WO1999018205A1 - POLYPEPTIDE, ADNc LE CODANT ET LEUR UTILISATION - Google Patents

POLYPEPTIDE, ADNc LE CODANT ET LEUR UTILISATION Download PDF

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WO1999018205A1
WO1999018205A1 PCT/JP1998/004515 JP9804515W WO9918205A1 WO 1999018205 A1 WO1999018205 A1 WO 1999018205A1 JP 9804515 W JP9804515 W JP 9804515W WO 9918205 A1 WO9918205 A1 WO 9918205A1
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WO
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cdna
polypeptide
cells
present
seq
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PCT/JP1998/004515
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Inventor
Tasuku Honjo
Keizo Kato
Hideaki Tada
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide, a method for producing the same, a cDNA encoding the polypeptide, a vector comprising the cDNA, a host cell transformed with the vector, an antibody of the polypeptide, and a polypeptide.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a peptide or an antibody.
  • a novel polypeptide produced by a certain mouse cell ES cell line and a homolog thereof a method for producing the polypeptide, a cDNA encoding the polypeptide, a vector comprising the cDNA, Host cells transformed with such vectors, antibodies to the polypeptides, and pharmaceutical compositions containing the antibodies.
  • the inner cell mass with pluripotency at the blastocyst stage differentiates into various cell lineages such as blood cells, muscles, and bones through mesodermal induction.
  • the control of differentiation into each cell lineage is controlled by the action of the space in which the cell itself is placed, that is, the intensity of stimulation from the extracellular differentiation-inducing factor (or inhibitor) or the adjacent cell surface molecule. It is considered to be determined by the combination and change.
  • transcription factors as cell lineage-specific proteins and intracellular proteins involved in the signal transduction system also play an important role, those that greatly control their expression and cell behavior are membrane proteins ( Receptor) and its ligand molecule.
  • Receptor membrane proteins
  • Recent examples include differential display of genes that are specifically expressed in embryos at this stage, or subtraction of genes that are specifically expressed in germ layers by separating embryos from endoderm, mesoderm, and ectoderm.
  • MJ Guimaraes et.a Development, m, 3335-3346, 1995
  • SM Harrison et a Development, _m, 2479-2489, 1995
  • these methods require the isolation of a large number of small embryos in the early stages of development, and even if the genes are actually isolated, they are still intracellular proteins or still appear to be humoral factors or their receptors. No molecules have been isolated.
  • the present inventors have so far studied the cloning of genes for growth / differentiation factors that work in the hematopoietic and immune systems. Most of secretory proteins such as growth / differentiation factors (eg, various site proteins) and membrane proteins such as their receptors have a sequence called signal sequence at their N-terminus. Focusing on the method, we have intensively studied a method for efficiently and selectively cloning a gene encoding a signal sequence. As a result, we developed a method (Signal Sequence Strap: SST) that can efficiently amplify the ⁇ 'terminal fragment and search the signal sequence easily (JP-A-6-315380, Tashiro et al., Science, 261, 600-603, 1993). Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies using the SST method to find a novel secreted protein that is produced during the induction of ES cell differentiation and is involved in early development and early hematopoiesis.
  • the present inventors have developed a culture system (T. Nakano, et. Al. Al.) That induces differentiation from ES cells, which are cells derived from the inner cell mass having a pluripotent differentiation potential at the blastocyst stage, into blood cells. , Science, 265, 1098-1101, 1994), and in combination with SST, which enables efficient cloning of secretory proteins and membrane proteins.
  • ES cells which are cells derived from the inner cell mass having a pluripotent differentiation potential at the blastocyst stage, into blood cells.
  • SST a novel factor
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, or 13;
  • FIG. 1 is a printout of a acrylamide gel after electrophoresis (SD S-PAGE) detected using an imaging analyzer (FUJI BAS2000), showing the protein expression of mouse ⁇ HP106.
  • SD S-PAGE acrylamide gel after electrophoresis
  • FUJI BAS2000 imaging analyzer
  • the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, or 13 in substantially pure form, a homologue thereof, And its homologues.
  • the invention further relates to cDNAs encoding these polypeptides. More specifically, a cDNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, or 14, or the nucleotide sequence shown in 3, 6, 9, 12, or 15 and a sequence CDNA having a base sequence represented by any of the numbers 2, 5, 8, 11 or 14 or a fragment selectively hybridizing to the base sequence represented by 3, 6, 9, 12, or 15 About.
  • the hybridizing cDNA includes the complementary sequence of the above sequence.
  • a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, or 13 in a substantially pure form generally means 90% or more of the polypeptide at the time of production, for example, 95 , 98 or 99% are polypeptides having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10 or 13.
  • a homolog of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10 or 13 is generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 10 0 contiguous amino acid regions are at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologues are described below in the present invention. Described as a polypeptide.
  • a fragment of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, or 13 or a fragment of a homologue thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, For example, 2 (means a 25, 30, 40, 50, or 60 amino acid portion.
  • cDNAs that selectively hybridize to cDNAs having the nucleotide sequence shown in 15 are generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 10 0 contiguous base sequence regions, at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably Is 95% or more homologous, and such cDNA is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • the cDNA fragment having the nucleotide sequence shown in 9, 12, or 15 is at least 10 bases, preferably at least 15 bases, for example, 20,
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector include a plasmid, a virus or a phage vector comprising an ori region and, if necessary, a bromo overnight for expression of the above-mentioned cDNA, a regulator of a promoter, and the like.
  • the vector may contain one or more alternative marker genes, for example, an ampicillin resistance gene.
  • the vector can be used in vitro, for example, for producing mRNA corresponding to cDNA and transforming host cells.
  • the present invention provides a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, or 14, or a nucleotide sequence represented by 3, 6, 9, 12, or 15 or an open sequence thereof. Also included is a host cell transformed with a vector for replicating or expressing a cDNA of the present invention comprising a cDNA having a coding frame.
  • Cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably carried out under conditions under which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • Antisense mRNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of a vector as described above. Such antisense mRNA regulates the level of the polypeptide of the present invention in cells. Can also be used.
  • the present invention also includes a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Furthermore, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by ordinary hybridoma technology using the polypeptides of the present invention or fragments thereof as antigens. The polyclonal antibody can be produced by an ordinary method in which a host animal (for example, a rat or a heron) is inoculated with the polypeptide of the present invention and an immune serum is collected.
  • a host animal for example, a rat or a heron
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, an antibody thereof, a pharmaceutically acceptable excipient, and Z or a carrier.
  • polypeptide of the present invention of (1) those having a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, or 13 or a part of which is deleted (for example, SEQ ID NO: Among 1, 4, 7, 10 or 13, polypeptides consisting only of the parts essential for the expression of biological activity, etc., and those in which a part has been substituted with other amino acids (for example, amino acids having similar physical properties) ) And those in which another amino acid is added or inserted in part.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention specified by (2) includes all the nucleotide sequence groups encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10 or 13 of (1). Changing the nucleotide sequence may improve the productivity of the polypeptide.
  • the cDNA specified in (3) is an embodiment of the cDNA specified in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNA shown in (4) shows the sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
  • Preparation of cDNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, or 15 is performed according to the following method.
  • the amplified cDNA was subjected to a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) using a primer containing the enzyme I site and a primer containing the enzyme II site, and the amplified cDNA was then added to the enzyme I-enzyme II. And then fractionate again,
  • PCR polymerase chain reaction
  • step (1) all mRNAs are isolated from target cells according to the method of Chomcynski, P. and others (described in Anl. Biochem. 162, 156 (1987)). It is. Further, purification of mRNA is performed using a 01 igo (dT) column or the like.
  • the target cells were co-cultured with op / op mouse neonatal calvarial stromal cell line ⁇ P9 cells (H. Kodama, et. Al., Exp. Hematol, 22, 979-984, 1994).
  • Mouse ES (Embryonic Stem) cell line D3 (TC Doetsc man, et. Al., J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985), which has been induced to differentiate into blood cells.
  • a single-stranded cDNA is synthesized using a random primer to which the (enzyme I) site is linked, and then a double-stranded cDNA is synthesized by the method of Gublerr & Hoffman.
  • Step (2) is performed by blunting the ends with T4 cDNA polymerase, ligating the enzyme II adapter, and fractionating into 400-600 bp cDNA by agarose electrophoresis. Restriction enzyme linked to random primer
  • the restriction enzyme (enzyme II) site used in step (2) and the restriction enzyme (enzyme II) site used in step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • Sa1I is used as enzyme I
  • EcoRI is used as enzyme II.
  • step (3) cDNA is amplified by PCR.
  • the amplified cDNA is digested with enzyme I and enzyme II and fractionated by agarose gel electrophoresis into 300 to 800 bp of cDNA.
  • step (4) a gene (known as a reporter gene) such as a known membrane protein in which a signal sequence has been deleted from a plasmid vector for eukaryotic cell expression, and the cDN obtained in step (3) upstream thereof
  • a gene such as a reporter gene
  • a membrane protein in which a signal sequence has been deleted from a plasmid vector for eukaryotic cell expression
  • the cDN obtained in step (3) upstream thereof This is a step of transforming by incorporating the A fragment.
  • Various known plasmid vectors for eukaryotic cell expression include, for example, pcDL-SR ⁇ and pcEV-4.
  • the reporter gene all kinds of soluble secreted proteins and genes of mature proteins of membrane proteins can be used. In addition, the expression of these repo overnight genes must be confirmed by some method such as an antibody method.
  • the human IL-12 receptor tt gene is used. Many Escherichia coli strains for transformation are already known, and any of them may be used.
  • DH5 is a competent cell. The transformant is cultured by a conventional method to obtain the cDNA library of the present invention.
  • the library contains a gene fragment encoding the N-terminus of a protein, but not all clones contain a signal peptide, and not all are unknown. It is not necessarily the gene fragment that encodes the (new) signal sequence. Therefore, it is necessary to screen a gene fragment encoding an unknown signal sequence from the library.
  • the cDNA library is subdivided into boules of an appropriate size and incorporated into an expression system.
  • Expression systems for producing the polypeptide include mammalian cells (eg, monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.). Transfection is, for example, DEAE —Performed by the dextran method. After culturing, the presence or absence of expression of the repo overnight gene is determined.
  • Reporter genes are known to be expressed even if the signal sequence is specific to other secreted proteins. That is, expression of the reporter gene indicates that a signal sequence of some secreted protein was incorporated into the library. Positive pools are further subdivided and expression and determination are repeated until a single clone is obtained.
  • the expression of the reporter gene is determined depending on the type of the repo gene, but is determined by a fluorescent-labeled antibody method, an enzyme-labeled antibody method (ELISA method), a radiolabeled antibody method (RIA method), or the like.
  • ELISA method enzyme-labeled antibody method
  • RIA method radiolabeled antibody method
  • a fluorescence-labeled antibody method using anti-human Tac labeled with fluorescein-isothiocyanate is used.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone is determined, and a homology search with the DNA base is performed.
