WO1999001213A1 - Microbilles preparees a partir d'hydrogel de polysaccharide reticule pouvant contenir des molecules d'interet biologique ou des cellules - Google Patents

Microbilles preparees a partir d'hydrogel de polysaccharide reticule pouvant contenir des molecules d'interet biologique ou des cellules Download PDF

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    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns

Definitions

  • the different nfilff ⁇ technologies all follow the same scheme comprising two stages. The first consists in dispersing the product or the preparation to be encapsulated into fine droplets. The second sees the realization of the encapsulation proper by the solidification of droplets either on the surface or in the mass.
  • the dispersion is a »ft ⁇ key to the success of a good encapsulation because it conditions at the same time the effectiveness of encapsula ⁇ on, the size of the balls, the homogeneity of size and the shape.
  • Extrusion consists in dispersing the solution to be encapsulated by dropping it drop by drop in a medium where the gelification of the drops or the formation of a surface membrane is carried out (Levy and Poncelet, 1994, Biofutur, Mars, 16-21) .
  • the drip is obtained using a needle.
  • this technique can be modulated by the application of a coaxial air current of a potential difference or a vibration. If it is thus possible to better control the size range, it It seems impossible to envisage industrial production for capsules smaller than 500 microns at a time for reasons of yields and size dispersion.
  • This step leads to the - synthesis of the microcapsule containing the structure to be encapsulated, by the establishment of a membrane of varied nature more or less resistant or by complete solidification forming a solid ball by polymerization or gelation.
  • the capsule must be biocompatible, must not modify physiological balances, must not induce side effects, must be biodegradable after having fulfilled its role and above all be stable in its conditions of use. In addition, it must have a high encapsulation capacity and allow effective modulation of the properties of permeability to nutrients, to the compounds produced or encapsulated, as well as to the various compounds or elements of the medium of use or implantation of the capsules. Finally, the encapsulation technique must be easily industrializable.
  • the capsule can therefore have the following criteria:
  • the compound must be compatible with the stability of the compounds to be encapsulated
  • interfacial polymerization To overcome the low chemical stability of the capsules obtained by ionic coating, other techniques have been developed, called interfacial polymerization. All these techniques are based on the same principle.
  • An aqueous suspension of proteins or polymers containing the product to be encapsulated is dispersed in an organic phase with which the crosslinking agent is added, generally a polychloride of acid which reacts with the amino groups at the interface, to give a membrane.
  • nylon type FR 2 642329A1
  • Macroencapsulation on hollow fiber provides very good results in terms of cell survival and in vivo stability (Aebischer et al, 1991, Exp. Neurol., 111, 269).
  • these techniques have certain disadvantages such as:
  • hydrogels from polymers used in hollow fibers such as acrylonitrile and sodium methaUysulfonate (FR 2696755A1), or ethylene gh / col muttiacrylate photopolymers (WO 9631199), or potyacrylamides.
  • polymers used in hollow fibers such as acrylonitrile and sodium methaUysulfonate (FR 2696755A1), or ethylene gh / col muttiacrylate photopolymers (WO 9631199), or potyacrylamides.
  • the capsule is biocompatible and does not cause an organism response in the event that it is implanted
  • the size is controllable - the porosity can be modulated
  • microcapsules according to the invention are characterized in that they consist of a hydrogel prepared by covalent crosslinking of biocompatible polymers preferably chosen from polysaccharides.
  • the present invention relates to a new type of microcapsule useful in particular for the transport of compounds for biological use.
  • microcapsules have a very important stability, a defined size which can be modulated according to the applications. They are capable of encapsulating various synthetic, semi-synthetic, recombinant or natural molecules, bacterial cells, yeasts, mammalian cells, oily compounds, flavors and powders. These microcapsules can be used to allow or increase solubility and aqueous dispersibility, to provide protection against responses of the immune system during implants, to facilitate the handling and recovery of ferments during vinification and fermentation processes in general.
  • microcapsules can also be used to obtain a modulation of the modes of release of the molecules over time, to improve the physicochemical stability over time of sensitive molecules, to protect the encapsulated compounds against mechanical and thermal aggressions, to ensure transport molecules within complex eukaryotic or prokaryotic biological systems intended to ensure chemical, photochemical, enzymatic immunological reactions for pharmaceutical, cosmetological, diagnostic, study and research, fermentation applications.
  • the present invention relates to a new type of biocompatible polymer matrix intended for the encapsulation of various compounds and characterized in that the crosslinking phase of the polymer can be modulated to allow the internal incorporation of water-soluble or hydrophobic molecules. This homogeneous encapsulation is introduced after the first step of crosslinking the polymer and before complete gelation.
  • the compound to be encapsulated is added while maintaining agitation
  • the reaction medium is then dispersed in a hydr ⁇ phobic organic phase until complete polymerization of the capsules
  • Microcapsules are thus obtained after washing, allowing re-encapsulation of numerous compounds.
  • the reaction medium containing the encapsulation product is not dispersed in the hydrophobic organic phase. It is left to stand until solidified in the form of a gel.
  • the microcapsules containing the product to be encapsulated are then obtained by mechanical grinding.
  • the microcapsules obtained are not spherical but this technique makes it possible to obtain very small sizes of microcapsules without the use of surfactants.
