WO1998025969A1 - Von willebrand factor derivative and method for isolating proteins - Google Patents

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WO1998025969A1
WO1998025969A1 PCT/AT1997/000253 AT9700253W WO9825969A1 WO 1998025969 A1 WO1998025969 A1 WO 1998025969A1 AT 9700253 W AT9700253 W AT 9700253W WO 9825969 A1 WO9825969 A1 WO 9825969A1
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vwf
derivative
proteins
fraction
factor viii
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PCT/AT1997/000253
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Hans-Peter Schwarz
Peter Turecek
Johann Eibl
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Immuno Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors

Definitions

  • the invention relates to a von Willebrand factor derivative and a method for isolating proteins that bind to vWF.
  • Von Willebrand Factor is a glycoprotein that circulates in plasma in a series of multimers of approximately 500 to 20,000 kilodaltons in size.
  • the multimeric forms of vWF consist of 250 kD polypeptide subunits, which are linked to each other via disulfide bridges.
  • vWF plays a role in binding platelets to the subendothelium of a damaged vascular wall, with only the largest multimers also showing haemostatic activity. It is believed that the endothelial cells secrete large polymeric forms of vWF and that those forms of vWF which have a lower molecular weight (low molecular weight vWF, LMW) have arisen from proteolytic cleavages.
  • vWF is formed in the vascular endothelial cells, which are the main source of this plasma protein, by constitutive or stimulated release, but is also synthesized to a small extent by the megakaryocytes.
  • the biosynthesis of vWF is very complex and therefore results in a large number of different vWF molecules with different structures, tasks and properties.
  • vWF can bind to different receptors in different tissues, whereby the binding to proteins such as glycoprotein Ib, the glycoprotein complex II / IIla, factor VIII: C, to platelets, to the subendothelium is one of the most important physiological activities of the vWF .
  • the factor VIII complex or factor VIII: C / vWF complex is formed, which contains factor VIII: C as a stabilized protein.
  • a vWF deficiency inevitably leads to a reduction in the factor VIII: C concentration in the blood, since the stabilization there is no effect of the vWF.
  • this vWF-Sepharose contained factor VIII in addition to vWF due to the plasmatic starting material, which contains the factor VIII: C / vWF complex. Contamination with the plasmatic factor VIII: C would pose a major problem in the production of pharmaceutical preparations.
  • the object of the present invention is therefore to provide a chromatography material with which proteins which bind to vWF can be isolated, even if vWF is present in the solution from which the proteins are to be isolated.
  • the object of the present invention is to provide a material with an avidity which is higher than that of the vWF in association with its binding partners, in particular than that of the vWF in the factor VIIl / vWF complex.
  • a vWF derivative consisting of vWF, immobilized on a particulate carrier or a carrier gel (carrier), in particular on a chromatographic Phiematerial, which is characterized in that the vWF is a recombinant vWF (r-vWF).
  • the vWF derivative is free of blood coagulation factor VIII and, because of the avoidance of anti-vWF antibodies, free of xenogenic material, such as antibodies.
  • an r-vWF is free of blood coagulation factor VIII, and in particular free of plasmatic proteins, which would be disruptive in an isolation process for vWF-binding proteins.
  • the r-vWF is fixed by chemical binding to the chromatography material.
  • the chemical fixation stabilized the chromatography material, but surprisingly it did not affect the nativity of the vWF.
  • the use of corresponding antibodies which mediate the binding of the vWF to a solid phase can be dispensed with. Antibody binding would have the disadvantage of instability and increased leakage, i.e. removing the immobilized vWF at the same time as acquiring the binding partner for vWF.
  • the avidity of the vWF derivative can be further increased through the targeted selection of the rWF fraction. Surprisingly, it has been shown that just from an r-vWF fraction with a low primary hemostatic activity, in particular from a low molecular weight r-vWF fraction with a molecular weight below about 1.5 million Da, preferably below 1 million Da, a material can be manufactured with high avidity for factor VIII.
  • the availability of recombinant von Willebrand factor in high purity and unlimited quantity enables the vWF derivative according to the invention to be widely used as a ligand in affinity chromatography or related affinity methods in which a molecule to be bound is linked by specific interaction with the ligand.
  • r-vWF is preferably found in mammalian cells, e.g. CHO cells. Such a vWF is described in patent application WO96 / 10584.
  • vWF is described in patent application WO96 / 10584.
  • Heparin affinity chromatography results in fractions which contain molecules with a relatively low molecular weight for vWF (up to approx. 1 million Daltons). While these fractions per se have a relatively low primary hemostatic activity, they are still able to bind proteins that interact with vWF, e.g. Factor VIII to bind.
  • a gel is preferably used as the chromatography material which has good affinity chromatographic properties, i.e. low back pressure corresponding to high flow rates, high binding capacity for the ligand to be immobilized, low bleeding behavior and the possibility of disinfection with e.g. Sodium hydroxide solution.
  • the r-vWF is coupled to the solid matrix in such a way that the binding properties for the proteins to be bound in affinity chromatography are not lost.
  • standard immobilization techniques can be used for this purpose, for example in Woodward "Immobilized Cells and Enzymes", IRL. Press, Oxford, Washington (1985).
  • a chromatographic gel has good reusability properties and stability, so that even with repeated After constant use, there is a constant binding capacity for the molecules to be isolated.
  • a preferred vWF derivative therefore comprises an organic polymer, in particular an organic polymer based on carbohydrates, as the chromatography material.
  • Suitable gel matrices or particulate carriers are e.g. Sephacele, Sephadexe, Sepharosen,
  • ® also synthetic polymers, such as Toyopearl gels (Tosohaas)
  • the vWF derivative according to the invention is preferably subjected to virus inactivation treatment, so that it can be ensured that the chromatography material is not a virus contamination factor when isolating proteins which bind to vWF.
  • the treatment for inactivating viruses is preferably carried out before the derivatization by a chemical and / or physical process, for example by treatment with surfactants, polyethylene glycols, chaotropes, by heat treatment or by radiation treatment.
  • the finished derivative preferably in lyophilized form, can also be subjected to a treatment such as that of heat treatment or radiation.
  • the vWF derivative according to the invention is made available in a storage-stable form, in particular as a lyophilisate, which significantly facilitates trading, distribution and storage.
  • the present invention also relates to a device comprising a container and a vWF derivative according to the invention contained therein, the container having an inlet opening and an outlet opening which is suitable for the passage of liquids.
  • the device according to the invention is a column, in particular an affinity acid or chromatography column, trained which, if desired, can be made available as a ready-to-use product in a storage-stable form, so that only swelling of the material has to be carried out by the respective user before protein isolation.
  • the present invention also relates to a method for isolating proteins that bind to the vWF, which is characterized by the following steps:
  • This process can be carried out batchwise, that is to say as a “batch” process, or else as a column chromatography process.
  • Proteins that can be isolated using the method according to the invention are, above all, the physiological binding proteins of vWF, that is to say glycoprotein Ib, the glycoprotein Ilb / IIIa complex, collagen and in particular factor VIII, but of course also recombinant derivatives and analogs of these proteins , vWF antigens, vWF antibodies, vWF multimerases or vWF depolymerases and even enzymes that recognize the vWF as a substrate, and other natural or synthetic peptides and proteins that have an affinity for vWF.
  • vWF-binding saccharides such as e.g. Heparin to be isolated using this procedure.
  • the vWF derivative according to the invention Due to the high avidity of the vWF derivative according to the invention, it is possible to specifically bind and recover the proteins to be isolated in yields of more than 60%, preferably more than 80%, most preferably almost quantitatively, on the chromatography material according to the invention and in purified form Elute form of the vWF derivative, with which the preparation of concentrates of the isolated proteins by simple elution without subsequent the concentration step is possible.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the production of biologically active proteins with factor VIII activity, in particular of plasmatic or recombinant factor VIII and their mutants or analogs. This can be isolated with the method according to the invention even if a starting solution which contains the factor VIII / vWF complex is used.
  • the elution of the proteins is preferably carried out with a buffer containing calcium ions.
  • factor VIII from plasma fractions containing factor VIII or from cell culture supernatants of cells which express factor VIII.
  • vWF acts as a carrier protein of factor VIII, i.e. factor VIII is bound to vWF.
  • factor VIII and vWF can only be separated using complex methods, e.g. by binding factor VIII to immobilized mono- or polyclonal antibodies directed against factor VIII, to which the factor VIII / vWF complex binds and then vWF is specifically eluted without the binding of the antibody with factor VIII being disturbed. Then factor VIII is eluted from the chromatographic gel.
  • factor VIII proteins with affinity for vWF can also be bound to immobilized r-vWF and isolated from complex mixtures, namely, for example factor VIII hybrid proteins, in particular factor VIII-heparin cofactor II hybrid protein according to US Ser.No. 08 / 558,107 or factor VIII-factor V hybrid protein according to WO 90/05570 or chimeric human / porcine factor VIII according to WO 94/11503, FVIII mutants, such as in Austria.
  • factor VIII hybrid proteins in particular factor VIII-heparin cofactor II hybrid protein according to US Ser.No. 08 / 558,107 or factor VIII-factor V hybrid protein according to WO 90/05570 or chimeric human / porcine factor VIII according to WO 94/11503, FVIII mutants, such as in Austria.
  • a 921/96 (factor VIII dB695-R2307Q), described factor VIII mutant with an Arg 23 ° 7 ⁇ Gln substitution, which has a reduced inhibitor binding with constant factor VIII: C procoagulatory activity and vWF binding activity, by Willebrand Factor-degrading enzymes, for example the vWF-specific depolymerase or vWF multimerase or platelet receptors, such as GPIIb / IIIa or GPIb / IX complex, the pure representation of which is of biochemical-analytical, diagnostic or therapeutic interest.
