WO1999011763A9 - Method for purifying and concentrating aav-2 and antigen portions thereof - Google Patents

Method for purifying and concentrating aav-2 and antigen portions thereof

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WO1999011763A9
WO1999011763A9 PCT/DE1998/002569 DE9802569W WO9911763A9 WO 1999011763 A9 WO1999011763 A9 WO 1999011763A9 DE 9802569 W DE9802569 W DE 9802569W WO 9911763 A9 WO9911763 A9 WO 9911763A9
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Juergen Kleinschmidt
Andrea Kern
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Deutsches Krebsforsch
Juergen Kleinschmidt
Andrea Kern
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a process for the purification of AAV-2 and antigenic parts thereof.
  • viruses in particular recombinant viruses, which are used as vectors, have to be purified and concentrated.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which adeno-associated viruses of type 2 (AAV-2) can be purified and concentrated easily and efficiently from cell culture supernatants and cell extracts.
  • AAV-2 adeno-associated viruses of type 2
  • this object is achieved by a process for the purification and concentration of AAV-2 and antigenic parts thereof, which comprises the following steps: coupling an antibody directed against AAV-2 to an activated chromatography material,
  • the method according to the invention is based on the principle of affinity chromatography graphic.
  • an antibody directed against AAV-2 is bound to a chromatography material.
  • the antibody is bound to the chromatography material according to known methods, for example as described in "Harlow and Lane, Antibodies (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, 1 988".
  • Suitable chromatography materials are the chromatography materials known to the person skilled in the art, in particular those hydrophilic materials which are known in connection with gel filtration. These are, for example, agarose gels (eg Sepharose R ), dextran gels (eg Sephadose R ), cellulose gel matrices and acrylamide geomatrices.
  • the chromatography material is advantageously activated, which enables the binding and immobilization of proteins. This activation can take place by cyanogen bromide (CNBr) activation or NHS activation.
  • CNBr cyanogen bromide
  • AAV-2 or antigenic parts thereof can be a polycionic or monoclonal antibody.
  • the antibody can be derived from any animal or human, with rabbits preferred for a polyclonal antibody and mice preferred for a monoclonal antibody.
  • the antibody can be synthetic, parts or parts that are not necessary for the above recognition being missing in whole or in part or these parts being replaced by others which give the antibody further favorable properties. Parts outside the binding regions of the antibodies can also be modified, eliminated or replaced.
  • DNA recombination technology is particularly suitable for the above measures. He is very familiar with this.
  • A20 deposited with the DSMZ under DSM ACC21 94 on 1 October 3, 994.
  • AAV-2 or antigenic parts thereof refers to AAV-2 capsid proteins, in particular VP1, VP2 and / or VP3 and their fragments that perform an antigenic function.
  • AAV-2 includes both wild type and also recombinantly produced AAV-2.
  • Methodological aspects of AAV-2 such as cell culture, virus growth, virus pre-purification, isolation of the proteins can be found in the relevant literature, e.g. B. in Handbook of Parvoviruses, Vol. I and II, CRC Press, Boca Raton, Florida, ED. P. Tjissen; Ruffing, M. et al. (1,992), J. Virol., 66, pp. 6922-6930.
  • a solution containing AAV-2 is added to a chromatography column to which an antibody directed against AAV-2 is coupled, e.g. B. in the form of cell culture supernatants or cell extracts, there is binding to the immobilized antibody and AAV-2 can be detached therefrom, whereby a purification and concentration takes place.
  • the elution conditions are almost neutral, approx. PH 6 to 8.
  • the elution solution contains 0.5 to 4.5 M MgCl 2 , preferably 2-3 M MgCl 2 .
  • the activated chromatography material can also contain spacers bound to it. These spacers are preferably aliphatic or cyclic hydrocarbon groups.
  • the aliphatic hydrocarbon groups can be straight or branched ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, or decyl groups.
  • the cyclic hydrocarbon groups include phenyl, benzyl and cyclohexyl groups.
  • kits for carrying out the method according to the invention is also provided, which is also the subject of the present invention.
  • a kit includes the following
  • AAV-2 an antibody directed against AAV-2
  • common tools such as buffers, chromatography matrix and controls.
  • helper viruses adenoviruses
  • Concentration from large volumes is also advantageous, with a yield of almost 100% being achievable.
  • a scale-up of the method according to the invention is easily possible for large production quantities.
