WO1998042835A1

WO1998042835A1 - Genes humains

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Publication number: WO1998042835A1
Application number: PCT/JP1998/001146
Authority: WO
Inventors: Takashi Tokino; Yusuke Nakamura
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 1998-10-01
Also published as: CA2284859C; EP1006186A1; AU6418498A; AU724681B2; JP3885177B2; CA2284859A1; JPH10262681A; EP1006186A4; US6255472B1

Description

明細書ヒト遺伝子技術分野

本発明は、ヒトの疾患の予防、診断及び治療の指針として有用な遺伝子、より詳しくは、癌抑制遺伝子 P 5 3による特異的な転写制御下にあるヒト遺伝子に関し、遺伝子診断並びに新しい治療法の開発に利用可能な遺伝子に関する。背景技術

癌抑制遺伝子 P 5 3の変異は、ヒト癌に見出される遺伝的変異において最も普遍的なものであり、ヒトの発癌に関与する最も重要な遺伝子のひとつとされている〔Hollstein M. , et al., Science (Washington DC), 253： 49-53, 1991) 。 p 5 3は転写因子として作用し〔Vogelstein B. , et al. , Cell, 70： 523-526, 1992) 、配列特異的な DN Aへの結合により、 p 2 1 /WAF 1、 MDM 2、 GADD 4 5、 BAX、 cyclin G、 I GF— BP 3、 PCNA及びGML等の各種遺伝子を活性化することが確認されている〔EI- Deiry W. S. , et al., Cell, 75： 817-825, 1993 ； Wu X. , et al. , Genes Dev. , 7^ 1126- 1132, 1993 ； Kastan M. B. , et al. , Cell, 71： 587-597, 1992 ； iyashita T. , et al. , Cell, 80: 293-299, 1995 ； Okamoto K.， et al. , EMBO. J. , 13: 4816-4822， 1994 ； Buckbinder し， et al. , Nature, 377^ 646-649, 1995 ； Morris G. E.， et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 93： 895-899， 1996 ； Furuhata T. , et al.， Oncogene, 13： 1965-1970, 1996 〕。このうち、 p 2 1 / WA F l 、 BAX及び GMLは、 p 5 3により仲介される細胞周期停止及びアポトーシスの主要因子と思われる。また、 GADD 4 5は、 DNA修復に重要な役割を果たしている。しかして、 p 5 3によって制御されている遺伝子の確認は、 p 5 3の生物生理学的機能の解明に必須である。すなわち、かかる p 5 3標的遺伝子の同定、解明は、癌研究の分野はもとより、その標的遺伝子を利用する新しい癌の診断乃至治療法の開発の面からも斯界で望まれているところである。

尚、本発明者等は、ヒトゲノムの機能的 p 5 3結合部位（functional _P53 -binding sites或は p 5 3タグサイト： p53- tagged sites) の近隣に ρ &'3標的遺伝子の候補を見出すようにデザィンされた方法を確立しており、この方法に関して、本発明者はその発現が抗癌剤の感受性に相関すると考えられている GML の単離に既に成功している〔Furuhata，T. , et al.， Oncogene, 13： 1965-1970, 1996〕。

本発明は、癌抑制遺伝子 p 5 3の標的遺伝子（p53-target genes) 或は p 5 3 誘導型遺伝子（p53- inducible genes) 、すなわち p 5 3による特異的な転写制御下にある新規なヒト遺伝子を見出し、これを同定して斯界で要望される所望の情報を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者等は、ヒトゲノ厶からの機能的 p 5 3夕グサイトのクローニングにおいて、野生型 p 5 3によって誘導される新規な遺伝子を単離し、これが上記目的に合致する新規なヒト遺伝子であることを見出し、ここに本発明を完成するに至つた o

すなわち、本発明は、配列番号： 1で示されるアミノ酸配列の全部又は一部をコードする塩基配列を含むヒト遺伝子、特に、配列番号： 2で示される塩基配列の全部又は一部を含む遺伝子を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、野生型 p 5 3による P 2 XM遺伝子発現の誘導を調べるために、野生型 p 5 3アレルを欠く大腸癌細胞株 SW 4 8 0における p 5 3誘導 mRNAの発現を RT— P CRにより解析した結果を示す写真である。

図 2は、ヒト組織における P 2 XMのノーザンブロット解析結果を示す写真でめる。

図 3及び 4は、 P 2 XM遺伝子のゲノム構成を示す図であり、図 3は 1 9 1遺伝子のェクソン/ィント口ン境界のヌクレオチド配列を示し、図 4の )-'はェクソン及び P 5 3結合部位の存在位置を示し、図 4の（c) はコスミド p 5 3— 1 9 1の p 5 3結合部位と p 5 3コンセンサス結合配列の比較を示す。

図 5及び 6は、各種 P 2 Xレセプターのァミノ酸配列を示す図である。

図 7は、別態様スプライシングバリアントを示す図である。

図 8〜 1 0は、骨格筋及び各種癌細胞株におけるスプライシングバリアントの発現を R T - PCRにより解析した結果を示す写真である。

図 1 1は、蛍光 in situ ハイブリダィゼーシヨンの結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、 I UPAC、 I UBの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。

本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「P 2 XM」と名付けられたクローンの有する DN A配列から演繹されるものを挙げることができ、その塩基配列は、配列表に示される通りである。

本発明遺伝子は、例えば配列番号： 2で示されるように、一本鎖 DNA配列で表されるが、本発明はかかる一本鎖 D N A配列に相補的な D N A配列やこれらの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、配列番号： 2に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコードされる各ァミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ選択した塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮することができる（Nucleic Acids Res. , 9ι 43-74， 1981 〕。

更に本発明遺伝子には、上記で示されるァミノ酸配列の一部のァミノ酸乃至ァミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変してなり、同様の機能を有する同効物をコードする DNA配列もまた包含される。これらポリペプチドの製造、改変 (変異）等は天然に生じることもあり、また翻訳後の修飾により或は遺伝子工学的手法により、天然の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を、例えばサイトスぺシフィック ' ミュー夕ゲネシス（Methods in Enzymology, 154^ p.350, 367 -382, 1987 ；同 p.468, 1983 ； Nucleic Acids Res. , 12： p.9441, 1984 ；続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 II」、日本生化学会編， P.105， 1986〕等の方法により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸ァミダイト法等の化学合成手段〔 Am. Chem. So ， 89： p.4801, 1967 ；同 p.3350, 1969; Science, 150: p.178, 1968 ； Tetrahedron Lett., 22: p.1859, 1981 ：同 24: p.245, 1983) により変異させた D N Aを合成したり、或はそれらの組合せにより収得することができる。