  • Willebrand Factor-degrading enzymes for example the vWF-specific depolymerase or vWF multimerase or platelet receptors, such as GPIIb / IIIa or GPIb / IX complex, the pure representation of which is of biochemical-analytical, diagnostic or therapeutic interest.
  • the specific isolation of therapeutic proteins is currently carried out using the method of immunoaffinity chromatography.
  • the molecule to be isolated is bound to an immobilized monoclonal antibody (which is usually obtained from mouse cells) and washed free of impurities and then eluted in high purity.
  • monoclonal antibodies can be used to deliver mouse proteins into the preparation, which, if the molecule to be bound is used therapeutically, lead to side effects such as e.g. lead to antibody formation against mouse protein.
  • vWF physiological binding proteins for vWF according to the inventive method has the further advantage that the vWF exercises a stabilizer or carrier function for its binding partners.
  • the proteins obtained are therefore protected even during isolation and purification from denaturing conditions which may be granted during the elution.
  • the products obtained are thus obtained not only in terms of their antigenicity in the high yield mentioned, but also in terms of their activity or nativity.
  • vWF multimerase Another particularly preferred protein or protein complex which can be purified with the vWF derivative according to the invention is the vWF multimerase, which degrades the high molecular forms of the vWF into low molecular weight variants (see Austrian applications A 769/96 and A 770 / 96).
  • the multimerase can bind to the immobilized vWF, but the derivatization prevents the degradation of the material according to the invention.
  • elution can be carried out particularly efficiently with a buffer which contains a chelating agent for metal ions, in particular EDTA.
  • the vWF derivative according to the invention is also suitable for optionally extracorporeal immunoadsorption of antibodies which are directed against vWF.
  • the formation of antibodies against vWF is a pathological condition that can occur as an autoimmune disease and lead to a blood clotting defect with increased bleeding tendency or can occur as a side effect of the treatment of patients with preparations containing vWF.
  • the formation of a functional inhibitory antibody makes substitution therapy impossible or leads to drastic dose increases in order to maintain the hemostatic effect of the coagulation factor concentrate. In such cases, the circulating functional antibody against the coagulation factor has been removed in the past by plasmapheresis or by extracorporeal immunoadsorption on proteins directed against IgG, for example protein A or protein G.
  • Another application of the method according to the invention for the production of antibodies lies in the preparation of polyclonal or monoclonal anti-vWF antibodies for diagnostic purposes.
  • An elution buffer which is preferably used in the elution of antibodies from the vWF derivative according to the invention, has an acidic pH, in particular a pH in the range from 2 to 5.
  • One of the main advantages of the present invention is that it is possible to purify the proteins from any starting material.
  • Particularly preferred starting fractions form fractions which are derived from a body fluid of a mammal or from a cell culture. Because of the avidity of the chromatography material according to the invention, fractions which contain the vWF and / or the factor VIII / vWF complex are also preferred.
  • a preferred embodiment variant of the method according to the invention is that it is carried out using the device according to the invention with the vWF derivative contained therein.
  • 1 and 2 show the purification of recombinant factor VIII with the vWF derivative according to the invention.
  • a CHO cell clone that produces recombinant von Willebrand factor is described in FEBS.Lett. 351 (1994), 345-348.
  • the cell line was brought to co-expression of human furin by transfection with a vector coding for the cDNA human furin (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 664).
  • Such stable cell clones were fermented on a large scale in perfusion reactors on microcarriers (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, (1994), 267-269) .
  • the purification was carried out by a 2-stage chromatographic method according to Thromb.Haemost. 73: 1160 (1995).
  • the fraction desorbed by elution with sodium chloride was obtained and buffered by gel filtration through Sephadex G25 (Pharmacia) in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5.
  • the preparation was then concentrated by ultraconcentration over an Amicon YM30 membrane (cut-off: 30,000 D) to a protein concentration of 3 mg / ml.
  • the vWF concentration in this preparation was 60 U vWF antigen / mg protein. This preparation did not contain factor VIII due to the avoidance of serum or plasma components during the production in cell culture and during the cleaning.
  • the preparation of the recombinant vWF from Example 1 was diluted to 1.5 mg / ml with a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5.
  • a preactivated gel suitable for affinity chromatography (Actigel, ALD-Superflow, from Sterogene) was excessively prewashed with a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5.
  • One volume part of the pre-washed gel was mixed with 1.1 parts by volume of protein solution to be immobilized and then 0.15 parts by volume of a solution of 0.1 M cyanoborohydride (NaCNBH 3) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7, 0, is added.
  • NaCNBH 3 0.1 M cyanoborohydride
  • the gel was shaken suspended in this buffer and incubated for 16 hours at room temperature with further shaking.
  • the gel was then placed on a sintered funnel with 10 times the volume of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 and with 5 times the volume of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5.
  • the mixture was then equilibrated again with 5 parts by volume of the buffer, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 and the gel was transferred to a chromatographic column with a dimension of diameter to a gel bed height of 1: 4.
  • a recombinant factor VHI preparation (Recombine, Baxter) was mixed with 10 ml A.dest. reconstituted.
  • This solution contained 50 IU FVIII / ml, 12 mg human albumin / ml, 1.5 mg polyethylene glycol 3350 / ml and traces of vWF in a histidine saline buffer at physiological pH.
  • the low molecular weight components were separated from this solution by gel filtration on Sephadex G25 (Pharmacia) and the factor VIII / vWF / albumin mixture was brought into a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  • a mouse monoclonal antibody directed against vWF (MAb 03768/3, from Chemicon International, Inc.) with an IgG concentration of 7 mg / ml was gel-filtered via Sephadex G25 (from Pharmacia) in a buffer, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, buffered. The protein concentration was adjusted to 0.5 mg / ml by dilution with the same buffer. 4 ml of this solution were pumped at a flow rate of 0.5 ml / min over the column containing immobilized recombinant vWF from Example 3 and the optical density at 280 nm was determined in a run.
  • the UV absorption was measured at 280 nm and the activity of the vWF-degrading enzyme was determined as follows.
  • a preparation of the recombinant vWF from Example 1 was repuffed in a buffer, 5 mM Tris-HCl, 1.5 M urea, containing 0.2% (w / v) bovine serum albumin. finished and brought to 0.4 vWF E / ml.
  • Aliquots of the fractions to be examined of 100 ⁇ l were each mixed with 5 ⁇ l of a 50 mM aqueous PPACK solution and 12.5 ⁇ l of a 200 mM BaCl 2 solution and incubated for 5 min at 37 ° C.
  • the sample 1 + 1 prepared in this way was mixed with the substrate (vWF) and 15 h at 37 ° C. on a floating dialysis membrane (Millipore VSWP) according to the method of Marusky and Sergeant (Anal. Biochem. 105 (1980), 403) dialyzed against a buffer containing 5 mM Tris-HCl, 1.5 M urea, pH 8.0. The dialysate was then analyzed for its residual vWF activity in an ELISA, in which the collagen binding activity of the vWF and its antigenicity are determined.
  • a floating dialysis membrane Millipore VSWP
  • Buffer 1 (for collagen coating and antibody dilution):
  • Bovine serum albumin pH 7.3
  • the reciprocal of the collagen binding activity is a direct measure of the enzyme activity of the vWF-degrading enzyme.
  • a plasmatic factor VHI / von Willebrand factor concentrate (IMMUNATE; Fa. Immuno) was reconstituted with 5 ml of distilled water. This solution contained 25 IU factor VHI / ml and 10 U vWF / ml (measured with the ristocetin cofactor method) in a citrate-glycine-lysine buffer, pH 7.4. The factor VHI / von Willebrand factor complex was buffered against a buffer containing 20 mM Tris / HCl, pH 7.5, by gel filtration on Sephadex G25. 3 ml of this solution were then applied directly to the column from Example 2. The flow rate was 0.1 ml / min.

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Abstract

Disclosed is a von Willebrand Factor (vWF) derivative consisting of vWF, immobilized in a carrier, which is characterized in that the vWF is r-vWF. Also disclosed is a method for isolating proteins which bind to the vWF when the vWF derivative is used.

Description

von Willebrand-Faktor-Derivat sowie ein Verfahren zur Isolierung von von Willebrand factor derivative and a method for isolating
ProteinenProteins
Die Erfindung betrifft ein von Willebrand-Faktor-Derivat sowie ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an vWF binden.The invention relates to a von Willebrand factor derivative and a method for isolating proteins that bind to vWF.
