WO1999022047A1 - Dispositif et procede d'elaboration de cristaux par sustentation sur film de gaz - Google Patents

Dispositif et procede d'elaboration de cristaux par sustentation sur film de gaz Download PDF

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WO1999022047A1
WO1999022047A1 PCT/FR1998/002271 FR9802271W WO9922047A1 WO 1999022047 A1 WO1999022047 A1 WO 1999022047A1 FR 9802271 W FR9802271 W FR 9802271W WO 9922047 A1 WO9922047 A1 WO 9922047A1
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WO
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diffusers
lift
media
gas
displacement
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/002271
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English (en)
Inventor
Claude Parayre
Jacky Bancillon
Claudine Piras
Juan Carlos Fontecilla
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
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Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B30/00—Production of single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the action of electric or magnetic fields, wave energy or other specific physical conditions
    • C30B30/08—Production of single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the action of electric or magnetic fields, wave energy or other specific physical conditions in conditions of zero-gravity or low gravity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions

Definitions

  • the subject of the present invention is a device and a method for producing crystals and in particular organic and / or biological crystals by levitation on gas films.
  • the invention relates to a device and to a method for producing crystals in media or drops suspended on gas films in which it is possible to support several media or drops and to move those or these in order to allow their observation and / or their manipulation and / or their control.
  • the technical field of the invention can be defined as that of the production of crystals by levitation, levitation on a film of gas. It is necessary, in the context in particular of the determination of the three-dimensional structure of biological and / or organic macromolecules by diffractometric analysis methods such as X-rays, neutrons ... to succeed in growing crystals of size, shape and of sufficient quality.
  • nucleation phenomenon is the creation of the first solid germs called "nuclei", that is to say germs in French in a supersaturated solution; it is the first step in the formation of a new crystallized phase.
  • nucleation There are two kinds of nucleation, homogeneous nucleation and heterogeneous nucleation.
  • the nucleation is said to be homogeneous when there is nucleus formation exclusively between the species and the free ions in solution; nucleation is said to be heterogeneous when there is formation of nuclei in contact with an interface such as walls, crystals already formed, dust, etc.
  • the interface can participate in energy exchanges, which generally has the effect of reducing the free enthalpy of germ formation.
  • the latency time also called germination time, is the time necessary for a sufficient number of molecules to gather and assemble to form stable elementary germs (nuclei).
  • the crystallogenesis processes based on the above principle can therefore be classified into two main categories: namely on the one hand contact processes, on the other hand contactless processes.
  • the contact methods include, for example, crystallization methods by dialysis, in particular by double dialysis and crystallization methods by vapor diffusion.
  • the operating diagram of this process is as follows, it is indicated in FIGS. 1A and 2.
  • the drop hanging (22) on the lid (21) of the container contains for example a biological macromolecule such as a protein in solution, a buffer for adjusting the pH, an agent precipitating at an initial concentration Ci.
  • the container also contains in its reservoir part (24) a solution of same agent precipitating at a concentration C r .
  • the reservoir and the drop are separated by an air-filled space (23).
  • the volume of solution in the reservoir is much greater than that of the drop so that C r remains constant throughout the duration of the crystallization.
  • FOWLIS WW De LUCAS LJ in "Experimental and theoretical analysis of the rate of solvent equilibration in the hanging drop method of protein crystal growth"; Second International. Conf.
  • the solubility curves (31, 41) and the precipitation curves (32, 42) and the precipitation zone (33, 43) have been shown.
  • the initial and final concentrations of precipitating agent and protein are represented respectively by Ci, Cf and Cip, Cfp.
  • the chronology is as follows: As the concentration of the precipitating compound (in this case a salt) increases, the protein solution becomes supersaturated; then the rate of supersaturation continuing to grow, the solution reaches the spontaneous nucleation domain located beyond the solubility curve (31,41), that is to say that the figurative point passes from A to B in FIG. 4A. The germ (s) that appear get bigger and therefore deplete the solution. The figurative point therefore goes from B to C ( Figure 4B). The crystals stop growing when the saturation limit is reached at point C.
  • the precipitating compound in this case a salt
  • This process achievable in the absence of gravity, in space, or on the ground, consists in levitating between two electrodes a charged drop of water with a diameter of 3 mm, and in growing therein for example a crystal of NaCl.
  • document FR-A-2 509 637 describes the gas film lift process which allows the lift, positioning and molding of a liquid mass, without contact with a wall.
  • the liquid mass is separated from the wall by a pressurized layer of a gas which is chemically inert with respect to the liquid mass and the material constituting the wall.
  • This process would support a volume of solution much higher than those of the processes mentioned above and could be used for volumes up to 10 ml and up to 100 ml.
  • This document also describes the application of this process to the levitation of liquid drops on a flat and horizontal porous wall, to the shaping of a liquid mass inside a cylindrical container whose bottom and walls are porous, in order to allow the passage of a gas, in the zone fusion on large parts, in the shaping of a liquid cylindrical part in micro-gravity, in the continuous casting, and in the realization of single crystals by vertical traction.
  • All these operations are therefore operations carried out in a homogeneous medium, and at the origin, monophasic, concerning in particular changes of state of a single and same compound. This is for example the fusion, the solidification of a homogeneous ingot. There does not occur within the mass any chemical reaction, or a crystallization or other, implying the presence of several reagents or a solvent-solute couple (s).
  • This process has hitherto been used exclusively in the limited field of metallurgy and has been confined to specific applications in a homogeneous medium, and has not been applied to carrying out a reaction in a heterogeneous liquid medium comprising a plurality of reagents, for example to crystallization or crystallogenesis in solution involving one or more solvent (s) and one or more solute (s).
  • the document FR-A-2 742 771 relates to a device and to a method for producing crystals and in particular organic and / or biological crystals by levitation on a film of gas.
  • FIG. 6 which also corresponds to FIG. 6 of document FR-A-2,742,771 to which reference may be made.
  • the device shown in FIG. 6 essentially takes up a double-walled enclosure (61) produced for example in the form of two half-enclosures, one of which forms a cover.
  • This enclosure is provided with means making it possible to regulate the interior temperature which are in particular in the form of a double wall in which circulates a thermostatically controlled liquid (62) coming from the thermostat control loop.
  • the enclosure is preferably lined with an insulating material (63).
  • the current experiment inside the enclosure can be followed via a single apical porthole (64) provided in the double wall.
  • the enclosure is provided with several connectors (65, 66) or other means allowing this enclosure to be passed through to the various cabling and power supplies connected to the various measurement means and devices, probes, for example probe of humidity, and sensors arranged inside the enclosure.
  • the device comprises a first connector (65) for the passage of the wires connected to the means for measuring the temperature such as probes (67, 68) with platinum resistance measuring "Pt 100" of the temperature; and a second connector (67) for supporting and connecting a humidity probe (618).
  • the enclosure also includes means such as a nozzle for supplying sweep gas (69) such as air or nitrogen.
  • the enclosure also comprises means such as a bore (620) for carrying out the evacuation of the gases from the enclosure.
  • the essential part of the device according to the invention is constituted by the means making it possible to put the medium in levitation which take on Fig.6 the form of a diffuser (610) whose useful part is, for example, a spherical sector which is mounted on a pressurization chamber (611) comprising means for regulating the temperature which preferably consist, as shown in Figure 6 in a coil (612) supplied by a thermostating fluid through the tube (613).
  • the diffuser also comprises means for measuring the temperature, constituted for example by a temperature probe, for example of the platinum resistance type "Pt 100" (614), the connection cable (615) of which passes through the supply nozzle. in lift gas (616).
  • FIG. 7 of document FR-A-2 742 771 represents the complete lift system, in particular for the lift of aqueous solutions on a gas film, making it possible to particular to carry out the protein crystallogenesis.
  • This installation comprises in particular means for observing the liquid placed under lift. These observation means include for example a stereoscopic microscope, by means of which the drop can be observed, either directly with the eyepiece, or on a television monitor via a camera.
  • the device described in document FR-A-2 742 771 in particular in FIG. 6 of this document has the drawback of being able to treat only one drop or lifting medium at a time.
  • observation system described in FIG. 7 of document FR-A-2 742 771 is limited, as indicated above, to a measurement of the variation in the size of the drop as a function of time thanks to a video camera.
  • the only optical access to the sample is the single apical porthole.
  • the object of the invention is to provide a device for producing crystals in media supported on gas films, which meets, inter alia, the needs indicated above, which does not have the drawbacks, disadvantages, and limitations devices of the prior art, and which solves the problems posed by the devices of the prior art.
  • a device for producing crystals in media suspended on gas films comprising a treatment enclosure, means or diffusers for simultaneously placing said media in lift on gas films, and means of observation and / or control, and / or manipulation of said levitated media, in which said device comprises at least two diffusers, and means for moving said diffusers inside of said treatment enclosure, permanently maintaining said media in lift, and allowing manipulation and / or observation and / or control of said media supported by said manipulation and / or observation and / or control means .
  • the device according to the invention comprises several diffusers, in other words, at least two diffusers, the simultaneous treatment of several preparation media, such as drops is possible, and there is in fact no physical limit the number of drops that can be sustained.
  • the device according to the invention surprisingly combines the advantages inherent in the device for producing crystals using lift on gas films with the advantages linked to the simultaneous production of several crystals.
  • the device is provided with means for moving the diffusers inside the treatment enclosure and allowing their manipulation and / or their observation and / or their control by the manipulation means. and / or observation and / or control.
  • These means for moving the diffusers can for example be designated under the general name of diffuser holders and can be in different forms depending on the movement that it is desired to see the diffusers make.
  • Said displacement can be any displacement.
  • This displacement is for example an alternative or sequential displacement.
  • Said displacement can also be a linear displacement along a single axis or else a displacement along two axes, for example orthogonal, or else a curvilinear displacement, for example circular.
  • the device of the invention which comprises means for moving the diffusers, and the fact that these means or holder diffusers are movable inside the treatment enclosure, and that they also make it possible to maintain the media. in permanent lift and in particular throughout the movement, it is possible to “scroll”, for example successively and / or alternately, all the media placed in lift, for example all the drops lifted at the location or at the location provided for their observation and / or their control and / or their manipulation. It is possible to precisely position the media placed in lift in the field of action of the observation and / or control and / or manipulation means, for example observation means, without the quality of the lift and therefore crystallogenesis is seen in no way affected.
  • the media put on lift such as the lifted drops, for example successively, in the same place, which makes it possible to set up only one only observation and / or control and / or manipulation device.
  • said means for moving the diffusers comprise a rotating barrel supporting said diffusers.
  • said means comprise a support plate on which the diffusers are arranged in a matrix that can be moved, for example linearly and orthogonally.
  • said means comprise a support strip on which is disposed a row of diffusers and which can be moved linearly and alternately.
  • the means for moving the diffusers inside the enclosure further comprise means for supplying lift gas, generally in the form of a single lift gas supply chamber supplying all the diffusers and receiving a supply line of lift gas.