本発明にかかる配列番号： 2に示す遺伝子は、 p 5 3による特異的な転写制御下にある遺伝子であり、生体において p 5 3によりその発現が活性化され、癌の抑制に寄与すると考えられる。従って、本発明遺伝子の発現を目的とする遺伝子治療或は本発明遺伝子産物の生体への投与は、癌の予防及び治療に極めて有用であると考えられる。殊に、遺伝性の高発癌体質であるし i- Fraumeni症候群や、 P 5 3遺伝子の LOHや、変異が認められる各種の癌等の場合のように p 5 3による癌抑制機能が失われた結果として癌化に向かうとされる個体において、本発明遺伝子乃至同遺伝子産物の利用が好適と考えられる。

尚、上記した本発明遺伝子を利用する遺伝子治療或は同遺伝子産物を利用する癌処置においては、必ずしも本発明遺伝子又はそのコードする産物の全て、すなわち全配列からなる遺伝子或は産物が必要とされることはなく、本発明にかかる配列番号： 2に示す遺伝子における所望の機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記したそれらの改変体或はそれらの一部配列からなる遺伝子或は産物が良好に使用できる。

本発明遺伝子を利用して、すなわち例えば、これを微生物のベクターに組込み、形質転換された微生物を培養することによって、上記各遺伝子でコードされる P 5 3関連蛋白を容易にかつ安定して製造することができる。

また本発明の遺伝子を利用して得られる各蛋白を用いて、特異抗体を作成することもできる。ここで抗原として用いられるコンポーネントとしては、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生される蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、それぞれの蛋白の精製、測定、識別等に有利に利用できる。

本発明遺伝子は、本発明によって開示された配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造できる〔Molecular Cloning 2nd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；続生化学実験講座「遺伝子研究法し Π、 IIIJ 、日本生化学会編（1986) 等参照〕。

例えば、ヒト c DNAライブラリー（各遺伝子の発現される適当な起源細胞より常法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の適当なプローブゃ抗体を用いて所望クローンを選択することができる〔Pro Natl. Acad. Sci. USA., 78： 6613, 1981 ； Science, 222： 778, 1983 等〕。

上記において、起源細胞としては、目的の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示され、これらからの全 RN Aの分離、 mRNAの分離や精製、 cDNAへの変換（合成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、 c DNAライブラリ一は市販されてもおり、本発明においてはそれら c D N Aライブラリー、例えばクローンテック社 (Clontech Lab. Inc. ) 等より市販の各種 c DNAライブラリ一等を用いることもできる。

c DNAライブラリ一からの本発明遺伝子のスクリ一二ングは、前記通常の方法に従い実施できる。該スクリーニング方法としては、例えば c DNAの産生する蛋白質に対して、該蛋白質特異抗体を使用した免疫的スクリ一二ングにより、対応する c DNAクローンを選択する方法、目的の DN A配列に選択的に-'結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼ一ション、コロニ一ハイブリダイゼーション等ゃこれらの組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の DN A配列に関する情報をもとにして化学合成された DN A配列等を用いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断片もかかるプローブとして利用できる。

更に各細胞、組織より抽出、単離精製された天然抽出物の部分アミノ酸配列情報に基づき、センス ' プライマー、アンチセンス 'プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。

また、本発明遺伝子の取得に際しては、 PCR法（Science, 23( 1350-1354, 1985) による DNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長の c D N Aが得られ難いような場合には、レース法（ R A C E ： Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、 J (6)： 35-38, 1994)、殊に 5 ' -RACE CFrohman M. A., et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 8^ 8998- 9002, 1988) の採用が好適である。かかる PCR法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従い合成できる。

尚、増幅させた DNA/RNA断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法等によればよい。

上記で得られる本発明遺伝子或は各種 DN A断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、例えばジデォキン法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74 ： 5463-5467, 1977〕やマキサム一ギルバート法〔Method in Enzymology, 65: 499, 1980〕等により行なうことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行ない得る。

本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、 Science, 224： p.1431, 1984 ； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 13(h p.692, 1985; Pro Natl. Acad. Sci. USA, 80: p.5990, 1983及び前記引用文献等参照-'〕に従うことにより、各組換え体蛋白を得ることができる。該蛋白の製造は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換え DNAを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより行なわれる。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞である C 0 S細胞〔Cell， 23： 175-182， 1981〕ゃチャィニ一ズ ' ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 roc. Natl. Acad. Sci. USA, 77： 4216-4220, 1980〕等がよく用いられているが、これらに限定される訳ではない。

脊椎動物の発現べクタ一としては、通常発現しょうとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現べクタ一の例としては、例えば、 SV 4 0の初期プロモーターを保有する p SV 2dMr CMol. Cell. Biol., 854， 1981〕等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモータ一を有する P AM 8 2 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1-5， 1983) 等を利用できる。また、本発明遺伝子の発現べクタ一としては、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく例示でき、該べク夕一の具体例としては、例えば分子量 2 6 0 0 0の G ST ドメイン（S. japonicum 由来）を有する p G EX— 2 TKや p GEX— 4 T - 2等を例示できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。これらを宿主とする場合、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及び SD (シャイン ·アンド · ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えば ATG) を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての大腸菌としては、ェシエリヒア ' コリ（Escherichia coli) K 1 2株等がよく用いられ、ベクタ一としては一般に p BR 3 2 2及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びべクタ —をも利用できる。プロモー夕一としては、例えばトリブトファン（trp) プロモ —ター、 lpp プロモーター、 lac プロモータ一、 PL/PRプロモーター等を使用できる。

かくして得られる所望の組換え DN Aの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的の蛋白が生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

上記により、形質転換体の細胞内、細胞外乃至細胞膜上に目的とする組換え蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。