Von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein Glykoprotein, welches in Plasma in einer Reihe von Multimeren der Größe von etwa 500 bis 20 000 Kilodalton zirkuliert. Die multimeren Formen von vWF setzen sich aus 250 kD Polypeptid-Untereinheiten zusammen, welche über Disulfidbrücken aneinander gebunden sind. vWF spielt eine Rolle bei der Bindung von Blutplättchen an das Subendothelium einer beschädigten Gefäßwand, wobei nur die größten Multimere auch haemostatische Aktivität zeigen. Es wird angenommen, daß die Endothelzellen große polymere Formen von vWF sekretieren und daß diejenigen Formen von vWF, welche ein kleineres Molekulargewicht aufweisen (low molecular weight vWF, LMW) , durch proteo- lytische Spaltungen entstanden sind.Von Willebrand Factor (vWF) is a glycoprotein that circulates in plasma in a series of multimers of approximately 500 to 20,000 kilodaltons in size. The multimeric forms of vWF consist of 250 kD polypeptide subunits, which are linked to each other via disulfide bridges. vWF plays a role in binding platelets to the subendothelium of a damaged vascular wall, with only the largest multimers also showing haemostatic activity. It is believed that the endothelial cells secrete large polymeric forms of vWF and that those forms of vWF which have a lower molecular weight (low molecular weight vWF, LMW) have arisen from proteolytic cleavages.
vWF wird in den vaskulären Endothelzellen, welche die Hauptquelle dieses Plasmaproteins darstellen, durch konstitutive oder stimulierte Freisetzung gebildet aber auch in einem geringen Anteil durch die Megakaryozyten synthetisiert. Die Biosynthese von vWF ist sehr komplex und resultiert daher in einer Vielzahl verschiedenster vWF-Moleküle mit unterschiedlichster Struktur, Aufgaben und Eigenschaften.vWF is formed in the vascular endothelial cells, which are the main source of this plasma protein, by constitutive or stimulated release, but is also synthesized to a small extent by the megakaryocytes. The biosynthesis of vWF is very complex and therefore results in a large number of different vWF molecules with different structures, tasks and properties.
Dies führt dazu, daß vWF an verschiedene Rezeptoren in unterschiedlichen Geweben binden kann, wobei die Bindung an Proteine, wie Glykoprotein Ib, den Glykoproteinkomplex II/IIla, Faktor VIII :C, an Thrombozyten, an das Subendothelium zu den wichtigsten physiologischen Aktivitäten des vWF zählt.This leads to the fact that vWF can bind to different receptors in different tissues, whereby the binding to proteins such as glycoprotein Ib, the glycoprotein complex II / IIla, factor VIII: C, to platelets, to the subendothelium is one of the most important physiological activities of the vWF .
Bei der Bindung des vWF an den Blutgerinnungsfaktor VIII wird der Faktor VIII-Komplex oder Faktor VIII : C/vWF-Komplex gebildet, welcher den Faktor VIII :C als stabilisiertes Protein enthält. Ein vWF-Mangel führt unweigerlich auch zu einer Reduktion der Faktor VIII : C-Konzentration im Blut, da der Stabilisierungs- effekt des vWF ausbleibt .When the vWF binds to the blood coagulation factor VIII, the factor VIII complex or factor VIII: C / vWF complex is formed, which contains factor VIII: C as a stabilized protein. A vWF deficiency inevitably leads to a reduction in the factor VIII: C concentration in the blood, since the stabilization there is no effect of the vWF.
Es ist bekannt, rekombinanten Faktor VIII durch eine Säule enthaltend plasmatischen von Willebrand-Faktor, gekoppelt an Sepharose (vWF-Sepharose) , zu reinigen (Wood et al., Nature 312 (1984) , 330-337) . Es zeigte sich jedoch, daß die Avidität eines immobilisierten plasmatischen vWF niedrig ist und daher beispielsweise die Gewinnung von Faktor VIII mit der beschriebenen vWF-Sepharose aus einer Lösung, welche den Faktor VIII/vWF- Komplex enthält, in nennenswerten Ausbeuten nicht möglich ist.It is known to purify recombinant factor VIII by a column containing a plasma von Willebrand factor coupled to Sepharose (vWF-Sepharose) (Wood et al., Nature 312 (1984), 330-337). However, it was found that the avidity of an immobilized plasmatic vWF is low and, for example, it is therefore not possible to obtain factor VIII with the vWF-Sepharose described from a solution which contains the factor VIII / vWF complex in significant yields.
Darüberhinaus enthielt diese vWF-Sepharose neben vWF noch Faktor VIII aufgrund des plasmatischen Ausgangsmaterials, welches den Faktor VIII :C/vWF-Komplex enthält. Bei der Gewinnung von pharmazeutischen Präparaten würde allerdings die Kontamination mit dem plasmatischen Faktor VIII :C ein großes Problem darstellen.In addition, this vWF-Sepharose contained factor VIII in addition to vWF due to the plasmatic starting material, which contains the factor VIII: C / vWF complex. Contamination with the plasmatic factor VIII: C would pose a major problem in the production of pharmaceutical preparations.
Bindungsstudien, bei welchen die Inhibierung der Bindung von Faktor VIII an in Mikrotiterplattennäpfchen immobilisiertem plasmatischen vWF durch rekombinanten vWF untersucht worden sind, zeigten darüberhinaus, daß rekombinanter vWF in Lösung eine noch schlechtere Avidität bezüglich des Bindungspartners Faktor VIII:C erzielt werden konnte (Leyte et al., Biochem. J. , 274 (1991) , 257-261) . Daher ist dieses Material nicht zur prä- parativen Darstellung von Faktor VIII geeignet.Binding studies in which the inhibition of the binding of factor VIII to plasmatic vWF immobilized in microtiter wells by recombinant vWF were furthermore shown that recombinant vWF in solution an even worse avidity with regard to the binding partner factor VIII: C could be achieved (Leyte et al ., Biochem. J., 274 (1991), 257-261). This material is therefore not suitable for the preparation of factor VIII.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher das Zurverfügung- stellen eines Chromatographiematerials, mit welchem Proteine, die an vWF binden, isoliert werden können, selbst wenn vWF in der Lösung, aus der die Proteine isoliert werden sollen, vorhanden ist. Anders formuliert, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung im Zurverfügungstellen eines Materials mit einer Avidität, die höher ist als die des vWF im Verbund mit seinen Bindungspartnern, insbesondere als die des vWF im Faktor VIIl/vWF- Komplex.The object of the present invention is therefore to provide a chromatography material with which proteins which bind to vWF can be isolated, even if vWF is present in the solution from which the proteins are to be isolated. In other words, the object of the present invention is to provide a material with an avidity which is higher than that of the vWF in association with its binding partners, in particular than that of the vWF in the factor VIIl / vWF complex.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein vWF-Derivat, bestehend aus vWF, immobilisiert an einen partikulären Träger oder ein Trägergel (Träger) , insbesondere an ein Chromatogra- phiematerial, welches sich dadurch auszeichnet, daß der vWF ein rekombinanter vWF (r-vWF) ist. Vorzugsweise ist das vWF-Derivat frei von Blutgerinnungsfaktor VIII, und aufgrund der Vermeidung von anti-vWF-Antikörpern, frei von xenogenem Material, wie Antikörpern.This object is achieved according to the invention by a vWF derivative, consisting of vWF, immobilized on a particulate carrier or a carrier gel (carrier), in particular on a chromatographic Phiematerial, which is characterized in that the vWF is a recombinant vWF (r-vWF). Preferably, the vWF derivative is free of blood coagulation factor VIII and, because of the avoidance of anti-vWF antibodies, free of xenogenic material, such as antibodies.
Überraschenderweise hat sich nämlich gezeigt, daß - im Gegensatz zu plasmatischem vWF - r-vWF eine überraschende hohe Avidität gegenüber vWF-bindenden Proteinen hat, trotzdem er an ein Chromatographiematerial gebunden worden ist.Surprisingly, it has been shown that - in contrast to plasmatic vWF - r-vWF has a surprisingly high avidity towards vWF-binding proteins, despite the fact that it has been bound to a chromatography material.
Darüberhinaus ist ein r-vWF im Gegensatz zu plasmatischem vWF frei von Blutgerinnungsfaktor VIII, und insbesondere frei von plasmatischen Proteinen, welche bei einem Isolierungsverfahren für vWF-bindende Proteine störend wären.In addition, unlike plasmatic vWF, an r-vWF is free of blood coagulation factor VIII, and in particular free of plasmatic proteins, which would be disruptive in an isolation process for vWF-binding proteins.
Bei einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen vWF- Derivates ist der r-vWF durch chemische Bindung an das Chromatographiematerial fixiert. Dadurch wird gewährleistet, daß die hohe Avidität des erfindungsgemäßen vWF-Derivates mit einer großen Stabilität erhalten bleibt, was die Einsatzfähigkeit des erfindungsgemäßen Materials enorm erhöht . Durch die chemische Fixierung wurde die Stabilisierung des Chromatographiematerials erreicht, und überraschenderweise jedoch die Nativität des vWF nicht beeinträchtigt. Gleichzeitig kann auf die Verwendung von entsprechenden Antikörpern verzichtet werden, die eine Bindung des vWF an eine feste Phase vermitteln. Eine Bindung über Antikörper hätte den Nachteil der Instabilität und ein vermehrtes "leakage", d.h. ein Herauslösen des immobilisierten vWF gleichzeitig mit der Gewinnung der Bindungspartner für vWF.In a special embodiment of the vWF derivative according to the invention, the r-vWF is fixed by chemical binding to the chromatography material. This ensures that the high avidity of the vWF derivative according to the invention is retained with great stability, which enormously increases the usability of the material according to the invention. The chemical fixation stabilized the chromatography material, but surprisingly it did not affect the nativity of the vWF. At the same time, the use of corresponding antibodies which mediate the binding of the vWF to a solid phase can be dispensed with. Antibody binding would have the disadvantage of instability and increased leakage, i.e. removing the immobilized vWF at the same time as acquiring the binding partner for vWF.
