WO1998044972A2 - Device for isolating particles, especially cells - Google Patents

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WO1998044972A2
WO1998044972A2 PCT/DE1998/001007 DE9801007W WO9844972A2 WO 1998044972 A2 WO1998044972 A2 WO 1998044972A2 DE 9801007 W DE9801007 W DE 9801007W WO 9844972 A2 WO9844972 A2 WO 9844972A2
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capillary
cannula
vessel
cell
manipulator
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WO1998044972A3 (en
Inventor
Klaus-Michael Debatin
Christian Beltinger
Gerd RÜHLE
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B01L3/0217—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type
    • B01L3/022—Capillary pipettes, i.e. having very small bore

Definitions

  • the invention relates to a device for isolating particles, in particular cells, with a capillary for transporting the particle or particles.
  • the relevant cell is first released using the microdissection and then using the relevant cell
  • Fine steel cannulas are particularly suitable for microdissection.
  • transfer of the released cell with steel cannulas into a vessel is hampered by adhesive or electrostatic forces, and repeated, time-consuming attempts are usually required to attach the cell to the needle.
  • the needle is moved from the object glass in the vicinity of the reaction vessel, the cell is often lost and when the cell is inserted into the reaction vessel, electrostatic forces often push the cell off the needle.
  • Steel cannulas are also unsuitable for aspiration of cells due to the thickness of the wall, the length of the tip and the size of the opening.
  • glass capillaries are very well suited for the aspiration of microdissected cells. Because of their fragility, they are only very suitable for microdissection. Inserting the glass capillary with the aspirated cell into a reaction vessel to eject the cell often leads to the loss or contamination of the cell and is very time-consuming.
  • the invention has for its object to develop a generic device that shortens the time required for cell extraction and is easy to use.
  • the object is achieved in particular with a generic device in which a cannula is arranged around the capillary, in which the capillary can be displaced along its longitudinal axis.
  • Guiding the capillary in a cannula has the advantage that the cannula can be made of a firmer material and is used for microdissection.
  • the fine capillary is guided in a protected manner in the cannula and can also be used for microdissection or to support it, and secondly the capillary is used to hold the particle or cell.
  • the displaceability of the capillary in the cannula allows the cannula to be used exclusively for microdissection when the capillary is withdrawn.
  • the capillary which is moved out towards the front can also be used for microdissection. However, it primarily serves to aspirate the particle.
  • capillary and cannula described thus connects the micro-dissection needle and aspiration capillary and allows both work steps to be carried out with a single device.
  • the capillary can be rotated about its longitudinal axis in the cannula.
  • the often irregular opening of the capillary can thus be placed on a dissected cell in such a way that its aspiration into the capillary is effortless succeed.
  • the production of glass capillaries and metal cannulas has proven particularly useful in practice.
  • the extremely fine glass capillary is protected by the harder metal cannula with its larger diameter.
  • the metal cannula has a front end with a tip.
  • one end of the capillary opens directly into an essentially closed vessel. This allows the cell or any particle to be conveyed into the capillary in the capillary after it has been taken up into the capillary.
  • the closed vessel has a lid element with a capillary opening and a pneumatic opening.
  • the capillary opening serves to introduce the capillary into the vessel and the pneumatic opening to create a negative pressure in the vessel through which the particle can be sucked into the vessel with a drop of liquid.
  • a simple operation of the device is achieved with a manipulator that holds the cannula, the capillary on the same manipulator along the
  • the capillary can be axially displaced relative to the cannula in order to move the capillary out of the cannula to the dissected object.
  • This manipulator is advantageously designed in such a way that the cannula and the capillary are arranged together by means of the manipulator so as to be pivotable about an axis. This allows the capillary and cannula to be easily and quickly guided into the field of view of a microscope and removed from the field of view again.
  • a simple construction of the micromanipulator is achieved in that the axis, about which the cannula and capillary are arranged pivotably, is arranged essentially vertically.
  • the manipulator is made considerably easier by a positioning device which enables precise positioning in the field of view and focus of a microscope above an object. It is particularly advantageous if the positioning device has a latching device which can be adjusted in such a way that it allows simple, quick, rough adjustment of the entire device.
  • FIG. 1 shows a perspective illustration of a receptacle with capillary and cannula
  • FIG. 2 is a perspective view of a micromanipulator with a receptacle, capillary and cannula
  • FIG. 3 schematically shows the handling of the device according to the invention in 3 steps (1st embodiment)
  • FIG 4 shows schematically in 3 steps the handling of the device according to the invention (2nd embodiment).
  • FIG. 1 shows the device 1 without a manipulator 2 (see FIG. 2). It consists of the glass capillary 3, which is guided in a steel cannula 4 and with one end 5 extends into a vessel 6.
  • the vessel 6 is essentially closed and has only one capillary opening 7 through which the capillary ins
  • Vessel is guided, and a pneumatic opening 8 through which an angle tube or a hose 9 can be connected to the vessel.
  • Capillary opening 7 and pneumatic opening 8 are arranged in a cover element 10 which can be connected in a gas-tight manner to a hollow body part 11.
  • an end cover 1 2 is provided, which can be placed on the cover part 10 in such a way that it covers the capillary opening 7 and the pneumatic opening 8.
  • the cannula 4 has a front end 1 4 with a tip 1 5 and at its opposite end 1 6 a perforated plastic plug 17 is fastened, in which the capillary 3 runs.