  • the means for moving the diffusers further comprise drive means generally in the form of an axis or shaft actuated by a motor.
  • drive means are adapted to the embodiment indicated above, thus, in the case where the means for moving the diffusers comprise a rotating barrel, said drive means comprise a rotary axis supporting said single supply chamber, said axis being driven, actuated by a motor.
  • the axis is hollow and also plays the role of supply pipe.
  • connection means making it possible to adapt them to the means of training.
  • connection means comprising a rotating joint or sliding.
  • the observation means generally comprise at least one porthole, according to the invention, the treatment enclosure comprises at least one lateral porthole, for example from 1 to 10 lateral portholes which allow optimal observation of the media placed in lift.
  • the manipulation and / or control means comprise means chosen from in situ diagnostic means, remote handling means, etc.
  • the invention also relates to a process for producing crystals in media simultaneously lifted on gas films in a treatment enclosure in which said media at least 2 are placed in lift and are moved inside said treatment enclosure while maintaining them permanently in lift, in order to allow their observation and / or their control and / or their manipulation.
  • FIGS. 1A, 1B and 1C are schematic representations of the methods of the most common prior art, namely hanging drop: FIG. 1A, drop placed: fig. 1B, and sandwich drop: fig. 1 C;
  • - Figure 2 is a schematic representation of the crystallization by the hanging drop method "hanging drop method";
  • FIG. 3 shows schematically the principle of a device according to the invention and serves as a reference to define the different parameters which influence the crystallization and the notations used;
  • - Figure 6 illustrates the structure of the treatment enclosure described in document FR-A-2,742,771;
  • Figure 7 is a schematic sectional view of a device according to the invention in a embodiment where the scrolling of the drops is carried out by a rotating barrel;
  • FIG. 8 is the general block table of a protein crystallogenesis installation by gas film levitation, including the device according to the invention
  • the device according to the invention which comprises several diffusers, allows the simultaneous lift of several media placed in lift.
  • each of the diffusers supports a single medium, which allows on the one hand a physical separation of the media placed in lift, on the other hand the decoupling of the media in the event of wetting of one of them and finally maintenance, easy cleaning and reconditioning of diffusers between two experiments.
  • the number of diffusers can range, for example, from 2 to 12, preferably from 4 to 6.
  • each of the media placed in levitation preferably has the shape of a drop, this shape being dictated inter alia by the characteristics inherent in the process
  • Each medium may be any medium which can be adequately lifted, but it is preferably a fluid, liquid or gelled mass.
  • Each medium is still preferably a solution, preferably an aqueous solution, but it is obvious that other solvents or mixtures of solvents can be envisaged such as alcohols, polymers, fluorocarbons, salts, milk, ...
  • the solution can comprise only one of the above-mentioned compounds as solvent, but can also comprise a mixture of two or more of these solvents.
  • Water is the preferred solvent, in particular when it is desired to form organic and / or biological crystals such as crystals of organic and / or biological macromolecules, for example of protein (s).
  • the solvent can also contain a compound called "precipitating salt".
  • It can be an organic, or inorganic, for example mineral, compound such as ammonium sulphate, sodium chloride, or else a polymer, an alcohol such as polyethylene glycol or methyl pentanediol.
  • the compound (s) to be crystallized is (are) any and can be an organic or mineral (mineral) compound (s).
  • the compound (s) to be crystallized is (are) one (or more) organic macromolecule (s) and in particular one (or more) macromolecule (s) ) biological (s) such as nucleic acids and in particular proteins such as enzymes, hormones, receptors, etc.
  • the device according to the invention is in fact particularly advantageous for the crystallogenesis of biological macromolecules because, because of the better control, the better observation of the crystallization that it allows, better knowledge of the parameters of growth germination is thus possible.
  • the compound to be crystallized is generally present at an initial concentration in , the medium of between 1 and 30 g / ml.
  • One or more crystals can be grown in each of the media, for example drops, put in levitation, depending on the application that is made of the method according to the invention.
  • the device according to the invention where it is possible to put several media simultaneously in levitation to simultaneously develop several crystals is therefore particularly advantageous.
  • the process according to the invention is used as a separation technique, for example by fractional crystallization, it will then be preferable to grow several crystals per medium or drop.
  • All the media placed in levitation in the device according to the invention can be identical, but one or more of these media can also have a different composition from the others.
  • the application of the device according to the invention with a view in particular to obtaining a crystal of satisfactory size can take place in two ways.
  • each medium placed in levitation can also comprise a compound for example a precipitating salt, mentioned above, such as NaCl or
  • a pH adjustment buffer can also be present in each medium: this buffer can be chosen from the buffer systems known to those skilled in the art. It can be for example a TRIS buffer allowing to buffer the (aqueous) medium at a pH of 8.5 to 7 or also a cacodylate buffer making it possible to buffer the medium at a pH of 6 to 5.
  • the initial volume of each medium is preferably in accordance with one of the advantageous characteristics of the invention of between 30 and 100 ⁇ l, and better still between 50 and 60 ⁇ l, which is a volume substantially greater than the initial volumes of the media of the devices of the prior art without contact.
  • the gas used for the lift must preferably be chemically neutral vis-à-vis the medium put into lift; preferably use a gas such as helium, argon, nitrogen or even filtered air.
  • the flow of lift gas must be sufficient to keep the medium in lift; it must also be constant and can be easily determined by a person skilled in the art in this field of technology; it will preferably be between 1 and 100 ml / min.
  • the device according to the invention can be used under conditions of normal gravity, for example on the ground, or else under conditions of reduced gravity or microgravity, for example in a spaceship.
  • the device according to the invention according to one of its particularly advantageous characteristics makes it possible to control, regulate, control the production process by means of a certain number of parameters.
  • FIG. 5 schematically illustrates the general principle of a device according to the invention, and carries out the inventory of the influencing parameters and of the notations used in the general case of the levitation on the gas film of a fluid or gelled mass.
  • FIG. 5 is similar to FIG. 5 of the document FR -A-2,742,771.
  • This device essentially comprises means enabling the medium to be lifted in the form, for example, of several diffusers; for the sake of clarity, only one of these diffusers is shown in FIG. 5.
  • This diffuser generally designated by the reference (51), is placed in an enclosure (52).
  • the lift gas (53) feeds the diffuser (51) shown, by means of supply means in the form for example, of a supply line (54) passing through the enclosure (52).
  • the excess gas is evacuated by means of evacuation in the form for example of an exhaust orifice (512).
  • the diffusers may in particular be of the type described in document FR-A-2 509 637 already mentioned above, that is to say that the mass of the medium to be supported, which may for example be a drop (55) of a fluid or gelled mass, is supported above a wall (56 ) using a gas film (57).
  • the plate (56) is porous and constitutes the diffusing wall of a chamber allowing the pressurization and temperature of the gas used.
  • the gas such as helium, or the like, is forced through this wall which may for example be made of graphite, or ceramic, or synthetic material and have a thickness, for example from 1 to 5 mm.
  • a hanging drop is formed which is gradually approached by the diffusing wall so as to promote the formation of the gas film between the drop and said wall.
  • the drop on the filter gradually increases its volume and then ruptures the meniscus connecting to the needle by moving it away.
  • FIG. 5 gives the inventory of the influencing parameters and the notations used: - Q g designates the flow of lift gas arriving through the pipeline (54),
  • T g denote the relative humidity and the temperature (° C) of the lift gas (53).
  • T d denotes the temperature of the diffuser taken in (58) using means for measuring the temperature Td, for example using a temperature probe in the form of a platinum resistance or thermistor probe.
  • Rh a denote the temperature of the drop, assumed to be isothermal, and the relative humidity on its surface in (59),
  • T ⁇ and RH ⁇ denote the temperature and relative humidity in the enclosure, far from the drop, for example in (510) and can be measured by measuring means, for example by suitable sensors and probes,
  • T p denotes the temperature of the wall of the enclosure taken for example in (511) using measuring means, for example using one or more probe (s) or sensor (s) , suitable, such as platinum resistance (Pt) or thermistor probe (s).
  • Tp is equal to Tg which is close to Td, namely for example from 0 to 40 ° C.
  • the surface fluxes for example of water vapor, are proportional to the concentration gradient in the boundary layer of the gas phase at the surface of the drop.
  • the volume of the enclosure is greater than that of the process, taken as the reference process, namely the so-called "hanging drop” process, for example the volume of the enclosure is two orders of magnitude greater than that of the reference method.
  • An additional wet gas circuit such as air makes it possible, on the one hand, to reduce the time constant for establishing the desired humidity level in the enclosure after opening, and on the other hand to maintain it throughout the duration of 1 experience.
  • the device according to the invention makes it possible to control and control the nucleation, then the growth rate of the faces of the crystals by means of one or more of the parameters listed above: for example, evaporation can be carried out of the drop at constant T ⁇ and variable RH ” or an evaporation of the drop at variable T ⁇ , or else an evaporation of the drop by variation of Rh g and / or T g , or the concentrations can be varied by injection of solvent or reagents into the drop, or finally the concentration of precipitating salt can be varied in the tank in the image of what is done in the reference process with suspended drop.
  • Figure 7 is a schematic sectional view of the device according to the invention in an embodiment where the movement of the drops is achieved by a rotating barrel.
  • the device according to the invention can be defined as an improvement to the device of the prior art as described in document FR-A-2 742 771 and in FIG. 6.
  • the device of FIG. 7, according to the invention differs essentially from the device of FIG. 6 by the fact that it comprises several diffusers, means for moving these diffusers in the form of a rotating barrel, as well as means lift gas supply adapted to the presence of a plurality of diffusers. Therefore, the following description, made with reference to FIG. 7, will relate essentially to the elements of the device according to the invention which are different from the device of the prior art according to FIG. 6 and / or which are added to that -this.
  • the rest of the device is essentially similar to the device of Figure 6 and is not generally described in more detail, we can therefore refer to Figure 6, already described, or to document FR-A-2,742 771.
  • the device according to the invention essentially comprises an enclosure (71) which is a double-walled enclosure.
  • the enclosure is produced in the form of two half-enclosures, one of they forming a double-walled cover (72) and the other forming a double-walled bottom (73).
  • This enclosure is provided with means making it possible to regulate the interior temperature, that is to say the temperature of the drop and of the atmosphere of the enclosure.
  • These means are in particular in the form of a circulation of thermostatically controlled liquid (75), for example water, or a mixture of water and ethylene glycol, coming from the thermostat control loop described in the figure. 8.
  • the thermostatically controlled liquid is introduced into the double wall through the tubes (76) (77) and out of it through the tubes (78) (79).
  • temperature control means are only one embodiment. It is also possible to design a system for regulating and controlling the temperature of the drop using, for example, microwave heating in the case of dielectric fluids such as water, organic solvents, etc .; high frequency induction heating in the case of electrically conductive fluids; or radiative heating in both cases.
  • the enclosure is preferably lined with a heat-insulating material (701) such as cork or synthetic foam, which makes it possible to maintain inside the enclosure a temperature preferably of 0 to 40 ° C, preferably even higher than 0 ° C and substantially constant, that is to say preferably with a variation not exceeding ⁇ 0.05 ° C.
