WO1998056824A2 - Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins - Google Patents

Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins Download PDF

Info

Publication number
WO1998056824A2
WO1998056824A2 PCT/EP1998/003398 EP9803398W WO9856824A2 WO 1998056824 A2 WO1998056824 A2 WO 1998056824A2 EP 9803398 W EP9803398 W EP 9803398W WO 9856824 A2 WO9856824 A2 WO 9856824A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
carrier
peptide
host cell
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/003398
Other languages
German (de)
French (fr)
Other versions
WO1998056824A3 (en
Inventor
Nediljko Budisa
Robert Huber
Carolin Minks
Luis Moroder
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. filed Critical MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority to EP98936310A priority Critical patent/EP0998487A2/en
Priority to AU85363/98A priority patent/AU8536398A/en
Publication of WO1998056824A2 publication Critical patent/WO1998056824A2/en
Publication of WO1998056824A3 publication Critical patent/WO1998056824A3/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical composition which contains at least one pharmacologically active amino acid analog as active ingredient incorporated in a peptide or polypeptide as carrier or vehicle. Methods for producing such pharmaceutical compositions are also disclosed.
  • thiazolidine-2-carboxylic acid thioproline
  • thioproline is known to have an effect in the human body as an antioxidant, radical scavenger, nitrite scavenger and suppressor of nitrite-induced carcinogenesis, while its role in the reversion of cancer is still controversial.
  • Pharmacologically active amino acid analogs have hitherto been available in free form in various ways, e.g. orally or parenterally. However, undesirable strong side effects were often observed, especially when thioproline was administered.
  • amino acid analogs e.g. Thioproline
  • chemical peptide analogues by chemical synthesis which itself have pharmacological properties, e.g. as enzyme inhibitors (see e.g. Baldwin et al., Structure 3 (1995), 581-590).
  • enzyme inhibitors see e.g. Baldwin et al., Structure 3 (1995), 581-590.
  • active substance precursors which release the actual active substance, the amino acid analogue, upon physiological degradation.
  • the object underlying the present invention was therefore to provide an improved method for the administration of pharmacologically active amino acid analogs.
  • synthetic or biosynthetic incorporation of pharmacologically active analogs into peptides or polypeptides as carriers or vehicles represents a new and interesting possibility for the administration and targeting of such active substances.
  • naturally occurring, genetically coded amino acids in the peptide or polypeptide sequence of the carrier are preferably replaced by non-genetically coded, pharmacologically active amino acid analogs which are similar to the natural amino acids in form, in steric complementarity and in volume, so as to avoid steric conflicts to prevent.
  • carrier peptides or polypeptides are generated which retain their characteristic folding and functional activity as well as their biologically active conformation. Accordingly, the immunological or antigenic properties of such mutants remain essentially unchanged.
  • peptide or polypeptide carriers which contain a pharmacologically active amino acid analog built into their amino acid chain, serve as active substance precursors or prodrugs that are physiologically broken down in the body after administration and in this way release the actual active substance, the amino acid analog.
  • amino acid analogs into peptides and polypeptides can be done by synthetic and semi-synthetic methods as well as by recombinant DNA technology. While peptides and smaller proteins with a molecular weight of ⁇ 10 kDa are accessible using methods of chemical synthesis, an effective recombinant expression system, such as the bacterial T7 promoter polymerase system, is required for larger proteins which are preferred as carriers.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical composition which contains at least one amino acid analog incorporated as active ingredient in a peptide or polypeptide and optionally pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers.
  • the amino acid analog is preferably incorporated in such a way that the resulting modified peptide or polypeptide maintains its natural conformation.
  • an amino acid analog is generally installed instead of a structurally related natural amino acid.
  • Suitable amino acid analogs are halogen analogs, ie amino acids which have at least one additional halogen group compared to naturally occurring, genetically coded amino acids.
  • halogen analogs ie amino acids which have at least one additional halogen group compared to naturally occurring, genetically coded amino acids.
  • the introduction of such amino acid analogs into polypeptides for example fluoro-phenylalanine (Cohen and Munier, Biochim. Biophys. Acta 31 (1 959), 347-356), fluoro-tyrosine (Sykes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71 (1 974), 469-473), fluorotryptophan (Browne et al., Biochim. Biophys. Res. Commun.
  • the bioincorporation of the amino acid analogs can generally be achieved by (i) in vitro suppression or circumvention or elimination of the aminoacylation of tRNA or (ii) selection pressure incorporation (SPI) methods.
  • SPI selection pressure incorporation
  • the so-called nonsense suppression phenomenon is used in the in vitro suppression method, whereby harmful stop codons inserted into a DNA sequence by mutation can be compensated for in vivo by reading this stop codon as another natural amino acid.
  • site-specific mutagenesis to introduce stop codons into the coding sequence and using synthetically modified suppressor tRNAs that specifically target such introduced termination codons, i.e. Recognize nonsense suppression sites, it is possible to introduce various unnatural amino acids at defined positions of proteins (Noren et al., Science 244 (1 989), 1 82-1 88).
  • cells in particular bacterial cells, are cultivated in a defined medium with a limited concentration of the natural amino acid to be replaced in each case, the transcription of the target gene remaining switched off. After consumption of the natural amino acid and the beginning of the stationary growth phase, the natural amino acid is replaced by the respective analog. Induction of the biosynthesis of the recombinant target protein leads to the production of a protein which contains only or partially the unnatural amino acid analogue instead of the naturally occurring amino acid.
  • the amino acid analog is particularly preferably incorporated into a recombinant mammalian polypeptide which has a molecular mass ⁇ 10 kDa.
  • the carrier containing an amino acid analog is a peptide or a polypeptide which has a largely or even completely identical spatial structure with a corresponding wild-type polypeptide (ie a same amino acid sequence but instead of the analog having the natural amino acid).
  • the correspondence of the spatial structures of analog-modified polypeptide and unmodified polypeptide are preferably determined by X-ray structure analysis.
  • the selection of the carrier peptides or polypeptides for the pharmacologically active amino acid analogue is advantageously carried out in accordance with the particular application.
  • tissue-specific means that the carrier is selected such that it preferably reaches its intended site of action selectively by tissue-specific mechanisms, for example carrier-mediated uptake or receptor-mediated absorptive endocytosis or transcytosis.
  • tissue-specific mechanisms for example carrier-mediated uptake or receptor-mediated absorptive endocytosis or transcytosis.
  • the carrier can be taken up into the desired target cell and can be degraded physiologically into individual amino acids within this cell, the amino acid analog being released as a pharmacologically active substance. In this way it is possible to transport the active substance to any desired location on the body by selecting suitable carriers.
  • tissue-specific endocytosis and / or adsorptive endocytosis for example, even the blood-brain barrier can be overcome (Abbott and Romero, Molecular Medicine Today, March 1 996, 106-1 13).
  • the carrier peptides can be administered orally, rectally, parenterally (intramuscularly or intravenously) or by inhalation.
