WO1998037916A1 - Nouveaux composes lipidiques et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique - Google Patents

Nouveaux composes lipidiques et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique Download PDF

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active substance
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Rainer Bischoff
Abdesslame Nazih
Yves Cordier
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Definitions

  • the present invention relates to new lipid compounds and novel compositions comprising them. More particularly, the present invention relates to the use of said compounds or of said compositions for preparing a transfer vector for an active substance, in particular therapeutically comprising negative charges, in particular a polynucleotide, in a target cell, particularly a vertebrate cell, and more particularly of mammal.
  • the first category relates to physical techniques such as microinjection, electroporation or particle bombardment which, although effective, are largely limited to in vitro applications and the implementation of which is cumbersome and delicate.
  • the second category calls upon techniques relating to molecular and cellular biology for which the gene to be transferred is associated with a vector of biological or synthetic nature which favors the introduction of the latter.
  • the most effective vectors are viral vectors, in particular adenoviral or retroviral.
  • viruses have already been the subject of numerous studies and some of them are already used on an experimental basis as gene vectors in humans for the purpose of, for example, vaccination, immunotherapy or therapy aimed at compensating for a genetic deficiency.
  • Non-viral methods include coprecipitation with calcium phosphate, the use of receptors mimicking viral systems (for a review see Cotten and Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705-710), or the use of polymers such as polyamidoamine (Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379), or of a polymer such as those presented in WO 95/24221 describing the use of dendritic polymers, the document WO 96/02655 describing the use of polyethylene imine, or polypropylene imine and documents US-A-5,595,897 and FR 2,719,316 describing the use of polylysine conjugates.
  • liposomes the advantage of which as an agent allowing the introduction, inside cells, of certain biological macromolecules, such as for example DNA, l RNA, proteins or certain pharmaceutically active substances has been widely described in the literature.
  • certain biological macromolecules such as for example DNA, l RNA, proteins or certain pharmaceutically active substances has been widely described in the literature.
  • cationic lipids which have a strong affinity for cell membranes and / or nucleic acids.
  • DOTMA DOTMA
  • DOGS or Transfectam TM Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986
  • DMRIE and DORIE DMRIE and DORIE
  • DC-CHOL Gao and Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285
  • DOTAPG McLachlan et al., 1995 , Gene Therapy, 2,674-622
  • Lipofectamine ⁇ as well as those described in patent applications WO9116024 or
  • R 7 is H, spermine, spermidine, histone, a protein, an amino acid, a polypeptide.
  • lipids which can be in cationic form, useful in particular for transferring an active substance, in particular therapeutically containing negative charges, in particular a polynucleotide, inside a target cell, including one can envisage the use in particular in vivo within the framework of a gene therapy.
  • residues R are, independently of each other, a hydrogen atom or a group of formula II:
  • alkenyl is understood to mean that the carbon chain can comprise one or more double bond (s) along the said chain.
  • the invention relates to a compound selected from the compounds of formulas:
  • R is a group of formula II as defined above and H 2 N - [- (CH 2 ) m -NR] n-1 - (CH 2 ) m -NH 2 Illb in which:
  • R has one of the meanings indicated for formula I provided that at least one R is a group of formula II and for each of the formulas: n is a positive integer from 1 to 6, m is a positive integer of 1 to 6 which can be different for each motif - (CH 2 ) m , and more particularly for each motif - (CH 2 ) m -NR- when n> 1.
  • the compounds of formula IIIb contain one or two R groups of formula II.
  • - n is an integer chosen from the numbers 2, 3 or 4,
  • - m is an integer chosen from the numbers 2, 3 or 4.
  • R t and R 2 are radicals of 6 to 10 carbon atoms, but in this case it is preferable to choose compounds for which the number of R groups of formula II is 2, 3 or 4.
  • the lipids according to the invention are chosen from the group consisting of the compounds of the following formulas:
  • R 3 and R 4 are protective groups, in particular Fmoc (Grandas et al., 1989, Int. Journal pept. Prot. Res. Vol 33, 386-390) with an amine of formula:
  • R 5 NH [(- CH 2 ) m -NR 5 ] n - ⁇ - (CH 2 ) m NHR 5 VI m, n having the same meaning as for formula I, R 5 being a protective group, in particular t- butoxycarbonyl (BOC) or a hydrogen atom, at least one of the radicals R 5 and at most four of the radicals R 5 corresponding to the hydrogen atom.
  • R 5 being a protective group, in particular t- butoxycarbonyl (BOC) or a hydrogen atom, at least one of the radicals R 5 and at most four of the radicals R 5 corresponding to the hydrogen atom.
  • the NR 3 , -NR 4 functions are then deprotected to fix, by amidation or alkylation, the radicals Ri and R 2 in a known manner, in particular by the action of the corresponding ester -N- hydroxysuccinimide.
  • the compound obtained is deprotected in the presence of trifluoroacetic acid.
  • the amines of formula VI are prepared in a known manner.
  • the compound of formula VI is 1-4 di-boc-spermidine
  • the methods described are generally applicable to syntheses of the compounds according to the invention subject to adaptations within the reach of the skilled person.
  • the compounds of the invention cannot be limited to those obtained by the methods of preparation described above.
  • the compounds according to the invention can also be substituted. Such substitutions may in particular consist of into a labeling molecule (see labeling molecules in US 4711955) which makes it possible, for example, to visualize the distribution of the compounds or complexes containing them after administration - in vitro or in vivo, a cell targeting molecule, an anchoring molecule.
  • the invention therefore also relates to a compound as presented above conjugated to one or more targeting elements, also called ligands of interest, via at least a) one of the carbon atoms, in particular chosen among those present on the groups Ri and / or R 2 , or b) one of the secondary or primary nitrogen atoms of the polyamine chain or of the diaminocarboxylic acid.
  • Such elements can allow targeting to a particular cell type, facilitate penetration inside the cell, lysis of endosomes or even intracellular transport and are widely described in the literature. It may, for example, be all or part of sugars, peptides (GRP peptide, Gastrin Releasing Peptide, for example), oligonucleotides, lipids, hormones, vitamins, antigens, antibodies, specific ligands for membrane receptors, ligands capable of reacting with an anti-ligand, fusogenic peptides, nuclear localization peptides, or a combination of such compounds.
  • Such conjugates can be easily obtained according to the techniques widely described in the literature, and more particularly by chemical coupling, in particular by using protective groups such as trifluoroacetyl or Fmoc or Boc on the polyamine and more particularly by using one or more orthogonal protective groups such as those described in Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds. TW Greene, PGM Wuts, Wiley) on polyamine or diaminocarboxylic acid. Selective deprotection of a protective group then makes it possible to couple the targeting element, and the lipid is then deprotected.
  • protective groups such as trifluoroacetyl or Fmoc or Boc
  • one or more orthogonal protective groups such as those described in Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds. TW Greene, PGM Wuts, Wiley) on polyamine or diaminocarboxylic acid.
  • said compound is in cationic form, that is to say that it is in protonated form by attachment of a proton to one or more nitrogen atoms present on the polyamine chain.
  • said cationic lipid is associated with one or more biologically acceptable anions, such as for example the trifluoroacetate, halide, halide, monomethylsulfate, acetate or phosphate, iodide, chloride, bromide ... anion.
  • biologically acceptable anions such as for example the trifluoroacetate, halide, halide, monomethylsulfate, acetate or phosphate, iodide, chloride, bromide ... anion.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising at least one compound as described above and optionally at least one adjuvant capable of improving the formation of complex between said compound and an active substance, or of improving the functioning of these complexes vis-à-vis the cell.
  • such an adjuvant will be a neutral or zwitterionic lipid, such as for example a lipid which is or derived from a triglyceride, a diglyceride, cholesterol (see for example US 5,438,044), in particular, a neutral or zwitterionic lipid which is or which is derived from a phosphatidyl ethanolamine - (PE), phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyelin, ceramide or cerebroside.
  • PE phosphatidyl ethanolamine -
  • DOPE dioleoylphosphatidyl ethanolamine
  • the weight ratio between the compound of the invention and the neutral or zwitterionic lipid is generally between 0.1 and 10, it being understood that this ratio may vary depending on the nature of the components considered. Those skilled in the art have sufficient knowledge to allow these minor adaptations. It is also possible to use a mixture of neutral and / or zwitterionic lipids or else a mixture of cationic lipids and neutral and / or zwitterionic lipids.
  • the invention further relates to a complex comprising at least one compound or at least one composition as described above and at least one active substance, in particular therapeutically comprising at least one negative charge. According to a variant of the invention, said complex can also contain one or more cationic amphiphiles such as those described in the literature, examples of which have been proposed above.
  • said active substance is chosen from nucleic acids and proteins.
  • the active substance of the complex according to the invention is a polynucleotide, said compound or said composition then making it possible to improve the transfecting power of the polynucleotide in a cell.
  • polynucleotide designating a fragment of DNA and / or RNA, double strand or single strand, linear or circular, natural isolated or synthetic, designating a precise sequence of nucleotides, modified or not (see title example US 5525711), branded or not (see, for example, US 4711955 or EP 302175), making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid without limitation of size.
  • polynucleotide is intended to denote in particular a cDNA, a genomic DNA, a plasmid DNA, " a messenger RNA, an antisense RNA, a ribozyme, a transfer RNA, a ribosomal RNA, or a DNA coding for such RNA.”
  • Polynucleotide " or “nucleic acid” are synonymous terms in the context of the present application.
  • Anti sense means a nucleic acid having a sequence complementary to a target sequence, for example a sequence of ⁇ RNm which one seeks to block the expression by hybridization on the target sequence, and by "sense", a nucleic acid having a sequence homologous or identical to a target sequence, for example a sequence which binds to a protein transcription factor and is involved in the expression of a given gene.
  • said polynucleotide comprises a gene of interest and elements allowing the expression of said gene of interest. said polynucleotide is advantageously in the form of a plasmid.
  • the elements allowing expression are the set of elements allowing the transcription of said DNA fragment into RNA (antisense RNA or mRNA) and the translation of mRNA into polypeptide.
  • These include promoter sequences and / or regulatory sequences effective in said cell, and optionally the sequences required to allow excretion or expression on the surface of target cells of said polypeptide.
  • the promoters such as the promoters of the RSV, MPSV, SV40, CMV or 7.5k viruses, of the vaccinia virus, the promoters of the gene coding for muscle creatine kinase, for actin, for the lung surfactant.
  • said polynucleotide can comprise at least two sequences, identical or different, having transcriptional promoter activity - and / or at least two DNA coding sequences, identical or different, located in relation to one another in a contiguous, distant manner, in the same direction or in the opposite direction, provided that the function of transcriptional promoter or transcription of said sequences is not affected.
  • this type of nucleic acid construction it is possible to introduce “neutral” nucleic sequences or introns which do not affect transcription and are spliced before the translation step.
  • polynucleotide may also contain sequences required for intracellular transport, for replication and / or for integration. Such sequences are well known to those skilled in the art.
  • polynucleotides according to the present invention can also be polynucleotides modified so that it is not possible for them to integrate into the genome of the target cell or polynucleotides stabilized using agents, such as for example spermine.
  • the polynucleotide can be homologous or heterologous to the target cell. It may be advantageous to use a polynucleotide which codes for all or part of a polypeptide, in particular a polypeptide exhibiting a therapeutic or prophylactic activity, and more particularly an immunogenic activity of the cellular or humoral type.
  • polypeptide is understood without restriction as to its size or its degree of modification (for example of glycosylation).
  • a factor for regulating transcription, translation, replication, stabilization of the transcripts or an antibody, such as for example the gene coding for the protein CFTR, dystrophin, factor VIII or IX, E6 / E7 of HPV, MUC1, BRAC1, the interferon ⁇ , the interferon " ⁇ , interleukin (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, tumor necrotizing factor (TNF) alpha type, GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), the tk gene of the Herpes Simplex virus type 1 (HSV-1), the gene associated with retinoblastoma or p53 or all or part of immunoglobulins, such as the fragments F (ab) 2 , Fab ', Fab or anti-idiotypes (US 4,699,880) Of course, this list is not exhaustive and other genes can be used.
