Reilly et al .; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987- 1997), VALuckow and
  • Proteins can be expressed by the method described in M.D. Summers; Bio Ibchnology S, 47 (1988).
  • transfection vector used in the method for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacHI (in vitro gene) and the like can be mentioned.
  • Autographa californica nuclear polyhedrosis virus which is an insect virus, such as Autographa californica nuclei polyhedrosis virus, can be used.
  • the protein of the present invention can be obtained by culturing the mia body obtained in the manner described in m: above in a culture medium, accumulating the protein of the invention in the culture medium, and recovering the medium.
  • the method of culturing the present invention in a culture medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a form obtained by using a prokaryote such as ⁇ iigfW, which is a difficult organism, as a host is a culture medium that contains charcoal, «3 ⁇ 4,» ⁇ , etc. It is a medium that can be used for any purpose.
  • the charcoal 3 ⁇ 43 ⁇ 4f may be any as long as the substance can be assimilated, such as gnorecose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch ⁇ ] ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Wt ⁇ ), ⁇ , propio: / ⁇ , Ethanol, propanono anorecono, etc. can be used.
  • ⁇ such as ammonia, ammonium chloride, ammonium, ammonium, l> m ammonium, etc. or ammonia, soya (7 ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ), along with peptone, meat extract, alongside extract, Corn steep liquor, casey ⁇ 3 ⁇ 41 ⁇ advice, lees and soybeans ⁇ ⁇ sou, each cell, and other types of bacteria can be used.
  • Examples thereof include lithium potassium, potassium dipotassium, potassium bamboosium, » ⁇ gnesium, sodium chloride, sulfuric acid ⁇ , manganese sulfate, W, calcium carbonate, and the like.
  • Culture is carried out under normal ⁇ ⁇ culture or under 3 ⁇ 4 »3 ⁇ 4 ⁇ # ⁇ * ⁇ .
  • the cultivation is preferably 15-40 ° C, and the cultivation 0 ⁇ is usually 16-96 B # ⁇ .
  • During fermentation pH should be 3.0 ⁇ 9.0.
  • the reaction is carried out using acid or alkaline, urea, calcium, ammonia, etc.
  • a substance such as ampicillin tracycline may be added to the culture medium during culture.
  • the indu When culturing the transformant using an inducible ferromotor or an expression vector, the indu may be added to the culture medium as necessary: for example, ia ⁇ ⁇ When culturing a product formed using an expression vector using a promoter, cultivate a product prepared using an expression vector using a promoter such as isobromopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside. In this case, the medium may be indolacrino.
  • the culture medium for culturing the mi ⁇ body obtained using the spores as a host is reduced to "" ⁇ .
  • RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, I22, 519 (1967)], Ea ⁇ e MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, S, 396 (1959)], 199 Culture medium [Prooeeding of the Society for Biological Medicine, 23, 1950]] or a medium in which bovine wombs are stimulated can be used for these mediums.
  • Culture is usually at pH 6-8, 30-40. C, 5% C0 2 ⁇ such as ⁇ (under cow:! Intends to 7 days.
  • a medium such as lysine or syrin may be added to the medium during the culture.
  • a TNM-FH medium called “Pharmingen”, a so-called Sf-900II SFM medium (Life Technology 3 ⁇ 4f3 ⁇ 4) And ExCell400, ExCeU405 [both JRH Bay: “Yen ⁇ ” (JRH Biosciences)) B, Grace's Insect Medium [Nature, 125, 788 (1962)] and the like can be used.
  • a substance such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • the protein of the present invention in order for the protein of the present invention to be expressed in a transgenic form in a filament, after completion of the culture, as was recovered from a distance and the aqueous system JS-screened, sonication, French press, Menton gaurine homogenase ⁇ ⁇ ", Thread 3 ⁇ 4 is crushed by Dynomino to obtain a thread-free liquid. Salting out method using ammonium sulfate, etc., 3 ⁇ 4 ⁇ method using a shelf, acetylethyl (DEAE)-Sepharose, DIAIONHPA-75 ( ⁇ it ⁇ ) using resin, etc.!
  • ⁇ T-on chromatographic method S -Sepharose FF ( ⁇ T-on chromatographic method using a resin such as Fano ⁇ Chine, ⁇ ⁇ -chromatographic method using a resin such as Butinole Faros and Phenylsepharose, a gel using a sieve Filtration method, affinity mouth chromatography One method, chromatography Focusing method, etc.
  • ⁇ Swim in the swimming island Kr & ⁇ can be used to obtain insects.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ which was expressed as a result of expression of the protein in Itoshima, was obtained by recovering the protein by a conventional method from the amount obtained by crushing and recovering the ⁇ and performing distant ⁇ The body of the protein is soluble in the protein.
  • the word ⁇ ! Melts into a sickle that does not contain protein difficulties or ugliness or that does not change the protein, but the protein does not change, or the protein is composed into a normal standing iW After this, ⁇ 12 and! I ⁇ t® to remove more! Goods can be obtained.
  • the protein in the culture supernatant can recover the derivative of the protein with a weight of 0%.
  • an article can be obtained by using the above and [ ⁇ ] from the word 141 minutes. .
  • the protein of the present invention can also be obtained by the Fmoc method (fluoreninolemethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarboninole method), etc. Also, Advanced ChemTfech, Nokinkin Eno! ⁇ 1, Fanocia, Protein Technology Instrument (Synthecell-Vega), and Protein Tfechnology Instrument. The company, PerSeptive, can also combine and combine peptides from the island's abdominal crop ff ⁇ .
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. 3 ⁇ 7 days after each administration, it is better to recommend it from ⁇ » ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 1 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1976 ⁇ E. Harlow and D. Lane: Antibodies-A W 99/31
  • the serum used in rabbits, goats, mice, rats, or hamsters showed sufficient antibody titers against the serum used for destruction.
  • Purification can be carried out using a conventional method of chromatography using ammonium salt, cabril removal, DEAE-Sepharose column, protein column or gel filtration column.
  • a mouse or rat As a medullary movement, a mouse or rat is used.
  • 8-azaguanine ⁇ us derived from BALB / c
  • 3 ⁇ 4S B »P3-X63Ag8-Ul hereinafter abbreviated as P 3—U 1 [Curr.TbpicsMiciObiol.Immunol., Ai, 1 (1978)], [Europ. J. Immunol., 511 976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 226, 269 978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J.
  • Nopridoma strain that contains a monoclonal antibody which is a protein of the present invention.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention which was obtained in (2-3), was conjugated to a monoclonal antibody.
  • Tesshi the spoon was Mausuka Agata, 3, 0 0 0 r P a solid content of 5 minutes to at m [ ⁇ to.
  • the obtained supernatant is subjected to salting out by 40 ⁇ 50% « ⁇ Chromatography using DAE-Sepharose column, Protein A-column, or column chromatography using Cell mouth Fine GSL2000 (Biochemical Chemistry Earth). I do.
  • the subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein content is calculated by the absorbance at 280 nm.
  • the DNA of the present invention can be obtained by performing Northern blot hybridization on RNA extracted as [1 ⁇ (1-1) and ( ⁇ ) from human-derived yarn using this as a probe.
  • the level of detection of the mEA of the protein of the present invention can be determined; frT can be determined. Can be.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a specific primer of the DNA of the present invention to reduce RNA extracted from human ([1] (1-1) and I ⁇ from human).
  • the mRNA of the present invention can also be detected by RT-PCR using the same DNA as that of the present invention; By using this as a probe and performing in situ hybridization on human fragments, it is possible to know a finer distribution of the oligonucleotide of the present invention, such as identification of the protein of the present invention. Can be.
  • the oligonucleotide (RAZDNA) of the present invention can be used by tranferring the transcription or mRNA of the protein of the present invention (Murakami; Chemistry, 46, 681 991), PS Universal, Bio Ifechnology. , 2, 358 (1992)], which is thought to be a potential source of VEGF-KDR ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ij ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It is possible to treat diseases that progress due to abnormal blood such as fresh blood.
  • the protein of the present invention can be obtained by using the DNA of the present invention and [2] the method of freezing.
  • screening for inhibiting the binding of the KDR intradomain to the protein of the present invention can be performed.
  • [1] use the cDNA of the KDR cell domain obtained in (1-1), and [2] use the method of language to select the domain protein in the ffl ⁇ of the KDR thread and use the protein of the present invention.
  • KDR Itoshima domain proteins in vitro After that, polyacrylamide gel electrophoresis is performed to detect a rise in the amount.
  • a cDNA clone of the obtained protein of the present invention inverted domain
  • a protein of the present invention ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ protein poor expression plasmid
  • the amount of 3 ⁇ 4 ⁇ can be aged by adding it, and it is possible to screen for destruction, and such destruction is considered to include fff ⁇ Sl of VEGF-KDR system. Therefore, it can be used to treat diseases that progress due to solid culture, inflammation in masticatory rheumatism, diabetes mellitus msm, ⁇ m, and dry abnormal blood.
  • an antibody against the protein of the present invention can be obtained by the method of [3] language.
  • the protein of the present invention can be detected by using an antibody against the protein of the present invention.
  • an antibody that inhibits the age of the protein of the present invention and KDR an antibody that inhibits the interaction between the protein of the present invention and the protein of the present invention, WTOfTOi ⁇ . It is thought that VEGF-KDR system is inhibited, so administration of such an antibody will result in solid phase ® ⁇ c occupation, »formation, littMfi rheumatism ( ⁇ ⁇ ⁇ if ⁇ , diabetes t4 S ⁇ S, ⁇ dry). Abnormal blood, etc. ⁇ It is possible to cure illness that progresses due to raw disease.
  • Figure 1 shows the KDR cDNA clone pBluescriptn KDR, KDR thread Domain 1 in MS?
  • the plasmid pAS-KDR for the no-brid method and the plasmid pAS-KDR and the cDNA library used for the two / brid method were used.
  • FIG. 2 shows the results of a northern blot for the distribution of the expression of the KDR receptor H ⁇ protein DNA1 in humans.
  • FIG. 3 shows the results of a Northern blot for investigating the distribution of KDR receptor protein DNA2 in humans.
  • FIG. 4 is a diagram showing the deletion of the K868M mutant KDR cDNA plasmid pBluescriptH KDR M-2.
  • FIG. 5 shows the result of a tuno-brid using plasmid clone # 37 and; KDR (pAS-KDR) or T ⁇ r mutant KDR.
  • Fig. 6 shows the use of plasmid clone # 2 and wild-type MKDR (pAS-KDR) or T ⁇ r mutant KDR. .
  • the fragment to be amplified in (A) is 810 bp, and since the BamHI site is located near the 5 'end and the site is located at the 3' end in the SIJ of this fragment, the DNA is cut with gi ⁇ EamHI and The DNA fragment of about 740 bp is used, and the fragment that flank in (B) is 1059 bp, and the primer is 7 ⁇ 5fe) haI site in 33 ⁇ 43 ⁇ 4.
  • ⁇ cytoca ⁇ ⁇ ⁇ near the 5 'end works in IW ⁇ Aial and hal, and a fragment of about 990bp is recovered.
  • the plasmid obtained by subcloning the KDR cDNA fragment of pBluescript ⁇ SK into pBluescript ⁇ SK was cut with BamHI and Xhal, and ligation was performed with the amHI- ⁇ al fragment of (A) and the ⁇ al-Xhal fragment of (B).
  • Primer Represents the entry made by KDR-2.
  • GAL4BD DNA ⁇ domain of GAL4
  • GAL4AD »GAL4 remains ⁇
  • KDRC KDR cDNA thread domain fragment
  • the JME ⁇ J of the obtained KDR cDNA was determined by the 'oxy method, and was determined as follows: »[BITbrman et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1S2, 1579 (1992)] (1)
  • the unknown two amino acids at the N-terminus are Mel ⁇ ATG) and Gln 2 (CAG), and the 272 bp 5 '"amino acid.
  • Val 297 (QTA) ⁇ He (ATA), Thr 7 '72 (ACG) - Ala (QCG), Gly 787 (QGG) - ⁇ Arg (CGG), Asn 835 (AAQ ⁇ I ⁇ s (AAG), Glu 848 (GAG) ⁇ Val (GTG), Thr 134 (ACG)- ⁇ SerCTCG) [S. Sawano et al .; Cell Growth & DiffercntiationJ, 213 (1996)].
  • this mutation creates one Aii l site in the fragment of the (B) increase
  • the plasmid pUC-KDRC is transformed into the Affi-primer KDR-2 (salt sequence P No. 15 ⁇ ⁇ )) K K K K K K K K K K K K K K K K K K ⁇ K ⁇ Pro Pro ⁇ 15 15 15 ⁇ ⁇ ⁇ 15 Immediately after the BamHI site ⁇ ; ⁇ Introduce one SC; cut this modified pUC-KDRC with W ⁇ EamHI and Sail; cut about 1.7 kb of the KDR cDNA fragment; cut this EamHI-Sall fragment mouth Nte Tsuno ⁇ hybrid 3 ⁇ 4 of Kkusha ⁇ 7 was subcloned between EamHI / Sall site of Kuta ⁇ pAS2-l, a plasmid pAS2-KDR and I Lou P AS2-KDR ⁇ !
  • Fig. 1 Screening method is performed according to the manual of Clonetech, which is sized for the library.
  • pAS2-KDR Sa chammvops oprpvisiae strain CG1945 (Introduced into Clonetech using the ⁇ lithium method: GAL4 binds to chromosome in CG1945 strain Downstream of EJIJ, it has histidine HIS3 and / 3 galactosidase lacZ as reporter Hfi ⁇ ", and is a strain requiring tributophan, leucine, and histidine.
  • Plasmid PAS2-KDR and KDR yarn E ⁇ The Sl form that expresses each protein of the cDNA clone of the protein that corresponds to the domain is GAL4 DNA ⁇ domain and GAL4 transgenic by the binding protein that encodes the KDR thread domain and cDNA.
  • the I4f-Dori domain is transcribed, so the HIS3 and lacZ transcripts downstream of the GAL4 DNA domain are transcribed, resulting in histidine tropism and / 3-galactosidase 3 ⁇ 43 ⁇ 41 «.
  • the ⁇ S ⁇ body was cultured in a minimal medium containing leucine and became leucine ⁇ ⁇
  • 3 ⁇ 4 ⁇ cDNA plasmid is recovered from the body, and the protein encoded by the cDNA in the recovered plasmid is DR
  • Clones # 37 and clones were identified as the clones:
  • Clones 37 forces; including cDNA salt »Row C
  • Plasmid clone # 37 which is the clone identified in (2) above, is cut with EffiRI and Egin, and a 1.9 kb fragment of cDNA 3 ⁇ 4r ⁇ * is cut into a fiber, subcloned between the HincIlZEamHI sites of the vector "pUC118" and nested deletion.
  • JME ⁇ J is the rooster No.5 ⁇ .
  • ⁇ 3 ⁇ 4H ⁇ is 1985 bp, which corresponds to the 283rd and later of the salt ij of the E ⁇ E1.
  • the homology of this ⁇ to the GenBank database was determined by BLAST search. As a result, no ⁇ 7 ⁇ MH ⁇ rooster U was found.
  • the cDNA containing clone # 37 is considered to be a novel cDNA that is known as a KDR receptor, and is named KDR receptor Hi ⁇ protein DNA1.
  • Plasmid clone # 2 which has been cloned in (2) (> ⁇ ), is cut with ECQRI and Xhol, and the cDNA 3 ⁇ 4rtj # 3 ⁇ 4 1.6 kb fragment is excised, and after ossification of * ⁇ , the vector “pUC118 Subcloning into the Hindi site of pDNA2-RX1 and pUK2-RXl, based on the nested deletion method, based on the series of cDNA deletions, and the plasmid before deletion.
  • the sequence Sl ⁇ was performed using a sequence kit from one company, DNA Inc., and DNA sequence 1 ⁇ ⁇ ABI310. ⁇ ] make a decision ⁇
  • Rooster No. 6 i The obtained; ⁇ ⁇ is 1610 bp, which corresponds to the 27th and following characters of Rooster No.1. This:
  • Homologous search was performed by BLAST search using GenBank.
  • the cDNA containing Clone # 2 is also considered to be a novel cDNA involved in the identification of KDR receptor 1 and this is named KDR receptor "protein DNA2".
  • CMSS Example 2 KDR receptor protein DNA release, cloth
  • KDR receptor protein DNA1 current distribution
  • the release of the KDR receptor protein DNA1 in humans was compared to the Multiple Tissue Northern Blot (Clontech tt), a mENA blot of human fibers ('brain, lunar disjunction, lunar, skeletal muscle, M).
  • a Northern blot By performing a Northern blot
  • the mENA of the KDR receptor “protein DNA1” has two views of 2.7 kb and 2.0 kb, and that the mRNA is not sewn; (It is considered that ⁇ 16
  • Human ⁇ ( ⁇ ⁇ (KDR receptor protein DNA2 is distributed to human fibers (I: mold, brain, lung, moon, skeletal muscle, haze); II. M thymus, anterior, testis, speaking, small intestine, colon , White rt) mRNA blots using Multiple Tissue Northern Blot I and II (Clonetech II).
  • mENA of KDR resorbu ⁇ ⁇ protein DNA2 is found to have two views, 3 kb and 6 kb. In the small intestine and colon, the crumbs were crushed, while the mRNA of 6 kb was found in the thymus, testis, and leukemia of the thymus.
  • a 2.2 kb target ECQRI fragment was a vector "" ECQR of pUCU9 [Subcloned into the site and obtained plasmid pUK137-Rl and pOKl37-Rl by EmRt and ⁇ 7: ®f ⁇ Fight U3 ⁇ 453 ⁇ 40.61 * wr and subcloning between pucii9 * ⁇ ⁇ Do ⁇
  • Escherichi cdiDH5ii which is a bacterium containing PUK137-R1) UKl37-Rl November 1997
  • the KDR receptor "" ⁇ protein DNA1 is linked to # 3 ⁇ 41 ⁇ 2, so KDR C 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 j j j ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the KDR receptor obtained in Step 1 is the cDNA of protein DNA2. Since the mENA was 0 ft, which became evident in Step 2, it does not encode cDNA i ⁇ length. Since it has Hft ⁇ ', the cDNA rfeftiD clone Make it! ⁇
  • a clone containing the longest cDNA of about 3.0 kb was selected from the positive clones obtained from Bracno and Ibridice. This clone was subjected to ECQRI, subcloned into the ECQEI site of the vector pUC119 ( ⁇ ⁇ -), and the plasmid pUK102-Rl was subcloned with the cDNA (I ECQR [fragment 3.0 kb]. The 3kb 1111 ⁇ (13 ⁇ 4 was considered to be the full-length cDNA clone corresponding to the above.
  • the KDR receptor protein DNA2 of pUK102-Rl was subjected to 5 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and the # 2 KDR receptor pig obtained in 3 ⁇ 4 ⁇ 1 was obtained.
  • ⁇ Synthetic protein DNA2 cDNA CD3 ⁇ 43 ⁇ 4S ⁇ J is 5bp 27 bp longer than 5 ⁇ »J KDR receptor of P UK102-R1"
  • Protein DNA2 cDNA is about 1.4kb longer than # 2 cDNA, but 5 ' It is considered to be a clone, not 3 ' ⁇ , but it is considered to be a clone.
  • the novelty of this amino translation is achieved by performing homology t ⁇ on the amino translation database Genpept :, PIR, Swiss-Prot, PRF, and PDB by Blast search.
  • a human leukocyte cDNA library (Clontech; vector, gtlO) was screened for a DNA2 clone from the human isolated cDNA library. Screening was performed in the same manner as the ning.
  • the human leukocyte cDNA library was again screened with plaqueno and hybridization, and the obtained clone: 1.8 kb from the eve clone cDNA ⁇ tf clone This clone was subjected to ECQRI and corresponds to cDNA.
  • Lys 868 which neutralizes the kinase activity of KDR, has difficulty in Met (hereinafter referred to as the K868M mutation).
  • ⁇ was introduced into the DRcDNA clone used in Zongyin 1 to encode KDR.
  • A Primer K14N «1 Ban No. 16) and Primer KMR-2 ® ⁇ No. 17
  • B Primer KMN-2 (Tori ⁇ I Ban No. 18) and Primer K3R 3 ⁇ 4 1 PCR No. 19) Perform PCR with two sets of primers ⁇ :
  • KNR-2 and KMN-2 are mutually exclusive primers with K868M variation 3 ⁇ 4K ⁇ . ⁇ IX the two combined DNA fragments and mix them.3 ⁇ 4 Next, use primers 2 and 5 used in Example 1 for PCR! The 0.8 kb cDNA fragment encoding KDR was used (Fig. 4).
  • the fragment is restricted with gg ⁇ EamHI and: Ikil
  • EamHI-fragment K868M mutation 3 ⁇ 4 ⁇ ,
  • an approximately 5.2 kb oil-EamHI fragment obtained by ligating pBluescriptll KDR with EamHI and 1, and pBluescriptn KDR was digested with: Ikgl and oil About 1.5 kb: Ikj fctl fragment with ligation ® ⁇ , ⁇ 868 ⁇ mutant KDR cDNA ⁇ l ⁇ t plasmid pBluescriptn KDR M-2
  • the language is 2% glucose and 5mM 3-aminotriazole ⁇ ⁇ , leucine, histidine, tryptophan 3 ⁇ 4 ⁇ manale, combined / ⁇ 3 ⁇ 4 Lb, 30 days at 30 C C, histidine dwarfism
  • Figure 5 shows the results of using plasmid claw # 37.
  • KDR and KDR receptor pig H ⁇ protein DNA1 and KDR receptor protein DNA2 have Lys 868 , which means that tyrosine chitase activity of KDR is necessary.
  • KDR receptor "KDR site which is ⁇ protein"
  • KDR resator " ⁇ In order to examine the power of a protein to KDR, we used a mutant of KDR and carried out the yeast two-hybrid method: A modified version of rnm l (l) with one base inserted immediately below the EamHI site! pUC-KDRC (7 "Main strand 3 ⁇ 4 ⁇ Using male primer 1 (1) and ⁇ The Tr on the C «side of the kinase domain of KDR was replaced with Phe by mutation introduction. The primer used was YF12 [Tyr (1136 YF13 [Tyi 1175)-Phe], YF14 with iffi IJ of Toriban No.
  • the warrior TVr mutant 7 was combined with the mutation ⁇ :, as multiple mutants of T r were mutated, YF12 + 14 [Tyr (1136, 1214) ⁇ Phe], YF12 + 13 + 14 [1 ⁇ 1136, 1175, 1214) ⁇ Phe], YF14 + 15 [1Vr (1214, 1223) ⁇ Phe], YF14 + 16 [1 ⁇ (1214, 1305) ⁇ Phe], YF1G -17 [ TVr (1305, 1309) ⁇ Phe] and YF12 + 14 + 16 [1Vr (1136, 1214, 1305) ⁇ Phe]: ⁇ The introduction of each mutation
  • the Hi Tr mutant KDR plasmid thus obtained was digested with EamHI and Sail, inserted between EamHlZSaJI of PAS2-1, and a plasmid in which Tr-transformed KDR was inserted into these pAS2-l. Introduced into strain HCG1945, cultured in Leu, His, rp 3 ⁇ 4r ⁇ Mana ⁇ ⁇ with 2% glucose and 80 mM 3-aminotriazole for 4 days at 30 ° C for 4 days, Check whether or not His
  • the iyr mutant plasmid of Arthropod magna 7 views in the TO ⁇ KI ⁇ body, KDR TVr (1305) was changed to Phe (YF16) On the other hand, a decrease in growth in a medium containing His was observed. On the other hand, the TVr mutation ⁇ ⁇ ⁇ 'in the other 6 views was a completely unrecognized force under the union ⁇ A mutant in which multiple Tyrs were transferred to Phe Nyaray, even a mutant of TVr (1305)
  • the abnormal blood t ⁇ f such as »flame, m, ⁇ m.

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Abstract

Attempts have been made to clarify a substance which induces, via binding to vascular endothelial cell growth factor (VEGF) receptor KDR, the signal transduction of KDR and thus causes abnormal neovascularizations such as proliferation of solid tumor, metastasis formation, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity and psoriasis. Specifically a protein capable of binding to the intracellular domain of VEGF receptor KDR to thereby induce the signal transduction of KDR; a DNA encoding this protein; a recombinant DNA obtained by integrating the DNA into a vector; a transformant carrying this recombinant DNA; a process for producing the above protein with the use of the transformant; and an antibody recognizing the protein. The use of the KDR receptor protein DNA as described above makes it possible to clarify the VEGF receptor KDR signal transduction mechanism, and to treat diseases showing the progression of the symptoms due to abnormal neovascularizations such as proliferation of solid tumor, metastasis formation, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity and psoriasis.

Description

明 細 書  Specification
新 «白質 謹  New
本発明は、 血管内皮糸 fflSS¾¾a÷(VEGF)リセプタ一 KDR (kinase insert domain-containing receptor；以下、 KDRと略 内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白質 に I る。  The present invention relates to a protein that induces KDR in the vascular endothelial thread fflSS¾¾a ÷ (VEGF) receptor-KDR (kinase insert domain-containing receptor; hereinafter, referred to as KDR).
血 «生は、 ^« ^の胎 ^期における循^ ¾系 成^^く の に βな^ jを 果たすとともに、 成棚体 (M) においても'觀期 ける黄体形成、 子宮内 ^性 殖、 月應成等に鎌に関与する。 さらに、 ^態としては、 固开 増殖、 率 形成、 m . 'ι蕭 リュウマチ 態形 鍵に血簡^ く関与しているBlood plays the role of β ^ j in the circulatory system during the fetal period of ^ «^, and also luteinization observed in the adult shelf (M), uterine ^ sex Involves sickles in breeding and moon formation. In addition, it is easily involved in solid growth, rate formation, and m. 'Ι Xiao rheumatism.