  • the optimum dosage for the respective application can easily be determined by a person skilled in the art by simple experiments.
  • Another object of the present invention is a method for producing a precursor for a pharmacological active ingredient, wherein at least one amino acid analogue is incorporated into a carrier selected from peptides and polypeptides and the resulting carrier is brought into a pharmaceutically acceptable form.
  • the amino acid analog can be incorporated by chemical synthesis, for example solid phase peptide synthesis, or preferably in vivo in a host cell.
  • Host cells include the incorporation of the amino acid analog carrier, preferably the following steps:
  • a prokaryotic cell in particular an E. coli cell, is preferably used as the host cell. It is further preferred that an auxotrophic host cell is used for the amino acid to be replaced by the amino acid analogue and that the amino acid to be replaced is added to the medium in step (a) of the above process.
  • auxotrophic host cell is used for the amino acid to be replaced by the amino acid analogue and that the amino acid to be replaced is added to the medium in step (a) of the above process.
  • Such host cells which are auxotrophic for one or more amino acids, are well known and can optionally be readily produced by mutating individual genes responsible for the biosynthesis of certain amino acids.
  • any regulatable expression control sequences can be used for the method according to the invention, for example promoters which are recognized by an endogenous DNA-dependent RNA polymerase of the host cell.
  • suitable prokaryotic regulatable expression control sequences are chemically regulatable expression control sequences such as the lac, the trp or the tac expression system or temperature-regulatable expression systems such as the ⁇ expression system.
  • a bacteriophage is used as the regulatable expression control sequence.
  • Promoter in combination with a host cell which contains a gene for a bacteriophage DNA-dependent RNA polymerase which recognizes the promoter, this polymerase gene in turn being operatively linked to a further regulatable expression control sequence, for example a temperature-dependent ⁇ promoter.
  • a T7 promoter is particularly preferably used in combination with a T7 RNA polymerase gene.
  • Yet another aspect of the present invention is a method of administering a pharmacologically effective amino acid analog to a patient, preferably a human patient, wherein a pharmacologically effective amount of a suitable carrier peptide or carrier polypeptide containing the amino acid analog as part of its amino acid chain, optionally together with pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers.
  • a suitable carrier peptide or carrier polypeptide containing the amino acid analog as part of its amino acid chain, optionally together with pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers.
  • the pharmacologically effective amount of the carrier peptide or polypeptide can be varied over a wide range and depends on the type of carrier peptide or carrier polypeptide, the type of amino acid analogues administered and the type of disease. Dosages which are up to a factor of 10 to 100 below the dose which is required when the amino acid analogue is administered in free form can usually be used.
  • the present invention relates to polypeptides which contain at least one thioproline residue, preferably at least 2 and particularly preferably at least 3 thioproline residues, as part of their amino acid chain.
  • the polypeptides can also contain at least 5, in particular 5 to 25, thioproline residues.
  • the polypeptides can also contain at least 5, in particular 5 to 25, thioproline residues.
  • Polypeptides have a molecular mass> 10 kDa and contain several thioproline residues. It is particularly preferably recombinant
  • Mammalian polypeptides that contain thioproline residues at the positions where proline residues are normally located.
  • polypeptides can also be used in which additional mutagenesis
  • Proline residues were introduced. These polypeptides can be used to prepare a pharmaceutical composition as previously described, e.g. as
  • Tumor control agents are used. On the other hand, these can be used.
  • Polypeptides can also be used to elucidate protein structures, in particular by means of crystallographic studies.
  • the preparation of a polypeptide containing at least one thioproline residue preferably comprises the steps: (a) providing a host cell with a nucleic acid coding for a peptide or polypeptide with at least one proline residue in operative linkage with a regulatable expression control sequence, (b) cultivating the host cell under conditions in which the transcription of the nucleic acid coding for the peptide or polypeptide is at least largely is turned off, (c) adding thioproline and inducing expression of the peptide or polypeptide and (d) recovering the peptide or polypeptide from the host cell and / or the culture medium.
  • E.coli DSM1 563 (F “ ⁇ S thr” leu “ arg “ pro “ his “ thi “ SmA r ara “ xyl “ lac “ gal) was obtained from the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) and for all transformations -, Expression and purification experiments used. All cultivation, fermentation and expression experiments were carried out in New Minimal Medium (NMM).
  • NMM New Minimal Medium
  • the E.coli strain DSM 1 563 was co-transformed with 2 plasmids according to the RbCI or CaCI procedure (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1 989) Cold Spring Harbor Laboratory Press): pRSET-PP4, which is a Plasmid of the pRSET family is (Schoepfer, Gene 1 24 (1 993), 83-85), which contains a gene sequence for AnnexinV under the control of a T7 promoter and an ampicillin resistance gene, and pGP1 -2, which is a gene for the T7 polymerase and contains a kanamycin resistance gene (Studier and Moffat (1 996, supra).
  • the induction of the bacteriophage T7 RNA polymerase leads to a strong expression of genes under the control of the T7 promoter.
  • the bacteria were cultivated under selective pressure of 100 mg / l ampicillin and 70 mg / l kanamycin at 30 ° C.
  • Bacterial cultivation and expression experiments were carried out as follows: 5 ml NMM with 0.3 mmol / l proline were inoculated with 5 ⁇ transformed E.coli DSM 1 563 glycerol culture and grown overnight at 30 ° C. 1 ml of the overnight culture was then used as an inoculum for 100 ml of prewarmed (37 ° C) NMM. 1 ml of this culture was used to inoculate 100 ml of NMM with 0.05 mmol / l proline.
  • the protein synthesis in the cultures was induced by a temperature jump from 30 ° C to 42 ° C for half an hour together with the addition of thioproline to a final concentration of 1 mmol / l. Then the lines were fermented for 4 to 6 hours to express protein at 30 ° C.
  • the recombinant AnnexinV was purified according to the method described by Burger et al. (1 993) FEBS Lett. 329 (1,993), 25-28, published method.
  • the bacterial cells were disrupted by an osmotic shock and the protein was reversibly bound to liposomes in the presence of calcium.
  • the protein was further purified by ion exchange chromatography on a DEAE-Sepharose column, buffered with 20 mmol / l to Tris pH 6.0, and eluted with a linear NaCl gradient (0-200 mmol / l).
  • the purity of the recombinant protein was demonstrated by SDS-PAGE and silver staining, HPLC profile analysis and electrospray mass spectrum analysis.
  • concentrations of protein samples were determined using a Perkin-Elmer Lambda 17 UV / VIS spectrophotometer assuming an extinction coefficient of 22500 I mol "1 cm " 1 as calculated from the amino acid composition.
  • the yields of thioproline-containing annexin were 8 to 10 mg per liter of the culture.
  • AnnexinV contains five surface localized proline residues.
  • Pro 1 3 is located near the N-terminus in a flexible tail;
  • Pro87, Pro 1 1 9 and Pro248 are each in two amino acid residues long loops that connect helices, and
  • Pro 1 63 is in a long loop consisting of nine amino acid residues.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The invention relates to a pharmaceutical compound containing as an active ingredient at least one pharmacologically active amino acid analogue incorporated into a peptide or polypeptide as carrier or vehicle. The invention also relates to methods for producing such pharmaceutical compounds.