  • FIG. 1 The device parts shown in Figure 1 are in a micromanipulator 2 - see. Figure 2 - held.
  • This micromanipulator 2 consists essentially of a foot 1 8 to which an arm 19 is rotatably attached.
  • the foot 1 8 is attached to the countertop of an inverted microscope and has a vertical axis 20, about which is fixed to a disk 21 by means of a knurled nut.
  • Stigt arm 1 9 is rotatably mounted.
  • a mandrel 22 On the underside of the disk 21, a mandrel 22 is shown enlarged, which can be snapped into a groove 23.
  • the plastic plug 17 to which the cannula 4 is fastened is inserted into the arm 19.
  • the vessel 6 serving as a cell trap with the capillary 3 is around the
  • a vessel holder 26 is rotated about the axis 24 using a knurled nut 25.
  • a fine drive 27 is arranged between the vessel holder 26 and the arm 19, which allows the container 6 and thus the cannula 3 to be displaced along the axis 24 with a screw 28.
  • the glass capillary 3 which in practice has an outer diameter of 80 ⁇ m and an inner diameter of 40 ⁇ m, is first arranged in the steel cannula 4 in such a way that its front end 29 is completely inside the cannula 4.
  • the cannula 4 has an inner diameter of approximately 1,550 ⁇ m.
  • a small drop of liquid 30 at the front end 29 of the glass capillary 3 makes it easier to later take up a cell 31.
  • the capillary 3 is advanced by means of the screw 28 through the fine drive 27 of the micromanipulator so far inside the cannula 4 until the front end 29 of the glass capillary 3 is in the vicinity of the detached cell or cells. If necessary, the glass capillary 3 is rotated about its longitudinal axis 24 by means of the knurled nut 25, so that its opening is located directly on the cell (FIG. 3b). By suction on Tube 9 of the vessel 6, the cell 31 is aspirated into the glass capillary 3 ( Figure 3c).
  • the glass capillary 3 can also be extended initially in order to microdissect it. This is due to the stable and protective
  • the cannula with capillary is pulled away from the preparation and the manipulator arm 19 is pivoted away to the side.
  • the vessel is connected via the hose 9 to a manual piston pump, by means of which a vacuum can be generated in the vessel 6, which exerts a suction in the direction of the arrow 32 on the liquid drop 30 with the mobilized cell 31.
  • a vacuum can be generated in the vessel 6, which exerts a suction in the direction of the arrow 32 on the liquid drop 30 with the mobilized cell 31.
  • the capillary 3 and the vessel 6 can be centrifuged at 4,000 rpm in a table centrifuge after the cannula has been removed.
  • the cell is then covered in oil at the bottom of the reaction vessel 6.
  • the vessel 6 is removed from the cover element 10, closed with the end cover 1 2 and supplied for further use.
  • the micromanipulator 2 is attached to the work surface of an inverted microscope.
  • the slight pivoting of the arm 1 9 about the axis 20 facilitates loading with the vessel 6, the capillary 3, and the cannula 4.
  • the locking mechanism 22, 23 is set so that the tip 1 5 of the cannula 4 is precisely positioned when it is locked in the field of view slightly above the object and in focus. As a result, the tip does not have to be laboriously re-inserted into the device each time it is swung in after loading or emptying the device
  • the glass capillary opens into a pneumatic tube and a reaction vessel slide is attached to the micromanipulator arm (Fig. 4). With the reaction slide retracted, dissection and aspiration is unhindered (FIG. 4a). The micromanipulation arm is then swung out, the reaction vessel slide extended and a reaction vessel clamped (FIG. 4b). Without touching the capillary and cannula, the reaction vessel slide with the reaction vessel can now be pushed back and the cell after swiveling the
  • Manipulatorarmes are ejected pneumatically into the reaction vessel under microscopic control (Fig. 4c).
  • the device is particularly suitable for the molecular diagnosis of cancer and hereditary diseases on the basis of cytology and histology preparations. It also makes molecular diagnostics from morphological preparations practicable for routine clinical laboratories. The exact determination of the findings plays an important role in particular because the morphological findings lead to far-reaching consequences for the patient, such as surgery, chemotherapy or radiation. Additional, objective parameters are therefore required to assess histological and cytological specimens. Molecular analysis lends itself as such. For such analyzes, cells have to be removed from a histological or cytological preparation. With the device according to the invention it is now possible not to destroy the preparation, which in most cases consists of only a few cells, and nevertheless to be able to make further analysis, for example by means of PCR, accessible.
  • Another area of application of the device according to the invention is
  • fetal cells e.g. erythroblasts
  • the device is useful for obtaining single oocytes, spermatids, blastocysts or embryo cells for pre-implantation diagnosis in in-vitro fertilization in humans and in the context of animal breeding.

Abstract

The invention relates to a device for the microdissection and aspiration of cells. According to the invention, a glass capillary is positioned in a steel hollow needle. The glass capillary can be moved inside this steel hollow needle along its longitudinal axis. The glass capillaries and hollow needles are preferably positioned with a single micromanipulator. The invention makes cells substantially easier to obtain and reduces the time required to a few minutes. This makes it possible for clinical routine laboratories to use molecular diagnosis based on morphological preparations as well.

Description

Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Device for isolating particles, in particular from
ZellenCells
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Zellen, mit einer Kapillare zum Transport des oder der Partikel.The invention relates to a device for isolating particles, in particular cells, with a capillary for transporting the particle or particles.