  • this technique allows the incorporation of these cells while maintaining excellent viability and functionality, both for bacterial cells, yeasts and mammalian cells, for example glands adrenal or PC12 dopaminergic lines.
  • the present invention relates to a microcapsule characterized in that it comprises in order:
  • hydrogel matrix based on carbohydrates or crosslinked polyols, hydrophilic, non-liquid and biocompatible - inclusions of the compounds to be encapsulated which are dispersed throughout the matrix
  • the matrix can be prepared by various methods well known to those skilled in the art.
  • it is a polysaccharide, preferably biodegradable, linear or branched, for example starch and derivatives, ceUulose, dextran, polysaccharides derived naturally by ionic functions, for example chitosan, hyaluronic acids, alginates, carrageenans, hydrogel or porysaccharide matrix, is obtained by crosslinking, by methods well known to those skilled in the art.
  • Crosslinking methods can be carried out by the use of bifunctional agents capable react with the hydroxyl groups of polysaccharides such as epichlorohydrin, epibromohydrin or difunctionals such as bis-epoxides, ctialdehydes, dicarides of dicarboxylic acids, diisothiocyanates, mixed anhydrides of dicarboxylic acids.
  • the microcapsules are formed during the last step of the process.
  • a first variant of this step consists in mechanically grinding large blocks of matrices obtained by mass polymerization.
  • the second consists in resuscitating the matrix in the form of capsules by the technique of polymerization in dispersion in a liquid immiscible with the reaction phase.
  • the use of surfactants such as Tween or Span is dependent on the size sought.
  • the dispersion in the hydrophobic phase is carried out by stirring in a reactor using a blade or by stirring on a stirring table with circular movement.
  • the physico-chemical and mechanical stability as well as the porosity of the microcapsule thus prepared are a function of the crosslinking operating conditions such as the initial dilution of the polymer and / or the amount of crosslinking agent.
  • These microcapsules can be used for the administration of molecules by oral, per lingual, nasal, vaginal, rectal, cutaneous, ocular but also pulmonary and parenteral routes. They can also be used for topical applications of keratinous tissues such as dander.
  • Hydrophobic compounds such as mineral oils, for example paraffin or silicone, organic oils, for example, olive, calendula, sweet almond, salmon, cod liver, evening primrose, essential oils, flavorings , dyes, mineral powders such as talc, titanium dioxide, zinc oxide, silicates, foundations for insoluble dyes and pigments, oily dispersions of plant extracts, vitamins alone or in oily dispersion , cells for example hepatocytes, streams of Langerhans, pancreatic cells, adrenal meduocells, PC12 dopaminergic cell cells, genetically modified cells, yeasts for example boulardi saccharomyces, saccharomyces cerevisiae, bacteria by example leuconostoc oenos and molecules with therapeutic activity.
  • mineral oils for example paraffin or silicone
  • organic oils for example, olive, calendula, sweet almond, salmon, cod liver, evening primrose, essential oils, flavorings , dyes, mineral powders such as talc, titanium dioxide, zinc oxide, silicates
  • - peptides and their derivatives glucagon, somatostatin, calcitonin, interferon and interleukins, LHRH, rerythropoietin, bradykinin antagonists, polypeptides as well as recombinants from biotechnology
  • oligonucleotide analogs and reverse transcriptase inhibitors in particular oligonucleotide analogs and reverse transcriptase inhibitors
  • vasodilators diuretics and antidiuretics - prostaglandins
  • Example 1 Preparation of microcapsules of silicone hula 400 microns
  • Example 2 Preparation of 40 micron vitamin A propionate microcapsules
  • Example 3 Preparation of microcapsules of vitamin E / vitamin C / sweet almond oil mixture
  • Example 4 Preparation of microcapsules for mixing titanium dioxide powders and magnesium siUcate
  • Example 5 Preparation of microcapsules for mixing titanium dioxide and zinc oxide powders
  • Example 6 Preparation of microcapsules of rose essential oil of 2000 microns
  • the agitation is kept dispersed by slow agitation using an anchor-type blade at a speed between 30 and 50 revolutions / min. After 3 hours of stirring, the capsules are recovered by decantation and then taken up in 16 liters of water and neutralized with 2N HCl. The microcapsules are then washed 3 times by decantation with 8 liters of water. We obtain essential oil capsules of 2000 microns
  • Example 7 Preparation of microcapsules of essential oil of rose of 40 microns
  • the agitation is kept dispersed by slow agitation using an anchor-type blade at a speed between 30 and 50 revolutions min. After 3 hours of stirring, the capsules are recovered by decantation and then taken up in 16 others of water and neutralized with 2N HCl. The microcapsules are then washed 3 times by decantation with 8 liters of water. 40 micron essential oil capsules are obtained.
  • Example 9 Preparation of encapsulated Boulardii saccharomyces yeasts
  • Example 10 Preparation of encapsulated Leuconostoc Oenos bacteria
  • Example 11 Preparation of large-pore capsules containing leuconostoc oenos

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Abstract

Nouveau type de capsule obtenue par la réticulation covalente de polymère naturel biocompatible, par exemple l'amidon. Le procédé d'encapsulation mis en oeuvre assure une très grande stabilité physico-chimique de la capsule et permet l'encapsulation de composé fragile hydrosoluble ou liposoluble, ainsi que de cellules. Cette nouvelle technologie peut être utilisée pour l'encapsulation stable de cellules d'intérêt thérapeutique, desinées à être implantées.