  • the complexes according to the invention are small (less than 500 nm, advantageously 200 nm and preferably 100 nm). Furthermore, the transfection experiments carried out show that advantageously the weight ratio of the lipid compound according to the invention to said polynucleotide is from 0.01 to 100. The optimal ratio is from 0.05 to 10.
  • the invention also relates to a process for the preparation of the cationic compound / anionic active substances complexes, the said process being characterized in that one or more lipids in cationic form or a composition according to the invention are present in which the lipid is under cationic form with one or more active substances comprising at least one negative charge and in that said complex is recovered, possibly after a purification step. It also relates to kits for preparing such complexes comprising one or more lipids or one or more compositions according to the invention.
  • one or more cationic compounds are dissolved with an appropriate quantity of solvent or mixture of solvents miscible in water, in particular ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or preferably a 1: 1 ethanol / DMSO mixture (v: v), so to form lipid aggregates according to a known method described for example in patent application WO-A-9603977, or according to a second variant, are suspended with an appropriate amount of a detergent solution such as an octylglucoside such as n -octyl ⁇ -D-glucopyranoside, or 6- 0- (N-heptylcarbomoyl) -methyl- ⁇ -D-glucopyranoside.
  • a detergent solution such as an octylglucoside such as n -octyl ⁇ -D-glucopyranoside, or 6- 0- (N-heptylcarbomoyl) -methyl- ⁇ -D-glucopyranoside.
  • the suspension can then be put in a buffer medium and mixed with a solution of active substance containing negative charges.
  • a neutral or zwitterionic lipid is present in the final complex, a known manner is formed before being dissolved in the water-miscible solvent or in the detergent solution, a film with a mixture containing a cationic compound and a neutral or zwitterionic lipid, such as for example DOPE.
  • the ratio between the positive charges of the cationic lipid and the negative charges of the active substance is between 0 , 05 and 20, in particular between 0.1 and 15 and preferably between 5 and 10.
  • This ratio between the number of positive charges of the compound (s) and / or cationic compositions and the number of negative charges of said active substance also constitutes an advantageous characteristic of the complex according to the invention.
  • the calculation to arrive at such a ratio will take into account the negative charges carried by the active substance and the amount of compound necessary will be adjusted to satisfy the ratio indicated above.
  • the quantities and concentrations for the other components are adjusted by as a function of their respective molar masses and of their number of positive and / or negative charges.
  • one or more cationic compounds or compositions are suspended in a buffer and then the suspension is subjected to sonication until visual homogeneity.
  • the lipid suspension is then extruded through two microporous membranes under appropriate pressure.
  • the lipid suspension is then mixed with a solution of active substance comprising negative charges.
  • a film of the mixture of cationic lipid and neutral lipid such as DOPE is formed before suspension, in a known manner.
  • This so-called sonication-extrusion technique is well known in the art.
  • the characteristics of the complexes formed can be evaluated by several means making it possible to determine, for example: the state of complexation with the active substance, in particular by searching for free nucleic acids by electropnoresis on agarose gel in the case where the substances are nucleic acids, -the size of the particles by quasi-elastic light scattering,
  • the present invention also relates to the complexes obtained by the implementation of the methods listed above.
  • the invention also relates to the use of a compound, a composition or a complex according to the invention for transferring at least one active substance, in particular therapeutically active, more particularly a nucleic acid, into target cells, in in vitro, ex vivo or in vivo, more particularly in vivo.
  • active substance in particular therapeutically active, more particularly a nucleic acid
  • target cells prokaryotic cells, yeast cells and eukaryotic cells, plant cells, human or animal cells, and in particular mammalian cells. Mention should also be made of cancer cells.
  • the invention can be applied to the interstitial or luminal space of tissues such as the lung, the trachea, the skin, the muscle, the brain, the liver, the heart, the spleen, the bone marrow, thymus, bladder, lymph, blood, pancreas, stomach, kidney, ovaries, testes, rectum, peripheral or central nervous system, eyes, lymphoid organs, cartilage, endothelium.
  • the target cell will be a muscle cell, a hematopoietic stem cell or even an airway cell, more particularly a tracheal or pulmonary cell, and advantageously a cell of the respiratory epithelium.
  • the complexes according to the invention can be used as a medicament, for curative, preventive or vaccine purposes. This is why the invention also relates to the complexes of the invention as a medicament for curative, preventive or vaccine purposes.
  • Such complexes can be used in a method of therapeutic treatment consisting in transferring at least one therapeutically active substance, in particular a polynucleotide, in target cells, in particular a mammalian cell, and more precisely a muscle cell, a hematopoietic stem cell, an airway cell, more particularly a tracheal or pulmonary cell, a cell of the respiratory epithelium.
  • a compound according to the invention is very particularly advantageous for transferring a nucleic acid into a muscle cell or a lung cell. This is the compound noted pcTG37 (see example).
  • the present invention also relates to a method for introducing an active substance comprising negative charges inside a cell, in particular in vitro, characterized in that cells, in particular cultured on an appropriate medium, are brought into contact with a cationic compound / active substance complex comprising at least one negative charge according to the invention, in particular in the form of a suspension of complexes. After a certain incubation time, the cells are washed and recovered. Verification of the introduction of the active substance can be carried out (possibly after lysis of the cell) by any suitable means.
  • introduction process is well known per se.
  • introduction is meant that the active substance comprising negative charges is transferred into the cell and is located, at the end of the process, inside said cell or at the level of the membrane thereof.
  • the active substance is a nucleic acid
  • verification of the transfection of the nucleic acid may be carried out by any appropriate means, for example by measuring the expression of the gene considered or the concentration of the expressed protein.
  • the invention relates more particularly to the use of a compound, composition or complex according to the invention for preparing a medicament for curative, preventive o "u vaccine for the treatment of the human body or animal, in particular by gene therapy.
  • the medicament can be administered directly in vivo (for example into a muscle, into the lungs by aerosol, etc.). It is also possible to adopt the ex vivo approach which consists in taking cells from the patient (stem cells from the bone marrow, lymphocytes in the peripheral blood, muscle cells, etc.), transfecting them in vitro according to the present invention and re-administering them. to the patient.
  • the complexes according to the invention can be administered by intramuscular, intratracheal, intranasal, intracerebral, intrapleural, intratumoral, intracardiac, intragastric, intraperitoneal, epidermal, intravenous, intraarterial syringe or any other equivalent means, systems suitable for the treatment of airways or mucous membranes such as inhalation, instillation, or aerosolization. Mention may also be made of the modes of administration by application of a cream, by oral administration or any other means perfectly known to those skilled in the art and applicable to the present invention.
  • a complex according to the invention prepared so as to adjust the compound or composition / therapeutically active substance ratio in said complex, the apparent charge of the complex (see in particular Liu et al, 1997, Gene Therapy, 4, 517-523; Thierry et al., 1995, PNAS, 92, 9742-9746).
  • the invention also relates to a method of gene therapy comprising administering to a patient an amount appropriate of a composition according to the invention.
  • a method of gene therapy comprising administering to a patient an amount appropriate of a composition according to the invention.
  • the administration may take place in a single or repeated dose one or more times after a certain period of time.
  • the repeated administration would make it possible to reduce the quantity of therapeutically active substance, of DNA more particularly, to be administered for a given dose
  • the route of administration and the appropriate dosage vary according to various parameters, for example the individual or the disease to be treated or the polynucleotide to be transferred.
  • the invention relates more particularly to a pharmaceutical preparation comprising at least one complex as described above, optionally also containing at least one adjuvant capable of stabilizing said pharmaceutical preparation for storage, for example, and / or of improving the transfection power. of said complex.
  • an adjuvant could for example be chosen from the group consisting of chloroquine, a polar protic compound chosen in particular from propylene glycol, polyethylene glycol, glycerol, ethanol, 1-methyl L -2-pyrrolidone or their derivatives , or an aprotic polar compound chosen in particular from dimethylsulfoxide (DMSO), diethylsulfoxide, di-n-propylsulfoxide, dimethylsulfone, sulfolane, dimethylformamide, dimethylacetamide, tetramethylurea, acetonitrile or their derivatives.
  • said preparation may contain a pharmaceutically acceptable carrier allowing its administration to humans or animals.
  • the invention relates to a cell transfected with a complex as defined above, particularly a prokaryotic cell, a yeast or eukaryotic cell, in particular an animal cell, in particular a mammalian cell, and more particularly a cancer cell.
  • said cell is an airway cell, more particularly a tracheal or pulmonary cell, and advantageously a cell of the respiratory epithelium.
  • FIG. 2 indicates the results observed after intravenous injection of complexes according to the invention, the luciferase activity is indicated in RLU / mg of protein).
  • the amino groups of the reaction product are protected by 99 mmol of BOC-ON [(2-boc-oxyimino) -2-phenylacetonitrile] (Fluka; reference 15475) in 50 ml of solvent CH 2 C1 2 / CH 3 0H 2 / 1.
  • the protective reaction is left overnight at room temperature.
  • the solvents are evaporated and the product is taken up in 75 ml of ethyl acetate for 3 extractions with 75 ml of 1M NaOH.
  • the organic phase is again extracted with 5% citric acid, then dried and filtered over Na 2 S0 before evaporation to dryness.
  • the nitriles reduction step is carried out, in ether at 0 ° C., in the presence of 20 mmol of L1AIH4 (Sigma; L0260). After 30 hours, the reaction is stopped by adding 20 ml of 1M NaOH at 0 ° C, with evolution of hydrogen. The mixture is filtered and extracted 3 times with a solution of 20% NaCl in water. After drying of the ethereal fraction, the product is deposited on a silica column in a solvent CH 2 C1 2 / CH 3 0H 2/1, then eluted in a solvent CH 2 C1 2 / CH 3 0H / (C 2 H 5 ) 3 N 15/5/1.
  • the Fmoc groups are removed from the product in a solution of 20% piperidine, 20% tetrahydrofuran and 60% CH 2 C1 2 for 1 hour. After evaporation, a further purification is carried out on a silica column in a solvent CH 2 C1 2 / CH 3 0H 1/1. The fractions containing the product are determined by thin layer chromatography. The product is dried before the last coupling.
  • 510 ⁇ mol of the N-hydroxysuccinimide ester of oleic acid (Sigma 0 9506) diluted in 5 ml of anhydrous CH 2 C1 2 is added .
  • the amounts of lipids are calculated based on the concentration of final DNA (0.1 mg / ml for the in vitro tests), the desired charge ratio, the molar mass and the number of positive charges for the cationic lipid chosen.
  • 0.1 mg DNA / ml or (0.1 / 330) mmol of negative charges correspond to 0.30 ⁇ mol / ml of negative charges.
  • a concentration of 3.0 ⁇ mol / ml of positive charges provided by the cationic lipid is required.
  • the molar mass of pcTG37 in the form of trifluoroacetate is 988 g / mol and the molecule contains 2 positive charges. So 1.5 ⁇ mol / ml of pcTG37 is required, which corresponds to 1.49 mg / ml.
  • the lipids are taken up in chloroform, dried by evaporation then solubilized in chloroform / methanol (v: v) and again dried.
  • the cationic lipids are weighed and the amount of DOPE is added from a stock solution of 10 or 20 mg / ml in chloroform in a glass tube sterilized with alcohol and UV to obtain a concentration of 2 mM in cationic lipid.
  • the solvents are evaporated in vacuo (0.2.105
  • the lipid film is taken up in ethanol to be at the concentration of 50 mg / ml in cationic lipid.
  • This solution is completed with 270 ⁇ l of 20 mM HEPES pH 7.5 (adjusted with NaOH) to prepare a solution at 5 mg / ml final.
  • the plasmid DNA is prepared from a 1 mg / ml stock solution (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5).
  • lipids are added to the DNA.
  • the suspension is mixed by aspiration / delivery with a pipette (10 times).
  • the complexes are stored at + 4 ° C.