Die Avidität des vWF-Derivates kann durch gezielte Auswahl der rWF-Fraktion weiter gesteigert werden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß gerade aus einer r-vWF-Fraktion mit einer geringen primären hämostatischen Aktivität, insbesondere aus einer niedermolekularen r-vWF-Fraktion mit einem Molekulargewicht unter ca. 1,5 Millionen Da, vorzugsweise unter 1 Million Da, ein Material mit hoher Avidität für Faktor VIII hergestellt werden kann. Die Verfügbarkeit von rekombinantem von Willebrand-Faktor in hoher Reinheit und unbegrenzter Quantität ermöglicht den breiten Einsatz des erfindungsgemäßen vWF-Derivats als Ligand in der Affinitätschromatographie oder verwandten Affinitätsmethoden, bei welchen ein zu bindendes Molekül durch spezifische Wechselwirkung mit dem Liganden verbunden wird.The avidity of the vWF derivative can be further increased through the targeted selection of the rWF fraction. Surprisingly, it has been shown that just from an r-vWF fraction with a low primary hemostatic activity, in particular from a low molecular weight r-vWF fraction with a molecular weight below about 1.5 million Da, preferably below 1 million Da, a material can be manufactured with high avidity for factor VIII. The availability of recombinant von Willebrand factor in high purity and unlimited quantity enables the vWF derivative according to the invention to be widely used as a ligand in affinity chromatography or related affinity methods in which a molecule to be bound is linked by specific interaction with the ligand.
r-vWF wird vorzugsweise in Säugetierzellen, z.B. CHO-Zellen, exprimiert . Ein derartiger vWF ist in der Patentanmeldung WO96/10584 beschrieben. Bei der Reinigung von r-vWF über z.B. Heparin-Affinitätschromatographie fallen Fraktionen an, welche Moleküle mit für vWF verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht (bis ca. 1 Million Dalton) enthalten. Diese Fraktionen haben zwar an sich eine relativ geringe primäre hämostatische Aktivität, sie sind allerdings weiterhin in der Lage, Bindungsproteine, die mit vWF in spezifische Interaktionen treten, z.B. Faktor VIII, zu binden. Da für therapeutisch angewandte vWF-Konzentrate mit großem Anteil an Hochmultimeren diese Nebenfraktionen der r- vWF-Produktion nicht verwendet werden, stellen diese somit ein Nebenprodukt dar, welches erfindungsgemäß für die Immobilisierung und nachfolgende Anwendung des Immobilisats für die Herstellung einer Affinitätsmatrix verwendet werden kann.r-vWF is preferably found in mammalian cells, e.g. CHO cells. Such a vWF is described in patent application WO96 / 10584. When cleaning r-vWF via e.g. Heparin affinity chromatography results in fractions which contain molecules with a relatively low molecular weight for vWF (up to approx. 1 million Daltons). While these fractions per se have a relatively low primary hemostatic activity, they are still able to bind proteins that interact with vWF, e.g. Factor VIII to bind. Since these by-fractions of r-vWF production are not used for therapeutically applied vWF concentrates with a large proportion of high multimers, they therefore represent a by-product which can be used according to the invention for the immobilization and subsequent use of the immobilizate for the production of an affinity matrix.
Als Chromatographiematerial wird erfindungsgemäß vorzugsweise ein Gel verwendet, welches gute affinitätschromatographische Eigenschaften besitzt, d.h. geringen Rückdruck entsprechend hohen Flußraten, eine hohe Bindungskapazität für den zu immobilisierenden Liganden, ein geringes Ausbluteverhalten und die Möglichkeit zur Desinfektion mit z.B. Natronlauge, aufweist.According to the invention, a gel is preferably used as the chromatography material which has good affinity chromatographic properties, i.e. low back pressure corresponding to high flow rates, high binding capacity for the ligand to be immobilized, low bleeding behavior and the possibility of disinfection with e.g. Sodium hydroxide solution.
Die Kopplung des r-vWF an die feste Matrix wird so durchgeführt, daß die Bindungseigenschaften für die in der Affinitätschromatographie zu bindenden Proteine nicht verloren gehen. Dazu können überraschenderweise Standardimmobilisierungstechniken verwendet werden, wie beispielsweise in Woodward "Immobilized Cells and Enzymes", IRL. Press, Oxford, Washington (1985), beschrieben. Weiters besitzt ein solches chromatographisches Gel gute Wiederverwendungseigenschaften und Stabilität, so daß auch bei wieder- holtem Einsatz gleichbleibende Bindungskapazität für die zu isolierenden Moleküle besteht.The r-vWF is coupled to the solid matrix in such a way that the binding properties for the proteins to be bound in affinity chromatography are not lost. Surprisingly, standard immobilization techniques can be used for this purpose, for example in Woodward "Immobilized Cells and Enzymes", IRL. Press, Oxford, Washington (1985). Furthermore, such a chromatographic gel has good reusability properties and stability, so that even with repeated After constant use, there is a constant binding capacity for the molecules to be isolated.
Ein bevorzugtes vWF-Derivat umfaßt daher als Chromatographiematerial ein organisches Polymer, insbesondere ein organisches Polymer auf Kohlenhydratbasis . Geeignete Gelmatrizes bzw. parti- kuläre Trager sind z.B. Sephacele , Sephadexe , Sepharosen ,A preferred vWF derivative therefore comprises an organic polymer, in particular an organic polymer based on carbohydrates, as the chromatography material. Suitable gel matrices or particulate carriers are e.g. Sephacele, Sephadexe, Sepharosen,
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Fast Flow-Medien, High Performance-Medien, Sepharose Big BeadsFast flow media, high performance media, Sepharose Big Beads
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(alle Fa. Pharmacia), Tris-Acryl -, Spherodex - oder Hyper-D -(all Pharmacia), Tris-Acryl -, Spherodex - or Hyper-D -
® Medien (alle Fa. Sepracor) , Macropep -Gele (Fa. BioRad) , aber® media (all from Sepracor), Macropep gels (from BioRad), but
® auch synthetische Polymere, wie Toyopearl -Gele (Fa. Tosohaas)® also synthetic polymers, such as Toyopearl gels (Tosohaas)
® und Fractogele (Fa. Merck) .® and Fractogele (Merck).
Um Kontaminationen, insbesondere mit huma -pathogenen Viren, zu vermeiden, wird das erfindungsgemäße vWF-Derivat vorzugsweise einer Virusinaktivierungsbehandlung unterzogen, so daß sichergestellt werden kann, daß das Chromatographiematerial bei der Isolierung von Proteinen, die an vWF binden, keinen Virus-Kontaminationsfaktor darstellt . Die Behandlung zur Inaktivierung von Viren wird vorzugsweise vor der .Derivatisierung durch ein chemisches und/oder physikalisches Verfahren vorgenommen, beispielsweise durch eine Behandlung mit Tensiden, Polyethylenglykolen, Chaotropen, durch eine Hitzebehandlung oder eine Strahlenbehandlung. Gleichfalls kann aber auch das fertige Derivat, vorzugsweise in lyophilisierter Form, einer Behandlung, wie die der Hitzebehandlung oder Bestrahlung, unterworfen werden.In order to avoid contamination, in particular with human-pathogenic viruses, the vWF derivative according to the invention is preferably subjected to virus inactivation treatment, so that it can be ensured that the chromatography material is not a virus contamination factor when isolating proteins which bind to vWF. The treatment for inactivating viruses is preferably carried out before the derivatization by a chemical and / or physical process, for example by treatment with surfactants, polyethylene glycols, chaotropes, by heat treatment or by radiation treatment. Likewise, however, the finished derivative, preferably in lyophilized form, can also be subjected to a treatment such as that of heat treatment or radiation.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße vWF-Derivat in lagerstabiler Form, insbesondere als Lyophilisat, zur Verfügung gestellt, wodurch bedeutende Erleichterungen beim Handel, Vertrieb und bei der Lagerung erzielt werden.In a preferred embodiment, the vWF derivative according to the invention is made available in a storage-stable form, in particular as a lyophilisate, which significantly facilitates trading, distribution and storage.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung, umfassend einen Behälter und ein darin enthaltenes erfindungsgemäßes vWF-Derivat, wobei der Behälter eine Eingangsöffnung und eine Ausgangsöffnung aufweist, die geeignet zur Durchleitung von Flüssigkeiten ausgebildet ist. Praktischerweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dabei als Säule, insbesondere als Affinitätssäure oder Chromatographiesäule, ausgebildet, welche erwünschtenfalls als gebrauchsfertiges Produkt in lagerstabiler Form zur Verfügung gestellt werden kann, so daß lediglich noch eine Quellung des Materials vom jeweiligen Benutzer vor der Proteinisolierung durchgeführt werden muß. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an den vWF binden, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:According to a further aspect, the present invention also relates to a device comprising a container and a vWF derivative according to the invention contained therein, the container having an inlet opening and an outlet opening which is suitable for the passage of liquids. Conveniently, the device according to the invention is a column, in particular an affinity acid or chromatography column, trained which, if desired, can be made available as a ready-to-use product in a storage-stable form, so that only swelling of the material has to be carried out by the respective user before protein isolation. The present invention also relates to a method for isolating proteins that bind to the vWF, which is characterized by the following steps:
Bereitstellen einer Fraktion, welche Proteine enthält, die an den vWF binden,Providing a fraction containing proteins that bind to the vWF
Kontaktieren der Fraktion mit einem erfindungsgemäßen vWF-Contacting the fraction with a vWF
Derivat, wobei die Proteine an das vWF-Derivat gebunden werden,Derivative, the proteins being bound to the vWF derivative,
Abtrennen der nicht gebundenen Bestandteile undSeparating the unbound components and
Eluieren der Proteine vom vWF-Derivat.Elute the proteins from the vWF derivative.
Dieses Verfahren kann ansatzweise, also als "batch" -Verfahren durchgeführt werden oder aber als säulenchromatographisches Verfahren .This process can be carried out batchwise, that is to say as a “batch” process, or else as a column chromatography process.