Description

Inkorporation von pharmakologisch wirksamen Aminosäureanaloga in ProteineIncorporation of pharmacologically active amino acid analogs into proteins
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein pharmakologisch wirksames Aminosäureanalogon eingebaut in ein Peptid oder Polypeptid als Träger oder Vehikel enthält. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen offenbart.The invention relates to a pharmaceutical composition which contains at least one pharmacologically active amino acid analog as active ingredient incorporated in a peptide or polypeptide as carrier or vehicle. Methods for producing such pharmaceutical compositions are also disclosed.
In den letzten Jahren sind große Anstrengungen aufgewendet worden, um neue und wirksame Methoden zur Verabreichung und insbesondere zur zielgerichteten gewebespezifischen Verabreichung von Arzneimitteln zu entwickeln. Arzneimittel unterscheiden sich jedoch stark hinsichtlich ihrer Größe, ihrer chemischen Natur und ihrer pharmakologischen Funktionen. Daher ist es besonders schwierig, wenn nicht unmöglich, eine dieser neuen Methoden generell anzuwenden, da jede der im folgenden genannten Voraussetzungen erfüllt werden muß:In recent years, great efforts have been made to develop new and effective methods for the administration and in particular for the targeted tissue-specific administration of drugs. However, medicines differ widely in terms of their size, chemical nature and pharmacological functions. It is therefore particularly difficult, if not impossible, to apply one of these new methods in general, since each of the following requirements must be met:
(i) Eindringen des Arzneimittels in den Körper,(i) penetration of the drug into the body,
(ii) Aufrechterhalten der biologischen Aktivität des Arzneimittels,(ii) maintaining the biological activity of the drug,
(iii) Transport zu seinem Wirkort und (iv) Abgabe des Arzneimittels an diesem Ort in wirksamer Form.(iii) transportation to its site of action and (iv) delivery of the drug to that site in an effective form.
Es gibt verschiedene natürlich und nichtnatürlich vorkommende Aminosäureanaloga, die eine pharmakologische Wirksamkeit besitzen. So ist beispielsweise für Thiazolidin-2-carbonsäure (Thioprolin) eine Wirkung im menschlichen Körper als Antioxidationsmittel, Radikalfänger, Nitritfänger und Suppressor von Nitrit-induzierter Karzinogenese bekannt, während ihre Rolle bei der Reversion von Krebs noch umstritten ist. Canavanin, ein Analog von Arginin, ist als stark antibiotisch wirksame Verbindung bekannt; 3-(3,5)-Dihydroxyphenyl-L-alanin (L-DOPA) ist die Vorstufe von Dopamin; 5-Hydroxy-L-tryptophan ist die Vorstufe von Serotonin und Selenomethionin (SeMet) wird zur Zufuhr von Selen bei Selenmangel eingesetzt. Melatonin (N-Acetyl-5-methoxytryptamin) ist ein Zirbeldrüsenhormon. Diiodo-Tyrosin ist die Vorstufe des Schilddrüsenhormons Thyroxin.There are various naturally and unnaturally occurring amino acid analogs that have pharmacological activity. For example, thiazolidine-2-carboxylic acid (thioproline) is known to have an effect in the human body as an antioxidant, radical scavenger, nitrite scavenger and suppressor of nitrite-induced carcinogenesis, while its role in the reversion of cancer is still controversial. Canavanine, a Analog of arginine, is known as a strong antibiotic compound; 3- (3,5) -Dihydroxyphenyl-L-alanine (L-DOPA) is the precursor of dopamine; 5-Hydroxy-L-tryptophan is the precursor of serotonin and selenomethionine (SeMet) is used to supply selenium in the case of selenium deficiency. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is a pineal gland hormone. Diiodo-tyrosine is the precursor of the thyroid hormone thyroxine.
Pharmakologisch wirksame Aminosäureanaloga sind bisher in freier Form auf verschiedene Art und Weise, z.B. oral oder parenteral, verabreicht worden. Dabei wurden jedoch oftmals unerwünschte starke Nebenwirkungen beobachtet, insbesondere bei der Verabreichung von Thioprolin.Pharmacologically active amino acid analogs have hitherto been available in free form in various ways, e.g. orally or parenterally. However, undesirable strong side effects were often observed, especially when thioproline was administered.
Darüber hinaus wurden Aminosäureanaloga, z.B. Thioprolin, durch chemische Synthese in Peptidanaloga eingebaut, die selbst pharmakolo- gische Eigenschaften, z.B. als Enzyminhibitoren, besitzen (vgl. z.B. Baldwin et al., Structure 3 (1995), 581 -590). Über die Verwendung solcher Peptidanaloga als Wirkstoffvorläufer, die bei physiologischem Abbau den eigentlichen Wirkstoff, das Aminosäureanalogon freisetzen, ist nichts bekannt.In addition, amino acid analogs, e.g. Thioproline, built into chemical peptide analogues by chemical synthesis, which itself have pharmacological properties, e.g. as enzyme inhibitors (see e.g. Baldwin et al., Structure 3 (1995), 581-590). Nothing is known about the use of such peptide analogs as active substance precursors which release the actual active substance, the amino acid analogue, upon physiological degradation.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, eine verbesserte Methode zur Verabreichung von pharmakologisch wirksamen Aminosäureanaioga bereitzustellen. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß der synthetische oder biosynthetische Einbau von pharmakologisch wirksamen Analoga in Peptide oder Polypeptide als Träger oder Vehikel eine neue und interessante Möglichkeit zur Verabreichung und zum Targeting solcher Wirkstoffe darstellt. Dabei werden vorzugsweise natürlich vorkommende, genetisch kodierte Aminosäuren in der Peptid- oder Polypeptidsequenz des Trägers durch nicht genetisch kodierte, pharmakolo- gisch wirksame Aminosäureanaloga ersetzt, welche den natürlichen Aminosäuren in der Form, in der sterischen Komplementarität und im Volumen ähneln, um sterische Konflikte möglichst zu verhindern. Auf diese Weise werden Trägerpeptide bzw. -polypeptide erzeugt, die ihre charakteristische Faltung und funktioneile Aktivität sowie ihre biologisch wirksame Konformation beibehalten. Entsprechend bleiben auch die immunologischen oder antigenen Eigenschaften solcher Mutanten im wesentlichen unver- ändert.The object underlying the present invention was therefore to provide an improved method for the administration of pharmacologically active amino acid analogs. Surprisingly, it was found that the synthetic or biosynthetic incorporation of pharmacologically active analogs into peptides or polypeptides as carriers or vehicles represents a new and interesting possibility for the administration and targeting of such active substances. In this case, naturally occurring, genetically coded amino acids in the peptide or polypeptide sequence of the carrier are preferably replaced by non-genetically coded, pharmacologically active amino acid analogs which are similar to the natural amino acids in form, in steric complementarity and in volume, so as to avoid steric conflicts to prevent. To this In this way, carrier peptides or polypeptides are generated which retain their characteristic folding and functional activity as well as their biologically active conformation. Accordingly, the immunological or antigenic properties of such mutants remain essentially unchanged.
Diese Peptid- oder Polypeptidträger, die ein pharmakologisch wirksames Aminosäureanalogon eingebaut in ihre Aminosäurenkette enthalten, dienen als Wirkstoffvorläufer oder Prodrugs, die nach Verabreichung im Körper physiologisch abgebaut werden und auf diese Weise den eigentlichen Wirkstoff, das Aminosäureanalogon, freisetzen.These peptide or polypeptide carriers, which contain a pharmacologically active amino acid analog built into their amino acid chain, serve as active substance precursors or prodrugs that are physiologically broken down in the body after administration and in this way release the actual active substance, the amino acid analog.
Der Einbau von Aminosäureanaloga in Peptide und Polypeptide kann durch synthetische und semisynthetische Methoden sowie durch rekombinante DNA-Technologie erfolgen. Während mit Methoden der chemischen Synthese Peptide und kleinere Proteine mit einer Molekülmasse < 10 kDa zugänglich sind, wird für größere Proteine, die als Träger bevorzugt sind, ein wirksames rekombinantes Expressionssystem wie etwa das bakterielle T7 Promotor-Polymerasesystem benötigt.The incorporation of amino acid analogs into peptides and polypeptides can be done by synthetic and semi-synthetic methods as well as by recombinant DNA technology. While peptides and smaller proteins with a molecular weight of <10 kDa are accessible using methods of chemical synthesis, an effective recombinant expression system, such as the bacterial T7 promoter polymerase system, is required for larger proteins which are preferred as carriers.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Aminosäureanalogon eingebaut in ein Peptid oder Polypeptid und gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Hilfs-, Zusatz- oder Trägerstoffe enthält. Vorzugsweise erfolgt der Einbau des Aminosäureanalogons derart, daß das resultierende modifizierte Peptid oder Polypeptid seine natürliche Konformation beibehält. Hierzu wird im allgemeinen ein Aminosäureanalogon anstelle einer strukturell verwandten natürlichen Aminosäure eingebaut.The present invention thus relates to a pharmaceutical composition which contains at least one amino acid analog incorporated as active ingredient in a peptide or polypeptide and optionally pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers. The amino acid analog is preferably incorporated in such a way that the resulting modified peptide or polypeptide maintains its natural conformation. For this purpose, an amino acid analog is generally installed instead of a structurally related natural amino acid.
