WO1998054356A1 - PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE β-D-GALACTOPIRANOSIL-XILOSAS UTILIZABLES PARA LA EVALUACION DIAGNOSTICA DE LA LACTASA INTESTINAL - Google Patents

PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE β-D-GALACTOPIRANOSIL-XILOSAS UTILIZABLES PARA LA EVALUACION DIAGNOSTICA DE LA LACTASA INTESTINAL Download PDF

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WO1998054356A1
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galactopyranosyl
xyloses
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Francisco Javier CAÑADA VICINAY
Alfonso Fernandez-Mayoralas Alvarez
Manuel Martin Lomas
Esther Montero Prieto
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • Intestinal lactase is the enzyme responsible for hydrolyzing lactose ingested in the diet into its monosaccharide components, glucose and galactose, so that they are absorbed from the intestine and metabolized.
  • Deficiency or low activity in intestinal lactase is rare as a congenital metabolic error, but it is a very common syndrome in adult humans.
  • milk consumption causes the appearance of gastric disorders such as flatus and diarrhea. Therefore, the determination of intestinal lactase activity is of importance in both pediatrics and gastroenterology.
  • Spanish patent ES-P-9502185 describes a simplified process for obtaining compound I together with the 2-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose regioisomers of formula II and 3-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D- Xylose of formula III.
  • This patent claims the use of ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xyloses I, II, and III, for the diagnostic evaluation of intestinal lactase, and it is observed that the disaccharides of formulas II and III are better substrates of intestinal lactase than the compound of formula I and that 3-O-meti I-lactose, although the latter are structurally more similar to lactose.
  • the process for obtaining compounds I, II and III according to patent ES-P-9502185 is carried out by the reaction of a D-xylose and a ⁇ -D-galactopyranoside substrate in the presence of a ⁇ -galactosidase enzyme, preferably the E. coli ⁇ -galactosidase, according to the reaction scheme
  • the present invention aims to improve the process described in Spanish patent ES-P-9502185, by obtaining reactions with high proportions of disaccharides II and III, better substrates of intestinal lactase than I, using enzymes from different sources.
  • the preparation, using the same procedure, of analog disaccharides containing a xylose residue of the L series is also described and claimed: the 2-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-L-xylose compounds (formula IV), 3- O- ⁇ -D-galactopyranosyl-L-xylose (formula V) and 4-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-L-xylose (formula VI).
  • IV, V, and VI are substrates of the intestinal lactase enzyme, leading after hydrolysis to D-galactose and L-xylose, the latter detectable by colorimetry. Therefore, compounds IV, V, VI are potentially usable in the diagnostic evaluation of intestinal lactase.
  • the process for obtaining the ⁇ -D-galactopyranosyl-D- and L-xyloses (compounds I-VI) disaccharides is carried out from D-xylose or L-xylose and a ⁇ -D-galactopyranoside substrate, preferably or -nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside or lactose, in the presence of a ⁇ -glycosidase enzyme.
  • the concentration of xylose is between 2 and 20 times the concentration of the donor ⁇ -D galactopyranosyl substrate.
  • the reaction medium is buffered water at pH 5.0 to 9.0, in the presence or absence of water miscible solvents such as acetonitrile, dimethylformamide or dimethylsulfoxide.
  • the reaction temperature can be any within the range 4 to 37 ° C, the progress being monitored by thin layer chromatography or gas chromatography.
  • the reaction can be stopped by freezing at -70 ° C and subsequent lyophilization, or by denaturing the enzyme by heating the reaction mixture at 100 ° C or by separating and recovering the enzyme of the reaction medium by ultrafiltration techniques.
  • the isolation of the disaccharides formed can be done either by filtration column with Sephadex G-10 or Biogel P2, or, more economically, with an active carbon column.
  • the eluent may be water or water-alcohol mixtures.
  • the ratio of disaccharides 1— III and IV-VI obtained from the chromatographic column was determined by gas chromatography with a chromatograph equipped with flame ionization detector and SE-54 capillary column (15 m long, 0.15mm internal diameter and 0.3 mm thick). A nitrogen flow of 1 mL / min was used in the analyzes.
  • the temperature program used was: initial temperature 160 ° C; initial time 2 min; temperature rise 5 ° C / min; final temperature 250 ° C.
  • the samples were analyzed after trimethylsilylation by the following protocol: an aliquot (10 ml) was frozen and lyophilized, pyridine (25 mL) was added to the dry residue, which contained as an internal reference benzyl xylopyranoside (1 mM) and til / -thmethylsilylimidazole (25 mL), and heating was continued at 60 ° C for 30 min.
  • the retention times of the peaks assignable to the different disaccharides were the following: benzyl xylopyranoside (internal reference): 13.39 min.
  • Example 1 Preparation of a mixture of 4-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose (disaccharide I), 2-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-D-xylose (disaccharide II) and 3-O- ⁇ - D- galactopyranosyl-D-xylose (disaccharide III)
  • o-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside (1g, 32mM
  • D-xylose 5g, 320mM
  • buffered water 26mM acetic acid, 100mM pyridine, pH 5.8
  • Sigma Aspergillus oryzae ⁇ -galactosidase 8.3 mg, 5.3 u / mg
  • Example 2 Preparation of a mixture of 2-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-L-xylose (disaccharide IV), 3-O- ⁇ -D-galactopyranoses N-L-xylose (disaccharide V) and 4-O- ⁇ - D- galactopyranosyl-L-xylose (disaccharide VI)