Bei Vorrichtungen zur Isolation von Partikeln, wie beispielsweise zur Isolation und Aufnahme von einzelnen Zellen klinischer Präparate, wird zunächst mittels der Mikrodissection die relevante Zelle freigestellt und anschließend mittels derIn the case of devices for isolating particles, such as for isolating and taking up individual cells from clinical preparations, the relevant cell is first released using the microdissection and then using the
Aspiration vom klinischen Präparat entfernt.Aspiration removed from the clinical specimen.
Zur Mikrodissection eignen sich vor allem feine Stahlkanülen. Ein Transfer der freigestellten Zelle mit Stahlkanülen in ein Gefäß wird jedoch durch adhäsions- oder elektrostatische Kräfte behindert und es bedarf daher meist wiederholter, zeitraubender Versuche, um die Zelle an die Nadel zu heften. Beim Bewegen der Nadel vom Objektglas in die Nähe des Reaktionsgefäßes geht dann die Zelle häufig verloren und beim Einführen der Zelle in das Reaktionsgefäß stoßen oft elektrostatische Kräfte die Zelle von der Nadel. Auch zur Aspiration von Zellen eignen sich Stahlkanülen wegen der Dicke der Wandung, der Länge der Spitze sowie der Größe der Öffnung nicht.Fine steel cannulas are particularly suitable for microdissection. However, transfer of the released cell with steel cannulas into a vessel is hampered by adhesive or electrostatic forces, and repeated, time-consuming attempts are usually required to attach the cell to the needle. When the needle is moved from the object glass in the vicinity of the reaction vessel, the cell is often lost and when the cell is inserted into the reaction vessel, electrostatic forces often push the cell off the needle. Steel cannulas are also unsuitable for aspiration of cells due to the thickness of the wall, the length of the tip and the size of the opening.
Andererseits eignen sich Glaskapillaren sehr gut zur Aspiration mikrodissezierter Zellen. Wegen ihrer Zerbrechlichkeit eignen sie sich jedoch nur sehr beschränkt zur Mikrodissection. Das Einführen der Glaskapillare mit der aspirierten Zelle in ein Reaktionsgefäß zum Ausstoßen der Zelle führt häufig zum Verlust oder zu einer- Kontamination der Zelle und ist sehr zeitaufwendig.On the other hand, glass capillaries are very well suited for the aspiration of microdissected cells. Because of their fragility, they are only very suitable for microdissection. Inserting the glass capillary with the aspirated cell into a reaction vessel to eject the cell often leads to the loss or contamination of the cell and is very time-consuming.
Außerdem ist der Umgang mit einer Nadel und einer Kapillaren, die jeweils von einem Mikromanipulator geführt werden unter dem Mikroskop sehr schwierig. Aus diesem Grunde hat die molekulare Diagnostik, die nur eine einzelne Zelle benötigt, bisher nur geringe Verbreitung gefunden.It is also very difficult to handle a needle and a capillary, which are each guided by a micromanipulator, under the microscope. For this reason, molecular diagnostics, which only require a single cell, have so far found little use.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine gattungsgemäße Vorrichtung zu entwickeln, die den Zeitaufwand zur Zellgewinnung verkürzt und einfach handzuhaben ist.The invention has for its object to develop a generic device that shortens the time required for cell extraction and is easy to use.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.This object is achieved by a device according to claim 1. Advantageous refinements result from the subclaims.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe insbesondere mit einer gattungsgemäßen Vorrichtung gelöst, bei der um die Kapillare eine Kanüle angeordnet ist, in der die Kapillare längs ihrer Längsachse verschiebbar ist.According to the invention, the object is achieved in particular with a generic device in which a cannula is arranged around the capillary, in which the capillary can be displaced along its longitudinal axis.
Die Führung der Kapillare in einer Kanüle bringt den Vorteil, daß die Kanüle in einem festeren Werkstoff ausgeführt sein kann und der Mikrodissection dient. In der Kanüle ist die feine Kapillare geschützt geführt und kann zum einen ebenfalls zur Mikrodissection genutzt werden oder diese unterstützen und zum anderen dient die Kapillare der Aufnahme des Partikels bzw. der Zelle.Guiding the capillary in a cannula has the advantage that the cannula can be made of a firmer material and is used for microdissection. The fine capillary is guided in a protected manner in the cannula and can also be used for microdissection or to support it, and secondly the capillary is used to hold the particle or cell.
Die Verschiebbarkeit der Kapillare in der Kanüle ermöglicht es, bei zurückgezogener Kapillare die Kanüle ausschließlich zur Mikrodissection zu verwenden. Die nach vorne herausgefahrene Kapillare kann ebenfalls zur Mikrodissection eingesetzt werden. Sie dient jedoch vor allem der Aspiration des Partikels.The displaceability of the capillary in the cannula allows the cannula to be used exclusively for microdissection when the capillary is withdrawn. The capillary which is moved out towards the front can also be used for microdissection. However, it primarily serves to aspirate the particle.
Die beschriebene Kombination aus Kapillare und Kanüle verbindet somit Mikro- dissectionsnadel und Aspirationskapillare und erlaubt es, mit einer einzigen Vorrichtung beide Arbeitsschritte durchzuführen.The combination of capillary and cannula described thus connects the micro-dissection needle and aspiration capillary and allows both work steps to be carried out with a single device.