〔J.Folkmanら； J. BioL C em., 221, 10931 (1992)〕 。 血簡生は、 血簡細子が分泌され ることが引き金となり、 旁にある既^血管の内戯 ¾からプロテアーゼカ s分必され、 as 膜、 間質力'囊され、 織、て血管内 ¾ («¾、 it¾ ^はじまり、 ts¾^形成されることで 血管力 S新生される よりなる 〔J.Folkmanら； J. Biol. Chem., 2βΙ, 10931 (1992)〕 。 血管 新生を誘導する因子としては、 Vascular permeability fector (VPF)A¾scular endothelial growth factor (VEGFが上記発生 における血 1¾ί生およ t)«3な状態における iflL^ff生に ぉレヽて最も; figな因子として知られてレ、る OVLShibuya; Advances in Cancer Research, 161, 281ひ 995)〕 。 VPF/VEGFはホモダイマ一よりなる分子量約 4万の蛋白であり、 1983年に血 ^¾l4iJ©S因 V scular permeability fkctor VPi として 〔D.R.Sengerら； Science, 212， 983 (1983)] 、 1989年に血管内 ascular endothelial growth factor VEGF)と し " ¾ϊζ:した として されたが 〔N.Ferraraら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 851 (1989)〕 、 cDNAクローニングの結果、 は同一 、あることが明らカとなった[J. Folkman et al .; J. BioL Cem., 221, 10931 (1992)]. Blood sprouts are triggered by the secretion of blood spores, and require protease protease from the inner blood vessels of the blood vessels adjacent to the blood vessels, as membranes, interstitial strength, tissue, and blood vessels. ¾ («¾, it¾ ^ begins, ts¾ ^ is formed to produce vascular strength S [J.Folkman et al .; J. Biol. Chem., 2βΙ, 10931 (1992)]] Induces angiogenesis Among the factors that occur, the most important factor is Vascular permeability fector (VPF) A¾scular endothelial growth factor (VEGF is the most prominent factor in the production of iflL ^ ff in the above-mentioned conditions). OVLShibuya; Advances in Cancer Research, 161, 281h 995)]. VPF / VEGF is a protein consisting of homodimers and having a molecular weight of about 40,000. In 1983, as blood ^ ¾l4iJ © S factor V scular permeability fkctor VPi [DRSenger et al .; Science, 212, 983 (1983)], 1989 Intravascular ascular endothelial growth factor VEGF) was described as “¾ϊζ: as described in [N. Ferrara et al .; Biochem. Biophys. Res. Comm., 851 (1989)]. However, the results of cDNA cloning may be the same. It became clear
[D.W.Leun ら； Science, 246, 1306 (1989)、 P.J.Keckら； Science, 24β, 1309 (1989)〕 （以 下 VEGFと垂 c VEGFの¾¾としてはこれまでに、 血管内 J¾WSに対し、 増殖 iSiStt[DWLeun et; Science, 246, 1306 (1989 ), PJKeck al; Science, 24β, 1309 (1989 ) ] (so far as ¾¾ the hereinafter VEGF and vertical c VEGF, to intravascular J¾WS, growth iSiStt
0ED5O = 2 ~ 3pM) [N.Ferraraら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 231, 851 (1989)〕 、 遊^ 生 E.Kochら； J. Immunology, 152， 4149 (1994)〕 、 メタロブ口テア一ゼ分泌促 〔E.N.Unemoriら； J. Cell Physiol., 153, 557 (1992)〕 、 ゥロキ^""ゼ、 tPA分泌ィ ®1¾ 性 CM.S.Pepperら； Biochem. Biophys. Res. Comm., 1S1, 902 (1991)〕 を示し、 in vivoにおレ、 て ttlilLi¾f生 iStStt [T^saharaら； Circulatior^ 22 suppl Π， 365 (1995)〕 、 血 足0ED 5O = 2-3 pM) [N. Ferrara et al .; Biochem. Biophys. Res. Comm., 231, 851 (1989)]; free E. Koch et al .; J. Immunology, 152, 4149 (1994)]. Metalob mouth secretion promotion [ENUnemori et al .; J. Cell Physiol., 153, 557 (1992)], Peroki ^ "", tPA secretory®1¾ CM.S.Pepper et al .; Biochem. Biophys. Res. Comm., 1S1, 902 ( 1991)], and in vivo, ttlilLi¾f raw iStStt [T ^ sahara et al .; Circulatior ^ 22 suppl Π, 365 (1995)]
〔0. 8611§61«ら；801611∞, 212，983ひ983)〕 が艦されている。 VEGF 管内戯 に極めて特¾14の高レ、増 ¾S子であることが されている 〔N.Ferraraら； Biochem. [0.86111§61 et al .; 801611∞, 212, 983h 983)]. VEGF is known to be a high-level, high-sensitivity probe for tube sex [14. N. Ferrara et al .; Biochem.
Biophys. Res. Comm., 161, 851ひ 989)〕 。 Biophys. Res. Comm., 161, 851 989)].
血菌生を伴う疾患の中で、 増殖、 車 形成、 m . 慢 リュウ マチ (^態 Jf城に VEGF力 ¾く関与していること力 s酷されている。 @¾月鶴にっレ、ては、 こ れまでに腎癌 CA.Takahashiら； Cancer Research, 54, 4233ひ 994)〕 、 fl^ [L.F.Brownら； Human Pathology 26, 86ひ 995)〕 、月 ¾S鶴 [RABerkmanら； J. Clinical Investigation^ 21, 153 (1993)〕 、 消ィ I ^癌 [LEBrownら； Cancer Research 53， 4727 (1993)〕 、  Among the diseases accompanied by blood bacteria, proliferation, car formation, m. 慢 慢 チ ^ (^ 態 ^ ^ ^ ^ ^ f f f f f To date, renal cancer CA. Takahashi et al .; Cancer Research, 54, 4233h 994)], fl ^ [LFBrown et al .; Human Pathology 26, 86h 995)], Mon ¾S crane [RABerkman et al .; J Clinical Investigation ^ 21, 153 (1993)], Kou I ^ cancer [LEBrown et al .; Cancer Research 53, 4727 (1993)],
[TAOlsonら； Cancer Research, , 276 (1994)) < 多くのヒト月麵職にぉレ、て VEGF 力；胜されてレ、ること力 S酷されてレ、る。 ¾ ^につレ、ては VEGFと患者の予後との「关 が樹 され 果、 VEGF敲溯鶴は、 低発溯鶬に比べ、 鹏血鶴 であり生裤カ氐 いことが明ら力となっている CM Ibiら； Japanese J. Cancer Research, S5, 1045 (1994)] 。 ま た、 ヌードマウスにヒト ®¾を皮 ¾¾したゼノグラフトモデル において、 抗 VEGFモ ノクローナル抗体 効果を^ Tこと力 S されてレ、る [J. Kmら； Nature, 362, 841 (1993)] 。 さらに、 ヌードマウスにおけるヒト モデルにおいて、 抗 VEGFモ ノク口一ナル抗体は ¾ ^を嫌 IJできることが酷されてレ、る (OMelnykら； Cancer Research, 56, 921 (1996)3 。 従って、 VEGF活性を卿 Jすることができれば癌患者における腫 m< im. 繊形成を できるものと搬される。 また、 ヒト 隱水、 献中に高 « の VEGF力 s検出されることから、胸水、 の な因子である可能 14も示され  [TAOlson et al .; Cancer Research,, 276 (1994)) <Many human occupations per month, VEGF power; As a result of the formation of “关” between VEGF and the prognosis of the patient, it is clear that VEGF elaboration cranes are more bloody cranes and more viable than those with low onset. CM Ibi et al., Japanese J. Cancer Research, S5, 1045 (1994)], and demonstrated that anti-VEGF monoclonal antibody effect was ^ T in a xenograft model obtained by coating human ® in nude mice. [J. Km et al., Nature, 362, 841 (1993)] In addition, in human models in nude mice, it has been severely implicated that anti-VEGF monoclonal antibodies can disturb I ^. (Omelnyk et al .; Cancer Research, 56, 921 (1996) 3). Therefore, if VEGF activity can be reduced, it is concluded that m <im. Since human VEGF was detected at high VEGF levels during human occultation, pleural effusion was a possible factor14.
[S.Kondoら； Biochimica et BiophysicaActa, 1221, 211 (1994)] 、 VEGFをブロックするこ とで¾»水、 «の Ρί¾を防ぐことも柳寺される。 [S. Kondo et al., Biochimica et BiophysicaActa, 1221, 211 (1994)]. Blocking VEGF can also prevent water and water.
Figure imgf000004_0001
ヽては、 異常な血 生により纏剥离 硝 出血をおこして細にレ、 たるが、 糖尿病 における血 生と .¾¾¾艮¾^1の VEGFレベルが正相 ること力報 告されている 〔L.RAielloら； New England J. Medicine, 331, 1480 (1994)] 。 また、 サル 離モデル ί レ、て抗 VEGF中和モノク口一ナル抗体の眼 F¾¾与により VEGF活生を 喇す ると血 が 劇されること力;報告されてレ、る A.RAdamisら： Arch OpthalmoL, 114, 66 (1996)] 。 従って、 應 IJに ¾ ^される VEGF ¾½を することで糖尿^ Μ^ί:^ΰける血 魏生を 嘛できること力^^される。
Figure imgf000004_0001
In recent years, it has been reported that abnormal blood bleeding causes severe denitrifying nitric bleeding and causes severe diarrhea.However, it has been reported that the blood vegetation in diabetes and the VEGF level of. RAiello et al .; New England J. Medicine, 331, 1480 (1994)]. Also, the ability of blood to play when VEGF is activated by administration of an anti-VEGF neutralizing monoclonal antibody to the eye F in a monkey detachment model; A. RAdamis et al .: Arch OpthalmoL, 114, 66 (1996)]. Therefore, by applying VEGF to the IJ, you will be able to repel the diabetic blood.
爾挪リュウマチの 態 «S (骨、 軟骨 纏 に d fc鶴生を伴うが、 嫩 TOリュゥマチ患者の «液中には VEGFカ高 «で含まれてレ、ること、 Γ*¾ίί中のマクロファ - ¾5 VEGFを することが酷されてレ、る CA.E.Kochら； J. ImmunoL, 152, 4149 (1994)、 RAFavaら； J. Exp. Med., 1SQ, 341ひ 994)〕 。 廳に¾ ^される VEGF？ Sttを清 ijすること で 炎 ί ける血 ff生を 鋼できること力 される。  The condition of rheumatoid arthritis «S (bone, cartilage together with d fc Tsuruo, but in the« liquid of patients with Nen TO rheumatism «included in VEGF high«, macrophage in Γ * ¾ίί- ¾5 The use of VEGF has been severely compromised. CA.E. Koch et al .; J. ImmunoL, 152, 4149 (1994); RAFava et al .; J. Exp. Med., 1SQ, 341 994)]. VEGF in the cafe? By cleaning the Stt, it is possible to steel the blood ff raw.
ヒ卜の VEGFリセプタ一としてはこれまでに Rt-l(fins-like tyrosine kinase) CM.Shibuya ら； On∞gene, 5， 519ひ 990)、 C.Vriesら； Science, 255, 989 (1992)) および KDI¾kiiiase insert domain-containing receptor) [B.I.Tbrmanら； W092/14748, Priolity Feb.22ひ 991)、 B.I.Tfermaiiら； Biochem. Biophys. Res. Comm., IS2, 1579ひ 992)〕 の 2觀が酷されてレ、 る。 ヒ卜の VEGFリセプター KDRのマウス〖 けるホモログは Plk-1 CWMatthewsら； Proc. Natl. Acad. ScL USA, S8, 9026ひ 991)、 A-Ullichら； W094 11499 Priolity Nov. 13 (1992)、 BJMillauerら； 12, 835 (1993)] と命名されてレ、る。 Flt-1および KDR/FTk-1は As human VEGF receptors, Rt-l (fins-like tyrosine kinase) CM. Shibuya et al .; On∞gene, 5, 519 990), C. Vries et al .; Science, 255, 989 (1992) ) And KDI¾kiiiase insert domain-containing receptor) [BITbrman et al .; W092 / 14748, Priolity Feb.22h 991), BITfermaii et al .; Biochem. Biophys. Res. Comm., IS2, 1579h 992)] Being harsh. Homologs of the mouse VEGF receptor KDR in mice are Plk-1 CWMatthews et al .; Proc. Natl. Acad. ScL USA, S8, 9026 991), A-Ullich et al .; W094 11499 Priolity Nov. 13 (1992), BJMillauer 12, 835 (1993)]. Flt-1 and KDR / FTk-1
»とも糸 fflWドメィンは 7個のィムノグロブリ ¾ドメインよりなり、 糸鹏内ドメィンには チロシンキ^"ゼドメィンを有する 量 180-200キ口ダルトン (^容 ί ^チロシンキナ一ゼ ファミリ一に属する!^白である。 VEGFは nt-1および KDR/Flk-1にはそれぞれ KD ifi^ 20pMおよび 75pMで特¾½に結合する。 Flt-1および KDR/Flk-1 ί ίΐ管内皮細胞に特異的に 発現してレ、ると酷されてレ、る [T.P.Quinnら； Proc. Natl. Acad. Sd. USA Q, 7533 (1993)、 RLKendaUら； Proc. Natl. Acad. ScL USA 2Q, 8915 (1993)] 。 »Tomo Yarn The fflW domain consists of seven imglobulin domains, and the domain within the thread has a tyrosinki ^" zedomin. A quantity of 180-200-kilodaltons (^ volume ί ^ belongs to the tyrosinkinase family! VEGF specifically binds to nt-1 and KDR / Flk-1 at KD ifi ^ 20pM and 75pM, respectively Flt-1 and KDR / Flk-1 発 現 specifically expressed on vascular endothelial cells Natl. Acad. Sd. USA Q, 7533 (1993), RLKendaU et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 2Q, 8915 (1993)].
様々なヒト 砉、における KDR 現につレ、ては、 ヒト臟麵職の鶴血管内 鹏  KDR in various humans
[E.Hatvaら； American J. Pathology, 146， 368, (1995)〕 、 ヒト消ィ 観の ffl¾血管内皮 糸鹏 [LEBrownら； Cancer Research, 53, 4727 (1993)] ( レ、て ίϋΕ 職の血管内戯鹏 に比べ KDRの mRNAレベル ¾ ^上昇していることが酷されている。 これらの結果は、 月鶴血魏生にぉレ、て VEGF-VEGF プタ一 KDR系が fi ^な體 iJを果たしてレ、ることを強 く るものである。 さらに、 慢 ttKSfiリュゥマチ唐者の f の血管内皮糸 ¾におレ、ても in situ hybridizationにより KDR mRNA ^認められることが酷されており [RAFava ら； J. Exp. Med.，120, 341，（1994)〕 、 リュウマチにおける VEGF-VEGF Hrプタ一 KDR系の '|·生を 変してレヽる:  [E. Hatva et al., American J. Pathology, 146, 368, (1995)], ffl¾vascular endothelial thread 鹏 of human consumption [LEBrown et al .; Cancer Research, 53, 4727 (1993)] It is severe that the mRNA level of KDR is increased compared to that of the intravascular games.These results indicate that the KDR system is VEGF-VEGF peptide. In addition, even in the vascular endothelial thread of f of ttKSfi rheumatism T, the KDR mRNA ^ is recognized by in situ hybridization. [RAFava et al .; J. Exp. Med., 120, 341, (1994)], '| · Altering the life of the VEGF-VEGF Hr puta-KDR system in rheumatism:
3 VEGF ブター KDR/Flk-1の につレ、ては、 ブタ動脈の血管內^ に KDRを発現さ せると VEGFに し増殖、 i ¾すること力ゝら、 VEGFの雜な の中で KDR i lk管內皮 糸 «殖、 艇に関与すると船されてレ、る [J. Waltenbergerら； J. BioL Chem., 2fi2, 26988 (1994)] 。 また、 マウス型 flk-1遺^ "を赚した flk-1ノックアウトマウス ίΐβ!熟した 血管内皮,栖包が全く認められず、 卵難の血島も形成されず、 子宫内で死亡したことから、 動 tifS体にぉレ、ても KDR/flk-1 ί ίίιι管内皮糸鹏の増殖、 分化に関与することが艦されてレ、る 〔F, Shalabyら； Nature, 326, 62 (1995)〕 。 Three When KDR is expressed in the blood vessels of the porcine artery, it becomes VEGF and proliferates and proliferates in the vein of the porcine artery. lk tube 內 糸 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 殖 J J J J J J J J J J J J J. In addition, the flk-1 knockout mouse with the mouse-type flk-1 residue ίΐβ! Ripe vascular endothelium and sulphur were not observed at all, no blood islands were formed, and they died in the child. However, it has been reported that it is involved in the proliferation and differentiation of KDR / flk-1 管 ιιιιιι 内皮 endothelial fibrils, even in the tifS body [F, Shalaby et al .; Nature, 326, 62 (1995) ].
こチロシンキトゼ型リセブタ一のf^fStは、 リガンドとの；^により自己のチロシ ンキナーゼカ¾+¾匕され、 自己およ 也^？"のチロシン をリ はることで寸 t¾ist 力;開始されると考えられている。 この 、 リセブターの自己リ 匕 TVrに SH2 ドメイン介 して別の蛋白質 が し、 こ^ ^力也 (¾Η·と したり瞧 をおこすことにより ff^c fSS^なされていくと考えられている。 KDRの齢も、 血管内戯 «において、 VEGF との により自己の TVr ¾Sがリ 1 ^匕を受けること 〔J. Waltenbergerら； J. Biol. Chem., 269, 26988 (1994)] 、 フォスフォリノくーゼ C- γ (PLC-y) の TVr リ ^(匕力 SIされること、 MAPキナーゼカ活|¾ t "ること力 S酷されてレ、る (T.T¾kahashiら； On∞gene, 14, 2079 (1997)] 。 また、 KDE FTk-lと Flt-1を Egi}¾rf VEGFによる†f$SiSiとして見た^ \ VEGFで τΤることにより、 糸 に^ Sしてレ、る蛋白質である pl25 focal adhesion kinaseおよび paxillinが TVrリ ^匕を受けるとレ、う酷 [ Abediら； J. Biol. Chem, 222, 15442 (1997)] や、 VEGFで朿 I微したゥシ血管内戯鹏で、 SH2ドメインをも 白として PLC- 、 GAP (ras G Pase activating protein) 、 PI3-kinase vphosphatidylinositol 3- kinase) 、 Nckがリ ^ヒを受けること力 されてレ、る (D.Guoら； J. Biol. Chem., 22Q, 6729 (1995)] 。 ただし KDRの糸 ¾内ドメインと してレ、る につレ、てはこれまで報 告されていなレ、。  F ^ fSt of this tyrosine chitose-type receptor pig is ligated with its ligand; It is thought that the tyrosine is released by re-entering the tyrosine, and this protein is initiated by the receptor self-redirecting TVr through another protein via the SH2 domain. It is thought that ff ^ c fSS ^ is performed by inducing a dripping. The age of KDR also causes the TVr ¾S to be subjected to GF ^^ by VEGF in vascular endosperm [J Waltenberger et al., J. Biol. Chem., 269, 26988 (1994)], TVr l of phosphophorinose C-γ (PLC-y). (T.T¾kahashi et al .; On∞gene, 14, 2079 (1997)) Also, KDE FTk-l and Flt-1 were viewed as † f $ SiSi by Egi} ¾rf VEGF. The protein, pl25 focal adhesion kinase and paxillin, are exposed to TVr by applying τ \ ^ VEGF τ to the thread, resulting in severe illness [Abedi et al .; J. Biol. Chem, 222, 15442 (1997)] The SH2 domain is also white, and PLC-, GAP (ras G Pase activating protein), PI3-kinase vphosphatidylinositol 3-kinase), and Nck are affected by the intravascular intravenous play, which has been diluted with VEGF. (D. Guo et al., J. Biol. Chem., 22Q, 6729 (1995)]. However, it has been reported as a domain within the KDR thread. Not done.
Flk-1 内チロシンキナーゼドメィンを した^ S†¾の Flk-1ミュ一タントを用レ、、 ウィルスべクタ一により内戯 に導入する方法が^^たところ、 稀醒 Flk-1ミュータン トウィルスと を混合して K 鹏 t^!Sすると fifiS^翻 «fJされること力 ¾ ^さ れており 〔B. Millauerら； Nature, Z, 576ひ 994)〕 、 Flk-1の个颜¾§を阻害することで腫 瘍増鶴 «ijされること力;示されてレ、る。  Flk-1 mutant using ^ S † ¾ with tyrosine kinase domain was used. When K 鹏 t ^! S is mixed with a virus, fifiS ^ 翻 力 f 力 力 力 B [B. Millauer et al .; Nature, Z, 576 994)] Inhibition of tumors by inhibiting ¾§ The power to be mobilized;
のこと力 、 ヒト型 VEGF受容体 KDRの 縫を阻害できれば、 ヒトにおける師 » ^殖、 繊形成、 1蕭 リュウマチ ί ける κίίί炎、 糖尿病 ffi«s、 ^ mm^. ¾ι縛の異常な血 t=tf生により病態が進 i る疾患の治療に有用であることカ^^される。 発明の開示 If the ability to inhibit the stitching of the human VEGF receptor KDR, »^ Breeding, formation of fibrils, 1 Xiao rheumatism, κίίί inflammation, diabetes ffi« s, ^ mm ^. る こ と ι Abnormal blood t = tf life is useful for the treatment of diseases in which the disease progresses. Will be done. Disclosure of the invention
本発明の! ^は、 VEGFリセブター KDRへの^によって KDRの†ff«¾を誘導し、 HffM < im, 繊形成、 1舊 リュウマチにおける「关搬、 糖尿病 i4WM、 m , 乾鮮 等の異常な血魏生を起こす原因物質 糊することにある。  In the present invention, ^ induces † ff «¾ of KDR by ^ to VEGF receptor KDR, and causes abnormalities such as HffM <im, fibril formation, and` `transportation, diabetes mellitus i4WM, m, dryness, etc. in old rheumatism. A substance that causes blood wei life.
本発明者らは上言 欲すべき鋭意職を重ね 結果、 ヒ ^^cDNAライブラリ一よ り KDRの糸»内ドメインと^してそ (7 Τ^ββ¾を誘導する蛋白質をコードする cDNAを単 離し、 その酉 E^ij決定をして、 本発明を¾^るに至つ  The inventors of the present invention have been eager to elaborate and, as a result, have isolated the cDNA encoding the protein that induces (7 ^^ ββ) as the domain within the KDR thread from the ^^ cDNA library. , The Rooster E ^ ij decision and led to the present invention
即ち、 本発明の第 1 ( ^明は、  That is, the first aspect of the present invention (
以下の (a) または (b) の蛋白質：  The following protein (a) or (b):
(a) 酉 墦号 3、 4および 2 8力 選 る酉 墦号に言凍のァミノ翻 Jからなる蛋白質 (a) Rooster No. 3, 4 and 28 Protein selected from Romin No. J
(b) (a)の蛋白質の有するアミノ翻 リにおいて 1若しくは数個のアミノ^^欠失、 し くは付加されたアミノ豳 S ^からなり、 力つ血管内戯 fflM麵子 (VEGF) リセプター (b) a fflM receptor (VEGF) receptor consisting of one or several amino ^^ deletions or added amino acids in the amino acid sequence of the protein (a)
KDR(kiiiase insert domain-containing receptor)の糸趣内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白 g-eある。 There is a protein g-e that induces KDR as a domain within KDR (kiiiase insert domain-containing receptor).
上記のァミノ 欠失、 m しくは付加は、 前周 M術である細 特驗変廳発法 により ¾¾することができ、 また、 1若しくは数個のアミノ酸とは、 細立特 »変難発法に より欠失、 しくは付加できる禾 is (^のァミノ酸を魏する。  The above amino deletions or additions can be identified by the method of the specialty experiment, which is a preoperative technique, and one or several amino acids can be defined as the specialty modification. The amino acid that can be deleted or added by the method is is (^.
力かる 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 しくは付加されたァミノ翻 Jからなり、 力 KDRの糸鹏内ドメインと する性質を有する蛋白質は、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 F.M.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、 MJ.ZoUer and M.Snith； Nucleic Acids Research, IQ, 6487 (1982)、  Proteins consisting of amino acids J with one or several amino acids deleted or added, and having the properties of the KDL domain of KDR, are described in J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), FMFrederick et al; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), MJ.ZoUer and M.Snith; Nucleic Acids Research, IQ , 6487 (1982),
CDalbadie-McFarlandら； Proc. NatL Acad. Sci., USA^ 12， 6409(1982)、 JAWellsら； Gene, M, 315 (1985), P.Carterら； NucleicAdds Researc 13, 4431 (1985)、 TAKunkelら； Proc. NatLAcad. Sci USA, S2, 488 (1985)等に言激の: ^去に準じて讓することができる：  Natal Acad. Sci., USA ^ 12, 6409 (1982); JAWells et al .; Gene, M, 315 (1985); P. Carter et al .; NucleicAdds Researc 13, 4431 (1985); TAKunkel et al. In Proc. NatLAcad. Sci USA, S2, 488 (1985), etc .: You can subscribe as follows:
以下、 本発明の蛋白質を KDRリセァタ" ^蛋白質と呼ぶこともある. 本発明の第 2 (7 ¾明は、 上記蛋白質をコードする DNA、 酉 播号 1、 2および 2 7力 選ば れる酉 墦^!こ«の^ ¾ 』を有する DNA、 また ί¾ 播号 1、 2および 2 7力ゝら週 る 播号に読の ^Sfi^jを有する DNAとストリンジヱントな 牛下でハイプリダイズし、 力 つ VEGFリセァター KDRの糸鹏内ドメィンに して KDRの を誘導する蛋白質を コ一ドする DNAカゝらなる DNAである。 Hereinafter, the protein of the present invention may be referred to as a KDR resator "^ protein. The second (7) description of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned protein, a DNA having a rooster seed No. 1, 2 and 27 A protein that hybridizes under the stringent cow with DNA having ^ Sfi ^ j read at the seeding number of 2 and 27, and induces KDR as a domain within the thread of VEGF receptor KDR It is a DNA that is a DNA character.
上記の 「ストリンジェン卜な^ ί牛下でノ ブリダィズし、 力つ VEGFリセプタ一 KDRの細 胞内ドメィンに して KDR cot颜 Siを誘導する蛋白質をコ一ドする DNA」 と 酉 噃 号 1、 2および 2 7から選 る酉 噃号に鐘の ¾¾ 〗を有する DNAをプローブとして、 コロニー · ノ^ブリダイゼーシヨン法、 プラーク · , ^ブリダイゼーシヨン法あるレ、は ~1 'ン プロットノ^ブリダイゼ一ション？ を用レヽることにより得られる DNAを Ε¾し、 具 ίΦ½には、 コ口ニーあるレ、はプラーク由 DNAを固定化したフィルターを用レ、て、 0.7〜； L0Mの Nad 下、 65°Cでノ ブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1 X〜2 X SSC (saline-sodium citrate) [ 1 SSC裔夜 (150mM NaCl、 15mMクェ^^"トリゥム） ； n Xは n倍濃 度の灘を^ Τ。 〕 を用レ、、 65°C^f牛下でフィルターを赚することにより同^?きる DNA をあげることができる。 ノ ブリダィゼーシヨンは、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressひ 989)、  The above-mentioned “DNA that codes for a protein that induces KDR cot 颜 Si as a stringent ^ GF under the cow, and becomes a intracellular domain of the VEGF receptor-KDR.” The colony-no-bridation method, the plaque, and the bridging method are used as probes using DNA with the bell of the rooster selected from, 2 and 27 as probes. Plot No Bridging? The DNA obtained by using a filter is prepared by using a filter immobilized with plaque-derived DNA, using a filter with immobilized DNA, 0.7 ~; under L0M Nad, 65 ° C 0.1 X to 2 X SSC (saline-sodium citrate) [1 SSC descendant night (150 mM NaCl, 15 mM que ^^ "trim); n X is n-density n times By using a filter under 65 ° C ^ f cow, the DNA that can be obtained can be increased.No bridging is described in J. Sambrook et al .; Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 989),
FM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John WHLey & Sons (1987-1997)、 DM.Glover and B.D.Hames； DNA Clonin 1: Core Ifechniques, A FM. Frederick et al .; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John WHLey & Sons (1987-1997), DM.Glover and B.D.Hames; DNA Clonin 1: Core Ifechniques, A
Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の纖書に言凍されて レ、る方法に準じて行うことができる。 ノ^プリダイス可能な DNAとして具鹏には、 酉 潘号 1、 2および 2 7力 選 i る酉 墦号に言凍の ^SE^Jと少なくとも 80%以上の相 生を有 する DNA、 好ましくは 95%Riiの相同生を有する DNAをあげることができる。 Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc., can be performed according to the method of writing on a fiber. As a DNA that can be pre-dicated, the DNA of Tori Ban No. 1, 2 and 27 can be selected from the following: Can include DNA having a homolog of 95% Rii.