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Abstract

Procedimiento de la patente española P9502185, empleando enzimas de diferentes fuentes, para la obtención de compuestos IV, V y VI potencialmente utilizables en la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal.

Description

TITULO
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE β-D-GALACTOPIRANOSIL-XILOSAS
UTILIZABLES PARA LA EVALUACIÓN DIAGNÓSTICA DE LA LACTASA
INTESTINAL
SECTOR DE LA TÉCNICA
Sector ciencias de la salud, técnicas de diagnóstico de lactasa intestinal.
ESTADO DE LA TÉCNICA La lactasa intestinal es la enzima responsable de hidrolizar la lactosa ingerida en la dieta en sus componentes monosacáridos, glucosa y galactosa, para que sean absorbidos desde el intestino y metabolizados. La deficiencia o baja actividad en lactasa intestinal es rara como error metabólico congénito, pero es un síndrome muy frecuente en humanos adultos. En individuos que presentan baja actividad en lactasa intestinal, la consumición de leche les provoca la aparición de trastornos gástricos tales como flatos y diarreas. Por tanto, la determinación de la actividad lactasa intestinal es de importancia tanto en pediatría como en gastroenterología.
En la patente española ES-P-9001680 se describe un método no cruento, de fácil manejo y directo, para la evaluación de la actividad lactasa intestinal basado en la administración oral de un disacárido de estructura similar a la lactosa, la 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa de fórmula I, y análisis de la D- xilosa excretada en orina mediante colorimetría. Este método mejora a los descritos previamente en las patentes españolas ES-P-478590 y ES-P-482073, que hacen uso también de un disacárido derivado de la lactosa, la 3-O-metil- lactosa, pero que necesitan de un cromatógrafo de gases para la detección de la 3-O-metil-D-glucosa en la orina.
Figure imgf000004_0001
I
La patente española ES-P-9502185 describe un procedimiento simplificado de obtención del compuesto I junto con los regioisómeros 2-O-β-D- galactopiranosil-D-xilosa de fórmula II y 3-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa de fórmula III. En esta patente se reivindica el uso de las β-D-galactopiranosil-D- xilosas I, II, y III, para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, y se observa que los disacáridos de las fórmulas II y III son mejores sustratos de la lactasa intestinal que el compuesto de fórmula I y que la 3-O-meti I-lactosa, a pesar de que estas últimas son estructuralmente más parecidas a la lactosa.
Figure imgf000004_0002
El procedimiento de obtención de los compuestos I, II y III según la patente ES-P-9502185, se realiza mediante la reacción de una D-xilosa y un sustrato β-D-galactopiranósido en presencia de una enzima β-galactosidasa, preferentemente la β-galactosidasa de E. coli, según el esquema de reacción
Figure imgf000004_0003
β -D-Galactopiranósido D-Xilosa DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención tiene como objeto mejorar el procedimiento descrito en la patente española ES-P-9502185, mediante la obtención de reacciones con altas proporciones de los disacáridos II y III, mejores sustratos de la lactasa intestinal que I, empleando enzimas de diferentes fuentes. También se describe y reivindica la preparación, empleando el mismo procedimiento, de los disacáridos análogos que contienen un residuo de xilosa de la serie L: los compuestos 2-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa (fórmula IV), 3- O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa (fórmula V) y 4-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa (fórmula VI). Se ha observado que IV, V, y VI son sustratos de la enzima lactasa intestinal, conduciendo tras hidrólisis a D-galactosa y L-xilosa, ésta última detectable mediante colorimetría. Por tanto, los compuestos IV, V, VI son potencialmente utilizables en la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal.