  • cDNAs that have been found to encode unknown proteins, they can be used as probes to hybridize to full-length cDNA libraries or genomic libraries, or to obtain oligonucleotides having appropriate nucleotide sequences. It can be synthesized and used to isolate a full-length clone from a mammal-derived cDNA library or mR ⁇ A by PCR, and determine the full-length nucleotide sequence.
  • cDNA encoding the protein of the present invention present in mammals or cDNA encoding the homologue and a subset of the protein of the present invention is obtained.
  • An oligonucleotide having an appropriate mouse nucleotide sequence is synthesized, and the resulting oligonucleotide is used to hybridize from a mammalian cDNA library or mRNA by the PCR method or a fragment of the appropriate mouse nucleotide sequence as a probe.
  • a cDNA encoding a mammalian type of the protein can be obtained from one of the mammalian cDNA libraries or the genomic library.
  • mouse OHP106K For example, after the nucleotide sequence of the mouse shown in SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 From the kidney cDNA library, mouse OHP106K, a clone having a 22 bp insertion sequence in the open reading frame of the mouse OHP106 nucleotide sequence, and mouse OHP106 nucleotide sequence from the human uterus cDNA library.
  • clones showing significant homology with mouse OHP106, mouse OHP106H and human ⁇ HP106H were found from mouse 13.5 and 14.5 day fetal cDNA libraries and human fetal liver and spleen cDNA libraries. If the cDNA obtained in this way contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it encodes a signal sequence. It is evident that it is full-length or nearly full-length (the signal sequence is encoded at the 5 'end of the open reading frame of cDNA, since the signal sequence is, without exception, at the N-terminus of the protein).
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band and the size of the cDNA are compared, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the cDNA of the present invention can be obtained by chemically synthesizing a fragment of the nucleotide sequence and hybridizing it as a probe. Furthermore, a required amount of the desired cDNA can be obtained by introducing the vector cDNA containing the present cDNA into an appropriate host and growing it.
  • Examples of expression systems (host-vector systems) for producing polypeptides using genetic recombination techniques include bacterial, yeast, insect cell, and mammalian cell expression systems.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of the cDNA encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is transferred to an appropriate promoter (for example, trp promoter). Yuichi, connected downstream of the lac promoter, ⁇ PL promoter, T7 promoter, etc., and connected to a vector (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) that functions in E. coli. Insert and create an expression vector.
  • Escherichia coli for example, E. Coli DH1, E. Coli JM109, E. Coli HB101, etc. transformed with this expression vector is cultured in an appropriate medium, and the cells are cultured.
  • a more desired polypeptide can be obtained.
  • the target polypeptide can be secreted during periplasm by using the signal sequence of the pateria (eg, the signal sequence of pe1B). In addition, it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, 6, 9 or 12 may be replaced with an appropriate vector (for example, retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector).
  • An SV40-based vector, etc. into an appropriate promoter (eg, an SV40 promoter, an LTR promoter, a meta-mouth thionein promoter, etc.) to produce an expression vector.
  • appropriate mammalian cells eg, monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.
  • the transformant is cultured in an appropriate medium.
  • the desired polypeptide is secreted into the culture solution.
  • the polypeptide obtained as described above can be obtained by a general biochemical method. It can be isolated and purified.
  • polypeptides of the present invention and the cDNAs encoding them will exhibit one or more effects or biological activities, including those related to Atsushi listed below.
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the present invention may be attributed to the administration or use of the protein, or the administration or use of a cDNA encoding the protein (eg, suitable for gene therapy or cDNA transfer).
  • Vector e.g., suitable for gene therapy or cDNA transfer.
  • the protein of the present invention may exhibit site force-in activity and cell proliferation (induction or inhibition) / differentiation activity (induction or inhibition), or may induce or suppress the production of other cytokines in a certain cell population.
  • Many of the currently discovered proteinaceous factors, including all known site force-ins, have been active in one or more factor-dependent cell growth assays, and their It functions as a convenient method for confirming site activity.
  • the activity of the proteins of the present invention can be demonstrated by any of a number of conventional factor-dependent cell line cell proliferation assays.
  • the protein of the present invention is considered to exhibit immunostimulatory activity and immunosuppressive activity. Certain proteins may also regulate (stimulate or suppress) the growth and proliferation of, for example, lymphocytes and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations. It is considered to be effective in the treatment of various immunodeficiencies and diseases (including severe combined immunodeficiency (SCID)). These immunodeficiencies can be hereditary or can be caused by, for example, a virus such as HIV, as well as bacterial or mold infections. Alternatively, it may come from an autoimmune disease.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • HIV hepatitis viruses
  • Infections caused by viruses, bacteria, fungi or other infections including various mold infections such as herpes viruses, mycobacteria, leishmania, malaria and Candida
  • mold infections such as herpes viruses, mycobacteria, leishmania, malaria and Candida
  • the proteins of the present invention are believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. It is contemplated that other conditions in which immunosuppression is desired (including, for example, asthma and related respiratory diseases) can be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may be associated with, for example, infections such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or any other IL-11. May also suppress chronic or acute inflammation resulting from overproduction of site forceins such as TNF and IL-11, which have been proven effective.
  • infections such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or any other IL-11.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • inflammatory bowel disease inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • any other IL-11 May also suppress chronic or acute inflammation resulting from overproduction of site forceins such as TNF and IL-11, which have been proven effective.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or deficiency of lymphoid cells. Even the weakest biological activities with the help of knee-forming cells or factor-dependent cell lines suggest that they may be involved in the regulation of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to one or all of the following.
  • erythroid progenitor cells alone, or in combination with other cytokins, and suggests its efficacy, such as treating various anemias, or producing erythroid progenitors and / or erythrocytes
  • myeloid cells such as granulocytes and monocyte Z macrophages (ie, classic CSF activity); myelosuppression associated with chemotherapy Combined with chemotherapy to prevent cancer
  • megakaryocytes The general use of or in complement to platelet transfusions to support the growth and proliferation of blood and subsequent platelet growth and proliferation, thereby preventing and treating various platelet disorders such as thrombocytopenia; Supports the growth and proliferation of hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the cells, and thus supports various stem cell disorders, including but not limited to aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Can be therapeutically effective (such as those commonly treated with transplantation), and can be used
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used in any of bone, cartilage, tendons, ligaments, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and / or bone or any growth in an environment that does not form bone normally have application in the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals. It is considered that a preparation using the protein of the present invention can be used prophylactically for reduction of closed fracture as well as open fracture and improvement of fixation of artificial joint. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the repair of craniofacial defects induced by congenital, traumatic, and carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs are thought to provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the protein of the present invention may be used to stimulate the repair of bone and cartilage or any of them, or to cause tissue destruction (collagenase activity or Blocking the process of osteoclast activity) is thought to be effective in the treatment of osteoporosis and osteoarthritis.
  • tissue regeneration activity Another category of tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon
  • the protein of the present invention induces such tissue formation in an environment where tendon Z ligament-like tissue or other tissue is not properly formed, but has tendon / ligament tears, malformations, and in humans and other animals. Applicable for healing other tendon Z ligament disorders.
  • Formulations that use proteins that induce tendon / ligament-like tissue can be used to improve the fixation of tendon Z ligaments to bone or other tissues and to repair tendon ligament tissue defects, as well as tendons or ligaments Preventive use for the protection of injuries is also conceivable.
  • Neoplastic tendon / ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin.
  • compositions of the present invention provide an environment that attracts tendon ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate. Alternatively, it induces tendon Z ligament cells or their progenitor cells ex vivo in preparation for in vivo reversion to achieve tissue repair.
  • the composition of the present invention is also effective in treating tendinitis, Carnal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the compositions also include sequestering agents well known to those skilled in the art, as well as a suitable matrix and carrier.
  • the protein of the present invention can be used for the growth of nerve cells and regeneration of nerve and brain tissues, that is, central and peripheral as well as mechanical and traumatic disorders including degeneration, death, or trauma of nerve cells or nerve tissues. It may also be effective in treating nervous system disorders and diseases. More specifically, certain proteins are disorders of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotropic laterality (amyotropic It is considered to be effective in treating central nervous system disorders such as lateral) and Shy-Drager syndrome. Further, the present invention Conditions that can be treated in response to such conditions include mechanical and traumatic disorders such as spinal cord disorders, head trauma, and cerebrovascular diseases such as stroke. Peripheral neurosis resulting from chemotherapy or other treatments can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention has an activity of producing other tissues such as organs including the kidney, liver, intestine, kidney, skin, endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular tissues including vascular endothelium, or the like. It is also expected to exhibit the activity of promoting the proliferation of cells constituting such tissues. Some of the desired effects may also be mediated by inhibition of fibrous scars, which regenerate normal tissue.
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in protecting or regenerating the gastrointestinal tract and treating fibrosis of the lungs or liver, reperfusion injury of various tissues, and conditions caused by systemic site force-in disorders. Can be It is believed that the proteins of the present invention exhibit activity associated with activin / inhibin.
  • Activin is characterized by its ability to stimulate the release of follicle-stimulating hormone (FSH).
  • Inhibin is characterized by its activity of inhibiting the release of follicle-stimulating hormone (FSH). Therefore, the protein of the present invention is a heterodimer alone or with a member of inhibin a family, which controls fertility based on the activity of inhibin, which reduces the fertility of female mammals and reduces spermatogenesis in males. It is considered to be effective as an agent. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin b group, and is used to induce therapeutic infertility based on the activity of an activin molecule that stimulates FSH release from cells of the forebrain pituitary. (See US Pat. No. 4,798,885).
  • the proteins of the present invention are believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals in order to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs. [Chemotaxis chemokinetic activity]
  • the protein of the present invention can be used, for example, as a chemokine for monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or mammalian cells containing any of them. It is thought to have chemical chemokinetic activity. Chemotaxis Z chemokinetic proteins can be used to immobilize or attract a desired cell population to the desired site of the reaction. Chemotactic / chemokinetic proteins offer special advantages in treating wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may improve the immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell. Whether a particular protein retains chemotactic activity for a cell in a population can be readily determined by using such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay. .
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including genetic disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds resulting from trauma, surgery or other causes.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in dissolving or inhibiting the formation of thrombus, and in treating and preventing conditions resulting from thrombus or stroke.
  • the protein of the present invention may also show activity as an inhibitor or agonist of a receptor, receptor ligand or receptor / ligand. That's it Examples of such receptors and ligands include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, receptors involved in cell-cell interactions (Selectin, Integur in , And its ligands, including cell adhesion molecules such as receptor kinases) and their ligands, and combinations of receptor noligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and development of cellular and humoral immune responses.
  • the present invention is not limited to these.
  • Receptors and ligands are also useful for the screening of inhibitors of potential peptides or small molecules for their interaction.
  • the proteins of the present invention including but not limited to receptor and ligand fragments, are themselves considered to be effective inhibitors of receptor Z ligand interactions.
  • the proteins (polypeptides) of the invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: infectious agents, including bacteria, viruses, molds, and other parasites Has the effect of suppressing or promoting body characteristics such as height, weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation, or organ size, for example, breast enlargement or weight loss.