  • a heat-insulating material 701 such as cork or synthetic foam
  • the device of FIG. 7 comprises, in accordance with the invention, observation means in the form of portholes (702, 703, 704), arranged in bushings made in the double wall of the enclosure, for example, in the cover and in the side walls.
  • this in addition to the apical window (702) unique similar to that which is provided with the device of the prior art comprises a number of side windows.
  • the device of FIG. 7 does it include four side windows which allow the lighting and the radial observation of the drops. Only two of these portholes (703, 704) have been shown.
  • the wall crossings can also be provided with means of control and / or manipulation such as non-invasive in-situ diagnostic means (for example lateral lighting, by light sheet, of the equatorial plane of the drop, allowing an examination in the dark background and, consequently, the detection of the passage of the crystalline germs entrained by the convection currents in the drop), means of teleoperation or telemanipulation (for example a system of injection / sampling needle allowing either to modify the composition of the solution is to deposit a crystalline germ to inoculate the mother solution).
  • non-invasive in-situ diagnostic means for example lateral lighting, by light sheet, of the equatorial plane of the drop, allowing an examination in the dark background and, consequently, the detection of the passage of the crystalline germs entrained by the convection currents in the drop
  • means of teleoperation or telemanipulation for example a system of injection / sampling needle allowing either to modify the composition of the solution is to deposit a crystalline
  • the handling means can for example allow the deposition and removal of the drops, various additions making it possible to modify the composition of the solution, etc.
  • the deposition of the drops can be carried out using an injection needle in a configuration where the enclosure is closed, for example by mounting a perforable membrane in place of a porthole.
  • the enclosure is also provided with several connectors or other means making it possible to pass through the double wall of the enclosure to the various cabling, power supplies, etc. connected to the various means and measuring devices, sensor probes arranged inside. of the enclosure. Reference is made in this regard to FIG. 6.
  • the enclosure comprises, for example, means in the form of nozzles and pipes (705,
  • the gas may for example be air or nitrogen, and it is of course chosen to be compatible with the reagents used as well as with the materials forming the diffuser, the enclosure, the measuring means, etc. ...
  • This gas is generally the same as the lift gas, and it is generally a gas whose humidity is controlled in order to regulate the humidity in the atmosphere of the enclosure.
  • the device comprises several diffusers, thus the device shown in FIG. 7 comprises four diffusers, two of which are visible (708, 709), but this number is absolutely not limiting.
  • These four diffusers are mounted on a rotating barrel (712) which allows ensure the scrolling of the drops with great precision, in particular in front of the apical porthole (702).
  • each diffuser supports a drop (713, 714), such an arrangement allows, on the one hand the decoupling of the drops in the event of wetting of one of them, on the other hand cleaning, repackaging diffusers between two experiments.
  • the four diffusers, each carrying a drop of mother solution, are placed on the rotating barrel placed on the common single high pressure chamber for the supply of lift gas, also called pressurization chamber (715).
  • the pressurization chamber can also include means for regulating the temperature, as in FIG. 6.
  • the diffuser holder that is to say the assembly constituted by the rotary barrel and the pressurization chamber is carried by a rotary shaft or shaft (716).
  • This axis, driven by a motor (717), is preferably hollow and also plays the role of supply pipe forming part of the means for supplying lift gas.
  • the means for supplying lift gas are designed so as to keep the droplets constantly lifted and in particular during their movement, for example these means comprise connection means such as a rotating joint system ( 718) as shown in FIG. 7 or even in another embodiment a sliding joint system, which makes it possible to ensure a constant supply of lift gas so as not to disturb the crystallogenesis.
  • FIG. 8 represents the complete lift installation, in particular of aqueous solutions on a gas film, making it possible in particular to carry out the crystallogenesis of proteins. In this installation, the enclosure described above in FIG. 7 is shown diagrammatically at (81).
  • the double wall of this enclosure is connected to the thermostat loop (82) comprising a temperature control device (83) such as a thermostat by the inlet (84) and outlet (85) tubes conveying a liquid.
  • thermostatically controlled such as water or ethylene glycol which makes it possible to regulate the temperature inside the enclosure (81) at a temperature preferably between 0 and 40 ° C, more preferably above 0 ° C , preferably with a variation not exceeding plus or minus 0.05 ° C.
  • the lift gas for example air or nitrogen, supplying the diffuser at a flow rate preferably from 1 to 100 ml / min, comes from the control and regulation bay (86) of the gas supply. , fitted with a flow meter (87) and a flow control valve (88).
  • This gas passes first, before being sent into the pipe (89) ending in the enclosure, and more precisely in the diffuser, in a bubbler device, consisting for example of a thermostated bath (810), which allows to adjust its relative humidity to a value between 90 and 100% RH and its temperature to a value preferably between 0 40 ° C, more preferably greater than 0 ° C.
  • a second gas supply circuit allows the chamber to be scanned with a flow rate preferably of 0.1 to 5 1 / min, much greater than that of the lift circuit: this flow rate is still preferably between 0.2 and 2 1 / min.
  • the purge gas which is preferably the same as the lift gas comes from the common gas supply via the control and regulation bay of the gas supply which is provided with means for controlling, regulating and measuring the flow in the form for example of a flow meter (812) and of a flow control valve (813) and passes first, before being sent in the enclosure by the inlet orifice (814), in a bubbler device consisting of a thermostatically controlled bath (815) which makes it possible to adjust its relative humidity to a value between 90 and 100% RH and its temperature to a preferably between 0 and 40 ° C, more preferably more than 0 ° C.
  • the excess lift and sweep gases can be removed from the enclosure through the exhaust port (816) and recycled.
  • the purge gas supply circuit makes it possible, after an opening and closing operation of the enclosure, to restore the relative humidity of the atmosphere of the enclosure with a much lower time constant.
  • the installation also comprises, according to the invention, means of observation and / or control and / or manipulation of the liquid placed under lift.
  • the observation means comprise, in addition to the portholes described above and possibly in association with one or more of these portholes, for example a stereoscopic microscope (817), by means of which each drop can be observed, either directly with the eyepiece or on a television monitor (818) via a camera
  • the device also comprises side windows which can be provided with multiple means of observation and / or manipulation, and / or control, for example of diagnosis, etc. which have already been mentioned above, for example.
  • the video signal mentioned above is possibly recorded on recording means such as a video recorder.
  • the measurements collected in the enclosure by the various means for measuring temperature and hygrometry are transmitted by the line (820) to acquisition and processing means comprising for example a central measurement unit (821) and a micro- computer (825) for example of the HP 3852 type sold by the company HEWLETT-PACKARD coupled with printing means such as a printer (723) which therefore allows the acquisition of measurements, the periodic control of lighting and the output of a paper snapshot on the video printer (822) by which we can a posteriori measure the diameter of the drop and the calculation of its open volume.
  • the analog signals are recorded on paper (824) in continuous plotting.
  • control means for regulating and measuring the humidity of the enclosure and the lift gas described in the foregoing are given for information only. It is obvious that other means of control, regulation and measurement can be implemented, in particular within the framework of an industrial scale production of the installation. It is the same for the means of control, regulation and measurement of the temperature; for the means of control, regulation and measurement of the different flow rates; for the means of lifting; for the means of supply and discharge of the various gases and other fluids; for the enclosure itself; for the means of observation and / or control and / or manipulation of the media put into lift with which it is provided; for the processing, reproduction and printing acquisition means and for all the other means provided for in the device and the installation of the invention and in particular for the means for moving the diffusers inside the enclosure, for training means, for connection means, etc.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'élaboration de cristaux par sustentation sur film de gaz ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. Le but de l'invention est essentiellement d'obtenir des cristaux présentant un taille, une forme et une qualité suffisantes, afin notamment de permettre l'étude de leur structure. Ce but est atteint, selon l'invention par un procédé d'élaboration d'au moins un cristal caractérisé en ce que ledit cristal est élaboré dans un milieu tel qu'une goutte de solution mis en sustentation sur un film de gaz. Le procédé peut être notamment appliqué à l'étude de la structure de molecules organique et/ou biologiques ou peut être utilisé comme technique séparative par cristallisation fractionnée.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE D'ELABORATION DE CRISTAUX PAR SUSTENTATION SUR FILM DE GAZ
La présente invention a pour objet un dispositif et un procédé d'élaboration de cristaux et en particulier de cristaux organiques et/ou biologiques par sustentation sur des films de gaz.
De manière plus précise, l'invention est relative à un dispositif et à un procédé d'élaboration de cristaux dans des milieux ou gouttes mis en sustentation sur des films de gaz dans lequel il est possible de sustenter plusieurs milieux ou gouttes et de déplacer ceux-ci ou celles-ci afin de permettre leur observation et/ou leur manipulation et/ou leur contrôle.
Le domaine technique de l'invention peut être défini comme étant celui de l'élaboration de cristaux par sustentation, lévitation sur un film de gaz . II est nécessaire, dans le cadre notamment de la détermination de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques et/ou organiques par des méthodes d'analyse diffractométriques telles que rayons X, neutrons... de parvenir à faire croître des cristaux de taille, de forme et de qualité suffisantes.
Les méthodes courantes de cristallogénèse des molécules biologiques et/ou organiques et en particulier des protéines sont décrites de manière détaillée dans le document de DUCRUIX A., GIEGE R "Crystallisation of Nucleic Acids and Proteins. A practical approach", chapter 4, "Methods of crystallization", p. 73-98. The practical approach séries. IRL Press, (Oxford University Press), 1992.
Toutes ces méthodes ont en commun le fait que l'on cherche à amener la solution de molécules ou de macromolécules biologiques dans un état de sursaturation, en effet, pour qu'il y ait croissance des cristaux, il faut d'une part que la limite de solubilité soit dépassée, c'est-à-dire qu'il y ait sursaturation : c'est l'aspect thermodynamique ; il faut ensuite que le temps de latence, c'est-à-dire le temps d'apparition des cristaux, ne soit pas trop long : c'est l'aspect cinétique. Le phénomène de nucléation est la création des premiers germes solides appelés "nucléi", c'est-à-dire germes en Français dans une solution sursaturée ; c'est la première étape de la formation d'une nouvelle phase cristallisée. On distingue deux sortes de nucléation, la nucléation homogène et la nucléation hétérogène. La nucléation est dite homogène lorsqu'il y a formation de nucléi exclusivement entre les espèces et les ions libres en solution ; la nucléation est dite hétérogène lorsqu'il y a formation de nucléi au contact d'une interface telle que parois, cristaux déjà formés, poussières, etc.
L'interface peut participer aux échanges énergétiques, ce qui a généralement pour effet de diminuer l'enthalpie libre de formation d'un germe.