Vorteilhaft ist es, wenn die Kapillare in der Kanüle um ihre Längsachse verdrehbar ist. Damit kann die oft unregelmäßige Öffnung der Kapillare so an eine dissezierte Zelle plaziert werden, daß deren Aspiration in die Kapillare mühelos gelingt.It is advantageous if the capillary can be rotated about its longitudinal axis in the cannula. The often irregular opening of the capillary can thus be placed on a dissected cell in such a way that its aspiration into the capillary is effortless succeed.
Obwohl für Kapillare und Kanüle unterschiedlichste Werkstoffe in Frage kommen, hat sich in der Praxis die Herstellung der Kapillare aus Glas und die der Kanüle aus Metall besonders bewährt. Die extrem feine Glaskapillare wird dabei durch die härtere Metallkanüle mit ihrem größeren Durchmesser geschützt. Zur Erleichterung der Dissection weist die Metallkanüle ein vorderes Ende mit einer Spitze auf.Although different materials can be used for capillaries and cannulas, the production of glass capillaries and metal cannulas has proven particularly useful in practice. The extremely fine glass capillary is protected by the harder metal cannula with its larger diameter. To facilitate dissection, the metal cannula has a front end with a tip.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein Ende der Kapillare direkt in ein im wesentlichen geschlossenes Gefäß mündet. Dies erlaubt es, die Zelle oder ein beliebiges Partikel nach der Aufnahme in die Kapillare in der Kapillare weiter bis zum Aufnahmegefäß zu fördern.It is particularly advantageous if one end of the capillary opens directly into an essentially closed vessel. This allows the cell or any particle to be conveyed into the capillary in the capillary after it has been taken up into the capillary.
Ein Ausführungsbeispiel sieht vor, daß das geschlossene Gefäß ein Deckelelement mit einer kapillaren Öffnung und einer Pneumatiköffnung aufweist. Die kapillare Öffnung dient dem Einführen der Kapillare in das Gefäß und die Pneumatiköffnung der Erzeugung eines Unterdrucks im Gefäß, durch den das Partikel mit einem Flüssigkeitstropfen in das Gefäß hineingesaugt werden kann.An embodiment provides that the closed vessel has a lid element with a capillary opening and a pneumatic opening. The capillary opening serves to introduce the capillary into the vessel and the pneumatic opening to create a negative pressure in the vessel through which the particle can be sucked into the vessel with a drop of liquid.
Alternativ kann es wünschenswert erscheinen, die freigestellte Zelle nur in den distalsten Abschnitt der Kapillare aufzunehmen, um diese dann unter Kontrolle des Mikroskopes in ein Reaktionsgefäß auszustoßen. Nachteilen wie Möglichkeit des Verlustes oder Kontamination der Zelle stehen Vorteile wie die Möglichkeit der Verminderung der Kontamination durch gelöste Bestandteile duch Minimierung der Mitaufnahme von Flüssigkeit in die Kapillare sowie der mikroskopischen Kontrolle des Transfers der Zelle in das Reaktionsgefäß gegenüber.Alternatively, it may appear desirable to take up the free cell only in the most distal section of the capillary in order to then eject it into a reaction vessel under the control of the microscope. Disadvantages such as the possibility of loss or contamination of the cell are offset by advantages such as the possibility of reducing contamination by dissolved components by minimizing the entrainment of liquid in the capillary and the microscopic control of the transfer of the cell into the reaction vessel.
Eine einfache Bedienung der Vorrichtung wird mit einem Manipulator erreicht, der die Kanüle hält, wobei die Kapillare am gleichen Manipulator längs derA simple operation of the device is achieved with a manipulator that holds the cannula, the capillary on the same manipulator along the
Längsachse verschiebbar angeordnet ist. Dies ermöglicht es, mit einem einzigenLongitudinal axis is slidably disposed. This makes it possible with one
Manipulator Kapillare und Kanüle zu führen. Beispielsweise mittels einer Rädel- schraube und eines Gewindes ist an diesem Manipulator die Kapillare relativ zur Kanüle axial verschiebbar, um die Kapillare aus der Kanüle heraus zum dissezier- ten Objekt zu bewegen.Manipulator to guide capillary and cannula. For example, using a screw and a thread on this manipulator, the capillary can be axially displaced relative to the cannula in order to move the capillary out of the cannula to the dissected object.
Dieser Manipulator ist vorteilhafterweise so ausgebildet, daß die Kanüle und die Kapillare gemeinsam mittels des Manipulators um eine Achse schwenkbar angeordnet sind. Dies erlaubt es, Kapillare und Kanüle einfach und schnell in das Gesichtsfeld eines Mikroskops zu führen und aus dem Gesichtsfeld wieder zu entfernen.This manipulator is advantageously designed in such a way that the cannula and the capillary are arranged together by means of the manipulator so as to be pivotable about an axis. This allows the capillary and cannula to be easily and quickly guided into the field of view of a microscope and removed from the field of view again.
Ein einfacher Aufbau des Mikromanipulators wird dadurch erreicht, daß die Achse, um die Kanüle und Kapillare schwenkbar angeordnet sind, im wesentlichen senkrecht angeordnet ist.A simple construction of the micromanipulator is achieved in that the axis, about which the cannula and capillary are arranged pivotably, is arranged essentially vertically.