  • Fig. 1 Principle of the method according to the invention
  • Fig. 3 Graphic representation of the elution (light gray columns: wild type AAV-2; dark gray columns: rAAV-2)
  • A20 antibody was affinity-purified from 500 ml of A20 hybridoma supernatant on an anti-mouse IgG column (alternatively, a "Quick Antibody Matrix from Dianova can be used). 8 mg of A20 antibody were applied
  • HiTrap NSH-activated Sepharose (Pharmacia) coupled according to the manufacturer's instructions.
  • the MgCl 2 can be removed by dialysis or pelleting of the virus particles and resuspension in a desired buffer (eg Tris or 1 0/1 TE).
  • the A20 monoclonal antibody was removed from the hybridoma supernatant
  • the column was washed continuously with PBS and the AAV-2 capsids were eluted with 2.5 M MgCl 2 in PBS supplemented with 50 mM Tris, pH 7.
  • the A20 hitrap column was regenerated with PBS and stored under PBS / 0.01% sodium azide.
  • the AAV-2 viruses were titrated by dot blot hybridization and immunofluorescence.
  • Recombinant AAV-2 was also purified according to the above procedure for wild-type AAV-2.
  • the expression of the LacZ gene was measured by in-situ X-Gal staining of the infected HeLa cells after serial dilutions (dark gray columns in FIG. 3).

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Abstract

The invention relates to a method for purifying and concentrating AAV-2 and antigen portions thereof. AAV-2 or antigen portions thereof are bonded to an activated chromatographic material on which antibodies are linked, said antibodies being directed against AAV-2. Afterwards, elution using a solution containing 0.5 to 4.5 MgCl2 is carried out. The invention also relates to a kit for implementing said method.

Description

Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davonProcess for the purification and concentration of AAV-2 and antigenic parts thereof
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon.The present invention relates to a process for the purification of AAV-2 and antigenic parts thereof.
Für therapeutische Ansätze müssen Viren, insbesondere rekombinante Viren, die als Vektoren verwendet werden, aufgereinigt und ankonzentriert werden. Die dafür bisher gebräuchlichen Verfahren, wie mehrfache Dichtegradientenzen- trifugation oder chromatografische Methoden, z. B. mit einer sulfonierten Cellulo- sesäule, sind oft aufwendig und teuer und müssen mehrfach wiederholt werden, um so viele Kontaminationen wie möglich zu entfernen. Trotzdem ist damit oftmals nur eine partielle Reinigung möglich.For therapeutic approaches, viruses, in particular recombinant viruses, which are used as vectors, have to be purified and concentrated. The methods previously used for this, such as multiple density gradient centrifugation or chromatographic methods, e.g. B. with a sulfonated cellulose column, are often complex and expensive and have to be repeated several times to remove as much contamination as possible. Nevertheless, partial cleaning is often only possible.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem adeno-assozierte Viren vom Typ 2 (AAV-2) aus Zell- kultur-Überständen und Zellextrakten einfach und effizient aufgereinigt und ankonzentriert werden können.The object of the present invention is therefore to provide a method with which adeno-associated viruses of type 2 (AAV-2) can be purified and concentrated easily and efficiently from cell culture supernatants and cell extracts.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.This object is solved by the subject matter of the claims.
Insbesondere wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon gelöst, das die folgenden Schritte aufweist: - Kopplung eines gegen AAV-2 gerichteten Antikörpers an ein aktiviertes Chromatografiematerial,In particular, this object is achieved by a process for the purification and concentration of AAV-2 and antigenic parts thereof, which comprises the following steps: coupling an antibody directed against AAV-2 to an activated chromatography material,
Auftragen einer wt-AAV-2 bzw. rAAV-2 enthaltenden Probe, Eluieren von wt-AAV-2 bzw. rAAV-2 mit einer Lösung, bevorzugt einem Puffer, enthaltend 0,5 bis 4, 5 M MgCI2.Applying a sample containing wt-AAV-2 or rAAV-2, eluting wt-AAV-2 or rAAV-2 with a solution, preferably a buffer, containing 0.5 to 4.5 M MgCl 2 .