Als Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden können, kommen vor allem die physiologischen Bindungsproteine von vWF in Betracht, also Glykoprotein Ib, der Glykoprotein Ilb/IIIa-Komplex, Collagen und insbesondere Faktor VIII, aber selbstverständlich auch rekombinante Derivate und Analoga dieser Proteine, vWF-Antigene, vWF-Antikörper, vWF-Multimerasen bzw. vWF-Depolymerasen und sogar Enzyme, die den vWF als Substrat erkennen, und andere natürliche oder synthetische Peptide und Proteine, welche eine Affinität zu vWF aufweisen. Außerdem können vWF-bindende Saccharide, wie z.B. Heparin, mit diesem Verfahren isoliert werden.Proteins that can be isolated using the method according to the invention are, above all, the physiological binding proteins of vWF, that is to say glycoprotein Ib, the glycoprotein Ilb / IIIa complex, collagen and in particular factor VIII, but of course also recombinant derivatives and analogs of these proteins , vWF antigens, vWF antibodies, vWF multimerases or vWF depolymerases and even enzymes that recognize the vWF as a substrate, and other natural or synthetic peptides and proteins that have an affinity for vWF. In addition, vWF-binding saccharides such as e.g. Heparin to be isolated using this procedure.
Auf Grund der hohen Avidität des erfindungsgemäßen vWF-Derivats ist es möglich, die zu isolierenden Proteine in Ausbeuten von mehr als 60 %, vorzugsweise mehr als 80 %, am meisten bevorzugt nahezu quantitativ, am erfindungsgemäßen Chromatographiematerial spezifisch zu binden und zu gewinnen und in gereinigter Form vom vWF-Derivat zu eluieren, womit die Herstellung von Konzentraten der isolierten Proteine durch einfache Elution ohne anschließen- den Konzentrierungsschritt möglich ist.Due to the high avidity of the vWF derivative according to the invention, it is possible to specifically bind and recover the proteins to be isolated in yields of more than 60%, preferably more than 80%, most preferably almost quantitatively, on the chromatography material according to the invention and in purified form Elute form of the vWF derivative, with which the preparation of concentrates of the isolated proteins by simple elution without subsequent the concentration step is possible.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Gewinnung von biologisch aktiven Proteinen mit Faktor VIII-Aktivität, insbesondere von plasmatischem oder rekombinantem Faktor VIII und deren Mutanten bzw. Analoga. Dieser kann mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren selbst dann isoliert werden, wenn eine Ausgangslösung, welche den Faktor VIII/ vWF-Komplex beinhaltet, verwendet wird.The method according to the invention is particularly suitable for the production of biologically active proteins with factor VIII activity, in particular of plasmatic or recombinant factor VIII and their mutants or analogs. This can be isolated with the method according to the invention even if a starting solution which contains the factor VIII / vWF complex is used.
Das Eluieren der Proteine, insbesondere bei der Gewinnung von Faktor VIII -Proteinen, wird vorzugsweise mit einem Kalziumionen enthaltenden Puffer durchgeführt.The elution of the proteins, in particular when obtaining factor VIII proteins, is preferably carried out with a buffer containing calcium ions.
Von besonderer Bedeutung ist dabei die Isolierung von Faktor. VIII aus Faktor VIII-hältigen Plasmafraktionen oder aus Zellkul- turüberständen von Zellen, welche Faktor VIII exprimieren. Bei der Isolierung von Faktor VIII aus Plasmafraktionen ist zu beachten, daß vWF als Trägerprotein des Faktor VIII fungiert, d.h.. Faktor VIII an vWF gebunden vorkommt. Die Trennung von Faktor VIII und vWF ist sonst nur mit aufwendigen Methoden zu bewerkstelligen, z.B. durch Bindung von Faktor VIII an immobilisierte gegen Faktor VIII gerichtete mono- bzw. polyklonale Antikörper, an welche der Faktor VIII/vWF-Komplex bindet und anschließend vWF gezielt eluiert wird ohne, daß die Bindung des Antikörpers mit Faktor VIII gestört wird. In der Folge wird dann Faktor VIII vom chromatographischen Gel eluiert. Solche Verfahren sind äußerst aufwendig, führen aber zu hochreinen Faktor VIII-Präparaten. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines immobilisierten r-vWF mit einer hohen spezifischen Bindungskapazität und einer hohen Avidität für Faktor VIII, läßt sich der in Plasmafraktionen vorkommende Komplex aus Faktor VIII und vWF dissoziieren, wobei Faktor VIII an den immobilisierten vWF mit höherer Avidität bindet. Auf diesem Wege läßt sich auch aus Plasmafraktion ein hochreiner Faktor VIII isolieren, der frei von vWF ist.The isolation of factor is of particular importance. VIII from plasma fractions containing factor VIII or from cell culture supernatants of cells which express factor VIII. When isolating factor VIII from plasma fractions, it should be noted that vWF acts as a carrier protein of factor VIII, i.e. factor VIII is bound to vWF. Otherwise, factor VIII and vWF can only be separated using complex methods, e.g. by binding factor VIII to immobilized mono- or polyclonal antibodies directed against factor VIII, to which the factor VIII / vWF complex binds and then vWF is specifically eluted without the binding of the antibody with factor VIII being disturbed. Then factor VIII is eluted from the chromatographic gel. Such procedures are extremely complex, but lead to high-purity factor VIII preparations. By using an immobilized r-vWF according to the invention with a high specific binding capacity and a high avidity for factor VIII, the complex of factor VIII and vWF occurring in plasma fractions can be dissociated, whereby factor VIII binds to the immobilized vWF with higher avidity. In this way, a highly pure factor VIII which is free of vWF can also be isolated from the plasma fraction.
Außer Faktor VIII lassen sich auch andere Proteine mit Affinität zu vWF an immobilisiertem r-vWF binden und aus komplexen Mischungen isolieren, nämlich z.B. Faktor VIII-Hybridproteine, insbesondere Faktor VIII-Heparin-Cofaktor II-Hybridprotein gemäß US Ser.No. 08/558,107 oder Faktor VIII-Faktor V-Hybridprotein gemäß der WO 90/05570 oder chimärer humaner/porciner Faktor VIII gemäß der WO 94/11503, FVIII-Mutanten, wie z.B. in der Österr. Anmeldung A 921/96 (factor VIII dB695-R2307Q) , beschriebene Faktor VIII-Mutante mit einer Arg23 ° 7→Gln-Substitution, die bei gleichbleibender Faktor VIII :C-procoagulatorischer Aktivität und vWF-Bindungsaktivität eine reduzierte Inhibitorbindung aufweist, von Willebrand Faktor-abbauende Enzyme, z.B. die vWF-spezifische Depolymerase bzw. vWF-Multimerase oder Thrombozytenrezeptoren, wie GPIIb/IIIa oder GPIb/IX-Komplex, deren Reindarstellung von biochemisch-analytischem, diagnostischem oder therapeutischem Interesse ist.In addition to factor VIII, other proteins with affinity for vWF can also be bound to immobilized r-vWF and isolated from complex mixtures, namely, for example factor VIII hybrid proteins, in particular factor VIII-heparin cofactor II hybrid protein according to US Ser.No. 08 / 558,107 or factor VIII-factor V hybrid protein according to WO 90/05570 or chimeric human / porcine factor VIII according to WO 94/11503, FVIII mutants, such as in Austria. Application A 921/96 (factor VIII dB695-R2307Q), described factor VIII mutant with an Arg 23 ° 7 → Gln substitution, which has a reduced inhibitor binding with constant factor VIII: C procoagulatory activity and vWF binding activity, by Willebrand Factor-degrading enzymes, for example the vWF-specific depolymerase or vWF multimerase or platelet receptors, such as GPIIb / IIIa or GPIb / IX complex, the pure representation of which is of biochemical-analytical, diagnostic or therapeutic interest.
Gegenwärtig wird die spezifische Isolierung von therapeutischen Proteinen mit der Methode der I munaffinitätschromatographie durchgeführt . Hierbei wird an einen immobilisierten monoklonalen Antikörper (welche in der Regel aus Mauszellen gewonnen werden) das zu isolierende Molekül gebunden und von Verunreinigungen freigewaschen und anschließend in hoher Reinheit eluiert. Der Nachteil der Verwendung von monoklonalen Antikörpern besteht darin, daß durch diese in die Präparation Mausproteine abgegeben werden können, die, sofern das zu bindende Molekül therapeutisch angewendet wird, zu Nebenwirkungen, wie z.B. zur Antikörperbildung gegen Mausprotein, führen. Durch die Verwendung eines immobilisierten spezifischen Liganden humanen Ursprungs oder eines dem humanen Protein äquivalenten Moleküls und die Vermeidung von xenogenen Antikörpern wird das immanente Problem der Kontamination durch das Ausbluten von Affinitätssäulen dahingehend reduziert, daß die im Präparat mögliche Verunreinigung ebenso humanen Ursprungs ist und damit die genannte Nebenwirkung, nämlich die Bildung von heterologen Antikörpern, ausgeschlossen wird. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß durch die Verwendung eines hochspezifischen Liganden, der kein Antikörper ist, Unspe- zifitäten, wie sie bei Antikörpern gelegentlich vorkommen, ausgeschlossen werden.The specific isolation of therapeutic proteins is currently carried out using the method of immunoaffinity chromatography. The molecule to be isolated is bound to an immobilized monoclonal antibody (which is usually obtained from mouse cells) and washed free of impurities and then eluted in high purity. The disadvantage of using monoclonal antibodies is that they can be used to deliver mouse proteins into the preparation, which, if the molecule to be bound is used therapeutically, lead to side effects such as e.g. lead to antibody formation against mouse protein. Through the use of an immobilized specific ligand of human origin or a molecule equivalent to the human protein and the avoidance of xenogenic antibodies, the inherent problem of contamination by bleeding from affinity columns is reduced to the extent that the contamination which is possible in the preparation is also of human origin and hence the one mentioned Side effect, namely the formation of heterologous antibodies, is excluded. Another advantage is that the use of a highly specific ligand that is not an antibody eliminates the unspecificities that sometimes occur with antibodies.