  • 150 ⁇ l of pcTG37 / DOPE are added to 350 ⁇ l of the DNA solution to obtain 0.5 ml of 0.1 mg / ml DNA complex and a charge ratio of 10.
  • the preparation of the complexes is done under a laminar flow hood.
  • the complexes are obtained according to the same protocol as above.
  • lipid film is taken up in a solution of n-octyl, ⁇ -D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, 0 9882) according to a cationic lipid / detergent ratio of 1/5 (mole: mole).
  • plasmid DNA is prepared from a mother solution of plasmid DNA at 1 mg / ml from which 50 ⁇ l are taken for a final volume of 0.5 ml (0.1 mg / ml final) to which 262 are added, 5 ⁇ l of 20 mM HEPES pH 7.5.
  • 187.5 ⁇ l of the lipid suspension are added to the DNA by aspirating and discharging 10 times with a pipette to obtain the final suspension at 0.1 mg / ml in DNA and a charge ratio +/- of 10.
  • pH 7.5 dialysis microdiigts (exclusion threshold of 13.2 kD; Sartorius, Gôttingen, Germany).
  • the complexes DNA / dialyzed lipids are stored at + 4 ° C. The preparation is done in a laminar flow hood.
  • the amounts of lipids are calculated as described above based on the concentration of final DNA (0.1 mg / ml for the in vitro tests), the desired charge ratio, the molar mass and the number of positive charges. of the cationic lipid chosen.
  • the mixing of the lipids is done in a glass tube sterilized with alcohol and UV, to obtain a 2 mM solution of cationic lipid, as indicated above.
  • the solvents are evaporated and the lipid film is taken up in 900 ⁇ l of 20 mM HEPES pH 7.5 at 4 ° C for approximately 16 h.
  • the suspension is sonicated in a sonication bath (Bransonic 221) until visual homogeneity.
  • the lipid suspension is extruded through two membranes of 0.2 ⁇ m pore diameter (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) and rinsed with HEPES 20mM pH 7.5 (Extruder from Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) at a maximum pressure of 50 bars.
  • the lipid suspension is kept at room temperature for 1 hour.
  • 450 ⁇ l of the lipid suspension are added to 50 ⁇ l of a mother solution of the plasmid DNA (1 mg / ml) and mixed by suction / delivery 10 times with a pipette.
  • the lipid / DNA complexes are stored at + 4 ° C.
  • the preparations are made in a laminar flow hood. Protocol for the evaluation of DNA complexation by lipids
  • a 1% gel (w: v) of agarose is prepared in a TAE buffer (TAE: Tris " -4, 86g / l + sodium acetate 0.68g / l + EDTA 0.336g / l pH 7.8. If necessary, the sample is diluted in TAE then the blue sample buffer of bromophenol 0.083%, cyanol xylene FF 0.083%, glycerol 10% in water) is added so as to be at 50 ng of DNA / ⁇ l. The sample is briefly subjected to a vortex and left for 30 min at room temperature. As a control, the uncomplexed plasmid prepared at the same concentration is used.
  • the analyzes are carried out on a Coulter N4Plus (Coultronics France S.A., Margency, France) at 25 ° C after equilibration of the sample for 20 min. An aliquot of the sample is aspirated and discharged several times before being pipetted. the sample is diluted in the measuring tank and homogenized.
  • Coulter N4Plus Coultronics France S.A., Margency, France
  • the measurement of the diffracted light at 90 ° is made for 180 sec after 180 sec of waiting.
  • the range used goes from 3 nm to
  • the cells are seeded 24 h to 48 h before transfection in a 96-well culture dish at a rate of 5 ⁇ 10 3 to 10 4 cells per well, at approximately 30% confluence, and maintained at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% C0 2 and 95% air.
  • Transfections are performed with mixtures of varying amounts of lipid and plasmid DNA to determine charge ratios and optimal DNA concentrations per well.
  • the complexes used are prepared 24 h to 48 h before transfection and diluted in HamF 14 medium containing 40 ⁇ g / ml of gentamycin and 2 mM glutamine.
  • A549 cells Transfection of A549 cells with lipid complexes
  • the A549 cells are cultured in Eagle's medium modified by Dulbecco (DMEM) containing 10% fetal calf serum (Gibco BRL) 24 hours before the start of transfection in 96-well plates (2 ⁇ 10 4 cells per well) in a humid atmosphere at 37 ° C. and 5% CO 2 /95% air.
  • DMEM Dulbecco
  • Gibco BRL 10% fetal calf serum
  • lipid / DNA complexes are prepared in another microplate (lipid / DNA complexes at 0.1 mg / ml of DNA and at the indicated charge ratio): 44 ⁇ l (4.4 ⁇ g DNA), 22 ⁇ l ( 2.2 ⁇ g DNA), 5.5 ⁇ l (0.55 ⁇ g DNA) of stock solution in the first 3 wells, and 11 ⁇ l (0.11 ⁇ g DNA) of the stock solution diluted 10 times in the next well.
  • the volume is made up to 110 ⁇ l with DMEM and 100 ⁇ l are transferred to the A549 cells. Incubation is carried out with 4, 2, 0.5 and 0.1 ⁇ g of DNA per well for 4 hours.
  • DMEM + 30% of fetal calf serum 50 ⁇ l of DMEM + 30% of fetal calf serum are added 4 hours after the start of the transfection then 100 ⁇ l of DMEM + 10% of FCS 24 hours after the start of the transfection.
  • the transfections in the presence of 10% of fetal calf serum are carried out in an identical manner except that the transfection takes place in medium with serum.
  • the cationic lipid preparations pcTG37 were evaluated by in vitro transfection using A549 cells and primary dog myoblasts.
  • the intermediate NN '(di-boc) N, N' (dipropionitrile) 1, 4-diaminobutane is obtained by reaction of 37.6 mmol of diaminobutane (Fluka; reference 32790) diluted in 3.8 ml of dichloromethane + 2 ml of methanol at 0 ° C with 75.2 mmol of acrylonitrile (Fluka; reference 01710), one hour at 0 ° C.
  • the reaction product is blocked with 100 mmoles of BOC-ON [(2-boc-oxyimino) -2-phenylacetonitrile] (Fluka; reference 15475) in 50 ml of solvent CH 2 Cl 2 / CH 3 OH 2/1.
  • the blocking reaction is placed overnight at room temperature.
  • the solvents are evaporated and the product is taken up in 200ml of ethyl acetate and then subjected to 3 extractions with 200ml of 1M NaOH.
  • the organic phase is again extracted with 5% citric acid, dried and filtered over Na 2 S0 4 before evaporation to dryness.
  • a nitrile reduction step is then carried out in ether at 0 ° C., in the presence of 260 mmol of LiAlH4 (Sigma; L0260). After 15 hours, the reaction is stopped by adding 100 ml of 1M sodium hydroxide at 0 ° C, with evolution of hydrogen. The mixture is filtered and extracted
  • N, N 'diboc-spermidine The fractions containing N, N 'diboc-spermidine are determined by chromatography on RP-HPLC. A pure part of N, N ′ di-boc-spermidine is thus isolated from the other position isomers of di-boc-spermidine.
  • the reaction product is blocked with 109 mmoles of BOC-ON [(2-boc-oxyimino) -2-phenylacetonitrile] (Fluka; reference 15475) in 50 ml of solvent CH 2 C1 : / CH 3 0H 2/1.
  • the blocking reaction is placed overnight at room temperature.
  • the solvents are evaporated and the product is taken up in 300ml of ethyl acetate for 3 extractions with 300ml of 1M NaOH.
  • the organic phase is again extracted with 5% citric acid, dried and filtered over Na 2 S0 before evaporation to dryness.
  • the nitriles reduction step is then carried out in ether at 0 ° C.
  • the activated ester precipitates on addition and the reaction proceeds in heterogeneous phase for 15 hours with stirring at room temperature. And the same purification protocol (see N- ⁇ -N- ⁇ -Di [oleylamido] -propionic acid) is applied. Weighing: 0.14 g (0.15 mmol), yield: 15%.
  • the final product, taken up in 10ml CH 2 C1 2 is deprotected Boc by adding dropwise at 0 ° C 50ml of trifluoroacetic acid (Fluka 91699) redistilled at 72 ° C and diluted in 50ml CH 2 Cl 2 . After 4 hours, the mixture is evaporated 2 times at reduced pressure after dilution in 50 ml of n-hexane.
  • the product is taken up in 10 ml of ether, precipitated in hexane and filtered on filter paper. The product is taken up by washing the paper in a solvent CH 2 C1 2 / CH 3 0H 1/1. Controls on TLC (ethyl acetate), HPLC and NMR. Evaporation and weighing: 670 mg (0.68 mmol) yield: 47%.
  • Des- complexes according to the invention were synthesized according to the methods described above from the compound pcTG337, in the presence or in the absence of DOPE (2: 1, mol: mol), at a fixed charge ratio of 5, using a plasmid containing the luciferase gene pTG11033 (French patent application No. 97/08267).
  • mice used are female C57BL / 6 mice from 9 to 11 weeks old.
  • the mice are pretreated by injection of 50 ⁇ l of a preparation of chlodronate encapsulated in a liposome (see Van Rooijen and Sanders, 1994, J. Immunol. Methods, 174, 83-93) incorporated into a total volume of 200 ⁇ l (+ 150 ⁇ l of PBS buffer).
  • Intravenous injections are carried out in the tail after disinfection of the skin with 70% ethanol.
  • the volume injected is 250 ⁇ l and the quantity of DNA is 60 ⁇ g, the quantity of lipid is 345 ⁇ g.
  • mice Two days after the injections, the mice are sacrificed. After extraction, the tissues are frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. In order to measure the luciferase activity, the tissues are mechanically ground using a pestle in a mortar placed on the dry ice. 500 ⁇ l of a lysis buffer (Promega) are added to the tissue debris obtained from the lungs and subjected to three stages of freezing / thawing. Cellular debris is removed by centrifugation and the luciferase activity (in RLU / min, relative light unit per minute) is measured on 20 ⁇ l of supernatant according to the supplier's instructions (Promega) by adding 100 ⁇ l of reagent and measuring l by luminescence.
  • a lysis buffer Promega
  • the luciferase activity measured is standardized with respect to the protein quantity using a standard range produced from commercially available luciferase (Promega).
  • the amount of total protein is, moreover, determined by the colorimetric method of bicinchoninic acid. BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) from an aliquot of supernatant. This makes it possible "to express the luciferase activity in RLU per milligram of protein extracted from the tissues.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux composés lipidiques de formule (I): R-HN-[-(CH2)m - NR-]n-1 - (CH2)m-NH-R, dans laquelle les restes R sont, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe de formule (II), pour laquelle R1 et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C6-C23) alkyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des radicaux fluoroalkyle, des groupements polyéthylène glycol, des groupements oxyéthylène ou oxyméthyléne éventuellement répétés, linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, p est un nombre entier positif de 1 à 4, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)m, et plus particulièrement pour chaque motif -(CH2)m-NR- lorsque n > 1, le nombre de groupes R de formule (II) étant compris entre 1 et 4, lesdits composés étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquement acceptables. Elle concerne également de nouveaux complexes comprenant au moins undit composé cationique et une substance active comportant des charges négatives permettant l'introduction desdites substances actives dans les cellules. Elle concerne notamment de nouveaux complexes, dont la substance active consiste en un ou plusieurs acides nucléiques, utiles pour transfecter les cellules.

Description

NOUVEAUX COMPOSES LIPIDIQUES ET COMPOSITIONS LES CONTENANT
UTILISABLES POUR LE TRANSFERT D'AU MOINS UNE SUBSTANCE ACTIVE,
NOTAMMENT UN POLYNUCLEOTIDE, DANS UNE CELLULE CIBLE ET
UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne de nouveaux composés lipidiques et de nouvelles compositions les comprenant. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation desdits composés ou desdites compositions poαr préparer un vecteur de transfert d'une substance active, notamment thérapeutiquement comportant des charges négatives, notamment un polynucléotide, dans une cellule cible, particulièrement une cellule de vertébré, et plus particulièrement de mammifère.