本発明の第 3 明は、 上記 DNA ¾ ^有する糸藤えべクタ一である。  A third aspect of the present invention is an Itoh vector containing the above DNA layer.
本発明の第 4 i 上言 s»えべクターを宿 ϋ鹏に導入して得られる形 s^freあ る。  There is a form s ^ fre obtained by introducing the 4th above-mentioned s »vector in the inn of the present invention.
本発明の第 5の発明は、 上言 S ^体を培地 咅養し、 ±咅難中に上記蛋白質を«^ させ、 咅麵力ゝら該蛋白質を聽することを稱教とする該蛋白質の! ¾t¾¾である  The fifth invention of the present invention relates to a method for producing a protein, comprising feeding the above-mentioned S-form in a culture medium, allowing the above-mentioned protein to be added during a period of difficulty, and listening to the protein from the outside. ! T¾¾
本発明の第 6 (7 ¾明は、 上記 DNA
Figure imgf000008_0001
The sixth (7) description of the present invention relates to the DNA
Figure imgf000008_0001
列を有するオリゴヌクレオチドである- 該オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 酉 潘号 1、 2および 2 7力、ら る酉 墦号に雄の ¾¾ 冲(¾ ^した 5 ~€0 ¾S、 好ましくは 10 50歹»75；^ 1〗と同じ または W½な: を有するオリゴヌクレオチドをあ げることができる。 The oligonucleotide having the sequence-as the oligonucleotide, for example, Two and twenty-seven strengths, an oligonucleotide having the same or different as the male or female: Can be
本発明の第 7 明は、 上記蛋白質を認識する抗^ Cある。  A seventh aspect of the present invention is an anti-C that recognizes the above protein.
本発明の第 8 (7 ¾明は、 上言¾ [体を用いることを赚とする、 上！ ^白質 ^ ^出法 である。 The eighth (7) description of the present invention is the above-mentioned [white matter ^ ^ extraction method, in which a body is used.
本発明の第 9 明は、 上言 リゴヌクレ; ^ドまた iiH¾t体を極成分とする、 異常な 血 «生により病 ¾|が進 frTる疾巒、または KD R(Z«6e¾の異常に起因する疾崈、の治纏で ある。  The ninth aspect of the present invention relates to the above-mentioned ligoneucle; ^ or iiH¾t body as an extreme component, abnormal blood 生 | It is the management of the disease.
本発明の第 10 < i 上言 リゴヌクレオチドまた {让言 a¾体を械成分とする、 異常な 血管渐生により が進行する疾害、または KD Rの ff$giStの異常に起因する疾患の で ある。  The 10th <i above of the present invention is a disease that is caused by abnormal vascular growth or a disease caused by abnormal ff $ giSt of KDR, using a lignonucleotide or {让 a a body} as a mechanical component. is there.
本発明の第 11 ( Mi 上記蛋白 K¾た ί!±記 DNAを用レ、ることを とする、 KDRの 質のスクリーニング法である。 以下、 本発明を詳細に説明する。  A method for screening the quality of KDR, which comprises using the DNA of the eleventh (Mi) of the protein of the present invention. The present invention will be described in detail below.
[1] 本発明の DNAの « [1] The DNA of the present invention
本発明の蛋白質 の cDNAは、 プリッド （twchhy rid) 法により するこ と力 sできる。  The cDNA of the protein of the present invention can be prepared by a twchhy rid method.
ッ一ハイプリッド法としては、 例えば、 賺ッ一 ^ブリッド法 〔S.Fieldsら； Nature, Q 245 (1989)〕 をあげることができる。  Examples of the one-hybrid method include, for example, the following: the one-brid method [S. Fields et al .; Nature, Q245 (1989)].
騰ツー ^ブリッド法は、 DNA ドメインと転 匕ドメインが別々に するよう な酵母の転 Η子、 例えば GAL4を利用して目的蛋白質と複^:を形成できる蛋白質およ tH:
Figure imgf000009_0001
まず、 GAL4の 2つのドメインとの 蛋白質をそれぞれ 発現しうるようなべクタ一、 即ち、 目 白質 X (本発明 ί いては、 KDRの細納ドメイ ン） を DNA ¾^ドメイン (GAL ドメイン） と 蛋白 (^で発現させるベクタ一と、 蛋白質 ' （本発明にぉレ、ては cDNAライブラリ一中の各 cDNAがコードする蛋白 S) を転雜 ffi匕ドメィン (GAL4 S14fヒドメイン） との ΐ ^蛋白 (^で発現させるべクターの両者で酵母を 形 ¾ί云換すると、 蛋白質 Xと蛋白質 Υカ湘互作用して複^本を形成した酵母クローンは、 転写 匕ドメインが DNAのプロモータ ~¾分に^する形となって転写カ¾¾{匕され、 リポ一タ ~¾ 力 現する。 そして、 リポータ HI 現を鍵として、 糸 内ドメインと相互 作用する蛋白質の cDNA力;含まれている形 体をスクリ一ニングし、 形 ®¾換体からブラ スミドを^ ることにより目的とする cDNAをクローン itfる。 The Teng-to-Brid method is a method for producing a yeast protein in which a DNA domain and a transcription domain are separated, for example, a protein capable of forming a complex with a target protein using GAL4 and tH:
Figure imgf000009_0001
First, a vector capable of expressing a protein with two domains of GAL4, that is, protein X (in the present invention, the KDR domain) is used as a DNA DNA ^ domain (GAL domain) and a protein. (A vector to be expressed by ^ and a protein ′ (the protein S encoded by each cDNA in the cDNA library according to the present invention) and a ffi ^ protein (GAL4 S14f human domain) In other words, the yeast clones that interact with protein X and protein X to form multiple copies are transcribed. The dangling domain takes on the form of a DNA promoter, which is transcribed, and is expressed as a reporter. Then, using the reporter HI expression as a key, the cDNA ability of the protein that interacts with the domain within the thread; screening the contained form and extracting the plasmid from the transformed form to obtain the desired cDNA Clone itf.
以下、 上言 法による本発明の蛋白質 の cDNAのクローニングを具^]に説明する。 Hereinafter, the cloning of the cDNA of the protein of the present invention by the above method will be described.
(1) DNA ドメインと KDR 鹏内ドメインとの 蛋白発現プラスミドの (1) DNA expression plasmid and KDR II domain
(1-1)糸 内ドメィン½¾ KDR cDNAの讓  (1-1) Itouchi Domain KDR cDNA Substitution
糸 内ドメィン¾ ^む KDR cDNAの讓は、  The domain of KDR cDNA is
(i) KDRの cDNA ¾r^t ^®^体 (ATCC740931, ATCC40975) 力も 法により cDNAを 含むプラスミド DNAを »する、  (i) KDR cDNA ¾r ^ t ^ ® ^ form (ATCC740931, ATCC40975)
(ii) RT(reverse txanscription)-PCR [MJMcPhersonら； PCR2, A practical ½proach， Oxford University Press (1995)〕 により KDRの DNAを ± ^畐する、  (ii) RT (reverse txanscription) -PCR [MJMcPherson et al .; PCR2, A practical ½proach, Oxford University Press (1995)]
(iii) cDNAライブラリ一から KDRcDNAクローンを^ f る、 のレ、ずれかにより行うことがで きる。  (iii) A KDR cDNA clone can be obtained from a cDNA library by performing the following steps:
(ii)による は、 まず、 KDR力 現している «あるいはネ鹏、 例えばヒト月 ゝら全 RNAを麵する。 全 E Aを蒸する方法としては、 チォシァ グァニジン一トリフルォロ g^tシゥム法 〔H.Okayamaら； Methods inEn2ymologyJ ，3ひ 987)〕 、 ¾¾チオシアン 酸グァニジン.フエノール.クロ口ホルム （AGPC) 法 〔P.Chomczynski andN.Sacchi； Analytical Biochemista , J£2, 156 (1987)] 等力'挙げられる。 この全 RNAを用レヽて  According to (ii), first, the total RNA from the KDR-expressing DNA or human, for example, human moon, is shown. Methods for steaming all EA include the thiosian guanidine-trifluorene g ^ t shim method [H. Okayama et al., Methods in En2ymology J, 397], the guanidine dithiocyanate phenol. Clonal form (AGPC) method [P. Chomczynski and N. Sacchi; Analytical Biochemista, J £ 2, 156 (1987)]. Use this total RNA
J.oambrookり； Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), EM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology Supplement 〜 38， John Wiley & Sons (1987-1997)、 DJVLGlover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^proach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に言凍の方法で の を行レ、、 RNA中の mENAを cDNAに変換する。 ま た Sft、には、 Superscript Preamplification System 〔ライフテクノ口シース (Life J. oambrook et al .; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), EM. Frederick et al .; Current Protocols in Molecular Biology Supplement ~ 38, John Wiley & Sons (1987-1997), DJVLGlover and BDHames; DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^ proach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc., using the method of freezing to convert mENA in RNA to cDNA. In addition, Sft has a Superscript Preamplification System [Life Techno Mouth Sheath (Life
Tfechnologies) 社 $S 等のキットを用いてもよい。 この cDNAを,にして、 KDRの cDNA の に基づいたブライマ一を用いて PCR MJMcPhersonら； PC¾ A practical Approach, Oxford University Pi¾ss (1991)] を行レ、、 KDRの cDNA断片を増幅する： また、 以下に述べる cDNAライブラリ一がある はライブラリ一 DNAを,にしてもょレ \ (iii) による^は、 まず、 （ii)と [^にして KDRカ 現している «あるい ίお m ^ら全 RNAを纏し、 全 RNAカゝらポリ (A)+ RNAとして mRNAを讀する。 謹去としては、 ォ リゴ (dT)セルロースを用いる方法 [J.Sambrookら； Molecular Cloning, A kit such as $ S by Tfechnologies may be used. Using this cDNA as a primer, PCR MJMcPherson et al .; PC¾A practical Approach, Oxford University Pi¾ss (1991)] using a primer based on the KDR cDNA to amplify the KDR cDNA fragment: There is a cDNA library described below. ^ according to (iii), first, summarize the total RNA such as «or ί m ^ that is expressed in KDR as (ii) and [^, and convert the mRNA as total RNA poly (A) + RNA. Read. As a reminder, a method using oligo (dT) cellulose [J. Sambrook et al .; Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 等力 げられる。 あるいは、 Fast Track mRNA Isolation Kit 〔インビトロジェン （Invitrogen) 社 、 Quick Prep mENA Purification Kit 〔ファノレマシア （Pharmacia) 社劉 等のキットを 用レ、て から赚 mENAを譲することもできる。 この mENAを cDNAに変換し、 適当なべクター〖 且み)^、 宿 田胞に導入することにより cDNAライブラリ一をィ樓する。 具励な cDNAライブラリ ~ 去としては、 J.Sambrookら； Molecular Cloning, A A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Alternatively, 赚 mENA can be transferred after using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit [Invitrogen Co., Ltd., Quick Prep mENA Purification Kit [Pharmacia Co., Ltd. Liu]. This mENA is converted into cDNA, and a suitable vector is introduced into Sukutadashi to produce a cDNA library. Encouraging cDNA Libraries ~ See J. Sambrook et al .; Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition, Com spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Laboratory Manual, Second Edition, Com spring Harbor Laboratory Press (1989),
EM.Frederickら； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38， John Wiley & Sons (1987-1997)、 D JVLGlover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に言 Ξ¾された； ¾去、 あ るレヽは TfJSSのキット、 ^ijえは' Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (ライフ.テクノロ^ズ謂 や ZAP^cDNA Synthesis Kit 〔ストラタジーン EM. Frederick et al; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), D JVLGlover and BDHames; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press ( In the past, there was a certain TfJSS kit, ^ ij-e 'Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life.Technologies, so-called ZAP ^ cDNA Synthesis Kit [Stratagene]
(Staratagene)a ] を用いる方縛が挙げられる。  (Staratagene) a].
cDNAライブラリ一を^ Tるためのクローニングべクタ一としては、 M K12株中で自 ¾S できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミドベクタ一等レ、ずれでも できる。 具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン ¾ 、 Strategies, 5, 58 (1992)] 、 pBluescriptn SK (+) [NucleicAcids Research, 12, 9494 (1989)] 、 Lambda ZAP Π (ストラタジーン卞 、 え gtlO、 gtll [DNA Cloning, APracticalApproach, 1, 49 (1985)] 、 XTViplEx (クローンテ ック鶴 、 XExCeU (ファノ!^シァ誦 、 pT7T318U (ファノ シァ鶴 、 pcD2 As a cloning vector for ^ T of a cDNA library, a phage vector, a plasmid vector or the like can be used as long as it can be used in the MK12 strain. Specifically, ZAP Express [Stratagene II, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescriptn SK (+) [NucleicAcids Research, 12, 9494 (1989)], Lambda ZAP II (Stratagene Bye, gtlO, gtll [DNA Cloning, APracticalApproach, 1, 49 (1985)], XTViplEx (clone-tech crane, XExCeU (Fano! ^ Shea recitation, pT7T318U (Fano-shear crane, pcD2
(H.Okayama and RBerg； MoL Cell. Biol., 3， 280 (1983)〕 等を挙げることができる c 宿 «物としては、 大腸菌 Escherichia coliに属する微牛物であれば 、ずれも用レ、るこ^カ できる： 具体的には、 Escherichia mli XLl-Blue證 F 〔ストラタジーンぉ 、 Strategies, 5, 81 (1992)〕 、 Escherichia coH CeOO [R Appleyard； Genetics, 22, 440 (1954)] 、 (H. Okayama and RBerg; MoL Cell. Biol., 3, 280 (1983)). Examples of the c- house include small cows belonging to Escherichia coli. Ruko ^ a can: Specifically, Escherichia mli XLl-Blue certificate F [Stratagene II, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coH CeOO [R Appleyard; Genetics, 22, 440 (1954)],
Es herichia mli Y1088 〔RAA'oung and R.W.Davis ; Science, 222, 778ひ 983)] 、 Escherichia O)liYl090 [RAYoung and RW.Davis； Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia ml丽 522 Es herichia mli Y1088 [RAA'oung and R.W.Davis; Science, 222, 778 983)], Escherichia O) liYl090 [RAYoung and RW.Davis; Science, 222, 778 (1983)], Escherichia ml 丽 522
CJAGough and N.E.Murray； J. Mol. Biol., Ιββ, 1 (1983)] 、 Escherichia m]j K802 1 CJAGough and NEMurray; J. Mol. Biol., Ιββ, 1 (1983)], Escherichia m] j K802 1
[W.B.Wood ； J. Mol. BioLOe, 118 (1966)] および Escherichia mli JM105 [L.JJ¾eha- Krantz； Gene, 38， 275 (1985)〕 等が用いられる。 [W.B.Wood; J. Mol. BioLOe, 118 (1966)] and Escherichia mli JM105 [L.JJ¾eha-Krantz; Gene, 38, 275 (1985)].
あるいは、 クロ一ンテックネ の βの cDNAライブラリ一を購入してもよレ、： i:のよ うに讓した cDNAライブラリ一に対してコロニーノ^ブリダイゼーションある！/、はプラーク ノ ^ブリタ ゼ——ンョン [J.aambrookら； Molecular Cloning, A Laboratory ivlanual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 FJMFrederickら； Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、 D.M.Glover and B.D.Hames； DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^proach, Second Edition, Oxford University Press (1995)] を行うことより KDRの cDNAクローンを得ることができる。 プロ —ブとしては、 DNA合 βによりィ匕学合成した KDR cDNAの" ^の ^をもつォリゴヌ クレオチド^ (ii) 示した RT-PCRにより増幅した KDRの cDNA断片を、 32P等で した ものを用いることができる。 Alternatively, you can purchase a cloned cDNA library from β, and colony hybridization is performed on the cDNA library obtained as in i :! /, Is a plaque-no-brita-zeon-ion [J. aambrook et al .; Molecular Cloning, A Laboratory ivlanual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), FJMFrederick et al .; Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), DMGlover and BDHames; DNA Cloning 1: Core Tfechniques, A Practical ^ proach, Second Edition, Oxford University Press (1995)] to obtain a KDR cDNA clone. Pro - As the blanking, which the Origonu Kureochido ^ (ii) cDNA fragment was amplified KDR by RT-PCR showed that with "^ Bruno ^ of I匕学synthesized KDR cDNA by DNA if beta, and with 32 P or the like Can be used.
ひ- 2) DNA ドメインとの 蛋白発現ブラスミドの »  G-2) DNA expression of plasmids with DNA domain »
(1-1)で «した KDRcDNAを組み込む "Sil^蛋白発 べクターとしては、 »  Incorporating the KDR cDNA described in (1-1) "As a Sil ^ protein vector,»
Sacoharomvffis visiae 能であり■ 適当な形質 «マーカ一遺 、 例えば TRP1、 LEU2等のァミノ^^遺 をもち、 »で発現するプロモータ Uえはブルコーノ ヒドロゲ^-ゼ (ADH) プロモーターの で、 GAL 等の DNA ドメインを発現でき るようなベクターである。 この^、 KDRの cDNA挿入のため、 DNA結合ドメインの C末側 に相当する部分に適当な制 サイトがあり、 また、 ベクター DNAの fflM等の w±、 -m 菌でも でき、 了ンピシリン耐 Ιίϋ^ϊ1等の;^悬菌での形質 マ—力一をもつものが望ま しい。 このようなベクタ一としては pGBT9 (クローンテックネ±) 、 pASl 〔T.Durfeeら； Genes & Development,?, 555ひ 993)〕 、 pAS2-l (クローンテック±) 等が挙げられる。 Sacoharomvffis visiae ability and suitable trait «has a marker, for example, TRP1, LEU2, etc., and the promoter U expressed at» is a promoter of the bulcono hydrogenase (ADH) promoter, such as GAL. It is a vector that can express a DNA domain. For insertion of this ^, KDR cDNA, there is an appropriate control site in the portion corresponding to the C-terminal side of the DNA binding domain, and it can also be formed with w ±, -m bacteria such as fflM of vector DNA. ^ I 1 or the like; ^ traits Ma in悬菌- is desired arbitrary one with the force scratch. Examples of such vectors include pGBT9 (Clontech ±), pASl [T. Durfee et al., Genes & Development,?, 555/993], pAS2-l (Clontech ±), and the like.
(1-1) で讓した KDR cDNAの糸 内ドメィンの断片を戦隹し、 DNA結合ドメインの。末 側の制 サイ卜に蛋白のフ ムが合うように挿入する。 KDRcDNAの細^]ドメィンの 断片は、 適当な制 例えば Asp8C)6 (7«iに據する EamHIサイトで切り出したり、 細 胞内ドメィンのみ ¾τ¾Φ畐するような酉 IJのプライマ一を用レ、た PCR [MJMcPhersonら； PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)〕 を行うことにより戦 t"f"る。 (2) 耘 ¾14|匕ドメインとの 蛋白発 ecDNAライブラリ一の The domain fragment in the thread of the KDR cDNA obtained in (1-1) was purified to obtain the DNA binding domain. Insert the protein into the control site at the end so that the protein hood fits. A fragment of the KDR cDNA thin domain can be cut out using an appropriate control such as Asp 8C) 6 (77i at the EamHI site based on i, or a primer from the Rooster IJ that only の み τ¾Φ 畐 in the intracellular domain. PCR [MJMcPherson et al .; PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)] to fight “f” (2) 耘 | 14 |
転 D4fヒドメインとの 蛋白発 ¾ cDNAラィブラリ一を するため クターとし ては、 酵母 Saccha画 vcfis隱 visiae 製可能であり 適当 マーカ H»5÷、 例 えば RP1、 LEU2等の のアミノ^ 等をもち、 gfSで発現するプロモーター、 例えば ADHプロモーターの柳 ίΡΤで、 GAL4等の転^ ¾14ί匕ドメィンを発現できるようなべ クターである。 この^、 転 ¥¾ttf匕ドメィンの C末側に相当する部分に適当 サイ トがあり、 また、 ベクター DNAの;^等の «±、 大 β昜菌でも でき、 アンピシリン ftH4» 等の刘昜菌で ^マーカーをもつもの力 s望ましレ、。 このようなべクターとしては pGAD 〔C.T,Chienら； Proc NatLAca ScL USASa SSTS iiggiW 、 pGAD424 (クローン テック tt) や pACT 〔T.Durfeeら； Genes & Development, 2， 555 (1993)〕 、 pACT2-l (クロA protein library for inverting D4f human domains and a cDNA library The yeast can be made from yeast Saccha drawing vcfis occidental visiae and has a suitable marker H »5 ÷, such as RP1, LEU2, etc., and a promoter expressed in gfS, such as ADH promoter Yanagi, GAL4, etc. It is a vector that can express the 転 14ί domain. There is a suitable site on the C-terminal side of the ^, inverted \ ¾ttf domain, and で き ± and large β bacteria, such as; ^, in vector DNA, and fungi such as ampicillin ftH4 » In ^ what has the marker power s desired ,. Such vectors include pGAD [CT, Chien et al .; Proc NatLAca ScL USASa SSTS iiggiW, pGAD424 (Clontech tt) and pACT [T. Durfee et al .; Genes & Development, 2, 555 (1993)], pACT2-l ( Black
—ンテックネ 等カ举げられる。 —Can be used for other applications.
KDR (D mドメインと相互作用する蛋白質は KDRと同じfflSM職で発現していると考 えられる。 従って (1-1) と! ^にして、 KDR力^ §現していると考えられる »^鹏から cDNAを譲し、 前述の!^蛋白発画 クターの転 f¾ttf匕ドメィンの C末側の制 サイトに挿入することにより、 cDNAライブラリ一をィ懐する。 この:^、 cDNAと転^ Stt 化ドメィンの方向およびフームがあってレ、た # ^には、 転 ヒドメインと cDNAがコー ドする蛋白質との齢蛋白カ 現することになる。 あるレ、¾S#Sッ一ノ^ブリッド法に棚で きる趙のライブラリー、 例えば MATCHMAKER cDNAライブラリー （クローンテック卒±) を利用することもできる。  KDR (The protein interacting with the Dm domain is considered to be expressed in the same fflSM position as KDR. Therefore, (1-1) and! Transfer cDNA from ィ and insert it into the control site at the C-terminus of the! ^ Protein fragment conversion domain described above to save the cDNA library. Due to the orientation of the domain and the fume, the # ^ represents the age protein between the transgenic domain and the protein encoded by the cDNA. Zhao's library that can be used on shelves, for example, the MATCHMAKER cDNA library (Clontech) can also be used.
(3) 麵ツーハイブリッド法による cDNAのスクリ一二ング  (3) Screening of cDNA by two-hybrid method
(1)およ ΐ (2) で脑した KDR (^贿内ドメイン St^蛋白発現プラスミドと 蛋白発画 cDNAライブラリーを導入する隨としては、 SaccharomyoRS cerevisiaeに属する酵母であつ て、 ίのッ一ノ^ Tブリット、用のプラスミドを導入でき、 さらに （i)導入するプラスミド 質 繊マ一カー 、 およびツーノ ブリッド法の DNA ^ドメィンおよ 生ドメィ ンに用レ、た転写因子の遺ィ 力次^変異により発現できなレ、こと、 （ϋ) 適当なリポ一タ ~¾ のプロモータ ϋに、 ツーハイプリッド法で用いた DNA¾^ドメインカ¾^1^寻るよう な ¾¾ |〗力 入してあることが必要である。 この^のリポ一タ ~¾ としては、 相互作 用により転写が開始された:^に検出力;容易なもの、 例えば HIS3等のァミノ ^^^遺  In order to introduce the KDR (^^ domain St ^ protein expression plasmid and the protein-expressing cDNA library obtained in (1) and (2), yeast belonging to SaccharomyoRS cerevisiae, In addition, (i) a plasmid fiber marker to be introduced, and a transcription factor used for the DNA ^ domain and the raw domain of the Tunobrid method. ^ The expression that cannot be expressed due to the mutation, (ϋ) Insert the DNA promoter used in the two-hybrid method into the appropriate promoter ~ ¾, such as As a reporter of this ^, the transcription was initiated by interaction: ^ has power; an easy one, such as an amino acid such as HIS3 ^^^
(この 、 ッ一ノ^ブリツド用のブラスミド ®f激マ一カーとは異なるものを用いる） 、 昜菌の /3ガラク
Figure imgf000013_0001
等が用いられる。 例 ば Sac hammvffis rRvHsiae CG1945株 （クローンテック卞±) 、 Y153株 [TDurfeeら； Genes & Development. I, 555 (1993)] 、 CGY1::171株 〔G.Gill and M tashne ; Celt ^L, 121 (1987)〕 等があげられる。 この宿 »Sに (1)およ t (2) でィ樓した KDRの糸赚内ドメイン 蛋白発現プラスミドと 1 ^蛋白発 ¾ cDNAライブラリ一の両方を導入し、 リポータ Hl^c ¾現を鍵にして KDRの; ilSS内ドメインと する蛋白質をコ一ドする cDNAを^ 体を繊する。 例えば、 HIS3遺 をリボータ "¾β÷とした は、 Hisを含まない最小培地で咅養したと きに生育するコ口ニーを、 lacZ遺 をリポーターとした:^は X-galを作用さ く ¾feす るコロニーを顧する。 (Use a different type of brassmid ® f super-marker for this one-piece bridging)
Figure imgf000013_0001
Are used. For example, Sac hammvffis rRvHsiae strain CG1945 (Clontech By ±), strain Y153 [TDurfee et al .; Genes & Development. I, 555 (1993)], and CGY1 :: 171 strain [G. Gill and Mtashne; Celt ^ L, 121 (1987)]. Introduce both the KDR intracellular domain protein expression plasmid and the 1 ^ protein generation cDNA library from (1) and (2) to this inn »S, and the reporter Hl ^ c expression is key. Then, a cDNA encoding a protein serving as a domain in ilSS of KDR is ligated. For example, HIS3 was used as a reporter "{β}", and was used as a reporter for lacZ as a reporter, when it was fed on a minimal medium without His, and lacZ was used as a reporter. Look at all the colonies.