  • Proteins having the above activities include, for example, proliferation or cell death of B cells, T cells, mast cells, class-specific induction by promoting immunoglobulin class switching, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursor cells Proliferation or differentiation, cell death, monocyte-macrophage progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, neutrophil, monocyte-macrophage, eosinophil, basophil proliferation or hyperactivity, cell death, megakaryocyte precursor Cell proliferation or cell death, neutrophil progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, Proliferation or differentiation of B or T progenitor cells, cell death, promotion of erythrocyte production, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, basophil, monocyte / macrophage, mast cell, megakaryocyte progenitor cell growth support, neutrophil Promotion of migration of spheres, monocytes, macrophages, ⁇ cells or ⁇ cells, proliferation or death of thymocytes, suppression of differentiation of fat cells, proliferation
  • the polypeptide of the present invention since the polypeptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death, promotes the proliferation or death of glial cells, Extension of processes, maintenance or death of ganglion cells, promotion of proliferation or differentiation of astrocytes or cell death, proliferation or maintenance of peripheral nerves, cell death, proliferation or death of Schwann cells, proliferation of motor nerves, It is thought that it also has the effect of maintaining survival and cell death.
  • polypeptide of the present invention may be used in the developmental process of the early embryo during the development of the early embryo, such as formation of the epidermis, brain, spine, and nerve by the action of inducing ectoderm, the dorsal cord connective tissue (bone, muscle, tendon) and blood cells by the action of inducing mesoderm Promotes or inhibits the formation of cells, heart, kidney, gonad organs, or the formation of digestive organs (stomach, intestine, liver, kidney) and respiratory system (lung, trachea) by inducing endoderm It is thought to have a function of inhibiting the growth or growth of the above-mentioned organs in a living body as well as acting in a biological manner.
  • the polypeptide of the present invention itself is a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • Hematopoietic stem cell depletion after bone marrow transplantation Cancer, Leukemia, platelet, ⁇ cell or ⁇ cell depletion after irradiation or chemotherapy for leukemia, anemia, infectious disease, cancer , Leukemia, AIDS, abnormal bone metabolism (osteoporosis, etc.), various degenerative diseases It is expected to be used as a prophylactic or therapeutic drug for patients (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.) or nerve damage.
  • polypeptide of the present invention is considered to have an action of differentiating or proliferating ectoderm, mesoderm or endoderm-derived organs, the polypeptide (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine, It is also expected to be used as a tissue repair agent for liver, kidney, lung, trachea, etc.).
  • polypeptide of the present invention can be quantified in a living body using the polyclonal antibody or the monoclonal antibody of the polypeptide, whereby the relationship between the polypeptide and a disease can be studied or the disease can be diagnosed.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by a conventional method using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
  • an affinity column is prepared, and a known or unknown protein (ligand) that binds to the present polypeptide is prepared.
  • ligand a known or unknown protein that binds to the present polypeptide is prepared.
  • polypeptide of the present invention preferably, a transmembrane domain or an intracellular domain polypeptide
  • the West-Western method or its cDNA (preferably, the transmembrane domain of the polypeptide or Using cDNA encoding an intracellular domain)
  • downstream signaling molecules interacting with the polypeptide in the cytoplasm can be identified and gene cloning can be performed, for example, by the yeast two-hybrid method.
  • polypeptide of the present invention screening for the polypeptide receptor agonist, the antagonist of the present invention, and an inhibitor between the receptor and one signaling molecule can be performed.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and indispensable type ⁇ when producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have tremendous utility, as well as the diagnosis and treatment of genetic diseases.
  • Genomic cDNA can be separated using the cDNA of the present invention as a probe.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • Dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is generally within the range of 100 g to 100 mg / day for each adult. It may be administered orally once to several times, or parenterally in a dose of 10 g to 100 mg per adult per day, once to several times a day.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a dose smaller than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be required outside the range.
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is administered, it is used as a solid composition, a liquid composition and other compositions for oral administration, an injection for parenteral administration, an external preparation, a suppository and the like.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances may include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polish). Mixed with vinyl pyrrolidone and magnesium aluminate metasilicate).
  • the composition is formulated according to the usual methods, with additives other than inert diluents, such as lubricants (Magnesium stearate, etc.), disintegrants (calcium cellulose glycolate, etc.), stabilizers (human serum albumin, lactose, etc.), and solubilizers (arginine, aspartic acid, etc.) Good.
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film, such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc., if necessary. May be coated. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • This composition contains, in addition to the inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • Methods for producing sprays are described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3.095.355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • Non-aqueous diluents include, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (registered trademark) and the like.
  • compositions may further include preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg, human serum albumin, lactose, etc.), solubilizing agents (eg, Adjuvants such as arginine and aspartic acid).
  • preservatives wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg, human serum albumin, lactose, etc.), solubilizing agents (eg, Adjuvants such as arginine and aspartic acid).
  • mice ES Embryonic Stem cell line D 3 (see ⁇ ⁇ C. Doetschman, et. Al., J. Embryo 1. Exp. Morphol., 87, 27, 1985) was converted to D M E M, 15% F C S,
  • TR Iz01 reagent Trizol Reagent, registered trademark, sold by GIBC0BRL
  • poly (A) was extracted using Oligotex-d T30 ⁇ Supper> (registered trademark, sold by Takara Shuzo).
  • SST mammalian cell signal sequence strap
  • the nucleotide sequence of the cDNA cDNA of each positive clone was determined.
  • the nucleotide sequence is determined by a fluorescent dye terminator-one-cycle sequence method using a DNA sequencing kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction) (trade name, sold by Applied Biosystems Inc.). And the reading was carried out using an automatic cDNA sequencer 373 (Applied Biosystems Inc.) (hereinafter, all the nucleotide sequences were determined by this method).
  • a homology search was performed on the obtained nucleotide sequence with a database.
  • a known protein having a signal sequence was found to have 7 clones (a secretory protein such as Apolipoprotein E, 0 steopont in and a membrane protein such as PTPase-kappa), It was revealed that there were 17 new clones.
  • nucleotide sequences of the 5 'end and the 3' end were determined, and it was confirmed that the F1 primer sequence was present on the 5 'side and the po1y (A) + sequence was present on the 3' side. Subsequently, the full-length nucleotide sequence was determined, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained. Further, an open reading frame was determined, and an amino acid translation region shown in SEQ ID NO: 2 and a deduced amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 were obtained.
  • mouse OHP106 region between amino acid sequence 25-153 of SEQ ID NO: 1
  • the oncogene myb derived from chicken leukemia virus.
  • Derived Chicken MD-1 (significant homology between amino acid sequence 28-154 of Pir Accession S42854) (see 0. Burk et. Al .. EMBO J, J_0, 3713-3719) Showed that there is. Based on these homologies, mouse OHP106 is expected to retain at least the activity associated with Chicken MD-1. [Northern analysis]
  • RNA prepared from undifferentiated ES cells and ES cells that had undergone the above differentiation induction were subjected to 1% agarose electrophoresis and transferred to a nylon membrane. Then, use a random primer DNA labeling kit (trade name, sold by Takara Shuzo) to label the mouse OHP 106 6 0 ⁇ '8 with 32 1 ( ⁇ ⁇ ⁇ ?). , 50% formamide, 5 XSSPE 0.1% SDS, 2 XDenhaldis, 0.1 mg / m 1 Salmon sperm DNA was hybridized with nylon membrane at 42 ° C for 15 hours.
  • a random primer DNA labeling kit (trade name, sold by Takara Shuzo)
  • Mouse ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ A clone (clonelD 520548) derived from the mouse kidney cDNA library having an insertion sequence of 22 b in the open reading frame of the base sequence of HP106 was purchased from IMAGE Consortium, and mouse OHP106K and Named. The entire nucleotide sequence was determined in the same manner as mouse ⁇ HP106, and the sequence shown in SEQ ID NO: 6 was obtained. Further, an open reading frame was determined, and an amino acid sequence translation region shown in SEQ ID NO: 5 and a deduced amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 were obtained.
  • a clone (ClonelD489463) derived from a human pregnant uterus cDNA library having homology to a part of the nucleotide sequence of mouse OHP106 was purchased from IMAGE Consortium and named human HP106. . The entire nucleotide sequence was determined in the same manner as in mouse ⁇ HP106, and the sequence shown in SEQ ID NO: 9 was obtained. Further, an open reading frame was determined to obtain an amino acid translation region shown in SEQ ID NO: 8 and a deduced amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • mice fetal cDNA library 1 (ClinelD 402964) and clones derived from human fetal liver and kidney cDNA libraries (ClinelD 402964), which have significant homology to a part of the amino acid sequence of mouse OHP 106 ClonelD 111816) was purchased from IMAGEConsortium and named as mouse OHP106H and human OHP106H, respectively. The entire nucleotide sequence was determined in the same manner as for mouse OHP106, and the sequences shown in SEQ ID NOS: 12 and 15 were obtained.
  • the open reading frame was determined, and the amino acid translation regions shown in SEQ ID NOS: 11 and 14 and the deduced amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 10 and 13 were obtained.
  • the region encoding the amino acid of OHP106 was found to be 76% at the cDNA level and 64% at the amino acid level between mouse and human.
  • the homology between mouse and human of ⁇ HP106H was 77% at the cDNA level and 67% at the amino acid level.
  • the homology of human OHP 106 -OHP 106 H was 49% at the cDNA level and 23% at the amino acid level.
  • Plasmids were prepared and it was confirmed that there was no mutation in the nucleotide sequence of the cDNA cDNA.
  • the obtained plasmid was introduced into Cos 7 cells using lipofectin (trade name, sold by GIBC0BRL). After 24 hours, the medium was replaced with a serum-free medium and cultured for 72 hours. After recovering the cell supernatant, the cells were concentrated about 10-fold with CentriBrep-10 (trade name, sold by Amicon) and subjected to SDS-PAGE.
  • the protein was transferred from acrylamide gel to Immobilon-P (PVDF membrane, trade name, sold by Millipore), and the FLAG fusion protein was anti-FLAG2 monoclonal antibody (sold by Eastman Kodak) and horseradish peroxidase.
  • VDF membrane trade name, sold by Millipore
  • FLAG fusion protein was anti-FLAG2 monoclonal antibody (sold by Eastman Kodak) and horseradish peroxidase.
  • Expression of the mouse ⁇ HP106 fusion protein using the binding protein ⁇ ⁇ and the 6 XHis residue fusion protein developed using horseradish peroxidase-linked Ni — NTA (trade name, sold by QIAGEN) was detected.
  • mouse OHP106 [Expression of proteins of mouse OHP106 and its related gene (hereinafter abbreviated as mouse OHP106) using mammalian cells]
  • the obtained mouse ⁇ full length cDNA such as HP106 was expressed in Xh of mammalian expression vector Yuichi pED6 (see Kaufman et al., Ucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)).
  • ol (or EcoRI) A vector was constructed that ligated to the NotI site to express a protein such as mouse @ HP106.