Le transfert de gène dans une cellule donnée est la base même de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies graves pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces, voire inexistantes, et concerne aussi bien les maladies d'origine génétique (hémophilie, mucoviscidose, myopathie,...) qu'acquises (cancer, SIDA, ... ) .
Au cours des 30 dernières années, de nombreux outils ont été mis au point permettant l'introduction de divers gènes hétérologues dans des cellules, notamment des cellules de mammifère. Ces différentes techniques peuvent être divisées en deux catégories. La première catégorie concerne les techniques physiques telles que la microinjection, l' électroporation ou le bombardement particulaire qui, bien qu'efficaces, sont largement limitées à des applications in vitro et dont la mise en oeuvre est lourde et délicate. La seconde catégorie fait appel à αes techniques relatives à la biologie moléculaire et cellulaire poαr lesquelles le gène à transférer est associé à un vecteur de nature biologique ou synthétique qui favorise l' introduction dudi t ma érieJ . Actuellement, les vecteurs les plus efficaces sont des vecteurs viraux, en particulier adenoviraux ou retroviraux. Les techniques développées reposent sur les propriétés naturelles dont disposé-nt ces virus pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation de leur matériel génétique et faire pénétrer leur génome dans le noyau. Ces virus ont déjà fait l'objet de nombreuses études et certains d'entre eux sont d'ores et déjà employés à titre expérimental comme vecteurs de gènes chez l'homme en vue par exemple d'une vaccination, d'une immunothérapie ou d'une thérapie visant à suppléer une déficience génétique. Toutefois, cette approche virale présente de nombreuses limitations, notamment en raison de la capacité de clonage restreinte dans le génome viral, des risques de dissémination dans l'organisme hôte et dans l'environnement des particules virales infectieuses produites, du risque de mutagénèse artéfactuel par insertion dans la cellule hôte dans le cas des vecteurs retroviraux, et de la forte induction des réponses immunitaire et inflammatoire in vivo lors du traitement thérapeutique, limitant considérablement le nombre d' administrations pouvant être envisagées (Me Coy et al, 1995, Human Gène Therapy, 6, 1553-1560 ; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442). Ces nombreux inconvénients, notamment dans le cadre d'un usage chez l'homme, ont conduit plusieurs équipes à développer des systèmes alternatifs de transfert de polynucléotides .
Plusieurs méthodes non-virales sont disponibles à l'heure actuelle. Citons pour exemples la coprécipitation au phosphate de calcium, l'utilisation de récepteurs mimant les systèmes viraux (pour une revue voir Cotten et Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705-710), ou l'utilisation de polymères tels que le polyamidoamine (Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem. , 4, 372-379), ou de polymère tels que ceux présentés dans WO 95/24221 décrivant l'utilisation de polymères dendritiques, le document WO 96/02655 décrivant l'utilisation de polyethylene imine, ou de polypropylene imine et les documents US-A- 5 595 897 et FR 2 719 316 décrivant l'utilisation de conjugués de polylysine. D'autres techniques non virales s'appuient sur l'utilisation de liposomes dont l'intérêt à titre d'agent permettant l'introduction, à l'intérieur de cellules, de certaines macromolécules biologiques, telles que par exemple l'ADN, l'ARN, les protéines ou certaines substances pharmaceutiquement actives a été largement décrit dans la littérature. A cette fin, plusieurs équipes ont déjà proposé l'utilisation de lipides cationiques qui présentent une forte affinité à l'égard des membranes cellulaires et/ou des acides nucléiques. En effet, bien qu'il ait été montré, dans le cas des acides nucléiques, que ce type de macromolécule est capable de traverser la membrane plasmatique de certaines cellules in vivo (WO 90/11092), il n'en demeure pas moins que l'efficacité de la transfection observée est encore très limitée, en raison notamment de la nature polyanionique des acides nucléiques qui prévient leur passage au travers de la membrane cellulaire, présentant elle-même une charge apparente nette négative. Dés 1989 (Felgner et al., Nature, 337, 387-388) les lipides cationiques ont été présentés comme des molécules intéressantes pour favoriser l'introduction de grosses molécules anioniques, telles que les acides nucléiques, dans certaines cellules. Ces lipides cationiques sont capables de se complexer aux molécules anioniques tendant ainsi à neutraliser les charges négatives desdites molécules et à favoriser leur rapprochement vers les cellules. De nombreuses équipes ont déjà développé différents lipides cationiques. A titre d'exemples, on peut citer le DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417), le DOGS ou Transfectam™ (Behr et al ., 1989 , PNAS, 86, 6982-6986), le DMRIE et le DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), le DC-CHOL (Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), le DOTAPG (McLachlan et al., 1995, Gène Therapy, 2,674-622) ou la Lipofectamine^, ainsi que ceux décrits dans les demandes de brevet WO9116024 ou
W09514651.
Plus particulièrement, la demande de brevet WO-A-9116024 décrit des l'i-pides cationiques de formule :
(H
Figure imgf000006_0001
dans laquelle : Ri et R2 sont notamment des radicaux alkyle ou alcényle ; Yι,Y2 sont des radicaux -0CH2- , -OC(=0)- ou -0- ; R3, R sont des radicaux alkyle ou alcényle ; R5 est une chaîne alkylène ; Rs est -C (=0) - (CH2) m-NH-, un acide diaminocarboxylique ou -C(≈0)- (CH2)m-NH- lié audit acide diaminocarboxylique ;
R7 est H, spermine, spermidine, histone, une protéine, un amino acide, un polypeptide.
Toutefois, plusieurs travaux (à titre d'exemples, voir Mahato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267-1271, Thierry et al., 1995, P.N.A.S, 92, 9742-9746) ont mis en évidence que l' efficacité du transfert à l' intérieur des cellules de la macromolécule anionique pouvait varier en fonction notamment de l'interaction entre les complexes et les membranes cellulaires, de la cellule considérée, de la composition lipidique des composés cationiques, de la taille des complexes formés avec les molécules anioniques et plus particulièrement du rapport de charges positives et négatives des différents composants dudit complexe. Les mécanismes qui permettent en particulier l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et le transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont encore largement méconnus et les chercheurs procèdent dans leurs travaux selon une approche fortement empirique. D'autres facteurs, tels que par exemple la formation des complexes, la stabilité, le comportement in vivo, ou éventuellement leur toxicité, rendent en outre le choix des lipides à priori non évident. Il est par conséquent souhaitable de proposer, d ' autres lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés améliorées ou- différentes de ceux déjà décrits. Le déposant a aujourd'hui identifié de nouveaux composés lipidiques, qui peuvent se présenter sous forme cationique, utiles notamment pour transférer une substance active, notamment therapeutiquement comportant des charges négatives, notamment un polynucleotide, à l'intérieur d'une cellule cible, dont on peut envisager l' utilisation notamment in vivo dans le cadre d' une thérapie génique.
Ainsi, la présente invention a tout d'abord pour objet un composé lipidique de formule :
R-HN-[-(CH2)m - NR-]n_ι - (CH2)m-NH-R I
dans laquelle : les restes R sont, indépendamment les uns des autres, un atome d' hydrogène ou un groupe de formule II :
(CH2)P-NH-Rι II
-C-CH-NH-R, II 0 dans laquelle : Ri et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux C5-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C (=0) - (C6-C23) alkyle ou -C (=0) - (C5-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des radicaux fluoroalkyle, des groupements polyethylene glycol, des groupements oxyéthylène ou oxymethylene éventuellement répétés, linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, p est un nombre entier positif de 1 à 4, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)m , -et plus particulièrement pour chaque motif -(CH2)m-NR- lorsque n > 1, ' - le nombre de groupes R de formule II étant compris entre 1 et 4.
Par l' expression «alcényle», on entend que la chaîne carbonée peut comprendre une ou plusieurs double (s) liaison(s) le long de ladite chaîne. Selon un cas particulier, l'invention concerne un composé sélectionné parmi les composés de formules :
H2N-[- (CH2)m-NH-]n R III
RNH-[- (CH2)m-NH]n H Illa dans lesquelles :
R est un groupe de formule II tel que défini précédemment et H2N-[-(CH2)m-NR]n-1-(CH2)m-NH2 Illb dans laquelle :
R a l'une des significations indiquées pour la formule I pour autant qu'au moins un R est un groupe de formule II et pour chacune des formules : n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)m , et plus particulièrement pour chaque motif -(CH2)m-NR- lorsque n > 1.
Selon un cas préféré, les composés de formule Illb renferment un ou deux groupes R de formule II.
Selon des modes de réalisation préférés de l' invention, on choisira les variantes présentées ci-dessous, prises ou non en combinaison entre elles :
Ri et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux -C(=0)- alkyle linéaires ou -C(=0)- alcényle linéaires, - R: et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux - C(=0)- alkyle ou -C(=0)- alcényle, comprenant de 12 à 20 atomes de carbone, de préférence 12, 16 ou 18 atomes de carbone, lorsque le lipide comporte 1 ou 2 groupements R de formule II,
- n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4,
- m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
Selon un cas particulier, il est possible de diminuer la longueur de la chaîne alkyle ou alcényle de manière à ce que Rt et R2 soient des radicaux de 6 à 10 atomes de carbone mais dans ce cas on choisira de préférence des composés pour lesquels le nombre de groupes R de formule II est égal à 2, 3 ou 4.
De préférence, les lipides selon l'invention sont choisis dans le groupe constitué par les composés de formules suivantes:
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
pour lesquelles Ri et R2 sont identiques et choisis parmi les radicaux stéaroyle et oléoyle. Les composés selon l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle:
R3 et R4 sont des groupes protecteurs, notamment Fmoc (Grandas et al., 1989, Int. Journal pept . prot . Res. vol 33, 386-390) avec une aminé de formule :
R5NH[(-CH2)m-NR5]n-ι-(CH2)m NHR5 VI m, n ayant la même signification que pour la formule I, R5 étant un groupe protecteur, notamment le t- butoxycarbonyle (BOC) ou un atome d'hydrogène, au moins un des radicaux R5 et au plus quatre des radicaux R5 correspondant à 1' atome d' hydrogène .
Les fonctions N-R3, -N-R4 sont ensuite déprotégées pour fixer par amidation ou alkylation les radicaux Ri et R2 de manière connue, notamment par action de l'ester -N- hydroxysuccinimide correspondant.
Le composé obtenu est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique .
Les aminés de formule VI sont préparées de manière connue. Dans le cas où le composé de formule VI est la 1-4 di-boc- spermidine on se référera aux exemples indiqués ci-après pour connaître les modalités pratiques de synthèse. Les procédés décrits sont applicables en général aux synthèses des composés selon l'invention moyennant des adaptations à la portée de l'homme du métier. Toutefois, les composés de l'invention ne sauraient se limiter à ceux obtenus par les modes de préparation décrits précédemment .
Les composés selon l'invention peuvent en outre être substitués. De telles substitutions peuvent notamment consister en une molécule de marquage (voir molécules de marquage dans US 4711955) qui permet par exemple de visualiser la distribution des composés ou des complexes les renfermant après administration- in vitro ou in vivo, une molécule de ciblage cellulaire, une molécule d'ancrage. L'invention concerne par conséquent également un composé tel que présenté ci-dessus conjugué à un ou plusieurs éléments de ciblage, également appelés ligands d'intérêt, par l'intermédiaire d'au moins a) un des atomes de carbone, en particulier choisis parmi ceux présents sur les groupements Ri et/ou R2, ou b) un des atomes d' azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de l'acide diaminocarboxylique. De tels éléments peuvent permettre le ciblage vers un type cellulaire particulier, faciliter la pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir par exemple de tout ou partie de sucres, de peptides (peptide GRP, Gastrin Releasing Peptide, par exemple), d' oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogèniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés. On peut citer plus particulièrement les résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur asyaloglycoproteique à la surface des cellules hépatiques, le peptide fusogénique INF-7 dérivé de la sous-unité HA-2 de l' hémagglutinine du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 (Lanford et Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr (Ambinder et al., 1991, J. Virol . 65, 1466-1478).