顧した形 体コロニー力 S4 ^蛋白発 cDNAブラスミドを^ f る。 コロニーに は KDR (^田胞内ドメイン 蛋白発現プラスミドと 蛋白発觀 cDNAプラスミドの 2種 類のプラスミドが含まれているので、 方法としてはコロニーからプラスミド^ ii DNAを職 し、 昜菌を形 し、 蛋白 ¾ cDNAプラスミドの方のマーカ を基に形質 体を ¾Rすることにより、 cDNAクローンを;^し、 ¾ した 3昜菌からプラスミド DNA を ¥ ""る 〔D.Rickwood and B.D.Hames； DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Pressひ 995)、 C.-T.Chienら； Proc. Natl. Acad. ScL, S8, 9578ひ 991)〕 。  See the colony strength of S4 ^ protein-derived cDNA plasmid. The colony contains two kinds of plasmids, KDR (^ plasmid intracellular domain protein expression plasmid and protein-discovered cDNA plasmid). The method is as follows. Then, the cDNA clone is obtained by を R of the transformant based on the marker of the protein ¾ cDNA plasmid, and the plasmid DNA is obtained from the obtained 3 昜 fungus [D. Rickwood and BDHames; DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press 995), C.-T. Chien et al .; Proc. Natl. Acad. ScL, S8, 9578 999)]).
(4) cDNAク口ーン (^晰  (4) cDNA clone
(4-1) KDRの細胞内ドメインとの ^の検証  (4-1) Verification of ^ with KDR intracellular domain
«した 蛋白発 cDNAクローンと KDRの糸細包内ドメィン 蛋白発現プラスミド の f¾ を宿 «母に導入し、 リボータ ~¾ (7 ¾現を 、することにより、 10)11の細»ド メインとの;^を できる。  Introduce the protein-derived cDNA clone and the KDR domain protein expression plasmid f 糸 in the thread wrapper into the host «mother, and then use the revoter ~ ¾ (7) to reduce the ; ^ Can be.
また、 KDRの糸！^内ドメィンの DNA ドメインとの齢蛋白発現に用レ、たべクターに、 KDRの糸 MS内ドメィン (^弋わりに別 を挿入した齢蛋白発現ブラスミドを ί樓し、 こ のプラスミドと,した 蛋白発 cDNAク口一ンの両者を宿 に導入したときには リ
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した cDNAがコードする蛋白 が KDRの細胞内ドメインと特 ¾½に¾ ^することを ¾|忍できる。Also KDR yarn! ^ Use the DNA domain of the inner domain for expression of the age protein, and in the vector, the domain of the KDR thread MS When both cDNA clones are introduced into the inn,
Figure imgf000014_0001
It is possible to bear that the protein encoded by the obtained cDNA specifically binds to the intracellular domain of KDR.
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0002
得られた cDNAクローンをそのまま、 あるレ、は cDNA部分を適当な IW¾によって切り出 して pUCU8等 (¾1当なクローニングべクターにサブクローニングした後、 通常用レ、られる塩 SIE^ 浙方法、 例えば Sangerらのジデォキシ法 [Prcc. NatL Acad. Sd. \JS. 24, 5463 (1977)] あるいはパーキン'ェノレマー (Perkin Elmer) 社やファノレマシア社等の DNAシーク ェ 1 ^を用レ、ることにより決定する。 The obtained cDNA clone is left as is, and the cDNA portion is cut out with an appropriate IW¾ and pUCU8 etc. (¾1 After subcloning into a suitable cloning vector, the salt is used for normal SIE ^ Zhe method, for example, Sanger Natl Acad. Sd. \ JS. 24, 5463 (1977)] Alternatively, the DNA sequence is determined by using a DNA sequence 1 ^ from Perkin Elmer or Fanare Masia.
cDNAの ^が新規な酉 リかどう Wま、 BLAST等の相同^^プログラムを用レ、て、 GenBank, EMBLおよび DDBJ等の;^ 1 一タベースを; t ^Tることにより、 データべ —ス中の既 ^遺 の; ^ ]と ると考えられるような明らかな相同性を^ f^S己 歹リがなレヽことにより ¾I、できる。  If the cDNA ^ is a new rooster, use a homology ^^ program such as WLAST, BLAST, etc., and use a database such as GenBank, EMBL and DDBJ; The obvious homology, which is considered to be [?] In the source, can be obtained by the ^ f ^ S system.
m:のようにして得られた、 KDRの糸 ¾内ドメインと^する新規な蛋白質をコ一ドする cDNAとして、 例えば、 酉 Ξ ^潘号 5または 6 を有する cDNAクローンをあげる ことができる。  Examples of the cDNA encoding the novel protein serving as an intracellular domain of KDR obtained as in m: include a cDNA clone having a rooster 5 or 6.
以下、 KDRの細胞内ドメインと^する蛋白質をコードする DNAを KDRリセプタ 蛋白質 DNAと呼ぶこともある。  Hereinafter, the DNA encoding the protein that functions as the intracellular domain of KDR is sometimes referred to as KDR receptor protein DNA.
(4-3) ^gcDNAの譲  (4-3) Transfer of ^ gcDNA
(4-2) の;^ 晰ぉよび、 後記 [4]のノーザンブロットノ ブリダィゼ一シヨンで得ら れた mE A ¾さ ゝら、 (3) で得られた本発明の蛋白質 の cDNAが では ないと予測される ^は、 以下の方法で本発明の蛋白質遺 cDNAを »することが できる。  The cDNA of the protein of the present invention obtained in (3), and the mEA plasmid obtained in Northern blotting (4), The ^ which is not expected to be obtained can be used to obtain the cDNA of the protein of the present invention by the following method.
(4-3-1) cDNAライブラリ一のスクリ一二ング  (4-3-1) Screening of cDNA library
(2) で IHi ^した 蛋白発 ¾の cDNAライブラリー、 あるい ii*発明の蛋白質カ 現して レ、ると考えられる糸職また (お から (1-1) と赚にし XI ^した cDNAライブラリーに対し て、 （3) で得られた cDNA全体あるいは ~ ^をプローブとして (1-1) の雄のようにコロニーノヽ イブリダイゼーシヨンやプラークハイブリダィゼ一シヨンを行レヽ、 ポ、: ^イブクローンの中か ら本発明の蛋白質遺^"の cDNA^Sと考えられる長さの cDNAクローンを蒙する。 得ら れた cDNAクローンにつレ、て (Φ2) と曜にして ifflS^Jを決定することにより、 本発明の蛋 白質遺 β÷の cDNA全体の iffiE ^および、 本発明の蛋白質全体のァミノ醚 を明ら力 4こす ることができる。  The cDNA library of the protein produced by IHi ^ in (2), or the protein of ii * invention, For the rally, colony hybridization or plaque hybridization was performed using the entire cDNA obtained in (3) or ~ ^ as a probe, as in the case of the male in (1-1). : From the Eve clones, a cDNA clone of a length considered to be the cDNA ^ S of the protein residue of the present invention is exposed. If the obtained cDNA clone is (Φ2), By determining ^ J, it is possible to clarify the iffiE ^ of the entire cDNA of the protein ββ of the present invention and the amino acid of the entire protein of the present invention 4.
本発明の蛋白質のァミノ翻 ϋが新規であることは、 FASTA、 Framesearch等の相同隨 索プログラムを用いて、 GenPept、 PIR、 Swiss-Prot等のアミノ翻 データベースを検^ ることにより、 データべ一ス中の既 ^ァミノ麵 〗と一 grTると考えられるような明らかな 相同 を ァミノ麵 リがなレ、ことにより ¾mできる = このようにして得られた^ ScDNAクローンとして、 例えば、 酉 播号 1、 2および 2 7力 ら適 る酉 潘号 ί ¾«ffiE ^を有する cDNAクローンをあげることができる。 The novel amino translation of the protein of the present invention can be confirmed by examining amino translation databases such as GenPept, PIR and Swiss-Prot using a homology search program such as FASTA or Framesearch. already in the scan ^ Amino noodles〗 and Amino noodles Riganare obvious homologous, such as deemed Ru one grT, can ¾m by = As the ^ ScDNA clone thus obtained, for example, a cDNA clone having a suitable roto-ban ffi «EffiE ら from rooster seed Nos. 1, 2 and 27 can be mentioned.
(4-3-2) RACE (rapid amplification ofcDNA ends)  (4-3-2) RACE (rapid amplification of cDNA ends)
本発明の蛋白質カ 現してレヽると考えられる糸職あるレ、はネ から (1-1) と同様にして cDNA を讓し、 その cDNAの両端にアダプタ一を付加し、 このアダプタ—の と (3)で得られ た cDNAクローンの塩 ¾¾P.列に某づレ、たプライマーで PCRを行う 5'-RACEおよび 3'-RACE In a manner similar to (1-1), the cDNA of the present invention is considered to be a protein, and the cDNA is substituted in the same manner as in (1-1), and adapters are added to both ends of the cDNA. Salts of the cDNA clones obtained in (3) PCR Perform PCR with primers in the row P. 5'-RACE and 3'-RACE
CMAFrohmanら； Proc. Nad. Acad. ScL USA, S5, 8998 (1988)] により、 （3)でクローン化さ れた cDNAよりも 5'端則および 3'端則の cDNAを得ることができる。 得られた cDNAの驢 酉 IJを (Φ2) と にして決定し、 この; M IJをもとにして、 得られた cDNAと (3)で得られ た cDNAクローンとをつなぎあ ることにより^ と考えられる本発明の蛋白質遺 の cDNAを ¾ί等することもできる。 Proc. Nad. Acad. ScL USA, S5, 8998 (1988)], it is possible to obtain a cDNA with a 5 'terminal rule and a 3' terminal rule than the cDNA cloned in (3). By determining the donkey IJ of the obtained cDNA as (Φ2), the obtained cDNA was linked to the cDNA clone obtained in (3) based on this M IJ ^ The cDNA of the protein of the present invention which is considered to be the same can also be used.
また、 RJのようにして麟された ^ScDNAの ^が明らカ^なつた後は、 該 cDNA の; fflE ^に基づレ、たプライマーを ¾し、 本発明の蛋白質力 現してレ、ると考えられる β あるレ、はネ から (1-1) と [^にし した cDNAあるレ、は cDNAライブラリ一 とし て、 PCR [MJMcPhersonら； PCR^ApracticalApproac Oxford University Press (1991)〕 を行うことにより目的とする本発明の蛋白質をコ一ドする DNAを聯导することができる。 また決定された DNAの; Μ ϋに基づレヽて、 DNA合膽で化学合财ることによって目的 とする本発明の蛋白質をコードする DNAを讓することもできる。  Further, after the ^ ScDNA obtained as in RJ was clearly identified, a primer based on fflE ^ of the cDNA was used to express the protein of the present invention. Β is considered to be the same as (1-1) and the cDNA converted to [^] is to be subjected to PCR [MJMcPherson et al .; PCR ^ ApracticalApproac Oxford University Press (1991)] as a cDNA library. Thus, DNA encoding the target protein of the present invention can be linked. In addition, based on the determined DNA, the DNA encoding the target protein of the present invention can be obtained by chemically synthesizing the DNA with DNA.
。^合«としては、 チ《スフアイト法を利用した島津製作所 の DNA合 Λ フォ スフオアミダイト法を利用したパ一キン 'エノ！^一 tt^ DNA合 )¾¾mo d e 1 3 9 2等をあ げることができる。  . The results are as follows: 《“Shizuzu's DNA synthesis using sulphite method パ Pakkin using the phosphoramidite method“ Eno! ^ 1 tt ^ DNA) ¾¾mode 1 3 9 2 etc.
該 DNAおよび DNA断片を用レ、て、 維あるレ、は DNA合纖により、 本発明の DNAの一 部の酉 IJを有するアン «ンス ·オリゴヌクレオチド、 センス 'オリゴヌクレオチド等のオリ ゴヌクレオチドを I ^することができる。  Using the DNA and DNA fragment, a DNA strand is used to synthesize an oligonucleotide such as an oligonucleotide and a sense oligonucleotide having a part of the rooster IJ of the DNA of the present invention using a DNA fiber. I can.
該ォリゴヌクレオチドとしては、 上記 DNAの有する 〗中の纖した 1 0〜5 0¾¾と 同じ酉 を有する DNAまたは該 DNAと な酉 リを有する DNAをあげることができ、 具 鹏には、 酉 潘号 1、 2および 2 7力ゝら選 る酉 噃号で表される iffiE^j中 した 1 0〜5 0塩某^同じ西?.列》有する DNAまたは該 DNAと W½な ^を有する DNAをあげ ることができる： W /31238 Examples of the oligonucleotide include a DNA having the same rooster as that of the fibrous 10 to 50 in the DNA contained in the DNA or a DNA having a rooster with the DNA. No. 1, 2 and 27 The rooster selected by the ゝ 噃 1 1 if fi fi fi DNA 1 有 す る DNA 有 す る 有 す る 有 す る 有 す る 有 す る 有 す る DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA Can be: W / 31238
該ォリゴヌクレオチド ίま本発明のォリゴヌクレオチドである。 The oligonucleotide is also an oligonucleotide of the present invention.
更に、 これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとしてあげること ができる。 言 ^導体 DNAとしては、 DNA中のリン酸ジエステノ ^がホスフォ口チォェ一ト ^に変換された誘導体 DNA、 DNA中のリン酸ジエステノ^^が N 3 ' — P 5 ' ホスフォア ミデート に変換された誘導体 DNA、 DNA中のリボースとリ ジエステノ がぺプチ ド に変換された誘導体 DNA、 DNA中のゥラシルが C— 5プロピニルゥラシルで纖 された誘導体 DNA、 DNA中のゥラシルが C_ 5チアゾ一ルゥラシルで纖された誘導体 DNA、 DNA中のシトシンが C— 5プロピニルシトシンで された誘導体 DNA、 DNA中の シトシンがフェノキサジン シトシン （phenoxazine-modified cytosine)で^^された誘導体 DNA、 DNA中のリボースが 2 ' — O—プロピルリボースで ¾された誘導体 DNA、 あるいは DNA中のリボースが 2 ' —メトキシエトキシリボースで された誘導体 DNA等をあげるこ とができる 学， 1β, 1463 (1997)〕 。  Furthermore, derivatives of these oligonucleotides can also be mentioned as the oligonucleotide of the present invention. Words ^ Conductive DNA: Derivatives in which diesteno phosphate in DNA is converted to phosphoric acid carbonate ^ DNA, Diesteno phosphate in DNA is converted to N 3 '-P 5' phosphoamidate Derivative DNA, Derivative DNA in which ribose and riiesteno in DNA are converted to peptides, Derivative DNA in which peracyl in DNA is fiberized with C-5 propynyl peracyl, Peracyl in DNA is C_5 thiazolyl peracyl Fiber-derivative DNA, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with C-5 propynylcytosine, derivative DNA in which cytosine in DNA is replaced with phenoxazine-modified cytosine, ribose in DNA is 2 '— O-propylribose-derived DNA, or 2'-methoxyethoxyribose-derived DNA, etc. 1β, 1463 (1997) ].
[2]本発明の蛋白質の ¾ [2] of the protein of the present invention
上記 [1〗に言 Ξ¾の 去により制辱し:^:発明の DNAを宿主細胞中で発現させるために、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)や Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38，（1987- 1997)等に言識された方法を用レヽることができる。  The above [[1] is humiliated by removing the word: ^: In order to express the DNA of the invention in host cells, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) and Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987-1997), etc., can be used.
即ち、 本発明の DNAを適当な発現べクターのプロモータ一下流に挿入し 纖えべクタ一 を作成し、 それを宿 ϋ鹏に導入することにより、 本発明の蛋白質を発現する形 激体を得 ることができる。  That is, by inserting the DNA of the present invention downstream of the promoter of an appropriate expression vector to prepare a fiber vector and introducing it into a host, a morphogen that expresses the protein of the present invention is obtained. Obtainable.
宿 としては、 m. 麵、 麵鹏、 昆 ^iraa等、 目的とする遺 βτ·を発現できるも のであればいずれも用いることができる。  Any lodging can be used as long as it can express the target βτ ·, such as m.
発現べクターとしては、 上記宿 におレ、て自 可能なレ、しは 体中^)艇が可 能で、 本発明の DNAを転写できる位置にプロモーター 有してレヽるものが用いられる。  As the expression vector, an expression vector that can be used in the above-mentioned inns, or that can be used in the body, and that has a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
糸鹏等の赚生物を宿 贿として用いる：^は、 本発明の蛋白質遺 発現べクタ一 ί源 核生物中で自立纏可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム; i^fE 本発明の DNA、 w-m & より構成され 蕭ぇベクタ一であることが好ましい： プロモーターを趟 ίρ-τ る遺 含まれてレ、てもょレ、  Using an organism such as thread as a host: ^ is a protein expression vector according to the present invention. Source is capable of self-organization in a nucleus, as well as a promoter and a ribosome; i ^ fE a DNA of the present invention; It is preferable that the vector is composed of wm & xiao ぇ vector: The promoter is 遺 ίρ-τ.
発現べクタ—としては、 例えば、 ρΚΚ233-2 (フアルマシア ft) 、 pSE280 (インビトロジェ ン卒±) 、 pGEMEX-l 〔プロメガ (Promega)tt] 、 pQE-8 (キアゲン (QIAGEN)tt) 、 pKYPIOExamples of expression vectors include ρΚΚ233-2 (Pharmacia ft), pSE280 (Invitrogen 卒, pGEMEX-l [Promega tt], pQE-8 (QIAGEN) tt, pKYPIO
(糊昭 58^110600) 、 pKYP200 [T.Nishiら； Agricultural Biological Chemistry, 4S, 669 (1984)] 、 pLSAl 〔HMiyajiら； Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕 、 pGELl [S.Sekine ら； Proc. Natl. Acad. Sd. JSA, S2, 4306ひ 985)〕 、 pBluescript Π SK (-) (ストラタジーン ft) 、 pGEX (ファノ シァ ¾h) 、 pET-3 (ノバジヱン ¾) 等を挙げることができる。 (Kishisho 58 ^ 110600), pKYP200 [T.Nishi et al .; Agricultural Biological Chemistry, 4S, 669 (1984)], pLSAl [HMiyaji et al .; Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [S Natl. Acad. Sd. JSA, S2, 4306h 985)), pBluescript Π SK (-) (Stratagene ft), pGEX (Fanosia ¾h), pET-3 (Novadin ¾), etc. Can be mentioned.
プロモータ一としては、 昜菌等の宿 中で発現できるものであ ヽかなるものでも よい。 例えば、 プロモータ一 （P^rp) 、 lac_プロモーター、 PLプロモータ一、 PRプロモ 一ター、 PSEプロモーター、 T7プロモーター等の、 昜菌ゃファー^に由来するプロモ一 ター、 S P O lプロモーター、 S P 0 2プロモーター、 pen Pプロモーター等をあげることがで きる。 また を 2つ 1 ^させたプロモーター （P^rp X S ) 、 tailプロモーター、 lacT7プロ モータ一、 let lプロモーターのように人為的に設言†¾変されたプロモーター等も用いることが できる。 The promoter may be any promoter that can be expressed in a host such as a fungus. For example, a promoter one (P ^ rp), lac_ promoter, P L promoter one, P R promoter one coater, P S E promoter, such as T7 promoter, promoter one terpolymer derived from昜菌Ya fur ^, SPO l promoter , SP02 promoter, pen P promoter and the like. Further, artificially modified promoters such as a promoter (P ^ rp XS), a tail promoter, a lacT7 promoter, an let promoter, and the like, which are obtained by combining two promoters, can also be used.
リボソーム,^ g ijとしては、 昜菌等の宿 田胞中で発現できるものであればいかなるも のでもよレヽが、 シャイン一ダルガノ （Shine-Dalgarno) 酉 E^Jと開始コドンとの間を適当な β (例えば 6〜1 8繊 に讓したプラスミツドを用いること力;好ましい。  The ribosome, ^ g ij, may be any as long as it can be expressed in the spores of the fungus, etc., but it is necessary to divide the Shine-Dalgarno rooster E ^ J and the initiation codon. Use of a suitable β (for example, 6 to 18 fibers of plasmid; preferred).
本発明の§mえべクタ一 ί レ、ては、 本発明の DNAの発現には転写 msia ^は必ずしも必要 ではなレヽが、 «ϋ¾ の srに転写 «s ijを配 ること力 子ましレ、。  In the present invention, transcription is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, and transcription sia is distributed to sr of «ϋ¾. Les ,.
原孩生物としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属、 シユードモナス属、 バチノレス属等に属する 物、 例えば、 Escherichia mliXLl-Blu Escherichia coli XL2-B1UR. Escherichia coli DHL Escherichia coli MCIOOO. Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485、 Esdierichia coli JM109、 Escherichia coli HBim . Escherichia ooli No.49. Escherichia coli W3110. Escherichia coli NY49、 Bacillus s b ilis. Bacillus amvloliquefadnRs. Brevibacterium ammoniagenes. Brevibacterium  The original organisms include those belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevipacterium, Pseudomonas, and Batinoles, such as Escherichia mliXLl-Blu Escherichia coli XL2-B1UR. Escherichia coli DHL Escherichia MC Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Esdierichia coli JM109, Escherichia coli HBim. Escherichia ooli No.49. Escherichia coli W3110. Escherichia coli NY49, Bacillus sbilis.
immariophilmn ATCC14068, Brevihart^r】m saccharolvticum ATCC14066- Corynebacterium glutamicum ATCC14067 、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Cnrvnpbartfirium glntami im ATCm.S0.S9. Corynebacterium acetoaridophilum immariophilmn ATCC14068, Brevihart ^ r) m saccharolvticum ATCC14066- Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Cnrvnpbartfirium glntami im ATCm.S0.S9. Corynebacterium acetoaridophilum
ATCC13870、 Micmhac ^rium ammoniaphilum ATCC1 等を挙げることができる 糸 えべクタ一の導入; W去としては、 上記宿 細胞へ DNAを導入する:^去であれば 、ずれ も用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 〔S. Cohenら； Proc. Natl. Acad ScL US^ £2, 2110 (1972)] 、 ァロトプラスト法 （糊昭 63-2483942) 、 エレク トロポ "ション法、 または Gene, II, 107 (1982や Molecular & General Genetics, J£S, Ulひ 979) 等を挙げることができる。 ATCC13870, Micmhac ^ rium ammoniaphilum ATCC1 and the like can be mentioned.Introduction of thread vector; DNA can be introduced into the above-mentioned host cells: Method using calcium ion [S. Cohen et al .; Proc. Natl. Acad ScL US ^ £ 2, 2110 (1972)], arotoplast method (63-2483942), electrotrophic method, or Gene, II, 107 (1982 and Molecular & General Genetics, J £ S, Ulhi 979 ) And the like.
隨菌株を宿 ±鹏として用いる には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 To use the strain as a host, use an expression vector such as YE P 13
(ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 PHS19、 pHSl5等を 用いることができる。 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051) , YCp50 (ATCC37419), can be used P HS19, pHSl5 like.
プロモーターとしては、 »菌株中で発現できるものであ ま 、ずれのものを用レヽてもよく、 例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロ ΐ~タ一、 gal lプロモーター、 gal lOプロモーター、 ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MFa l プロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。  The promoter may be any one that can be expressed in a bacterial strain, or may be one that is out of alignment. For example, a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, a gal promoter, or a gal promoter may be used. And promoters such as heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, and CUP1 promoter.
S^S困株としては、 Saocharomyces cerevisae. Schizasaccharomyces pomhe,  S ^ S strains include Saocharomyces cerevisae. Schizasaccharomyces pomhe,
Kl yveromyces lactis、 Trichosporon ullulans. Sdiwanniomyces aUuvius あけ。こと力 できる。 Klyveromyces lactis, Trichosporon ullulans. Sdiwanniomyces aUuvius. I can do it.
繊えべクターの導入方法としては、賺に DNAを導入する方法であれば 、ずれも用レ、る こと力でき、 例えば、 エレクトロポ I ^シヨン法 (DJVl.BeckerandL.Guarente； Methods. Enzymol., 124, 182 (1990)] 、 スフエロプラスト法 〔D.Shortleら； Proc. NatLAcai ScL USA SI.4889 (1984)〕 、 赚リチウム法 〔H. Itoら； Journal of Bacteriology 153， 163 (1983)〕 、 Proc. Natl. Acad. Sci. US 15, 1929 (1978)等をあげることができる。  As a method for introducing a delicate vector, if the method is to introduce DNA into the accessory, it can be used to adjust the displacement. For example, the electroporation I ^ method (DJVl. Beckerand L. Guarente; Methods. Enzymol. , 124, 182 (1990)], the spheroplast method [D. Shortle et al., Proc. NatLAcai ScL USA SI. 4889 (1984)], the lithium method [H. Ito et al., Journal of Bacteriology 153, 163 (1983)]. Natl. Acad. Sci. US 15, 1929 (1978).
田胞を宿主として用レ、る には、 発現ベクターとして、 例えば、 pAGE107 〔特開平 3- 22979 ; H. Miyajiら、 Cytotechnology, 3, 133，（1990)〕 、 pAS3-3 (欄平 2-227075) 、 pCDM8 [B. Seed； Nature, 229, 840, (1987)] 、 pcDNAI/Amp (インビトロジェンネ通 、 pREP4 (インビトロジェン¾^¾ 、 pAGE103 〔T Mizukamiら； Journal of Biochemistry, 101， 1307 (1987)] 等が用レ、られる。  To use a spore as a host, as an expression vector, for example, pAGE107 [JP-A-3-22979; H. Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 (Paragraph 2- 227075), pCDM8 [B. Seed; Nature, 229, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogenenne, pREP4 (Invitrogen ^^, pAGE103 [T Mizukami et al .; Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987) )] And so on.
ァロモーターとしては、 ft«棚包中で発現できるものであ ま'いずれも用いることができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺 β ^のプロモータ一、 SV40のネ應プロモータ一あるレ、はメタロチォネィンのブ口モーター、 レトロウィルスのプロモ 一タ一、 ヒートショックプロモータ一、 S Rひブロモータ一等をあげることができる： また、 ヒト CMVの IE遺 のェンハン ^をプロモーターと共に用いてもよレ\  Any of the promoters that can be expressed in ft «shelves can be used. For example, the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early), β ^, and the SV40 promoter One example is a metallotionin motor, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, an SR promoter, and the like. \
田胞としては、 ヒト 鹏である ルバ (Namalwa) 糸瑚包、 サルの糸 MSである COS «、 チャイニーズ'ハムスターの である CHO糸!^、 HBT5637 昭 63-299) 等をあ げることができる。 The vesicles are human 鹏, Luba (Namalwa), and monkey thread MS, COS. «, CHO thread of Chinese hamster! ^, HBT5637 (Showa 63-299).