各組換え蛋白は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブック Π」、 1175 - 1259 頁、第 1版第 1刷、 1980 年 6月 23日株式会社東京化学同人発行； Biochemistry, 25(25): 8274 8277， 1986 ； Eur. J. Biochem. , 163^ 313-321, 1987等参照〕により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩ク口マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ一、ァフィ二ティクロマトグラフィ一、高速液体ク口マトグラフィ一

(HPLC) 等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、及びこれらの組合せ等を例示でき、特に好ましい上記方法としては所望の蛋白を結合させたカラムを利用したァフィ二ティクロマトグラフィーを例示できる。 ' - また、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種ヒ卜組織における本発明遺伝子の発現の検出を行なうことができる。これは常法に従って、例えは RT— P C R [Reverse transcribed - Polymerase chain reaction: Kawasaki E. S.. et al.， Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21-27, 1991〕による RNA増幅により、またノーザンブロッテイング解析（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 等により、いずれも良好に実施し得る。

尚、前記 P CR法を採用する場合において、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限り何等限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常これは常法に従って 20〜3 0ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。

しかして、本発明はかかる新規なヒト遺伝子に特有の検出に有用なプライマ一及びノ又はプローブをも提供するものである。実施例

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。

実施例 1 ( 1 ) コスミドライブラリーのスクリーニング

p 5 3タグサイト（クローン P 5 3— 1 9 1 ) は、時野等の方法に従い特定した〔Tokino T.， etal. , Hum. Mol. Gene, 3^ 1537-1542， 1994〕。 p 5 3夕グサィトを含む〔³²P〕標識プローブを使用して、ヒト末梢血リンパ球のコスミドライブラリをスクリーニングした。得られたコスミド： p 5 3 - c o s 1 9 1 を E c 0 R I で消化し、該 E c o R I フラク、、メ-'ントを p B l u e s c r i p t llSK (-) (Stratagene) にサブクローン化した。 DN A配列決定は、キット (Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit; ABO を使用して AB I 3 7 7 DNAシークェンサ一にて行った。

( 2) c DNAクロ一ニング

コスミド p 5 3— c o s l 9 1に存在する遺伝子の単離に、ェクソン増幅と R AC Eの両者を行った。

コスミド P 5 3— c 0 s 1 9 1を B amH I及び B g 1 IIにて消化し、該制限酵素フラグメントを、ェクソントラップベクタ一 p S P L 3 (Gibco-BRL) の B amH Iサイ卜にサブクローン化し、 L i p o f e c t A C E (Gibco-BRL) を用いて C 0 S 7細胞に導入した。該紬胞を 2 4時間培養後、 TR I Z〇 L (Gibco-BRL) により全 R N Aを調製した。ファーストストランド c D N A合成及びスプライスしたフラグメントの PCR増幅は、 North 等の方法に従い実施した〔North M. ' et al.， Mamm. Genome, 4： 466 - 474， 1993) 。 c DNAフラグメントは、 p B 1 u e s c r i p t IIS K (—）にサブクローン化され、上記のとおり T 3又は T 7プライマーを使用して配列決定された。候補のひとつとしての配列 1 9 1 E 1を、 c DNA増幅キット（Marathon cDNA amplification kit; Clontech) を用い、骨格筋ポリ（A) + R N Aを铸型として使用する 5 ' 一及び 3' —RACEに付した。

( 3) RT— P CR解析

p 5 3発現ベクター、 p 5 3— w t又は p 5 3— 2 7 3 CKern S. E.. et al.， Science (Washington DC), 256i 827-830, 1992) 、による大腸癌細胞株 SW 4 8 0の一過的 DNA導入及び c DNAの調製は、 Furuhata 等の報告に従い行った〔Furuhata T.， et al.， Oncogene, 13： 1965- 1970, 1996 〕。全 RNAは、 S u p e r s c r i p t s (Gibco-BRL) を使用して逆転写した。 RT— PC Rの指数的成長相は、 2 0— 3 0サイクルにおいて決定され、同一反応により得られた c DNA間の半定量的比較を可能とした。各 P C'R反応は、 2 0 0 n gの全 RNAからの c DNAを使用して実施した。 P C R溶液は文献

CHan H-J. , etal. , Hum. Mol. Genet., 4^ 237-242, 1995〕記載のものを使用し、反応は、 9 4 °C 2分の初期変性ステップに次ぐ 3 0サイクル（ 1 9 1 E 1の場合）又は 2 5サイクル（P 2 1 /WAF 1及び GAPDHの場合）のサイクリングステップ（ 9 4 °C 3 0秒、 5 5— 6 0 °C 3 0秒、 7 2 °C 1分）にて行つた

(GeneAmp PCR system 9600; Perkin Elmer) 。プライマ一配列は、次表 1のとおりである：

表 1

増幅された c DNAは、 3 %Nu S i e v e GTG ( 2 : l ) ァガロースゲルにて分離した。

( 4 ) ノ一ザンブロット解析

正常ヒト組織由来のポリ（A) +RNAを含むノーザンプロット（Clontech) を本発明 c DNAのヌクレオチド 9 0 9— 1 5 8 3に相当するランダ厶プライム〔³²P〕標識 DNAプローブによりハイブリダィズした。ブロットを 5 0°Cにて洗浄し（0.1XSSCZ0.1% SDS) — 8 0 °Cにて 2 4時間オートラジオグラブィ一の感光に付した。

( 5) F I SH

F I SHは、 Inazawa 等の方法に従い実施した〔Inazawa J. , et al.， Genomics, 17： 153-162， 1993〕。ヒ卜分裂中期染色体は、常法（thymidine synchronization I bromodeoxyuridine release technique; に従し、調製した。ハイブリダィゼーシヨンに先立ち、分裂中期の細胞は染色（Hoechst 33258) 及び U V照射した。コスミドクローン p 5 3— c 0 s 1 9 1は、ニックトランスレ —シヨンによりピオチン— 1 6— d UTPにより標識し、変性した分裂中期染色体とハイプリダイズした。 A 1 uリピ一トのような散在する繰返し配列によるノィズシグナルを除去する為に、染色体 in situ 抑制（chromosomal in situ suppression) ハイブリダィゼ一シヨンを使用した。ハイブリダィズシグナルは、 F I TC—アビジンにて検出した。ハイブリダィズシグナルの詳細な位置決定は、複製一 Gバンドの可視化によって行った。