Description

MICROBILLES PREPAREES A PARTIR D'HYDROGEL DE POLYSACCHARIDE REΗCULE POUVANT CONTENIR DES MOLECULES D'INTERET BIOLOGIQUE OU DES CELLULES
L'utilisation de cellules, d'orgamtes cellulaires ou même de nombreux composés fragiles comme les huiles essentielles, les arômes, les vitamines, ne peut être envisagée que par l'utilisation de techniques dites de Bioencapsulauon. On peut ainsi protéger, isoler ou modifier le coπiportcuicul des éléments encapsulés vis à vis du milieu dans lequel ils sont utilisés ou formulés.
La Biccπcapsulation eimet :
- de protéger les cellules, orgasάtes ou molécules contre des stress thermiques ou mécaniques, contre le cisaillement et les variations de pression. - de protéger contre les stress chimiques comme l'oxydation ou l'action des acides et des bases.
- de protéger contre l'action du système immunitaire dans le cas de microcapsules implantées.
- de moduler les μaxameties de libération des composés encapsulés. . de moduler les stress hydriques.
- d'améliorer la conservation et le stockage.
Stratégies d'encapsniation
Les différentes technologies nfilff^, suivent toutes le même schéma comprenant deux étapes. La première consiste à disperser le produit ou la préparation à encapsuler en fines gouttelettes. La seconde voit la réalisation de l'encapsulation proprement dite par la solidification de gouttelettes soit en surface, soit dans la masse.
La dispersion est une »ftητ clé de la réussite d'une bonne encapsulation car elle conditionne à la fois l'efficacité de encapsulaϋon, la taille des billes, l'homogénéité de taille et la forme.
Les deux voies bien connues de l'homme de l'art restent l'extrusion et l'é ulsification comme décrit par Levy e Poncelet, 1994, Biofutur, Mars 16-21.
* L'extrusion :
L'extrusion consiste à disperser la solution à encapsuler en la laissant tomber goutte à goutte dans un milieu où est réalisée la gelificaation des goutte ou la formation d'une membrane superficielle (Levy et Poncelet, 1994, Biofutur, Mars, 16-21). Le goutte à goutte est obtenu à l'aide d'une aiguille. Cependant, en fonction de la taille des capsules souhaitée, cette technique peut être modulée par l'application d'un courant d'air coaxiaL d'une différence de potentiel ou d'une vibration. S'il est ainsi possible de mieux contrôler le domaine de taille, il apparaît impossible d'envisager une production industrielle pour des capsules inférieures à 500 microns à la fois pour des raisons de rendements et de dispersion de taille.
Une évolution intéressante est la technique de coextrusion de la solution à encapsuler et de la solution de polymères formant la membrane de la microcapsule. Cette technique permet d'obtenir des taux d' encapsulation intéressants mais elle est difficile à maîtriser et nécessite un matériel spécifique.
• La dispersion par émulsification
C'est la technique la plus simple de dispersion de la solution à encapsuler. Elle consiste à disperser cette solution aqueuse dans une phase hydrophobe par agitation, généralement en présence de tensioactif. Cette technique simple est industrialisable à très grande échelle. Elle est surtout retenue pour la production de capsules de tailles comprises entre 10 et 500 microns. En dehors de ce domaine, les distributions de tailles ne sont plus homogènes.
Quel que soit le mode de dispersion employé, il est suivi de l'étape de solidification. Cette étape conduit à la - synthèse de la microcapsule contenant la structure à encapsuler, par la mise en place d'une membrane de nature variée plus ou moins résistante ou par la solidification complète formant une bille pleine par polymérisation ou gélification.
La notion d'encapsulation doit être ici comprise au sens large c'est à dire qu'elle correspond à l'inclusion dans une structure généralement polymérique permettant :
- la protection - la facilité de séparation
- le conditionnement comme microréacteur
- la modulation du mode de libération de molécules
Les différentes techniques de Bioencapsulation ont permis d'obtenir des résultats intéressants dans des domaines très variés. On peut distinguer les premières applications dans le domaine du papier sans carbone mais aussi la stabilisation de mycorhizes et de fragment racinaire encapsulés en billes d'alginate (Strulhi et al, 1991, World J. Microbiol. Biotechnol. 7, 292-297).
Des résultats excellents ont été obtenus dans les protocoles de cryoconservation d'apex végétaux par enrobage toujours avec des billes d'alginates (Scottez C. et al 1993, Cryobiology, 29, 691). Enfin la production d'éthanol et la maturation de la bière ou du vin (FR 2736924A1) ont bénéficié de ces techniques d'immobilisation de micro-organismes dans des capsules thermoplastiques des billes d'alginates ou en dérivé granulaire de la cellulose (DEAE -cellulose) utilisé par les brasseries finlandaises KERAVA. On obtient dans ces derniers cas une récupération par décantation sans les techniques lourdes d'ultrafiltration et on prévient le problème de la floculation. Parallèlement des sociétés utilisent ces technologies pour la production d'anticorps monoclonaux à partir de billes d'alginates (Damon biotech) et pour l'immunoprotection de xenogreffes par encapsulation en fibres creuses par Cytotherapeutics (Emerich et al, 1996, Cell Transplantation, 5, 589-596).