Die Gewinnung der physiologischen Bindungsproteine für vWF gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hat weiters den Vorteil, daß der vWF eine Stabilisator- bzw. Trägerfunktion für seine Bindungs- partner ausübt . Die gewonnenen Proteine sind daher sogar während der Isolierung und Reinigung vor denaturierenden Bedingungen, die eventuell während der Elution gewährt werden, geschützt. Die erhaltenen Produkte werden also nicht nur bezüglich ihrer Anti- genität in der genannten hohen Ausbeute erhalten, sondern auch bezüglich ihrer Aktivität bzw. Nativität.Obtaining the physiological binding proteins for vWF according to the inventive method has the further advantage that the vWF exercises a stabilizer or carrier function for its binding partners. The proteins obtained are therefore protected even during isolation and purification from denaturing conditions which may be granted during the elution. The products obtained are thus obtained not only in terms of their antigenicity in the high yield mentioned, but also in terms of their activity or nativity.
Ein weiteres, besonders bevorzugtes Protein bzw. Proteinkomplex, welcher mit dem erfindungsgemäßen vWF-Derivat aufgereinigt werden kann, ist die vWF-Multimerase, welche die hochmolekularen Formen des vWF zu niedrigmolekularen Varianten abbaut (siehe Österr. Anmeldungen A 769/96 und A 770/96) . Dabei kann die Mul- timerase an den immobilisierten vWF binden, die Derivatisierung verhindert jedoch den Abbau des erfindungsgemäßen Materials.Another particularly preferred protein or protein complex which can be purified with the vWF derivative according to the invention is the vWF multimerase, which degrades the high molecular forms of the vWF into low molecular weight variants (see Austrian applications A 769/96 and A 770 / 96). The multimerase can bind to the immobilized vWF, but the derivatization prevents the degradation of the material according to the invention.
Insbesondere bei der Isolierung der vWF-Multimerase kann besonders effizient mit einem Puffer, welcher eine Chelatbildner für Metallionen, insbesondere EDTA, enthält, eluiert werden.In particular when isolating the vWF multimerase, elution can be carried out particularly efficiently with a buffer which contains a chelating agent for metal ions, in particular EDTA.
Das erfindungsgemäße vWF-Derivat eignet sich auch zur gegebenenfalls extracorporalen Immunadsorption von Antikörpern, die gegen vWF gerichtet sind. Die Bildung von Antikörpern gegen vWF stellt einen pathologischen Zustand dar, der als Autoimmunerkrankung auftreten kann und zu einem Blutgerinnungsdefekt mit gesteigerter Blutungsneigung führt oder als Nebenwirkung der Behandlung von Patienten mit vWF enthaltenden Präparaten auftreten kann. Die Bildung eines funktioneil inhibitorischen Antikörpers macht eine Substitutionstherapie unmöglich oder führt zu drastischen Dosissteigerungen, um den hämostatischen Effekt des Gerinnungsfaktorkonzentrates aufrecht erhalten zu können. In solchen Fällen wurde der zirkulierende funktioneile Antikörper gegen den Gerinnungsfaktor in der Vergangenheit durch Plasmapherese oder durch extracorporale Immunadsorption an gegen IgG gerichtete Proteine, z.B. Protein A oder Protein G, entfernt. Ein ähnliches Verfahren ist zur Entfernung von gegen Faktor VIII gerichteten Antikörpern von Nilsson und Berntorp bekannt. Hierbei wird das Plasma des Patienten über eine Säule mit immobilisiertem, rekom- binantem FVIII gepumpt, um die FVIII-inhibitorischen Antikörper aus dem Blutkreislauf zu entfernen (Nilsson et al . , Thromb. Haemostas. 70 (1993) , 56-59) . Der dort immobilisierte Ligand war jedoch frei an von Willebrand-Faktor. Entsprechend konnte keine extracorporale Immunadsorption von gegen vWF-gerichteten Antikörpern durchgeführt werden.The vWF derivative according to the invention is also suitable for optionally extracorporeal immunoadsorption of antibodies which are directed against vWF. The formation of antibodies against vWF is a pathological condition that can occur as an autoimmune disease and lead to a blood clotting defect with increased bleeding tendency or can occur as a side effect of the treatment of patients with preparations containing vWF. The formation of a functional inhibitory antibody makes substitution therapy impossible or leads to drastic dose increases in order to maintain the hemostatic effect of the coagulation factor concentrate. In such cases, the circulating functional antibody against the coagulation factor has been removed in the past by plasmapheresis or by extracorporeal immunoadsorption on proteins directed against IgG, for example protein A or protein G. A similar procedure is known for removing Nilsson and Berntorp anti-factor VIII antibodies. Here, the patient's plasma is pumped over a column with immobilized, recombinant FVIII, around the FVIII-inhibitory antibodies from the bloodstream (Nilsson et al., Thromb. Haemostas. 70 (1993), 56-59). However, the ligand immobilized there was free of the Willebrand factor. Accordingly, no extracorporeal immunoadsorption of antibodies directed against vWF could be carried out.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von Antikörpern liegt in der praparativen Gewinnung von polyklonalen oder monoklonalen anti-vWF-Antikörpern für diagnostische Zwecke.Another application of the method according to the invention for the production of antibodies lies in the preparation of polyclonal or monoclonal anti-vWF antibodies for diagnostic purposes.
Ein Elutionspuffer, welcher bevorzugt bei der Elution von Antikörper vom erfindungsgemäßen vWF-Derivat verwendet wird, weist einen sauren pH auf, insbesondere einen pH im Bereich von 2 bis 5.An elution buffer, which is preferably used in the elution of antibodies from the vWF derivative according to the invention, has an acidic pH, in particular a pH in the range from 2 to 5.
Einer der wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Aufreinigung der Proteine von jedem Ausgangsmaterial möglich ist. Besonders bevorzugte Ausgangsfraktionen bilden dabei Fraktionen, die aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers oder einer Zellkultur abgeleitet sind. Aufgrund der erfindungsgemäßen Avidität des Chromatographiematerials sind auch Fraktionen bevorzugt, welche den vWF und/oder den Faktor VIII/vWF-Komplex enthalten.One of the main advantages of the present invention is that it is possible to purify the proteins from any starting material. Particularly preferred starting fractions form fractions which are derived from a body fluid of a mammal or from a cell culture. Because of the avidity of the chromatography material according to the invention, fractions which contain the vWF and / or the factor VIII / vWF complex are also preferred.
Eine bevorzugte Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dem darin enthaltenen vWF-Derivat durchgeführt wird.A preferred embodiment variant of the method according to the invention is that it is carried out using the device according to the invention with the vWF derivative contained therein.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert.The invention is explained in more detail with reference to the following examples and the drawing figures, to which, however, it should not be restricted.
Es zeigen: Fig. 1 und Fig. 2 die Reinigung von rekombinantem Faktor VIII mit dem erfindungsgemäßen vWF-Derivat.1 and 2 show the purification of recombinant factor VIII with the vWF derivative according to the invention.
BEISPIEL 1:EXAMPLE 1:
Herstellung eines rekombinanten von Willebrand-Faktors aus CHO- Zellen .Production of a recombinant von Willebrand factor from CHO Cells.
Ein CHO-Zellklon, der rekombinanten von Willebrand-Faktor produziert, wird wie in FEBS.Lett. 351 (1994), 345-348, beschrieben, hergestellt . Durch Transfektion mit einem für die cDNA humanen Furins kodierenden Vektor (van den Ouweland et al . , Nucleic Acids Res. 18 (1990), 664) wurde die Zellinie zur Co-Expression von humanem Furin gebracht. Derartige stabile Zeilklone wurden im Großmaßstab in Perfusionsreaktoren auf Microcarriern fermentiert (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds . Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, (1994) , 267-269) .A CHO cell clone that produces recombinant von Willebrand factor is described in FEBS.Lett. 351 (1994), 345-348. The cell line was brought to co-expression of human furin by transfection with a vector coding for the cDNA human furin (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 664). Such stable cell clones were fermented on a large scale in perfusion reactors on microcarriers (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, (1994), 267-269) .
Die Reinigung wurde durch ein 2-stufiges chromatographisches Verfahren gemäß Thromb.Haemost. 73 (1995), 1160, durchgeführt. Die durch Elution mit Kochsalz desorbierte Fraktion wurde gewonnen und durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, umgepuffert. Anschließend wurde die Präparation durch Ultrakonzentration über eine Amicon YM30-Membran (cut-off: 30.000 D) auf eine Proteinkonzentration von 3 mg/ml aufkonzentriert . Die vWF- Konzentration in dieser Präparation betrug 60 E vWF-Antigen/mg Protein. Diese Präparation enthielt keinen Faktor VIII aufgrund der Vermeidung von Serum oder Plasmabestandteilen bei der Herstellung in Zellkultur und bei der Reinigung.The purification was carried out by a 2-stage chromatographic method according to Thromb.Haemost. 73: 1160 (1995). The fraction desorbed by elution with sodium chloride was obtained and buffered by gel filtration through Sephadex G25 (Pharmacia) in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. The preparation was then concentrated by ultraconcentration over an Amicon YM30 membrane (cut-off: 30,000 D) to a protein concentration of 3 mg / ml. The vWF concentration in this preparation was 60 U vWF antigen / mg protein. This preparation did not contain factor VIII due to the avoidance of serum or plasma components during the production in cell culture and during the cleaning.