Das Aminosäureanalogon kann eine beliebige, mit einer natürlichen, genetisch kodierten Aminosäure verwandte Verbindung sein. Vorzugsweise ist das Aminosäureanalogon eine σ-Aminocarbonsäure, die gegenüber einer natürlichen, genetisch kodierten Aminosäure Modifikationen in der Seitenkette enthält. Besonders bevorzugt werden Aminosäureanaloga als L- Enantiomere, am meisten bevorzugt in optisch reiner Form verwendet. Beispiele für solche Aminosäureanaloga sind etwa Chalkogenanaloga von Aminosäuren ausgewählt aus Methionin, Cystein, Serin, Threonin und Prolin. Konkrete Beispiele für geeignete Analoga dieser Aminosäuren sind 2-Aminohexansäure, Selenomethionin, Telluromethionin, Selenocystein und Thioprolin. Besonders bevorzugt ist Thioprolin. Weitere Beispiele für geeignete Aminosäureanaloga sind Halogenanaloga, d.h. Aminosäuren, die gegenüber natürlich vorkommenden genetisch kodierten Aminosäuren mindestens eine zusätzliche Halogengruppe aufweisen. Die Einführung solcher Aminosäureanaloga in Polypeptide, z.B. Fluoro-Phenylalanin (Cohen und Munier, Biochim. Biophys. Acta 31 (1 959), 347-356), Fluoro-Tyrosin (Sykes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71 (1 974), 469-473), Fluoro- Tryptophan (Browne et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 39 ( 1 970), 1 3- 1 9), Fluoro-Leucin (Feeney et al., J. Am. Chem. Soc. 1 1 8 ( 1 996), 8700- 8706) und Fluoro-Methionin (Duewel et al., Biochemistry 36 ( 1 997), 3404- 341 6) ist bekannt.The amino acid analog can be any compound related to a natural, genetically encoded amino acid. The amino acid analog is preferably a σ-aminocarboxylic acid, which is opposite one contains natural, genetically encoded amino acid modifications in the side chain. Amino acid analogs are particularly preferably used as L-enantiomers, most preferably in optically pure form. Examples of such amino acid analogs are chalcogen analogs of amino acids selected from methionine, cysteine, serine, threonine and proline. Specific examples of suitable analogs of these amino acids are 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine, selenocysteine and thioproline. Thioproline is particularly preferred. Further examples of suitable amino acid analogs are halogen analogs, ie amino acids which have at least one additional halogen group compared to naturally occurring, genetically coded amino acids. The introduction of such amino acid analogs into polypeptides, for example fluoro-phenylalanine (Cohen and Munier, Biochim. Biophys. Acta 31 (1 959), 347-356), fluoro-tyrosine (Sykes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71 (1 974), 469-473), fluorotryptophan (Browne et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 39 (1 970), 1 3- 1 9), fluoro-leucine (Feeney et al., J. Am. Chem. Soc. 1 1 8 (1 996), 8700-8706) and fluoro-methionine (Duewel et al., Biochemistry 36 (1 997), 3404-341 6) are known.
Darüber hinaus sind selbstverständlich auch andere Analoga von Aminosäuren geeignet, vorzugsweise wenn diese durch in vivo Methoden, insbesondere durch die im Folgenden diskutierte Selektionsdruck-Einbaumethode in Proteine eingebaut werden können.In addition, other analogs of amino acids are of course also suitable, preferably if these can be incorporated into proteins by in vivo methods, in particular by the selection pressure installation method discussed below.
Die Bioinkorporation nichtnatürlicher Aminosäureanaloga in Proteine durch eine in vivo Methode ist gegenüber der chemischen Synthese bevorzugt, da bei der Bioinkorporation ein selektiver Einbau von L-Enantiomeren der Aminosäureanaloga erfolgt, so daß mögliche unerwünschte Nebenwirkungen aufgrund des Vorhandenseins von D-Enantiomeren ausgeschlossen werden können. Bei der chemischen Synthese können hingegen auch D- Enantiomere eingebaut werden, so daß - um dies zumindest weitgehend zu verhindern - eine kostspielige und aufwendige Aufreinigung der Ausgangs- materialien erforderlich ist. Selbst dann können jedoch Verunreinigungen durch D-Enantiomere nicht vollständig ausgeschlossen werden.The bio-incorporation of unnatural amino acid analogs into proteins by an in vivo method is preferred over chemical synthesis, since bio-incorporation involves a selective incorporation of L-enantiomers of the amino acid analogs, so that possible undesirable side effects due to the presence of D-enantiomers can be excluded. In the chemical synthesis, however, D-enantiomers can also be incorporated, so that - in order to prevent this at least to a large extent - an expensive and time-consuming purification of the starting materials is required. Even then, contamination by D-enantiomers cannot be completely ruled out.
Die Bioinkorporation der Aminosäureanaloga kann im allgemeinen durch (i) in vitro Supression bzw. Umgehung oder Eliminierung der Aminoacylierung von tRNA oder (ii) Selektionsdruck-Einbau (SPI) Methoden erreicht werden. Bei der in vitro Supressionsmethode wird das sog. Nonsense-Supressions- phänomen ausgenützt, wobei schädliche, durch Mutation in eine DNA- Sequenz eingefügte Stopkodons in vivo durch Überlesen dieses Stopkodons als eine andere natürliche Aminosäure ausgeglichen werden können. Unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese zur Einführung von Stopkodons in die kodierende Sequenz und der Verwendung synthetisch modifizierter Supressor-tRNAs, die spezifisch solche eingeführten Terminationskodons, d.h. Nonsense-Supressionsstellen, erkennen, ist es möglich, verschiedene nichtnatürliche Aminosäuren an definierten Positionen von Proteinen einzuführen (Noren et al., Science 244 (1 989), 1 82-1 88) .The bioincorporation of the amino acid analogs can generally be achieved by (i) in vitro suppression or circumvention or elimination of the aminoacylation of tRNA or (ii) selection pressure incorporation (SPI) methods. The so-called nonsense suppression phenomenon is used in the in vitro suppression method, whereby harmful stop codons inserted into a DNA sequence by mutation can be compensated for in vivo by reading this stop codon as another natural amino acid. Using site-specific mutagenesis to introduce stop codons into the coding sequence and using synthetically modified suppressor tRNAs that specifically target such introduced termination codons, i.e. Recognize nonsense suppression sites, it is possible to introduce various unnatural amino acids at defined positions of proteins (Noren et al., Science 244 (1 989), 1 82-1 88).
Im Gegensatz dazu werden bei der SPI-Methode Zellen, insbesondere Bakterienzellen, in einem definierten Medium mit einer limitierten Konzen- tration der jeweils zu ersetzenden natürlichen Aminosäure kultiviert, wobei die Transkription des Targetgens abgeschaltet bleibt. Nach Verbrauch der natürlichen Aminosäure und dem Beginn der stationären Wachstumsphase wird die natürliche Aminosäure durch das jeweilige Analogon ersetzt. Eine Induktion der Biosynthese des rekombinanten Targetproteins führt zur Herstellung eines Proteins, welches ausschließlich oder partiell das nichtnatürliche Aminosäureanalogon anstelle der natürlich vorkommenden Aminosäure enthält. Mit dieser SPI-Methode wurden bereits erfolgreich Aminosäureanaloga wie Selenomethionin, Ethionin, Telluromethionin, Selenocystein und Norleucin in humanes AnnexinV als Modellprotein eingebaut, wobei als Wirtszelle ein für die jeweils zu substituierende Aminosäure auxotropher E.coli Stamm und ein T7 Promotor/Polymerase- Expressionssystem verwendet wurde (Budisa et al., Eur. J. Biochem. 230 (1 995), 788-796; Karnbrock et al., J. Am. Chem. Soc. 1 1 8 ( 1 996), 91 3- 914 und Besse et al., Biol. Chem. 378 (1 997), 21 1 -21 8) . Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird nun erstmals beschrieben, wie die SPI- Methode auch zur Bioinkorporation von Thioprolin anstelle von Prolin in ein humanes Protein verwendet werden kann.In contrast to this, with the SPI method, cells, in particular bacterial cells, are cultivated in a defined medium with a limited concentration of the natural amino acid to be replaced in each case, the transcription of the target gene remaining switched off. After consumption of the natural amino acid and the beginning of the stationary growth phase, the natural amino acid is replaced by the respective analog. Induction of the biosynthesis of the recombinant target protein leads to the production of a protein which contains only or partially the unnatural amino acid analogue instead of the naturally occurring amino acid. With this SPI method, amino acid analogues such as selenomethionine, ethionine, telluromethionine, selenocysteine and norleucine have already been successfully incorporated into human AnnexinV as a model protein, using an E. coli strain that is auxotrophic for the amino acid to be substituted in each case and a T7 promoter / polymerase expression system (Budisa et al., Eur. J. Biochem. 230 (1,995), 788-796; Karnbrock et al., J. Am. Chem. Soc. 1 1 8 (1 996), 91 3- 914 and Besse et al., Biol. Chem. 378 (1 997), 21 1 -21 8). In the context of the present application, it is now described for the first time how the SPI method can also be used for bioincorporation of thioproline instead of proline in a human protein.