Il existe une taille critique en dessous de laquelle un nucleus est instable et tendra à se redissoudre. Au-delà, le nucleus pourra croître. Ceci correspond donc à une sursaturation à dépasser pour avoir une nucléation. C'est ce qu'on appelle zone de métastabilité . Le temps de latence appelé aussi temps de germination est le temps nécessaire pour qu'un nombre suffisant de molécules se rassemblent et s'assemblent pour former des germes élémentaires stables (nucléi) .
Lorsque les embryons ont atteint la taille du nucleus critique, la croissance cristalline a lieu puisque la solution sursaturée tend vers l'état d'équilibre par précipitation.
Les procédés de cristallogénèse basés sur le principe ci-dessus, peuvent donc être classés en deux grandes catégories : à savoir d'une part les procédés avec contact, d'autre part les procédés sans contact.
Les procédés avec contact comprennent par exemple les procédés de cristallisation par dialyse, notamment par double dialyse et les procédés de cristallisation par diffusion de vapeur.
Ces derniers procédés sont parmi les procédés les plus utilisés, ils ont été par exemple utilisés pour la première fois pour la cristallisation de l'ARNt et comprennent la cristallisation en goutte suspendue, la cristallisation en goutte posée et la cristallisation en goutte sandwich qui sont représentées respectivement sur les figures 1A, 1B, 1C dans lesquelles les solutions de macromolécule (1) et les réservoirs d'agent précipitant (2) sont indiqués.
Parmi ces variantes du procédé de cristallisation par diffusion de vapeur, le plus répandu que nous prenons comme référence ci-dessous est le procédé qui est schématisé sur la Figure 2, il s'agit du procédé de cristallisation en goutte suspendue, encore dénommé "hanging drop method" dans les ouvrages en langue anglaise.
Le schéma de fonctionnement de ce procédé est le suivant, il est indiqué sur les figures 1A et 2. La goutte suspendue (22) au couvercle (21) du récipient contient par exemple une macromolécule biologique telle qu'une protéine en solution, un tampon de réglage du pH, un agent précipitant à une concentration initiale Ci. Le récipient contient par ailleurs dans sa partie réservoir (24) une solution du même agent précipitant à une concentration Cr. Le réservoir et la goutte sont séparés par un espace rempli d'air (23) . Le volume de solution dans le réservoir est très supérieur à celui de la goutte de telle sorte que Cr reste constant pendant toute la durée de la cristallisation. FOWLIS W.W., De LUCAS L.J. dans "Expérimental and theoretical analysis of the rate of solvent équilibration in the hanging drop method of protein crystal growth" ; Second International. Conf. Strasbourg, France, July 1987 ; Journal of Crystal Growth. Vol. 90, (1988) n° 1-3, pp. 117-129 ont montré que la diffusion moléculaire contrôle le processus. La tension de vapeur d'eau à la surface (25) de la goutte est supérieure à celle régnant à la surface de la solution (26) dans le réservoir. Il y a donc transfert d'eau dans le sens de la goutte vers le réservoir. La concentration en sel précipitant augmente donc progressivement au cours du temps. La température est maintenue constante pendant toute la durée de l'expérience.
Les figures 3, 4A et 4B extraites du document de Ducruix et Giégé déjà mentionné ci-dessus, donnent l'allure du diagramme de phases dans le plan : concentration en protéine en fonction de la concentration en sel précipitant.
On a représenté les courbes de solubilité (31, 41) et les courbes de précipitation (32, 42) ainsi que la zone de précipitation (33, 43) . Les concentrations initiales et finales en agent précipitant et en protéine sont représentées respectivement par Ci, Cf et Cip, Cfp.
La chronologie est la suivante : La concentration du composé précipitant (dans ce cas un sel) augmentant, la solution de protéine devient sursaturée ; puis le taux de sursaturation continuant à croître, la solution atteint le domaine de nucléation spontanée situé au-delà de la courbe de solubilité (31,41), c'est-à-dire que le point figuratif passe de A à B sur la figure 4A. Le ou les germes qui apparaissent grossissent et, de ce fait, épuisent la solution. Le point figuratif passe donc de B à C (figure 4B) . Les cristaux cessent de croître quand la limite de saturation est atteinte au point C.
Dans le cas de la cristallogénèse des protéines par les procédés courants cités ci-dessus tels que ceux du type goutte posée dénommé "sitting drop method" ou goutte suspendue, encore dénommé "hanging drop method", on ne peut éviter la nucléation hétérogène au contact des parois du récipient ainsi que les problèmes de contamination liés au support.
La gamme des moyens de contrôle de la concentration des réactifs dans la goutte est très limitée et il en est donc de même du contrôle de la nucléation et de la vitesse de croissance liées à cette concentration.
C'est la raison pour laquelle ont été développés les procédés d'élaboration dits "sans contact" qui présentent, par rapport aux procédés courants tels que ceux du type goutte posée ou suspendue, l'avantage de supprimer ces problèmes de nucléation hétérogène et de contaminations liées au support, ainsi que d'offrir la possibilité de suivre aisément la composition dans la goutte.
Il existe de nombreux procédés et dispositifs d'élaboration sans contact de cristaux tels que des cristaux de protéine ; il s'agit par exemple du procédé dit de cristallisation par "pression de radiation optique" mettant en oeuvre un laser qui est décrit dans le document de A. ASHKIN : "Application of Laser Radiation Pressure" ; Science, 5 December 1980, Vol. 210, N°4474, p 1081-1088 où est évoquée l'application éventuelle de la pression de radiation à l'étude de processus fondamentaux tels que la sursaturation de gouttes ou leur cristallisation. Un autre procédé est le procédé dit de cristallisation par lévitation électrostatique qui est décrit dans le document de RHIM .K., CHUNG S.K., HYSON M. T., ELLEMAN D. D. "Charged drop levitators and their applications" ; Material Processing in the reduced gravity environment of space. Symposium tenu du 1 au 3 Décembre 1986, Boston, Mass., U.S.A. Material Research Society Symposia Proceedings. Volume 87. 1987, p. 103-112.
Ce procédé réalisable en l'absence de pesanteur, dans l'espace, ou au sol consiste à mettre en lévitation entre deux électrodes une goutte d'eau chargée d'un diamètre de 3 mm, et à y faire croître par exemple un cristal de NaCl.
Le document de RHIM .K., CHUNG S.K. "Containerless protein crystal growth method". Crystal growth of Biological Macromolecules . Third International. Conf. Washington, U.S.A. Août 1989, Journal of Crystal Growth. Vol. 110, (1991) n° 1-2, p. 293-301, est également relatif à un procédé de lévitation électrostatique, dans lequel on fait croître des cristaux de protéines, par exemple de lysozyme de blanc d'oeuf de poule à partir de gouttes placées en lévitation électrostatique dans des laboratoires spatiaux en microgravité ou dans des laboratoires au sol à gravité normale de 1 g. Il est indiqué que la taille de la goutte d'eau que l'on peut placer en lévitation ne peut excéder environ 86 μl et en pratique ne dépasse pas 30 μl .
Un autre procédé est le procédé de lévitation acoustique qui est notamment décrit dans le document de TRINH E.H. "Compact acoustic lévitation device for studies in fluid dynamics and material science in the laboratory and microgravity" . Review of Scientific Instruments. Vol. 56(11), November 1985, p. 2059-2065, et le document de TRINH E.H., ROBEY J., ARCE A., GASPAR M. "Expérimental studies in fluid mechanics and material science using acoustic lévitation". Material Processing in the reduced gravity environment of space. Symposium tenu du 1 au 3 Décembre 1986, Boston, Mass., U.S.A., Material Research Society Symposia Proceedings. Volume 87. 1987, p. 57-69.
Ce procédé, applicable dans des conditions de gravité normale et de microgravité, a permis la lévitation de gouttes de 2 mm de diamètre, et la cristallisation, notamment de O-terphényle . Les deux derniers procédés décrits ci-dessus ont été associés dans un procédé hybride acoustique et électrostatique dans le document de RHIM W.K., CHUNG S.K., TRINH E. H., ELLEMAND D.D. : "Charged drop dynamics experiment using an electrostatic-acoustic hybrid System" ; Material Processing in the reduced gravity environment of space ; Symposium tenu du 1 au 3 Décembre 1986, Boston, Mass., U.S.A., Material Research Society Symposia Proceedings. Volume 87. 1987, pp 329-337 ou des gouttes chargées des gouttes de 3 mm de diamètre ont été placées électrostatiquement en lévitation puis mises acoustiquement en rotation et en oscillation.
Les documents de COUTURES J.P., RIFFLET J.C., BILLARD D., COUTURES P. "Contactless treatment of liquids in a large température range by an aerodynamic lévitation device and laser heating" ; Proc. of the 6th European Symposium on Material Sciences under microgravity conditions, Bordeaux, 2-5 Décembre 1986, ESA SP-256, 1987, p. 427-430, et de WEBER J.K.R., SCHIFFMAN R.A., KRISHNAN S., NORDINE P.C. "Containerless processing and property measurements of high température liquids and solids" ; Proc. of the 7th European Symposium on Material Sciences under microgravity conditions, Oxford, RU 10-15 Septembre 1989, ESA SP-295, 1990, p. 639-643 ont trait à un procédé associant un dispositif aérodynamique et un chauffage avec un laser à C02 pour étudier à haute température la solidification de liquides, sans contact, afin d'obtenir des matériaux amorphes, vitreux.
Enfin les documents de
- WEBER J.K.R. , NORDINE P.C. : "Containerless Liquid phase Processing of Ceramic Materials", Microgravity Science and Technology, Vol. VII/4, Février 1995, p. 279-282, et de
- WEBER J.K.R. , et de HAMPTON D.S., MERKLEY D.R. REY C.A., ZATARSKY M. M., NORDINE P.C. : "Aero-acoustic lévitation : A method for containerless liquid-phase processing at high température" ; Review of Scientific Instruments. Vol. 65 (2), Février 1994, p. 456-465, décrivent-ils dans un environnement de microgravité, l'association de procédés de lévitation aéro-acoustique et aérodynamiques avec un chauffage et une fusion par laser pour étudier le traitement, et en particulier la solidification, de céramiques et de verres .
Tous les procédés d'élaboration sans contact décrits ci-dessus, s'ils permettent de surmonter certains des inconvénients des procédés classiques avec contact, ne permettent de traiter que de très faibles volumes de solution, à titre d'exemple, les ordres de grandeur des capacités maximum actuelles des procédés d'élaboration sans contact vont de 10"° ml pour le procédé à pression de radiation jusqu'à 10"1 ml pour les autres procédés, ce qui est notoirement insuffisant notamment pour faire croître des cristaux de dimension suffisante aux fins d'analyse radiocristallographiques .