( 6) 相同性検索

DNA比較は、 F A S T Aプログラムによるデ一夕べ一ス検索により行った non-redundant nucleic acid sequence databese 又は norrredundant protein sequence databese ；ヒトゲノム解析センター、東京大学医科学研究所）口^;

p 5 3誘導遺伝子のクロ一ニング

p 5 3タグサイトのひとつ、クローン P 5 3— 1 9 1をプローブとして、ヒトゲノムコスミドライブラリーをスクリーニングし、コスミドク□一ン： p 5 3— c 0 s 1 9 1を得た。このコスミドに由来する配列が p 5 3による転写制御を受けているかどうかを調べる為に、 RT— P CR解析を行った。 RT— P C Rでは、野生型又は変異型 P 5 3 c DN Aを含む発現ベクターで一過的に DN A導入した SW 4 8 0細胞（SW 4 8 0— wt 5 3又は SW 4 8 0— m t 5 3) より調製した RNAを铸型として使用した。候補配列のひとつである 1 9 1 E Γを試-'験した結果、 SW 4 8 0 — m t 5 3 (変異型）における場合に比べて、 SW 4 8 0 - w t 5 3 (野生型）における発現が著しく増加しており（図 1 参照）、 1 9 1 E 1の発現は野生型 p 5 3によって誘導されていると考えられた。

尚、図 1 は、野生型 P 5 3アレルを欠く大腸癌細胞株 SW 4 8 0における P 5 3誘導 m RNAの発現を RT - P CRにより解析した結果を示す写真である _c これによれば、 SW 4 8 0を、 p 5 3— w t (W) 又は p 5 3 - 2 7 3 (M) で一過的に形質転換して、 RT— P CR増幅により P 2 XM遺伝子の発現を確認した。 RNAサンプルは、逆転写酵素（RT) 存在下（十）又は非存在下（一）に逆転写反応に供した。 RN A铸型は GAP DH転写物の増幅によりコント口一ルし、これは両サンプルにおいて同程度のシグナルを与えた。

次いで、 1 9 1 E 1をプローブとして使用した c D N Aスクリーニング並びに 5 ' —及び 3' — RAC Eを行ない、 3 5 5 2 b pからなる c DNAを単離した _c 「P 2 XM」と名付けられた該 c DNAは、 4 3 1アミノ酸の蛋白をコードする 1 9 3 b pのオープンリーディングフレームを有している。その全 DN A配列は、配列番号： 3に示すとおりである。即ち、 P 2 XMc DNAのコード領域は、塩基番号 4 6から 1 3 3 8に示され、潜在的なトランスメンブランドメイン (M 1及び M 2 ) は、それぞれァミノ酸番号で 3 3〜 4 9番目及び 3 2 4〜 3 4 4番目のアミノ酸配列にあり、また voltage - gated K⁺ channelsH 5領域の類似セグメント（H) は、アミノ酸番号 3 0 6〜3 1 9に存在していた。

該 c DN Aをプロ一ブとするノーザンブロット解析によれば、骨格筋において 3. 6 k bの転写物が検出されており（図 2参照）、従って、該 c DNAは、ほぼ完全な転写物を含んでいるものと考えられる。

尚、図 2はヒト組織における P 2 XMのノーザンブロット解析結果を示す写真であり、各種組織 (Heart, Brain, Placenta, Lung, Skeletal muscle, Kidney, Spleen, Thymus, Prostate, Testis, Ovary, Small intestine, Colon, Leukocyte ) からのポリ（A)+ RNA (2 / g /レーン）のブロットを P-2 XM c DNAとハイプリダイズさせた結果を示すものである。

(口）相同性検索

蛋白データベースの相同性検索によれば、本発明にかかるァミノ酸配列は、 ATP - gated ion channel(P2X)レセプ夕一ファミリー〔Valera S.， et al.， Nature, 37L 516-519， 1994 ； Brake A. J. , et al.， Nature, 37^ 519-523, 1994〕と類似性を有し、特に、ラット P 2 X 6 CCollo G.， et al.， J. Neurosci. , 16： 2495-2507 1996) と 8 0 %の同一性を示した（図 5及び 6参照）。

図 3及び 4は、 Ρ 2 ΧΜ遺伝子のゲノム構成を示す図であり、図 3 (a)は、 1 9 1遺伝子のェクソン Zイントロン境界のヌクレオチド配列を示している。ェクソン及びイントロンの配列は、順次、大文字及び小文字で示されている。図 4 中、（b)は、ェクソンの存在位置を、そのサイズに応じた、番号付き箱により示したものである。また、図 4中（c)は、コスミド p 5 3— 1 9 1の p 5 3結合部位と p 5 3コンセンサス結合配列を比較したものであり、矢印は、 p 5 3コンセンサス結合配列（ペン夕マ一）を示す。大文字のヌクレオチドは、コンセンサスに一致するゲノム配列を示し、小文字はコンセンサス配列と相違する配列を示している。 P 2 Xレセプ夕一（P2X1- X6) ファミリ一の全てのメンバ一は、 2つのトランスメンブラン領域（M 1及び M 2) 、 voltage-gated K⁺ channel の H 5 領域に類似しているセグメント（H 5) 、 N—グリコシレーシヨンサイト及び進化上保存されている 1 1 システィン残基を有している（図 5及び 6参照）。図 5及び 6は、各種 P 2 Xレセプターのアミノ酸配列を示すものであり、図中、箱囲みした残基は、 P 2 XMの配列及びラット P 2 X I— P 2 X 7レセプ夕一に共通して保存されている。上線は、保存されている 2つの疎水性領域（M l及び M2 ) 及び H 5を示す。星印は、 P 2 XMの潜在的 N—結合グリコシレ一シヨンサイトを示す。

本発明のかかる遺伝子によってコードされているァミノ酸配列は、 ·同様:にこれら P 2 Xレセプタ一ファミリ一の基本的特徴を有しており、これはヒト P 2 Xレセプターファミリ一の新規なメンバーであると考えられる。