Nous pouvons donc définir les principaux critères de l'encapsulation idéale. La capsule doit être biocompatible, ne doit pas modifier les équilibres physiologiques, ne doit pas induire d'effets secondaires, doit être biodégradable après avoir rempli son rôle et surtout être stable dans ses conditions d'utilisation. De plus, elle doit présenter une capacité d'encapsulation élevée et permettre une modulation efficace des propriétés de perméabilité aux nutriments, aux composés produits ou encapsulés, ainsi qu'aux différents composés ou éléments du milieu d'utilisation ou d'implantation des capsules. Enfin la technique d'encapsulation doit être facilement industrialisable.
La capsule peut donc présenter les critères suivants :
- une structure particulière obtenue par établissement de liaisons covalentes, amène une bonne stabilité chimique, thermique et mécanique. Elle doit être obtenue sans faire appel aux techniques classiques difficiles de polymérisation interfaciale (Levy et al, 1982, J.Phaπn.Sci., 71,759-762), de gélification thermique (Poncelet et ai 1993, Fnndamentals of animal cell encapsulation and immobilisation, CRC Press Boca Raton,297-314) ou ionique (Kierstan et al, 1977, Biotechnol. Bioeng., 19,387), de peUiculage covalent (Dupuy et al, 1988, J. Biomed. Mater. Res., 22, 1061-1070) ou ionique (Lim et al., 1980, Science, 210, 908), de précipitation interfaciale (Stevenson et al., 1988, Biomater Artif. Cells Artif. Organs, 16(4),747-769), de coacervation ou de gélification superficielle par changement de solvant (Balladur et al, Ann. de Gastro-entérologie et d'Hépatologie, 30 (6), 265-269).
- le composé doit être compatible avec la stabilité des composés à encapsuler
- une capacité de changement importante aussi bien pour des composés biologiques, cellules ou organites, que pour des molécules hydrophobes
- une stabilité d'incorporation importante et modulable - une bonne dispersabilité dans les milieux aqueux
- un contrôle aisé de la taille
Ce cahier des charges n'est approché que par quelques techniques d'encapsulation. Parmi ces techniques, la plus utilisée reste la gélification de l'alginate. Elle a permis d'apporter des réponses à certains problèmes comme la conservation des complexes semences/micro-organismes (Strullu et al, 1994, Biofutur, Mars, 35-36), la conservation d'activité plurimensuelle lors de la fermentation, la production d'éthanol et la vinification. De plus, la taille des pores n'est pas stable et on ne contrôle pas les échanges. L'homme de l'art sait que des capsules gélifiées en masse, obtenues par extrusion de l'alginate puis précipitation en bain de CaCl2, tel que décrit par Kierstan et Bucke, 1977, Biotechnol. Bioeng.. 19, 387, sont extrêmement fragiles et sensibles à la présence d'agent complexant le cation Ca++, comme le phosphate, le citrate ou les tartrates présents dans les vins. Elles libèrent alors leur contenu. Une alternative à la gélification alginate/Ca-H- est apportée avec les gels thermosensibles comme les carraghénanes ou l'agarose. Ainsi le -carraghénane gélifie lorsque la température est ramenée sous 45°C et reste stable quelles que soient les espèces ioniques présentes. Cependant il ne permet l'encapsulation que de composés supportant des températures supérieures à 45°C, ce qui exclut les cellules et molécules thermosensibles.
Une des évolutions de la gélification de l'alginate est la technique de peUiculage par liaisons ioniques (Lim F. et Sun A.M., 1980, Sciences, 210, 908). Elle consiste à déposer un polymère de charge opposée à l'alginate à la surface de la bille d'alginate préformée, par simple dispersion dans un bain. Le polymère le plus utilisé est la potyrysine. On obtient ainsi une membrane de perméabilité définie par les conditions opératoires. Par cette nouvelle technique, il a été possible de préparer des capsules contenant des cellules tout en contrôlant la perméabilité de la membrane. Il devient alors possible de confiner des métabolites produits par les cellules dans la capsule réalisée, afin de faciliter leur manipulation, leur récupération. C'est la technologie retenue par Damon Biotech (GB A2094750, WO A8904637) comme décrit par Posillico, 1984, Biotechnology, 4, 114-117. D'autres équipes ont réalisé en suivant la technique de peUiculage ionique, rencapsulation de cellules afin d'obtenir une immunoisolation par la membrane et ainsi permettre la transplantation de xenogreffes, entre autres, d'isolats de Langerhans (Zekorm et al, 1992, Acta Diabetol., 29, 41-45) et d'hépatocytes. Ces travaux ont montré la validité du concept d'immunoprotection par Bioencapsulation. Cependant la stabilité de ces capsules est encore trop faible. In vivo, on assiste rapidement à l'infiltration de monocytes, de macrophages puis à la dégradation de la capsule, entraînant la perte de l'implant en quelques semaines (Clayton et al, Diabètes Research, 1990, 14, 127-132). De plus, même dans les sites à faible réaction comme le système nerveux central ou le péritoine, on observe rapidement une fibrose péricapsulaire.