  • the obtained plasmid was introduced into Cos 7 cells using lipofectin (trade name, sold by GIBC0BRL). After 24 hours, the medium was replaced with a Met- and Cys-free medium, and then 35S-Met and 35S-Cys were added, followed by culturing for 5 hours.
  • the cells were concentrated about 10-fold with Centricon 10 (trade name, sold by Amicon) and subjected to SDS-PAGE.
  • the expression of proteins such as mouse OHP106 was detected using BAS2000. That is, an exposure is performed on an imaging plate (Fuji imaging plate ⁇ - ⁇ ) and an imaging analyzer (Fuji imaging) is exposed. (Analyzer-1 BAS 2000 system), analyzed and printed out by FUJI Pictrography 3000.
  • the expression of mouse OHP106H is shown in FIG.

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Description

明 細 ポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする c D N A、 およびそれらの 用途 技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 その製造方法、 そのポリペプチドをコ一 ドする c D N A、 その c D N Aからなるベクタ一、 そのベクターで形質転換 された宿主細胞、 そのポリペプチドの抗体、 およびそのペプチドまたは抗体 を含有する薬学的組成物に関する。
更に詳細に述べると、 ある種のマウス細胞 E S細胞株が産生する新規なポ リペプチドおよびそのホモローグ、 それらポリペプチドの製造方法、 それら ポリペプチドをコードする c D N A、 それら c D N Aからなるベクター、 そ れらベクターで形質転換された宿主細胞、 それらポリペプチドの抗体、 およ または抗体を含有する薬学的組成物に関する。 背景技術
個体発生の過程において、 胚盤胞期の多能性分化能をもつ内部細胞塊は中 胚葉誘導を経て血球や筋肉、 骨などの様々な細胞系列へと分化をしていく。 この各細胞系列への分化の制御はその細胞自身が置かれている空間からの作 用、 すなわち細胞外からの分化誘導因子 （あるいは抑制因子） または隣接す る細胞表面分子からの刺激の強さやその組み合わせと変化により決定される と考えられている。 細胞系列特異的蛋白質としての転写因子やシグナル伝達 系に関わる細胞内蛋白質も重要な役割を果たしていることは事実であるが、 それらの発現および細胞の挙動を大きく支配しているものは膜蛋白質 （受容 体） とそのリガンド分子であるといってよい。 これまでァクチビンをはじめ とする T G F— bスーパ一フアミリーや F G Fフアミリーに属する分子など が同定されているが、 そのメカニズムとともにさらに未知の分子の関与が関 心の的となっており、 現在もこの発生初期に働き、 細胞の運命を決定づける 分子の単離が試みられている。
近年の例を挙げると、 この時期の胚に特異的に発現する遺伝子をディファ レンシャルディスプレイ、 あるいは内胚葉、 中胚葉、 外胚葉と胚を分離し胚 葉特異的に発現する遺伝子をサブトラクシヨンといった手法で単離する試み が報告されている（M. J. Guimaraes et. aに Development, m, 3335-3346, 1995、 S. M. Harrison et aに Development, _m, 2479-2489, 1995参照）。 し かしこれらの方法は、 発生初期の小さな胚を大量に分離しなければならず、 また実際に遺伝子が単離されても細胞内蛋白質であったり、 いまだに液性因 子やその受容体らしき分子の単離はなされていない。
本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のク ローニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイ ト力 ィン等） のような分泌蛋白質やその受容体のような膜蛋白質の大部分がその N末端にシグナルシークェンスと呼ばれる配列を有していることに着目して、 シグナルシークェンスをコードする遺伝子を効率的かつ選択的にクロ一ニン グする方法を鋭意検討した。 その結果、 ； \'末端断片を効率的に増幅させ、 シ グナルシークェンスを簡便に検索できる方法 （シグナルシークェンストラッ プ： S S T) を開発した （特開平 6- 315380号、 Tashiro et al. , Science, 261, 600-603, 1993参照） 。 発明の開示
本発明者らは、 ES細胞の分化誘導時に産生され、 初期発生および初期造 血に関与する新規の分泌蛋白質を見い出すべく、 S S T法を用いて鋭意検討 を行なった。
その結果、 本発明者らは、 胚盤胞期の多能性分化能をもつ内部細胞塊由来 の細胞である E S細胞から血球細胞へ分化誘導を行なう培養系（T. Nakano, et. al. , Science, 265, 1098-1101, 1994参照）に着目し、 分泌蛋白質ゃ膜蛋 白質を効率的 にクローニングすることができる S S Tと組み合わせて、 OHP 1 06と名付けられた新規因子 （ポリペプチド） およびそれらをコ一 ドする c DNA、 さらには新規の OHP 1 0 6関連因子群およびそれらを コ一ドする c DNAを見い出すことに成功し、 本発明を完成した。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTA により、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知の ポリぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索 した結果、 本発明のポリペプチドマウス〇HP 1 06およびそれをコードす る核酸配列と一致する配列はなかった。 また、 疎水性プロットによる解析か ら、 本発明のポリペプチドは膜貫通領域を持たないことが予想された。 この ことから、 本発明のボリペプチドは、 新規な分泌蛋白質であることが判明し た。
すなわち本発明は、
(1) 配列番号 1、 4、 7、 1 0または 1 3で示されるアミノ酸配列からな るポリペプチド、
(2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする cDNA、
(3) 配列番号 2、 5、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列を有する c
DNA、
(4) 配列番号 3、 6 9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列を有する c DNA、 に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 電気泳動 （SD S— PAGE) 後のアクリルアミドゲルについて イメージング，アナライザ一 （FUJI BAS2000) を用いて検出したプリンター 打ち出し図であり、 マウス〇HP 1 06の蛋白発現を示す。 発明の詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 1 0または 1 3 で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 その配列 のフラグメントおよびそのホモローグに関する。
本発明は、 さらにそれらのポリべプチドをコードする c D N Aに関する。 より具体的には、 配列番号 2、 5、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列、 あるいは 3 、 6、 9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列を有する c D N A、 および配列番号 2、 5、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列、 ある いは 3、 6 、 9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列に選択的にハイプリ ダイズするフラグメントを有する c D N Aに関する。
ハイブリダィズする c D N Aには、 上記配列の相補配列も含まれる。
実質的に純粋な形である配列番号 1 、 4、 7 、 1 0または 1 3で示される アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、 一般に、 生産時のポリペプチドの 9 0 %以上、 例えば、 9 5、 9 8または 9 9 %が配列番号 1 、 4、 7 、 1 0 または 1 3で示されるアミノ酸配列を有するポリべプチドであることを意味 する。
配列番号 1 、 4、 7、 1 0または 1 3で示されるアミノ酸配列からなるポ リペプチドのホモローグとは、 一般に少なくとも 2 0個、 好ましくは少なく とも 3 0個、 例えば 4 0、 6 0または 1 0 0個の連続したアミノ酸領域で、 少なくとも 7 0 %、 好ましくは少なくとも 8 0または 9 0 %、 より好ましく は 9 5 %以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグは、 以下本発 明のポリペプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1、 4、 7 、 1 0または 1 3で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドのフラグメント、 またはそれらのホモローグのフラグメ ントとは、 少なくとも 1 0アミノ酸、 好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸、 例えば 2 ( 2 5、 3 0、 4 0、 5 0または 6 0アミノ酸部分を意味する。 配列番号 2、 5、 8、 1 1または 1 4で示される塩基配列あるいは 3、 6、 9 、 1 2または 1 5中に示される塩基配列を有する c D N Aに選択的にハイ ブリダィズする c D N Aとは、 一般に、 少なくとも 2 0個、 好ましくは少な くとも 3 0個、 例えば 4 0、 6 0または 1 0 0個の連続した塩基配列領域で、 少なくとも 7 0 %、 好ましくは少なくとも 8 0または 9 0 %、 より好ましく は 9 5%以上相同性であるものであり、 そのような c DNAは、 以下本発明 の c DN Aとして記載される。
配列番号 2、 5、 8、 1 1または 14で示される塩基配列あるいは 3、 6、
9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列を有する c DNAのフラグメント とは、 少なくとも 1 0塩基、 好ましくは少なくとも 1 5塩基、 例えば 20、
25、 30または 40塩基部分を意味し、 そのようなフラグメントも本発明 の c DNAに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明の c DNAからなる複製または発現ベクター が含まれる。 ベクターとしては、 例えば、 o r i領域と、 必要により上記 c DNAの発現のためのブロモ一夕一、 プロモーターの制御因子などからな るプラスミ ド、 ウィルスまたはファ一ジベクターが挙げられる。 ベクタ一は ひとつまたはそれ以上の選択的マ一カー遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺 伝子を含んでいてもよい。 ベクタ一は、 イン · ビトロ （in vi tro) において、 例えば c DNAに対応する mRNAの製造、 宿主細胞の形質転換に用いるこ とができる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2、 5、 8、 1 1または 14で示される塩 基配列あるいは 3、 6、 9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列、 または それらのオープンリ一ディングフレームを有する c DNAを含む本発明の c DN Aを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞 も含まれる。 細胞としては、 例えば細菌、 酵母、 昆虫細胞または哺乳動物細 胞が挙げられる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプチドの製造方法 も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造さ れる条件下で行なわれることが好ましい。
本発明の c DNAは、 上記のようなベクタ一のアンチセンス領域に挿入す ることでアンチセンス mRNAを製造することもできる。 このようなアンチ センス mRNAは、 細胞中の本発明のポリぺプチドのレベルを制御すること に用いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクロ —ナル抗体をも含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナル またはポリクロ一ナル抗体の製造方法をも含む。 モノクローナル抗体は、 本 発明のポリペプチド、 またはその断片を抗原として用い、 通常のハイブリ ド —マの技術により製造することができる。 ポリクロ一ナル抗体は、 宿主動物 (例えば、 ラットやゥサギ等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清 を回収する、 通常の方法により製造することができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形 剤および Zまたは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
( 1) の本発明のボリペプチドとしては、 配列番号 1、 4、 7、 1 0また は 1 3で示されるアミノ酸配列を有するもの以外に、 その一部が欠損したも の （例えば、 配列番号 1、 4、 7、 1 0または 1 3中、 生物活性の発現に必 須な部分だけからなるポリペプチド等） 、 その一部が他のアミノ酸と置換し たもの （例えば、 物性の類似したアミノ酸に置換したもの） 、 およびその一 部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6 種類 （例えば、 Me tは 1種類、 L e uは 6種類） 存在する。 従って、 ポリ ぺプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DN Aの塩基配列を変えること ができる。