(ハ）構造解析

上記 c DNAとその対応するゲノム DNA配列（p53- cosl91) の比較により、ェクソン /ィントロン境界及び近接ィントロンの近傍 DN A配列を含む、この遺伝子のゲノム構成が明らかとなった（図 3参照）。この遺伝子は、約 1 2 kbのゲノム領域におよんでおり、 1 2のェクソンからなる（図 4の b参照）。 p 5 3 タグサイトは、この遺伝子の約 1. 6 kb下流に存在している（図 4の b及び c 参照）。コスミド p 53— c o s l 9 1をプローブとする蛍光 in situ ハイブリダイゼーシヨン法（ F I S H法）により、この遺伝子の染色体位置は、 22 q 1 1と確認された（図 1 1参照：特異的なハイブリダイゼ一シヨンシグナルがヒト染色体バンド 22 q 1 1に認められ、他の染色体上にはシグナルは認められなかった）。

(二）骨格筋（Skeletal muscle) における別態様スプライシング（alternative splicing)

骨格筋より調製した RNAの RT - P CR後の直接 DNA配列決定では、ェクソン 1 0、ェクソン 1 0— 1 1又はェクソン 1の一部（ェクソン 1のドナーサイ卜から下流 1 8 bp) を欠く、別態様スプライシングの 3種のインフレ一厶転写物（AL 1、 L 2及び AL 3) が確認された（図 7参照）。

この別態様スプライシングの模式図を図 7に示す。正常骨格筋からの主要な RT— PCR増幅産物は、 N 1 と N 2で示されている。 3つのタイプのバリアントは、 AL 1、 AL 2及び AL 3で示されている。 - これら別態様スプライシング転写物のそれぞれは、 3の倍数のヌクレオチドを欠失しており、いずれもそのリ一ディングフレームは維持されていた。

図 3及び 4に示すように、ェクソン 1— 2及びェクソン 1 1は、順次、トランスメンブラン領域 M 1及び M 2に相当する。該 M l及び M 2領域ば、ェ 'クソン 1 0によってコードされる近接疎水性セグメント（H 5) とともに、 ion pore and ion-bindin サイトを形成するとされている〔Valera S. , et al. , Nature, 371： 516-519, 1994 ； Brake A. J. , et al. , Nature, 37h 519-523, 1994) 。構造的推定によれば、これらのェクソンは、生物学的機能に重要なドメインをコ一ドしているものと思われる。

(ホ）ヒト癌細胞株における発現と別態様スプライシング

近年、異常な別態様スプライシングがヒト癌の発生、進展及び又は転移に何等かの関与をなしていることが報告されている〔Gunthert U. , et al., Cell, 65： 13 - 24， 1991 ； Arch R. , et al. , Science (Washington DC), 257^ 682- 685, 1992〕。そこで、 4種の横紋筋肉種、 2種の骨肉腫及び 1種の脂肪肉腫に由来する細胞株で、本発明遺伝子の mRNAレベル及び別態様スプライシングを RT - P CR解析により評価した。結果を図 8〜 1 0に示す。同図において、 RT - PCRは、細胞株から調製した全 RNA (200ng) を用いて前記に従い実施したものであり、各レーン（Cell lines) は、横紋筋肉種（A204：レーン 1， A673：レーン 2 , Hs729T：レーン 3， RD：レーン 4) ，脂肪肉腫（SW872：レ一ン 5) 及び骨肉腫（NY : レーン 6， Hu03Nl ：レーン 7) におけるものである。また、骨格筋の全 RNA (200ng) から調製し希釈（ 1 , 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8， 1 : 1 6, 1 : 3 2) した c DNAを用いて P CR増幅した結果を併せて示してレヽる ( "Skeletal muscle" レーン） _σ

図 8及び 9は、前記の Nし AL 1、 N 2、 AL 2及び AL 3における結果を示すものであり、それらの P CR産物サイズは、順次、 3 9 2、 3 1 4、 4 5 0、 3 8 4及び 3 0 6 bpである。尚、 RNA铸型は、 G A P D Hの増幅をとおしてコントロールし、これは全てのサンプルにおいて同様のシグナルを与えた（図 1 0)

その結果、この遺伝子の発現は、試験した 7種の細胞株中、ひとつの横紋筋肉種細胞株（A673) において顕著に減少していた。また、これら細胞株における別態様スプライシングは、次のとおりであった。ェクソン 1 0及びェクソン 1 0— 1 1を欠くスプライスバリアントは、癌細胞におけるその転写パターンが、正常骨格筋でのそれに類似していた。一方、ェクソン 1の一部を欠失しているバリアントの割合は、正常骨格筋では少なかったのに対し、ひとつの横紋筋肉種細胞株

(RD) 及びひとつの骨肉腫（Hu03Nl) では相対的により多く認められた。本発明により、 ATP- gated ion channels をコ一ドする P 2 Xフアミリーの新規なメンバ一であると考えられる新規な p 5 3誘導型遺伝子が単離された。 p 5 3結合性配列は、この遺伝子を含む全コスミド DNAの配列決定により、該遺伝子の下流約 1. 6 k bに見出された。 p 5 3により制御されている遺伝子の機能的 P 5 3結合部位は、今まで、これら遺伝子のイントロン又はプロモーター領域中に見出されてきている。本発明の新規遺伝子においては、該機能的 p 5 3 結合部位は、その下流に位置していた。これらの結果は、 p 5 3結合部位がェンハンサー配列として働く可能性を示唆している。