繊えべクタ一の導入方法としては、 睡糸嶋に DNAを導入する方法であ ίΐΐ、ずれも用レ、 ることができ、 例えば、 エレクトロポ シヨン法 CHMyajiら； Cytotechnology，3, 133 (1990)] 、 リ «7ルシゥム法 （欄平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法 [P.LFelgnerら； Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4， 7413ひ 987)〕 、 Virology, 52, 456 (1973)に言 £¾の¾？縛をあげ ることができる。  As a method for introducing a delicate vector, a method for introducing DNA into Soitoshima can be used. For example, the electroposition method CHMyaji et al .; Cytotechnology, 3, 133 (1990 )], The 7-rhd method (Parahei 2-227075), the lipofection method [P.LFelgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4, 7413h 987)], and Virology, 52, 456 (1973). Say £ ¾? You can raise a bond.
昆^！^を宿主として用いる:^には、 例えば D.R O'Reillyら； Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, (1987-1997)、 VALuckow and  Kun ^! Using ^ as a host: ^ includes, for example, DR O'Reilly et al .; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987- 1997), VALuckow and
M.D.Summers； Bio Ibchnology S, 47 (1988)等に された方法によって、 蛋白質を発現する ことができる。 Proteins can be expressed by the method described in M.D. Summers; Bio Ibchnology S, 47 (1988).
即ち、 «;t¾i5i導入べクターおよびバキュ口ウィルスを昆 闹包に^^入して昆^ 培養上清中:¾§mえウイノレスを得た後、 さら えウィルスを昆 させ、 蛋白質 を発現させることができる。  That is, «; t¾i5i-introduced vector and baculo-mouth virus are put into a container and the protein is expressed in the culture supernatant: ¾§m After obtaining vinoles, the virus is further released and the protein is expressed. be able to.
言 法 ( いて用いられる遺 導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacHI (ともにインビトロジェンネ» 等をあげることができる。  Examples of the transfection vector used in the method (for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacHI (in vitro gene) and the like can be mentioned.
バキュロウィルスとしては、 例えば、 昆虫 ίΟ^Τるウィルスであるアウトグラフ ァ 'カリフォルニ力 'ヌクレア一 ·ポリへドロシス ·ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。 昆虫糸 しては. Spodoptera frugiperda の嶋齙である Sf9 、 S£21 〔D.R O myら； Baculovirus Expression Vectors, A  As the baculovirus, for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is an insect virus, such as Autographa californica nuclei polyhedrosis virus, can be used. Sf9, S £ 21 [D.R O my et al .; Baculovirus Expression Vectors, A
Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New ork (1992)] 、 nchoplusia の である High 5 (インビトロジヱン 等を用いることができる。 Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New ork (1992)], nchoplusia's High 5 (in vitro gene, etc. can be used).
糸 えウィルスを!^するための、 昆 細胞への上言 asm^fe 導入べクターと上言 くキ ュロウイノレスの ^入方法としては、 例えば、 リ ルシゥム法 平 2-227075) 、 リポ フエクショ >Ϋ去 [P.L.Felgnerら； Proc. Natl. Acad. Sd. USA M, 7413 (1987)] 等をあげるこ とができる。  The above-mentioned asm ^ fe transfection vector and kurouinoresu method to introduce keratinocytes in order to control the virus are described in, for example, Rirushimu method 2-227075), Ripofex> [PLFelgner et al .; Proc. Natl. Acad. Sd. USA M, 7413 (1987)].
遺 O¾¾ ^去としては、 に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manua Second Edition (1989)に言 E¾されてレ、る方 に準じて、 分^ S、 蛋白質発現等を行う W / 1 3 As described in Molecular Cloning, A Laboratory Manua Second Edition (1989), the expression of protein and protein is performed in accordance with the method described in E. W / 1 3
ことができる。be able to.
, 隱、鹏または昆 *j齙により発現さ wこ には、 糖あるい 付加された蛋 白質を得ること力できる。  This is expressed by 齙, 隱, 昆 or 昆 * j w, which can provide sugar or added protein.
m:のようにして得られる形 mia 体を培地 咅養し、 培 «ti中 発明の蛋白質を «蓄 積させ、 咅難カゝら ることにより、 本発明の蛋白質を ることができる。  The protein of the present invention can be obtained by culturing the mia body obtained in the manner described in m: above in a culture medium, accumulating the protein of the invention in the culture medium, and recovering the medium.
本発明 ^体を培地 咅養する方法は、 宿主の培養に用レヽられる通常の方法に従って 行うことができる。  The method of culturing the present invention in a culture medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
驄等の原核生物あるレヽ iigfWの難生物を宿主として得られた形 体を培養する 培地としては、 言姓物が資化 L る炭颜、 «¾、 » ^等 有し、 形 体の培養 を¾«に行える培地であ ま ^ t咅地、 合 咅地のレ、ずれを用レ、てもよレ、。  A culture medium for culturing a form obtained by using a prokaryote such as の iigfW, which is a difficult organism, as a host is a culture medium that contains charcoal, «¾,» ^, etc. It is a medium that can be used for any purpose.
炭 ¾¾f、としては、 言 物が資化し得るものであればよく、 グノレコース、 フラクトース、 スク ロース、 これら ½有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプ^] πτΚ^ί^の^ Wt^)、 赚、 プロピオ:/^の ¾«、 エタノール、 プロパノーノ のァノレコーノ 等が用を用いることが できる。  The charcoal ¾¾f may be any as long as the substance can be assimilated, such as gnorecose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch ^] πτΚ ^ ί ^^ Wt ^), 赚, propio: / ^, Ethanol, propanono anorecono, etc. can be used.
^^、としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 赚アンモニゥム、 アンモニゥム、 リ >mアンモニゥム等の^ «もしくは アンモニゥ Λ¾、 そ Of也 (7 ^¾¾化^)、 並 びに、 ペプトン、 肉エキス、 隨エキス、 コーンスチープリカー、 カゼィ ^¾1^^勸、 粕および細助 ΠτΚ 漱、 各 菌体、 およ の消ィ を用いることができる。  ^^, such as ammonia, ammonium chloride, ammonium, ammonium, l> m ammonium, etc. or ammonia, soya (7 ^ ¾¾ 化 ^), along with peptone, meat extract, alongside extract, Corn steep liquor, casey ^ ¾1 ^^ advice, lees and soybeans Πτ 漱 sou, each cell, and other types of bacteria can be used.
としては、 リ ^—カリウム、 リ ¾二カリウム、 リ ^グネシゥム、 »^ グネシゥム、 塩化ナトリウム、 硫^^^、 硫酸マンガン、 W、 炭酸カルシウム等を用い ることができる。  Examples thereof include lithium potassium, potassium dipotassium, potassium lignesium, »^ gnesium, sodium chloride, sulfuric acid ^^^, manganese sulfate, W, calcium carbonate, and the like.
培養は、 通^^咅養また ¾»¾^#咅*^の好^]剁牛下で行う。 培養 は 15〜 40°Cがよく、 培養 0 ^は、 通常 16〜96 B#^である。 ±咅養中 pHは 3.0~9.0に る。 pHの 雄は、 議または機の酸、 アルカリ赚、 尿素、 ルシゥム、 アンモニア等を用いて 行う。  Culture is carried out under normal ^^ 咅 culture or under ¾ »¾ ^ # 咅 * ^. The cultivation is preferably 15-40 ° C, and the cultivation 0 ^ is usually 16-96 B # ^. During fermentation pH should be 3.0 ~ 9.0. For males with a pH, the reaction is carried out using acid or alkaline, urea, calcium, ammonia, etc.
また、 培養中 要に応じて、 ァンピシリン トラサイクリン等の 物質を培地に'励口し てもよいつ  If necessary, a substance such as ampicillin tracycline may be added to the culture medium during culture.
ァロモータ—として誘導性のァロモータ一を用レ、た発現べクターで形 換しだ 物を培 養するときには、 要に応じてインデュー を培地に '励□してもよい： 例えば、 ia ァロ ΐ~ ターを用レヽた発現べクタ一で形 Κΐ ^した 物を培養するときにはィソブロピル一 β—D— チォガラクトピラノシド等を、 ブロモータ一を用レヽた発現ベクターで形 S»した敝物を 培養するときにはィンドールァクリノ を培地に してもよい。 When culturing the transformant using an inducible ferromotor or an expression vector, the indu may be added to the culture medium as necessary: for example, ia ΐ ~ When culturing a product formed using an expression vector using a promoter, cultivate a product prepared using an expression vector using a promoter such as isobromopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. In this case, the medium may be indolacrino.
議田胞を宿主として得られた形 mi^体を培養する培地としては、 ""^に細されている The culture medium for culturing the mi ^ body obtained using the spores as a host is reduced to "" ^.
RPMI1640培地 [The Journal of the American Medical Association,I22, 519 (1967)] 、 Ea^e の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)] 、 DMEM培地 [Virology, S, 396 (1959)] 、 199培 地 〔Prooeeding of the Society for the Biological Medicine, 23, 1ひ 950)〕 またはこれら培地に牛 胎 ¾k?靜を'励口した培地等を用レヽることができる。 RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, I22, 519 (1967)], Ea ^ e MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, S, 396 (1959)], 199 Culture medium [Prooeeding of the Society for Biological Medicine, 23, 1950]] or a medium in which bovine wombs are stimulated can be used for these mediums.
培養は、 通常 pH6〜8、 30〜40。C、 5 %C02據下等の^ (牛下で：！〜 7日 う。 Culture is usually at pH 6-8, 30-40. C, 5% C0 2據下such as ^ (under cow:! Intends to 7 days.
また、 培養中必要に応じて、 力 イシン、 シリン等 霞を培地に励 Dしてもよ レ、。  In addition, if necessary, a medium such as lysine or syrin may be added to the medium during the culture.
昆 ϋ田胞を宿主として得られた形 体を培養する培地としては、 ~ ^に謂されている TNM-FH培地 〔ファーミンジェン （Pharmingen) 謂 、 Sf-900II SFM培地 （ライフ .テ クノロジーズ ¾f¾ 、 ExCell400, ExCeU405 〔いずれも JRHバイ: "ィエン^ "ズ （JRH Biosciences) ¾ B 、 Grace's Insect Medium [Nature, 125, 788 (1962)] 等を用いることがで きる。  As a medium for culturing the obtained form using the corn vesicle as a host, a TNM-FH medium called “Pharmingen”, a so-called Sf-900II SFM medium (Life Technology ¾f¾) And ExCell400, ExCeU405 [both JRH Bay: “Yen ^” (JRH Biosciences)) B, Grace's Insect Medium [Nature, 125, 788 (1962)] and the like can be used.
培養、 通常 pH6〜7、 25〜30。C等の餅下で 1〜 5日 う。  Culture, usually pH 6-7, 25-30. 1-5 days under mochi such as C.
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の 物質を培地に'励 Qしてもよい。  If necessary, a substance such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
上言 sia^体の培鎌から、 上言 により発現させた蛋白質を 製するためには、 通常の瞧の輔、 精嶽を用いればよい。  In order to produce the protein expressed by the above from the sia ^ body sickle, the usual 瞧 suke and Shotake can be used.
例えば、 本発明の蛋白質が、 糸鹏内に翻狱態で発現した には、 培養終了後、 asを遠 により回収し水系 JS»蔽にけん 、 超音波破 ¾ 、 フレンチプレス、 マントンガウリ ンホモゲナイ→ ~"、 ダイノミノ により糸 ¾を破砕し、 無糸 出液を得る。 該無細繊出液 を遠' ることにより得られた上清から、 通常の赚の輕膽去、 即ち、 出法、 硫安等による塩析法、 法、 棚讓による ¾ ^法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セ ファロース、 DIAIONHPA-75 (≡ it ± ) 等レジンを用いた!^ Tオン クロマトダラ フィ一法、 S-Sepharose FF (ファノ^シァネ 等のレジンを用いた^ Tオン クロマトグ ラフィ一法、 ブチノレ ファロ一ス、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた ¾τ性クロマト グラフィ一法、 篩を用レ、たゲルろ過法、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法、 クロマト フオーカシング法、 等鬣 ¾ 泳嶋の 泳 Kr&^の雜を 虫あるレ、fぉ且み合; tて用レ、、 精 品を得ることができる。 For example, in order for the protein of the present invention to be expressed in a transgenic form in a filament, after completion of the culture, as was recovered from a distance and the aqueous system JS-screened, sonication, French press, Menton gaurine homogenase → ~ ", Thread ¾ is crushed by Dynomino to obtain a thread-free liquid. Salting out method using ammonium sulfate, etc., ¾ ^ method using a shelf, acetylethyl (DEAE)-Sepharose, DIAIONHPA-75 (≡ it ±) using resin, etc.! ^ T-on chromatographic method, S -Sepharose FF (^ T-on chromatographic method using a resin such as Fano ^ Chine, チ τ-chromatographic method using a resin such as Butinole Faros and Phenylsepharose, a gel using a sieve Filtration method, affinity mouth chromatography One method, chromatography Focusing method, etc. 鬣 Swim in the swimming island Kr & ^ can be used to obtain insects.
また、 該蛋白質が糸嶋内に 体 城して発現した ¾ ^は、 [^に を回収後破砕し、 遠' 隹を行うことにより得られた 分より、 通常の方法により該蛋白質を回収後、 該蛋 白質の 体を蛋白 ΚΜ¾ϋで可溶ィ る。 言^!溶 夜を、 蛋白難、醜を含まないあるいは 蛋白觀隨の献が蛋白質が変 しない離に希薄な鎌に機、 あるい ί«ίし、 該蛋白 質を正常な立 iW に構成さ ¾こ後、 ±12と ! I^^t®去により精^！品を得ることがで きる。  Further, ¾ ^, which was expressed as a result of expression of the protein in Itoshima, was obtained by recovering the protein by a conventional method from the amount obtained by crushing and recovering the ^ and performing distant 隹The body of the protein is soluble in the protein. The word ^! Melts into a sickle that does not contain protein difficulties or ugliness or that does not change the protein, but the protein does not change, or the protein is composed into a normal standing iW After this, ± 12 and! I ^^ t® to remove more! Goods can be obtained.
本発明の蛋白質あるレヽはその の誘導体が糸 β¾こ分泌された ¾ ^には、 培養上清 に該蛋白質あるレヽはその謹付力 0^の誘導体を回収することができる。 即ち、言 咅難を上 記と ^の 去により鍵することにより可溶圏分を取得し、 言^«14 1分か ら、 上記と [^の を用いることにより、 品を得ることができる。  In the protein of the present invention, when the derivative of the protein is secreted from the thread β, the protein in the culture supernatant can recover the derivative of the protein with a weight of 0%. In other words, by obtaining the soluble zone component by keying the word difficulty in the above and leaving ^, an article can be obtained by using the above and [^] from the word 141 minutes. .
また、 本発明の蛋白質は、 Fmoc法 （フルォレニノレメチルォキシカルボニル法） 、 tBoc法 ( t—ブチルォキシカルボ二ノレ法） 等 ( f匕学合戯によっても i ることができる。 また、 ァドバンスト ·ケムテック （Advanced ChemTfech) 社、 ノ一キン ·エノ! ^一社、 ファノ シァ 社、 プロティン.テクノロジー .ィンストウルメント （Protein Tfechnology Instrument) 社、 シ ¾セル.ベガ （Synthecell-Vega) 社、 パーセプティブ (PerSeptive) 社、 島'腹作ff ^の ぺプチド合細を禾拥し化学合 ることもできる。  The protein of the present invention can also be obtained by the Fmoc method (fluoreninolemethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarboninole method), etc. Also, Advanced ChemTfech, Nokinkin Eno! ^ 1, Fanocia, Protein Technology Instrument (Synthecell-Vega), and Protein Tfechnology Instrument. The company, PerSeptive, can also combine and combine peptides from the island's abdominal crop ff ^.
[3]本発明の蛋白 ®¾I抗体の » [3] of the protein ® I antibody of the present invention »
(1)ポリクローナル抗体の » (1) Polyclonal antibodies »
上記 [2】に言 の方法により制导した蛋白質 (^Sまたは部優片精鶴品 を 50〜 100 /gZ匹ほど、 ゥサギ、 ャギまたは 3〜20週令のラット、 マウスもしくはノヽムスターの皮下、 |» または β内に、 適当なアジュバント 〔例えば、 フロインドの完全アジュバント  The protein controlled by the method described in the above [2] (^ S or a participant was used as a subcutaneous rat, mouse, or nomster of 50 to 100 / gZ, eg, a heron, a goat, or a 3 to 20-week-old rat) , | »Or β in the appropriate adjuvant [eg Freund's complete adjuvant
(Complete Freund's Adjuvant) または、 水^ ίヒアルミニウムゲルと百日 «ワクチ 〕 と ともに投与する。  (Complete Freund's Adjuvant) Or, administer with water ^^ aluminum gel and pertussis.
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜； 10回行う。 各投与後、 3〜7日目 に^ »薦より馳し、 言她清が艘に用レ、た赚と RJ、することを §1^5測定法 赚 髓測定法 （ELISA法） ：医学纖刊 1976 ^ E.Harlow and D.Lane： Antibodies-A W 99/31 The antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. 3 ~ 7 days after each administration, it is better to recommend it from ^ », 她 を 她 ^ ^ ^ 1 1 1 ^ 赚 髓 赚 赚 赚 医学 医学 医学1976 ^ E. Harlow and D. Lane: Antibodies-A W 99/31
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)] 等で ¾ ^、する。 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)].
滅に用いた ¾ 、に対し、 言她清が充分な抗体価を示したゥサギ、 ャギ、 マウス、 ラットま たはハムスターより血清を制尋し、 言她清より、 40〜50%颇 Πβアンモニゥムによる塩圻法、 カブリル俊 去、 DEAE—セファロースカラム、 プロテイン Α—カラムあるいはゲルろ過力 ラム等を用レヽたクロマト' ¾ ^の常法を用レヽて精 $¾ΐ体を することができる。  In contrast, the serum used in rabbits, goats, mice, rats, or hamsters showed sufficient antibody titers against the serum used for destruction. Purification can be carried out using a conventional method of chromatography using ammonium salt, cabril removal, DEAE-Sepharose column, protein column or gel filtration column.
(2)モノク口—ナル抗体の讓 (2) Monoclonal antibodies
(2-職体 の讓  (2-Proposal
上 |¾1)ί レ、て、 無に用いた に対し、 その血清が +^な抗体価を示したラットを抗体 として る。  Above | ¾1) ラ ッ ト て ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト に 対 し ラ ッ ト に 対 し ラ ッ ト に 対 し に 対 し ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト ラ ッ ト に 対 し に 対 し に 対 し に 対 し に 対 し に 対 し 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 血清 に 対 し 血清 血清 に 対 し.
言紙体価を示したラットに ¾¾¾物質を最½¾与した後 3〜 7日目に、 3幢を摘出する。  Three to seven days after the administration of the substance to the rat showing the pharmacokinetic value, three guinea pigs are removed.
言刻? I を ΜΕΜί咅地 (B7 m± )中で細断し、 ピ^ットでほぐし、 1， 200 r pm で 5 ^¾1' «した後、 上清を捨てる。  Cut the word I in the ground (B7 m ±), loosen it with a pit, remove it at 1,200 rpm for 5 ^ ¾1 ', and discard the supernatant.
得られた 分の脾糸 をトリス一塩化ァンモニゥム Hit腋 (ρΗ7. 65) で:!〜 2分 間艇し赤«を した後、 ΜΕΜί咅地で 3回洗浄し、 得られた腌細胞を抗体 ¾¾鹏とし て用いる。  The resulting amount of spleen was washed with Tris ammonium chloride Hit axilla (ρΗ7.65):! ~ 2 minutes, reddish, washed three times in the ground, and the obtained 腌 cells Used as ¾¾ 鹏.
(2-2) Hffl«の譲  (2-2) Transfer of Hffl «
髓動 としては、 マウスまたはラットから取得した を する。 たとえば、 8- ァザグァニン ΗΦ ウス （BALB/c由来) ¾S B»P3-X63Ag8-Ul (以下、 P 3— U 1と略 [Curr.TbpicsMiciObiol.Immunol.,ai, 1 (1978)] 、 [Europ.J.Immunol.， 511ひ 976)] 、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 226, 269ひ 978)] 、 P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunol, 123, 1548(1979)] 、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256， 495ひ 975)] 等を用いることができる。 これ ら fflKは、 8—ァザグァニ 咅地 〔RPMI— 1640培地にグルタミン （1. 5mM) 、 2_メルカブトエタノ一ノレ （5X 10—5M) 、 ジェンタマイシン （l O gZml) およ 胎¾&清 (FCS) (CSL確、 10%) を加えた培地 （以下、 正常培地という） に、 さら に 8—ァザグァニン （15//gZml) を力 []えた培 ¾) で糸 tTる力;、 糸 の 3〜4日前 に正常培地で培養し、 I ^には言 ¾；田胞を 2 X 107個 R fflレ、る。 As a medullary movement, a mouse or rat is used. For example, 8-azaguanine ΗΦ us (derived from BALB / c) ¾S B »P3-X63Ag8-Ul (hereinafter abbreviated as P 3—U 1 [Curr.TbpicsMiciObiol.Immunol., Ai, 1 (1978)], [Europ. J. Immunol., 511 976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 226, 269 978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol, 123, 1548 (1979) )], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495, 975)] and the like. These fflK is glutamine, 8 Azaguani咅地[RPMI-1640 medium (1. 5 mM), 2_ Merukabutoetano one Honoré (5X 10- 5 M), gentamicin (l O gZml) Oyo womb ¾ & Kiyoshi A medium containing (FCS) (CSL sure, 10%) (hereinafter referred to as a normal medium), and a thread that has been subjected to 8-azaguanine (15 // gZml) and a medium []]. Culture 3 to 4 days before in a normal medium, I ^ 言; 2 × 10 7 spores Rffl.
(2-3)ハイプリ ドーマの  (2-3) Hypri-Dorma
(2-1)で制辱した抗体 ¾¾M包と (2-2)で取得した を ME i咅地または P B S (リン 酸ニナトリウム 1. 83g、 リ / カリウム 0. 21 g、 ：¾¾7. 65g、 蒸留水 1リット ノレ、 pH7. 2) でよく辭し、 糸 ffl«^、 抗体 :fl¾MS=5〜l 0： 1になる よう混合し、 1, 200 r pmで 5 ¾¾1'1 ^|した後、 上清を捨てる。 Antibodies ¾¾M insulted in (2-1) ¾¾M and 2-2M obtained in (2-2) were added to ME i ground or PBS (1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of lithium / potassium, ¾¾7.65 g, 1 liter of distilled water No., mix well at pH 7.2), mix the threads ffl «^, antibody: fl¾MS = 5 ~ l 0: 1, make 5¾¾1'1 ^ | at 1,200 rpm, and then discard the supernatant throw away.
得られた 分の糸 をよくほぐし、 に、 辦しながら、 37°Cで、 108抗 体 豳あたり、 ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド （DM SO) 0. 7mlを混合した灘を 0. 2〜lml ¾¾)Πし、 更に：！〜 2分間毎に ΜΕΜί咅地 1〜 2 m 1を数回 '励する。  At 37 ° C, while unraveling the obtained thread, carefully and at 37 ° C, 2 g of polyethylene glycol 1000 (PEG-1000), 2 g of MEM, 2 ml of MEM and dimethyl sulfoxide (DMSO) per 108 antibodies per day. 0.2 ~ lml 灘) Π with 7ml mixed nada, and more! ~ 2 minutes every 2 minutes 1 ~ 2 m 1 'encourage.
励啦、 MEMJ:咅地を加えて^ ft^5 Om 1になるように讓する。  Encouragement, MEMJ: Add the ground and make it so that it becomes ^ ft ^ 5 Om 1.
を 900 r pmで 5^fB¾I'l «、 上清を捨てる。 At 900 rpm 5 ^ f B ¾I'l «, discard the supernatant.
得られた «画分の糸 ¾を、 ゆる 4こほぐした後、 メスピペットによる吸 、 吹出しで ゆる^^に HAT培地 〔正常培地にヒポキサンチン （10— 4M) 、 チミジン （1. 5 X 10"5 M) およひアミノプテリン （4X 10-7M) をカ卩えた培 ±ta 100ml中に » る。 After the obtained «fraction thread ¾, was loose 4 Kohogushi, absorption by measuring pipette, loose hypoxanthine HAT medium [normal medium ^^ with balloon (10- 4 M), thymidine (1. 5 X 10 "Ru 5 M) Oyohi aminopterin (4X 10- 7 M)» in the culture ± ta 100ml of example mosquitoes卩a.
言雄源夜を 96 咅養用プ!^卜に 100 1 Z穴ず 注し、 5%C02インキュベータ —中、 37 °Cで 7〜 14日『 咅養する。 Gen'yugen night 96咅養for-flops ^ me dispensed not a 100 1 Z hole, 5% C0 2 incubator - in, to "咅養7-14 days at 37 ° C.
培 «¾、 ±咅養上清の をとりァンチボディィズ [Antibodies, A Laboratoiy manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Chapterl4(1988)) 等に述べられてレ、る 測定法により、 老 ィ 啷 片ポリぺプチドに特異的に反応するノ 'ブリドーマ ¾する。  As described in Antibodies, A Laboratoiy manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Chapterl4 (1988), etc. A specifically reactive hybridoma.
^^測定法の具 として、 以下の方法をあげることができる。  ^^ The following methods can be cited as tools for measurement.
の際、 、に用いた本発明の蛋白質の ^または部 W^^品を適当なプ 卜に コ一トし、 ノ^ブリドーマ培養上清もしく の (2-4)で得られる ^^体を第一抗体として させ、 さらに第二抗体としてピオチン、 »、 化«»@あるい 謝匕^^で標 識した抗ラットイムノグロブリ 体を させた後に S ®に応じた を行なレ、、 本発 明の蛋白質に特勸に するものを本発明の蛋白質に るモノクローナル抗体を^ rる ノ^ブリドーマとして顧する。  At this time, the ^ or part W ^ ^ product of the protein of the present invention used in Example 1 was coated on a suitable plate, and the ^^ body obtained from the hybridoma culture supernatant or (2-4) As a first antibody, and then, as a second antibody, an anti-rat immunoglobulin labeled with biotin, », or« » Those advocated for the protein of the present invention are referred to as monoclonal antibodies using the monoclonal antibody of the protein of the present invention.
該ノ プリドーマを用いて、 限界職法によりクローユングを 2 り返し 〔1回目は、 H T培地 （HAT培聯らァミノブテリンを除レヽた培 ¾) 、 2回目は、 正常培地を難する〕 、 安定して強レ^ [体価の認められたものを本発明の蛋白質に *Η "るモノクローナル抗体を るノ プリドーマ株として舰する。  Using the nopridoma, cloing was repeated twice by the marginal method (first time: HT medium (culture medium except aminobuterin except HAT culture medium), second time: normal medium was difficult), and stable The protein whose titer is recognized is referred to as a Nopridoma strain that contains a monoclonal antibody which is a protein of the present invention.