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem Prinzip der Affinitätschromato- grafie. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein gegen AAV-2 gerichteter Antikörper an ein Chromatografiematerial gebunden. Die Bindung des Antikörpers an das Chromatografiematerial erfolgt gemäß bekannter Methoden, beispielsweise wie in " Harlow and Lane, Antibodies (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, 1 988" beschrieben. Als Chromatografiematerial eignen sich die dem Fachmann bekannten Chromatographiematerialien, insbesondere jene hydrophilen Materialien, die in Verbindung mit Gelfiltration bekannt sind. Dies sind beispielsweise Agarosegele (z.B. SepharoseR), Dextrangele (z. B. Sepha- dexR) , Cellulose-Gelmatrices und Acrylamid-Geimatrices. Für den erfindungs- gemäßen Zweck ist das Chromatografiematerial vorteilhafterweise aktiviert, wodurch die Bindung und Immobilisierung von Proteinen ermöglicht wird. Diese Aktivierung kann durch Cyanbromid (CNBr)-Aktivierung oder NHS-Aktivierung stattfinden.The method according to the invention is based on the principle of affinity chromatography graphic. In a preferred embodiment, an antibody directed against AAV-2 is bound to a chromatography material. The antibody is bound to the chromatography material according to known methods, for example as described in "Harlow and Lane, Antibodies (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, 1 988". Suitable chromatography materials are the chromatography materials known to the person skilled in the art, in particular those hydrophilic materials which are known in connection with gel filtration. These are, for example, agarose gels (eg Sepharose R ), dextran gels (eg Sephadose R ), cellulose gel matrices and acrylamide geomatrices. For the purpose according to the invention, the chromatography material is advantageously activated, which enables the binding and immobilization of proteins. This activation can take place by cyanogen bromide (CNBr) activation or NHS activation.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbaren Antikörper erkennenRecognize the antibodies that can be used for the method according to the invention
AAV-2 oder antigene Teile davon. Ein solcher Antikörper kann ein polykionaler oder monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann aus jeglichem Tier oder dem Menschen erhalten sein, wobei für einen polyklonalen Antikörper Kaninchen und für einen monoklonalen Antikörper Mäuse bevorzugt sind. Ferner kann der Antikörper synthetisch sein, wobei ihm ggf. Teile, die für vorstehende Erkennung nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die dem Antikörper weitere günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile außerhalb der Bindungsregionen der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maß- nahmen insbesondere die DNA-Rekombinationstechnik eignet. Diese ist ihm bestens vertraut. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere der bereits bekannte Antikörper geeignet, der in der WO 95/1 1 997 bzw. EP-A-0 725 837 beschrieben ist: A20; hinterlegt bei der DSMZ unter DSM ACC21 94 am 1 3. Oktober 1 994. Der Begriff "AAV-2 oder antigene Teile davon" bezieht sich auf AAV-2 Kapsid- proteine, insbesondere VP1 , VP2 und/oder VP3 sowie deren Fragmente, die eine antigene Funktion erfüllen. Der Begriff "AAV-2" schließt sowohl Wildtyp als auch rekombinant hergestelltes AAV-2 ein. Detaillierte Informationen bezüglich methodischer Aspekte von AAV-2, wie Zellkultur, Viruswachstum, Virus-Vorreinigung, Isolierung der Proteine können in der relevanten Literatur gefunden werden, z. B. in Handbuch der Parvoviren, Bd. I und II, CRC Press, Boca Raton, Florida, ED. P. Tjissen; Ruffing, M. et al. ( 1 992), J. Virol., 66, S. 6922-6930.AAV-2 or antigenic parts thereof. Such an antibody can be a polycionic or monoclonal antibody. The antibody can be derived from any animal or human, with rabbits preferred for a polyclonal antibody and mice preferred for a monoclonal antibody. Furthermore, the antibody can be synthetic, parts or parts that are not necessary for the above recognition being missing in whole or in part or these parts being replaced by others which give the antibody further favorable properties. Parts outside the binding regions of the antibodies can also be modified, eliminated or replaced. The person skilled in the art knows that DNA recombination technology is particularly suitable for the above measures. He is very familiar with this. The already known antibody, which is described in WO 95/1 1 997 or EP-A-0 725 837, is particularly suitable for the method according to the invention: A20; deposited with the DSMZ under DSM ACC21 94 on 1 October 3, 994. The term "AAV-2 or antigenic parts thereof" refers to AAV-2 capsid proteins, in particular VP1, VP2 and / or VP3 and their fragments that perform an antigenic function. The term "AAV-2" includes both wild type and also recombinantly produced AAV-2. Detailed information regarding methodological aspects of AAV-2, such as cell culture, virus growth, virus pre-purification, isolation of the proteins can be found in the relevant literature, e.g. B. in Handbook of Parvoviruses, Vol. I and II, CRC Press, Boca Raton, Florida, ED. P. Tjissen; Ruffing, M. et al. (1,992), J. Virol., 66, pp. 6922-6930.