本発明 c DN Aから推定されるァミノ酸配列は、 P 2 Xレセプ夕一ファミリ一のメンバー、特にラット P 2 X 6 ( 8 0 %同一性）、に相同性を有する。しかしながら、ラット P 2 X 6 mRN Aが脳の広い範囲において見出されるのに対し、この遺伝子は骨格筋において特異的に発現されており、従って、これがラット P 2 X 6のヒト相同物であるとは考えられない。 P 2 Xレセプ夕一は、 ATP - gated ion channels に分類され、細胞死やシナプス伝達のような細胞外 A T P 誘導型生物活性のメデイエ一夕一として機能するとされてきている〔Zheng し M.， et al.， J. Cell Biol.， Π3^ 279-288 1991 ； Zo tewei j J. P. , et al. , Biochem. J. , 288^ 207-213, 1992 ； Kennedy ， et al. , Nature, 377: 385-386, 1995) 。また、アミノ酸レベルでの配列類似性は、 RP— 2と呼ばれる部分配列 c DNAとの間でも認められる。 RP— 2は、ガンマ照射によりアポト一シスを起こしているラット胸腺細胞において誘導される m R N Aからの subtractive ハイブリダィゼ一シヨンによって単離されている〔0wens G. P. , et al. , Mol. Cell. Biol. , Π: 4177-4188 1991 〕。 ATPは、細胞内カルシゥ厶濃度を増加することにより、胸腺細胞、肝細胞及び各種のリンパ球細胞株において細胞死を誘導する。これらの事実によれば、本発明遺伝子は、骨格筋における P 5 3依存性アポトーシス（おそらく細胞外 ATPにより仲介される）に密接に関与しているものと考えられる。

ノーザンプロット解析により、骨格筋において 3. 6 k b転写物が検出された c この遺伝子の発現は、 4種の横紋筋肉種細胞株のひとつにおいて著しく減少していた。加えて、トランスメンブランドメイン M 1の一部をコードするェクソン 1 の一部を欠失するマイナーなスプライスバリアントが、残り 6種の癌細胞株の内 2つにおいて相対的により多く認められた。試験した癌細胞株で別態様スプラィシングで生じる異常産物の割合が高かったことは注目され、ァミノ末端での不均質性の生物学的意義を明らかにする事が重要となる。更に、横紋筋肉種を含む種々の組織の癌では、この遺伝子を含む染色体領域（22qll) に欠失があることが報告されており CNewsham I. , et al. , Genomics, 19： 433-440， 1994 ； Schofield D. E.， et al., Genes Chromosom. Cancer, 15: 10 - 17, 1996 ； Biegel J. A., et al. , Genes Chromosom. Cancer, 16： 94-105, 1996) , この遺伝子がこの領域に存在する癌抑制遺伝子である可能性を示唆している。産業上の利用可能性ヒトゲノ厶からの機能的 p 5 3タグサイトのクローニングにおいて、野生型 P 5 3によって誘導される新規な遺伝子を単離した。この c DNA配列は、 P 2 Xレセプターファミリーに相同性を示す 4 3 1ァミノ酸べプチドをコ― ドするオープンリーディングフレームを含んでいる。このペプチドは、 P 2 Xフアミリーのメンバーの主要な特徴を有し（ATP- gated ion channels) 、また、プログラム細胞死 (progra隱 ed cell death) を誘導された胸腺細胞において活性化される遺伝子、 R P— 2、と類似する。この遺伝子は、主に骨格筋に発現され、 P 2 XM (P2X specifically expressed in skeltal muscle) と名付けられた。該 P 2 XM遺伝子は、細胞増殖の抑制及び/又は骨格筋におけるアポトーシスに関与すると思われる。

この遺伝子の発現は、試験した 4種の横紋筋肉種細胞株のひとつにおいて著しく抑制されていた。トランスメンブラン領域 M 1をコードするェクソン 1の一部を欠くマイナーなスプライスバリアントが、試験した 7種の癌細胞株の 2つにおいて相対的に多かった。このことは、このスプライシングによって生じる変異産物の比率が、これらの癌細胞株において著しく増加することを示唆する。この遺伝子は、杆状癌（rhabdoid tumor) において欠失が知られている染色体バンド 2 2 q 1 1に位置していた。

本発明によれば、癌抑制遺伝子 p 5 3による特異的な転写制御下にある新規なヒト遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、そのコードする産物の構造及び機能等を解析でき、また、該遺伝子産物の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、癌の発生、進展、転移等の解明やその診断、予防、治療等に有用な技術が提供される。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 4 3 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直線状

配列の種類：蛋白 ' - 配列：

Met Gly Ser Pro Gly Ala Thr Thr Gly Trp Gly Leu Leu Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Thr Glu Lys Tyr Val Met Thr Arg Asn Trp Arg Val Gly Ala Leu Gin

20 25 30

Arg Leu Leu Gin Phe Gly He Val Val Tyr Val Val Gly Trp Ala Leu

35 40 45

Leu Ala Lys Lys Gly Tyr Gin Glu Arg Asp Leu Glu Pro Gin Phe Ser

50 55 60

lie He Thr Lys Leu Lys Gly Val Ser Val Thr Gin He Lys Glu Leu 65 70 75 80

Gly Asn Arg Leu Trp Asp Val Ala Asp Phe Val Lys Pro Pro Gin Gly

85 90 95

Glu Asn Val Phe Phe Leu Val Thr Asn Phe Leu Val Thr Pro Ala Gin

100 105 110

Val Gin Gly Arg Cys Pro Glu His Pro Ser Val Pro Leu Ala Asn Cys

115 120 125

Trp Val Asp Glu Asp Cys Pro Glu Gly Glu Gly Gly Thr His Ser His

130 135 140

Gly Val Lys Thr Gly Gin Cys Val Val Phe Asn Gly Thr His Arg Thr 145 150 155 160

Cys Gl u l ie Trp Ser Trp Cys Pro Val Glu Ser Gly— Val Val Pro Ser

165 170 175

Arg Pro Leu Leu Ala Gin Ala Gin Asn Phe Thr Leu Phe l i e Lys Asn

180 185 190

Thr Val Thr Phe Ser Lys Phe Asn Phe Ser Lys Ser Asn Ala Leu Gl u --

195 200 205

Thr Trp Asp Pro Thr Tyr Phe Lys Hi s Cys Arg Tyr Gl u Pro Gin Phe

210 215 220

Ser Pro Tyr Cys Pro Val Phe Arg H e Gly Asp Leu Val Ala Lys Ala 225 230 235 240

Gly Gly Thr Phe Glu Asp Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ser Val Gly l ie

245 250 255

Arg Val Hi s Trp Asp Cys Asp Leu Asp Thr Gl y Asp Ser Gl y Cys Trp

260 265 270

Pro Hi s Tyr Ser Phe Gin Leu Gin Glu Lys Ser Tyr Asn Phe Arg Thr

275 280 285

Ala Thr Hi s Trp Trp Glu Gin Pro Gly Val Gl u Ala Arg Thr Leu Leu

290 295 300

Lys Leu Tyr Gly l ie Arg Phe Asp l ie Leu Val Thr Gly Gin Ala Gly 305 310 315 320