Figure imgf000005_0001
IV VI
El procedimiento de obtención de los disacáridos β-D-galactopiranosil-D- y L-xilosas (compuestos I-VI) se lleva a cabo a partir de D-xilosa o L-xilosa y un sustrato β-D-galactopiranósido, preferentemente o-nitrofenil β-D- galactopiranósido o lactosa, en presencia de una enzima β-glicosidasa. La concentración de xilosa esta comprendida entre 2 y 20 veces la concentración del sustrato β-D galactopiranosilo dador. El medio de reacción es agua tamponada a pH de 5.0 a 9.0, en presencia o ausencia de codisolventes miscibles con agua tales como acetonitrilo, dimetilformamida o dimetilsulfóxido. La temperatura de la reacción puede ser cualquiera dentro del rango 4 a 37°C controlándose el progreso mediante cromatografía en capa fina o cromatografía de gases. Cuando se alcanza el máximo rendimiento de formación de disacáridos, la reacción se puede parar por congelación a -70°C y posterior liofilización, o por desnaturalización de la enzima por calentamiento de la mezcla de reacción a 100 °C o por separación y recuperación de la enzima del medio de reacción mediante técnicas de ultrafiltración. El aislamiento de los disacáridos formados puede realizarse bien por columna de filtración con Sephadex G-10 o Biogel P2, o bien, de forma más económica, con una columna de carbón activo. El eluyente puede ser agua o mezclas agua-alcohol.
Los resultados obtenidos con diversas enzimas comerciales: β- galactosidasa de testículo bovino, β-galactosidasa de hígado bovino, β- galactosidasa de Escherichia coli β-galactosidasa de Aspergillus oryzae y β- galactosidasa de Saccharomyces fragilis (todas ellas comercializadas por Sigma Aldrich España) y la propia enzima lactasa intestinal aislada de intestino de cordero, se resumen en las tablas I y II. Los resultados se presentan en términos de rendimientos de los compuestos l— III y IV-VI, empleando D- y L-xilosa respectivamente, referidos a la cantidad inicial de o-nitrofenil galactósido usado en la reacción. De los resultados recogidos en la columna "Relación de II + III / 1" de la tabla I puede observarse que las enzimas de testículo bovino, de Aspergillus oryzae, de Saccharomyces fragilis, y lactasa intestinal dieron valores más altos que la enzima de Escherichia coli, utilizada en la patente ES-P- 9502185. Por tanto, estas enzimas mejoran el procedimiento descrito en la patente ES-P-9502185 con vistas a obtener mezclas más enriquecidas en los disacáridos II y III.
La relación de disacáridos 1— III y IV-VI obtenidos de la columna cromatográfica se determinó por cromatografía de gases con un cromatógrafo equipado con detector de ionización de llama y columna capilar SE-54 (15 m de longitud, 0.15mm de diámetro interno y 0.3 mm de espesor). En los análisis se empleó un flujo de nitrógeno de 1 mL/min. El programa de temperaturas utilizado fue: temperatura inicial 160 °C; tiempo inicial 2 min; incremento de temperatura 5°C/min; temperatura final 250°C. Las muestras se analizaron tras trimetilsililación mediante el protocolo siguiente: una alícuota (10 mi) se congeló y liofilizó, al residuo seco se adicionó piridina (25 mL) que contenía como referencia interna bencil xilopiranosido (1 mM) y Λ/-thmetilsilimidazol (25 mL), y se continuó la calefacción a 60°C durante 30 min. Los tiempos de retención de los picos asignables a los distintos disacáridos fueron los siguientes: bencil xilopiranosido (referencia interna): 13,39 min.
4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, disacárido I: 22,10 y 22,23 min. 2-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, disacárido II: 19,83 y 20,96 min. 3-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, disacárido III: 19,67 min. 2-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa, disacárido IV: 19,67 y 21 ,04 min 3-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa, disacárido V: 19,54 y 19,83 min