Gibt man auf eine Chromatografie-Säule, an die ein gegen AAV-2 gerichteter Antikörper gekoppelt ist, eine Lösung, die AAV-2 enthält, z. B. in Form von Zell- kultur-Überständen oder Zellextrakten, findet eine Bindung an den immobilisier- ten Antikörper statt und AAV-2 kann davon wieder abgelöst werden, wodurch eine Reinigung und Konzentrierung stattfindet. Die Elutionsbedingungen liegen dabei im nahezu neutralen Bereich, ca. pH 6 bis 8. Die Elutionslösung enthält 0, 5 bis 4, 5 M MgCI2, bevorzugt 2-3 M MgCI2. Diese Bedingungen haben den Vorteil, daß der immobilisierte Antikörper nicht denaturiert wird und bei der Elution von AAV-2 nicht von der Säule abgelöst wird, sondern weiter an dieIf a solution containing AAV-2 is added to a chromatography column to which an antibody directed against AAV-2 is coupled, e.g. B. in the form of cell culture supernatants or cell extracts, there is binding to the immobilized antibody and AAV-2 can be detached therefrom, whereby a purification and concentration takes place. The elution conditions are almost neutral, approx. PH 6 to 8. The elution solution contains 0.5 to 4.5 M MgCl 2 , preferably 2-3 M MgCl 2 . These conditions have the advantage that the immobilized antibody is not denatured and is not detached from the column when eluting AAV-2, but continues to the
Säule gebunden bleibt, so daß die Säule nach ihrer Regenerierung mehrmals verwendet werden kann. Außerdem bleiben durch das erfindungsgemäße Verfahren die gereinigten Viren stabil bzw. infektiös.Column remains bound so that the column can be used several times after regeneration. In addition, the purified viruses remain stable or infectious through the method according to the invention.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das aktivierte Chromatografiematerial auch daran gebundene Spacer enthalten. Diese Spacer sind bevorzugt aliphati- sche oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppen. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen können gerade oder verzweigte Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, oder Decylgruppen sein. Bei den cyclischen Kohlenwasserstoffgruppen sind Phenyl-, Benzyl-, Cyclohexylgruppen zu nennen.In a preferred embodiment, the activated chromatography material can also contain spacers bound to it. These spacers are preferably aliphatic or cyclic hydrocarbon groups. The aliphatic hydrocarbon groups can be straight or branched ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, or decyl groups. The cyclic hydrocarbon groups include phenyl, benzyl and cyclohexyl groups.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch ein Kit bereitgestellt, der ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Ein solcher Kit umfaßt folgendesA kit for carrying out the method according to the invention is also provided, which is also the subject of the present invention. Such a kit includes the following
einen gegen AAV-2 gerichteten Antikörper, und übliche Hilfsmittel, wie Puffer, Chromatografiematrix und Kontrollen.an antibody directed against AAV-2, and common tools such as buffers, chromatography matrix and controls.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch einen einzigen Reinigungschritt eine hohe Reinigung erreicht. Es ist dabei eine vollständige Entfernung von Helferviren (Adenoviren) möglich. Vorteilhaft ist auch die Konzentrierung aus großen Volumina, wobei eine Ausbeute von nahezu 1 00% erreicht werden kann. Für große Produktionsmengen ist ein Scale-up des erfindungsgemäßen Ver- fahrens auf einfache Weise möglich.With the method according to the invention, high cleaning is achieved by a single cleaning step. Complete removal of helper viruses (adenoviruses) is possible. Concentration from large volumes is also advantageous, with a yield of almost 100% being achievable. A scale-up of the method according to the invention is easily possible for large production quantities.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:The invention is further described with reference to the figures, which show:
Fig. 1 : Prinzip der erfindungsgemäßen VerfahrensFig. 1: Principle of the method according to the invention
Fig. 2: Dot BlotFig. 2: Dot blot
Fig. 3: Grafische Darstellung der Elution (hellgraue Säulen: Wildtyp AAV-2; dunkelgraue Säulen: rAAV-2)Fig. 3: Graphic representation of the elution (light gray columns: wild type AAV-2; dark gray columns: rAAV-2)
Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele beschrieben:The invention is further described using the following examples:
BEISPIEL 1 :EXAMPLE 1 :
Das Verfahrensprinzip ist in Fig. 1 gezeigt.The principle of the method is shown in FIG. 1.