(2-4)モノクローナル抗体の  (2-4) monoclonal antibody
アリスタン処理 〔2, 6, 10， 14ーテトラメチ ンタデカン （P r i s t a n e) 0. W 99/31238 Aristane treatment [2,6,10,14-tetramethintadecane (Pristane) 0. W 99/31238
5 m lを腹！^ ¾与し、 2週間 する〕 した 8〜 1 0週令のマウスまたはヌ一ドマウスに、Belly 5 ml! ^ Give 2 weeks) to 8-10 week old mice or nude mice,
(2-3)で ¾mした本発明の蛋白質に るモノクローナル抗体を^ るノ ^プリドーマ糸嶋 5A monoclonal antibody against the protein of the present invention, which was obtained in (2-3), was conjugated to a monoclonal antibody.
〜20 X 1 06糸 匹を緩内に ai る。 1 0-2 1日間でソ プリドーマ ί»Κ癌ィは る。 ~ 20 X 10 6 ai are gently inserted. 1 0-2 Sopridoma in one day.
匕したマウスカ 縣を撤し、 3, 0 0 0 r P mで 5分 して固形分を [^する。 Tesshi the spoon was Mausuka Agata, 3, 0 0 0 r P a solid content of 5 minutes to at m [^ to.
得られた上清を、 4 0〜5 0% «^ァンモニゥムにょる塩析法、 カプリ ^法
Figure imgf000026_0001
、 D AE—セ ファロースカラム、 プロテイン A—カラムあるいはセル口ファイン GSL2000 (生化学ェ 土 ) を用いたカラムクロマト ¾ ^を用いて、 I g Gあるレ、は I gM 分 め、 モノクロ ーナノレ抗体として する。 The obtained supernatant is subjected to salting out by 40 ~ 50% «^
Figure imgf000026_0001
Chromatography using DAE-Sepharose column, Protein A-column, or column chromatography using Cell mouth Fine GSL2000 (Biochemical Chemistry Earth). I do.
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノ クローナル抗体タイピングキットを用レ、て行う。 蛋白質量は、 口一リー法あるレ、は 2 8 0 nm での吸 より算出する。  The subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit. The protein content is calculated by the absorbance at 280 nm.
[4] 本発明の DNA、 蛋白 た ί¾ΐ体の利用 [4] Use of DNA or protein of the present invention
本発明の DNAは、 これをプローブとして用いて、 ヒト ヒト由来の糸«から [1〗（1-1) と (^にして抽出した RNAにつレ、てノ一ザンブロットノ ブリダイゼーションを行うことによ り、 その における本発明の蛋白質遺 の mE Aを検出あるレヽは定; frTることがで きる。 各種 (^職でその mRNA を赚することにより本発明の蛋白質の糸職発現分布 を知ることができる。  The DNA of the present invention can be obtained by performing Northern blot hybridization on RNA extracted as [1 糸 (1-1) and (^) from human-derived yarn using this as a probe. In this case, the level of detection of the mEA of the protein of the present invention can be determined; frT can be determined. Can be.
また、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 本発明の DNAの特異的プライマ一として用いて、 ヒト (¾§»>ヒト由 から [1] (1-1) と I ^にして抽出した RNAにつレヽて RT-PCRを行 うことによっても mRNAの検 ¾ϋ量を行うことができる。 本発明の DNAあるレ、 亥 DNAの~¾の；^ S IJと同じ;^ SS?i〗または相補的な^ ^ リを有するオリゴヌクレオチドは、 これをプローブとして用いて、 ヒト 片に対して in situハイプリダイゼーシヨンを行う ことにより、 での本発明の蛋白質 の特定等のより細かレ 現分布を知ること ができる。  In addition, the oligonucleotide of the present invention is used as a specific primer of the DNA of the present invention to reduce RNA extracted from human ([1] (1-1) and I ^ from human). The mRNA of the present invention can also be detected by RT-PCR using the same DNA as that of the present invention; By using this as a probe and performing in situ hybridization on human fragments, it is possible to know a finer distribution of the oligonucleotide of the present invention, such as identification of the protein of the present invention. Can be.
これらの方法によって得られる、 本発明の蛋白質がどのような で発現してレ、るか
Figure imgf000027_0001
trるかとレ、う†t¾は、What kind of expression of the protein of the present invention can be obtained by these methods
Figure imgf000027_0001
tr or と t¾
VEGF-KDR系の f翻 ¾i ^冓 こ役立つ。 VEGF-KDR series f translation ¾i ^
また、 本発明のオリゴヌクレオチド （R AZDNA) は、 本発明の蛋白質遺 の転写もし くは mRNAの麵を猶 IJすることにより 〔村上；化学、 46, 681ひ 991)、 P.S遍 er； Bio Ifechnology, 2, 358 (1992)]、 VEGF-KDR系の'麵 ¾ό養 ijされると考えられること力 ら、 増殖、 |¾形 慢 ¾raリュウマチ ί ける 炎、 糖尿病 ffiM£、 » MI^M、 乾鮮等の異常な血 ff生により病態 進 i? る疾砉、を治療に謂できる。  In addition, the oligonucleotide (RAZDNA) of the present invention can be used by tranferring the transcription or mRNA of the protein of the present invention (Murakami; Chemistry, 46, 681 991), PS Universal, Bio Ifechnology. , 2, 358 (1992)], which is thought to be a potential source of VEGF-KDR 麵 麵 ¾ό ¾ό ij 増 殖 増 殖 増 殖 増 殖 増 殖 増 殖 リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュ リ ュIt is possible to treat diseases that progress due to abnormal blood such as fresh blood.
さらに、 本発明の DNAを用レヽ、 [2]言凍の方法により本発明の蛋白質を することができ る。  Furthermore, the protein of the present invention can be obtained by using the DNA of the present invention and [2] the method of freezing.
本発明の蛋白質または DNAを用レヽて、 KDRの糸 内ドメィンと本発明の蛋白質の結合を阻 害する のスクリ一ニングを行うことができる。 例えば、 [1] (1-1) で取得した KDRの細胞 內ドメィンの cDNAを用レ、て、 [2] 言 ¾feの方法により KDRの糸 ffl^内ドメィン蛋白質を »し、 本発明の蛋白質と KDR糸嶋内ドメイン蛋白質を in vitroで?！^後、 ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を行い、 好量の上昇し を検出する。 この系に たレ靈を動卩し、 の量を しなレ、： ^と]:附ることにより、 ：の量を させるような^且 を スクリ一二ングできる。 あるレヽ ί鉢発明の蛋白質遺ィ のクローニングに用レヽた麵ツー/^ ブリッド¾«系で、 cDNAライブラリ一のかわりに、 得られた本発明の蛋白質遺 の cDNA クローン （転^ 3¾{匕ドメインと本発明の蛋白質との ΐ ^蛋白貧発現プラスミド） で蒙を形 しリボータ Htfeiの転写量を見る系に、 たレ靈を劂口し、 リボータ "¾ の 転写量を励 Qしなレ、 と):附ることにより ¾ ^^の量を齢させるような;^且害滅を スクリ一ユングできる。 このような^且害 は VEGF-KDR系の fff^Slを 片ると考 えられることから、 固形 殖、 聿 形 リュウマチにおける 炎、 糖尿病 msm, ^m , 乾^異常な血 生により病態 進 i る疾 を治療に でき る。  Using the protein or DNA of the present invention, screening for inhibiting the binding of the KDR intradomain to the protein of the present invention can be performed. For example, [1] use the cDNA of the KDR cell domain obtained in (1-1), and [2] use the method of language to select the domain protein in the ffl ^ of the KDR thread and use the protein of the present invention. And KDR Itoshima domain proteins in vitro? After that, polyacrylamide gel electrophoresis is performed to detect a rise in the amount. By adding to the system, you can screen for the amount of: by adding the following: In a two- / two-brid system used for cloning the protein of the present invention, instead of a cDNA library, a cDNA clone of the obtained protein of the present invention (inverted domain) And a protein of the present invention (プ ラ ス ミ ド ^ protein poor expression plasmid) to form a system to monitor the transcription level of Ribota Htfei. And): The amount of ¾ ^^ can be aged by adding it, and it is possible to screen for destruction, and such destruction is considered to include fff ^ Sl of VEGF-KDR system. Therefore, it can be used to treat diseases that progress due to solid culture, inflammation in masticatory rheumatism, diabetes mellitus msm, ^ m, and dry abnormal blood.
また、 本発明の蛋白質を として用い、 [3] 言識の方法により本発明の蛋白質に财る抗 体を^^ることができる。  Also, using the protein of the present invention as an antibody, an antibody against the protein of the present invention can be obtained by the method of [3] language.
本発明の蛋白質に ¾- る抗体を用いて、 本発明の蛋白質を検出することができる。 具 に はマイクロタイタ一ブレートを用レヽる ELISA法、 去による細避 The protein of the present invention can be detected by using an antibody against the protein of the present invention. ELISA method using microtiter plate for tool, avoidance by leaving
¾fe、 ゥエスタンブロット'^を用レ、た検出法をあげることができる c また、 本発明の蛋白質に财る抗体の中で、 本発明の蛋白質と KDRの齢を阻害する抗体 や、 本発明の蛋白質と本発明の蛋白質 W†fTOi ^との相互作用を阻害する抗^ {ま VEGF-KDR系の を阻害すると考えられるので、 このような抗体を投与することによ り、 固形月 ®¾c職、 »形成、 littMfiリュウマチ ( ける ¾if^、 糖尿病 t4 S^S、 规 乾鮮等異常な血！ ^生により病態 進 ίΤΤる疾害、を治 »ることができる。 図面の簡職説明 ¾fe, © es tan blot '^ it is possible to increase Yore, was detection method c Further, among the antibodies according to the protein of the present invention, an antibody that inhibits the age of the protein of the present invention and KDR, and an antibody that inhibits the interaction between the protein of the present invention and the protein of the present invention, WTOfTOi ^. It is thought that VEGF-KDR system is inhibited, so administration of such an antibody will result in solid phase ® 月 c occupation, »formation, littMfi rheumatism (け る ^ if ^, diabetes t4 S ^ S, 乾 dry). Abnormal blood, etc. ^ It is possible to cure illness that progresses due to raw disease.
第 1図は、 KDRの cDNAクローン pBluescriptn KDR、 KDRの糸 MS内ドメィン½1？ッ —ノ ブリッド法用のプラスミド pAS-KDRの ί樓法、 およびツー/ ブリッド法に用いたプ ラスミド pAS-KDRと cDNAライブラリ一の «itを である。  Figure 1 shows the KDR cDNA clone pBluescriptn KDR, KDR thread Domain 1 in MS? The plasmid pAS-KDR for the no-brid method and the plasmid pAS-KDR and the cDNA library used for the two / brid method were used.
第 2図は、 KDRリセプタ H ^蛋白質 DNA1のヒト «^ ける発現分布を るため のノ一ザンブロッ卜の結果を¾¾"| 1]である。  FIG. 2 shows the results of a northern blot for the distribution of the expression of the KDR receptor H ^ protein DNA1 in humans.
第 3図は、 KDRリセプタ 蛋白質 DNA2のヒト^ ける発 ¾^布を調べるため のノ一ザンブロッ卜の結果を である。  FIG. 3 shows the results of a Northern blot for investigating the distribution of KDR receptor protein DNA2 in humans.
第 4図は、 K868M変異型 KDR cDNAプラスミド pBluescriptH KDR M-2のィ 去を^ 図である。  FIG. 4 is a diagram showing the deletion of the K868M mutant KDR cDNA plasmid pBluescriptH KDR M-2.
第 5図は、 プラスミドクロ一 #37と野; ¾ KDR (pAS-KDR) あるいは T^r変異型 KDR とを用いたツーノ^ブリッド 結果、 出現した形 コロニーを ^ Ilである。  FIG. 5 shows the result of a tuno-brid using plasmid clone # 37 and; KDR (pAS-KDR) or T ^ r mutant KDR.
第 6図は、 プラスミドクロー #2と野^ MKDR (pAS-KDR) あるいは T^r変異型 KDRと を用 ヽたッ一ノ ブリッド? 結果、 出現した开^ ^コ口ニーを^ τΠΙである。 発明を実施するための最良の形態  Fig. 6 shows the use of plasmid clone # 2 and wild-type MKDR (pAS-KDR) or T ^ r mutant KDR. . BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明の魏例を  Hereinafter, the Wei example of the present invention will be described.
瞧例 1〕 ッ一ノ、ィブリッド法による、 KDRの糸 MS内ドメインと する のスクリ一 ニング  瞧 Example 1) Screening of KDR yarn as domain in MS by the Ibrino and hybrid method
( 1 ) KDR 内ドメィン¾^¾ッ一ノ ブリッド法ブラスミドのィ徵  (1) Domains in the KDR domain
まず、 KDRの cDNAを単離するため、 Bruce L Tbnnan博士 (American Cyanamid ¾) 力 ^された KDRcDNA [B.I.Tfermanら； Biochem.Biophys. Res. Commun., IS2, 1579 (1992)] の 0.7kbの断片 （上言 £1侖文の cDNAの 5'端から ΗώάΠΙサイ卜までに相当） をブロー ブとして、 プラークノ ブリダィゼーシヨンによりヒト月继 cDNAライブラリ一 OVL Shibuya ら； On∞gene， 5, 519 (1990)] をスクリ一二ング L† スクリ一ニングの具励方法は First, in order to isolate KDR cDNA, a 0.7 kb fragment of KDR cDNA [BITferman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., IS2, 1579 (1992)], Dr. Bruce L. Tbnnan (American Cyanamid ¾) (Equivalent to 5 'end of cDNA of above £ 1 Lunmun to ΗώάΠΙ site) Screening of human 继 cDNA library OVL Shibuya et al .; On∞gene, 5, 519 (1990)] using plaquenobridation.
W.D.Bentonと R.W.Davis の方法 [Science, 126, 180 (1977)] に従っ スクリーニングの結 果、 約 2.7kbの KDRcDNAのクローンが^!され cDNAクロ一ンをライブラリーのクロ —ニングサイトである制 pgg^EcoR [で切断し、 約 2.7kbの cDNA部分を^ H、 この cDNA 断片を制 W Eamffl (この cDNA断片の 3'端のすぐ近くに BamHIサイトカ' 在する。 ) でさらに麵し職し こ 2.7kb の cDNA断片をべクタ ~T>Bluesoipt n SK (ストラタ ジーン tt) の EmRI/ amHIサイト間に挿入し As a result of screening according to the method of WDBenton and RWDavis [Science, 126, 180 (1977)], a clone of approximately 2.7 kb KDR cDNA is ^ !, and the cDNA clone is used as a library cloning site. After digestion with pgg ^ EcoR [approximately 2.7 kb of the cDNA portion to ^ H, this cDNA fragment was further excised with W Eamffl (a BamHI site located immediately adjacent to the 3 'end of this cDNA fragment). Insert the 2.7 kb cDNA fragment between the EmRI / amHI sites of the vector ~ T> Bluesoipt n SK (Stratagene tt).
cDNAライブラリーから得られた KDRcDNAは、 BamHIサイト < f立動ゝらみて赚翻 域の直後までしかなく、 糸鹏内ドメインに相当する部分がほとんどないものだったので、 cDNA 中の BamHIサイトよりも 3惻«分を RT-PCRにより ^t ることにし ヒト月继  Since the KDR cDNA obtained from the cDNA library was located only immediately after the BamHI site <f ゝ 赚 部分 鹏 鹏 鹏 、 、 、 、 、 、 、 、 ほ と ん ど ほ と ん ど 部分. We also decided to ^ t three parts by RT-PCR.
mENA (M. Shibuyaら； On∞gene, 5， 519 (1990)] から DM.Glover and B.D. Hames ； DNA Cloning 1, A Practical Approach, Core Tfechniques, Second Edition (1995) に言 B¾の方法 に基づき、 ランダムプライマーを用いて cDNAを合成し この cDNAを铸型として、 すでに 酷されている KDRcDNAの;^ ¾ リ [Genbank accession No. X61656, B.I. rmanら； Biochem.Biophys. Res. Commun., 127, 1579 (1992)〕 を基にしてプライマー 1〜 8
Figure imgf000029_0001
をそれぞ； 潘号 7〜： 14 示した） を合成し、 (A) プライマ一 1とプライマ一 6で^:、後、 を翻にしてプライマ一 2とプライマー 5で 、 (Β) プライマー 3とプライマー 8 で 後、 S ^夜 ¾ ^にしてプライマー 4とプライマー 7で の 2組のプライマ一 (¾且み 合: で nestedPCR [M.J.MacPhersonら； PCR A Practical ApproachJRL Press mENA (M. Shibuya et al .; On∞gene, 5, 519 (1990)) from DM.Glover and BD Hames; DNA Cloning 1, A Practical Approach, Core Tfechniques, Second Edition (1995) Synthesize cDNA using random primers and use this cDNA as type の for KDR cDNA that has already been severely damaged. [Genbank accession No. X61656, BI rman et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 1579 (1992)) based on primers 1-8
Figure imgf000029_0001
(A) Primer 1 and Primer 6 ^ :, then reverse and turn Primer 2 and Primer 5 and (Β) Primer 3 And primer 8 followed by S ^ night ¾ ^ and two primers with primer 4 and primer 7 (¾ 和合: in nestedPCR [MJMacPherson et al .; PCR A Practical ApproachJRL Press
(1991)〕 を行い DRcDNA ¾rt 幅し  (1991)].
(A) で增幅する断片は 810bpであり、 この断片の ¾S IJ中には 5'端の近くに BamHIサ ィト、 3'端 くに サイトが するので、 畐 DNAを制gi^EamHIおよび で切断し約 740bpの DNA断片を職し (B) で墻畐する断片は 1059bpであり、 3¾¾に はプライマ一 7由 5fe ) haIサイ卜が する。 またこの断片の ί^Ξ^中には 5'端の近くに ΔΪΕΙサイトカ^ ¾するので、 制 IW^Aialおよび halで働し、 約 990bpの断片を戦佳し ナ 上記で ί懐した 2.7kbの KDR cDNA断片を pBluescript Π SKにサブクローニングしたプ ラスミドを BamHIと Xhalで切断し、 （A) の amHI-^al断片と、 （B) の^ al-Xhal断 片とともにライゲ一ション を行レヽ、 pBluescnpt n SKに KDRcDNAの カ 入された プラスミド pBluescriptn KDRを難した 1図） c The fragment to be amplified in (A) is 810 bp, and since the BamHI site is located near the 5 'end and the site is located at the 3' end in the SIJ of this fragment, the DNA is cut with gi ^ EamHI and The DNA fragment of about 740 bp is used, and the fragment that flank in (B) is 1059 bp, and the primer is 7 由 5fe) haI site in 3¾¾. In addition, during the ¾ ^ Ξ ^ of this fragment, ΔΪΕΙ cytoca ^ 近 く near the 5 'end works in IW ^ Aial and hal, and a fragment of about 990bp is recovered. The plasmid obtained by subcloning the KDR cDNA fragment of pBluescriptΠSK into pBluescriptΠSK was cut with BamHI and Xhal, and ligation was performed with the amHI- ^ al fragment of (A) and the ^ al-Xhal fragment of (B). pBluescnpt n SK with KDR cDNA Plasmid pBluescriptn KDR was difficult 1) c )
尚、 第 1図中の記号が表 i ¾〖¾rf o lりである。  The symbols in FIG. 1 are Table i ¾ 〖¾rf o l.
π ：制！^^ Hindiサイト  π: System! ^^ Hindi site
A ：制 IW^ サイト  A: IW ^ site
H ：制 IW^Hi dinサイト  H: System IW ^ Hi din site
B ：制 IW^EamHIサイト  B: System IW ^ EamHI site
E ：制 W^ ECQRIサイト  E: System W ^ ECQRI site
X ：制I^¾XhaIサイト  X: Site I ^ ¾XhaI site
S ： イト  S: Light
Bg ：
Figure imgf000030_0001
サイト Bg:
Figure imgf000030_0001
site
Xh ：制 PS« hQlサイト  Xh: System PS «hQl site
TM ： KDR の鶴  TM: KDR crane
：プライマ一 KDR-2 によって行った 入を表わす。  : Primer: Represents the entry made by KDR-2.
2 μοή ：瞻 2μ爾始点  2 μοή: Cheom 2μ 爾 starting point
TRP1 ：瞻トリブトファン合脇遺ィ  TRP1: Cheom Tribute Fan Aside
a : £1ファージ (7^ ¾台点 a : £ 1 phage (7 ^ ¾ point
CYH2 ：酵母シク口へキシミド耐■ffiliSi  CYH2: キ シ ffiliSi resistant to yeast
P ：麵アルコーノ ヒドロ^ t遺 ^プロモーター  P: 麵 Arcono hydro ^ t remains ^ promoter
GAL4BD ： GAL4遺 の DNA ^ドメイン  GAL4BD: DNA ^ domain of GAL4
GAL4AD : »GAL4遺^ "の転^ gftf匕ドメイン  GAL4AD: »GAL4 remains ^
KDRC ： KDR cDNAの糸 内ドメィン 片  KDRC: KDR cDNA thread domain fragment
TADH:L ： «アルコ—ノげ、ヒドロ ゼ遺 ターミネーター  TADH: L: «Arco-noge, hydroze terminator
ColEl ori ： 驢コリシン E1因子 始点  ColEl ori: asshole colicin E1 factor start point
Ampr ：ァンピシリン耐 14¾^?· Amp r : Ampicillin resistance 14¾ ^? ·
得られた KDRcDNAの JME^Jを、 'ォキシ法により決定したところ、 » [B.I.Tbrman ら； Biochem.Biophys. Res. Commun., 1S2, 1579 (1992)] の塩薪列と i |¾して、 （ 1 ) 不明 であった N末の 2アミノ酸は Mel^ATG) 、 Gln2(CAG)であり、 272bp の 5' "或 んでい ( 2) 6ケ所の IJが異なっているため、 アミノ翻 IJも 6ケ所異なってい すなわち、 Val297(QTA)→He(ATA)、 Thr7'72(ACG)— Ala(QCG)、 Gly787(QGG) -→ Arg(CGG)、 Asn835(AAQ →I^s(AAG)、 Glu848(GAG)→Val(GTG), Thr134 (ACG)-→ SerCTCG)の 6ケ所である [S.Sawanoら； Cell Growth & DiffercntiationJ, 213 (1996)〕 。 な お、 この変異により、 （B) の増 ||1離片中に一ヶ所 Aii lサイトができるが、 pBluescripffl KDR 際に挿入した^ al-Xhal断片ではこの サイトは切断されてレ、なかつ The JME ^ J of the obtained KDR cDNA was determined by the 'oxy method, and was determined as follows: »[BITbrman et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun., 1S2, 1579 (1992)] (1) The unknown two amino acids at the N-terminus are Mel ^ ATG) and Gln 2 (CAG), and the 272 bp 5 '"amino acid. That is not different than 6 places, Val 297 (QTA) → He (ATA), Thr 7 '72 (ACG) - Ala (QCG), Gly 787 (QGG) - → Arg (CGG), Asn 835 (AAQ → I ^ s (AAG), Glu 848 (GAG) → Val (GTG), Thr 134 (ACG)-→ SerCTCG) [S. Sawano et al .; Cell Growth & DiffercntiationJ, 213 (1996)]. In addition, this mutation creates one Aii l site in the fragment of the (B) increase || 1 fragment, but this site is cleaved by the ^ al-Xhal fragment inserted during pBluescripffl KDR.
このようにして得られた KDR cDNAクローン pBluescriptn KDRを制限 S^EamHIおよ び Xhal i:«し、 糸 内ドメインをコードしている部分^^む 1.7kbの断片を^!し この EamHI-Xhal断片を、 ベクタ" pUC118 (¾¾造翻 の E mHlXSbalサイト間にサブクロ —ニングし、 プラスミド pUC-KDRCを作製した。  Restriction of the thus obtained KDR cDNA clone pBluescriptn KDR S ^ EamHI and Xhal i: 、, and a 1.7 kb fragment containing the region encoding the domain within the thread ^! The fragment was subcloned between the vector "pUC118 (EmHlXSbal site of ¾¾ 造 翻翻) to generate plasmid pUC-KDRC.
後で述べるツーノ^ブリッ クタ一に導入したとき、 ¾^蛋白のフ^""ムを合 ¾：る ため、 このプラスミド pUC-KDRCに対して、 変 ¾¾Affiプライマ一 KDR-2 (塩 列 P列 番号 15 ί し^ ) を用いて、 Kunkelの方法 (Proc. NatL Acad. Sd. USA, S2, 488 (1985)) に基づレ、て 立特異 然変 入を行レヽ、 サブクローニングした KDR断片の； BamHIサイ トの直後〖；^ SCを 1個導入し この改変型 pUC-KDRCを制 W^EamHIおよび Sailで 切断し、 «した KDR cDNA断片約 1.7kbを職し この EamHI-Sall断片をク口ーンテ ック社のツーノヽイブリッド¾<7 クタ ~pAS2-lの EamHI/Sallサイト間にサブクローニング し、 プラスミド pAS2-KDRをィ樓し PAS2-KDR ί!«マーカ一としてトリプトファン合 ィ S^TRPlを有し、 赚 Saocharomyoes o revisiae のァノレコー Λ ^、ヒドロ ^^"^ゼ遺伝 子 ADHのプロモーターを麵して、 転写 卸因子である GAL4の DNA；1¾^ドメインと KDR の糸 ¾内ドメインと力 ¾ ^蛋白 (^で発現される申 ffi をもつプラスミドである。 When introduced into the Tuno-Bricka described later, the plasmid pUC-KDRC is transformed into the Affi-primer KDR-2 (salt sequence P No. 15 ί ^)) K K K K K K K K K K K K K K K 番号 K 番号 Pro Pro 番号 15 15 15 番号 番号 番号 15 Immediately after the BamHI site 〖; ^ Introduce one SC; cut this modified pUC-KDRC with W ^ EamHI and Sail; cut about 1.7 kb of the KDR cDNA fragment; cut this EamHI-Sall fragment mouth Nte Tsunoヽhybrid ¾ of Kkusha <7 was subcloned between EamHI / Sall site of Kuta ~ pAS2-l, a plasmid pAS2-KDR and I Lou P AS2-KDR ί! «tryptophan if I S as a marker one ^ Has TRPl, is a transcription factor of Saocharomyoes o revisiae ァ ^, hydro ^^ "^ ze gene ADH promoter and is a transcription factor GAL4 DNA; 1¾ ^ domain and KDR thread ¾ domain and と ^ protein
( 2 ) ッ一ノ ^ブリツド法によるスクリーニング  (2) Screening by the ^^ bridging method
クローンテック社のッ一 "ブリッド法用ライブラリ一である MATCHMAKERヒト fl继 cDNAライブラリ一に対してスクリ一二ングを行つ;^ この cDNAライブラリ一はべクタ一 pACT2の EmRI Xhfll間に ΙΕ¾·向になるように cDNA力挿入されてレヽるものであり、 i¾マー カーとしてロイシン合; ¾¾¾i^f" LEU2をもち、 ADHプロモータ一を して、 GAL4の転 化ドメインと cDNAのコードする蛋白とが!^蛋白 で発現する形になってレヽる i Screening is performed on the MATCHMAKER human fl ブ リ cDNA library, which is a library for Clontech's Brit method; ^ This cDNA library is placed between the EmRI Xhfll of the vector pACT2. The leucine compound is inserted as a marker so that the expression is as follows: i¾f ”LEU2 is used as the marker, the ADH promoter works, and the GAL4 conversion domain and the protein encoded by the cDNA are linked. ! ^ I become a protein-expressed form i
1図） スクリ一二ングの具^]方法はライブラリ一に' 寸されたクローンテック社のマニュ アルに従って行っ すなわち、 ツーノ^ブリツド '翻のヒト月離 cDNAライブラリ一とFig. 1) Screening method is performed according to the manual of Clonetech, which is sized for the library.