Die Bedienung des Manipulators wird durch eine Positioniereinrichtung wesentlich erleichtert, die eine punktgenaue Positionierung im Gesichtsfeld und Focus eines Mikroskops oberhalb eines Objekts ermöglicht. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Positioniereinrichtung eine Rasteinrichtung aufweist, die so eingestellt werden kann, daß sie eine einfache, schnelle Grobeinstellung der gesamten Vorrichtung erlaubt.Operation of the manipulator is made considerably easier by a positioning device which enables precise positioning in the field of view and focus of a microscope above an object. It is particularly advantageous if the positioning device has a latching device which can be adjusted in such a way that it allows simple, quick, rough adjustment of the entire device.
Ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie der Umgang mit dieser Vorrichtung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.An embodiment of the device according to the invention and the handling of this device is shown in the drawing and will be described in more detail below.
Es zeigt,It shows,
Figur 1 eine perspektivische Darstellung eines Aufnahmegefäßes mit Kapillare und Kanüle,FIG. 1 shows a perspective illustration of a receptacle with capillary and cannula,
Figur 2 eine perspektivische Darstellung eines Mikromanipulators mit Aufnahmegefäß, Kapillare und Kanüle und Figur 3 schematisch in 3 Schritten den Umgang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ( 1 . Ausführungsform)Figure 2 is a perspective view of a micromanipulator with a receptacle, capillary and cannula FIG. 3 schematically shows the handling of the device according to the invention in 3 steps (1st embodiment)
Figur 4 schematisch in 3 Schritten den Umgang mit der erfindungsgemä- ßen Vorrichtung (2. Ausführungsform).Figure 4 shows schematically in 3 steps the handling of the device according to the invention (2nd embodiment).
In Figur 1 ist die Vorrichtung 1 ohne Manipulator 2 (vgl. Figur 2) gezeigt. Sie besteht aus der Glaskapillare 3, die in einer Stahlkanüle 4 geführt ist und mit ihrem einen Ende 5 in ein Gefäß 6 hineinreicht. Das Gefäß 6 ist im wesentlichen verschlossen und hat nur eine Kapillarenöffnung 7, durch die die Kapillare insFIG. 1 shows the device 1 without a manipulator 2 (see FIG. 2). It consists of the glass capillary 3, which is guided in a steel cannula 4 and with one end 5 extends into a vessel 6. The vessel 6 is essentially closed and has only one capillary opening 7 through which the capillary ins
Gefäß geführt ist, und eine Pneumatiköffnung 8, durch die ein Winkelrohr oder ein Schlauch 9 am Gefäß anschließbar ist.Vessel is guided, and a pneumatic opening 8 through which an angle tube or a hose 9 can be connected to the vessel.
Kapillarenöffnung 7 und Pneumatiköffnung 8 sind in einem Deckelelement 10 angeordnet, das mit einem Hohlkörperteil 1 1 gasdicht verbindbar ist. Am Hohlkörperteil 1 1 ist ein Abschlußdeckel 1 2 vorgesehen, der so auf das Deckelteil 10 aufsetzbar ist, daß er die Kapillarenöffnung 7 und die Pneumatiköffnung 8 abdeckt.Capillary opening 7 and pneumatic opening 8 are arranged in a cover element 10 which can be connected in a gas-tight manner to a hollow body part 11. On the hollow body part 1 1, an end cover 1 2 is provided, which can be placed on the cover part 10 in such a way that it covers the capillary opening 7 and the pneumatic opening 8.
Während die Kapillare 3 weit in das Hohlkörperteil 1 1 des Gefäßes 6 eingeführt ist, endet das im Gefäß 6 befindliche Ende 1 3 des Schlauches 9 im oberen Bereich des Gefäßes 1 1 , d. h. in der Nähe des Deckelelementes 1 0.While the capillary 3 is inserted far into the hollow body part 11 of the vessel 6, the end 13 of the tube 9 located in the vessel 6 ends in the upper region of the vessel 11, ie. H. near the cover element 1 0.
Die Kanüle 4 weist ein vorderes Ende 1 4 mit einer Spitze 1 5 auf und an ihrem entgegengesetzten Ende 1 6 ist ein durchbohrter Plastikstopfen 1 7 befestigt, in dem die Kapillare 3 verläuft.The cannula 4 has a front end 1 4 with a tip 1 5 and at its opposite end 1 6 a perforated plastic plug 17 is fastened, in which the capillary 3 runs.
Die in Figur 1 gezeigten Vorrichtungsteile werden in einem Mikromanipulator 2 - vgl. Figur 2 - gehalten. Dieser Mikromanipulator 2 besteht im wesentlichen aus einem Fuß 1 8 an dem drehbeweglich ein Arm 1 9 befestigt ist. Der Fuß 1 8 ist an der Arbeitsplatte eines umgekehrten Mikroskops befestigt und hat eine senkrechte Achse 20, um die der mittels einer Rändelmutter an einer Scheibe 21 befe- stigte Arm 1 9 drehbeweglich gelagert ist. Auf der Unterseite der Scheibe 21 ist vergrößert ein Dorn 22 dargestellt, der in eine Nut 23 einrastbar ist.The device parts shown in Figure 1 are in a micromanipulator 2 - see. Figure 2 - held. This micromanipulator 2 consists essentially of a foot 1 8 to which an arm 19 is rotatably attached. The foot 1 8 is attached to the countertop of an inverted microscope and has a vertical axis 20, about which is fixed to a disk 21 by means of a knurled nut. Stigt arm 1 9 is rotatably mounted. On the underside of the disk 21, a mandrel 22 is shown enlarged, which can be snapped into a groove 23.