Pour pallier à la faible stabilité chimique des capsules obtenues par peUiculage ionique, d'autres techniques ont été développées dites de polymérisation interfaciale. Toutes ces techniques reposent sur le même principe. Une suspension aqueuse de protéines ou de polymères contenant le produit à encapsuler, est dispersée dans une phase organique à laqueUe est ajouté l'agent réticulant, généralement un polychlorure d'acide qui réagit avec les groupements aminés à l'interface, pour donner une membrane de type nylon (FR 2 642329A1). Ces techniques basées sur l'emploi de collagène, ont permis rencapsulation de complexes enzymatiques ainsi que de composés hydrophobes. Cependant l'homme de l'art sait qu'elle reste trop agressive pour l'encapsulation de ceUules. D'autre part, la nature protéique de la membrane limite considérablement les possibilités d'application thérapeutique ou d'administration, en raison des risques de réponse immunitaire.
La macroencapsulation sur fibre creuse apporte de très bons résultats en terme de survie ceUulaire et de stabilité in vivo (Aebischer et al, 1991, Exp. Neurol., 111, 269). Néanmoins ces techmques présentent certains inconvénients comme :
- une taiUe importante nécessitant un acte chirurgical dans le cas d'implants d'aUogreffes et de xénogreffes. - une épaisseur de membrane importante qui entraîne des problèmes de diffusion et ne permet pas une réponse rapide à un stimuli physiologique. La sécrétion d'insuline par des îlots de Langerhans encapsulés est ainsi décalée.
- une faible densité de cellules encapsulées impliquant une longueur de fibre élevée.
Pour pallier à ces difficultés, certaines équipes proposent des techniques de microencapsuiation utilisant des hydrogels à partir de polymères utilisés dans les fibres creuses comme acrylonitrile et le méthaUysulfonate de sodium (FR 2696755A1), ou les photopolymères éthylène gh/col muttiacrylate (WO 9631199), ou des potyacrylamides.
Ces dernières techmques sont encore délicates à maîtriser. De plus, elles font appel à des solvants ou à des photoinitiateurs producteurs de radicaux libres, qui entraînent tous des problèmes de toxicité.
La présente invention concerne un nouveau type de microcapsule destinée à rincorporation interne de composés fragUes et caractérisée en ce que :
- la stabilité physico-chimique peut être modulée
- la capsule est biocompatible et n'entraîne pas de réponse de l'organisme dans le cas où eUe est implantée
- la taiUe est contrôlable - la porosité peut être modulée
Les microcapsules selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un hydrogel préparé par réticulation covalente de polymères biocompatibles choisis de préférence parmi les polysaccharides.
Plus particulièrement la présente invention concerne un nouveau type de microcapsule utile notamment pour le transport de composés à usage biologique.
Ces microcapsules présentent une stabilité très importante, une taille définie qui peut être modulée en fonction des applications. EUes sont aptes à encapsulation de molécules diverses synthétiques, hémisynthétiques, recombinantes ou naturelles, de cellules bactériennes, de levures, de cellules de mammifères, de composés huileux, d'arômes et de poudres. Ces microcapsules peuvent être utilisées pour permettre ou accroître la solubilité et la dispersabilité aqueuse, pour assurer la protection contre les réponses du système immunitaire lors d'implants, pour faciliter la manipulation et la récupération de ferments lors de la vinification et des procédés de fermentation en général. Ces microcapsules peuvent être aussi utilisées pour obtenir une modulation des modes de libération des molécules dans le temps, pour améliorer la stabilité physico-chimique dans le temps de molécules sensibles, pour protéger les composés encapsulés contre les agressions mécaniques et thermiques, pour assurer le transport des molécules au sein de systèmes biologiques complexes eucaryotes ou procaryotes destinés à assurer des réactions chimiques, photochimiques, enzymatiques immunologiques pour des applications pharmaceutiques, cosmétologiques, de diagnostic, d'études et de recherche, de fermentation. La présente invention concerne un nouveau type de matrice polymérique biocompatible destinée à l'encapsulation de composés variés et caractérisée en ce que la phase de réticulation du polymère peut être modulée pour permettre l'incorporation interne de molécules hydrosolubles ou hydrophobes. Cette encapsulation qui a Ueu de manière homogène est introduite après la première étape de réticulation du polymère et avant la gélification complète.
Si ces réactions de réticulation, par exemple par répichlorhydrine, sont biens connues de l'homme de l'art, le procédé selon l'invention apporte une modification intéressante dans un mode de mise en oeuvre préféré en effectuant :
- la dispersion du polymère dans une phase aqueuse alcaline -l'addition de l'agent réticulant, par exemple répichlorhydrine à la dispersion alcaline de polymères sous agitation
- après un temps de réaction autorisant la dispersion complète de l'agent réticulant et avant le début de gélification, on ajoute le composé à encapsuler en maintenant l'agitation
- le milieu de réaction est alors dispersé dans une phase organique hydrσphobe jusqu'à polymérisation complète des capsules
On obtient ainsi après lavage, des microcapsules permettant rencapsulation de nombreux composés. Dans un autre mode de mise en oeuvre, le mitieu réactionnel contenant le produit d'encapsulation n'est pas dispersé en phase organique hydrophobe. Il est laissé au repos jusqu'à prise en masse sous forme de gel. Les microcapsules contenant le produit à encapsuler sont alors obtenues par broyage mécanique. Les microcapsules obtenues ne sont pas spheriques mais cette technique permet d'obtenir de très petites tailles de microcapsules sans emploi de tensioactifs.