Lys Phe Gly Leu l ie Pro Thr Ala Val Thr Leu Gly Thr Gly Ala Ala

325 330 335

Trp Leu Gly Val Val Thr Phe Phe Cys Asp Leu Leu Leu Leu Tyr Val

340 345 350

Asp Arg Glu Ala His Phe Tyr Trp Arg Thr Lys Tyr Glu Glu Ala Lys 355 360 365

Ala Pro Lys Ala Thr Ala Asn Ser Val Trp Arg Glu Leu Ala Leu Ala

370 375 380

Ser Gin Ala Arg Leu Ala Glu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Ala Pro Ala

385 390 395 400

Pro Thr Ala Thr Ala Ala Gly Ser Gin Thr Gin Thr Pro Gly Trp Pro ：

405 410 415

Cys Pro Ser Ser Asp Thr Hi s Leu Pro Thr Hi s Ser Gly Ser Leu

420 425 430

配列番号： 2

配列の長さ： 1 2 9 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類： DNA (cDNA)

配列：

ATGGGCTCCC CAGGGGCTAC GACAGGCTGG GGGCTTCTGG ATTATAAGAC GGAGAAGTAT 60 GTGATGACCA GGAACTGGCG GGTGGGCGCC CTGCAGAGGC TGCTGCAGTT TGGGATCGTG 120 GTCTATGTGG TAGGGTGGGC GCTCCTCGCC AAAAAAGGCT ACCAGGAGCG GGACCTGGAA 180

CCCCAGTTTT CCATCATCAC CAAACTCAAA GGGGTTTCCG TCACTCAGAT CAAGGAGCTT 240

GGAAACCGGC TGTGGGATGT GGCCGACTTC GTGAAGCCAC CTCAGGGAGA GAACGTGTTC 300

TTCTTGGTGA CCAACTTCCT TGTGACGCCA GCCCAAGTTC AGGGCAGATG CCCAGAGCAC 360

CCGTCCGTCC CACTGGCTAA CTGCTGGGTC GACGAGGACT GCCCCGAAGG GGAGGGAGGC 420

ACACACAGCC ACGGTGTAAA AACAGGCCAG TGTGTGGTGT TCAATGGGAC CCACAGGACC 480

TGTGAGATCT GGAGTTGGTG CCCCGTGGAG AGTGGCGTTG TGCCCTCGAG GCCCCTGCTG 540

GCCCAGGCCC AGAACTTCAC ACTGTTCATC AAAAACACAG TCACCTTCAG CAAGTTCAAC 600 TTCTCTAAGT CCAATGCCTT GGAGACCTGG GACCCCACCT ATTTTAAGCA CTGCCGCTAT 660

GAACCACAAT TCAGCCCCTA CTGTCCCGTG TTCCGCATTG GGGACCTCGT GGCCAAGGCT 720

GGAGGGACCT TCGAGGACCT GGCGTTGCTG GGTGGCTCTG TAGGCATCAG AGTTCACTGG 780

GATTGTGACC TGGACACCGG GGACTCTGGC TGCTGGCCTC ACTACTCCTT CCAGCTGCAG 840

GAGAAGAGCT ACAACTTCAG GACAGCCACT CACTGGTGGG AGCAACCGGG TGTGGAGGCC 900

CGCACCCTGC TCAAGCTCTA TGGAATCCGC TTCGACATCC TCGTCACCGG GCAGGCAGGG - 960

AAGTTCGGGC TCATCCCCAC GGCCGTCACA CTGGGCACCG GGGCAGCTTG GCTGGGCGTG 1020

GTCACCTTTT TCTGTGACCT GCTACTGCTG TATGTGGATA GAGAAGCCCA TTTCTACTGG 1080

AGGACAAAGT ATGAGGAGGC CAAGGCCCCG AAAGCAACCG CCAACTCTGT GTGGAGGGAG 1140

CTGGCCCTTG CATCCCAAGC CCGACTGGCC GAGTGCCTCA GACGGAGCTC AGCACCTGCA 1200

CCCACGGCCA CTGCTGCTGG GAGTCAGACA CAGACACCAG GATGGCCCTG TCCAAGTTCT 1260

GACACCCACT TGCCAACCCA TTCCGGGAGC CTG 1293 配列番号： 3

配列の長さ： 1 6 9 7

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類： DNA (cDNA)

配列の特徴：

特徴を表わす記号： CDS

存在位置： 4 6 , . 1 3 3 8

特徴を決定した方法： E

配列：

CTGCCATGCT GACTCATGTG CCCGCAGCTA GCAGGAGCTG GCAGC ATG GGC TCC 54

Met Gly Ser CCA GGG GCT ACG ACA GGC TGG GGG CTT CTG GAT TAT AAG ACG GAG AAG 102 Pro Gly Ala Thr Thr Gly Trp Gly Leu Leu Asp Tyr Lys Thr Glu Lys

5 10 15

TAT GTG ATG ACC AGG AAC TGG CGG GTG GGC GCC CTG CAG AGG CTG CTG 150 Tyr Val Met Thr Arg Asn Trp Arg Val Gly Ala Leu Gin Arg Leu Leu

20 25 30 3'5 -:

CAG TTT GGG ATC GTG GTC TAT GTG GTA GGG TGG GCG CTC CTC GCC AAA 198 Gin Phe Gly l ie Val Val Tyr Val Val Gly Trp Ala Leu Leu Ala Lys

40 45 50

AAA GGC TAC CAG GAG CGG GAC CTG GAA CCC CAG TTT TCC ATC ATC ACC 246 Lys Gly Tyr Gin Glu Arg Asp Leu Glu Pro Gin Phe Ser l ie l ie Thr

55 60 65

AAA CTC AAA GGG GTT TCC GTC ACT CAG ATC AAG GAG CTT GGA AAC CGG 294 Lys Leu Lys Gly Val Ser Val Thr Gin He Lys Glu Leu Gly Asn Arg