An dem Arm 1 9 ist der Plastikstopfen 1 7, an dem die Kanüle 4 befestigt ist, eingesteckt. Das als Zellfalle dienende Gefäß 6 mit der Kapillare 3 ist um dieThe plastic plug 17 to which the cannula 4 is fastened is inserted into the arm 19. The vessel 6 serving as a cell trap with the capillary 3 is around the
Längsachse 24 der Kapillare 3 drehbeweglich am Arm 1 9 befestigt. Um die Kapillare 3 um ihre Längsachse zu drehen, wird mit einer Rändelmutter 25 eine Gefäßhalterung 26 um die Achse 24 gedreht.Longitudinal axis 24 of the capillary 3 rotatably attached to the arm 1 9. In order to rotate the capillary 3 about its longitudinal axis, a vessel holder 26 is rotated about the axis 24 using a knurled nut 25.
Darüberhinaus ist zwischen der Gefäßhalterung 26 und dem Arm 1 9 ein Feintrieb 27 angeordnet, der es erlaubt, mit einer Schraube 28 den Behälter 6 und damit die Kanüle 3 längs der Achse 24 zu verschieben.In addition, a fine drive 27 is arranged between the vessel holder 26 and the arm 19, which allows the container 6 and thus the cannula 3 to be displaced along the axis 24 with a screw 28.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Glaskapillare 3, die in der Praxis einen Außendurchmesser von 80μm und einen Innendurchmesser von 40μm aufweist, zunächst so in der Stahlkanüle 4 angeordnet, daß sich ihr vorderes Ende 29 vollständig innerhalb der Kanüle 4 befindet. Die Kanüle 4 hat einen Innendurchmesser von etwa 1 50 ym. Ein kleiner Flüssigkeitstropfen 30 am vorderen Ende 29 der Glaskapillare 3 erleichtert das spätere Aufnehmen einer Zelle 31 .When using the device according to the invention, the glass capillary 3, which in practice has an outer diameter of 80 μm and an inner diameter of 40 μm, is first arranged in the steel cannula 4 in such a way that its front end 29 is completely inside the cannula 4. The cannula 4 has an inner diameter of approximately 1,550 μm. A small drop of liquid 30 at the front end 29 of the glass capillary 3 makes it easier to later take up a cell 31.
Mit der Spitze 1 5 der Stahlkanüle 4 kann nun unter einem umgekehrten Mikroskop effizient das von einem Tropfen Flüssigkeit bedeckte Präparat disseziert werden, während die empfindliche Glaskapillare 3 vollständig geschützt im Inneren der Kanüle 4 liegt (Figur 3a) .With the tip 15 of the steel cannula 4, the preparation covered by a drop of liquid can now be efficiently dissected under an inverted microscope, while the sensitive glass capillary 3 lies completely protected inside the cannula 4 (FIG. 3a).
Nach erfolgreicher Mikrodissection wird die Kapillare 3 mittels der Schraube 28 durch den Feintrieb 27 des Mikromanipulators so weit innerhalb der Kanüle 4 vorgeschoben bis das vordere Ende 29 der Glaskapillare 3 sich in der Nähe der gelösten Zelle oder der gelösten Zellen befindet. Gegebenenfalls wird die Glaskapillare 3 mittels der Rändelmutter 25 um ihre Längsachse 24 gedreht, so daß sich ihre Öffnung unmittelbar an der Zelle befindet (Figur 3b) . Durch Sog am Schlauch 9 des Gefäßes 6 wird die Zelle 31 in die Glaskapillare 3 aspiriert (Figur 3c).After successful microdissection, the capillary 3 is advanced by means of the screw 28 through the fine drive 27 of the micromanipulator so far inside the cannula 4 until the front end 29 of the glass capillary 3 is in the vicinity of the detached cell or cells. If necessary, the glass capillary 3 is rotated about its longitudinal axis 24 by means of the knurled nut 25, so that its opening is located directly on the cell (FIG. 3b). By suction on Tube 9 of the vessel 6, the cell 31 is aspirated into the glass capillary 3 (Figure 3c).
Alternativ dazu kann die Glaskapillare 3 auch schon initial ausgefahren werden, um mit ihr zu mikrodissezieren. Dies wird durch die stabile und schützendeAs an alternative to this, the glass capillary 3 can also be extended initially in order to microdissect it. This is due to the stable and protective
Führung in der Stahlkanüle 4 ermöglicht.Guiding in the steel cannula 4 allows.
Wenn die Zelle 31 in die Kapillare 3 aufgenommen ist, wird die Kanüle mit Kapillare vom Präparat weggezogen und der Manipulatorarm 1 9 seitlich wegge- schwenkt.When the cell 31 is received in the capillary 3, the cannula with capillary is pulled away from the preparation and the manipulator arm 19 is pivoted away to the side.
Das Gefäß ist über den Schlauch 9 mit einer manuellen Kolbenpumpe verbunden, durch die im Gefäß 6 ein Unterdruck erzeugbar ist, der einen Sog in Richtung des Pfeiles 32 auf den Flüssigkeitstropfen 30 mit der mobilisierten Zelle 31 ausübt. Dadurch wird die Zelle in der Glaskapillare 3 zum Gefäß 6 gefördert.The vessel is connected via the hose 9 to a manual piston pump, by means of which a vacuum can be generated in the vessel 6, which exerts a suction in the direction of the arrow 32 on the liquid drop 30 with the mobilized cell 31. As a result, the cell in the glass capillary 3 is conveyed to the vessel 6.