Noch eine weitere Methode der Bioinkorporation von Aminosäureanaloga in Proteine ist das von Ibba und Hennecke (FEBS Letters 364 ( 1 995), 272- 275) beschriebene Verfahren, welches auf der Verminderung der Sub- stratspezifität einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase beruht, und die in vitro und in vivo Synthese von Polypeptiden mit unnatürlichen Aminosäuren erlaubt.Yet another method of bioincorporation of amino acid analogs into proteins is the method described by Ibba and Hennecke (FEBS Letters 364 (1 995), 272-275), which is based on the reduction in the substrate specificity of an aminoacyl-tRNA synthetase, and the like in vitro and in vivo synthesis of polypeptides with unnatural amino acids allowed.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält als "Wirkstoffvorläufer" ein Trägerpeptid oder ein Trägerpolypeptid, welches mindestens ein Aminosäureanalogon als Wirkstoff enthält. Vorzugsweise ist der Träger ein Säugerpeptid oder ein Säugerpolypeptid, es können jedoch selbstverständlich auch Peptide oder Polypeptide aus anderen eukaryonti- schen Organismen oder aus Prokaryonten sowie rekombinante Peptide oder Polypeptide mit einer veränderten Aminosäuresequenz eingesetzt werden. In vielen Fällen wird bevorzugt ein Träger verwendet, welcher sich in seiner Aminosäuresequenzvon dementsprechenden endogenen natürlichen Peptid oder Polypeptid nur durch den Austausch einer natürlichen Aminosäure durch ein Aminosäureanalogon unterscheidet. Besonders bevorzugt ist das Aminosäureanalogon in ein rekombinantes Säugerpolypeptid eingebaut, welches eine Molekülmasse ≥ 10 kDa aufweist. Weiterhin ist bevorzugt, daß der ein Aminosäureanalogon enthaltende Träger ein Peptid oder ein Polypeptid ist, das eine mit einem entsprechendem Wildtyp-Polypeptid (d.h. ein dieselbe Aminosäuresequenz, aber anstelle des Analogons die natürliche Aminosäure aufweisendes Polypeptid) weitgehend oder sogar vollständig identische Raumstruktur aufweist. Die Übereinstimmung der Raumstrukturen von Analogon-modifiziertem Polypeptid und nicht modifiziertem Polypeptid werden vorzugsweise durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Die Auswahl der Trägerpeptide oder -polypeptide für das pharmakologisch wirksame Aminosäureanalogon erfolgt günstigerweise entsprechend dem jeweiligen Einsatzzweck. Um eine möglichst zielgerichtete Verabreichung des Wirkstoffs zu erreichen, ist in vielen Fällen die Verwendung eines gewebespezifischen Peptids oder Polypeptids sinnvoll. Die Bezeichnung "gewebespezifisch" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß der Träger so ausgewählt wird, daß er bevorzugt durch gewebespezifische Mechanismen, z.B. Träger-vermittelte Aufnahme oder Rezeptor-vermittelte absorptive Endocytose oder Transcytose selektiv zu seinem beabsichtigten Wirkort gelangt. Dort kann der Träger in die gewünschte Zielzelle aufgenommen werden und innerhalb dieser Zelle physiologisch in einzelne Aminosäuren abgebaut werden, wobei das Aminosäureanalogon als pharmakologischer Wirkstoff freigesetzt wird. Auf diese Weise ist es möglich, durch Auswahl geeigneter Träger den Wirkstoff gewebespezifisch an jeden gewünschten Ort des Körpers zu transportieren. Durch spezifische Rezeptor-vermittelte Endocytose und/oder adsorptive Endocytose kann beispielsweise sogar die Blut-Hirnschranke überwunden werden (Abbott und Romero, Molecular Medicine Today, März 1 996, 106-1 13) .The pharmaceutical composition according to the invention contains, as "active ingredient precursor", a carrier peptide or a carrier polypeptide which contains at least one amino acid analogue as the active ingredient. The carrier is preferably a mammalian peptide or a mammalian polypeptide, but it is of course also possible to use peptides or polypeptides from other eukaryotic organisms or from prokaryotes as well as recombinant peptides or polypeptides with a modified amino acid sequence. In many cases, a carrier is preferably used which differs in amino acid sequence from the corresponding endogenous natural peptide or polypeptide only by the replacement of a natural amino acid by an amino acid analog. The amino acid analog is particularly preferably incorporated into a recombinant mammalian polypeptide which has a molecular mass ≥ 10 kDa. It is further preferred that the carrier containing an amino acid analog is a peptide or a polypeptide which has a largely or even completely identical spatial structure with a corresponding wild-type polypeptide (ie a same amino acid sequence but instead of the analog having the natural amino acid). The correspondence of the spatial structures of analog-modified polypeptide and unmodified polypeptide are preferably determined by X-ray structure analysis. The selection of the carrier peptides or polypeptides for the pharmacologically active amino acid analogue is advantageously carried out in accordance with the particular application. In order to achieve the most targeted possible administration of the active ingredient, the use of a tissue-specific peptide or polypeptide is useful in many cases. In this context, the term “tissue-specific” means that the carrier is selected such that it preferably reaches its intended site of action selectively by tissue-specific mechanisms, for example carrier-mediated uptake or receptor-mediated absorptive endocytosis or transcytosis. There the carrier can be taken up into the desired target cell and can be degraded physiologically into individual amino acids within this cell, the amino acid analog being released as a pharmacologically active substance. In this way it is possible to transport the active substance to any desired location on the body by selecting suitable carriers. By means of specific receptor-mediated endocytosis and / or adsorptive endocytosis, for example, even the blood-brain barrier can be overcome (Abbott and Romero, Molecular Medicine Today, March 1 996, 106-1 13).
Die Art der Verabreichung der Trägerpeptide kann je nach Einsatzzweck oral, rektal, parenteral (intramuskulär oder intravenös) oder durch Inhalation erfolgen. Die optimale Dosierung für den jeweiligen Einsatzzweck kann vom Fachmann durch einfache Versuche ohne weiteres ermittelt werden.Depending on the intended use, the carrier peptides can be administered orally, rectally, parenterally (intramuscularly or intravenously) or by inhalation. The optimum dosage for the respective application can easily be determined by a person skilled in the art by simple experiments.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers für einen pharmakologischen Wirkstoff, wobei man mindestens ein Aminosäureanalogon in einen Träger ausgewählt aus Peptiden und Polypeptiden einbaut und den resultierenden Träger in eine pharmazeutisch appiizierbare Form bringt. Der Einbau des Aminosäureanalo- gons kann durch chemische Synthese, z.B. Festphasenpeptidsynthese oder aber vorzugsweise in vivo in einer Wirtszelle erfolgen. Bei Verwendung von Wirtszellen umfaßt der Einbau des Aminosäureanalogons einen Träger vorzugsweise folgende Schritte:Another object of the present invention is a method for producing a precursor for a pharmacological active ingredient, wherein at least one amino acid analogue is incorporated into a carrier selected from peptides and polypeptides and the resulting carrier is brought into a pharmaceutically acceptable form. The amino acid analog can be incorporated by chemical synthesis, for example solid phase peptide synthesis, or preferably in vivo in a host cell. When using Host cells include the incorporation of the amino acid analog carrier, preferably the following steps:
(a) Bereitstellen einer Wirtszelle mit einer für den Träger kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer regulierbaren(a) Providing a host cell with a nucleic acid coding for the carrier in operative linkage with a regulatable one
Expressionskontrollsequenz,Expression control sequence,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen die Transkription der für den Träger kodierenden Nukleinsäure weitgehend abgeschaltet ist, (c) Zugeben des Aminosäureanalogons und Induzieren der Expression des Trägers und (d) Gewinnen des das Aminosäureanalogon enthaltenden Trägers aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium.(b) culturing the host cell under conditions in which the transcription of the nucleic acid coding for the carrier is largely switched off, (c) adding the amino acid analogue and inducing the expression of the carrier and (d) obtaining the carrier containing the amino acid analogue from the host cell or / and the culture medium.
Vorzugsweise verwendet man als Wirtszelle eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine E.coli Zelle. Weiterhin ist bevorzugt, daß man eine für die durch das Aminosäureanalogon zu ersetzende Aminosäure auxotrophe Wirtszelle verwendet und bei Schritt (a) des obigen Verfahrens die zu ersetzende Aminosäure dem Medium zusetzt. Solche für eine oder mehrere Aminosäuren auxotrophe Wirtszellen sind wohlbekannt und können gegebenenfalls durch Mutation einzelner für die Biosynthese bestimmter Aminosäuren verantwortlicher Gene ohne weiteres hergestellt werden.A prokaryotic cell, in particular an E. coli cell, is preferably used as the host cell. It is further preferred that an auxotrophic host cell is used for the amino acid to be replaced by the amino acid analogue and that the amino acid to be replaced is added to the medium in step (a) of the above process. Such host cells, which are auxotrophic for one or more amino acids, are well known and can optionally be readily produced by mutating individual genes responsible for the biosynthesis of certain amino acids.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können grundsätzlich beliebige regulierbare Expressionskontrollsequenzen verwendet werden, z.B. Promotoren, die von einer endogenen DNA-abhängigen RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannt werden. Beispiele für solche geeigneten prokaryontischen regulierbaren Expressionskontrollsequenzen sind chemisch regulierbare Expressionskontrollsequenzen wie etwa das lac-, das trp- oder das tac-Ex- pressionssystem oder temperaturregulierbare Expressionssysteme wie etwa das Λ-Expressionssystem eingesetzt werden. Vorzugsweise verwendet man jedoch als regulierbare Expressionskontrollsequenz einen Bakteriophagen- Promotor in Kombination mit einer Wirtszelle, die ein Gen für eine, den Promotor erkennende Bakteriophagen DNA-abhängige RNA-Polymerase enthält, wobei dieses Polymerasegen wiederum in operativer Verknüpfung mit einer weiteren regulierbaren Expressionskontrollsequenz, z.B. einem temperaturabhängigen Λ-Promotor steht. Besonders bevorzugt verwendet man einen T7 Promotor in Kombination mit einem T7 RNA-Polymerasegen. Dieses Expressionssystem wird von Studier und Moffat (J. Mol. Biol. 1 89 ( 1 986), 1 1 3-1 30 und Studier et al., Methods Enzymol. 1 85 ( 1 991 ), 60-89) beschrieben.In principle, any regulatable expression control sequences can be used for the method according to the invention, for example promoters which are recognized by an endogenous DNA-dependent RNA polymerase of the host cell. Examples of such suitable prokaryotic regulatable expression control sequences are chemically regulatable expression control sequences such as the lac, the trp or the tac expression system or temperature-regulatable expression systems such as the Λ expression system. Preferably, however, a bacteriophage is used as the regulatable expression control sequence. Promoter in combination with a host cell which contains a gene for a bacteriophage DNA-dependent RNA polymerase which recognizes the promoter, this polymerase gene in turn being operatively linked to a further regulatable expression control sequence, for example a temperature-dependent Λ promoter. A T7 promoter is particularly preferably used in combination with a T7 RNA polymerase gene. This expression system is described by Studier and Moffat (J. Mol. Biol. 1 89 (1 986), 1 1 3-1 30 and Studier et al., Methods Enzymol. 1 85 (1 991), 60-89).