BEISPIEL 2 :EXAMPLE 2:
Immobilisierung von rekombinantem von Willebrand-Faktor.Immobilization of recombinant von Willebrand factor.
Die Präparation des rekombinanten vWF aus Beispiel 1 wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, auf 1,5 mg/ml verdünnt. Ein voraktiviertes, für die Affinitäts- chromatographie geeignetes Gel (Actigel, ALD-Superflow, Fa. Sterogene) wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, exzessiv vorgewaschen. Ein Volumsteil des vorgewaschenen Gels wurde mit 1,1 Volumsteilen der zu immobilisierenden Proteinlösung versetzt und anschließend 0,15 Volumsteile einer Lösung von 0,1 M Cyanborhydrid (NaCNBH3 ) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 , 0 ,, zugesetzt . Das Gel wurde durch Schütteln in diesem Puffer suspendiert und unter weiterem Schütteln 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert . Anschließend wurde das Gel auf einer Sinternutsche mit dem 10-fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, und mit dem 5- fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7,5, gewaschen. Dann wurde nochmals mit 5 Volumsteilen des Puffers, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, äquilibriert und das Gel in eine chromatographische Säule mit einer Dimension Durchmesser zu Gelbetthöhe von 1:4 übergeführt. Durch Bestimmung der Proteinkonzentration in den auf der Sinternutsche abgetrennten Lösungen des Inkubationsüberstandes der vWF-Lösung und des Affinitätsgeles sowie der Waschlösungen konnte eine Kopplungs- rate von über 90 % des eingesetzten Proteins ermittelt werden.The preparation of the recombinant vWF from Example 1 was diluted to 1.5 mg / ml with a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. A preactivated gel suitable for affinity chromatography (Actigel, ALD-Superflow, from Sterogene) was excessively prewashed with a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. One volume part of the pre-washed gel was mixed with 1.1 parts by volume of protein solution to be immobilized and then 0.15 parts by volume of a solution of 0.1 M cyanoborohydride (NaCNBH 3) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7, 0, is added. The gel was shaken suspended in this buffer and incubated for 16 hours at room temperature with further shaking. The gel was then placed on a sintered funnel with 10 times the volume of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 and with 5 times the volume of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5. The mixture was then equilibrated again with 5 parts by volume of the buffer, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 and the gel was transferred to a chromatographic column with a dimension of diameter to a gel bed height of 1: 4. By determining the protein concentration in the solutions of the incubation supernatant of the vWF solution and the affinity gel as well as the washing solutions separated on the sintered chute, a coupling rate of over 90% of the protein used could be determined.
BEISPIEL 3 :EXAMPLE 3
Reinigung von rekombinantem Faktor VIII .Purification of recombinant factor VIII.
Ein rekombinantes Faktor VHI-Präparat (Reco binate, Fa. Baxter) wurde mit 10 ml A.dest. rekonstituiert. Diese Lösung enthielt 50 IE FVIII/ml, 12 mg Humanalbumin/ml, 1,5 mg Polyethylenglykol 3350/ml sowie Spuren von vWF in einem Histidin-Kochsalz-Puffer bei physiologischem pH-Wert. Durch Gelfiltration auf Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) wurden die niedrigmolekularen Komponenten aus dieser Lösung abgetrennt und das Faktor VIII/vWF/Albumin-Gemisch in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, gebracht. 7 ml dieser Lösung wurden anschließend auf die Säule aus Beispiel 2 mit einer Flußrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Danach wurde bei gleicher Flußrate mit 10 ml eines Puffers, 20 mM Tris- HCl, pH 7,5, nachgewaschen und weiters die an vWF-gebundene FVIII-Fraktion mit 250 mM Calciumchlorid im selben Puffer eluiert. Während der gesamten, bei Raumtemperatur durchgeführten, Chromatographie wurden Fraktionen zu 500 μl gesammelt und nach dem Säulendurchlauf die optische Dichte bei 280 nm bestimmt. In den Fraktionen wurde in der Folge der FVIII-Gehalt mittels des chromogenen Faktor VIII-Tests, Immunochrom FVIII:C (Fa. Immuno), bestimmt. Das Resultat ist der Fig. 1 zu entnehmen.A recombinant factor VHI preparation (Recombine, Baxter) was mixed with 10 ml A.dest. reconstituted. This solution contained 50 IU FVIII / ml, 12 mg human albumin / ml, 1.5 mg polyethylene glycol 3350 / ml and traces of vWF in a histidine saline buffer at physiological pH. The low molecular weight components were separated from this solution by gel filtration on Sephadex G25 (Pharmacia) and the factor VIII / vWF / albumin mixture was brought into a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5. 7 ml of this solution were then applied to the column from Example 2 at a flow rate of 0.5 ml / min. The mixture was then washed at the same flow rate with 10 ml of a buffer, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, and further the FVIII fraction bound to vWF was eluted with 250 mM calcium chloride in the same buffer. During the entire chromatography, carried out at room temperature, 500 μl fractions were collected and, after the column had passed, the optical density at 280 nm was determined. The FVIII content in the fractions was subsequently determined using the chromogenic factor VIII test, immunochrome FVIII: C (from Immuno). The result is shown in FIG. 1.
Die Analyse der Fraktionen zeigt, daß mehr als 90 % des Proteins im Säulendurchlauf und in der Waschlösung enthalten waren, wäh- rend mit dieser Proteinfraktion nur ein geringer Teil der FVIII- Aktivität (unter 5 %) eluierte. Die Hauptmenge an FVIII konnte durch die Elution mit Calciumchlorid von der Säule in hoher Reinheit desorbiert werden. Die Gewinnung des Faktor VIII erfolgte mit einer Ausbeute von mehr als 90 %.Analysis of the fractions shows that more than 90% of the protein was contained in the column run and in the wash solution, while Only a small part of the FVIII activity (below 5%) eluted with this protein fraction. Most of the FVIII could be desorbed from the column in high purity by elution with calcium chloride. Factor VIII was obtained with a yield of more than 90%.
BEISPIEL 4 :EXAMPLE 4
Wiederverwendbarkeit des Affinitätsgeles.Reusability of the affinity gel.
Nach Abschluß der ersten äffinitatschromatographischen Reinigung von rekombinantem Faktor VIII wurde das Affinitätsgel in der Säule exzessiv mit einem Puffer, 20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen. In der Waschlösung wurde vWF-Antigen mittels ELISA (Fa. Boehringer, Mannheim) bestimmt. Es konnte kein vWF:Ag gemessen werden, was ein Indikator für geringes Ausbluteverhalten der Affinitätssäule ist. Die affinitätschromatographische Reinigung von rekombinantem Faktor VIII an immobilisiertem rekombinanten vWF wurde wie in Beispiel 3 unter identen Bedingungen wiederholt. Das Elutionsdiagramm ist Fig. 2 zu entnehmen. Protein- und Aktivitätselutionsprofil waren innerhalb der Testabweichungen mit dem ersten äffinitatschromatographischen Lauf vergleichbar. Es kann daher von einer guten Wiederverwendbarkeit des Äffinitätsgeles ausgegangen werden.After completion of the first affinity chromatographic purification of recombinant factor VIII, the affinity gel in the column was washed excessively with a buffer, 20 mM Tris, pH 7.5. VWF antigen was determined in the washing solution by means of ELISA (Boehringer, Mannheim). No vWF: Ag could be measured, which is an indicator of low bleeding behavior on the affinity column. The affinity chromatography purification of recombinant factor VIII on immobilized recombinant vWF was repeated as in Example 3 under identical conditions. The elution diagram is shown in FIG. 2. Protein and activity elution profiles were comparable to the first affinity chromatographic run within the test deviations. Good reusability of the affinity gel can therefore be assumed.
BEISPIEL 5 :EXAMPLE 5
Bindung von anti-von Willebrand Faktor-Antikörpern an immobilisierten rekombinanten von Willebrand Faktor.Binding of anti-von Willebrand factor antibodies to immobilized recombinant von Willebrand factor.
Ein gegen vWF gerichteter Maus-monoklonaler Antikörper (MAb 03768/3, Fa. Chemicon International, Inc.) mit einer IgG-Konzen- tration von 7 mg/ml wurde durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) in einen Puffer, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, umgepuffert. Die Proteinkonzentration wurde durch Verdünnung mit demselben Puffer auf 0,5 mg/ml eingestellt. 4 ml dieser Lösung wurden mit einer Flußrate von 0,5 ml/min über die immobilisierten rekombinanten vWF aus Beispiel 3 enthaltende Säule gepumpt und im Durchlauf die optische Dichte bei 280 nm bestimmt. Anschließend wurde mit 20 ml des Tris-HCl-Puffers nachgewaschen und weiters mit 10 ml eines Tris-HCl-Puffers, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. Bei keinem der genannten Waschschritte konnten nennenswerte Proteinmengen von der Affinitätssäule eluiert werden. Nachfolgend wurde mit einem Puffer, 100 mM Glycin-Hydro- chlorid, pH 2,2, eluiert. Durch pH-Wert-Änderung konnte Protein quantitativ von der Säule desorbiert werden. Die Bestimmung des IgG-Gehaltes ergab, daß von den eingesetzten 2 mg IgG 1,75 mg IgG im Glycin-Eluat wiedergefunden wurden. Dies entspricht einer Ausbeute von 88 %. Die Affinitätssäule wurde nach dem Elutions- schritt mit dem sauren Puffer zur weiteren Wiederverwendung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gespült.A mouse monoclonal antibody directed against vWF (MAb 03768/3, from Chemicon International, Inc.) with an IgG concentration of 7 mg / ml was gel-filtered via Sephadex G25 (from Pharmacia) in a buffer, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, buffered. The protein concentration was adjusted to 0.5 mg / ml by dilution with the same buffer. 4 ml of this solution were pumped at a flow rate of 0.5 ml / min over the column containing immobilized recombinant vWF from Example 3 and the optical density at 280 nm was determined in a run. It was then washed with 20 ml of the Tris-HCl buffer and further with 10 ml of a Tris-HCl buffer containing 500 mM NaCl, washed. No significant amounts of protein could be eluted from the affinity column in any of the washing steps mentioned. The mixture was then eluted with a buffer, 100 mM glycine hydrochloride, pH 2.2. Protein could be quantitatively desorbed from the column by changing the pH. The determination of the IgG content showed that of the 2 mg IgG used, 1.75 mg IgG were recovered in the glycine eluate. This corresponds to a yield of 88%. After the elution step, the affinity column was rinsed with the acid buffer for further reuse with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5.