70 75 80

CTG TGG GAT GTG GCC GAC TTC GTG AAG CCA CCT CAG GGA GAG AAC GTG 342 Leu Trp Asp Val Ala Asp Phe Val Lys Pro Pro Gin Gly Glu Asn Val

85 90 95

TTC TTC TTG GTG ACC AAC TTC CTT GTG ACG CCA GCC CAA GTT CAG GGC 390 Phe Phe Leu Val Thr Asn Phe Leu Val Thr Pro Ala Gin Val Gin Gly

100 105 110 115

AGA TGC CCA GAG CAC CCG TCC GTC CCA CTG GCT AAC TGC TGG GTC GAC 438 Arg Cys Pro Glu Hi s Pro Ser Val Pro Leu Ala Asn Cys Trp Val Asp

120 125 130

GAG GAC TGC CCC GAA GGG GAG GGA GGC ACA CAC AGC CAC GGT GTA AAA 486 Glu Asp Cys Pro Glu Gly Glu Gly Gly Thr Hi s Ser Hi s Gly Val Lys 135 140 145

ACA GGC CAG TGT GTG GTG TTC AAT GGG ACC CAC AGG ACC TGT GAG ATC 534 Thr Gly Gin Cys Val Val Phe Asn Gly Thr Hi s Arg Thr Cys Gl u He

150 155 160

TGG AGT TGG TGC CCC GTG GAG AGT GGC GTT GTG CCC TCG AGG CCC CTG 582 Trp Ser Trp Cys Pro Val Gl u Ser Gly Val Val Pro Ser Arg Pro Leu - '

165 170 175

CTG GCC CAG GCC CAG AAC TTC ACA CTG TTC ATC AAA AAC ACA GTC ACC 630 Leu Ala Gin Ala Gin Asn Phe Thr Leu Phe l i e Lys Asn Thr Val Thr

180 185 190 195

TTC AGC AAG TTC AAC TTC TCT AAG TCC AAT GCC TTG GAG ACC TGG GAC 678 Phe Ser Lys Phe Asn Phe Ser Lys Ser Asn Ala Leu Gl u Thr Trp Asp

200 205 210

CCC ACC TAT TTT AAG CAC TGC CGC TAT GAA CCA CAA TTC AGC CCC TAC 726 Pro Thr Tyr Phe Lys Hi s Cys Arg Tyr Glu Pro Gin Phe Ser Pro Tyr

215 220 225

TGT CCC GTG TTC CGC ATT GGG GAC CTC GTG GCC AAG GCT GGA GGG ACC 774 Cys Pro Val Phe Arg He Gly Asp Leu Val Ala Lys Ala Gl y Gly Thr

230 235 240

TTC GAG GAC CTG GCG TTG CTG GGT GGC TCT GTA GGC ATC AGA GTT CAC 822 Phe Glu Asp Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ser Val Gly l ie Arg Val Hi s

245 250 255

TGG GAT TGT GAC CTG GAC ACC GGG GAC TCT GGC TGC TGG CCT CAC TAC 870 Trp Asp Cys Asp Leu Asp Thr Gly Asp Ser Gly Cys Trp Pro Hi s Tyr

260 265 270 275

TCC TTC CAG CTG CAG GAG AAG AGC TAC AAC TTC AGG ACA GCC ACT CAC 918 Ser Phe Gin Leu Gin Glu Lys Ser Tyr Asn Phe Arg Thr Ala Thr Hi s

280 285 290

TGG TGG GAG CAA CCG GGT GTG GAG GCC CGC ACC CTG CTC AAG CTC TAT 966

Trp Trp Glu Gin Pro Gly Val Glu Ala Arg Thr Leu Leu Lys Leu Tyr

295 300 305

GGA ATC CGC TTC GAC ATC CTC GTC ACC GGG CAG GCA GGG AAG TTC GGG --- 1014

Gly H e Arg Phe Asp l ie Leu Val Thr Gly Gin Ala Gly Lys Phe Gly

310 315 320

CTC ATC CCC ACG GCC GTC ACA CTG GGC ACC GGG GCA GCT TGG CTG GGC 1062

Leu l i e Pro Thr Ala Val Thr Leu Gly Thr Gl y Ala Ala Trp Leu Gly

325 330 335

GTG GTC ACC TTT TTC TGT GAC CTG CTA CTG CTG TAT GTG GAT AGA GAA 1110

Val Val Thr Phe Phe Cys Asp Leu Leu Leu Leu Tyr Val Asp Arg Glu

340 345 350 355

GCC CAT TTC TAC TGG AGG ACA AAG TAT GAG GAG GCC AAG GCC CCG AAA 1158

Ala Hi s Phe Tyr Trp Arg Thr Lys Tyr Glu Glu Ala Lys Ala Pro Lys

360 365 370

GCA ACC GCC AAC TCT GTG TGG AGG GAG CTG GCC CTT GCA TCC CAA GCC 1206

Ala Thr Ala Asn Ser Val Trp Arg Glu Leu Ala Leu Ala Ser Gin Ala

375 380 385

CGA CTG GCC GAG TGC CTC AGA CGG AGC TCA GCA CCT GCA CCC ACG GCC 1254

Arg Leu Ala Glu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Ala Pro Ala Pro Thr Ala

390 395 400

ACT GCT GCT GGG AGT CAG ACA CAG ACA CCA GGA TGG CCC TGT CCA ACT 1302

Thr Ala Ala Gly Ser Gin Thr Gin Thr Pro Gly Trp Pro Cys Pro Ser

405 410 415 —3

[>

CD

「

—3

C

n cn

—0

GC AG TAT

GCCCC CTG TCTTT

CGTT TAGGGGCGTGTT CTGTT ATAGATT GGG¾AGC CCCAA TTTT

TGG AA¾GGGCGGGGGGTTTG GTAAG GC GCCT

GCC CCA ACA TTG ACC C C CG GCCGTCCAT TCCTT 13

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列の全部又は一部をコードする塩基配列を含むヒト遺伝子。

2 . 配列番号： 2で示される塩基配列の全部又は一部を含む請求項 1記載の遺伝子。 ' --

3 . 請求項 1又は 2記載の遺伝子の一部の塩基配列を有することを特徴とする請求項 1又は 2記載の遺伝子検出用プローブ又はプライマ一。