4-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa, disacárido VI: 20,95 min Los siguientes ejemplos muestran el procedimiento de síntesis y las medidas de actividad de los compuestos IV-VI frente a la lactasa intestinal de cordero.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1 : Preparación de una mezcla de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa (disacárido I), 2-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa (disacárido II) y 3-O-β-D- galactopiranosil-D-xilosa (disacárido III) A una solución de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (1g, 32mM) y D- xilosa (5g, 320mM) en agua tamponada (26 mM ácido acético, 100mM piridina, pH 5.8), se adicionó β-galactosidasa de Aspergillus oryzae de Sigma (8,3 mg, 5,3 u/mg) y la mezcla se incubó a 37°C durante 50 min. Pasado este tiempo, la mezcla se calentó a 100°C durante 10 min, se concentró y el residuo resultante se introdujo en una columna de carbón activado utilizando un gradiente de agua-etanol 1 :0 -> 85:15. Se eluyeron primero los monosacá dos D-xilosa y galactosa, y seguidamente la mezcla de los disacáridos I, II y III. Se obtuvieron 370 mg de mezcla de disacáridos (36% relativo a los equivalentes de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido iniciales), en una relación 1:11:111 de 1.0:9.0:8.5 respectivamente. Los disacáridos I, II y III se caracterizaron como se ha descrito anteriormente en la patente original ES-P-9502585.
Ejemplo 2: Preparación de una mezcla de 2-O-β-D-galactopiranosil-L-xilosa (disacárido IV), 3-O-β-D-galactopiranosN-L-xilosa (disacárido V) y 4-O-β-D- galactopiranosil-L-xilosa (disacárido VI)
A una solución de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (1g, 32mM) y L- xilosa (5g, 320mM) en agua tamponada (26mM ácido acético, 100mM piridina, pH 5.8), se adicionó β-galactosidasa de Aspergillus oryzae de Sigma (8,3 mg, 5,3 u/mg) y la mezcla se incubó a 37°C durante 50 min. Pasado este tiempo, la mezcla se calentó a 100°C durante 10 min, se concentró y el residuo resultante se introdujo en una columna de carbón activado utilizando un gradiente de agua-etanol 1 :0 -> 85:15. Se eluyeron primero los monosacáridos L-xilosa y galactosa, y seguidamente la mezcla de los disacáridos IV, V y VI. Se obtuvieron 404 mg de mezcla de disacáridos (39% relativo a los equivalentes de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido iniciales), en una relación IV:V:VI de 1 :4:10 respectivamente.
De las distintas fracciones que contenían los disacáridos IV, V y VI, pudieron separarse algunas con cada uno de ellos puro, que se utilizaron para caracterizarlos por RMN. Con objeto de caracterizar y determinar de forma inequívoca la regioquímica del enlace formado, las fracciones enriquecidas en cada uno de los disacáridos IV, V y VI se acetilaron y los productos resultantes se aislaron por HPLC semipreparativo (columna fase normal Siθ2, hexano-acetato de etilo 1 :1 , detección por índice de refracción). Posteriormente, se registró el espectro de 1 H-RMN (200 MHz, CDCI3) de los derivados obtenidos. Ensayo cinético de la hidrólisis in vitro de IV, V, y VI por la lactasa intestinal
Los disacáridos β-D-galactopiranosil-L-xilosas (compuestos IV, V y VI) y lactosa como referencia se incubaron en presencia de la lactasa intestinal de cordero a pH 6,0, según el método de A. Rivera-Sagredo, F.J. Cañada, O. Nieto, J. Jiménez-Barbero y M. Martín-Lomas, Eur. J. Biochem., 209 (1992) 415-422. Todos las β-D-galactopiranosil-L-xilosas fueron sustratos de la enzima y dieron lugar a D-galactosa y L-xilosa tras hidrólisis, con los siguientes resultados relativos a constantes de Michaelis (Km) y velocidades máximas (Vmax)-
Disacárido Km (mM) Vmax (%) lactosa 11 100 disacárido IV 36 17 disacárido V 4 53 disacárido VI 47 51