(2) で特定される本発明の c DN Aには、 （ 1) の配列番号 1、 4、 7、 1 0または 1 3で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が 含まれる。 塩基配列を変えることによって、 ポリペプチドの生産性が向上す ることがある。
( 3) で特定される c DNAは、 （2) で示される c DNAの一態様であ り、 天然型配列を表わす。
(4) に示される cDNAは、 （3) で特定される c DNAに天然の非翻 訳部分を加えた配列を示す。 配列番号 3、 6、 9、 1 2または 1 5中に示される塩基配列を有する c DNAの作製は、 以下の方法に従って行なわれる。
シグナルシークェンストラップ （S ST) 用 c DN Aライブラリーの作製：
( 1 ) 対象となる細胞より mRN Aを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I ) サイ卜を連結したランダムプライマーを用いて二本鎖 c DNAを合成し、
(2) サイズで分画した後、 酵素 I とは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイ卜を含むアダプターを連結し、
(3) 酵素 Iサイ卜を含むプライマ一と酵素 IIサイ トを含むプライマーを用 いてポリメラーゼ連鎖反応 （以下、 PCRと略記する。 ） に付し、 増幅され た c DN Aを酵素 I一酵素 IIで消化した後、 再度分画し、
(4) 得られた c DNA断片を、 シグナルシークェンスを削除した公知の膜 蛋白質等の遺伝子の上流に連結し、 真核細胞発現プラスミ ドベクタ一に組み 込んだ後、 形質転換する工程よりなる。
各工程を詳しく説明すると、 工程 （ 1 ) では、 対象となる細胞より、 Chomcynski, P等の方法（Anl. Biochem. 162, 156 (1987)に記載） に準じて全 mRN Aの単離が行なわれる。 また mRN Aの精製は 01 igo(dT)カラム等を用 いて行なわれる 。
対象となる細胞としては、 o p/o pマウス新生仔頭蓋冠由来ストローマ 細胞株〇P 9細胞（H. Kodama, et. al. , Exp. Hematol, 22, 979-984, 1994)と 共生培養して血液細胞へ分化誘導したマウス E S (Embryonic Stem) 細胞株 D 3 (T. C. Doetsc man, et. al. , J. Embryol. Exp. Morphol. , 87, 27, 1985)が 挙げられる。
次に （酵素 I ) サイ トを連結したランダムプライマ一を用いて一本鎖 cDNAを合成した後、 Gublerr & Hoffmanの方法により二本鎖 c D N Aを合 成する。
工程 （2) は、 T4 c DNAポリメラーゼで末端を平滑化し、 酵素 IIァダ プタ一を連結し、 ァガロース電気泳動により 400〜600 b pの c DNA に分画することにより行なわれる。 ランダムプライマーに連結される制限酵 素 （酵素 I) サイトと工程 （2) で用いられる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用いてもよい。 好ましくは、 酵素 Iとして S a 1 I、 酵素 IIとしては E c o R Iが用いられる。
工程 （ 3) では、 P C Rにより c DN Aの増幅を行なう。 増幅された c DNAは酵素 I一酵素 IIで消化し、 ァガロース電気泳動により 300〜 800 b pの c DN Aに分画される。
工程 （4) は、 真核細胞発現用プラスミ ドベクターにシグナルシークェン スを削除した公知の膜蛋白質等の遺伝子 （レポーター遺伝子という。 ） と、 その上流に工程 （3) で得られた c DN A断片とを組み込んで形質転換する 工程である。 真核細胞発現用プラスミドベクタ一としては種々のものが知ら れている力 例えば、 p c DL— S R αや p c EV— 4が用いられる。
また、 レポーター遺伝子としては、 あらゆる種類の可溶性分泌蛋白質およ び膜蛋白質の成熟蛋白部分の遺伝子が用いられる。 さらに、 これらのレポ一 夕一遺伝子は、 抗体法などの何らかの方法でその発現が確認できるものでな ければならない。 ここではヒト I L一 2レセプ夕一 tt遺伝子が用いられる。 形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 いずれ を用いてもよいが、 好ましくは DH 5のコンビテントセルである。 形質転換 体は常法により培養され、 本発明の c DN Aライブラリーが得られる。
本発明の c DNAライブラリ一作製方法では、 ライブラリ一中に蛋白質の N末端をコードする遺伝子断片を含む可能性は高いが、 すべてのクローンが シグナルペプチドを含んでいる訳ではないし、 またすべてが未知の （新規 な） シグナルシークェンスをコードする遺伝子断片とは限らない。 そこで、 次に該ライブラリーから未知のシグナルシークェンスをコードする遺伝子断 片をスクリーニングする必要がある。
すなわち、 c DNAライブラリーを適当なサイズのブールに細分化し、 発 現系に組み込む。 ポリペプチドを生産するための発現系としては、 哺乳動物 細胞 （例えば、 サル COS— 7細胞、 チャイニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） が挙げられる。 トランスフエクシヨンは、 例えば DEAE —デキストラン法によって行なわれる。 培養後、 レポ一夕一遺伝子の発現の 有無を判定する。
レポーター遺伝子は、 シグナルシークェンスが他の分泌蛋白質に固有のも のであっても発現することが知られている。 すなわち、 レポーター遺伝子が 発現されたということは、 ライブラリ一中に何らかの分泌蛋白質のシグナル シークェンスが組み込まれていたことを示している。 陽性を示すプールにつ いてはさらに細分化を行ない、 単一クローンを得るまで発現と判定を繰り返 す。 レポーター遺伝子の発現の判定は、 レポ一夕一遺伝子の種類によって異 なるが、 蛍光標識抗体法、 酵素標識抗体法 （EL I SA法） 、 放射性標識抗 体法 （R I A法） などにより行なわれる。 ここではフルォレセイン ·イソチ オシァネ一卜でラベルした抗ヒト T a cによる蛍光標識抗体法が用いられる。 次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 デ一夕ベース との相同性検索を行なう。 未知の蛋白質をコードすることが明らかになった c DNAについては、 それをプローブとして、 全長 c DNAライブラリーあ るいはゲノムライブラリーとハイブリダィズさせることにより、 あるいは適 当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、 それを用いて、 哺乳類 由来の c DNAライブラリー、 あるいは mRヽ 'Aから P CR法により、 全長 クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定する二とができる。
陽性クローンの塩基配列が、 一部、 好ましくは全てが確定されると哺乳類 に存在する本発明の蛋白質をコードする c DN Aもしくは本発明蛋白質のホ モロ一グおよびサブセットをコードする c DNAを得ることができる。 適当 な該マウス塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、 それを用いて、 哺乳類由来の c DNAライブラリ一あるいは mRNAから P CR法により、 あるいは適当な該マウス塩基配列の断片をプローブとしてハイブリダイズさ せることにより、 哺乳類 c DNAライブラリ一あるいは該ゲノムライブラ リーから、 哺乳類型の当該蛋白質をコードする c DNAを得ることができる。 例えば、 配列番号 2で示される塩基配列あるいは配列番号 3中に示される 塩基配列で示されるマウス〇HP 1 06の塩基配列が確定された後、 マウス 腎臓 c DNAライブラリ一よりマウス OHP 1 06の塩基配列のオープン リーディングフレーム内に 22 b pの挿入配列を有するクローン、 マウス〇 HP 106Kを、 またヒト子宮 c DNAライブラリーよりマウス OHP 10 6の塩基配列と高い相同性を有し、 マウス〇HP 1 06のヒトカウンターパ ートと考えられる約 550 b pのクローン、 ヒト OHP 106を見い出した。 さらにマウス 13.5、 14.5日胎児 c DNAライブラリ一およびヒト胎児肝臓、 脾臓 c DNAライブラリ一よりマウス OHP 1 06と有意な相同性を示す クローン、 マウス OHP 106 Hおよびヒト〇HP 1 06 Hを見い出した。 このようにして得られた c DNAが、 S S Tで得られた c DNA断片の塩 基配列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルシークェンスを コードしていることになるので、 その cDNAが全長、 またはほぼ全長であ ることは明らかである （シグナルシークェンスは例外なく蛋白質の N末端に 存在することから、 c DNAのオープンリーディングフレームの 5 ' 末端に コードされている。 ） 。
さらに、 該 c DNAをプローブとしてノザン（Northern)解析によって全長 の確認をしてもよい。 ハイプリダイズしたバンドから得られる mRN Aのサ ィズと該 c DN Aのサイズを比較し、 ほぼ同じであれば該 c DNAはほぼ全 長であると考えられる。
配列番号 2、 5、 8、 1 1または 14で示される塩基配列あるいは 3、 6、 9、 12または 1 5中に示される塩基配列が一旦確定されると、 その後は、 化学合成によって、 あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、 これをプロ一 ブとしてハイブリダィズさせることにより、 本発明の c D N Aを得ることが できる。 さらに、 本 c DNAを含有するベクター c DNAを適当な宿主に導 入し、 これを増殖させることによって、 目的とする c DN Aを必要量得るこ とができる。
本発明のポリべプチドを取得する方法としては、
(1) 生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 または (3) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリぺプチドを生産するための発現系 （宿主 —ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細 胞の発現系が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードする c DNAの 5 ' 末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた c DNAを、 適当なプロモー夕一 （例えば、 t r pプロモ一夕一、 l a cプロモーター、 λ P Lプロモーター、 T 7プロモーター等） の下流に接続し、 大腸菌内で機 能するべクタ一 （例えば、 p B R 3 2 2、 pUC 1 8、 p U C 1 9等） に挿 入して発現べクタ一を作製する。
次に、 この発現ベクターで形質転換した大腸菌 （例えば、 E. Coli DH 1、 E. Coli J M 1 0 9、 E. Coli HB 1 0 1株等） を適当な培地で培養して、 その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 パクテリ ァのシグナルシークェンス （例えば、 p e 1 Bのシグナルシークェンス） を 利用すれば、 ペリブラズム中に目的とするポリべプチドを分泌することもで きる。 さらに、 他のポリペプチドとのフュージョン · プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 3、 6、 9 または 1 2中に示される塩基配列を適当なベクター （例えば、 レトロウィル スベクタ一、 パピローマウィルスベクター、 ワクシニアウィルスベクタ一、 S V 4 0系べクタ一等） 中の適当なプロモーター （例えば、 S V 4 0プロ モータ一、 LTRプロモ一夕一、 メタ口チォネインプロモーター等） の下流 に挿入して発現ベクターを作製する。 次に、 得られた発現ベクターで適当な 哺乳動物細胞 （例えば、 サル C O S— 7細胞、 チャイニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） を形質転換し、 形質転換体を適当な培地で培 養することによって、 その培養液中に目的とするポリぺプチドが分泌される。 以上のようにして得られたポリぺプチドは、 一般的な生化学的方法によって 単離精製することができる。
産業上の利用可能性
本発明のポリぺプチドおよびそれをコードする c DN Aは、 一つあるいは それ以上の効果あるいは生物活性 （以下に列挙するアツセィに関連するもの を含む） を示すことが考えられる。 本発明の蛋白に関して記述される効果あ るいは生物活性は、 その蛋白の投与あるいは使用により、 あるいは、 その蛋 白をコードする c DNAの投与あるいは使用 （例えば、 遺伝子療法や c DNA導入に適したベクター） により、 提供される。
[サイトカイン活性および細胞増殖 Z分化活性]
本発明の蛋白は、 サイ ト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻害） /分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団に他 のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。 全ての既知の サイ ト力インを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子は、 因子に依存 した一つあるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、 活性を示してきたので、 それらのアツセィは、 サイ ト力イン活性の便利な確認法として機能する。 本 発明の蛋白の活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の細胞増殖アツセィ のうちのいずれかによつて証明され得る。
[免疫刺激 Z抑制活性]
本発明の蛋白は、 免疫刺激活性および免疫抑制活性を示すと考えられる。 また、 ある蛋白は、 例えば、 丁リンパ球および Bリンパ球あるいはどちらか 一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様に NK 細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免疫 不全および疾患 (severe com ined immunodeficiency ( S C I D) を -む） の治療に効果を示すと考えられる。 これらの免疫不全は遺伝性である場合も あるし、 例えば H I Vのようなウィルスや、 同様に細菌やカビの感染が原因 で起こる場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患から由来する可能性もある。 より特殊な場合に、 H I V、 肝炎ウィルス （hepatitis viruses) 、 ウイ レス (herpes viruses) 、 マイコゾ クテリア (mycobacteria) 、 リーシ ュマニア （leishmania) 、 マラリア （malaria) およびカンジダ （Candida) のような様々なカビ感染を含む、 ウィルス、 細菌、 カビあるいは他の感染に よる感染症の原因を、 本発明の蛋白を用いることによって治療できると考え られる。 もちろん、 この関連より、 本発明の蛋白は、 免疫システムが増大し ていることが一般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所において効果 を示すと考えられる。