Par ailleurs, le document FR-A-2 509 637 décrit le procédé de sustentation sur film de gaz qui permet la sustentation, le positionnement et le moulage d'une masse liquide, sans contact avec une paroi. La masse liquide est séparée de la paroi par une couche sous pression d'un gaz chimiquement inerte vis-à-vis de la masse liquide et du matériau constitutif de la paroi. Ce procédé permettrait de sustenter un volume de solution très supérieur à ceux des procédés mentionnés ci-dessus et pourrait être utilisé pour des volumes jusqu'à 10 ml et pouvant atteindre 100 ml. Ce document décrit également l'application de ce procédé à la sustentation de gouttes liquides sur une paroi poreuse plane et horizontale, à la mise en forme d'une masse liquide à l'intérieur d'un récipient cylindrique dont le fond et les parois sont poreux, afin de permettre le passage d'un gaz, à la fusion de zone sur des pièces de dimensions importantes, à la mise en forme d'une pièce cylindrique liquide en micro-gravité, à la coulée continue, et à la réalisation de monocristaux par traction verticale. Toutes ces opérations sont donc des opérations réalisées en milieu homogène, et à l'origine, monophasique, concernant en particulier des changements d'état d'un seul et même composé. Il s'agit par exemple de la fusion, de la solidification d'un lingot homogène. Il ne se produit pas au sein de la masse une quelconque réaction chimique, ou une cristallisation ou autre, impliquant la présence de plusieurs réactifs ou d'un couple solvant-soluté (s) .
Ce procédé a été mis en oeuvre jusqu'à présent exclusivement dans le domaine limité de la métallurgie et a été confiné à des applications spécifiques en milieu homogène, et n'a pas été appliqué à la réalisation d'une réaction dans un milieu liquide hétérogène comprenant une pluralité de réactifs, par exemple à une cristallisation ou cristalogénèse en solution impliquant un ou des solvant (s) et un ou plusieurs soluté (s).
Le document FR-A-2 742 771 est relatif à un dispositif et à un procédé d'élaboration de cristaux et en particulier de cristaux organiques et/ou biologiques par sustentation sur un film de gaz.
La structure du dispositif décrit dans ce document est reproduite sur la figure 6 jointe qui correspond également à la figure 6 du document FR-A-2 742 771 auquel on pourra se reporter.
Le dispositif représenté sur la figure 6 reprend essentiellement une enceinte (61) à double paroi réalisée par exemple sous la forme de deux demi- enceintes dont l'une d' entre-elles forme couvercle. Cette enceinte est pourvue de moyens permettant de réguler la température intérieure qui se présentent en particulier sous la forme d'une double paroi dans laquelle circule un liquide thermostaté (62) en provenance de la boucle de thermostatage. De plus l'enceinte est de préférence doublée par un matériau calorifuge (63) .
L'expérience en cours à l'intérieur de l'enceinte peut être suivie par l'intermédiaire d'un hublot apical unique (64) prévu dans la double paroi. L'enceinte est munie de plusieurs connecteurs (65, 66) ou d'autres moyens permettant de faire traverser cette enceinte aux différents câblages et alimentations reliés aux divers moyens et dispositifs de mesure, sondes, par exemple sonde d'hygrométrie, et capteurs disposés à l'intérieur de l'enceinte.
Ainsi, sur la figure 6, le dispositif comprend-il un premier connecteur (65) pour le passage des fils reliés aux moyens de mesure de la température tels que des sondes (67, 68) à résistance de platine "Pt 100" de mesure de la température; et un second connecteur (67) pour le support et la connexion d'une sonde d'hygrométrie (618). L'enceinte comprend aussi des moyens tels qu'un piquage pour l'alimentation en gaz de balayage (69) tel que de l'air ou de l'azote.
L'enceinte comprend également des moyens tels qu'un perçage (620) pour réaliser l'évacuation des gaz de l'enceinte.
La partie essentielle du dispositif selon l'invention est constituée par les moyens permettant de mettre le milieu en sustentation qui prennent sur la Fig.6 la forme d'un diffuseur (610) dont la partie utile est, par exemple, un secteur spherique qui est monté sur une chambre de pressurisation (611) comportant des moyens de régulation de la température qui consistent de préférence, comme montré sur la figure 6 en un serpentin (612) alimenté par un fluide de thermostatage par le tube (613).
Le diffuseur comporte également des moyens de mesure de la température constitué par exemple par une sonde de température, par exemple de type à résistance de platine "Pt 100" (614) dont le câble de connexion (615) passe par le piquage d'alimentation en gaz de sustentation (616) .
Par ailleurs, la figure 7 du document FR-A- 2 742 771 représente l'installation complète de sustentation, notamment pour la sustentation de solutions aqueuses sur film de gaz, permettant en particulier de réaliser la cristallogénèse de protéines. Cette installation comprend en particulier des moyens d'observation du liquide placé en sustentation. Ces moyens d'observation comprennent par exemple un microscope stéréoscopique, grâce auquel on peut observer la goutte, soit directement à l'oculaire, soit sur un moniteur de télévision via une caméra.
Le dispositif décrit dans le document FR-A- 2 742 771 en particulier sur la figure 6 de ce document présente l'inconvénient de ne pouvoir traiter qu'une seule goutte ou milieu de sustentation à la fois.
En effet, bien qu'il soit indiqué dans ce document qu'il serait éventuellement possible de concevoir un appareil permettant la sustentation simultanée de plusieurs milieux ou gouttes, aucun exemple de réalisation n'est donné.
Le fait de ne pouvoir traiter qu'une seule goutte à la fois est extrêmement préjudiciable, car alors le résultat de l'expérience unique est fortement influencée par de nombreux paramètres peu ou pas contrôlés qui nuisent au bon aboutissement de la cristallogénèse et qui « bruitent » le résultat de 1' expérience . Dans les procédés courants tels que le procédé de référence à goutte suspendue, il est possible au contraire de réaliser de nombreux essais en parallèle ce qui permet de ce fait de s'affranchir de l'influence de ces paramètres. La durée d' une expérience de cristallogénèse est importante, généralement de 10 à 100 heures. Si donc la goutte présente un problème conduisant à l'échec de l'expérience, un temps important est perdu. Avec une expérience mettant en jeu plusieurs gouttes, il est rare que toutes les gouttes aient un problème avant le terme programmé.
Enfin, le système d'observation décrit sur la figure 7 du document FR-A-2 742 771 se limite comme on l'a indiqué plus haut, à une mesure de la variation de la taille de la goutte en fonction du temps grâce à une caméra vidéo. Le seul accès optique à l'échantillon est constitué par l'unique hublot à apical.
Même si l'on essayait de faire croitre plusieurs milieux dans le dispositif du FR-A-2 742 771, leur observation, leur contrôle ou leur manipulation ne serait pas possible.
Il existe donc un besoin pour un dispositif d'élaboration de cristaux dans des milieux mis en sustentation sur un film de gaz, qui permette notamment la mise en sustentation simultanée de plusieurs milieux d'élaboration de cristaux, ou gouttes, tout en assurant l'observation, et/ou la manipulation et/ou le contrôle de chaque milieu d'élaboration de cristaux sans perturber le processus de cristallisation et la continuité et la qualité de la sustentation.
L' invention a pour but de fournir un dispositif d'élaboration de cristaux dans des milieux mis en sustentation sur des films de gaz, qui réponde, entre autres aux besoins indiqués ci-dessus, qui ne présente pas les inconvénients, désavantages, et limitations des dispositifs de l'art antérieur, et qui résolve les problèmes posés par les dispositifs de l'art antérieur. Ce but et d'autres encore sont atteints conformément à l'invention par un dispositif d'élaboration de cristaux dans des milieux mis en sustentation sur des films de gaz, comprenant une enceinte de traitement, des moyens ou diffuseurs pour mettre lesdits milieux simultanément en sustentation sur des films de gaz, et des moyens d'observation et/ou de contrôle, et/ou de manipulation desdits milieux mis en sustentation, dans lequel ledit dispositif comprend au moins deux diffuseurs, et des moyens pour déplacer lesdits diffuseurs à l'intérieur de ladite enceinte de traitement, maintenir en permanence lesdits milieux en sustentation, et permettre la manipulation et/ou l'observation et/ou le contrôle desdits milieux mis en sustentation par lesdits moyens de manipulation et/ou d'observation et/ou de contrôle.
Du fait que le dispositif selon l'invention comporte plusieurs diffuseurs, autrement dit, au moins deux diffuseurs, le traitement simultané de plusieurs milieux d'élaboration, tels que des gouttes est possible, et il n'y a en fait pas de limite physique au nombre de gouttes qui peuvent être sustentées.
En conséquence, le dispositif selon l'invention associe de manière surprenante les avantages inhérents au dispositif d'élaboration de cristaux mettant en oeuvre la sustentation sur films de gaz aux avantages liés à la réalisation simultanée de plusieurs cristaux.
Selon une caractéristique essentielle du dispositif selon l'invention celui-ci est pourvu de moyens pour déplacer les diffuseurs à l'intérieur de l'enceinte de traitement et permettre leur manipulation et/ou leur observation et/ou leur contrôle par les moyens de manipulation et/ou d'observation et/ou de contrôle . Ces moyens pour déplacer les diffuseurs peuvent par exemple être désigné sous le nom général de porte-diffuseurs et peuvent se présenter sous différentes formes selon le déplacement que l'on souhaite voir effectuer aux diffuseurs. Ledit déplacement peut être un déplacement quelconque.
Ce déplacement est par exemple un déplacement alternatif ou séquentiel. Ledit déplacement peut être encore un déplacement linéaire selon un axe unique ou bien un déplacement selon deux axes, par exemple orthogonaux, ou encore un déplacement curviligne, par exemple circulaire. Grâce au dispositif de l'invention qui comporte des moyens pour déplacer les diffuseurs, et du fait que ces moyens ou porte-diffuseurs sont mobiles à l'intérieur de l'enceinte de traitement, et qu'ils permettent en outre de maintenir les milieux en sustentation en permanence et en particulier tout au long du déplacement, il est possible de faire « défiler » par exemple successivement et/ou alternativement tous les milieux mis en sustentation, par exemple toutes les gouttes sustentées à l'emplacement ou aux emplacement prévus pour leur observation et/ou leur contrôle et/ou leur manipulation. Il est possible de positionner précisément les milieux mis en sustentation dans le champ d'action des moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation, par exemple des moyens d'observation, sans que la qualité de la sustentation et donc de la cristallogénèse se voit en aucune façon affectée .
De préférence, selon une forme de réalisation particulièrement avantageuse de l'invention, on fait « défiler » les milieux mis en sustentation tels que les gouttes sustentées, par exemple successivement, au même endroit, ce qui permet de ne mettre en place qu'un seul dispositif d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation. Cela simplifie grandement le dispositif selon l'invention, car le nombre de moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation tels que des appareils de diagnostic et/ou de téléopération se trouve fortement réduit, ce qui se répercute de manière positive sur le coût global du dispositif selon l'invention, en égard au caractère onéreux de ce type d'appareils.
Dans une première forme de réalisation du dispositif selon l'invention, lesdits moyens pour déplacer les diffuseurs comprennent un barillet tournant supportant lesdits diffuseurs.
Dans une deuxième forme de réalisation du dispositif selon l'invention lesdits moyens comprennent une plaque support sur laquelle les diffuseurs sont disposés selon une matrice pouvant être déplacée par exemple de manière linéaire et orthogonale.