Claims

REIVINDICACIONES 1. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, caracterizado porque dicho procedimiento comprende: a) reacción de xilosa y un sustrato β-D-galactopiranósido en presencia de una enzima β-glicosidasa, siendo la concentración de xilosa de 2 a 20 veces superior a la del β-D-galactopiranósido, en un medio acuoso tamponado a pH comprendido entre 5,0 y 9,0 y a una temperatura comprendida entre 4 y 37°C. b) desactivación de la enzima β-glicosidasa cuando se alcanza el máximo rendimiento de formación de disacáridos detectado mediante cromatografía en capa fina. c) aislamiento de los disacáridos formados mediante filtración en columnas de relleno, utilizándose como eluyente agua o mezclas agua/alcohol.
2. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según la reivindicación 1 , caracterizado porque la xilosa empleada pertenece a la serie D.
3. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según la reivindicación 1 , caracterizado porque la xilosa empleada pertenece a la serie L
4. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según la reivindicación 1 , caracterizado porque el β-D-galactopiranósido utilizado es o- nitrofenil β-D-galactopiranósido.
5. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según la reivindicación 1 , caracterizado porque el β-D-galactopiranósido utilizado es lactosa.
6. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una β- galactosidasa de testículo bovino.
7. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una β- galactosidasa de hígado bovino.
8. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una β- galactosidasa de Escherichia coli.
9. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una β- galactosidasa de Aspergillus oryzae.
10. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una β- galactosidasa de Saccharomyces fragilis.
11. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la enzima β-glicosidasa es una lactasa intestinal.
12. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la desactivación de la enzima β- glicosidasa se realiza mediante calefacción a 100 °C.
13. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la desactivación de la enzima β- glicosidasa se realiza mediante congelación a -70 °C y posterior liofilización.
14. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en presencia de codisolventes miscibles con agua tales como acetonitrilo, dimetilformamida o dimetilsulfóxido.
15. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque las columnas de filtración para el aislamiento de los disacáridos están rellenas con Sephadex G-10 ó Biogel P-2.
16. Procedimiento enzimático de obtención de β-D-galactopiranosil-xilosas utilizables para la evaluación diagnóstica de la lactasa intestinal, según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque las columnas de filtración para el aislamiento de los disacáridos están rellenas con carbón activo.
17. Utilización de β-D-galactopiranosil-xilosas obtenidas mediante un procedimiento según las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque las β-D- galactopiranosil-xilosas obtenidas se administran por vía oral y conducen a la aparición en orina de xilosa que, valorada espectrofotométricamente, se utiliza de una manera específica, rutinaria, incruenta y sencilla para la evaluación diagnóstica de las deficiencias en actividad en lactasa.
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PCT/ES1998/000138 WO1998054356A1 (es) 1997-05-28 1998-05-14 PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE β-D-GALACTOPIRANOSIL-XILOSAS UTILIZABLES PARA LA EVALUACION DIAGNOSTICA DE LA LACTASA INTESTINAL

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