De tels conjugués peuvent être aisément obtenus selon les techniques largement décrites dans la littérature, et plus particulièrement par couplage chimique, notamment en utilisant des groupes protecteurs tels que trifluoroacétyle ou Fmoc ou Boc sur la polyamine et plus particulièrement en utilisa-nt un ou plusieurs groupes protecteurs orthogonaux tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds . T.W. Greene, P. G. M. Wuts, Wiley) sur la polyamine ou l'acide diaminocarboxylique. La déprotection sélective d'un groupe protecteur permet alors de coupler l'élément de ciblage, et l'on déprotège ensuite le lipide. Il convient toutefois d' indiquer que la substitution des groupes non réactifs tels que les atomes de carbone dans les groupements CH ou CH2, sera réalisée en cours de synthèse des composés de l' invention selon des méthodes connues de l'homme du métier ; tandis que les groupes réactifs, tels que les aminés primaires ou secondaires, peuvent faire l'objet de substitutions sur les lipides de l'invention néosynthétisés .
Selon un cas avantageux de l'invention, ledit composé est sous forme cationique, c' est à dire qu' il est sous forme protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes d'azote présents sur la chaîne polyamine. Dans ce cas, ledit lipide cationique est associé à un ou plusieurs anions biologiquement acceptables, tels que par exemple l'anion trifluoroacétate, halogènure, monométhylsulfate, acétate ou phosphate, iodure, chlorure, bromure... Il est également possible d'obtenir des composés sous forme cationique par substitution des aminés par exemple avec un radical méthyl, éthyl, ...
Selon un autre aspect, l'invention concerne également une composition comprenant au moins un composé tel que décrit ci- dessus et éventuellement au moins un adjuvant susceptible d'améliorer la formation de complexe entre undit composé et une substance active, ou d'améliorer le fonctionnement de ces complexes vis-à-vis de la cellule.
De manière préférée, un tel adjuvant sera un lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple un lipide qui est ou dérive d'un triglycéride, d'un diglyceride, du cholestérol (voir par exemple US 5 438 044), en particulier, un lipide neutre ou zwitterionique qui est ou qui dérive d'une phosphatidyl éthanolamine - (PE), phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyéline, céramide ou cérébroside. De manière avantageuse, on choisira la dioleoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE) .
Le rapport en poids entre le composé de l' invention et le lipide neutre ou zwitterionique est généralement compris entre 0,1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la nature des composants considérés. L'homme du métier dispose des connaissances suffisantes pour permettre ces adaptations mineures. Il est également possible d'utiliser un mélange de lipides neutres et/ou zwitterioniques ou encore un mélange de lipides cationiques et de lipides neutres et/ou zwitterioniques. L' invention concerne en outre un complexe comprenant au moins un composé ou au moins une composition tels que décrits précédemment et au moins une substance active, notamment therapeutiquement comportant au moins une charge négative. Selon une variante de l' invention, ledit complexe peut en outre renfermer un ou plusieurs amphiphiles cationiques tels que ceux décrits dans la littérature dont des exemples ont ete proposes plus haut.
Selon un mode particulier de réalisation, ladite substance active, est choisie parmi les acides nucléiques et les protéines. De préférence, la substance active du complexe selon l'invention est un polynucleotide, ledit composé ou ladite composition permettant alors d'améliorer le pouvoir transfectant du polynucleotide dans une cellule.
Par «polynucleotide», on entend designer un fragment d'ADN et/ou d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isole ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucleotides, modifies ou non (voir a titre d'exemple US 5525711), marques ou non (voir, par exemple, US 4711955 ou EP 302175), permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Par polynucleotide on entend désigner notamment un cADN, un ADN génomique, un ADN plasmidique, "un ARN messager, un ARN antisens, un ribozyme, un ARN de transfert, un ARN ribosomique, ou un ADN codant pour de tels ARN. «Polynucleotide» ou «acide nucléique» sont des termes synonymes dans le cadre de la présente demande. Par "anti sens", on entend désigner un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d ΑRNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible; et par "sens", un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéique et impliquée dans l'expression d'un gène donné. Selon un mode de réalisation particulier de l' invention, ledit polynucleotide comprend un gène d' intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de réalisation, ledit polynucleotide est avantageusement sous forme de plasmide. Les éléments permettant l'expression sont l' ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requisent pour permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs tels que les promoteurs des virus RSV, MPSV, SV40, CMV ou 7.5k, du virus de la vaccine, les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d' informations relatives à de telles séquences promotrices. Par ailleurs, ledit polynucleotide peut comprendre au moins deux séquences, identiques ou différentes, présentant une activité de promoteur transcriptionnel- et/ou au moins deux séquences codantes d'ADN, identiques ou différentes, situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que la fonction de promoteur transcriptionnel ou la transcription desdites séquences ne soit pas affectée. De même, dans ce type de construction d'acide nucléique, il est possible d'introduire des séquences nucléiques «neutres» ou introns qui n' affectent pas la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature. Ledit polynucleotide pourra également renfermer des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration. De telles séquences sont bien connues de l'homme de l'art. Par ailleurs, les polynucléotides selon la présente invention peuvent également être des polynucléotides modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des polynucléotides stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine .
Dans le cadre de la présente invention, le polynucleotide peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut être avantageux d' utiliser un polynucleotide qui code pour tout ou partie d'un polypeptide, notamment un polypeptide présentant une activité thérapeutique ou prophylactique, et plus particulièrement une activité immunogène de type cellulaire ou humorale. Le terme polypeptide s'entend sans restriction quant à sa taille ou son degré de modification (par exemple de glycosylation) . On peut à titre d' exemples citer les gènes codant pour un enzyme, une hormone, une cytokine, un récepteur membranaire, un polypeptide structural, un polypeptide formant un canal membranaire, un polypeptide de transport, une molécule d' adhésion, un ligand, un facteur de régulation de la transcription, de la traduction, de la réplication, de la stabilisation des transcripts, ou un anticorps, tels que par exemple le gène codant pour la protéine CFTR, la dystrophine, le facteur VIII ou IX, E6/E7 de HPV, MUC1, BRAC1, l' interféron β, 1' interféron "γ, l' interleukine (IL) 2, l'IL-4, l' IL-6, l'IL-7, l'IL-12, le facteur nécrosant de tumeur (TNF) de type alpha, le GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) , le gène tk du virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) , le gène associé au rétinoblastome ou p53 ou tout ou partie d' immunoglobulines, telles que les fragments F(ab)2, Fab' , Fab ou les anti-idiotypes (US 4,699,880). Bien entendu, cette liste n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent être employés.
Selon un mode de réalisation préféré, les complexes selon 1' invention sont de faible taille (inférieure à 500 nm, avantageusement à 200 nm et de préférence à 100 nm) . Par ailleurs, les expériences de transfection réalisées montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit polynucleotide est de 0,01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0,05 à 10.
L' invention concerne également un procédé de préparation des complexes composés cationiques/substances actives anioniques, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs lipides sous forme cationique ou une composition selon l' invention dont le lipide est sous forme cationique avec une ou plusieurs substances actives comportant au moins une charge négative et en ce que l'on récupère ledit complexe, éventuellement après une étape de purification. Elle concerne également les kits pour préparer de tels complexes comprenant un ou plusieurs lipides ou une ou plusieurs compositions selon l'invention. Dans un premier temps, selon une première variante, un ou plusieurs composés cationiques sont mis en solution avec une quantité appropriée de solvant ou mélange de solvants miscibles dans l'eau, notamment l'éthanol, le diméthylsulfoxide (DMSO),ou de façon préférée un mélange éthanol/DMSO 1:1 (v:v), de manière à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9603977 , ou selon une seconde variante, sont mis en suspension avec une quantité appropriée d' une solution de détergent comme un octylglucoside tel que le n-octyl β-D-glucopyranoside, ou le 6- 0- (N-heptylcarbomoyl ) -méthyl-α-D-glucopyranoside .
La suspension peut ensuite être mise dans un milieu tampon et mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où l'on souhaite qu'un lipide neutre ou zwitterionique soit présent dans le complexe final, on forme, de manière connue, préalablement à la mise en solution dans le solvant miscible à l'eau ou dans la solution de détergent, un film avec un mélange renfermant undit composé cationique et undit lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple la DOPE.
Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans le choix du rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active. Sans vouloir être limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre le nombre de charges positives du composé ou de la composition cationique et le nombre de charges négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20, notamment entre 0,1 et 15 et de préférence entre 5 et 10.
Ce rapport entre le nombre de charges positives du ou des composés et/ou compositions cationiques et le nombre de charges négatives de ladite substance active constitue également une caractéristique avantageuse du complexe selon l'invention. Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en considération les charges négatives portées par la substance active et on ajustera la quantité de composé nécessaire pour satisfaire au rapport indiqué ci-dessus. Les quantités et les concentrations pour les autres composants sont ajustées en fonction de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives et/ou négatives.
Dans le cas de la seconde variante et de manière optionnelle,"- on peut procéder à une dialyse subséquente pour réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe d'une telle méthode est par exemple décrit par Hofland et al. (1996, PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre II du document Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993) .
On a montré que la première variante conduit à d'excellents résultats en terme de taille des complexes obtenus .
Selon une troisième variante, un ou plusieurs composés ou compositions cationiques, sont mis en suspension dans un tampon puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est ensuite extrudéε au travers de deux membranes microporeuses sous pression appropriée. La suspension lipidique est alors mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension, un film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE de manière connue. Les mêmes remarques concernant le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette troisième variante. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien connue dans l'art.
Les caractéristiques des complexes formés peuvent être évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer, par exemple : -l'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par electropnorese sur gel d' agarose dans le cas où les substances sont des acides nucléiques, -la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière,
-l'absence de précipitation à long terme.
La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par la mise en oeuvre des procédés énumérés ci-dessus.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour transférer au moins une substance active, notamment therapeutiquement active, plus particulièrement un acide nucléique, dans des cellules cibles, in vitro, ex vivo ou in vivo, plus particulièrement in vivo.
Par «cellules cibles» selon l' invention, on entend les cellules procaryotes, les cellules de levure et les cellules eucaryotes, les cellules de plantes, les cellules humaines ou animales, et en particulier les cellules de mammifère. Il convient par ailleurs de citer les cellules cancéreuses. In vivo, l'invention peut être appliquée au niveau de l'espace interstitiel ou luminal de tissus tels que le poumon, la trachée, la peau, le muscle, le cerveau, le foie, le coeur, la rate, la moelle osseuse, le thymus, la vessie, la lymphe, le sang, le pancréas, l'estomac, le rein, les ovaires, les testicules, le rectum, le système nerveux périphérique ou central, les yeux, les organes lymphoïdes, les cartilages, l' endothélium. Selon un choix avantageux de l'invention, la cellule cible sera une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique ou encore une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de l' épithélium respiratoire.
Les complexes selon l' invention sont utilisables à titre de médicament, à but curatif, préventif ou vaccinal. C'est pourquoi l'invention a également pour objet les complexes de l'invention à titre de médicament à but curatif, préventif ou vaccinal. De tels complexes peuvent être mis en oeuvre dans une méthode de traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans des cellules cibles, notamment une cellule de mammifère, et plus precisemment une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une cellule de l' épithélium respiratoire.
Un composé selon l'invention est tout particulièrement intéressant pour transférer un acide nucléique dans une cellule musculaire ou une cellule pulmonaire. Il s'agit du composé noté pcTG37 (voir exemple) .
Plus largement, la présente invention concerne également un procédé pour introduire une substance active comportant des charges négatives à l'intérieur d'une cellule notamment in vitro, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules, notamment cultivées sur un milieu approprié avec un complexe composé cationique/substance active comportant au moins une charge négative selon l'invention, notamment sous forme d'une suspension de complexes. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées. La vérification de l' introduction de la substance active peut être effectuée (éventuellement après lyse de la cellule) par tout moyen approprié .
Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par le terme «introduction» on entend que la substance active comportant des charges négatives est transférée dans la cellule et est localisée, en fin de procédé, à l'intérieur de ladite cellule ou au niveau de la membrane de celle-ci. Dans le cas où la substance active est un acide nucléique, on parlera plus particulièrement de «transfection» . Dans ce cas, la vérification de la transfection de l'acide nucléique pourra être effectuée par tout moyen approprié, par exemple par mesure de l'expression du gène considéré ou de la concentration de la protéine exprimée . L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour la préparation d'un médicament à but curatif, préventif o"u vaccinal, destiné au traitement du corps humain ou animal, notamment par thérapie génique.
Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter in vitro selon la présente invention et de les réadministrer au patient .
Les complexes selon l' invention peuvent être administrés par voie intramusculaire, intratrachéale, intranasale, intracérébrale, intrapleurale, intratumorale, intracardiaque, intragastrique, intrapéritonéale, épidermique, intraveineuse, intraartérielle par seringue ou tout autre moyen équivalent, les systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou l' aérosolisation. On peut également citer les modes d'administration par application d'une crème, par administration orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art et applicable à la présente invention. II est également dans la portée de l' invention de cibler des organes ou des tissus particuliers par administration, notamment par voie intraveineuse, d'un complexe selon l'invention préparé de façon à ajuster le rapport composé ou composition/substance therapeutiquement active dans ledit complexe, la charge apparente du complexe (voir notamment Liu et al, 1997, Gène Therapy, 4, 517-523 ; Thierry et al., 1995, P.N.A.S. , 92, 9742-9746) .
L' invention concerne également un procédé de thérapie génique consistant à administrer à un patient une quantité appropriée d'une composition selon l'invention. Selon la présente invention et dans le cadre d'une thérapie qénique in vivo, il est possible de répéter plusieurs fois, chez un patient donné, le "procédé tel que proposé sans » qu'aucune réaction immunitaire majeure ne soit déclenchée à l' encontre de l'un des composés administrés. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. L'administration répétée permettrait de réduire la quantité de substance therapeutiquement active, d'ADN plus particulièrement, à administrer pour une dose donnée. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du polynucleotide à transférer.
L' invention concerne plus particulièrement une préparation pharmaceutique comprenant au moins un complexe tel que décrit précédemment, renfermant éventuellement en outre au moins un adjuvant capable de stabiliser ladite préparation pharmaceutique en vue de son stockage par exemple et/ou d'améliorer le pouvoir de transfection dudit complexe. Un tel adjuvant pourrait par exemple être choisi parmi le groupe consistant en la chloroquine, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyethylene glycol, le glycérol, l'éthanol, le 1-methyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, ou un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO) , le diéthylsulfoxide, le di-n- propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacetamide, la tetraméthylurée, l' acétonitrile ou leurs dérivés. De même, ladite préparation peut renfermer un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique permettant son administration à l'homme ou l' animal .
Dans le cadre de la mise en oeuvre d' un procédé de traitement in vivo selon la présente invention, il est en outre possible d'effectuer, avant l'administration d'une préparation pharmaceutique telle que décrite précédemment, un traitement du patient visant à observer une déplétion temporaire des macrophages permettant d'améliorer le taux de transfection. Une telle technique est décrite dans la littérature, voir notamment Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184.
Enfin, l'invention concerne une cellule transfectée par un complexe tel que défini précédemment, particulièrement une cellule procaryote, une cellule de levure ou eucaryote, notamment une cellule animale, en particulier une cellule de mammifère, et plus particulièrement une cellule cancéreuse. Selon un cas préféré de l' invention, ladite cellule est une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de 1' épithélium respiratoire. Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la limiter en aucune façon. Un schéma de synthèse explicatif faisant partie intégrante de la description est annexé (Figure 1). La figure 2 indique les résultats observés après injection intraveineuse de complexes selon l'invention, l'activité luciférase est indiquée en RLU/mg de protéine) .
EXEMPLES
La préparation du lipide cationique de formule I dans laquelle R, R2 identiques sont les radicaux oléoyle ou stéaroyle n = 2 ; ma = 3, mβ = 4 est décrite ci-dessous en liaison avec le schéma de synthèse représenté à la figure 1. α et β sont les positions des motifs -(CH2)rn-NH- à partir du carbonyle .
Synthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, ma = 3, mβ = 4 , R = oléoyle (pcTG37) (voir figure 1) Synthèse de l'intermédiaire 1-4 di-boc-spermidine
Le protocole appliqué pour obtenir le 1, 4-di-boc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-3286). En pratique, l'intermédiaire N-propionitrile 1 , 4-diaminobutane est obtenu par réaction de 37,6 mmoles de diaminobutane (Fluka ; référence 32790) dilué dans 3,8 ml de dichloromethane + 2 ml de méthanol à 0°C avec 18,8 mmoles d' acrylonitrile (Fluka référence 01710) pendant 1 heure à 20°C. Les groupements aminés du produit de la réaction sont protégés par 99 mmoles de BOC-ON [ (2-boc-oxyimino) -2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50 ml de solvant CH2C12/CH30H 2/1. La réaction de protection est laissée la nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 75 ml d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 75 ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% d'acide citrique, puis sèchée et filtrée sur Na2S0 avant évaporation à sec. Puis on procède à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 20 mmoles de L1AIH4 (Sigma ; L0260). Après lheure 30, la réaction est arrêtée par addition de 20 ml de NaOH 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20% dans de l'eau. Après séchage de la fraction éthérée, le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2C12/CH30H 2/1, puis élue dans un solvant CH2C12/CH30H/ (C2H5) 3N 15/5/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le di- boc-spermidine . données de RMN : RMN-1H (200 MHz, CDC13) : 1,43-1,48 ppm (s, 18 H, Boc) , 1,48-1,72 ppm (m, 6H, NH (Boc) -CH2-CH2-CH2-CH2- N (Boc) -CH2-CH2-CH2-NH2) , 2,69 ppm (t, 2H, J = 6, 7 Hz, -CH2-NH2), 3,07-3,25 ppm (m, 6H, NH (Boc) -CH2-CH2-CH2-CH2-N (Boc) -CH2-CH2-CH2- NH2), 4,59 ppm (b, 1H, NH(Boc)).
Quantité synthétisée (1,45 g ; 5,1 mmol) - rendement 27 *> par rapport à la quantité d' acrylonitrile . Synthèse du pcTG37
On ajoute à 140 μmoles de N-α N-β, di-Fmoc- diaminopropionique (Bachem B2265) 140 μmoles de N- hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006) , puis 140 μmoles de di-boc- spermidine dans 1 ml de tétrahydrofuranne anhydre, et enfin 180 μmoles de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma ; D3128) dilué dans 2 ml CH2C12. Après 2 heures de réaction, on- filtre le dicyclohexylurée formé et on purifie le produit sur colonne de silice dans- un solvant CH2C12/CH30H 99/1. Après evaporation, on élimine les groupements Fmoc du produit dans une solution de 20% pipéridine, 20% tétrahydrofurane et 60% CH2C12 pendant 1 heure. Après evaporation, on procède à une nouvelle purification sur colonne de silice dans un solvant CH2C12/CH30H 1/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le produit. Le produit est séché avant le dernier couplage. Au di- boc-spermidine-diaminopropionamide, on ajoute 510 μmoles de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma 0 9506) dilué dans 5 ml de CH2C12 anhydre. Après evaporation, le produit est purifié sur colonne de silice (éther / acétate d'éthyle ; 1/1) . Le produit final, repris dans 1 ml de CH2C12 est déprotégé Boc dans 10 ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699). Pour éliminer l'acide trifluoroacétique on évapore à pression réduite après dilution dans 50 ml de n-hexane .
Rendement global de synthèse : 64 % (89 mg ; 90 μmol) RMN-,H (200 MHz, CDC13/CD30D : 0,81 ppm (t, j = 6, 4 Hz, 6H, - CH3) , 1,22-1,3 ppm (m, 44 H, -CH2-), 1,51 ppm (m, 4 H, -CH2-CH:- CO-NH-), 1,72-1,90 ppm (m, 6 H, NH3 + -CH2-CH:-CH2-CH:-NH: + -CH2-CH2- CH:-NH-) , 1,92 ppm (m, 8 H, CH2-CH=) , 2,07-2,2 ppm (m, 4 H, CH- CO-NH-), 2,89 ppm (m: 6 H, NH3 + -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2" -CH2-CH2-CH2- NH-), 4,22 ppm (t, 1 H, NH-CO-CHR-NH-) , 5,27 ppm (m, 4H,-CH=). Spectrométrie de masse : mesurée 759,7 Da (calculée 760,2 Da) .
Synthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, ma = 3, mβ = 4 ; R = stéaroyle (lipide pcTG39) Le composé pcTG39 est préparé à l'échelle de 140 μmoi de la même façon en utilisant l' acide stéarique et le dicyclohéxylcarbodiimide ou de la (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) comme agent de couplage. Rendement global de synthèse : 22 % (30 mg ; 30 μmol) RMN-:H (200 MHz, CDCl3/CD3OD/D20) : 0,68 ppm (t, j = 6,8 Hz, 6H, -CH3), 1,06 ppm (m, 48 H, -CH2-) , 1,37 ppm (m, 4 H, -CH2-CH2- CO-NH-), 1,'5-3-1, 75 ppm (m, 6 H, NH3 + -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 + -CH2-CH2- CH2-NH-) , 1,90-2,30 ppm (m, 4 H, CH2-CO-NH=) , 2,74 ppm (m, 6H, NH3 + -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 + -CH2-CH2-CH2-NH- ) , 3,25-3,55 ppm (m, 4 H, -CH2-NH-CO-) .
Spectrométrie de masse : mesurée 764,5 Da (calculée 764,3 Da) . Préparation des complexes lipides-ADN par mise en suspension dans l'éthanol
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE, -ADN
Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG37/DOPE et de l'ADN plasmidique à un ratio de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par l'ADN à une concentration d'ADN finale de 0,1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon le calcul suivant :
0,1 mg d'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives (330 Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à 0,30 μmole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration de 3,0 μmole/ml de charges positives apportées par le lipide cationique. La masse molaire de pcTG37 sous forme de trifluoroacétate est de 988 g/mole et la molécule contient 2 charges positives. Donc il faut 1,5 μmole/ml de pcTG37 ce qui correspond à 1,49 mg/ml.
Pour obtenir une concentration équimolaire en L-α- Dioleoyl-phosphatidyléthanolamine (DOPE, 744 g/mole, Sigma P0510) , il en faut 1,12 mg/ml dans la préparation lipidique. Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives.
Les lipides sont repris dans du chloroforme, séchés par evaporation puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (v:v) et à nouveau séchés. Les lipides cationiques sont pesés et la quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10 ou 20 mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2 mM en lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (0,2.105
Pa (200 mbar) ) pendant 45 min à 45°C en utilisant un vortex de
40 tours par minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried,
Allemagne). Le film lipidique est repris dans de l'éthanol pour être à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique. pcTG37/DOPE 1,49 mg + 1,12 mg = 2,61 mg dans 30 μl d'éthanol. Cette solution est complétée avec 270 μl d' HEPES 20mM pH 7,5 (ajusté avec NaOH) pour préparer une solution à 5 mg/ml finale .
L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère à 1 mg/ml (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5).
Pour une solution de 0,5 ml finale, on prélève 50 μl de la solution mère (50 μg ADN) auxquels on ajoute 300 μl d' HEPES 20mM pH 7,5.
Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par aspiration/refoulage à la pipette (10 fois). Les complexes sont conservés à + 4°C.
150 μl de pcTG37/DOPE sont ajoutés à 350 μl de la solution ADN pour obtenir 0,5 ml de complexe à 0,1 mg/ml ADN et un rapport de charges de 10.
La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux laminaire .
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après . 2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement DOPE, -ADN
On obtient les complexes selon le même protocole que précédemment.