Dans une troisième forme de réalisation du dispositif selon l'invention lesdits moyens comprennent une bande support sur laquelle est disposée une rangée de diffuseurs et pouvant être déplacée de manière linéaire et alternative.
Afin de maintenir en permanence les milieux en sustentation c'est-à-dire en particulier au cours de leur déplacement les moyens pour déplacer les diffuseurs à l'intérieur de l'enceinte comprennent en outre des moyens d'alimentation en gaz de sustentation, généralement sous la forme d'une chambre unique d'alimentation en gaz de sustentation alimentant l'ensemble des diffuseurs et recevant une canalisation d'alimentation en gaz de sustentation.
Les moyens pour déplacer les diffuseurs, comprennent en outre des moyens d' entrainement généralement sous la forme d'un axe ou arbre actionné par un moteur. Ces moyens d' entrainement sont adaptés au mode de réalisation indiqué plus haut, ainsi, dans le cas où les moyens pour déplacer les diffuseurs comprennent un barillet tournant, lesdits moyens d' entrainement comprennent un axe rotatif supportant ladite chambre unique d'alimentation, ledit axe étant entrainé, actionné par un moteur.
De préférence, l'axe est creux et joue également en outre le rôle de canalisation d'alimentation.
Selon l'invention et de nouveau afin de maintenir les milieux en sustentation au cours de leur déplacement, les moyens d'alimentation en gaz de sustentation sont pourvus de moyens de connection permettant de les adapter aux moyens d' entrainement .
Ainsi, dans le cas où les moyens d'alimentation comprennent une canalisation d'alimentation confondue avec l'axe des moyens d' entrainement, l'alimentation en gaz de sustentation est réalisée par l'intermédiaire de moyens de connection comprenant un joint tournant ou glissant.
Les moyens d'observation comprennent généralement au moins un hublot, selon l'invention l'enceinte de traitement comprend au moins un hublot latéral par exemple de 1 à 10 hublots latéraux qui permettent une observation optimale des milieux mis en sustentation.
Les moyens de manipulation et/ou de contrôle comprennent des moyens choisis parmi des moyens de diagnostic in situ, les moyens de télémanipulation, etc...
L' invention a également trait à un procédé d'élaboration de cristaux dans des milieux mis simultanément en sustentation sur des films de gaz dans une enceinte de traitement dans lequel lesdits milieux mis en sustentation sont au nombre d'au moins 2 et sont déplacés à l'intérieur de ladite enceinte de traitement tout en les maintenant en permanence en sustentation, afin de permettre leur observation et/ou leur contrôle et/ou leur manipulation.
L'invention apparaîtra plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple illustratif et nullement limitatif, en référence aux dessins joints dans lesquels : - les figures 1A, 1B et 1C sont des représentations schématiques des procédés de l'art antérieur les plus courants, à savoir goutte suspendue : fig. 1A, goutte posée : fig. 1B, et goutte sandwich : fig. 1C; - la figure 2 est une représentation schématique de la cristallisation par le procédé en goutte suspendue "hanging drop method";
- les figures 3, 4A et 4B donnent une représentation schématique du diagramme de cristallisation dans les procédés mettant en oeuvre la diffusion de vapeur. La concentration en protéine est représentée en ordonnée et la concentration en agent de cristallisation ou de précipitation est représentée en abscisse; - la figure 5 représente schématiquement le principe d'un dispositif selon l'invention et sert de référence pour définir les différents paramètres qui influencent la cristallisation et les notations utilisées; - la figure 6 illustre la structure de l'enceinte de traitement décrite dans le document FR-A- 2 742 771; la figure 7 est une vue en coupe schématique d'un dispositif selon l'invention dans une forme de réalisation où le défilement des gouttes est réalisé par un barillet tournant;
- la figure 8 est le tableau synoptique général d'une installation de cristallogénèse de protéines par sustentation sur film de gaz, incluant le dispositif selon l'invention;
Le dispositif selon l'invention qui comporte plusieurs diffuseurs, permet la sustentation simultanée de plusieurs milieux mis en sustentation. De préférence chacun des diffuseurs sustente un seul milieu ce qui permet d'une part une séparation physique des milieux mis en sustentation, d'autre part le découplage des milieux en cas de mouillage de l'un d'entre eux et enfin une maintenance, un nettoyage et un reconditionnement facile des diffuseurs entre deux expériences.
Le nombre des diffuseurs peut aller par exemple de 2 à 12 de préférence de 4 à 6.
Selon l'invention, chacun des milieux mis en sustentation a de préférence la forme d'une goutte, cette forme étant dictée entre autres par les caractéristiques inhérentes au procédé
Chaque milieu peut être tout milieu pouvant être mis en sustentation de manière adéquate, mais il s'agit de préférence d'une masse fluide, liquide ou gélifiée.
Chaque milieu est encore de préférence une solution, de préférence une solution aqueuse, mais il est bien évident que d'autres solvants ou mélanges de solvants peuvent être envisagés tels que alcools, polymères, fluorocarbones, sels, laitiers, ...
La solution peut comprendre un seul des composés indiqués ci-dessus comme solvant, mais peut aussi comprendre un mélange de deux ou plus de ces solvants. L'eau est le solvant préféré, en particulier lorsqu'on désire élaborer des cristaux organiques et/ou biologiques tels que des cristaux de macromolécules organiques et/ou biologiques, par exemple de protéine (s).
Le solvant peut également contenir un composé appelé « sel précipitant ».
Il peut s'agir d'un composé organique, ou inorganique par exemple minéral tel que le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, ou bien un polymère, un alcool tel que le polyéthylène glycol ou le méthyl-pentanediol .
Le ou les composé (s) à cristalliser est (sont) quelconque et peuvent être un (des) composé (s) organique (s) ou minéral (minéraux) .
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée du procédé selon l'invention, le (les) composé (s) à cristalliser est (sont) une (des) macromolécule (s) organique (s) et en particulier une (des) macromolécule (s) biologique (s) telles que les acides 'nucléiques et en particulier des protéines telles que les enzymes, les hormones, les récepteurs, etc.
Le dispositif selon l'invention est en effet particulièrement avantageux pour la cristallogénèse des macromolécules biologiques car du fait du meilleur contrôle, de la meilleure observation de la cristallisation qu'il permet, une meilleure connaissance des paramètres de germination croissance est ainsi possible.
Il en découle une meilleure maîtrise de la cristallogénèse, en particulier des macromolécules biologiques. Les connaissances acquises par la caractérisation du cristal permettant ensuite une meilleure maîtrise du génie bio-moléculaire. Le composé à cristalliser est généralement présent à une concentration initiale dans, le milieu comprise entre 1 et 30 g/ml.
On peut faire croître dans chacun des milieux, par exemple gouttes, mis en sustentation, un ou plusieurs cristaux selon l'application que l'on fait du procédé selon l'invention.
Par exemple, si l'on souhaite obtenir un cristal de taille, de forme et de qualité suffisantes pour pouvoir effectuer l'étude de sa structure, il sera préférable de ne faire croître qu'un cristal par milieu ou goutte ; le dispositif selon l'invention où l'on peut mettre plusieurs milieux simultanément en sustentation pour élaborer simultanément plusieurs cristaux s'avère alors particulièrement avantageux.
Si le procédé selon l'invention est utilisé comme technique séparative, par exemple par cristallisation fractionnée, il sera alors préférable de faire croître plusieurs cristaux par milieu ou goutte.
Tous les milieux mis en sustentation dans le dispositif selon l'invention peuvent être identiques, mais un ou plusieurs de ces milieux peuvent également avoir une composition différente des autres. Comme on l'a déjà mentionné plus haut, l'application du dispositif selon l'invention en vue en particulier de l'obtention d'un cristal de dimension satisfaisante peut s'opérer de deux manières.
Soit, dans une première variante, on part d'une solution limpide contenant le composé à cristalliser et l'on provoque la nucléation d'un germe, puis sa croissance. Soit on introduit un germe exogène d'une taille par exemple de quelques microns à quelques dizaines de microns dans la solution, c'est ce que l'on appelle l'ensemencement, puis on le fait croître. Chaque milieu mis en sustentation peut également comprendre un composé par exemple un sel précipitant, cité plus haut, tel que le NaCl ou le
(NH4)2S04 à une concentration initiale comprise entre 5 et 50 % (poids ou volume) .
Un tampon de réglage du pH peut également être présent dans chaque milieu : ce tampon peut être choisi parmi les systèmes tampons connus de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un tampon TRIS permettant de tamponner le milieu (aqueux) à un pH de 8,5 à 7 ou encore d'un tampon cacodylate permettant de tamponner le milieu à un pH de 6 à 5.
On a vu ci-dessus que le volume initial de chaque milieu, c'est-à-dire par exemple de chaque goutte est, de préférence, conformément à l'une des caractéristiques avantageuses de l'invention compris entre 30 et 100 μl, et mieux encore entre 50 et 60 μl, ce qui est un volume sensiblement plus important que les volumes initiaux des milieux des dispositifs de l'art antérieur sans contact.
Le gaz utilisé pour la mise en sustentation doit de préférence être chimiquement neutre vis-à-vis du milieu mis en sustentation ; on utilisera de préférence un gaz tel que l'hélium, l'argon, l'azote ou bien encore l'air filtré.
Le débit de gaz de sustentation doit être suffisant pour maintenir le milieu en sustentation ; il doit également être constant et peut être déterminé aisément par l'homme du métier dans ce domaine de la technique ; il sera compris de préférence entre 1 et 100 ml/mn.
Le dispositif selon l'invention peut être mis en oeuvre dans des conditions de gravité normale, par exemple au sol, ou bien dans des conditions de gravité réduite ou de microgravité, par exemple dans un vaisseau spatial.
Le dispositif selon l'invention selon l'une de ses caractéristiques particulièrement avantageuse permet de maîtriser, de réguler, de contrôler le processus d'élaboration par l'intermédiaire d'un certain nombre de paramètres.
La figure 5 illustre de manière schématique le principe général d'un dispositif selon l'invention, et effectue l'inventaire des paramètres influents et des notations utilisées dans le cas général de la sustentation sur film de gaz d'une masse fluide ou gélifiée.
Le principe du dispositif selon l'invention qui est un perfectionnement du dispositif selon le document FR-A- 2 742 771 est analogue à celui du dispositif décrit dans ce document, de ce fait la figure 5 est analogue à la figure 5 du document FR-A-2 742 771. Ce dispositif comprend essentiellement des moyens permettant de mettre le milieu en sustentation sous la forme par exemple de plusieurs diffuseurs ; par souci de clarté, on a représenté sur la figure 5 seulement l'un de ces diffuseurs. Ce diffuseur, désigné généralement par la référence (51), est placé dans une enceinte (52) .
Le gaz de sustentation (53) alimente le diffuseur (51) représenté, par l'intermédiaire de moyens d'alimentation sous la forme par exemple, d'une canalisation d'alimentation (54) traversant l'enceinte (52). Le gaz en excès est évacué par l'intermédiaire de moyens d'évacuation sous la forme par exemple d'un orifice d'échappement (512) .