本発明の蛋白は、 アレルギー反応および喘息や他の呼吸器系疾患のような 状況の治療に効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるような他の状態 (例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む） にも、 本発明の蛋白を用いて治療 できると考えられる。
本発明の蛋白は、 例えば、 敗血病性のショックあるいは全身性炎症反応症 候群 （S I RS) のような感染、 炎症性大腸炎、 クローン病に関連する、 あ るレ ま I L - 1 1により効果が証明された TN Fや I L一 1のようなサイ ト 力インの過剰産生から由来する慢性あるいは急性の炎症を抑制する可能性も ある。
[造血細胞制御活性]
本発明の蛋白は、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞ある いはりンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コ口 ニー形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性で さえも、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次に 挙げる全てあるいはそのいずれかで例えられるようなものに係わるものであ る。 赤血球前駆細胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサイ トカイ ンとの組み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血の治療、 あるいは赤血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生を刺激す る放射線療法/化学療法と組み合わせての使用 ；顆粒球および単球 Zマクロ ファージのような骨髄球の成長および増殖を支持 （すなわち、 古典的な CS F活性） 、 化学療法に伴う骨髄抑制を防ぐための化学療法との併用 ；巨核球 の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 それに よって血小板減少症のような様々な血小板障害を防御および治療を可能とす る血小板輸血の際あるいは相補的な一般的使用 ；上記造血細胞の幾つかある いは全ての細胞へ成熟可能な造血幹細胞の成長および増殖の支持、 従って、 様々な幹細胞障害 （限定はされないが、 再生不良性貧血および発作性夜間血 色素尿症を含む、 移植で一般的に治療されるようなもの） に治療的効果を見 い出せる、 また、 正常細胞あるいは遺伝子療法のため遺伝的に操作された細 胞をイン · ビトロ （i n v i t ro) あるいはェクス · ビボ （ex v i vo) (すなわち、 骨髄移植に伴う） どちらかで、 放射線療法 Z化学療 法後の幹細胞分画の再構 築を行なうことも同様である。
本発明の蛋白は、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが可能 である。
[組織生成/修復活性]
本発明の蛋白は、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 および潰 瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに使用されると考えられる。
骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋白は、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷あ るいは欠損の治癒に適用される。 本発明の蛋白を使用している製剤は、 開放 骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良にも、 予防的に使 用できるものと考えられる。 骨形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天 性、 外傷性、 癌切除術により誘発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 ま た、 美容形成外科分野にも有効である。
本発明の蛋白は、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用されると考 えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺 激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 該発明 の蛋白は、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを通して、 あるいは、 炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナーゼ活性や 破骨細胞の活性） の過程を阻止すことにより、 骨粗鬆症および骨関節炎の治 療に有効と考えられる。
本発明の蛋白に起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリ一は腱
Z靭帯形成である。 本発明の蛋白は、 腱 Z靭帯様組織あるいは他の組織が正 常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒト および他の動物における腱/靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱 Z靭帯の障害 の治癒に適用できる。 腱/靭帯様組織を誘導する蛋白を使用している製剤は、 骨あるいは他の組織への腱 Z靭帯の固定の改良、 および腱ノ靭帯組織の欠損 の修復での使用はもちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対する予防的使 用も考えられる。 本発明の構成物により誘導される新生腱/靭帯様組織形成 は、 先天性、 外傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭帯欠損の修復に貢献す る。 また、 腱あるいは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも有効 である。 本発明の構成物は、 腱 靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖 を刺激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あ るいは、 組織修復を果たすためイン · ビボ （in vivo) への返還に備えてェク ス · ビボ （ex vivo) で腱 Z靭帯細胞あるいはその前駆細胞を誘導する。 本発 明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症候群 （Carnal tunnel syndrome) 、 お よび他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有効である。 該構成物には、 適当な マトリックスおよびキヤリア一と同様に当業者に良く知られているシ一クェ ス夕リング （Sequestering) 剤も含まれる。
本発明の蛋白は、 神経細胞の増殖、 および、 神経および脳組織の再生、 す なわち、 神経細胞あるいは神経組織の変性、 死、 あるいは外傷を含む機械的 および外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療に 対しても効果を示すと考えられる。 より特異的には、 ある蛋白は、 末梢神経 障害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疾患、 および アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側策症 (amyotropic lateral) 、 およびシャイ · ドレ一ガ一 (Shy-Drager) 症候群 のような中枢神経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 さらに本発明 に応じて治療され得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および脳卒中等の脳 血管疾患のような機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あるいは他の治 療から起因する末梢神経症も本発明の蛋白を用いて治療可能である。
本発明の蛋白は、 例えば塍臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓器、 平滑、 骨格あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような他の 組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を促進 する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正常組織を再 生させる繊維性瘢痕 （s c ar r i ng) の阻害によっても担われると考えられる。 本発明の蛋白は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊維 化、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイ ト力イン障害に起因する状 態に対する治療にも有効であると考えられる。 本発明の蛋白は、 ァクチビン/インヒビンに関連した活性を示すと考えら れる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H ) の放出を刺激する活性によ つて特徴づけられる力 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H ) の放出 を阻害する活性によって特徴づけられる。 よって、 本発明の蛋白は、 単独あ るいはインヒビン aフアミリーのメンバ一とのへテロダイマーで、 哺乳類動 物の雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるインヒビンの活性に 基づく避妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のインヒビン の投与によって、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。 一方、 本発明の蛋白は、 ィンヒビン bグループの他の蛋白サブュニッ卜とのホモダイマーあるいはへ テロダイマーで、 前脳下垂体の細胞から F S H放出を刺激するァクチビン分 子の活性に基づいた治療的な不妊誘導として有効であると考えられる （米国 特許 4, 798, 885参照） 。
本発明の蛋白は、 牛、 羊、 および豚のような家畜の生涯出産能力可能な期 間を延ばすために、 性的に未熟なほ乳類動物における妊娠開始を早めること に有効であると考えられる。 [走化性 化学運動性活性]
本発明の蛋白は、 例えば、 単球、 好中球、 T細胞、 マスト細胞、 好酸球、 および内皮細胞、 あるいはそのいずれかを含む哺乳動物の細胞に対して、 例 えば、 ケモカインとして働く走化性 Z化学運動性活性を有すると考えられる。 走化性 Z化学運動性蛋白は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団を固 定化あるいは引き寄せるため使用されることが可能である。 走化性/化学運 動性蛋白は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別な優 位性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍あるいは 感染部位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答を改 善する結果となると考えられる。
蛋白やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接に特殊な細胞集団に対し て指示された方向あるいは運動刺激が可能であれば、 そのような細胞集団に 対する走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白やペプチドは、 細 胞の指示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。 特別な蛋白がある 集団の細胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 どんな既知の細胞走化性 のアツセィ法にそのような蛋白あるいはぺプチドを使用しても容易に決定で さる。
[凝血および血栓活性]
本発明の蛋白は、 凝血あるいは血栓活性も示すと考えられる。 結果として、 そのような蛋白は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含む） の 治療に有効であると予期される。 あるいは、 外傷、 手術あるいは他の原因に より生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させることが 予期される。 本発明の蛋白は、 血栓の形成の溶解あるいは阻害、 および血栓 あるいは卒中等より生じる状態の治療および予防にも効果があると考えられ る。
[受容体/リガンド活性]
本発明の蛋白は、 受容体、 受容体 リガンドあるいは受容体/リガンドの インヒビ夕一あるいはァゴニス卜としての活性を示す可能性もある。 そのよ うな受容体およびリガンドの例として、 サイトカイン受容体およびそのリガ ンド、 受容体キナーゼおよびそのリガンド、 受容体フォスファターゼおよび そのリガンド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （Se l ec t i n、 In t egur i n, お よびそのリガンド、 受容体キナーゼ等の細胞接着分子を含む） およびそのリ ガンド、 および抗原提示、 抗原認識、 および細胞性および液性免疫反応の発 達に係わる受容体ノリガンドの組み合わせが挙げられるが、 これらに限定さ れるものではない。 受容体およびリガンドは、 その相互作用に対する可能な ぺプチドあるいは小分子のインヒビ夕一のスクリーニングにも有効である。 本発明の蛋白 （受容体およびリガンドの断片を含むが、 制限されるものでは ない） は、 それ自身受容体 Zリガンドの相互作用のインヒビ夕一として有効 であると考えられる。
[その他の活性]
本発明の蛋白 （ポリペプチド） は、 以下に示す付加的な活性あるいは効果 の一つあるいはそれ以上を示すと考えられる ：細菌、 ウィルス、 カビ、 およ び他の寄生虫を含む感染性の物質を殺傷する ； 身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の組織の色素沈着、 あるいは例えば、 胸部増量あるいは減量等 の器官の大きさ等の身体的特徴を抑制あるいは促進する効果を及ぼす； 食餌 脂肪、 蛋白、 あるいは炭水化物の分解に効果を及ぼす；食欲、 性欲、 ストレ ス、 認識 （認識障害） 、 鬱病、 暴力行動を含む行動特徴に効果を及ぼす；鎮 痛効果あるいは他の痛みを減少させる効果を及ぼす；胚性幹細胞の造血系以 外の他の系統への分化および増殖を促進する ；および、 酵素の場合その酵素 の欠失を補い、 また関連疾患を治療する。