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verabreichung eines pharmakologisch wirksamen Aminosäureanalogons an einen Patienten, vorzugsweise an einen humanen Patienten, wobei man eine pharmakologisch wirksame Menge eines geeigneten Trägerpeptids oder Trägerpolypeptids, das das Aminosäureanalogon als Bestandteil seiner Aminosäurenkette enthält, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs-, Zusatz- oder Trägerstoffen verabreicht. Neben der Verabreichung an humane Patienten ist selbstverständlich auch ein Einsatz in der Veterinärmedizin, insbesondere für nichthumane Säuger denkbar. Die pharmakologisch wirksame Menge des Trägerpeptids oder Polypeptids kann über weite Bereiche variiert werden und hängt von der Art des Trägerpeptids oder Trägerpolypeptids, der Art des verabreichten Aminosäureanalogons und der Art der Erkrankung ab. Üblicherweise können Dosierungen verwendet werden, die um bis zu einen Faktor 10 bis 100 unterhalb derjenigen Dosis liegen, die bei einer Verabreichung des Aminosäureanalogons in freier Form benötigt wird.Yet another aspect of the present invention is a method of administering a pharmacologically effective amino acid analog to a patient, preferably a human patient, wherein a pharmacologically effective amount of a suitable carrier peptide or carrier polypeptide containing the amino acid analog as part of its amino acid chain, optionally together with pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers. In addition to administration to human patients, use in veterinary medicine is also conceivable, in particular for non-human mammals. The pharmacologically effective amount of the carrier peptide or polypeptide can be varied over a wide range and depends on the type of carrier peptide or carrier polypeptide, the type of amino acid analogues administered and the type of disease. Dosages which are up to a factor of 10 to 100 below the dose which is required when the amino acid analogue is administered in free form can usually be used.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung eines Aminosäureanalogons zur Herstellung eines Arzneimittelträgers ausgewählt aus Peptiden und Polypeptiden, der das Aminosäureanalogon als Wirkstoff eingebaut in die Peptid- oder Polypeptidkette des Trägers enthält, sowie die Verwendung eines mindestens ein Aminosäureanalogon enthaltenden Peptids oder Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels, welches als Wirkstoff das Aminosäureanalogon enthält.The invention also relates to the use of an amino acid analog for the production of a medicament carrier selected from peptides and polypeptides, which contains the amino acid analog as an active ingredient incorporated into the peptide or polypeptide chain of the carrier, and to the use of a peptide or at least one amino acid analog Polypeptide for the manufacture of a medicament which contains the amino acid analogue as active ingredient.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können für alle pharmakologischen Anwendungen eingesetzt werden, die für das Aminosäureanalogon in freier Form bereits bekannt sind. Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung von Thioprolin in der Antitumortherapie oder die Verwendung von selenhaltigen Aminosäuren, z.B. Selenomethionin, als Nahrungssupplementation. Fluorierte Aminosäuren können beispielsweise für antimikrobielle, z.B. antimykotische Anwendungen oder als Antitumormittel eingesetzt werden. Diiodo-Tyrosin und Melatonin können als Mittel zur Steigerung der Hormonproduktion verwendet werden.The medicaments according to the invention can be used for all pharmacological applications which are already known in free form for the amino acid analogue. An example of this is the use of thioproline in anti-tumor therapy or the use of selenium-containing amino acids, e.g. Selenomethionine, as a food supplement. Fluorinated amino acids can be used, for example, for antimicrobial, e.g. antifungal applications or as an anti-tumor agent. Diiodo-tyrosine and melatonin can be used as agents to increase hormone production.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide, die mindestens einen Thioprolinrest, vorzugsweise mindestens 2 und besonders bevorzugt mindestens 3 Thioprolinreste als Bestandteil ihrer Aminosäurekette enthalten. Beispielsweise können die Polypeptide auch mindestens 5, insbesondere 5 bis 25 Thioprolinreste enthalten. Vorzugsweise weisen dieFinally, the present invention relates to polypeptides which contain at least one thioproline residue, preferably at least 2 and particularly preferably at least 3 thioproline residues, as part of their amino acid chain. For example, the polypeptides can also contain at least 5, in particular 5 to 25, thioproline residues. Preferably, the
Polypeptide eine Molekülmasse > 1 0 kDa auf und enthalten mehrere Thioprolinreste. Besonders bevorzugt handelt es sich um rekombinantePolypeptides have a molecular mass> 10 kDa and contain several thioproline residues. It is particularly preferably recombinant
Säugerpolypeptide, die Thioprolinreste an denjenigen Positionen enthalten, an denen sich normalerweise Prolinreste befinden. Darüber hinaus können auch Polypeptide verwendet werden, in die durch Mutagenese zusätzlicheMammalian polypeptides that contain thioproline residues at the positions where proline residues are normally located. In addition, polypeptides can also be used in which additional mutagenesis
Prolinreste eingeführt wurden. Diese Polypeptide können zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie zuvor beschrieben, z.B. alsProline residues were introduced. These polypeptides can be used to prepare a pharmaceutical composition as previously described, e.g. as
Mittel zur Tumorbekämpfung, eingesetzt werden. Andererseits können dieseTumor control agents are used. On the other hand, these can
Polypeptide auch zur Aufklärung von Proteinstrukturen, insbesondere durch kristallographische Untersuchungen eingesetzt werden.Polypeptides can also be used to elucidate protein structures, in particular by means of crystallographic studies.
Die Herstellung eines mindestens einen Thioprolinrest enthaltenden Polypeptids umfaßt vorzugsweise die Schritte: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle mit einer für ein Peptid oder Polypeptid mit mindestens einem Prolinrest kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer regulierbaren Expressionskontrollsequenz, (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen die Transkription der für das Peptid oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäure zumindest weitgehend abgeschaltet ist, (c) Zugeben von Thioprolin und Induzieren der Expression des Peptids oder Polypeptids und (d) Gewinnen des Peptids oder Polypeptids aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium.The preparation of a polypeptide containing at least one thioproline residue preferably comprises the steps: (a) providing a host cell with a nucleic acid coding for a peptide or polypeptide with at least one proline residue in operative linkage with a regulatable expression control sequence, (b) cultivating the host cell under conditions in which the transcription of the nucleic acid coding for the peptide or polypeptide is at least largely is turned off, (c) adding thioproline and inducing expression of the peptide or polypeptide and (d) recovering the peptide or polypeptide from the host cell and / or the culture medium.
Weiterhin soll die Erfindung durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.The invention is further illustrated by the following examples.
BeispieleExamples
Beispiel 1 Bakterienstamm und MedienExample 1 Bacterial strain and media