Aus 500 ml A20-Hybridomüberstand wurde ca. 8 mg A20-Antikörper über eine anti-Maus IgG-Säule (alternativ kann auch eine "Quick Antibody Matrix der Fa. Dianova verwendet werden) affinitätsgereinigt. 8 mg A20-Antikörper wurden anApprox. 8 mg of A20 antibody was affinity-purified from 500 ml of A20 hybridoma supernatant on an anti-mouse IgG column (alternatively, a "Quick Antibody Matrix from Dianova can be used). 8 mg of A20 antibody were applied
HiTrap NSH-aktivierte Sepharose (Fa. Pharmacia) nach den Vorschriften der Herstellers gekoppelt. Ein geklärtes Frier-Tau-Lysat von Zellen, in denen Wildtyp- AAV-2 oder rAAV-2 produziert wurde, wurde langsam über die Säule gepumpt (4°C über Nacht), mit 1 0 Säulenvolumen PBS gewaschen und in 2-4 ml PBS mit 2,5 M MgCI2 eluiert. Das MgCI2 kann durch Dialyse oder Pelletierung der Viruspartikel und Resuspension in einem gewünschten Puffer (z.B. Tris oder 1 0/1 TE) entfernt werden.HiTrap NSH-activated Sepharose (Pharmacia) coupled according to the manufacturer's instructions. A cleared freeze-thaw lysate from cells in which wild-type AAV-2 or rAAV-2 was produced, was slowly pumped over the column (4 ° C. overnight), washed with 1 0 column volume of PBS and eluted in 2-4 ml of PBS with 2.5 M MgCl 2 . The MgCl 2 can be removed by dialysis or pelleting of the virus particles and resuspension in a desired buffer (eg Tris or 1 0/1 TE).
BEISPIEL 2:EXAMPLE 2:
Der A20-monoklonale Antikörper wurde aus dem Hybridoma-Überstand unterThe A20 monoclonal antibody was removed from the hybridoma supernatant
Verwendung der " Quick Antibody Purification Column" der Fa. Dianova, Hamburg gereinigt und ankonzentiert. Der gereinigte Antikörper wurde an Hitrap-NHS aktivierte Sepharose gemäß den Herstellerangaben (Fa. Pharmacia) gekoppelt. Eine ungereinigte AAV-2 Virusaufbereitung wurde 1 : 1 0 mit sterilem PBS ver- dünnt und langsam auf die A20-Hitrap-Säule appliziert. Nach Sammeln desUse of the "Quick Antibody Purification Column" from Dianova, Hamburg, cleaned and concentrated. The purified antibody was coupled to Hitrap-NHS activated Sepharose according to the manufacturer's instructions (Pharmacia). An unpurified AAV-2 virus preparation was diluted 1: 1 0 with sterile PBS and slowly applied to the A20 hitrap column. After collecting the
Durchlaufs wurde die Säule mit PBS gewaschen und die AAV-2-Kapside wurden mit 2, 5 M MgCI2 in PBS ergänzt mit 50 mM Tris, pH 7 eluiert. Die A20-Hitrap- Säule wurde mit PBS regeneriert und unter PBS/0,01 % Natriumazid aufbewahrt.The column was washed continuously with PBS and the AAV-2 capsids were eluted with 2.5 M MgCl 2 in PBS supplemented with 50 mM Tris, pH 7. The A20 hitrap column was regenerated with PBS and stored under PBS / 0.01% sodium azide.