Préparation des complexes lipides-ADN par mise en suspension dans une solution de détergent
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE, -ADN Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci- dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro) , le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, β-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, 0 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole :mole) .
On prélève 375 μl d'une solution d ' octylglucoside 20 mM dans de l' HEPES 20 mM pH 7,5, avec lesquels on reprend le film de mélange lipidique pcTG37/DOPE. L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont on prélève 50 μl pour un volume final de 0,5 ml (0,1 mg/ml final) auxquels on ajoute 262,5 μl d' HEPES 20 mM pH 7,5. 187,5 μl de la suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale à 0,1 mg/ml en ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour éliminer le détergent une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de l' HEPES 20 mM pH 7,5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion de 13,2 kD ; Sartorius, Gôttingen, Allemagne). Les complexes ADN/lipides dialyses sont conservés à + 4°C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire.
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées da'ns le tableau 1 ci-dessous.
2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement DOPE,- ADN
Selon le même protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.
Préparation des complexes lipides-ADN par sonication extrusion
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci- dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro) , le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. La mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 μl d' HEPES 20 mM pH 7,5 à 4°C pendant environ 16 h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221) jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0,2 μm de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rincée avec de l' HEPES 20mM pH 7,5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure. 450 μl de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 μl d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4°C. Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire. Protocole d'évaluation de la complexation de l'ADN par les lipides
Un gel à 1% (w:v) d' agarose est préparé dans un tampon TAE (TAE : Tris"-4, 86g/l + acétate de sodium 0, 68g/l + EDTA 0,336g/l pH 7,8. Si nécessaire, l'échantillon est dilué dans du TAE puis on ajoute le tampon d'échantillon bleu de bromophénol 0,083%, cyanol xylène FF 0,083%, glycérol 10% dans l'eau) de façon à se trouver à 50 ng d'ADN/μl. L'échantillon est brièvement soumis à un vortex et laissé 30 min à température ambiante. A titre de témoin, on utilise le plasmide non complexé préparé à la même concentration. 10 μl (500 ng d'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. Le gel est révélé dans du TAE contenant 0,006% (v:v) de bromure d'ethidium à 10 mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV.
Protocole de mesure de la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière
Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics France S.A., Margency, France) à 25°C après équilibration de l'échantillon pendant 20 min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'être pipettée. l'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénéisé.
La mesure de la lumière diffractée à 90° est faite pendant 180 sec après 180 sec d'attente. La gamme utilisée va de 3 nm à
10 000 nm en utilisant 31 bins . Pour être valable, l'échantillon doit donner entre 50 000 et 1 000 000 counts/sec.
Caractéristiques physico-chimiques Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol", "dialyse de détergent" et «sonication-extrusion» sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10 ou 5. Les formulations sont considérées comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d' agarose) et que les- complexes présentent des ' diamètres déterminés par diffusion quasi élastique dé- la lumière inférieurs à 500 nm. Le tableau 1 résume les résultats de ces analyses. Tous les complexes ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement.
TABLEAU 1
Figure imgf000031_0001
1 : Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN.
2 : Les populations qui représentent moins de 10 % de l'intensité ne sont pas indiquées. La taille est déterminée 24- 48 heures après la préparation.
Ces analyses montrent que les formulations remplissent les exigences requises. La méthode "injection d'éthanol" donne les meilleurs résultats, les différentes préparations testées présentant une taille inférieure à 100 nm. La méthode par dialyse de détergent ou de sonication/extrusion permet également d'obtenir des complexes répondant aux critères de la présente invention. Transfection in vitro de cellules satellites
Des cultures de muscles de chien et de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté" -avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 μg/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux) , et 40 μg/ml de gentamycine (Schering Plough) .
Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la transfection dans une boîte de culture à 96 puits à raison de 5xl03 à 104 cellules par puits, à environ 30 % de confluence, et maintenues à 37°C en atmosphère contenant 5 % C02 et 95 % d'air.
Les transfections sont effectuées avec des mélanges de quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN optimales par puits.
Les complexes utilisés sont préparés 24 h à 48 h avant la transfection et dilués dans le milieu HamF 14 contenant 40 μg/ml de gentamycine et 2mM de glutamine.
Après élimination du milieu de culture, 100 μl de mélanges de transfection avec ou sans 10 % de FCS sont transférés dans chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37°C.
Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à 10% de FCS, 10 μg/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ) , 2 mM de glutamine (bioMérieux), et 40 μg/ml de gentamycine (Schering Plough) pour un volume final de 250 μl. Les cultures sont incubées pendant 48h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations de protéines sont déterminées par le système de test de quantité de protéine (Promega) . Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques Les cellules A549 (cellules épithéliales dé-rivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 96 puits (2 x 104 cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37°C et 5% C02/95% air. Pour la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et remplacé par du milieu sans sérum. On prépare dans une autre microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes (complexes lipides/ADN à 0,1 mg/ml d'ADN et au rapport de charges indiqué) : 44 μl (4,4 μg ADN), 22 μl (2,2 μg ADN), 5,5 μl (0,55 μg ADN) de solution stock dans les 3 premiers puits, et 11 μl (0,11 μg ADN) de la solution stock diluée 10 fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 μl avec du DMEM et 100 μl sont transférés sur les cellules A549. L'incubation se fait avec 4, 2, 0,5 et 0,1 μg d'ADN par puits pendant 4 heures. 50 μl de DMEM + 30% de sérum de veau foetal sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis 100 μl de DMEM + 10% de FCS 24 heures après le début de la transfection. Les transfections en présence de 10% de sérum de veau foetal sont réalisées d'une façon identique sauf que la transfection se passe dans du milieu avec sérum.
Analyse de la transfection
48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 μl de solution phosphate PBS et lysées avec 50 μl de tampon de lyse (Promega) . Les lysats sont congelés à -80°C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase. Celle-ci se fait sur 20 μl de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la luciférase» (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 96 puits en mode cinétique. Transfection in vitro
Les préparations de lipides cationiques pcTG37 ont été évaluées en tranfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les myoblastes primaires de chien.
Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous et montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les valeurs données sont obtenues avec 0,5 μg d'ADN par puits. Tous les complexes sont préparés en utilisant la méthode d'injection d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA, Pierce) . A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 μg de protéine.
TABLEAU 2
Figure imgf000034_0001
1 : Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN. 2 :ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative.
Un autre mode de synthèse des composés selon l'invention a été mis au point 1. Synthèse de la partie polyaminée
1.1. Afin de pouvoir synthétiser des composés «T-branchés» pour lesquels le groupe R de formule II est fixé sur les aminés secondaires, une N, ' di-boc-spermine a été synthétisée. Le protocole appliqué pour obtenir le 1 , 4-diboc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46,3267-3286).
L'intermédiaire le N-N' (di-boc) N,N' (dipropionitrile ) 1 , 4- diaminobutane est obtenu par réaction de 37,6 mmoles de diaminobutane (Fluka; référence 32790) dilué dans 3,8ml de dichloromethane + 2ml de méthanol à 0°C avec 75,2mmoles d ' acrylonitrile (Fluka; référence 01710), lheure à 0°C. Le produit de la réaction est bloqué par lOOmmoles de BOC-ON [(2- boc-oxyimino) -2-phénylacétonitrile] (Fluka; référence 15475) dans 50ml de solvant CH2Cl2/CH3OH 2/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 200ml d'acétate d'éthyle puis soumis à 3 extractions avec 200ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% acide citrique, sèchée et filtrée sur Na2S04 avant evaporation à sec. On procède alors à une étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 260 mmoles de LiAlH4 (Sigma; L0260). Après 15heures, la réaction est arrêtée par addition de 100ml de soude 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait
3 fois avec une solution de NaCl 20%. Après séchage de la fraction éthérée, le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2C12/CH30H 1/1, puis élue dans un solvant CH2C12/CH30H/ (C2H5) 3N 15/5/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le di-boc-spermine . Pesée du produit final: 2,45g (5,8mmoles). Rendement global:15,5% 1.2. Synthèse de N,N' di-boc-spermidine à partir de la spermidine . 20mmoles de spermidine (Sigma S2626) dilués dans 20ml de dichloromethane ajoutés à 20ml de méthanol, llmmoles (2ml) de di'i-sopropyléthylamine à 0°C et 40mmoles de BOC-O-BOC [di- (tert-butyl) -dicarbonate] (Fluka; référence 34660) dans 80ml de solvant CH2C12/CH30H 1/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés puis le produit est déposé sur colonne de silice, et élue dans des palliers de solvants CH2C12/CH0H de 9/1 à 8/2. On détermine par chromatographie sur RP-HPLC les fractions contenant le N, N' di- boc-spermidine . Une partie pure de N,N' di-boc-spermidine est ainsi isolée des autres isomères de position de di-boc- spermidine. Pesée du produit final: 0,58g (l,68mmoles) Rendement global: 8,5% 1.3 Nouveau procédé de synthèse du 1-4 di-boc-spermidine : 50 mmoles de diaminobutane (Fluka; référence 32790) dilué dans 50ml de dichloromethane sont ajoutés à 20ml de méthanol à 0°C avec 58mmoles d ' acrylonitrile (Fluka; référence 01710) et placé lheure à 0°C. Le produit de la réaction est bloqué par 109mmoles de BOC-ON [ ( 2-boc-oxyimino) -2-phénylacétonitrile] (Fluka; référence 15475) dans 50ml de solvant CH2C1:/CH30H 2/1. La réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 300ml d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 300ml de NaOH 1M. La phase organique est à nouveau extraite avec 5% acide citrique, sèchée et filtrée sur Na2S0 avant evaporation à sec. On procède ensuite à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0°C, en présence de 140 mmoles de LiAlH4 (Sigma; L0260) . Après 15heures, la réaction est arrêtée par addition de 100ml de soude 1M à 0°C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20%. Après séchage de la fraction éthérée, le produit est prêt à être déposé sur colonne de silice pour la purification finale. 2 . Synthèse de la partie hydrophobe
Synthèse de l'acide N-α-N-β-Di [oleylamido] -propionique . A 4 , Immoles (0.58g) de N-α-N-β-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans "un mélange de 22ml d'eau, 44ml de dioxane et 20,5mmoles (2,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 9,04mmoles (3,43g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma O 9506) dilué dans 10ml dioxane. Après 2 heures de réaction, on procède à 2 extractions à l'éther/HCl 5%, puis lavage NaCl saturé et séchage sur Na2S04 avant evaporation à sec de la fraction éthérée. Le produit est déposé sur colonne de silice dans un solvant CH2C12/CH0H 95/5, puis élue dans des palliers de solvants CH2Cl2/CH3OH95/5, puis 92, 5/7, 5, et enfin 90/10. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant l'acide n-α-n-β- di [oleylamido] - propionique.. Contrôle sur CCM (CH2C12/CH30H 90/10) et RMN. Séchage . Pesée : 0, 916g (1, 45mmoles) , rendemement : 35 , 4% .
Synthèse de l'acide N-α-N-β-Di [laurylamido] -propionique . A Immole (0.14g) de N-α-N-β-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles (0,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2 , 2mmoles (0, 65g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide laurique (Sigma L3900) dilué dans 10ml dioxane. Le même protocole de purification (voir l'acide N-α-N-β-Di [oleylamido] -propionique) est appliqué. Pesée:0,4g (0,5mmole), rendemement : 50% .
Synthèse de l'acide N-α-N-β- Di [palmitylamido] -propionique . A Immole (0.14g) de N-α-N-β-diaminopropionique acide, HCl (Bachem F3040) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles (0,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2 , 2mmoles (0, 79g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide palmitique (Sigma P1162) dilué dans 10ml dioxane. L'ester activé précipite à l'addition et la réaction procède en phase hétérogène pendant 15 heures sous agitation à température ambiante. Et le même protocole de purification (voir l'acide N-α-N-β-Di [oleylamido] -propionique) est appliqué. Pesée:0,14g (0,15mmole), rendemement : 15% .