E.coli DSM1 563 (F"ΛS thr" leu" arg" pro" his" thi" SmAr ara" xyl" lac" gal ) wurde von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) bezogen und für alle Transformations-, Expression- und Reinigungsexperimente verwendet. Alle Kultivierungs-, Fermentations- und Expressionsexperimente wurden in New Minimal Medium (NMM) durchgeführt. Dieses wird aus autoklavierten 1 mol/l Stammlösungen von verschiedenen Substanzen hergestellt und enthält diese in folgenden Konzentrationen: Ammoniumsulfat (7,5 mmol/l), NaCI (8,5 mmol/l), Kaliumdihydrogen- phosphat (22 mmol/l), Kaliumhydrogenphosphat (50 mmol/l), Magnesiumsulfat (1 mmol/l) und Glukose (20 mmol/l). Aus durch Filtration sterilisierten Stammlösungen von Ca 2 + ( 1 g/l), Fe2 + ( 1 g/l) und Spurenelementen (Cu2 +, Mn2 + , Zn2 + und MoO4 2") (jeweils 1 mg/l) wurden Aliquots auf eine Endkonzentration von 1 mg/l bzw. 1 μg/l in das Medium pipettiert. Aliquots von sterilisierten Thiamin- und Biotinstammlösungen ( 10 g/l) wurden auf eine Endkonzentration von 10 mg/l in das Medium gegeben. Eine Mischung aller Aminosäuren außer Prolin (Filter-sterilisierte Stammlösung von 0,5 g/l in phosphatgepufferter Salzlösung) wurde auf eine Endkonzentration von 50 mg/l zugegeben. Stammlösungen von Prolin und Thioprolin mit einer Konzentration von jeweils 50 mmol/l wurden in bidestilliertem Wasser hergestellt.E.coli DSM1 563 (F " Λ S thr " leu " arg " pro " his " thi " SmA r ara " xyl " lac " gal) was obtained from the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) and for all transformations -, Expression and purification experiments used. All cultivation, fermentation and expression experiments were carried out in New Minimal Medium (NMM). This is made from autoclaved 1 mol / l stock solutions of various substances and contains these in the following concentrations: ammonium sulfate (7.5 mmol / l), NaCl (8.5 mmol / l), potassium dihydrogen phosphate (22 mmol / l), Potassium hydrogen phosphate (50 mmol / l), magnesium sulfate (1 mmol / l) and glucose (20 mmol / l). From stock sterilized by filtration of Ca 2 + (1 g / l), Fe 2 + (1 g / l) and trace elements (Cu 2 + , Mn 2 + , Zn 2 + and MoO 4 2 " ) (each 1 mg / l) Aliquots were pipetted into the medium to a final concentration of 1 mg / l or 1 μg / l of sterilized thiamine and biotin stock solutions (10 g / l) were added to the medium to a final concentration of 10 mg / l. A mixture of all amino acids except proline (filter-sterilized stock solution of 0.5 g / l in phosphate-buffered saline) was added to a final concentration of 50 mg / l. Proline and thioproline stock solutions, each with a concentration of 50 mmol / l, were prepared in bidistilled water.
Beispiel 2 Fermentationsbedingungen und ProteinexpressionExample 2 Fermentation Conditions and Protein Expression
Der E.coli Stamm DSM 1 563 wurde mit 2 Plasmiden gemäß der RbCI- oder CaCI-Prozedur (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1 989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) cotransformiert: pRSET-PP4, welches ein Plasmid der pRSET-Familie ist (Schoepfer, Gene 1 24 ( 1 993), 83-85), das eine Gensequenz für AnnexinV unter der Kontrolle eines T7 Promotors und ein Ampicillinresistenzgen enthält, und pGP1 -2, das ein Gen für die T7 Polymerase und ein Kanamycinresistenzgen enthält (Studier und Moffat (1 996, supra) . Die Induktion der Bakteriophagen T7 RNA Polymerase führt zu einer starken Expression von Genen unter Kontrolle des T7 Promotors.The E.coli strain DSM 1 563 was co-transformed with 2 plasmids according to the RbCI or CaCI procedure (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1 989) Cold Spring Harbor Laboratory Press): pRSET-PP4, which is a Plasmid of the pRSET family is (Schoepfer, Gene 1 24 (1 993), 83-85), which contains a gene sequence for AnnexinV under the control of a T7 promoter and an ampicillin resistance gene, and pGP1 -2, which is a gene for the T7 polymerase and contains a kanamycin resistance gene (Studier and Moffat (1 996, supra). The induction of the bacteriophage T7 RNA polymerase leads to a strong expression of genes under the control of the T7 promoter.
Die Bakterien wurden unter selektiven Druck von 100 mg/l Ampicillin und 70 mg/l Kanamycin bei 30°C kultiviert. Bakterielle Kultivierungs- und Expressionsexperimente wurden wie folgt durchgeführt: 5 ml NMM mit 0,3 mmol/l Prolin wurden mit 5 μ\ transformierter E.coli DSM 1 563 Glyzerinkultur inokuliert und über Nacht bei 30°C wachsen gelassen. 1 ml der Übernachtkultur wurde dann als Inokulum für 100 ml vorgewärmtes (37 °C) NMM verwendet. 1 ml dieser Kultur wurde zur Inokulation von 100 ml NMM mit 0,05 mmol/l Prolin verwendet. Nach Verbrauch des Prolins (8-10 h Fermentation) wurde die Proteinsynthese in den Kulturen durch einen Temperatursprung von 30°C auf 42°C für eine halbe Stunde zusammen mit Zugabe von Thioprolin auf eine Endkonzentration von 1 mmol/l induziert. Dann wurden die Zeilen für 4 bis 6 Stunden zur Expression von Protein bei 30°C fermentiert.The bacteria were cultivated under selective pressure of 100 mg / l ampicillin and 70 mg / l kanamycin at 30 ° C. Bacterial cultivation and expression experiments were carried out as follows: 5 ml NMM with 0.3 mmol / l proline were inoculated with 5 μ transformed E.coli DSM 1 563 glycerol culture and grown overnight at 30 ° C. 1 ml of the overnight culture was then used as an inoculum for 100 ml of prewarmed (37 ° C) NMM. 1 ml of this culture was used to inoculate 100 ml of NMM with 0.05 mmol / l proline. After consumption of the proline (8-10 h fermentation) the protein synthesis in the cultures was induced by a temperature jump from 30 ° C to 42 ° C for half an hour together with the addition of thioproline to a final concentration of 1 mmol / l. Then the lines were fermented for 4 to 6 hours to express protein at 30 ° C.
Beispiel 3 Reinigung und ProteinausbeuteExample 3 Purification and Protein Yield
Die Reinigung von rekombinantem AnnexinV erfolgte nach der von Burger et al. ( 1 993) FEBS Lett. 329 (1 993), 25-28, publizierten Methode. Hierzu wurden die Bakterienzellen durch einen osmotischen Schock aufgeschlossen und das Protein in Gegenwart von Calcium reversibel an Liposomen gebunden. Nach Freisetzung aus den Liposomen durch EDTA wurde das Protein weiter durch lonenaustauschchromatographie an einer DEAE- Sepharosesäule, gepuffert mit 20 mmol/l Bis Tris pH 6,0, gereinigt und mit einem linearen NaCl Gradienten (0-200 mmol/l) eluiert. Die Reinheit des rekombinanten Proteins wurde durch SDS-PAGE und Silberanfärbung, HPLC- Profilanalyse und Elektrospraymassenspektrum-Analyse gezeigt. Die Konzentrationen von Proteinproben wurden unter Verwendung eines Perkin- Elmer Lambda 1 7 UV/VIS Spektrophotometers bestimmt unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 22500 I mol"1 cm"1 wie aus der Aminosäurezusammensetzung berechnet. Die Ausbeuten an Thioprolin enthalten- dem Annexin waren 8 bis 10 mg pro Liter der Kultur.The recombinant AnnexinV was purified according to the method described by Burger et al. (1 993) FEBS Lett. 329 (1,993), 25-28, published method. For this purpose, the bacterial cells were disrupted by an osmotic shock and the protein was reversibly bound to liposomes in the presence of calcium. After release from the liposomes by EDTA, the protein was further purified by ion exchange chromatography on a DEAE-Sepharose column, buffered with 20 mmol / l to Tris pH 6.0, and eluted with a linear NaCl gradient (0-200 mmol / l). The purity of the recombinant protein was demonstrated by SDS-PAGE and silver staining, HPLC profile analysis and electrospray mass spectrum analysis. The concentrations of protein samples were determined using a Perkin-Elmer Lambda 17 UV / VIS spectrophotometer assuming an extinction coefficient of 22500 I mol "1 cm " 1 as calculated from the amino acid composition. The yields of thioproline-containing annexin were 8 to 10 mg per liter of the culture.
Beispiel 4 ProteinanalyseExample 4 Protein Analysis
AnnexinV enthält fünf oberflächenlokalisierte Prolinreste. Pro 1 3 ist nahe dem N-Terminus in einem flexiblen Schwanz lokalisiert; Pro87, Pro 1 1 9 und Pro248 befinden sich jeweils in zwei Aminosäurereste langen Schleifen, die Helices miteinander verbinden, und Pro 1 63 befindet sich in einer langen Schleife, die aus neun Aminosäureresten besteht.AnnexinV contains five surface localized proline residues. Pro 1 3 is located near the N-terminus in a flexible tail; Pro87, Pro 1 1 9 and Pro248 are each in two amino acid residues long loops that connect helices, and Pro 1 63 is in a long loop consisting of nine amino acid residues.
Der erfolgreiche Einbau von Thioprolin in AnnexinV wurde durch massen- spektrometrische Analyse bestätigt (erwartete Molekülmasse des Proteins: 35897 Da; gefunden: 35891 ± 4 Da) . Eine Aminosäureanalyse durch HPLC ergab das Fehlen von Prolin und eine Zunahme des Seringehalts aufgrund der gleichen Retentionszeit für Serin und Thioprolin, was durch unabhängige Messungen mit Thioprolin bestätigt wurde. Thioprolin-AnnexinV kristallisierte unter den gleichen Bedingungen wie Wildtyp AnnexinV. Durch kristallographische Untersuchungen wurde das Vorhandensein von Schwefel im Prolinring in der Elektronendifferenzdichtekarte F0-Fc aufgrund des Vorliegens einer zusätzlichen Dichte in der C-γ Position bestätigt.The successful incorporation of thioproline in AnnexinV was confirmed by mass spectrometric analysis (expected molecular weight of the protein: 35897 Da; found: 35891 ± 4 Da). An amino acid analysis by HPLC revealed the lack of proline and an increase in serine content due to the same retention time for serine and thioproline, which was confirmed by independent measurements with thioproline. Thioproline-AnnexinV crystallized under the same conditions as wild-type AnnexinV. The presence of sulfur in the proline ring in the electron difference density map F 0 -F c was confirmed by crystallographic investigations due to the presence of an additional density in the C-γ position.
Durch Analyse von Fluoreszenzspektren wurde eine 1 6 nm Rotverschiebung im Emissionsmaximum des Thioprolin-AnnexinV bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm gefunden. Bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm war die Rotverschiebung 5 nm. Durch Circulardichroismusspek- troskopie sowie durch Röntgenkristallographie konnten keine Änderungen der Sekundärstruktur bei Thioprolin enthaltendem AnnexinV gegenüber dem nativen Protein hergestellt werden. Im Gegensatz dazu führte eine thermische Denaturierung zu unterschiedlichen Entfaltungsprofilen für beide Proteine. A 16 nm red shift in the emission maximum of the thioproline annexinV was found at an excitation wavelength of 280 nm by analysis of fluorescence spectra. At an excitation wavelength of 295 nm, the red shift was 5 nm. No changes in the secondary structure of thioproline-containing AnnexinV compared to the native protein could be produced by circular dichroism spectroscopy or by X-ray crystallography. In contrast, thermal denaturation led to different unfolding profiles for both proteins.