上記活性を有する蛋白は、 例えば、 B細胞、 T細胞、 肥満細胞の増殖また は細胞死、 免疫グロブリンのクラススィツチ促進によるクラス特異的誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、 顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 単球 ·マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球 · マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球 前駆細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 ·マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆 細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 Β細胞または Τ細胞の遊 走促進、 胸腺細胞の増殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラー細胞の増殖または細胞死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞およ び各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞へ の分化促進または増殖、 細胞死、 あるいは破骨細胞の活性化や単球から破骨 細胞への分化促進による骨吸収の促進の作用を本発明のポリペプチドのみで、 またリガンドーレセプ夕一間の結合を介して、 あるいは他の分子と相乗的に 働くことにより有すると考えられる。
また本発明のポリペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各種神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または 細胞死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞 の生存維持または細胞死、 ァストロサイ卜の増殖または分化促進または細胞 死、 末梢神経の増殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細 胞死、 運動神経の増殖または生存維持、 細胞死の作用もあると考えられる。 さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導 作用による表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結 合組織 （骨、 筋肉、 腱） 、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 ある いは内胚葉誘導作用による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝臓、 塍臓） 、 呼吸器系 (肺、 気管） の形成に促進的または抑制的に作用すると考えられるとともに、 生体においても上記器官の増殖あるいは増殖抑制作用を有すると考えられる。 したがって、 本発明のボリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系も しくは骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発 育不全または異常増殖、 例えば、 炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または 化学療法剤投与後の白血球、 血小板、 Β細胞または Τ細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 A I D S、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） 、 各種変性疾 患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等） 、 あるいは神経損傷の予防または 治療薬として用いることが期待される。
また、 本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の 分化または増殖作用を有すると考えられるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 塍臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用 いることも期待される。
また、 本発明のポリぺプチドのポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル 抗体を用いて、 生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、 これによつて 該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用すること ができる。 ポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチド あるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。 また本発明のポリべプチド （好ましくはその細胞外ドメインのポリべプチ ド） を用いることにより、 例えばァフィ二ティ一カラムを作製して、 本ポリ ペプチドと結合する既知または未知の蛋白 （リガンド） の同定、 精製あるい はその遺伝子クローニングを行なうことができる。
また、 本発明のポリペプチド （好ましくはその膜貫通領域または細胞内ド メインのポリペプチド） を用いて、 例えばウェスト一ウエスタン法により、 またはその c D N A (好ましくは、 該ポリペプチドの膜貫通領域または細胞 内ドメインをコードする c D N A ) を用いて、 例えば酵母 2—ハイブリッド 法により該ポリべプチドと細胞質内で相互作用する下流のシグナル伝達分子 の同定、 遺伝子クローニングを行なうこともできる。
さらに本発明のポリぺプチドを用いることによって、 本ポリべプチドレセ プ夕ーァゴニスト、 アン夕ゴニス卜および受容体一シグナル伝達分子間の阻 害剤等のスクリーニングを行なうこともできる。
本発明の c D N Aは、 多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを 生産する際の重要かつ必須の錶型となるだけでなく、 遺伝病の診断や治療
(遺伝子欠損症の治療またはアンチセンス c D N A (m R N A) によって、 ボリペプチドの発現を停止させることによる治療等） に利用できる。 また、 本発明の c D N Aをプローブとしてジエノミック （genomi c) c D N Aを分離 できる。 同様にして、 本発明 c D N Aと相同性の高いヒトの関連ポリべプチ ドの遺伝子、 またマウス以外の生物における本発明ポリぺプチドと相同性の 高いポリべプチドの遺伝子を分離することも可能である。
[医薬品への適用]
前記の疾患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに対する抗体は通常、 全身的又は局所的に、 一般的には経口ま たは非経口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および脳 室内投与である。
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 1 0 0 gから 1 0 O m gの 範囲で、 一日一回から数回経口投与されるか、 または成人一人あたり、 一回 にっき、 1 0 gから 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。
もちろん前記したように、 投与量は、 種々の条件により変動するので、 上 記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合 もある。
本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成 物およびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等とし て用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクトース、 マンニトール、 グル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ リビニルピロリ ドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば、 潤滑剤 (ステアリン酸マグネシウム等） 、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム 等） 、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラク卜一ス等） 、 溶解補助剤 （アル ギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒドロキシプロピルメチルセル口一スフ夕レート等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、 また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、 不活性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2. 868, 691号および同第 3. 095. 355号明細書に詳しく記 載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水 性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な 希釈剤と混合される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生 理食塩水が挙げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールの ようなアルコール類、 ポリソルベート 8 0 (登録商標） 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラク トース等） 、 溶解補助剤 （例えば、 アルギニン、 ァスパラギン酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範 囲を制限するものではない。 また以下の説明中、 特に記載がなければ、 Molecular Cloning (Sambrook, J. , Fri tsh, E. F.および Maniai is, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressよ り 1989年に発刊） または Current Protocol in Molecular Biology ( F. M. Ausubel ら編、 John Wiley & Sons, Inc.より発刊） の記載に準じて行なった。 キット等の商品を使用した場 合には、 そこに添付されたている使用方法に従って行なった。 実施例
[細胞の調製]
初めにマウス ES (Embryonic Stem) 細胞株 D 3 (Τ· C. Doetschman, et. al. , J. Embryo 1. Exp. Morphol. , 87, 27, 1985参照）を D M E M, 1 5 % F C S ,
L I Fの培養液を用いて、 マイ トマイシン C処理した Embryonic Fibroblast 細胞上で未分化な状態を保って培養を行なった。 1 0 cmデイシュ内にコン フルェントにした o p o pマウス新生仔頭蓋冠由来ス トローマ細胞株
〇 P 9細胞（H. Kodama, et. al. , Exp. Hematol, 22, 979-984, i994参照）上に トリプシン処理して単一にした ES細胞 1 X 1 05個 Zwe 1 1を均一になる ように捲き、 a— MEM， 2 0 % F C Sの培養液を用いて 3 7 °C, 5 % C〇2で培養を行ない、 血液細胞への分化誘導を行なった（T. Nakano, et. al.,
Science, 265, 1098-1101, 1994参照） 。 2日目に培養液を半量交換した後、 5日目に全細胞を回収した。
[p o l y (A) +RNAの調製]
TR I z 0 1試薬 （TRIzol Reagent, 登録商標， GIBC0BRL社より販売） を 用いて全 RNAを抽出し、 Oligotex— d T 30 <S u p e r〉 （登録商標， 宝酒造より販売） を用いて p o l y (A) +RNAを精製した。 [哺乳動物細胞シグナルシークェンストラップ （S ST) cDNAライブラ リーの調製]
この mRN Aを铸型として S a 1 I部位を連結したランダム 9 m e r ： 5 ' -GAGACGGTAATACGATCGACAGTAGGTCGAC NNNNNNNNN- 3 ' (配列番号 16 ) をプライマーとして逆転写酵素 Superscript (登録商標、 GIBC0BRLより販売） を用いて 1本鎖 c DN Aを合成 し、 Gublerr & Hoffmanらの方法により 2本鎖 c DNAを合成した。 次に DNAライゲーシヨンキット Ver.2 (ligation kit Ver.2, 商品名、 宝酒造 より販売） を用いて 2本鎖 c DNAの両端に E c o R Iアダプター： 5 ' - CCGCGAATTCTGACTAACTGATT— 3 ' (配列番号 1 7 )
(配列番号 1 8) を結合した後、 ァガロース電気泳動により 400〜600 b pの c DNAを切り出して分画し、 Forwardのプライマー： 5' — CCGC GAATTCTGACTAACTGATT— 3 ' (配列 1 9 ) と Reverseの プライマー： 5 ' — GACGGTAATACGATCGACAGTAGG— 3 ' (配列番号 20) を用いて、 95°C， 30秒， 55°C, 1分， 72°C， 1分， 25サイクルの条件で P C Rを行ない、 c DNAを増幅した。 その c DNAを E c 0 R Iと S a 1 Iで消化した後、 ァガロース電気泳動により 40 0〜600 b pの c DNAを切り出して分画し、 pUC— S R a— T a c (国際公開番号 96/01843号明細書に詳細が記載されている。 ） の E c 0 R I /S a 1 I部位に連結し、 大腸菌 DH 5 aに形質転換して、 動物 細胞 S ST用の c DNAライブラリ一を得た。
[S STによるスクリーニング]
特開平 6 - 315380号明細書に記載された方法に準じて行なった。 上記ライブ ラリーのコロニ一計 4, 500個を 125プール （約 36コロニー/プール） に細 分化した。 各プールごとにプラスミ ドを調製し、 DEAE—デキストラン (dextran) 法を用いて C o s 7細胞にトランスフエクトした。 48時間後、 細胞をディッシュからはがして、 フルォレセィン ·ィソチオシァネートで ラベルした抗ヒ 卜 T a c抗体 (FITC-conjugated Monoclonal Mouse Ant i Human Inter leukin-2 Receptor Clone ACT- 1, DAKOより販売） を用いて細胞 表面の T cに対する蛍光染色を行ない、 蛍光顕微鏡下で陽性を示すプール を選択した。 さらに陽性プールのコロニーを細分化し、 単一クローンを得る まで同様の方法を繰り返した。