Die AAV-2 Viren wurden durch Dot Blot-Hybridisierung und Immunfluoreszenz titriert. Dafür wurden HeLa-Zellen in 96-er Mikrotiterplatten in einer Konzentration von ca. 1 x1 04-Zellen/Vertiefung eingefüllt, mit AAV-2 aus verschiedenen Fraktionen des obigen Affinitätsexperiments (aufgetragenes Material, Durchfluß, Waschlösung, Elutionsfraktion) in seriellen Verdünnungen infiziert und mit Adenovirus Typ 5 (MOI = 5) überinfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen für die Immunfluoreszenz fixiert oder für die Dot Blot-Hybridisierung gefroren/aufgetaut (3x) . Die Infektion mit AAV-2 wurde durch Immunfluoreszenz mit dem monoklonalen Antikörper 76/3 (Fa. Progen, Heidelberg) zum Nachweis der AAV- 2 rep Gen-Expression verfolgt. Replizierende AAV-2 wurden mit einem markier- ten DNA-Fragment des AAV-2 Rep-Gens detektiert (Dots in Fig. 2; hellgraueThe AAV-2 viruses were titrated by dot blot hybridization and immunofluorescence. For this, HeLa cells were filled into 96-well microtiter plates in a concentration of approx. 1 × 10 4 cells / well, infected with AAV-2 from various fractions of the above affinity experiment (applied material, flow-through, washing solution, elution fraction) in serial dilutions and overinfected with adenovirus type 5 (MOI = 5). After three days the cells were fixed for immunofluorescence or frozen / thawed (3x) for dot blot hybridization. The infection with AAV-2 was followed by immunofluorescence with the monoclonal antibody 76/3 (Progen, Heidelberg) to detect the AAV-2 rep gene expression. Replicating AAV-2 were detected with a labeled DNA fragment of the AAV-2 Rep gene (dots in FIG. 2; light gray
Säulen in Fig. 3) . Rekombinantes AAV-2 wurde auch gemäß dem vorstehenden Verfahren für Wildtyp-AAV-2 gereinigt. Für die Titration von rAAV-2 wurde die Expression des LacZ-Gens durch in-situ X-Gal Färbung der infizierten HeLa-Zellen nach seriellen Verdünnungen gemessen (dunkelgraue Säulen in Fig. 3) . Columns in Fig. 3). Recombinant AAV-2 was also purified according to the above procedure for wild-type AAV-2. For the titration of rAAV-2, the expression of the LacZ gene was measured by in-situ X-Gal staining of the infected HeLa cells after serial dilutions (dark gray columns in FIG. 3).

Claims

Patentansprücheclaims
1 ) Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon, dadurch gekennzeichnet, daß man AAV-2 oder antigene1) Process for the purification and concentration of AAV-2 and antigenic parts thereof, characterized in that AAV-2 or antigens
Teile davon an ein aktiviertes Chromatografiematerial bindet, das daran gekoppelte gegen AAV-2 gerichtete Antikörper umfaßt, und man anschließend mit einer Lösung enthaltend 0,5 bis 4, 5 M MgCl2 eluiert.Parts of it bind to an activated chromatography material which comprises coupled antibodies directed against AAV-2, and then eluted with a solution containing 0.5 to 4.5 M MgCl 2 .
2) Verfahren nach Anspruch 1 , wobei AAV-2 entweder Wildtyp-AAV-2 oder rekombinant hergestelltes AAV-2 ist.2) The method of claim 1, wherein AAV-2 is either wild-type AAV-2 or recombinantly produced AAV-2.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Chromatografiematerial ausgewählt ist aus Agarosegelen, Dextrangelen, Cellulose-Gelmatrices und Acrylamid-Gelmatrices.3) Method according to claim 1 or 2, wherein the chromatography material is selected from agarose gels, dextran gels, cellulose gel matrices and acrylamide gel matrices.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Chromatografiematerial einen zur Bindung von Proteinen, insbesondere von Antikörpern geeigneten Liganden trägt.4) Method according to one of claims 1 to 3, wherein the chromatography material carries a ligand suitable for binding proteins, in particular antibodies.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Chromatografiematerial CNBr-aktivierte SepharoseR oder NHS-aktivierte SepharoseR ist.5) Method according to one of claims 1 to 4, wherein the chromatography material is CNBr-activated Sepharose R or NHS-activated Sepharose R.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Elutionslösung 2 bis 3 M MgCl2 enthält.6) Method according to one of claims 1 to 5, wherein the elution solution contains 2 to 3 M MgCl 2 .
7) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei der AAV- 2 bzw. rAAV-2 enthaltenden Probe um einen Zellkultur-Uberstand oder Zellextrakte handelt.7) Method according to one of claims 1 to 6, wherein the sample containing AAV-2 or rAAV-2 is a cell culture supernatant or cell extracts.
8) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der gegen AAV-2 gerichtete Antikörper A20 (DSM ACC21 94) ist. 9) Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfassend einen gegen AAV-2 gerichteten Antikörper, und übliche Hilfsmittel, wie Puffer, Chromatografiematerial und Kontrollen. 8) Method according to one of claims 1 to 7, wherein the anti-AAV-2 antibody is A20 (DSM ACC21 94). 9) Kit for performing the method according to any one of claims 1 to 8 comprising an anti-AAV-2 antibody, and conventional aids such as buffers, chromatography material and controls.
PCT/DE1998/002569 1997-09-02 1998-09-01 Method for purifying and concentrating aav-2 and antigen portions thereof WO1999011763A2 (en)

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