Claims

Ansprüche Expectations
1 . Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff mindestens ein Aminosäureanalogon eingebaut in ein Trägerpeptid oder Trägerpolypeptid sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Hilfs-, Zusatz- oder Trägerstoffe enthält.1 . Pharmaceutical composition, characterized in that it contains, as active ingredient, at least one amino acid analogue incorporated into a carrier peptide or carrier polypeptide and, if appropriate, pharmaceutically customary auxiliaries, additives or carriers.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Aminosäureanalogon ein Chalkogenanalogon einer Aminosäure ausgewählt aus Methionin, Cystein, Serin, Threonin und Prolin ist.2. Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that the amino acid analogue is a chalcogen analogue of an amino acid selected from methionine, cysteine, serine, threonine and proline.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminosäureanalogon Thioprolin ist.3. Pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, characterized in that the amino acid analogue is thioproline.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminosäureanalogon ein Halogenanalogon einer Aminosäure ist.4. Pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, characterized in that the amino acid analogue is a halogen analogue of an amino acid.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der ein Aminosäureanalogon enthaltende Träger ein naturanaloges Peptid oder Polypeptid ist, das eine mit einem entsprechen- den Wildtyp-Polypeptid weitgehend identische Raumstruktur aufweist. 5. Pharmaceutical composition according to one of claims 1 to 4, characterized in that the carrier containing an amino acid analogue is a natural-analogous peptide or polypeptide which has a spatial structure largely identical to a corresponding wild-type polypeptide.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Säugerpeptid oder -polypeptid ist.6. Pharmaceutical composition according to one of claims 1 to 5, characterized in that the carrier is a mammalian peptide or polypeptide.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, das der Träger ein humanes Peptid oder Polypeptid ist.7. Pharmaceutical composition according to one of claims 1 to 6, characterized in that the carrier is a human peptide or polypeptide.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein rekombinantes Polypeptid ist.8. Pharmaceutical composition according to one of claims 1 to 7, characterized in that the carrier is a recombinant polypeptide.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein gewebespezifisches Peptid oder Polypeptid ist.9. Pharmaceutical composition according to one of claims 1 to 8, characterized in that the carrier is a tissue-specific peptide or polypeptide.
1 0. Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers für einen pharmakologi- schen Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Aminosäureanalogon in einen Träger ausgewählt aus Peptiden und Polypeptiden einbaut und den resultie- renden Träger in eine pharmazeutisch applizierbare Form bringt.1 0. Process for producing a precursor for a pharmacological active ingredient, characterized in that at least one amino acid analogue is incorporated into a carrier selected from peptides and polypeptides and the resulting carrier is brought into a pharmaceutically applicable form.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Einbau des Aminosäureanalogons in vivo in einer Wirtszelle erfolgt. 1 1 . Method according to claim 10, characterized in that the incorporation of the amino acid analogue takes place in vivo in a host cell.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 0 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Einbau des Aminosäureanalogons in den Träger die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle mit einer für den Träger kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer regulierbaren Expressionskontrollsequenz,2. The method according to any one of claims 1 0 or 1 1, characterized in that the incorporation of the amino acid analogue into the carrier comprises the steps: (a) providing a host cell with a nucleic acid encoding the carrier in operative linkage to a regulatable expression control sequence,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen die Transkription der für den Träger kodierenden Nukleinsäure zumindest weitgehend abgeschaltet ist,(b) cultivating the host cell under conditions in which the transcription of the nucleic acid encoding the carrier is at least largely switched off,
(c) Zugeben des Aminosäureanalogons und Induzieren der Expression des Trägers und(c) adding the amino acid analog and inducing expression of the carrier and
(d) Gewinnen des das Aminosäureanalogon enthaltenden Trägers aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium.(d) recovering the carrier containing the amino acid analogue from the host cell and/or the culture medium.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtszelle eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine E.coli Zelle verwendet.3. The method according to any one of claims 1 1 or 12, characterized in that a prokaryotic cell, in particular an E. coli cell, is used as the host cell.
4. Verfahren nach einem der Anspruch 1 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine für eine durch das Aminosäureanalogon zu ersetzende natürliche Aminosäure auxotrophe Wirtszelle verwendet und bei Schritt (a) die zu ersetzende natürliche Aminosäure dem Medium zusetzt.4. The method according to any one of claims 1 1 to 1 3, characterized in that a host cell which is auxotrophic for a natural amino acid to be replaced by the amino acid analogue is used and in step (a) the natural amino acid to be replaced is added to the medium.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als regulierbare Expressionskontrollsequenz einen Bakterio- phagen-Promotor verwendet und die Wirtszelle ein Gen für eine, den Promotor erkennende Bakteriophagen DNA-abhängige RNA-Polyme- rase enthält, welches in operativer Verknüpfung mit einer weiteren regulierbaren Expressionskontrollsequenz steht.1 5. The method according to any one of claims 1 1 to 14, characterized in that a bacteriophage promoter is used as the adjustable expression control sequence and the host cell contains a gene for a bacteriophage that recognizes the promoter, DNA-dependent RNA polymers. rase, which is operatively linked to another regulatable expression control sequence.
6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen T7 Promotor und ein T7 RNA-Polymerasegen verwendet.6. The method according to claim 1 5, characterized in that a T7 promoter and a T7 RNA polymerase gene are used.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als regulierbare Expressionskontrollsequenz einen Promotor verwendet, der von einer endogenen DNA-abhängigen RNA-Polyme- rase der Wirtszelle erkannt wird.7. The method according to any one of claims 1 1 to 1 4, characterized in that a promoter is used as the regulatable expression control sequence, which is recognized by an endogenous DNA-dependent RNA polymerase of the host cell.
8. Verfahren zur Verabreichung eines pharmakologisch wirksamen Aminosäureanalogons an einen Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine pharmakologisch wirksame Menge eines Trägerpeptids oder Trägerpolypeptids, das das Aminosäureanalogon als Bestandteil seiner Aminosäurenkette enthält, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs- Zusatz- oder Trägerstoffen verabreicht.8. A method for administering a pharmacologically active amino acid analogue to a patient, characterized in that a pharmacologically effective amount of a carrier peptide or carrier polypeptide, which contains the amino acid analogue as part of its amino acid chain, is administered, optionally together with pharmaceutically customary auxiliary, additives or carriers.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Patient aus Menschen und nichthumanen Säugern ausgewählt wird.1 9. The method according to claim 1 8, characterized in that the patient is selected from humans and non-human mammals.
20. Verwendung eines Aminosäureanalogons zur Herstellung eines Arzneimittelträgers ausgewählt aus Peptiden und Polypeptiden, der das Aminosäureanalogon als Wirkstoff eingebaut in die Peptid- oder Polypeptidkette des Trägers enthält. 20. Use of an amino acid analogue for the production of a drug carrier selected from peptides and polypeptides, which contains the amino acid analogue as an active ingredient incorporated into the peptide or polypeptide chain of the carrier.
21 . Verwendung eines mindestens ein Aminosäureanalogon enthaltenden Peptids oder Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels, welches als Wirkstoff das Aminosäureanalogon enthält.21. Use of a peptide or polypeptide containing at least one amino acid analogue for the production of a medicament which contains the amino acid analogue as an active ingredient.
22. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Thioprolinrest als Bestandteil seiner Aminosäurenkette enthält.22. Polypeptide, characterized in that it contains at least one thioproline residue as part of its amino acid chain.
23. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Molekülmasse > 1 0 kDa aufweist.23. Polypeptide according to claim 22, characterized in that it has a molecular mass > 1 0 kDa.
24. Polypeptid nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Säugerpolypeptid ist, das Thioprolinreste an denjenigen Positionen enthält, an denen sich normalerweise Prolinreste befinden.24. Polypeptide according to one of claims 22 or 23, characterized in that it is a recombinant mammalian polypeptide which contains thioproline residues at those positions at which proline residues are normally located.
25. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.25. Use of a polypeptide according to one of claims 22 to 24 for producing a pharmaceutical composition.
26. Verwendung nach Anspruch 25 für die Herstellung eines Antitumor- mittels.26. Use according to claim 25 for the production of an antitumor agent.
27. Verfahren zur Herstellung eines mindestens einen Thioprolinrest enthaltenden Polypeptids umfassend die Schritte:27. A method for producing a polypeptide containing at least one thioproline residue, comprising the steps:
(a) Bereitstellen einer Wirtszelle mit einer für ein Peptid oder Polypeptid mit mindestens einem Prolinrest kodierenden Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einer regulierbaren(a) Providing a host cell with a nucleic acid encoding a peptide or polypeptide with at least one proline residue in operative linkage to a regulatable one
Expressionskontrollsequenz, (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen die Transkription der für das Peptid oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäure zumindest weitgehend abgeschaltet ist,expression control sequence, (b) cultivating the host cell under conditions in which the transcription of the nucleic acid encoding the peptide or polypeptide is at least largely switched off,
(c) Zugeben von Thioprolin und Induzieren der Expression des Peptids oder Polypeptids und(c) adding thioproline and inducing expression of the peptide or polypeptide and
(d) Gewinnen des Peptids oder Polypeptids aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium. (d) recovering the peptide or polypeptide from the host cell and/or the culture medium.
PCT/EP1998/003398 1997-06-11 1998-06-05 Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins WO1998056824A2 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98936310A EP0998487A2 (en) 1997-06-11 1998-06-05 Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins
AU85363/98A AU8536398A (en) 1997-06-11 1998-06-05 Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19724670A DE19724670A1 (en) 1997-06-11 1997-06-11 Incorporation of pharmacologically active amino acid analogs into proteins
DE19724670.2 1997-06-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1998056824A2 true WO1998056824A2 (en) 1998-12-17
WO1998056824A3 WO1998056824A3 (en) 1999-04-08

Family

ID=7832171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/003398 WO1998056824A2 (en) 1997-06-11 1998-06-05 Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0998487A2 (en)
AU (1) AU8536398A (en)
DE (1) DE19724670A1 (en)
WO (1) WO1998056824A2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10255132A1 (en) * 2002-11-26 2004-07-15 Max Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition containing peptide that includes amino acid analog, useful for treating e.g. cancer, where the peptide binds to and enters only specific target cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017713A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 Rijksuniversiteit Groningen Pharmaceutical composition having site-specific delivery

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5061693A (en) * 1989-07-28 1991-10-29 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
JPH0940577A (en) * 1995-05-24 1997-02-10 Mitsui Toatsu Chem Inc Medicinal composition containing tripeptide or dipeptide

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017713A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 Rijksuniversiteit Groningen Pharmaceutical composition having site-specific delivery

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAI, J. P.F. ET AL.: "Utilization of peptide carrier system to improve intestinal absorption: ..." J. PHARM SCI., Bd. 81, Nr. 2, 1992, Seiten 113-116, XP000248774 *
DATABASE WPI Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 97-175616 XP002084209 & JP 09 040577 A (MITSUI TOATSU CHEM INC) , 24. Mai 1995 *
OKU, N. ET AL.: "Therapeutic efficacy of 5-fluorouracil prodrugs using endogenous serum proteins as carriers: ..." BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, Bd. 2375a, 1995, Seiten 181-184, XP000491409 *
SWAAN, P.W. ET AL.: "Prodrug approach using the intestinal peptide carrier" PHARM RES., Bd. 10, Nr. 10suppl., 1993, Seite s295 XP002084208 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE19724670A1 (en) 1998-12-24
AU8536398A (en) 1998-12-30
EP0998487A2 (en) 2000-05-10
WO1998056824A3 (en) 1999-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0885961B1 (en) Novel insulin derivatives with rapid onset of action
EP2229406B1 (en) Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
DE69020573T2 (en) PROCESS FOR INHIBITING STEM CELLS.
DE69021335T2 (en) GROWTH HORMON FUSION PROTEINS.
EP2229407B1 (en) Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
DE69007975T2 (en) FUSION PROTEIN CONSISTING OF GM-CSF AND IL-3.
EP0764172B1 (en) Synthetic peptide analogs of lung surfactant protein sp-c
DE102008003566A1 (en) New insulin analogs useful for treating diabetes
EP1222207B1 (en) C-peptide for the improved production of insulin and insulin analogues
DD268976A5 (en) Process for the preparation of human insulin analogs
DE69434909T3 (en) PREPARATION OF HUMANINE SULIN
DE3854678T2 (en) Human manganese superoxide dismutase and treatment procedure.
DE69033937T2 (en) Process for the production of genetic vectors for expression of the nerve growth factor in eukaryotic cells
EP0851926B1 (en) Variants of human recombinant interferon-gamma (rhu-ifn-gamma) having increased heat-stability
AT400443B (en) HUMAN MANGANESE SUPEROXIDE DISMUTASE CDNA, ITS EXPRESSION IN BACTERIA AND METHOD FOR OBTAINING ENZYMATICALLY ACTIVE, HUMAN MANGANESE SUPEROXIDE DISISMUTASE
DE69530404T2 (en) KERATINOCYTE GROWTH FACTOR ANALOGS
DD301724A9 (en) MUTANTS OF HUMAN INTERLEUKIN-3
AU757275B2 (en) Novel insulin analogs with enhanced zinc binding
DE69434997T2 (en) Human chondromodulin I protein
DE69737766T2 (en) COMPOSITIONS OF STEM CELL FACTOR (SCF) ANALOGS AND METHODS RELATED TO THEM
EP0870030A1 (en) Polypeptides with interleukin 16 activity, process for the preparation and use thereof
WO1998056824A2 (en) Incorporation of pharmacologically active amino acid analogues into proteins
DE68914397T2 (en) Human lymphotoxin.
DE69011465T2 (en) Use of human ADF (= Adult T-cell leukemia-derived factor) for the manufacture of drugs.
DE69132050T2 (en) COMPOSITIONS OF GROWTH FACTORS, PRODUCTION AND USE

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09451424

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998936310

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1999501549

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998936310

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 1998936310

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998936310

Country of ref document: EP