Les diffuseurs peuvent être notamment du type de celui décrit dans le document FR-A-2 509 637 déjà mentionné ci-dessus, c'est-à-dire que la masse du milieu à supporter, qui peut être par exemple une goutte (55) d'une masse fluide ou gélifiée, est supportée au-dessus d'une paroi (56) à l'aide d'un film de gaz (57) .
La plaque (56) est poreuse et constitue la paroi diffusante d'une chambre permettant la mise en pression et en température du gaz employé.
On force le gaz, tel que l'hélium, ou autre à travers cette paroi qui peut être par exemple constituée de graphite, ou céramique, ou matériau synthétique et avoir une épaisseur, par exemple de 1 à 5 mm.
A l'aide d'un dispositif d'injection constitué par exemple, par une seringue munie d'une aiguille, on forme une goutte pendante que l'on approche progressivement de la paroi diffusante de manière à favoriser la formation du film de gaz entre la goutte et ladite paroi. Quand la goutte sustente sur le filtre on augmente progressivement son volume puis on rompt le ménisque de liaison à l'aiguille par éloignement de celle-ci .
Afin de maintenir la goutte (55) au même endroit de la surface externe de la plaque (56) , on a donné à celle-ci sur la figure 5 une forme légèrement concave.
En effet, le poids de la goutte étant équilibré par la pression du film de gaz, si aucune force de rappel ne la maintient, elle acquiert une grande mobilité sous l'effet de forces minimes non contrôlées. C'est pourquoi l'on prévoit de préférence une telle forme de paroi légèrement concave afin d'éviter un déplacement accidentel de la goutte. On a vu dans ce qui précède que dans le cas du procédé courant dit de la goutte suspendue de nombreux auteurs ont étudié le mécanisme des transferts de masse, à savoir essentiellement de la vapeur d'eau entre la goutte et le réservoir. La diffusion moléculaire de la vapeur d'eau dans l'air explique assez bien la cinétique de variation de la concentration en sel précipitant en fonction du temps. Le temps nécessaire à l'obtention de l'équilibre est de l'ordre de la centaine d'heures.
Dans le cas de la sustentation sur film de gaz, du fait du débit de gaz, de préférence d'air nécessaire à la sustentation, on a un système ouvert. La convection forcée autour du milieu mis en sustentation par exemple de la goutte "balaye" la couche limite, et on a une évacuation permanente par exemple d'eau qui doit être compensée par ailleurs.
La figure 5 donne l'inventaire des paramètres influents et les notations utilisées : - Qg désigne le débit de gaz de sustentation arrivant par la canalisation (54),
- Rhg, Tg désignent l'hygrométrie relative et la température (°C) du gaz de sustentation (53).
- Td désigne la température du diffuseur prise en (58) à l'aide de moyens de mesure de la température Td, par exemple à l'aide d'une sonde de température sous forme de sonde à résistance de platine ou thermistance.
- Ta et Rha désignent la température de la goutte, supposée isotherme, et l'hygrométrie relative à sa surface en (59) ,
- Tœ et RHœ désignent la température et l'hygrométrie relative dans l'enceinte, loin de la goutte, par exemple en (510) et peuvent être mesurées par des moyens de mesure, par exemple par des capteurs et sondes, adéquats,
- Tp désigne la température de la paroi de l'enceinte prise par exemple en (511) à l'aide de moyens de mesure, par exemple à l'aide d'un ou de plusieurs sonde (s) ou capteur (s), adéquat (s), tels que sonde (s) à résistance de platine (Pt) ou thermistance.
En première approximation Tp est égal à Tg qui est voisin de Td, à savoir par exemple de 0 à 40°C. Les flux surfaciques par exemple de vapeur d'eau sont proportionnels au gradient de concentration dans la couche limite de la phase gazeuse à la surface de la goutte.
Compte tenu des contraintes géométriques liées au procédé de sustentation, le volume de l'enceinte est supérieur à celui du procédé, pris comme procédé de référence à savoir le procédé dit "goutte suspendue", par exemple le volume de l'enceinte est de deux ordres de grandeur supérieurs à celui du procédé de référence.
Un circuit de gaz humide additionnel tel que de l'air permet d'une part de diminuer la constante de temps d'établissement du degré hygrométrique souhaité dans l'enceinte après ouverture, et d'autre part de le maintenir pendant toute la durée de 1 ' expérience .
Le dispositif selon l'invention permet de maîtriser et de contrôler la nucléation, puis la vitesse de croissance des faces des cristaux par l'intermédiaire de l'un ou de plusieurs des paramètres énumérés ci-dessus : par exemple, on pourra réaliser une évaporation de la goutte à T∞ constante et RH» variable ou une évaporation de la goutte à T∞ variable, ou bien une évaporation de la goutte par variation de Rhg et/ou Tg, ou on peut faire varier les concentrations par injection de solvant ou de réactifs dans la goutte, ou enfin on peut faire varier la concentration en sel précipitant dans le réservoir à l'image de ce qui se fait dans le procédé de référence à goutte suspendue. La figure 7 est une vue en coupe schématique du dispositif selon l'invention dans une forme de réalisation où le défilement des gouttes est réalisé par un barillet tournant.
Le dispositif selon l'invention peut être défini comme un perfectionnement au dispositif de l'art antérieur tel que décrit dans le document FR-A-2 742 771 et sur la figure 6.
Le dispositif de la figure 7, selon l'invention, se différentie essentiellement du dispositif de la figure 6 par le fait qu'il comporte plusieurs diffuseurs, des moyens pour déplacer ces diffuseurs sous la forme d'un barillet tournant, ainsi que des moyens d' alimentation en gaz de sustentation adaptés à la présence d'une pluralité de diffuseurs. De ce fait, la description qui suit, faite en référence à la figure 7, portera essentiellement sur les éléments du dispositif selon l'invention qui sont différents du dispositif de l'art antérieur selon la figure 6 et/ou qui sont ajoutés à celui-ci. Le reste du dispositif est pour l'essentiel analogue au dispositif de la figure 6 et n'est pas généralement décrit de manière plus approfondie, on pourra donc se reporter à la figure 6, déjà décrite, ou au document FR-A-2 742 771. Le dispositif selon l'invention comprend essentiellement une enceinte (71) qui est une enceinte à double paroi.
Selon la figure 7, l'enceinte est réalisée sous la forme de deux demi-enceintes, l'une d'entre elles formant un couvercle à double-paroi (72) et l'autre formant un fond à double-paroi (73).
Entre les deux demi-enceintes (72,73) est prévu par exemple un joint d'étanchéité (74). Cette enceinte est pourvue de moyens permettant de réguler la température intérieure c'est-à-dire la température de la goutte et de l'atmosphère de l'enceinte. Ces moyens se présentent en particulier sous la forme d'une circulation de liquide thermostaté (75) , par exemple de l'eau, ou un mélange d'eau et d' éthylène glycol, en provenance de la boucle de thermostatage décrite à la figure 8.
Le liquide thermostaté est introduit dans la double paroi par les tubes (76) (77) et en ressort par les tubes (78) (79) .
Ces moyens de régulation de la température ne constituent qu'une exemple de réalisation. On peut également concevoir un système de régulation et de contrôle de la température de la goutte faisant appel par exemple à un chauffage par micro-ondes dans le cas de fluides diélectriques tels que l'eau, les solvants organiques etc...; à un chauffage par induction haute fréquence dans le cas de fluides conducteurs électriques; ou à un chauffage radiatif dans les deux cas .
L'enceinte est de préférence doublée par un matériau calorifuge (701) tel que du liège ou une mousse synthétique ce qui permet de maintenir à l'intérieur de l'enceinte une température de préférence de 0 à 40°C de préférence encore supérieure à 0°C et sensiblement constante c'est-à-dire de préférence avec une variation ne dépassant pas ± 0,05°C.
Le dispositif de la figure 7 comporte conformément à l'invention des moyens d'observation sous la forme de hublots (702, 703, 704), disposés dans des traversée pratiquées dans la double paroi de l'enceinte, par exemple, dans le couvercle et dans les parois latérales.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse du dispositif selon l'invention; celui-ci, en plus du hublot apical (702) unique analogue à celui dont est pourvu le dispositif de l'art antérieur comporte un certain nombre de hublots latéraux.
Ainsi, le dispositif de la figure 7, comprend-il quatre hublots latéraux qui permettent l'éclairage et l'observation radiale des gouttes. Seuls deux de ces hublots (703, 704) ont été représentés.
Les traversées de paroi peuvent également être pourvues de moyens de contrôle et/ou de manipulation tel que des moyens de diagnostic in-situ non invasif (par exemple un éclairage latéral, par nappe de lumière, du plan équatorial de la goutte, permettant un examen en fond noir et, par suite, la détection du passage des germes cristallins entraînés par les courants de convection dans la goutte) , des moyens de téléopération ou de télémanipulation (par exemple un système d'aiguille d'injection/prélèvement permettant soit de modifier la composition de la solution soit de déposer un germe cristallin pour ensemencer la solution mère) .
Il est possible grâce aux caractéristiques du dispositif selon l'invention d'effectuer des opérations de télémanipulation sans risquer de modifier la qualité de l'atmosphère de traitement des gouttes. Les moyens de manipulation peuvent par exemple permettre le dépôt et le prélèvement des gouttes, des ajouts divers permettant de modifier la composition de la solution, etc.
En particulier, le dépôt des gouttes peut être réalisé à l'aide d'une aiguille d'injection dans une configuration où l'enceinte est fermée, par exemple en montant une membrane perforable à la place d'un hublot.
Ceci permet d'attendre la mise en équilibre hygrométrique de l'atmosphère de l'enceinte durant le dépôt des gouttes, et ainsi de raccourcir la durée d'une opération de cristallogénèse.
L'enceinte est également munie de plusieurs connecteurs ou d' autres moyens permettant de faire traverser la double paroi de l'enceinte aux différents câblages, alimentations, etc.. reliés aux divers moyens et dispositifs de mesure, sondes capteurs disposés à l'intérieur de l'enceinte. On se reportera à ce propos à la figure 6. L'enceinte comprend par exemple des moyens sous la forme de piquages et de canalisations (705,
706), pour l'alimentation d'un injecteur annulaire
(707) de gaz de balayage.
Le gaz peut être par exemple de l'air ou de l'azote, et il est bien entendu choisi pour être compatible avec les réactifs mis en oeuvre ainsi qu'avec les matériaux formant le diffuseur, l'enceinte, les moyens de mesure etc...
Ce gaz est généralement le même que le gaz de sustentation, et il s'agit généralement d'un gaz dont l'humidité est contrôlée afin de réguler l'hygrométrie dans l'atmosphère de l'enceinte.
Selon l'invention, le dispositif comporte plusieurs diffuseurs, ainsi le dispositif représenté sur la figure 7 comporte-t-il quatre diffuseurs dont deux sont visibles (708, 709), mais ce nombre n'est absolument pas limitatif.