Alternativ dazu können die Kapillare 3 und das Gefäß 6 nach Abziehen der Kanüle in einer Tischzentrifuge mit 4.000 rpm zentrifugiert werden. Die Zelle befindet sich danach in Öl bedeckt am Boden des Reaktionsgefäßes 6. Das Gefäß 6 wird von dem Deckelelement 10 entfernt, mit dem Abschlußdeckel 1 2 verschlossen und der weiteren Verwendung zugeführt.Alternatively, the capillary 3 and the vessel 6 can be centrifuged at 4,000 rpm in a table centrifuge after the cannula has been removed. The cell is then covered in oil at the bottom of the reaction vessel 6. The vessel 6 is removed from the cover element 10, closed with the end cover 1 2 and supplied for further use.
Um die Kanüle 4 und Kapillare 3 punktgenau unter einem Mikroskop zu führen, ist der Mikromanipulator 2 an der Arbeitsplatte eines umgekehrten Mikroskopes befestigt. Das leichte Verschwenken des Armes 1 9 um die Achse 20 erleichtert die Beschickung mit dem Gefäß 6, der Kapillare 3, und der Kanüle 4. Der Arretiermechanismus 22, 23 ist so eingestellt, daß im eingerasteten Zustand sich die Spitze 1 5 der Kanüle 4 punktgenau im Gesichtsfeld etwas oberhalb des Objektes und im Focus befindet. Dadurch muß nicht bei jedem Einschwenken nach dem Beschicken oder dem Entleeren der Vorrichtung erneut die Spitze mühsam in dasIn order to guide the cannula 4 and capillary 3 precisely under a microscope, the micromanipulator 2 is attached to the work surface of an inverted microscope. The slight pivoting of the arm 1 9 about the axis 20 facilitates loading with the vessel 6, the capillary 3, and the cannula 4. The locking mechanism 22, 23 is set so that the tip 1 5 of the cannula 4 is precisely positioned when it is locked in the field of view slightly above the object and in focus. As a result, the tip does not have to be laboriously re-inserted into the device each time it is swung in after loading or emptying the device
Gesichtsfeld und in den Focus gebracht werden. Besonders praktisch für den täglichen Umgang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es, wenn als Gefäß 6 handelsübliche Reaktionsgefäße aus Kunststoff verwendet werden, auf die eine Einheit aus Glaskapillare 3, Deckelelement 1 0 und Schlauch 9 aufsetzbar ist. Diese Einheit kann gebrauchsfertig aus einer sterilen Verpackung auf das geöffnete Reaktionsgefäß aufgesteckt werden.Field of vision and focus. It is particularly practical for the daily handling of the device according to the invention if commercially available plastic reaction vessels are used as the vessel 6, onto which a unit made of glass capillary 3, cover element 10 and hose 9 can be placed. This unit can be attached to the opened reaction vessel from a sterile packaging ready for use.
Um die freigestellte Zelle nur in den distalsten Abschnitt der Kapillare aufzunehmen, mündet die Glaskapillare in einen Pneumatikschlauch und ein Reaktions- gefäßschieber ist am Mikromanipulatorarm angebracht (Fig. 4) . Mit zurückgefahrenem Reaktionsschieber wird ungehindert disseziert und aspiriert (Fig. 4a) . Danach wird der Mikromanipulationsarm ausgeschwenkt, der Reaktionsgefäßschieber ausgefahren und ein Reaktionsgefäß eingeklemmt (Fig. 4b) . Ohne daß die Kapillare und Kanüle berührt werden, kann nun der Reaktionsgefäßschieber mit Reaktionsgefäß zurückgeschoben und die Zelle nach Einschwenken desIn order to accommodate the released cell only in the most distal section of the capillary, the glass capillary opens into a pneumatic tube and a reaction vessel slide is attached to the micromanipulator arm (Fig. 4). With the reaction slide retracted, dissection and aspiration is unhindered (FIG. 4a). The micromanipulation arm is then swung out, the reaction vessel slide extended and a reaction vessel clamped (FIG. 4b). Without touching the capillary and cannula, the reaction vessel slide with the reaction vessel can now be pushed back and the cell after swiveling the
Manipulatorarmes unter mikroskopischer Kontrolle in das Reaktionsgefäß pneumatisch ausgestoßen werden (Fig. 4c).Manipulatorarmes are ejected pneumatically into the reaction vessel under microscopic control (Fig. 4c).