( 1 ) で した pAS2-KDR Sa chammvops oprpvisiae CG1945株 (クローンテック に麵リチウム法を用いて導入した:. CG1945株は、 染色体中に、 GAL4が結合する EJIJの下流にヒスチジン合 遺 HIS3と /3ガラクトシダ一ゼ遺 lacZをレポータ Hfi ^"として持っており、 トリブトファン、 ロイシン、 ヒスチジン要求性の株である。 プラスミ ド PAS2-KDRと KDRの糸 E ^内ドメインと^する蛋白の cDNAクローンの しそ れぞれの 蛋白を発現する形 Sl^体は、 KDRの糸鹏內ドメインと cDNAのコ一ドする結 合蛋白の により GAL4 DNA ^ドメインと GAL4転雜 I4f匕ドメィンが碰するため、 GAL4 DNA ^ドメィンカ¾ ^する の下流の HIS3遺^および lacZ遺 転写 カ¾¾{匕されるため、 ヒスチジン艘求性、 /3—ガラクトシダーゼ¾¾1«となる。 2 X 106 個 ^体を 2 %グルコースおよび 5 mM 3- アミノトリアゾ一ル¾ ^み、 口ィシン、 ヒス チジン、 トリプトファン¾ ^まなレ ：咅社で、 30°Cで 5日 咅養し、 増殖するコ口二一を し 舰された各形^^体の ]3—ガラクトシダーゼ活性の検出をフィルタ一アツセィ(1) pAS2-KDR Sa chammvops oprpvisiae strain CG1945 (Introduced into Clonetech using the 麵 lithium method: GAL4 binds to chromosome in CG1945 strain Downstream of EJIJ, it has histidine HIS3 and / 3 galactosidase lacZ as reporter Hfi ^ ", and is a strain requiring tributophan, leucine, and histidine. Plasmid PAS2-KDR and KDR yarn E ^ The Sl form that expresses each protein of the cDNA clone of the protein that corresponds to the domain is GAL4 DNA ^ domain and GAL4 transgenic by the binding protein that encodes the KDR thread domain and cDNA. The I4f-Dori domain is transcribed, so the HIS3 and lacZ transcripts downstream of the GAL4 DNA domain are transcribed, resulting in histidine tropism and / 3-galactosidase ¾¾1 «. 2 X 10 6 pieces of 2 bodies in 2% glucose and 5mM 3-aminotriazolyl, Mouth glycine, histidine, tryptophan レ Manare: Co., Ltd., cultured at 30 ° C for 5 days and grown一 — の 各 各 各 各 各 各 3 各 3 Filter the detection of sidase activity
[KBreeaen and Nasmyth ； Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 50· 643ひ 985)〕 によって行い、 /3—ガラクトシダ一ゼ翻易 体をさらに繊し このように蒙された形歸激体から、 クローンテック社のマニュアルに従って全 DNA 色体 DNAとプラスミド DNA力 S混合しているもの） を譲し、 この DNAを Gene Pulser Π[KBreeaen and Nasmyth; Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 50 · 643h 985)] / 3—Galactosidase was converted into a more fragile form. According to the manufacturer's manual) and transfer this DNA to the Gene Pulser Π
(ノ Wオラット» を用レ、てエレクトロポ^ "シヨン法により、 ロイシン要求性で、ある;^昜 菌 HB101株に導入し、 形 をし エレクトロポ シヨンの具鹏方法はノ^オラッ ド社の膨に従つ (Use the electroporation method for electroporation using Lewis auxotrophic method, which is required for leucine. Follow the bulge of
言^^ S ^体をロイシンを含まなレ、最小培地で培養し、 ロイシン ^求十生になった:^  The ^^ S ^ body was cultured in a minimal medium containing leucine and became leucine ^ ^
¾ ^体から cDNAプラスミドを回収し 回収したプラスミド中の cDNAがコードする蛋白 質の；^が KDR »内ドメィン特勸であることを ¾|gするため、 KDRとは別のプロティ ンキナーゼである酵母の SNF1遺伝子をプラスミド pASlに挿入したプラスミドである pAS/SNFl [Stephen. J. EUedge博士より ^され T urfeeら； Genes & Development, 2, 555 (1993)) と、 回収した各 cDNAプラスミドを上記と同様にして CG1945株に導入し、 ヒ スチジン要求性と /3—ガラクトシダーゼ ¾†生を測定し cDNAのコ一ドする蛋白質と SNF1 蛋白質が しなレ、ため、
Figure imgf000032_0001
—ガラクトシダ一 ゼ ¾ttもみられないプラスミドクローンを、 その cDNAがコードする蛋白質が KDRの細« ドメィン特 1^してレヽるものとして iSRした： ¾ ^ cDNA plasmid is recovered from the body, and the protein encoded by the cDNA in the recovered plasmid is DR | g, indicating that ^ is a domain within KDR » PAS / SNFl (Turfee et al .; Genes & Development, 2, 555 (1993)), which is a plasmid in which the SNF1 gene was inserted into the plasmid pASl, and Dr. Stephen. J. EUedge; In the same manner, the strain was introduced into the CG1945 strain, and histidine requirement and / 3-galactosidase production were measured. As a result, the protein coding for cDNA and the SNF1 protein did not work.
Figure imgf000032_0001
—A plasmid clone without galactosidase was subjected to iSR as a protein whose cDNA encodes a specific domain of KDR:
該クローンとしてクロ一ン #37およびクローン を; i¾ した：  Clones # 37 and clones were identified as the clones:
( 3) クロ一ン = 37力;含む cDNAの塩»列 C 斤 ( 2) で ¾ されたクローン ί ~· であるプラスミドクローン #37を EffiRIと Eginで切断 し、 cDNA ¾r^*勺 1.9kbの断片を纖し、 ベクタ" pUC118の HincIlZEamHIサイト間に サブクローニングし nested deletion法 〔DM.Glover and B.D. Hames ； DNACloning l, A Practical Approach, Core Tbchniques, Second Edition (1995) 〕 ^S 、て cDNAの^^ らの欠^:のシリーズを «し、 欠失前のブラスミドぉょ 欠^:シリーズのブラスミドに 対し、 ノ《一キン ·エノ 一社の、 ~クエンス 用キットにより、^"クエンス を行い、 DNAシークェ
Figure imgf000033_0001
ことに より、 #37の cDNA (½¾¾^iJを決定し (3) Clones = 37 forces; including cDNA salt »Row C Plasmid clone # 37, which is the clone identified in (2) above, is cut with EffiRI and Egin, and a 1.9 kb fragment of cDNA ¾r ^ * is cut into a fiber, subcloned between the HincIlZEamHI sites of the vector "pUC118" and nested deletion. Method [DM. Glover and BD Hames; DNA Cloning, A Practical Approach, Core Tbchniques, Second Edition (1995)] ^ S欠 ^^: A series of brasmids is subjected to ^ "quenching with a quenching kit from ~
Figure imgf000033_0001
Therefore, the cDNA of # 37 (½¾¾ ^ iJ was determined.
得られた JME^Jを酉 号 5〖 し^ この: ^¾H^は 1985bpであり、 E ^墦号 1の塩 翻 ijの 283番目以降に相当する。 この ^について、 ； データベース GenBank に対して BLAST searchにより相同 を行つたところ、 既 <7¾MH^には一 ¾rTる酉 U はなかった。  The obtained JME ^ J is the rooster No.5 〖. This: ^ ¾H ^ is 1985 bp, which corresponds to the 283rd and later of the salt ij of the E ^ E1. The homology of this ^ to the GenBank database was determined by BLAST search. As a result, no <7 ^ MH ^ rooster U was found.
クローン #37力含む cDNAは、 KDRリセプターに し に『关 する新規な の cDNAであると舰され、 こ を KDRリセプタ Hi ^蛋白質 DNA1と名付け  The cDNA containing clone # 37 is considered to be a novel cDNA that is known as a KDR receptor, and is named KDR receptor Hi ^ protein DNA1.
(4)クローン #2力 cDNA
Figure imgf000033_0002
(4) Clone # 2 cDNA
Figure imgf000033_0002
(2) で »されたクローン ( >~ であるプラスミドクローン # 2を ECQRIおよび Xholで 切断し、 cDNA ¾r tj#¾ 1.6kbの断片を輔し、 *¾を 骨化した後、 べクタ" pUC118の Hindiサイトにサブクローニングし、 pUK2-RXlをィ懷し pUK2-RXlについて、 nested deletion法に基づレヽて cDNAの«からの欠 »のシリーズを條し、 欠失前のプラスミドぉ よ υ¾·欠 ^^シリーズのプラスミドに対し、 ノヽ。一キン'エノ 一社のシークェンス 用キッ トによりシークェンス Sl^を行レヽ、 DNAシークェン 1^~ABI310 (パ一キン · エノ 一謂 を用レ、、 cDNAの ^^ 】の決定を行つ ^  Plasmid clone # 2, which has been cloned in (2) (> ~), is cut with ECQRI and Xhol, and the cDNA ¾rtj # ¾ 1.6 kb fragment is excised, and after ossification of * 、, the vector “pUC118 Subcloning into the Hindi site of pDNA2-RX1 and pUK2-RXl, based on the nested deletion method, based on the series of cDNA deletions, and the plasmid before deletion. For the plasmids of the ^^ series, the sequence Sl ^ was performed using a sequence kit from one company, DNA Inc., and DNA sequence 1 ^ ~ ABI310. ^^] make a decision ^
得られた を酉 噃号 6 i 示し 得られたこの;^ ^ リは 1610bpであり、 酉 噃 号 1の麵 の 27番目以降に相当する。 この: Μ リについて、
Figure imgf000033_0003
The obtained is shown as Rooster No. 6 i. The obtained; ^ ^ is 1610 bp, which corresponds to the 27th and following characters of Rooster No.1. This:
Figure imgf000033_0003
GenBankを用レ、て BLAST searchにより相同赚索を行ったところ、 既存の ^^ 』には一 る酉 リはな力ゝっ o Homologous search was performed by BLAST search using GenBank.
クローン # 2力;含む cDNAも、 KDRリセプタ一に しす識¾1に関与する新規な の cDNAであること力 され、 こ^子を KDRリセァタ "^蛋白質 DNA2と名付け^ CMSS例 2〕 KDRリセプタ 蛋白質 DNAの発 、布 The cDNA containing Clone # 2 is also considered to be a novel cDNA involved in the identification of KDR receptor 1 and this is named KDR receptor "protein DNA2". CMSS Example 2) KDR receptor protein DNA release, cloth
( 1 ) KDRリセプタ 蛋白質 DNA1 ( ¾現分布  (1) KDR receptor protein DNA1 (current distribution
ヒ卜の における KDRリセプタ 蛋白質 DNA1の発 布を、 ヒトの繊 （'« 脳、 月離、 月巿、 月直 骨格筋、 M) の mENAブロットである Multiple Tissue Northern Blot (クローンテック tt ) に対してノーザンブロットを行うことにより  The release of the KDR receptor protein DNA1 in humans was compared to the Multiple Tissue Northern Blot (Clontech tt), a mENA blot of human fibers ('brain, lunar disjunction, lunar, skeletal muscle, M). By performing a Northern blot
プローブとして、 クロ一ン #37の KDRリセプタ H ^蛋白質 DNA1の Hindin-HincII断 片約 1.4kbを雄例 1と赚にして32 P職したもの用レヽ、 ^ブリタ"イス'および洗^)餅 はク口一ンテック社の に従っ^ As a probe, black Ichin # 37 of KDR receptors H ^ protein DNA1 Hindin-HincII fragment of about 1.4kb oleyl 1 and赚a manner 32 P positions to ones for Rere, ^ Brita "chair 'and wash ^) mochi Follow the Kokuchi Tech Co. ^
結果を第 2図 i し^  The result is shown in Figure 2 ^
第 2図〖 されるように、 KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA1の mENAには 2.7kbと 2.0kb の 2觀あることがわかつ mRNAはレ、ずれの糸職； レ、ても発? ¾0 され、 多く (^鹏 で ¾1的に^ 16していると考えられ  As shown in FIG. 2, it can be seen that the mENA of the KDR receptor “protein DNA1” has two views of 2.7 kb and 2.0 kb, and that the mRNA is not sewn; (It is considered that ^ 16
( 2 ) KDRリセプタ 蛋白質 DNA2 D¾現分布  (2) Distribution of KDR receptor protein DNA2D
ヒトの^ «( ける KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の発 ¾ 布を、 ヒトの繊 ( I ： 黴 脳、 肺、 月徵 骨格筋、 霞 瞧； II. m 胸腺、 前 、 精巣、 喋、 小 腸、 結腸、 白 rt) の mRNAブロットである Multiple Tissue Northern Blot Iおよび II (ク ローンテック ¾ ) に対してノーザンブロットを行うことにより  Human ^ (け る (KDR receptor protein DNA2 is distributed to human fibers (I: mold, brain, lung, moon, skeletal muscle, haze); II. M thymus, anterior, testis, speaking, small intestine, colon , White rt) mRNA blots using Multiple Tissue Northern Blot I and II (Clonetech II).
プローブとしては pUK2-K lの KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA2の BamHI断片約 1.5kbを難例 1と赚にして 32P したものを用レ、、 ブリダィズおよび洗 ί牛は クローンテック社の に従っ As a probe, use the KDR receptor of pUK2-Kl "^ approximately 1.5 kb of the BamHI fragment of protein DNA2 to 32 P in difficult cases 1 and 2.
結果を第 3図 示し  The results are shown in Fig. 3.
第 3図〖 されるように、 KDRリセブタ Η ^蛋白質 DNA2の mENAには 3kbと 6kbの 2觀あることがわかっ 3kbのものは、 Ά » Wi«こ顕著な発 ¾6聽され、 また 前通、 小腸、 結腸においても鶴され 一方 6 kbの mRNAは、 M 胸腺、 精巣、 白血 : mされ、 また他の繊にぉレ、ても低レベルで発 ¾ ^見られ  As shown in Fig. 3, mENA of KDR resorbu Η ^ protein DNA2 is found to have two views, 3 kb and 6 kb. In the small intestine and colon, the crumbs were crushed, while the mRNA of 6 kb was found in the thymus, testis, and leukemia of the thymus.
[^例 3〕 ^ScDNAのクローン化 [^ Example 3] ^ ScDNA cloning
( 1) KDRリセプタ "^蛋白質 DNA1の^ AcDNAのクローン化  (1) KDR receptor "^ Cloning of ^ AcDNA of protein DNA1
¾SS例 1で得られた KDRリセ 7タ 蛋白質 DNA1の cDNAは 例 2で明ら力 こなつ た mR A COftさから、 cDNAC½長をコードしていない可 fgi^あるため、 cDNA全長をク ローン化し KDRリセブタ" "^蛋白質 DNA1のコードする蛋白質 （以下、 ^^蛋白質 1と呼 ぶ） の^ Όアミノ^ ^を明らかにすることにし ¾ The cDNA of KDR receptor protein DNA1 obtained in SS Example 1 is evident in Example 2. Because of the mRA COft, it is fgi ^ that it does not encode cDNA C length, so clone the full length cDNA and use KDR receptor pigs. "" ^ Protein ^ encoded by DNA1 (hereinafter referred to as ^^ protein 1) ^ Ό Amino ^ ^ to reveal
え tlOをベクターとするヒト! ^cDNAライブラリ一 [M Shibuyaら； On∞gene，5，519 (1990)) に対してプラークハイプリダイゼーションによリ KDRリセプタ一 ^蛋白質 DNA1 の cDNAクローンをスクリーニングし プローブとしては #37のブラスミドを Hindlllおよ び ΙϋηοΙΙて «した約 1.4kbの cDNA断片を [ -32P] dCIPを用 、てランダムプライ厶法 (ATSambrookら； Molecular Qoning;ALaboratory Manual, Second Edition (1989) 〕 によ リ 32P職し、 プローブとし ブラ一クノ^ブリダイセ'一シヨンの具删な方法 した メンブレン （Hybond-N；アマシャム謂 に謝されたマニュアルに従つ Human cDNA using tlO as vector! ^ CDNA library [M Shibuya et al., On∞gene, 5, 519 (1990)] was screened for cDNA clone of KDR receptor 1 ^ protein DNA1 by plaque hybridization. the probe cDNA fragment of about 1.4kb obtained by «a Burasumido of # 37 Te Hindlll and ΙϋηοΙΙ [- 32 P] use the DCIP, Te random ply厶法(ATSambrook et; Molecular Qoning; ALaboratory Manual, Second Edition ( 1989)] by Li 32 P positions in, and probe bra one Techno ^ Buridaise 'single Chillon of Gu删way the membrane (Hybond-N;従Tsu in Amersham called Xie manual
プラークノ、イブリダイセ'一シヨンに得られたポジティブクローンから、 約 2_2kb と最も長い cDNAを含むクローンを選択し #37の KDRリセブタ" ^蛋白質 DNA1の cDNA さと J ^して、 このクローンの KDRリセプタ ""^蛋白質 DNA1の cDNAは 5'側に約 0.2kb 帳して ヽると考えられたため、 このクローンを ECQRI T-WU CDNA全長 (：!目当する ECQRI新片 2.2kbをべクタ"" pUCU9 の ECQR [サイトにサブクローニングし、 プラスミド pUK137-Rlを條し pOKl37-Rlを EmRtおよび ΜΠΙて七: ®fして得 ¾ U¾5¾0.61* wrを戦し、 pucii9の 間にサブクローニンク *υた後 ^^を し  From the positive clones obtained in Plakuno and Ibridaise, select the clone containing the longest cDNA of about 2_2 kb, and select the KDR receptor pig of # 37. ^ ^ The cDNA of protein DNA1 and J ^ and the KDR receptor of this clone. ^ Since the cDNA of protein DNA1 was considered to be about 0.2 kb on the 5 'side, this clone was designated as ECQRI T-WU CDNA full-length (:! A 2.2 kb target ECQRI fragment was a vector "" ECQR of pUCU9 [Subcloned into the site and obtained plasmid pUK137-Rl and pOKl37-Rl by EmRt and ΜΠΙ7: ®f 戦 Fight U¾5¾0.61 * wr and subcloning between pucii9 * 後 ^ Do ^
1で得られた #37の KDRリセプタ" ^蛋白質 DNA1の cDNAの ^と、 こ こて得られた KDRリセプタ HS^蛋白質 DNA1の cDNAの 5β1(Ό¾β ^を組み合;^る ことによリ、
Figure imgf000035_0001
1に示した、 2267bpからなる KDRリセプタ 蛋白質 DNA1の
Figure imgf000035_0002
By combining the # 37 KDR receptor of # 37 obtained in Step 1 ^ of the cDNA of the protein DNA1 and 5β1 of the cDNA of the KDR receptor HS ^ protein DNA1 thus obtained (Ό¾β ^),
Figure imgf000035_0001
The KDR receptor protein DNA1 consisting of 2267 bp shown in Fig. 1
Figure imgf000035_0002
PUK137-R1を含む^菌である Escherichi cdiDH5ii )UKl37-Rl 平成 9 年 11月 Escherichi cdiDH5ii which is a bacterium containing PUK137-R1) UKl37-Rl November 1997
19日付けでェ 命工学ェ 漏麵（日 *a茨 ¾mつくば mm ι丁目 ι番 3号）にOn the 19th, it was leaked to Life Engineering (Japanese * a tall ¾m Tsukuba mm ιchome ι number 3)
FERMBP>6168として寄託されている。FERMBP> 6168.
Figure imgf000035_0003
1140bp力らなるオープンリーディングフレーム （ORF) 力、 'あり、 380 アミノ^)ゝらなる蛋白質 KDRリセプタ H¾ ^蛋白質 DNA1をコードすること力わかつ ま たこの ORFの尸开¾ ^コドン ATGの 6bp上流には ATGと同じフレームでストップコドンである TGA力あるため、 この ATGを『 コドンとした。
Figure imgf000035_0003
1140 bp open reading frame (ORF) force, 'Yes, 380 amino ^) 蛋白 protein KDR receptor H¾ ^ protein DNA1 is also brilliant and also the codon ATG 6 bp upstream of the ATG Is a stop codon in the same frame as the ATG.
このアミノ麵 リ崎脆 ァミノ データベース Genpep PIR, Swiss-Prot, PRF、 PDBに対し Blastsearchにより相[« ^を行うことにより鶴し This aminopirisaki fragile amino database Genpep PIR, Swiss-Prot, PRF, PDB by Blastsearch [«^
¾M2に ように、 KDRリセプタ" "^蛋白質 DNA1はど にも #¾½に¾¾し ているので、 KDR C ¾ ^みら ¾血管内 j£«においても、 リン斷匕した KDRと して、 As in ¾M2, the KDR receptor "" ^ protein DNA1 is linked to # ¾½, so KDR C ¾ ¾ み 内 内 ¾ j j j し て し て リ ン
«内シグナノ wsiに,してレ、ると考えら ¾。 «I think it's supposed to be a sign nano wsi.
( 2 ) KDRリセプタ ""^蛋白質 DNA2 CO± . cDNAのクローン化  (2) Cloning of KDR receptor "" ^ protein DNA2 CO ±. CDNA
1で得られた KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAは¾« 2で明ら力になつ た mENA 0 ftさから、 cDNA i ^長をコードしていない可 Hft^'あるため、 cDNA rfeftiDク ローン化を!^  The KDR receptor obtained in Step 1 is the cDNA of protein DNA2. Since the mENA was 0 ft, which became evident in Step 2, it does not encode cDNA i ^ length. Since it has Hft ^ ', the cDNA rfeftiD clone Make it! ^
え tlOをベクターとするヒト cDNAライブラリ一 CM Shibuyaら； Oncogene, 5, 519 (1990)) に対して ¾SS^J 1と赚にしてプラークハイプリダイセ'ーションによリ KDRリセブタ ■ ^蛋白質 DNA2の cDNAクローンをスクリ一二ングし ブローブとしては^ S例 2と同 様に pUK2-RXlの KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAの BamHT断片約 l.5kbを 32P観したものをプローブとし プラークハイプリダイゼーションの具鹏な方法 ί翻 したメンブレン （Hybond-N；アマシャム; に'謝されたマ二ユアノレに従つ A human cDNA library using tlO as a vector CM Shibuya et al .; Oncogene, 5, 519 (1990)). the cDNA clones subscription twelve Ngushi Burobu ^ S example 2 and pUK2-RXl of KDR receptors "^ what the cDNA of BamHT fragment about l.5kb of protein DNA2 was 32 P outlook as a probe plaque High Priestess die in the same way The exact method of the embedment: Following the reversal of the membrane (Hybond-N; Amersham;
ブラ一クノ、イブリダイセ'一シヨンにより得られたポジティブクローンから、 約 3.0kbと最も 長い cDNAを含むクローンを した。 このクローンを ECQRIて し、 cDNA (I¾当する ECQR [断片 3.0kbをベクター pUC119 (^ ^Μ- ) の ECQEI部位にサブクロ一ニングし、 プ ラスミド pUK102-Rlを ί した。 このクローンは ¾ iJ 2で見られた 3kbの 1111^ (1¾当 する全長 cDNAクローンと考えられた。 pUK102-Rlの KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の cDNAの 5β Όϋ¾δ を^したところ、 ¾Μ 1で得られた # 2の KDRリセブタ"^ 合蛋白質 DNA2の cDNA CD¾¾S^Jよリも 5βに 27bpだけ長 »Jであつ PUK102- R1の KDRリセプタ "^蛋白質 DNA2の cDNAは # 2の cDNAに比べ約 1.4kb長 、が、 5' 側でなく 3'ί勝賺觸 力 ¾レ、クローンであると考えられ ここで得られた DRリセ プタ 蛋白質 DNA2の cDNAの 5βの ¾¾@ ^を # 2の cDNA COl^S Jと組み合わ せることにより、 号 2に示した、 1637bpカゝらなる KDRリセプタ^ ^蛋白質 DNA2 の cDNAの igffl^を得 PUK102-R1を含む «菌である Ksriierirhia cdi DH5 A clone containing the longest cDNA of about 3.0 kb was selected from the positive clones obtained from Bracno and Ibridice. This clone was subjected to ECQRI, subcloned into the ECQEI site of the vector pUC119 (^^ Μ-), and the plasmid pUK102-Rl was subcloned with the cDNA (I ECQR [fragment 3.0 kb]. The 3kb 1111 ^ (1¾ was considered to be the full-length cDNA clone corresponding to the above. The KDR receptor protein DNA2 of pUK102-Rl was subjected to 5β Όϋ¾δ, and the # 2 KDR receptor pig obtained in ¾Μ1 was obtained. ^ Synthetic protein DNA2 cDNA CD¾¾S ^ J is 5bp 27 bp longer than 5β »J KDR receptor of P UK102-R1" ^ Protein DNA2 cDNA is about 1.4kb longer than # 2 cDNA, but 5 ' It is considered to be a clone, not 3 '側, but it is considered to be a clone. By combining 5β ¾¾ @ ^ of the cDNA of the DR receptor protein DNA2 obtained here with # 2 cDNA COl ^ SJ 2), obtained igffl ^ of cDNA of KDR receptor ^ 2 protein DNA2 consisting of 1637 bp ゝ Ksriierirh which is a bacterium containing PUK102-R1 ia cdi DH5
/PUK102-R1 平成 9年 11月 19日付けでェ ^1¾命工学ェ 醫麵 （日 *Θ茨 つくばtJ¾ l丁目 1番 3号） に FEEMBP"6167として されている。  / PUK102-R1 Appeared on November 19, 1997 as FEEMBP "6167" in Life Science Engineering, Inc. (Japan * Ibaraki Tsukuba tJ-1-3 chome 1-3).