[S ST陽性クローンの塩基配列の決定]
次に各陽性クローンのィンサ一ト c DN Aの塩基配列を決定した。 塩基配 列の決定は DN A ' シーケンシング ' キッ ト （DNA Sequencing kit) (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready React ion ) (商品名 、 Applied Biosystems Inc.より販売） を用いた蛍光ダイターミネータ一サイクルシーク エンス法で反応を行ない、 自動 c D N Aシークェンサ一 3 7 3 (Applied Biosystems Inc. ) で読み取りを行なった （以下、 塩基配列決定はすべてこの 方法で行なった。 ） 。 得られた塩基配列についてデータベースとの相同性検 索を行なった結果、 シグナルシークェンスを有する既知の蛋白質が 7クロー ン （Apolipoprotein E, 0s teopont inなどの分泌蛋白質と PTPase- kappaなどの 膜蛋白質） 、 新規クローンが 1 7クローンあることが明らかとなった。
[全長 cDNAのクロ一ニングおよび塩基配列の決定]
新規 1 7クローンの中で OH P 1 06と名付けられたィンサ一ト長 444 b pのクローンに着目し、 3 ' RAC E (Rapid Amplification of cDNA End) 法により全長 c DNAを単離した。 3 ' RACE法は 3 ' RACEシス テム （商品名、 GIBC0BRL社より販売） の方法に準じて行なった。 上記の全 mRNAを铸型にして 3 ' RAC Eアダプタープライマ一： 5 ' — GGCC ACGCGTCGACTAC (T) 1 7— 3 ' (配列番号 2 1 ) を用いて 1 本鎖 c DNAを合成した。 次に 1本鎖 c DNAを铸型にして OHP 1 0 6 F 2プライマ一： 5 ' — CTC C CATATTGACTGAATCTGAG AAGC- 3 ' (配列番号 22) とユニバーサル · アンプリフィケ一シヨン (Universal Amplification) プライマ一： 5 ' -GGCCACGCGTCG ACTAC- 3 ' (配列番号 2 3) を用いて 9 5 °C， 30秒， 60°C, 30 秒， 7 2t：， 1分， 3 0サイクルの条件で P C Rを行なった。 さらにこの P CR溶液を铸型にして〇HP 1 0 6 F 1プライマー： 5 ' — AGTGGT T C T G C AA C T C C T C C - 3 ' (配列番号 2 4 ) と Universal A即 lificationプライマー： 5 ' -GGC CAC GC GTC GACTAC - 3 ' (配列番号 2 5 ) で再度同条件で P C Rを行ない、 約 5 3 0 b pの c DNAが特異的に増幅されることを確認した。 この c DNAを p GEM— T (商品名、 Promegaより販売） に連結し、 大腸菌 D H 5 aに形質転換してプ ラスミドを調製した。 初めに 5 ' 末端と 3 ' 末端の塩基配列を決定し、 5 ' 側に F 1プライマーの配列と 3 ' 側に p o 1 y (A) +配列が存在することを 確認した。 引き続き 全長の塩基配列を決定し、 配列番号 3中に示す塩基配列 を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 配列番号 2に示す アミノ酸翻訳領域および配列番号 1に示す推定アミノ酸配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリぺプチドマウス〇HP 1 0 6およびそれをコードする 核酸配列と一致する配列はなかった。 さらに得られたアミノ酸配列の疎水性 プロットによる解析から本発明のポリぺプチドは膜貫通領域を持たないこと が予想された。 これらのことから、 本発明のポリペプチドは、 新規の分泌蛋 白質であることが判明した。 しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クロー ン、 マウス OHP 1 0 6 (配列番号 1のアミノ酸配列 2 5〜 1 5 3間の領 域） とニヮトリの白血病ウィルス由来のガン遺伝子 my bによって発現が誘 導される Chicken MD— 1 (Pir Accession S42854のアミノ酸配列 2 8〜 1 54間の領域） （0. Burk et. al.. EMBO J, J_0, 3713-3719参照） の間に有 為な相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 マウス OHP 1 0 6は、 少なくとも Chicken MD— 1と関連した活性を保持すると期待さ れる。 [ノザン解析]
未分化な状態の E S細胞および上記の分化誘導を行なつた E S細胞より調 製した p o l y (A) +RNAを 1 %ァガロース電気泳動にかけ、 ナイロン膜 にトランスファ一した。 つぎにランダム ·プライマー · DNA ·ラベリング キット （Random Primer DNA Labeling kit) (商品名、 宝酒造より販売） を 用いてマウス OHP 1 06じ 0^'八を32 一（^〇丁？でラべルし、 50 %ホ ルムアミ ド， 5 X S S P E 0.1 % S D S , 2 XDenhaldis, 0. lmg/m 1 サーモン 'スパ一ム （salmon sperm) D N A中 42 °Cで 1 5時間ナイロン膜 とハイブリダィズさせた。 0.2X S S C, 0.1 % S D S , 6 5 °Cでフリーの 32 P— d CTPを除去した後、 48時間露光し、 BAS2000 (富士フィルム） を 用いて解析を行なった。 その結果、 分化誘導を行なった E S細胞の mRN A にのみ 600 b p付近にバンドが認められた。 このことからも配列番号 3中 に示された c DN Aはほぼ全長であること、 およびマウス〇HP 1 06の mRN Aは分化誘導時に発現することが示された。
[マウス OHP 1 06関連遺伝子の塩基配列の決定]
マウス〇HP 1 06の塩基配列のオープンリーディングフレーム内に 22 b の挿入配列を有するマウス腎臓 c DN Aライブラリー由来のクローン (clonelD 520548) を IMAGE Consor t iumより購入し、 マウス OHP 1 06 K と命名した。 マウス〇HP 1 06と同様の方法で全塩基配列を決定し、 配列 番号 6中に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 配列番号 5に示すアミノ酸配列翻訳領域および配列番号 4に示す推定アミノ 酸配列を得た。
またマウス OHP 1 06の塩基配列の一部と相同性を有するヒト妊娠子宮 c D N Aライ ブラ リー由来のク ローン （ ClonelD 489463 ) を IMAGE Consortium社より購入し、 ヒ ト〇 H P 1 0 6と命名した。 マウス〇 H P 1 06と同様の方法で全塩基配列を決定し、 配列番号 9に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 配列番号 8に示すアミノ酸 翻訳領域および配列番号 7に示す推定アミノ酸配列を得た。 さらにマウス OHP 106のアミノ酸配列の一部と有意な相同性を有する マウス 13.5、 14.5日胎児 c D N Aライブラリ一由来のクロ一ン （ClinelD 402964) およびヒト胎児肝臓、 腎臓 c DNAライブラリー由来のクローン (ClonelD 111816) を IMAGEConsor t ium社より購入し、 それそれマウス OHP 1 06 Hおよびヒト OHP 106 Hと命名した。 マウス OHP 106と同様 の方法で全塩基配列を決定し、 配列番号 1 2中および 1 5中に示す配列を得 た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 配列番号 1 1および 1 4に示すアミノ酸翻訳領域および配列番号 1 0および 1 3に示す推定アミノ 酸配列を得た。 相同性検索の結果、 OHP 1 06のアミノ酸をコードする領 域はマウス—ヒト間において c DNAレベルで 7 6 %、 アミノ酸レベルで 64 %—致していた。 また〇HP 1 06 Hのマウスーヒ ト間の相同性は c DNAレベルで 77%、 アミノ酸レベルで 67 %—致していた。 またヒト OHP 106 -OHP 106 Hの相同性は c DNAレベルで 49 %、 ァミノ 酸レベルで 23 %—致していた。
[哺乳動物細胞を用いたマウス〇HP 106融合蛋白質の発現]
OHP 106の翻訳開始点 AT Gを含む Xb a l—マウス OHP 1 06 F
GTTG C - 3 ' (配列番号 26) と翻訳終止点 T G Aを含む X b a I — F L AG—マウス〇HP 1 06 Hプライマー： 5 ' — CGTCTAGATC ACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCATTGACATC AC GG C GGTGAATGAT- 3 ' (配列番号 2 7 ) または同じ X b a I —マウス〇 HP 1 0 6 Fプライマーと翻訳終止点 T G Aを含む Xb a I - 6H i s—マウス〇HP 106 Hプライマ一： 5 ' — CGTCT CGGC GGTGAATGAT— 3 ' (配列番号 28 ) の組み合わせで 3 ' R AC E時に調製した 1本鎖 c DNAを铸型として P C Rを行ない、 増幅さ れた c DNAを Xb a Iで消化後、 哺乳動物細胞用発現ベクター p E F— BOS (S. Mizushima el. l. Nucleic Acid Res., 18, 5322) の Xb a I部 位に連結して、 OHP 1 06蛋白の C末端に F LAG (A s p Ty r L y s A s pA s pA s pA s p L y sからなるぺプチド） または 6個の H i s残 基をタグとしてつけた融合蛋白質を発現させるベクターを構築した。 プラス ミドを調製してィンサ一ト c DN Aの塩基配列に変異がないことを確認した。 得られたプラスミドをリポフエクチン （商品名、 GIBC0BRLより販売） を用 いて Co s 7細胞に導入した。 24時間後無血清培地に交換して 72時間培 養を行なった。 細胞上清を回収後セントリブレップ一 1 0 (商品名、 Amicon 社より販売） にて約 1 0倍に濃縮し、 SDS— PAGEを行なった。 蛋白を アクリルアミ ドゲルからィモビロン— P (PVDF膜、 商品名、 ミリポア社より 販売） にトランスファーし、 F LAG融合蛋白質は抗 F LAG 2モノクロ ーナル抗体 （イーストマン · コダック社より販売） と西洋ヮサビペルォキシ ダーゼ結合プロテイン Αを用いて、 また 6 XH i s残基融合蛋白質は西洋ヮ サビペルォキシダ一ゼ結合 N i — NTA (商品名、 QIAGENより販売） を用い て発色させて、 マウス〇HP 1 06融合蛋白質の発現を検出した。
[哺乳動物細胞を用いたマウス OHP 1 06およびその関連遺伝子 （以下マ ウス OHP106等と略記する。 ） の蛋白発現]
得られたマウス〇HP 1 06等の全長 c DN Aを哺乳動物細胞用発現べク 夕一 p ED 6 (Kaufman et al. , ucleic Acids Res.19, 4485- 4490 (1991)参 照） の Xh o l (または E c o R I ) —No t I部位に連結し、 マウス〇H P 1 06等の蛋白質を発現させるベクターを構築した。 得られたプラスミ ド をリポフエクチン （商品名、 GIBC0BRLより販売） を用いて C o s 7細胞に導 入した。 24時間後に M e tおよび C y s フリーの培地に交換した後、 35S— Me tおよび 35S— C y sを添加して 5時間培養を行なった。 細胞上 清を回収後、 セントリコンー 1 0 (商品名、 Amiconより販売） にて約 1 0倍 に濃縮し、 SD S— PAGEを行なった。 アクリルアミドゲルを乾燥させた 後、 マウス OHP 1 06等の蛋白発現を B AS 2000を用いて検出した。 すなわち、 イメージング · プレート （富士 （Fuj i)イメージング · プレート ΤΥΡΕ-ΙΙΙ) に露光し、 イメージング ·アナライザ一 （富士 （Fuji)ィメ一ジン グ ' アナライザ一 BAS 2000システム） にて読取り、 解析し、 プリン夕 ― (Fuji Pictrography 3000) にて打ち出した。 一例としてマウス OHP 1 06 Hの発現を図 1に示す。 ベクタ一 pED 6のみを導入した C o s 7細 胞と比較してマウス〇HP 106 H c DNAを導入した C o s 7細胞の上清 にのみ 20 kD a付近にバンドが認められ、 マウス〇HP 1 06 H蛋白の発 現が確認できた。

Claims

請求の範囲
1. 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 10または 13で示さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 またはそのホモローグ、 そのフラ グメントまだはそのフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
2. 配列番号 1、 4、 7、 10または 13で示されるアミノ酸配列からな る請求の範囲第 1項記載のポ
3. 請求の範囲第 1項に記載されたポリペプチドをコードする c DNA。
4. 配列番号 2、 5、 8、 1 1または 14で示される塩基配列を有する請 求の範囲第 3項記載の c DNA、 またはその配列に選択的にハイプリダイズ するフラグメントからなる cDNA。
5. 配列番号 3、 6、 9、 12または 15中に示される塩基配列を有する 請求の範囲第 3項記載の c DNA、 またはその配列に選択的にハイプリダイ ズするフラグメントからなる c DNA。
6. 請求の範囲第 3項から第 5項のいずれかの項に記載の c DN Aからな る複製または発現ベクター。
7. 請求の範囲第 6項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿 主細胞。
8. 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドを発現させ るための条件下で請求の範囲第 7記載の宿主細胞を培養することからなる請 求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリぺプチドの製造方法。
9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドのモノクロ ーナルまたはポリクロ一ナル抗体。
1 0 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドまたは請 求の範囲第 9項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および Zまたは 担体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
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