Die Vorrichtung eignet sich vor allem bei der molekularen Diagnostik von Krebs- erkrankungen und Erbkrankheiten auf der Grundlage von Zytologie- und Histologiepräparaten. Sie macht die molekulare Diagnostik aus morphologischen Präparaten auch für klinische Routinelabors praktikabel. Die exakte Befundermittlung spielt insbesondere deshalb eine wichtige Rolle, weil der morphologische Befund zu weitreichenden Konsequenzen für den Patienten, wie Operation, Chemo- therapie oder Bestrahlung führt. Es sind daher zusätzliche, objektive Parameter zur Beurteilung histologischer und zytologischer Präparate notwendig. Als solche bietet sich die molekulare Analyse an. Für solche Analysen müssen Zellen aus einem histologischen oder zytologischen Präparat entfernt werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es nun möglich, das in den meisten Fällen nur aus wenigen Zellen bestehende Präparat nicht zu zerstören und trotzdem eine weitergehende Analyse, z.B. mittels PCR, zugänglich machen zu können. Außerdem können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung einzelne verdächtige Zellen abgetrennt werden, ohne daß es zu einer Kontamination mit gesunden Zellen kommt. Außerdem ist nun durch die Möglichkeit des Zurückgreifens auf Zytologie- oder Histologiepräparate ein breiteres Spektrum an Untersuchungematerial der molekularen Analyse zugänglich, da die molekulare Analyse eigentlich immer auf frische oder zumindest gefrorene Zellen zurückgreifen mußte. So können dank der erfindungsgemäßen Vorrichtung Zellen aus histologischen oder zytologischen Präparaten jetzt besser der molekularen Analyse zugänglich gemacht werden und Mutationen sicherer nachgewiesen werden.The device is particularly suitable for the molecular diagnosis of cancer and hereditary diseases on the basis of cytology and histology preparations. It also makes molecular diagnostics from morphological preparations practicable for routine clinical laboratories. The exact determination of the findings plays an important role in particular because the morphological findings lead to far-reaching consequences for the patient, such as surgery, chemotherapy or radiation. Additional, objective parameters are therefore required to assess histological and cytological specimens. Molecular analysis lends itself as such. For such analyzes, cells have to be removed from a histological or cytological preparation. With the device according to the invention it is now possible not to destroy the preparation, which in most cases consists of only a few cells, and nevertheless to be able to make further analysis, for example by means of PCR, accessible. In addition, individual suspects can be found with the device according to the invention Cells are separated without contamination with healthy cells. In addition, the possibility of using cytology or histology specimens now makes a broader spectrum of examination material available for molecular analysis, since molecular analysis always had to resort to fresh or at least frozen cells. Thanks to the device according to the invention, cells from histological or cytological preparations can now be made more accessible to molecular analysis and mutations can be detected more reliably.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dieAnother area of application of the device according to the invention is
Gewinnung von fetalen Zellen (z.B. Erythroblasten) aus mütterlichen peripheren Blutausstrichen zum Zweck der nichtinvasiven Pränataldiagnostik. Außerdem ist die Vorrichtung nützlich zur Gewinnung von einzelnen Oozyten, Spermatiden, Blastozysten oder Embryozellen zur Präimplantationsdiagnostik bei der in-vitro- Fertilisation beim Menschen sowie im Rahmen der Tierzucht. Extraction of fetal cells (e.g. erythroblasts) from maternal peripheral blood smears for the purpose of non-invasive prenatal diagnosis. In addition, the device is useful for obtaining single oocytes, spermatids, blastocysts or embryo cells for pre-implantation diagnosis in in-vitro fertilization in humans and in the context of animal breeding.

Claims

Patentansprüche claims
1 . Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Zellen (31 ), mit einer Kapillare (3) zum Transport des oder der Partikel, dadurch gekennzeichnet, daß um die Kapillare (3) eine Kanüle (4) angeordnet ist, in der die Kapillare (3) längs ihrer Längsachse (24) verschiebbar ist.1 . Device for isolating particles, in particular cells (31), with a capillary (3) for transporting the particle or particles, characterized in that a cannula (4) is arranged around the capillary (3) in which the capillary (3 ) is displaceable along its longitudinal axis (24).
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (3) in der Kanüle (4) um ihre Längsachse (24) verdrehbar ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the capillary (3) in the cannula (4) is rotatable about its longitudinal axis (24).
3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (3) aus Glas und die Kanüle (4) aus Metall hergestellt ist.3. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the capillary (3) is made of glass and the cannula (4) made of metal.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ende (5) der Kapillare (3) in ein im wesentlichen geschlossenes Gefäß (6) mündet.4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that one end (5) of the capillary (3) opens into a substantially closed vessel (6).
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das geschlossene Gefäß (6) ein Deckelelement ( 1 0) mit einer kapillaren Öffnung (7) und einer Pneumatiköffnung (8) aufweist.5. The device according to claim 4, characterized in that the closed vessel (6) has a lid element (1 0) with a capillary opening (7) and a pneumatic opening (8).
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß ein Manipulator (2) die Kanüle (4) hält und die Kapillare (3) am gleichen Manipulator (2) längs ihrer Längsachse (24) verschiebbar angeordnet ist.6. Device according to one of the preceding claims, characterized in that a manipulator (2) holds the cannula (4) and the capillary (3) on the same manipulator (2) is arranged displaceably along its longitudinal axis (24).
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle (3) und die Kapillare (4) gemeinsam mittels des Manipulators (2) um eine7. The device according to claim 6, characterized in that the cannula (3) and the capillary (4) together by means of the manipulator (2)
Achse (20) schwenkbar angeordnet sind. Axis (20) are arranged pivotably.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Achse (20) im wesentlichen senkrecht angeordnet ist.8. The device according to claim 7, characterized in that the axis (20) is arranged substantially vertically.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Manipulator (2) eine Positioniereinrichtung aufweist, die eine punktgenaue Positionierung des vorderen Endes (29) der Kapillare (3) im Gesichtsfeld und Focus eines Mikroskops oberhalb eines Objekts ermöglicht.9. Device according to one of claims 6 to 8, characterized in that the manipulator (2) has a positioning device which enables precise positioning of the front end (29) of the capillary (3) in the field of view and focus of a microscope above an object.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionierungseinrichtung eine Rasteinrichtung (22, 23) aufweist. 10. The device according to claim 9, characterized in that the positioning device has a latching device (22, 23).
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