Selon la présente invention, on a découvert de manière totalement inattendue que cette technique permet l'incorporation de ceUules en maintenant une excellente viabilité et une fonctionnalité, à la fois pour des cellules bactériennes, des levures et des cellules de mammifères, par exemple de glandes surrénales ou de lignées dopaminergiques PC12.
Plus particuhèrement, la présente invention concerne une microcapsule caractérisée en ce qu'elle comporte dans l'ordre :
- une matrice d'hydrogei à base de carbohydrates ou de polyols réticulés, hydrophile, non liquide et biocompatible - des inclusions des composés à encapsuler qui sont dispersés dans la totalité de la matrice
La matrice peut être préparée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art. En particulier lorsqu'il s'agit d'un polysaccharide, de préférence biodégradable, linéaire ou ramifié, par exemple d'amidon et dérivés, de ceUulose, de dextrane, de polysaccharides dérivés natureUement par des fonctions ioniques, par exemple le chitosan, les acides hyaluroniques, les alginates, les carraghenanes, l'hydrogel ou matrice porysaccharidique, est obtenu par réticulation, par des procédés bien connus de l'homme de l'art Les procédés de réticulation peuvent être effectués par l'utilisation d'agents bifonctionnels capables de réagir avec les groupements hydroxyles des polysaccharides comme épichlorhydrine, l'épibromohydrine ou difonctionnels comme les bis-époxydes, les ctialdéhydes, les dichiorures d'acides dicarboxyUques, les diisothiocyanates, les anhydrides mixtes d'acides dicarboxyliques. La formation des microcapsules est réalisé au cours de la dernière étape du procédé. Une première variante de cette étape consiste à broyer mécaniquement de gros blocs de matrices obtenus par polymérisation en masse. La seconde consiste à réauser la matrice sous forme de capsules par la technique de polymérisation en dispersion dans un liquide non miscible avec la phase réactionnelle. Dans la technique de dispersion, l'utilisation de tensioactifs comme le Tween ou le Span est conditionnée par la taille recherchée. La dispersion dans la phase hydrophobe est réalisée par agitation en réacteur à l'aide d'une pale ou par agitation sur table d'agitation à mouvement circulaire. La stabilité physico-chimique et mécanique ainsi que la porosité de la microcapsule ainsi préparée sont fonction des conditions opératoires de réticulation comme la dilution initiale du polymère et/ou la quantité d'agent réticulant Ces microcapsules peuvent être utilisées pour l'administration de molécules par les voies orale, per linguale, nasale, vaginale, rectale, cutanée, oculaire mais aussi pulmonaire et parentérale. EUes peuvent être aussi utilisées pour les applications topiques des tissus kératineux comme les phanères. EUes peuvent être utilisées comme agent de protection lors du stockage à long terme, sous forme sèche ou humide, de molécules d'organites de cellules ou d'amas de cellules ou de fragments de tissus ou de semences ou d'embryons d'apex. Ces nouveaux véhicules de principes actifs sont capables d'encapsuler un grand nombre de composés. Des composés hydrophobes comme les huiles minérales par exemple de paraffine ou de sUicone, des huiles organiques par exemple d'olive, de calendula, d'amande douce, de saumon, de foie de morue, d'onagre, des huiles essentielles, des arômes, des colorants, des poudres minérales comme le talc, le dioxide de titane, l'oxyde de zinc, des silicates, des fonds de teint des colorants et pigments insolubles, des dispersions huileuses d'extraits végétaux, des vitamines seules ou en dispersion huileuse, des cellules par exemples des hépatocytes, des flots de Langerhans, des ceUules de pancréas, des ceUules de méduUo-surrénales, des ceUules de ugnέes dopaminergiques PC12, des cellules génétiquement modifiées, des levures par exemple saccharomyces boulardi, saccharomyces cerevisiae, des bactéries par exemple leuconostoc oenos et des molécules à activité thérapeutique. Par exemple : - les peptides et leurs dérivés, le glucagon, la somatostatine, la calcitonine, l'interféron et les interleukines, la LHRH, rerythropoietine, les antagonistes de la bradykinine, les polypeptides ainsi que les recombinants issus des biotechnologies
- les anticorps
- les protéogfycanes - Les anticancéreux
- les antibiotiques
- les antiviraux, en particulier les analogues d'oligonucléotides et les inhibiteurs de la transcriptase inverse
- les antiprotéases
- les insecticides et antifongiques - les oligonucléotides
- les anesthésiques et aπesthésiques locaux comme la benzocame
- les vasoconstricteurs
- les cardiotoniques comme la digitoxine et la digitaline et ses dérivés
- les vasodilatateurs - les diurétiques et antidiurétiques - les prostaglandines
- les neuroleptiques
- les antidépresseurs
- les hormones et dérivés - les anti-inflammatoires stéroïdiens et non stéroïdiens
- les antihistaminiques
- les agents anti-aUergiques
- les antiseptiques
- les agents de diagnostic - les acides aminés et sels minéraux - les enzymes
- les molécules à activité d'absorption des rayonnement U.V.