3. Nouvelle synthèse de pcTG37
A l,45mmoles (500mg) de 1, 4di-boc-spermidine dilué dans 30ml CHC13 anhydre, on ajoute l,45mmoles 916mg de l'acide N-α-N-β- di [oleylamido] -propionique, l,74mmoles (235mg) de N hydroxybenzotriazole (Sigma; H2006), 2mmoles (265μl) de diisopropyléthylamine, et enfin 2,175mmoles (449mg) de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma; D3128) dilué dans 10ml CHC13. Après 2 heures de réaction on filtre et après evaporation, on redilue dans ether/hexane 50/50, on procède à une nouvelle filtration-évaporation. Ce produit est purifié sur colonne de silice déposé dans l'ether et élue dans des palliers de solvant éther / acétate d'éthyle :75/25, 50/50, 25/75 et 100% acétate d'éthyle . Contrôle sur CCM (acétate d'éthyle) et RMN. Le produit final, repris dans 10ml CH2C12 est dèprotègè Boc en ajoutant goutte à goutte à 0°C 50ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699) redistillé à 72°C et dilué dans 50ml CH2Cl2. Après 4heures, on évapore 2 fois à pression réduite après dilution dans 50ml de n-hexane. Le produit est repris dans 10ml d'ether, précipité dans l'hexane et filtré sur papier filtre. Le produit est repris par lavage du papier dans un solvant CH2C12/CH30H 1/1. Contrôles sur CCM (acétate d ' éthyle) , HPLC et RMN. Evaporation et pesée: 670mg (0,68mmoles) rendement : 47% .
4 . Synthèse de pcTG89 (équivalent de pcTG37mais sous une forme T-branchée) On applique le même protocole que pour pcTG37 mais en remplaçant le 1, 4di-boc-spermidine par le N, N' di-boc- spermidine . Pesée du produit protégé: 170mg (0, Iδmmoles ) , rendement : 12 , 2% . Injection intraveineuse de complexes selon l'invention Les résultats sont résumés sur la figure 2. Des- complexes selon l' invention ont été synthétisés selon les méthodes décrites précédemment à partir du composé pcTG337, en présence ou en l'absence de DOPE (2:1, mol:mol), à un ratio de charge fixe de 5, en utilisant un plasmide contenant le gène de la luciférase pTG11033 (demande de brevet français n° 97/08267) .
Les souris utilisées sont des souris femelles C57BL/6 de 9 à 11 semaines. Un jour avant l'injection avec le complexe selon l'invention, les souris sont pré-traitées par injection de 50 μl d'une préparation de chlodronate encapsulé dans un liposome (voir Van Rooijen et Sanders, 1994, J. Immunol. Methods, 174, 83-93) incorporée dans un volume total de 200 μl (+ 150 μl de tampon PBS). Les injections intraveineuses sont effectuées dans la queue après désinfection de la peau à l' éthanol 70%. Le volume injecté est 250μl et la quantité d'ADN est 60 μg, la quantité de lipide est 345 μg.
Deux jours après les injections, les souris sont sacrifiées. Après extraction, les tissus sont congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80°C. Afin de mesurer l'activité luciférase, les tissus sont broyés mécaniquement à l'aide d'un pilon dans un mortier placé sur la carboglace. 500μl d'un tampon de lyse (Promega) sont ajoutés aux débris de tissus obtenus à partir des poumons et soumis à trois étapes de congélation/décongélation. Les débris cellulaires sont éliminés par centifugation et l'activité luciférase (en RLU/min, Unité de lumière relative par minute) est mesurée sur 20 μl de surnageant conformément aux instructions du fournisseur (Promega) en ajoutant 100 μl de réactif et en mesurant l'activité par luminescence. L'activité luciférase mesurée est standardisée par rapport à la quantité protéique à l'aide d'une gamme étalon réalisée à partir de luciférase disponible dans le commerce (Promega). La quantité de protéine totale est, par ailleurs, déterminée par la méthode colorimétrique d'acide bicinchoninique BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem. , 150, 76-85 Pierce) à partir d'un aliquote de surnageant. Ceci permet "d'exprimer l'activité luciférase en RLU par milligramme de protéine extraite des- tissus. Des contrôles sont réalisés pour lesquels les souris n'ont pas été injectées ou ont été injectées avec de l'ADN seul (60 μg) dans un tampon 20 mM HEPES pH 7.5. Les résultats (Figure 2) montrent que l'expression du gène rapporteur luciférase dans les poumons après injection intraveineuse de complexes renfermant le composé selon l'invention à un ratio de charge de 5, en présence de DOPE est nettement améliorée par rapport à l'injection de l'ADN seul. Les valeurs indiquées sont des valeurs moyennes obtenues à partir de 3 souris injectées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé lipidique de formule : R-HN-[-("C-H2)0 - NR-]n_ι - (CH2)m-NH-R I
dans laquelle : les restes R sont, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe de formule II :
(CH2)P-NH-Rι II -C-CH-NH-R,
I! o pour laquelle :
Ri et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C (=0) - (CD—C23) alkyle ou -C (=0) - (C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des radicaux fluoroalkyle, des groupements polyethylene glycol, des groupements oxyéthylène ou oxymethylene éventuellement répétés, linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, p est un nombre entier positif de 1 à 4, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)a> , et plus particulièrement pour chaque motif -(CH2)ra-NR- lorsque n > 1, le nombre de groupes R de formule II étant compris entre 1 et 4
2. Composé selon la revendication 1 sélectionné parmi les composés de formules :
H:N-[-(CH2)π-NH-]n R III RNH- [- (CH2)n-NH]η H Illa dans lesquelles :
R est un groupe de formule II tel que défini dans la revendication 1, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)m.
3. Composé selon la revendication 1 de formule : H2N- [- (CH2)m-NR] n_ι- (CH2)m-NH2 Illb dans laquelle :
R a l'une des significations indiquées pour la formule I de la revendication 1 pour autant qu' au moins un groupe R est de formule II, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 qui peut être différent pour chaque motif -(CH2)m , et plus particulièrement pour chaque motif -(CH2)m-NR- lorsque n > 1.
4 . Composé selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il renferme un ou deux groupes R de formule II.
5 . Composé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que Ri et R2 sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux -C(=0)- alkyle linéaires ou -C(=0)- alcényle linéaires.
6 . Composé selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit alkyle ou alcényle comprend de 12 à 20 atomes de carbone et en ce que ledit composé comporte 1 ou 2 groupements R de formule II .
7 . Composé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit alkyle ou alcényle comprend 12, 16 ou 18 atomes de carbone
8 . Composé selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou
4.
9. Composé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
10 . Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' il est choisi dans le groupe constitué par les composés de formules suivantes :
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
dans lesquelles Ri et R2 sont identiques et choisis parmi les radicaux stéaroyle et oléoyle.
11 . Composé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est conjugué à un ou plusieurs ligands d'intérêt par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de l'acide diaminocarboxylique .
12 . Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit élément de ciblage est choisi parmi le groupe consistant en tout ou partie de sucres, de peptides,. d' oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti- ligand, de peptides fusogèniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés.
13. Composé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il est sous forme cationique.
14 . Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications précédentes et éventuellement au moins un adjuvant capable notamment d' améliorer la formation de complexe entre undit composé et une substance active.
15 . Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que ledit adjuvant est un lipide neutre ou zwitterionique.
16 . Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est ou dérive d'un triglycéride, d'un diglyceride, du cholestérol, d'une phosphatidyl éthanolamine (PE) , phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyéline, céramide ou cérébroside.
17 . Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est la dioleylphosphatidyl éthanolamine (DOPE) .
18 . Composition selon les revendications 14 à 17, caractérisée en ce que le rapport en poids composé/adjuvant est compris entre 0,1 et 10.
19 . Complexe comprenant au moins un composé selon la revendication 13 ou au moins une composition selon l'une des revendications 14 à 18 et au moins une substance active, notamment therapeutiquement comportant au moins une charge négative.
20 . Complexe selon la revendication 19 caractérisé en ce que ladite substance active est choisie parmi les acides nucléiques et les protéines.
21 . Complexe selon la revendication 20 caractérisé en ce ladite substance active est un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un cADN, un ADN génomique, un ADN plasmidique, un polynucleotide antisens, un ARN messager, un ARN ribosomique, un ribozyme, un ARN de transfert, ou un ADN codant pour de tels ARN.
22 . Complexe selon la revendication 21 caractérisé en ce ledit acide nucléique comprend un gène d' intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt.
23. Complexe selon l'une des revendications 19 à 22 caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 500 nm, avantageusement inférieure à 200 nm.
24 . Complexe selon l'une des revendications 23 caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 100 nm.
25 . Complexe selon l'une des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que le rapport entre le nombre de charges positives du ou des composés et/ou compositions cationiques et le nombre de charges négatives de ladite substance active varie de 0,05 à 20, plus particulièrement de 0,1 à 15, et de préférence de 5 à 10.
26 Procédé de préparation d'un complexe selon les revendications 19 à 25 caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs composés selon la revendication 13 et/ou au moins une composition selon l'une des revendications 14 à 18 avec une ou plusieurs substances actives comportant au moins une charge négative et en ce que l'on récupère ledit complexe, éventuellement après une étape de purification.
27 . Procédé de préparation selon la revendication 26, caractérisé en ce que lesdits composés et/ou des compositions sont au préalable mis en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment l' éthanol ou le diméthylsulfoxide ou un mélange des deux.
28 . Procédé de préparation selon la revendication 26, caractérisé en ce que lesdits composés et/ou des compositions sont au préalable mis en suspension dans une solution de détergent.
29 . Procédé de préparation selon la revendication 28, caractérisé en ce que l' on procède en outre à une étape de purification dudit complexe par dialyse.
30 . Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, d'une composition selon l'une -quelconque des revendications 14 à 18, d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 19 à 25 pour transférer au moins une substance active, notamment therapeutiquement, en particulier un acide nucléique, dans des cellules cibles in vitro, ex vivo ou in vivo, plus particulièrement in vivo.
31 . Utilisation selon la revendication 30 caractérisée en ce que ladite cellule cible est une cellule de mammifère.
32 . Utilisation selon la revendication 31 caractérisée en ce que ladite cellule cible est sélectionnée parmi une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire .
33 . Procédé de transfert d'une substance active comportant au moins une charge négative à l'intérieure d'une cellule, caractérisé en ce qu'on met en contact ladite cellule avec un complexe selon l'une quelconque des revendications 19 à 25.
34 . Complexe selon l'une des revendications 19 à 25, à titre de médicament, à but curatif, préventif ou vaccinal.
35 . Complexe selon l'une des revendications 19 à 25 pour la mise en oeuvre d' une méthode de traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une substance therapeutiquement active, notamment un acide nucléique, dans des cellules cibles.
36 . Complexe selon la revendication 35 caractérisé en ce que ladite cellule cible est une cellule de mammifère.
37 . Complexe selon la revendication 36 caractérisé en ce que ladite cellule cible est sélectionnée parmi une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une cellule de l' épithélium respiratoire.
38 . Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 19 à 25 pour la préparation d'un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal destiné au trai-tement du corps humain ou animal, notamment par thérapie génique.
39 . Utilisation selon la revendication 38, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré par injection intramusculaire, par inhalation, par injection intratrachéale, par instillation , par aérosolisation, par voie topique ou par voie orale.
40 . Préparation pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un complexe selon l'une quelconque des revendications 19 à 25.
41 . Préparation selon la revendication 40 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir de transfection dudit complexe.
42. Préparation selon la revendication 41 caractérisée en ce que ledit adjuvant est choisi parmi le groupe consistant en la chloroquine, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyethylene glycol, le glycérol, l' éthanol, le 1-methyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, ou un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMSO) , le diéthylsulfoxide, le di-n- propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacetamide, la tetraméthylurée, l' acétonitrile ou leurs dérivés.
43 . Préparation selon l'une des revendications 40 à 42 caractérisée en ce qu' elle comprend en outre un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique permettant son administration à l'homme ou l'animal.
44. Cellule transfectée par un complexe selon l'une quelconque des revendications 19 à 25.
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