Ces quatre diffuseurs dont la partie utile est par exemple un secteur spherique (710, 711) sont montés sur un barillet tournant (712) qui permet d'assurer le défilement des gouttes avec une grande précision notamment devant le hublot apical (702) .
Sur la figure 7, chaque diffuseur supporte une goutte (713, 714), une telle disposition permet, d'une part le découplage des gouttes en cas de mouillage de l'une d'entre elles, d'autre part un nettoyage, reconditionnement des diffuseurs entre deux expériences .
Les quatre diffuseurs, portant chacun une goutte de solution mère, sont placés sur le barillet tournant disposé sur la chambre unique commune haute pression d'alimentation en gaz de sustentation, dite encore chambre de pressurisation (715) .
La chambre de pressurisation peut également comprendre des moyens de régulation de la température, comme sur la figure 6.
Le porte diffuseur, c'est-à-dire l'ensemble constitué par le barillet tournant et la chambre de pressurisation est porté par un axe ou arbre rotatif (716) .
Cet axe, entrainé par un moteur (717), est de préférence creux et joue également le rôle de canalisation d'alimentation faisant partie des moyens d'alimentation en gaz de sustentation. Selon l'invention les moyens d'alimentation en gaz de sustentation sont conçus de manière à maintenir les gouttes en sustentation en permanence et en particulier pendant leur déplacement, par exemple ces moyens comportent des moyens de connection tel qu'un système de joint tournant (718) comme représenté sur la figure 7 ou bien encore dans une autre forme de réalisation un système de joint glissant, ce qui permet d' assurer une alimentation constante en gaz de sustentation de ne pas perturber la cristallogénèse. La figure 8 représente l'installation complète de sustentation notamment de solutions aqueuses sur film de gaz permettant notamment de réaliser la cristallogénèse de protéines. Dans cette installation, l'enceinte décrite ci-dessus sur la figure 7 est représentée schématiquement en (81) . La double paroi de cette enceinte est reliée à la boucle de thermostatage (82) comprenant un appareil de contrôle de la température (83) tel qu'un thermostat par les tubes d'arrivée (84) et de sortie (85) acheminant un liquide thermostaté tel que de l'eau ou l' éthylène glycol qui permet de réguler la température à l'intérieur de l'enceinte (81) à une température comprise de préférence entre 0 et 40°C, de préférence encore supérieure à 0°C, avec de préférence une variation ne dépassant pas plus ou moins 0,05°C.
Le gaz de sustentation par exemple de l'air ou de l'azote, alimentant le diffuseur à un débit de préférence de 1 à 100 ml/mn, provient de la baie de contrôle et de régulation (86) de l'alimentation en gaz, munie d'un débitmètre (87) et d'une vanne de réglage (88) du débit.
Ce gaz passe tout d'abord, avant d'être envoyé dans la canalisation (89) aboutissant dans l'enceinte, et plus précisément dans le diffuseur, dans un appareil barboteur, constitué par exemple d'un bain thermostaté (810), qui permet de régler son hygrométrie relative à une valeur comprise entre 90 et 100 % RH et sa température à une valeur de préférence comprise entre 0 40°C, de préférence encore supérieure à 0°C.
Un deuxième circuit d'alimentation en gaz permet le balayage de la chambre avec un débit de préférence de 0,1 à 5 1/mn, beaucoup plus important que celui du circuit de sustentation : ce débit est encore de préférence compris entre 0,2 et 2 1/min. De manière analogue au gaz de sustentation, le gaz de balayage qui est de préférence le même que le gaz de sustentation provient de l'arrivée commune de gaz par l'intermédiaire de la baie de contrôle et de régulation de l'alimentation en gaz qui est munie de moyens de contrôle, de régulation et de mesure du débit sous la forme par exemple d'un débitmètre (812) et d'une vanne de réglage (813) du débit et passe tout d'abord, avant d'être envoyé dans l'enceinte par l'orifice d'entrée (814), dans un appareil barboteur constitué d'un bain thermostaté (815) qui permet de régler son humidité relative à une valeur comprise entre 90 et 100 % RH et sa température à une valeur de préférence comprise entre 0 et 40°C, de préférence encore supérieure à 0°C. Les gaz de sustentation et de balayage en excès peuvent être évacués de l'enceinte par l'orifice d'échappement (816) et recyclés.
Le circuit d'alimentation en gaz de balayage permet, après une opération d'ouverture et de fermeture de l'enceinte de rétablir l'hygrométrie relative de l'atmosphère de l'enceinte avec une constante de temps beaucoup plus faible.
L'installation comprend également selon l'invention des moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation du liquide placé en sustentation. Les moyens d'observation comprennent outre les hublots décrits plus hauts et éventuellement en association avec un ou plusieurs de ces hublots, par exemple un microscope stéréoscopique (817), grâce auquel on peut observer chaque goutte, soit directement à l'oculaire, soit sur un moniteur de télévision (818) via une caméra
(819) lorsqu'elle est exactement positionnée grâce au barillet tournant face au hublot apical. D'autres moyens d'observation ont été par exemple cités plus haut. Selon l'invention, le dispositif comprend également des hublots latéraux pouvant être pourvus de multiples moyens d'observation et/ou de manipulation, et/ou de contrôle par exemple de diagnostic etc... qui ont déjà été par exemple cités plus haut.
Le signal vidéo cité ci-dessus est éventuellement enregistré sur des moyens d'enregistrement tels qu'un magnétoscope.
Les mesures recueillies dans l'enceinte par les divers moyens de mesure de température et d'hygrométrie sont transmises par la ligne (820) à des moyens d'acquisition et de traitement comprenant par exemple une centrale de mesure (821) et un micro-ordinateur (825) par exemple du type HP 3852 commercialisé par la Société HEWLETT-PACKARD couplé à des moyens d'impression tels qu'une imprimante (723) qui permet donc l'acquisition des mesures, la commande périodique de l'éclairage et la sortie d'un cliché papier sur l'imprimante vidéo (822) grâce auquel on peut a posteriori mesurer le diamètre de la goutte et le calcul de son volume ouvert. Les signaux analogiques sont enregistrés sur papier (824) en tracé continu.
Les moyens de contrôle de régulation et de mesure de l'hygrométrie de l'enceinte et du gaz de sustentation décrits dans ce qui précède ne sont donnés qu'à titre indicatif. Il est bien évident que d'autres moyens de contrôle de régulation et de mesure peuvent être mis en oeuvre, en particulier dans le cadre d'une réalisation à l'échelle industrielle de l'installation. II en est de même pour les moyens de contrôle, de régulation et de mesure de la température ; pour les moyens de contrôle, de régulation et de mesure des différents débits ; pour les moyens de mise en sustentation ; pour les moyens d'alimentation et d'évacuation des différents gaz et autres fluides ; pour l'enceinte elle-même ; pour les moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation des milieux mis en sustentation dont elle est pourvue ; pour les moyens d'acquisition de traitement, de reproduction et d'impression et pour tous les autres moyens prévus dans le dispositif et l'installation de l'invention et en particulier pour les moyens pour déplacer les diffuseurs à l'intérieur de l'enceinte, pour les moyens d' entrainement, pour les moyens de connection etc..

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif d'élaboration de cristaux dans des milieux mis en sustentation sur des films de gaz, comprenant une enceinte de traitement, des moyens ou diffuseurs pour mettre lesdits milieux simultanément en sustentation sur des films de gaz et des moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation desdits milieux mis en sustentation, dans lequel ledit dispositif comprend au moins deux diffuseurs, et des moyens pour déplacer lesdits diffuseurs à l'intérieur de ladite enceinte de traitement, maintenir en permanence lesdits milieux en sustentation, et permettre l'observation et/ou le contrôle et/ou la manipulation desdits milieux mis en sustentation par lesdits moyens d'observation et/ou de contrôle et/ou de manipulation.
2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le déplacement des diffuseurs est un déplacement alternatif.
3. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le déplacement des diffuseurs est un déplacement séquentiel.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que ledit déplacement est un déplacement linéaire selon un axe unique .
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que ledit déplacement est un déplacement selon deux axes orthogonaux.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 caractérisé en ce que ledit déplacement est un déplacement circulaire.
7. Dispositif selon la revendication 6 caractérisé en ce que les moyens pour déplacer lesdits diffuseurs comprennent un barillet tournant supportant lesdits diffuseurs.
8. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé en ce que les moyens pour déplacer lesdits diffuseurs comprennent une plaque support sur laquelle les diffuseurs sont disposés selon une matrice.
9. Dispositif selon la revendication 4 caractérisé en ce que les moyens pour déplacer lesdits diffuseurs comprennent une bande support sur laquelle est disposée une rangée de diffuseurs.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que les moyens pour déplacer les diffuseurs et maintenir en permanence lesdits milieux en sustentation comprennent des moyens d' alimentation en gaz de sustentation et des moyens d' entrainement .
11. Dispositif selon la revendication 10 caractérisé en ce que lesdits moyens d'alimentation en gaz de sustentation comprennent une chambre unique d'alimentation en gaz de sustentation alimentant l'ensemble des diffuseurs, et recevant une canalisation d'alimentation en gaz de sustentation.
12. Dispositif selon la revendication 10 ou 11 caractérisé en ce que lesdits moyens d' entrainement comprennent un axe ou arbre actionné par un moteur.
13. Dispositif selon la revendication 12 caractérisé en ce que ledit axe est creux et joue également le rôle de canalisation d'alimentation en gaz de sustentation.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 caractérisé en ce que les moyens d'alimentation en gaz de sustentation sont pourvus de moyens de connection permettant de les adapter aux moyens d' entrainement.
15. Dispositif selon la revendication 14 caractérisé en ce que lesdits moyens de connection comprennent un joint tournant ou un joint glissant.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que les moyens d'observation comprennent au moins un hublot latéral.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que les moyens de manipulation et/ou de contrôle sont choisis parmi les moyens de diagnostic in situ, et les moyens de télémanipulation.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 caractérisé en ce que les milieux mis en sustentation sont des masses fluides ou gélifiées.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que les milieux sont des solutions.
20. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que les milieux ont la forme de gouttes .
21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le (les) composé (s) à cristalliser est (sont) un (des) composé (s) organique (s) ou minéral (minéraux) .
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le (les) dits composé (s) est (sont) une (des) macromolécule (s) organique (s) et/ou biologique (s) .
23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que le (les) dit (s) composé (s) est (sont) une (des) protéine (s).
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 caractérisé en ce qu'il comprend de 2 à 12 diffuseurs.
25. Procédé d'élaboration de cristaux dans des milieux mis simultanément en sustentation sur des films de gaz dans une enceinte de traitement, dans lequel lesdits milieux mis en sustentation sont au nombre d'au moins 2 et sont déplacés à l'intérieur de ladite enceinte de traitement tout en les maintenant en permanence en sustentation, afin de permettre leur observation et/ou leur contrôle et/ou leur manipulation.
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