La plupart des molécules à activité biologique peut être incorporée directement en mélange ou en dispersion huileuse. Les domaines d'utiUsation de ces capsules innovantes sont très étendus aussi bien pour les applications pharmaceutiques, cosmétiques et d'hygiène, que biotechnologiques et agro-alimentaires. On comprendra mieux la présente invention et ses nombreux avantages en se référant aux exemples particuUers suivants, donnés à titre d'exemple et qui ne sauraient en aucune façon limiter la dite invention. Toutes les parties indiquées dans les exemples sont des parties en volume et tous les pourcentages sont des pourcentages en poids.
Exemples
Exemple 1 selon l'invention : Préparation de microcapsules d'hiule de Silicone de 400 microns
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 20 grammes d'huile de Silicone Hûls. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 8 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 200 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours min pendant 3 heures. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HC1 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules d'huile de silicone de 400 microns
Exemple 2 selon l'invention : Préparation de microcapsules de propionate de vitamine A de 40 microns
Dans un bêcher de 500 mL on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours min, on ajoute 20 grammes de propionate de vitamine A. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 8 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin U est mélangé à 200 mg de Tween 80 et dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 200 ml d'huile de rjaraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HC1 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules d'ester de vitamine A de 40 microns
Exemple 3 selon l'invention : Préparation de microcapsules de mélange vitamine E/vitamine C/huile d'amande douce
Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de vitamine C finement dispersée dans 18 ml de mélange huile d'amande douce contenant 10% de vitamine E en poids.
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 1,1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute le mélange huileux de vitamines. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 8 minutes puis laissé au repos pendant 3 heures. Le gel obtenu contenant des inclusions du mélange de vitamines, est broyé grossièrement, repris dans 200 ml d'eau et neutralisé par HC1 2N. Le broyât est ensuite homogénéisé à l'aide d'une turbine à 1000 tours/min jusqu'à obtenir des microcapsules de 20 microns. Les microcapsules de vitamines sont ensuite lavées à l'eau par centrifugation.
Exemple 4 selon l'invention : Préparation de microcapsules de mélange de poudres de dioxide de titane et de siUcate de magnésium
Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de dioxyde de titane et 1 gramme de siUcate de magnésium finement dispersée dans 20 ml d'eau
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 1,1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute le mélange de dioxyde de titane et de siUcate de magnésium. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 8 minutes puis laissé au repos pendant 3 heures. Le gel obtenu contenant des inclusions du mélange d'oxyde de titane et de siUcate de magnésium, est broyé grossièrement, repris dans 200 ml d'eau et neutralisé par HC1 2N. Le broyât est ensuite homogénéisé à l'aide d'une turbine à 1000 tours/min jusqu'à obtenir des microcapsules de 20 microns. Les microcapsules de sont ensuite lavées à l'eau par centrifugation.
Exemple 5 selon l'invention : Préparation de microcapsules de mélange de poudres de dioxide de titane et d'oxyde de zinc
Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de dioxyde de titane et 1 gramme d'oxyde de zinc finement dispersée dans 20 ml d'eau
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 1,1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours min, on ajoute le mélange de dioxyde de titane et d'oxyde de zinc. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 8 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours min dans 200 ml d'huUe de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours min pendant 3 heures. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutraUsées par HC1 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 400 microns contenant le mélange de poudre. Exemple 6 selon l'invention : Préparation de microcapsules d'huile essentielle de rose de 2000 microns
Dans un réacteur de 30 litres ml, on disperse 500 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10000 dans 1000 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 36 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR 21 muni d'une pale, on ajoute 250 ml de solution NaOH 5N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute lentement 400 ml d'huile essentielle de rose. Le mélange est maintenu agité à 100 tours min pendant 8 minutes. Enfin le mélange est dispersé sous agitation à 100 tours min à l'aide d'une héUce tripale en inox de 200 mm de diamètre dans 15 Utres d'huile de paraffine épaisse Giffrer. L'émuision est maintenue dispersée par agitation lente à l'aide d'une pale de type ancre à une vitesse comprise entre 30 et 50 tours/min. Après 3 heures d'agitation les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 16 litres d'eau et neutraUsées par HCl 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 8 Utres d'eau. On obtient des capsules d'huUe essentieUe de 2000 microns
Exemple 7 selon l'invention : Préparation de microcapsules d'huile essentieUe de rose de 40 microns
Dans un réacteur de 30 Utres ml, on disperse 500 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10000 dans 1000 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 36 tours min à l'aide d'un système Heidolph RZR 21 muni d'une pale, on ajoute 250 ml de solution NaOH 5N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours min, on ajoute lentement 400 ml d'huUe essentieUe de rose. Le mélange est agité à 100 tours/min pendant 8 minutes.. Enfin le mélange est dispersé par agitation à 100 tours/min à l'aide d'une hélice tripale en inox de 200 mm de diamètre dans 15 litres d'huUe de paraffine épaisse Giffrer contenant 15 grammes de tween. L'émuision est maintenue dispersée par agitation lente à l'aide d'une pale de type ancre à une vitesse comprise entre 30 et 50 tours min. Après 3 heures d'agitation les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 16 Utres d'eau et neutraUsées par HCl 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 8 litres d'eau. On obtient des capsules d'huUe essentielle de 40 microns.
Exemple 8 selon l'invention : Préparation de ceUules de méduUo-surrénales de veau encapsulées
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 10 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hétice bipale, on ajoute 2,5 ml de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,980 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension de ceUules de méduUc- surrénales en milieu de culture DMEM. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin U est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huUe de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 °C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml de mitieu de culture . Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml de milieu jusqu'à neutralisation. On obtient des capsules de 250 microns contenant les cellules.