この 己列中には 861bp力、らなるオーブンリーディングフレーム (ORF) カ リ、 287 7 ミノ ゝらなる KDRリセプタ 蛋白質 （以下、 ^蛋白 2と呼ぶ） をコードすることがわ 力 ^ (ここで诵始コドンは cDNA上で量初に出現する Metとし/^ ) In this queue, 861 bp power, narana oven reading frame (ORF), 287 7 It is known that it encodes the KDR receptor protein (hereafter referred to as ^ protein 2) ^^ (where the initiation codon is the first occurrence of Met on the cDNA / ^)
このアミノ翻 」の新規性は、 アミノ翻 Ξ ^データベース Genpept：、 PIR、 Swiss-Prot, PRF、 PDBに対し Blast searchにより相同 t¾ ^を行うことにより し  The novelty of this amino translation is achieved by performing homology t ^ on the amino translation database Genpept :, PIR, Swiss-Prot, PRF, and PDB by Blast search.
雄例 2でみられた 3kbの mRNAはこの cDNAと ¾iSするものと考えられるので、 月離、 Wfl ¾どでは、 こ f氐 量の!^蛋白 2カ 現し、 糸 fflSS内' として 4¾½ 機能を担ってレヽると鍵リされる。  Since the 3 kb mRNA found in Male Example 2 is considered to be SiS with this cDNA, it shows 2 proteins of this amount in the moon, Wfl 、, and 4 ¾½ functions as 'in the thread fflSS'. It is keyed when you carry it.
—方、 6 kbの mENA f¾Woよび白«などの«系 職で it^高レ ¾ ^見られて レ、るので、 6kbの mRNAがコ一ドする^^蛋白 2も«系における に βな 機能をもつものと, れる。  On the other hand, it has been seen in ^ professions such as 6 kb mENA f¾Wo and white «, and so on, so that 6 kb mRNA is encoded ^ ^ protein 2 is also β in the« system It has a function.
そこで、 6kbの mRNAに相当する cDNAを有する DNA2クローンを得るため、 ヒト白 球 cDNAライブラリー （クローンテック社；ベクターえ gtlO) に対して、 ヒト月離 cDNAライブ ラリ一からの DNA2クローンのスクリ一ニングと同様にしてスクリ一二ングを行った。  Therefore, in order to obtain a DNA2 clone having a cDNA corresponding to a 6 kb mRNA, a human leukocyte cDNA library (Clontech; vector, gtlO) was screened for a DNA2 clone from the human isolated cDNA library. Screening was performed in the same manner as the ning.
プラークノ^ブリダィゼ一シヨンにより得られたポ、: ^イブクローンから、 約 4.3kbと最も 長い cDNA ^ fクローン ¾S し;^ このクロ一ンを ErnRIで働し、 cDNAに相当する ECQRI断片 4.3kbをべクタ ~TUC119の ECQR [維にサブクロ一ニングし、 プラスミド PUK201-R1を讓し o pUK201-Rlの cDNAは、 6kbとレ、う mRNA ( ^さから考えて全 長 cDNAではなレ、と考えられたので、 このクローンの cDNAの 5' 分に相当する部分 ¾r^¾ Sail -EamHI断片約 0.8kbを PUC119の Sall EamHI間にサブクローニングして pUK202- BS1を讓し^ この PUK202-BS1の cDNA部分 ¾r^t?XhaI断片 0.3kbをプローブとして 用いて、 再度ヒト白血球 cDNAライブラリーをプラークノ、イブリダィゼーシヨンによりスクリ —ニングし、 得られたポ、: ^イブクローンから、 1.8kbの cDNA ^tfクロ一ン¾¾¾し このクローンを ECQRI で し、 cDNAに相当する ECQRI断片 1.8kbをべクタ ~pUC119の ECQRI 立にサブクローニングし、 プラスミド pUK301-R5を體し pUK301-R5の cDNAの 分 む Xhal 断片 1.6kbを PU 201-R1の halサイトに挿入することによ り、 DNA2の 6 kbの mRNAに相当すると考えられる cDNA全体^ クローン pUK401-R2 を しナ pUK202-BSlおよび pUK301-R5の cDNAの塩辦.列を卜 iポと曜 ίこして決定し、 PUK102-R1の cDNAの^ ¾Ξ ^と組み合 ることにより、 酉 ^播号 2 7 示した、 3505bp からなる KDRリセァタ "^蛋白質 DNA2の cDNAの JME^Jを得た： この ^^ 冲には 2541bp力、らなる^ "プンリーディングフ^"ム （ORF) があり、 847 アミノ^)ゝらなる KDRリセプタ" ^蛋白質 （以下、 ^蛋白 3と呼ぶ） をコート"することが わかった !潘号 28) 。 またこの ORFの開始コドン ATGの 169 71bp上流には ATGと同 じフレームでストップコドンである TAGがあるため、 この ATGを開始コドンとし^ From the Eve clone, the longest cDNA of about 4.3 kb ^ f clone ¾S; ^ This clone was worked with ErnRI to obtain 4.3 kb of ECQRI fragment corresponding to cDNA. Vector-Subcloned into ECQR of TUC119 (substituted with fibrils, plasmid PUK201-R1 was removed, and the cDNA of pUK201-Rl was 6 kb. so obtained, the clone portions corresponding to the 5 'portion of cDNA ¾R ^ a ¾ Sail -EamHI fragment approximately 0.8kb was subcloned between Sall EamHI of P UC119 pUK202- BS1 to Yuzuru Mr ^ of P UK202-BS1 Using a 0.3 kb cDNA fragment of the ¾r ^ t? XhaI fragment as a probe, the human leukocyte cDNA library was again screened with plaqueno and hybridization, and the obtained clone: 1.8 kb from the eve clone cDNA ^ tf clone This clone was subjected to ECQRI and corresponds to cDNA. That the ECQRI fragment 1.8kb was subcloned into ECQRI elevation of the base Kuta ~ pUC119, a plasmid pUK301-R5 minute free Xhal fragment 1.6kb of cDNA of the congregation to pUK301-R5 to be inserted into hal site P U 201-R1 Thus, the entire cDNA, which is considered to correspond to the 6 kb mRNA of DNA2, was cloned, and the clones of pUK202-BS1 and pUK301-R5 were cloned. Combined with ^^^ of PUK102-R1 cDNA, JME ^ J of 3505bp KDR receptor "^ protein DNA2 cDNA shown in Rooster ^ 27 was obtained: This ^^ island has a 2541 bp force, a ^^ "punleading ^^" (ORF), which coats a 847 amino ^^^^ KDR receptor "^ protein (hereinafter referred to as ^ protein 3)". I understand that! In addition, since TAG which is a stop codon in the same frame as ATG is located at 169 71 bp upstream of the start codon ATG of this ORF, this ATG is used as a start codon.
このアミノ¾1 〗の新規性は、 アミノ麵 データベース Genpept、 PIR、  This novelty of amino-1 is based on the amino databases Genpept, PIR,
Swiss-Prct, PRF、 PDBに対し Blastsearchにより相同,索を行うことにより ¾ ^、し 結 合蛋白 2と^蛋白 3のアミノ廳 IJを i»Tると、 ^^蛋白 2の 9番め （Glu) 以降と!^蛋 白 3の 5 6 8番め （Glu) 以降のァミノ鹏 IJは同一だった力 それより N末側のァミノ翻 】 は異なっていた。 By homology and search for Swiss-Prct, PRF, and PDB by Blastsearch, ¾ ^, and amino-protein IJ of binding protein 2 and ^ protein 3 by i »T, ^ 9 of ^ 2 protein ( Glu) and after! ^ Protein 3 5 6 8 (Glu) and later amino IJ had the same power, and the N-terminal side amino was different.
〔鍵例 4〕 KDRとの相互作用 (^晰 [Key Example 4] Interaction with KDR (^ lucid
( 1 ) KDR活性中' C/変異体との相互作用  (1) Interaction with 'C / mutant during KDR activity
KDRのキナーゼ活性中 立にあたる Lys868が Met に難した （以 K868M変異 と言 る。 ) KDRをコードするように、 鍾例 1で用いた DRcDNAクローンに颜を導 入し すなわち雄例 1で讓した pBluescriptll KDRを讓にして、 (A) プライマー K14N « 1潘号 16) とプライマー KMR-2 ® 噃号 17) (B) プライマー KMN-2 (酉^ I潘 号 18) とプライマ一 K3R ¾ 1墦号 19) の 2組のプライマ一O み^:で PCRを行つ Lys 868, which neutralizes the kinase activity of KDR, has difficulty in Met (hereinafter referred to as the K868M mutation). 颜 was introduced into the DRcDNA clone used in Zongyin 1 to encode KDR. (A) Primer K14N «1 Ban No. 16) and Primer KMR-2 ® 噃 No. 17) (B) Primer KMN-2 (Tori ^ I Ban No. 18) and Primer K3R ¾ 1 PCR No. 19) Perform PCR with two sets of primers ^:
KNR-2と KMN-2はそれぞれ K868M変 ¾K ^をもつ互いに相 なプライマ一である。 聯畐 した二つの DNA断片を ©IXし、 両者を混合したもの ¾ ^として次に ¾¾例 1で用レヽたプライ マー 2とプライマ一 5を用!/、て PCRを行レ、、 Κ868Μ変異 KDRをコ一ドする cDNA断片 0.8kbを職した 4図） 。 この:^、 (A) の 3'«と （B) の 5'*¾まプライマー KNR- 2 と KMN-2 由 共通の 22bpの K^IJがあるので、 (A) 巾離片のセンス鎖と （B) の 増 >|1斷片のアン^^ンス ;この共適 E^ijを介してァニーリングした 、 PCRの により それぞれ (Zm ^プライマ一となって （A) と （B) カ¾ ^し、 K868M変異 ^の断片 カ 幅する。 こ 續片に対しては、 プライマ一 2とプライマー 5により 0.8kbの断片 幅できる。 次にこ^ 片を制gg^EamHIおよび: Ikilで «し、 約 0.2kbの EamHI- 断片 (K868M変異 ¾^、） を戦隹し、 pBluescriptll KDRを EamHIと 1で切隨 雜した約 5.2kbの oil-EamHI断片、 および pBluescriptn KDRを: Ikglと oilで切赚 戦隹し 約 1.5kbの: Ikj fctl 断片とともにライゲーシヨン ® ^を レ、、 Κ868Μ変異 KDR cDNA ^l^tプラスミド pBluescriptn KDR M-2を†線し^ KNR-2 and KMN-2 are mutually exclusive primers with K868M variation ¾K ^. © IX the two combined DNA fragments and mix them.¾ Next, use primers 2 and 5 used in Example 1 for PCR! The 0.8 kb cDNA fragment encoding KDR was used (Fig. 4). This: ^, 3 '«in (A) and 5' * in (B) Primers KNR-2 and KMN-2 Since there is a common 22 bp K ^ IJ, (A) the sense strand of the separated fragment And the increase of (B)> | 1 piece; ^^; annealed via this match E ^ ij, and by PCR (Zm ^ primers become (A) and (B) For the continuous fragment, a fragment of 0.8 kb can be obtained with the primer 1 and the primer 5. Next, the fragment is restricted with gg ^ EamHI and: Ikil, Approximately 0.2 kb of EamHI-fragment (K868M mutation ¾ ^,) was purified, and an approximately 5.2 kb oil-EamHI fragment obtained by ligating pBluescriptll KDR with EamHI and 1, and pBluescriptn KDR was digested with: Ikgl and oil About 1.5 kb: Ikj fctl fragment with ligation ® ^, Κ868Μ mutant KDR cDNA ^ l ^ t plasmid pBluescriptn KDR M-2
尚、 第 4図中の記号が表す ¾f¾A下の通りである。  It should be noted that the symbols in FIG.
E ：制限 S ^ ECQMサイト  E: Restriction S ^ ECQM site
T ：制 PSil^Ikalサイト  T: PSil ^ Ikal site
B ：制 pg^EamHIサイト  B: System pg ^ EamHI site
N ：制 PS^Notlサイト  N: System PS ^ Notl site
ΎΜ ： KDRの麟  ΎΜ: Lin of KDR
• ： K868M変異を表わす  •: Indicates K868M mutation
変異の導 正しく行われていることは、 ： Μ IJを決定して薦し こ (^変異型プラス ミ ド pBluescriptn KDRM-2を BamHIと Xhal "C¾DrU 糸鹏内ドメィン½^勺 1.7kbの 断片を職し、 ベクタ" UC118の EamHIXXhal間に挿入し/^ 蛋白にしたときのフレ 一ムを合 ^るため、 雄例 1と繊にしてプライマー KDR-2を用レ、て、 w  Derivation of mutations Correctly performed is as follows: 決定 Determine IJ and recommend (^ Mutant plasmid pBluescriptn KDRM-2 to BamHI and Xhal "C¾DrU ドIn order to match the frame of the vector "UC118 inserted between EamHIXXhal / ^ protein", use primer KDR-2 as a fiber with male example 1 and w
導入法により EamHI に 1 ¾¾Cを挿入し この プラスミドを制 PB^EamHI および Sailで消化して pAS2-lの EamfflZSall間に挿入することにより pAS-KDR-KMを作 製し pAS-KDR-KMをプラスミドク口一 #37またはプラスミドクロー^ #2ととも CG1945株に導入し形 し Insert 1 ¾¾C into EamHI by the introduction method, digest this plasmid with PB ^ EamHI and Sail, and insert between EamfflZSall of pAS2-l to create pAS-KDR-KM and pAS-KDR-KM plasmid Introduced into CG1945 strain together with Kuguchiichi # 37 or Plasmid Claw ^ # 2
言鄉 を 2%グルコースおよび 5mM 3- アミノトリアゾール ¾ ^み、 ロイシン、 ヒス チジン、 トリプトファン ¾ ^まなレ、合/^咅 ¾Lbで、 30CCで 5日 咅養し、 ヒスチジン矮求性 かどうかを The language is 2% glucose and 5mM 3-aminotriazole み ^, leucine, histidine, tryptophan ¾ ^ manale, combined / ^ ¾ Lb, 30 days at 30 C C, histidine dwarfism To
プラスミドクロー #37を用レ、た時の結果を第 5図 ί しナ  Figure 5 shows the results of using plasmid claw # 37.
野！^の KDRの糸 内ドメィンを^ pAS-KDRの:^と！： して、 His 頃求 c ¾質 繊体の数は、 プラスミドクロー #37、 プラスミドクロー レ、ずれを用レ、た ¾ ^にも、 著 しく低下してい:/ " o  field! ^ KDR thread in the domain ^ pAS-KDR: ^! The number of fibrous filaments was significantly reduced in plasmid claw # 37, plasmid crawling, misalignment, and ¾ ^: / "o
この結果は KDRと KDRリセブタ H ^蛋白質 DNA1および KDRリセプタ 蛋白質 DNA2の には Lys868、 つまり KDRのチロシンキトゼ活 要であることカ^ fl変さ れ This result shows that KDR and KDR receptor pig H ^ protein DNA1 and KDR receptor protein DNA2 have Lys 868 , which means that tyrosine chitase activity of KDR is necessary.
( 2 ) KDRリセプタ "^蛋白質と^する KDR部位 晰  (2) KDR receptor "KDR site which is ^^ protein"
KDRリセァタ "^蛋白質が KDRのど 或と する力を調べる目的で、 KDRの変異 体を用いて、 酵母ツーハイブリッド法により角浙した： 具鹏に ί¾下の 去で解析し ^ rnm l ( l ) で作製した、 EamHIサイトの直下に 1塩基を挿入した改^! pUC-KDRC (7 "本鎖¾^として以下 7觀のプライマーを用いて、 雄例 1 ( 1 ) と赚にして «特 ¾6 ^然変異導入により KDRのキナーゼドメインよりも C«側の T rを Pheに置換した。 用いたプライマーは、 酉 播号 20の:^ fflE^jを有する YF12 [Tyr(1136)→Phe； ( )内 ^(まァミノ »ί立置を 。 以下同じ。 〕 、 酉 潘号 21の を有する YF13 [Tyi 1175) - Phe] 、 酉 潘号 22の iffi IJを有する YF14 [Tyr(1214)→Phe] 、 酉 S l墦号 23の 己 列を有する YF15 [TVr(1223)→Phe] 、 酉 潘号 24の;^ リを有する YF16 [TVr(1305)→ Phe] 、 酉 潘号 25
Figure imgf000040_0001
KDR resator "^ In order to examine the power of a protein to KDR, we used a mutant of KDR and carried out the yeast two-hybrid method: A modified version of rnm l (l) with one base inserted immediately below the EamHI site! pUC-KDRC (7 "Main strand ¾ ^ Using male primer 1 (1) and 赚The Tr on the C «side of the kinase domain of KDR was replaced with Phe by mutation introduction. The primer used was YF12 [Tyr (1136 YF13 [Tyi 1175)-Phe], YF14 with iffi IJ of Toriban No. 22 [) → Phe; (1214) → Phe], YF15 [TVr (1223) → Phe] with a roster of S l 墦 23, YF16 [TVr (1305) → Phe] with a 24 ^^; Issue 25
Figure imgf000040_0001
を有する YF18 [TVr(1319)→Phe] の 7觀である。 7 views of YF18 [TVr (1319) → Phe] with.
変異体としては、 それそ 戦虫の TVr変異体 7觀と、 変異を組み合^:、 複数の T rを 変異させたものとして、 YF12+14 [Tyr(1136, 1214)→Phe] 、 YF12+13+14 〔1^1136, 1175, 1214)→Phe] 、 YF14+15 [1Vr(1214, 1223)→Phe] 、 YF14+16 [1^(1214, 1305)→Phe] 、 YF1G -17 [TVr(1305, 1309)→Phe] 、 YF12+14+16 [1Vr(1136, 1214, 1305)→Phe] の 6觀 を讓し：^ それぞれの変異の導入は、
Figure imgf000040_0002
As mutants, the warrior TVr mutant 7 was combined with the mutation ^ :, as multiple mutants of T r were mutated, YF12 + 14 [Tyr (1136, 1214) → Phe], YF12 + 13 + 14 [1 ^ 1136, 1175, 1214) → Phe], YF14 + 15 [1Vr (1214, 1223) → Phe], YF14 + 16 [1 ^ (1214, 1305) → Phe], YF1G -17 [ TVr (1305, 1309) → Phe] and YF12 + 14 + 16 [1Vr (1136, 1214, 1305) → Phe]: ^ The introduction of each mutation
Figure imgf000040_0002
このようにして ¾した Hiの T r変異型 KDRプラスミドを EamHIおよび Sailで切断し、 PAS2-1の EamHlZSaJI間に挿入し これらの pAS2-lに T r変翻 KDRを挿入したプラ スミド¾# 2とともにそれぞ; H CG1945株に導入し 2 %グルコースおよび 80mM 3- ァミノトリァゾール んで、 Leu, His, rp ¾r ^まなレ洽 咅¾±で、 30°Cで 4日 離 換体を培養し、 His 求性であるかどうかを鹏し  The Hi Tr mutant KDR plasmid thus obtained was digested with EamHI and Sail, inserted between EamHlZSaJI of PAS2-1, and a plasmid in which Tr-transformed KDR was inserted into these pAS2-l. Introduced into strain HCG1945, cultured in Leu, His, rp ¾r ^ Mana 洽 ± with 2% glucose and 80 mM 3-aminotriazole for 4 days at 30 ° C for 4 days, Check whether or not His
まず職虫の iyr変異型プラスミド 7觀それぞ; T O^KI^体の中では、 KDRの TVr(1305) を Pheに した変異 (YF16)
Figure imgf000040_0003
Hisを含まなレヽ培地での増殖の低下が見 られ これに対し他の 6觀の TVr変異 ^Τ'は、 聯 氐下は全く鹏されな力 ^ また 複数の Tyrを Pheに譲した変異体にぉレ、ても TVr(1305)の変異 んだ変異体に First, the iyr mutant plasmid of Arthropod magna 7 views; in the TO ^ KI ^ body, KDR TVr (1305) was changed to Phe (YF16)
Figure imgf000040_0003
On the other hand, a decrease in growth in a medium containing His was observed. On the other hand, the TVr mutation ^ 変 異 'in the other 6 views was a completely unrecognized force under the union ^ A mutant in which multiple Tyrs were transferred to Phe Nyaray, even a mutant of TVr (1305)
殖能は低下し、 この TVr(1305)¾Sが KDRリセプタ 蛋白質との相互作用に ijを 果たすことが^変された 6図） 。 産 !!±の利用可 Fertility was reduced, and it was changed that this TVr (1305) ¾S plays ij in the interaction with the KDR receptor protein (Fig. 6). Production !! ± available
本発明により得られる、 KDRリセブタ H ^蛋白質 DNAを用いることにより、 VEGFリセ ブタ一 KDR
Figure imgf000040_0004
'ι¾¾¾?ίリュウマチに おける »炎、 m , ^m .乾鮮等の異常な血 t¾f生により « ^進 ί τ る疾 の治療が可能である。 By using the KDR-receptor H ^ protein DNA obtained by the present invention, VEGF-receptor-KDR
Figure imgf000040_0004
'ι¾¾¾? ί For rheumatism The abnormal blood t 治療 f, such as »flame, m, ^ m.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1. 以下の (a)または (b)の蛋白質。 1. The following protein (a) or (b):
(a) 酉 潘号 3、 4および 2 8力 選〖 る酉 潘号に鐘のアミノ翻 ijからなる蛋白質 (a) Tori Ban No. 3, 4 and 2 8 proteins
(b) (a)の蛋白質の有するァミノ翻 E ^におレ、て 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 し くは付加されたァミノ翻 リからなり、 力つ血管内戯 fflM麵子 (VEGF) リセプター KDR(kinase insert domain^conteiningreceptor)の糸 E¾S内ドメィンに!^して KDRの十 ff^St を誘導する蛋白質 (b) One or several amino acids have been deleted or added to the amino acid sequence E ^ of the protein of (a). VEGF) Receptor KDR (kinase insert domain ^ conteining receptor) thread A protein that induces 10 ^ ff ^ St of KDR in the domain within E¾S
2. 請求項 1言 の蛋白質をコードする DNん  2. DN encoding the protein of claim 1
3. 以下の (a)または (b)の DNAからなる DNん  3. No DN consisting of the following DNA (a) or (b)
(a) 酉 幡号 1、 2および 2 7から選 i る酉 噃号に総の: ffl IJを有する DNA (a) Tori 号, selected from Tori Hata 1, 2, and 27: Total DNA of ffl IJ
(b) (a)の DNAとストリンジェントな餅下でノ、ィブリダイズし、 力つ血管內戯 β¾麵 子 （VEGF) リセプター KDR 内ドメインに して KDRの'^ δβ¾を誘導する蛋白質 をコードする DNA (b) The DNA of (a) hybridizes with a stringent rice cake under rice cake, and encodes a protein that induces the KDR '^ δβ¾ as a domain in the KDR of the potentiating blood vessel β¾ 麵 receptor (VEGF) receptor (VEGF) DNA
4. 請求項 2または 3に!^の DNA ^有する えべクター。  4. The vector having! ^ DNA ^ according to claim 2 or 3.
5. 請求項 4 の繊えべクタ一を宿主ネ鹏に導入して得られる形 Μ^Φ  5. Form obtained by introducing the delicate vector of claim 4 into the host net Μ ^ Φ
6. 請求項 5諫 露 体を培地 咅養し、 培勤中に蛋白質を させ、 言 咅勸 カ 該蛋白質を ることを糊教とする請求項 1言凍の蛋白質の S^ ^fe  6. Claim 5 Cultivation of the isocyanate in a culture medium, allowing the protein to be added during cultivation, and advocating that the protein is used as a glue.
7. 酉 潘号 1、 2および 2 7から選【 る酉^ I潘号に言凍の ¾¾ 冲(¾ ^した 1 0〜5 0 と同じ酉 SJljまたは な酉 IJを有するオリゴヌクレオチド。  7. Rooster Ban No. 1, 2 and 27 Selected from the rooster ^ I Ban, the oligonucleotides having the same rooster SJlj or rooster IJ as those of 10 ~ 50.
8. 請求項 l lEifeの蛋白質を認識する抗  8. Claims l Antibodies that recognize lEife protein
9. 請求項 8諫の抗体を用いることを赚とする、 請求項 1纖の蛋白質 ^S^ 出 ' 9. Claim 8 Claim 1 wherein the antibody of Isa is used.
10.請求項 715*feのォリゴヌクレオチドを械成分とする、 異常な血籠生により病態 進行 する疾崈および KD Rの†t$S{Siの異常に起因する疾崈、の治薩 10. Claim 715 * fe Origonucleotide as a machine component, a disease that progresses due to abnormal blood vessel formation and a disease caused by an abnormality of Rt $ S {Si of KDR
11.言青求項 8言 ¾fe¾t体を ¾ r力成分とする、 異常な血 i¾f生により病態が進 m~る疾崈ぉよひ 11. Words Blue 8 Words ¾Fe¾t body as ¾r force component, abnormal blood i¾f raw disease progresses m ~
D R(†t$Si3iの異常に起因する疾 βの治 D R († t $ Si3i
12.異常な血鶴生により病態 進 frrる疾崈、が、 m w .. 率 形成、 t4Msnリュ ゥマチにおける 炎、 糖尿病! ¾¾ME, または乾 τある、 請求項 1 0また は 1 1 の治織 12. The disease progressed due to abnormal blood crane life, mw .. rate formation, flame in t4Msn rheumatism, diabetes mellitus! ¾¾ME, or dry τ. Is the 1 1 weaving
13. KDRの†f$g^tの異常に起因する疾崈、が、 癌または白血病である、 請求項 1 0または 1 13. The disease caused by an abnormality in DRf $ g ^ t of KDR is cancer or leukemia.
1雄の治 1 Male cure
14.請求項 7纖のオリゴヌクレオチドを被力成分とする、 異常な血籠生により病態 衝亍 する疾崈および KD R f^Siの異常に起因する疾患の  14. Claim 7: Diseases caused by abnormal blood vessel formation and diseases caused by abnormal KD R f ^ Si, wherein the oligonucleotides of Fiber 7 are a potential component.
15.請求項 8鐘 «体を被力成分とする、 異常な血籠生により病態 進 frfる疾崈および KD 颜¾1の異常に起因する疾砉、の^ ¾  15.Claim 8 Bell «Diseases that are caused by abnormal blood crawling and that are caused by abnormal KD 颜 ¾1 と す る
16.異常な血鶴生により病態 進 m~る疾 が、 mmm< im. ^ 慢 リュ ゥマチにおける M^、 糖尿病 ttws、 ^ m, または乾魚 eある、 請求項 1 4また は 1 5練の診隨  16. The disease diagnosed by the abnormal blood crane is mmm <im. Custom
17. KDR(Z TfTOiの異常に起因する疾 が、 癌または白 である、 請求項 1 4または 1 5  17. KDR (Z The disease caused by the abnormality of TfTOi is cancer or white.
18.請求項 1言凍の蛋白質を用レ、ることを赚とする、 KDRの个編連且 のスクリ一二 ング 18. Claim 1 Screening of individual KDRs using frozen protein
19.請求項 2または 3言識の DNAを用レ、ることを糊数とする、 KDRの'^ β¾Ρ且害 ¾Kのス クリーニング  19. Screening of KDR '^ β¾Ρ and harmful K, using the DNA of claim 2 or 3 as the number of glue
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