Exemple 9 selon l'invention : Préparation de levures saccharomyces Boulardii encapsulées
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10000 dans 10 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une héUce bipale, on ajoute 2,5 ml de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours min, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de levures. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours min dans 150 ml d'huUe de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 toursmin pendant 3 heures à 36 °C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutraUsées par HCl 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 200 à 400 microns contenant les levures.
Exemple 10 selon l'invention : Préparation de bactéries Leuconostoc Oenos encapsulées
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10000 dans 7,5 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 2,5 mi de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de bactéries. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin U est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours min pendant 3 heures à 36 °C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCl 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 200 à 400 microns contenant les bactéries.
Exemple 11 selon l'invention : Préparation de capsules à large pores contenant leuconostoc oenos
Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10000 dans 15 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 3,5 ml de solution NaOH 6N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,75 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de bactéries. Le mélange est dispersé à 100 tours min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin U est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 °C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutraUsées par HCl 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 400 microns contenant les bactéries et caractérisées par une grande porosité proche de 500 000 daltons permettant le passage de nutriments et des produits de fermentation.

Claims

Revendications
1 - Microcapsules caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un hydrogel de polysaccharide réticulé par des liaisons covalentes et dans lequel sont dispersées des inclusions de produits encapsulés
2 - Procédé de fabrication des capsules selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'U comprend les étapes successives suivantes : a) - la dispersion du polymère dans une phase aqueuse alcaline b) -l'addition de l'agent réticulant, par exemple répichlorhydrine à la dispersion alcaline de polymères sous agitation c) - l'addition du composé à encapsuler sous agitation, après un temps de réaction autorisant la dispersion complète de l'agent réticulant et avant le début de gélification d) - la réticulation complète et dispersion du polymère conduisant à la formation des capsules e) - récupération des capsules par décantation ou filtration sont neutralisées et lavées par l'eau
3 - Procédé selon la revendications 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'étape d) en laissant au repos le miUeu de réaction pendant 3 heures jusqu'à réticulation complète et prise en masse sous forme de gel qui est ensuite neutralisé et broyé mécaniquement pour former les microcapsules contenant le produit à encapsuler.
4 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'étape d) en dispersant le milieu de réaction sous forme de gouttelettes dans une phase organique hydrophobe sous agitation jusqu'à réticulation complète des capsules.
5 - Procédé selon la revendications 4, caractérisé en ce que la phase hydrophobe est une huile de paraffine épaisse
6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications de 2 à 5, caractérisé en ce que le polymère est un amidon de poids moléculaire de 10000.
7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications de 2 à 6, caractérisé en ce qu'on introduit à la solution de polymère un ou plusieurs composés à encapsuler, à l'état de poudre, de solution, de suspension, d'émulsion.
8 - Capsule selon la revendication 1 ou teUe qu'obtenue par les procédés selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le ou les composés encapsulés sont des substances d'intérêt biologique, alimentaire, cosmétique, thérapeutique.
9 - Capsule selon les revendications 8, caractérisé en ce que le ou les composés encapsulés sont des substances choisies parmi : - les anticorps
- les protéoglycanes
- Les anticancéreux
- les antibiotiques - les antiviraux, en particulier les analogues d'oUgonucléotides et les inhibiteurs de la transcriptase inverse
- les antiprotéases
- les insecticides et antifongiques
- les oUgonucléotides, ADN et éléments de génome - les anesthésiques et anesthésiques locaux comme la benzocaïne
- les vasoconstricteurs
- les cardiotoniques comme la digitoxine et la digitaline et ses dérivés
- les vasodUatateurs
- les diurétiques et antidiurétiques - les prostaglandines
- les neuroleptiques
- les antidépresseurs
- les hormones et dérivés
- anti-inflammatoire stéroïdiens et non stéroïdiens - les antihistaminiques
- les agents anti-allergiques
- les antiseptiques
- les agents de diagnostic
- les vitamines - les acides aminés et sels minéraux
- les enzymes
- les hydroxyacides et les HuUes essentieUes
- les molécules à activité d'absorption des rayonnement U.V. ou d'hydratation de l'épidémie 10- Capsule selon la revendication 8 caractérisée en ce que les composés encapsulés sont des levures, des bactéries, des ceUules de mammifères, des apex végétaux.
11 - Capsule selon la revendication 10, caractérisée en ce que les ceUules sont choisies parmi des hépatocytes, des îlots de Langerhans, des ceUules de pancréas, des ceUules de méduUo-surrénales, des ceUules de lignées dopaminergiques PC 12, des ceUules génétiquement modifiées et caractérisée en ce que la capsule est implantable et l'hydrogel réticulé la formant est perméable à l'insuline, aux nutriments nécessaires aux ceUules, à la dopamine, aux métenképhalines, aux produits du métabolisme des hépatocytes et imperméable aux éléments cεUulaires et moléculaires du système immunitaire.
12 - Capsule selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou teUe qu'obtenue par les procédés selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la substance encapsulée est une phase huUeuse contenant une ou plusieurs substance d'intérêt biologique, alimentaire, cosmétique, thérapeutique, à l'état de solution, de dispersion ou d'émulsion.
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