BEISPIEL 6 :EXAMPLE 6
Reinigung eines von Willebrand-Faktor-abbauenden Enzyms.Purification of an enzyme that breaks down Willebrand factor.
Die von Furlan et al. (Blood 87 (1996), 4223-4234 beschriebene vWF-spaltende Protease aus Humanplasma wurde nach der ebenda beschriebenen Methode über Kupferchelat-Affinitätschromatographie und nachfolgende hydrophobe Interaktionschromatographie an Butylsepharose (Fa. Pharmacia) vorgereinigt. Das Eluat aus Bu- tylsepharose wurde gefriergetrocknet und konzentriert in destilliertem Wasser aufgenommen. Anschließend wurde es über Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) gegen einen Puffer, 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM BaCl2 , 5 mM PEFA-Block (Fa. Pentapharm) pH 7,5, umgepuffert. 3 ml dieser Lösung wurden über die Säule, enthaltend immobilisierten rekombinanten vWF aus Beispiel 2, mit einer Flußrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Anschließend wurde mit 10 ml desselben Puffers, gegen den die Proteasefraktion umgepuffert worden war, nachgewaschen und die Säule mit weiteren 10 ml eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 5 mM PEFA-Block (Fa. Pentapharm) pH 7,5, gespült. Während der gesamten Chromatographie wurden Fraktionen zu je 450 μl gesammelt, wobei in den Röhrchen des Fraktionssammlers bei jeder Fraktion 50 μl einer 1 %igen wäßrigen Lösung von bovinem Serumalbumin vorgelegt war, um das als labil bekannte vWF-abbauende Enzym zu stabilisieren. Während der Chromatographie wurde die UV-Absorption bei 280 nm gemessen und die Aktivität des vWF-abbauenden Enzyms wie folgt bestimmt. Eine Präparation des rekombinanten vWF aus Beispiel 1 wurde in einem Puffer, 5 mM Tris-HCl, 1,5 M Harnstoff, enthaltend 0,2 % (G/V) bovines Serumalbumin, umgepuf- fert und auf 0,4 vWF E/ml gebracht. Aliquote der zu untersuchenden Fraktionen von 100 μl wurden mit je 5 μl einer 50 mM wäßrigen PPACK-Lösung und 12,5 μl einer 200 mM BaCl2 -Lösung versetzt und 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die so vorbereitete Probe 1 + 1 mit dem Substrat (vWF) versetzt und 15 h bei 37°C auf einer schwimmenden Dialysemembrane (Millipore VSWP) nach der Methode von Marusky und Sergeant (Anal .Biochem. 105 (1980), 403) gegen einen Puffer, enthaltend 5 mM Tris-HCl, 1,5 M Harnstoff, pH 8,0, dialysiert. Anschließend wurde das Dialysat auf seine vWF-Restaktivität in einem ELISA, bei welchem die Collagenbindungsaktivität des vWF sowie dessen Antigenität bestimmt wird, analysiert. Dazu wurden in einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol (96 well, Pierce Reactibind™/Maleinsäureanhydrid aktiviert) pro Napf 100 μl Suspension von pepsinverdautem Typ- III-Collagen (Fa. Southern Biotechnology) aus humaner Plazenta in einer Konzentration von 2 μg/ml gegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 30 Minuten lang mit jeweils 150 μl Blockpuffer (SuperBlock™, Fa. Pierce) behandelt. Dann wurden jeweils 100 μl verschiedener Verdünnungen der vWF enthaltenden Probe aufgetragen (25-250 ng vWF/ml) und mit 100 μl einer Lösung eines Peroxidase-konjugierten anti-vWF-Antikörpers inkubiert (Dakopatts P226, Verdünnung 1:1000). Anschließend wurden 100 μl Substrat zugegeben (Single Component TMB Peroxidase EIA Substrate, Fa. Bio-Rad) und die Farbreaktion nach 1 min durch 1+1-Verdünnung mit 0,18 M H2 S04 abgestoppt. Danach wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem ELISA-Reader gemessen und die Probenkonzentration gegenüber einer Verdünnungsreihe eines Standards bestimmt. Nach jedem Inkubationsschritt wurde jeweils 3mal mit 150 μl Puffer (Puffer entsprechend der jeweils nächsten Stufe) gewaschen.The data provided by Furlan et al. (Blood 87 (1996), 4223-4234, the vWF-cleaving protease from human plasma was prepurified according to the method described above using copper chelate affinity chromatography and subsequent hydrophobic interaction chromatography on butyl sepharose (from Pharmacia). The eluate from butyl sepharose was freeze-dried and concentrated It was then taken up in distilled water and then subjected to Sephadex G25 (Pharmacia) against a buffer, 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM BaCl 2 , 5 mM PEFA block (Pentapharm) pH 7.5. 3 ml of this solution were applied to the column containing immobilized recombinant vWF from Example 2 at a flow rate of 0.5 ml / min, followed by washing with 10 ml of the same buffer against which the protease fraction had been buffered and the The column was rinsed with a further 10 ml of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 5 mM PEFA block (from Pentapharm) pH 7.5 Chromatography, fractions of 450 μl were collected, 50 μl of a 1% strength aqueous solution of bovine serum albumin for each fraction being placed in the tubes of the fraction collector in order to stabilize the vWF-degrading enzyme known as labile. During the chromatography, the UV absorption was measured at 280 nm and the activity of the vWF-degrading enzyme was determined as follows. A preparation of the recombinant vWF from Example 1 was repuffed in a buffer, 5 mM Tris-HCl, 1.5 M urea, containing 0.2% (w / v) bovine serum albumin. finished and brought to 0.4 vWF E / ml. Aliquots of the fractions to be examined of 100 μl were each mixed with 5 μl of a 50 mM aqueous PPACK solution and 12.5 μl of a 200 mM BaCl 2 solution and incubated for 5 min at 37 ° C. Subsequently, the sample 1 + 1 prepared in this way was mixed with the substrate (vWF) and 15 h at 37 ° C. on a floating dialysis membrane (Millipore VSWP) according to the method of Marusky and Sergeant (Anal. Biochem. 105 (1980), 403) dialyzed against a buffer containing 5 mM Tris-HCl, 1.5 M urea, pH 8.0. The dialysate was then analyzed for its residual vWF activity in an ELISA, in which the collagen binding activity of the vWF and its antigenicity are determined. For this purpose, 100 μl suspension of pepsin-digested type III collagen (from Southern Biotechnology) from human placenta in a concentration of 2 μg / ml was added per well in a microtiter plate made of polystyrene (96 well, Pierce Reactibind ™ / maleic anhydride) and 1 h incubated at room temperature. The mixture was then treated with 150 μl block buffer (SuperBlock ™, Pierce) for 30 minutes. Then 100 μl of different dilutions of the sample containing vWF were applied (25-250 ng vWF / ml) and incubated with 100 μl of a solution of a peroxidase-conjugated anti-vWF antibody (Dakopatts P226, dilution 1: 1000). 100 μl of substrate were then added (Single Component TMB Peroxidase EIA substrates, Bio-Rad) and the color reaction was stopped after 1 min by 1 + 1 dilution with 0.18 MH 2 SO 4 . Then the absorbance at 450 nm was measured with an ELISA reader and the sample concentration compared to a dilution series of a standard was determined. After each incubation step, washing was carried out 3 times with 150 μl buffer (buffer corresponding to the next step in each case).
Verwendetes Puffersystem:Buffer system used:
Puffer 1 (für die Collagenbeschichtung und Antikörperverdünnung) :Buffer 1 (for collagen coating and antibody dilution):
8 mM Natriumphosphat, 135 mM NaCl, 2 , 6 mM KC1, pH 7 , 3 Puffer 2 (für Probenverdünnung) : entspricht Puffer 1 + 0,05 % Tween 20 und 1 %8 mM sodium phosphate, 135 mM NaCl, 2, 6 mM KC1, pH 7, 3 buffer 2 (for sample dilution): corresponds to buffer 1 + 0.05% Tween 20 and 1%
Rinderserum- lbumin, pH 7 , 3 Der Reziprokwert der Collagenbindungsaktivität gilt als direktes Maß für die Enzymaktivität des vWF-abbauenden Enzyms.Bovine serum albumin, pH 7.3 The reciprocal of the collagen binding activity is a direct measure of the enzyme activity of the vWF-degrading enzyme.
Von der auf die von Willebrand Faktor-Säule aufgetragenen Enzymmenge fanden sich ca. 50 % im Durchlauf und in den Waschlösungen, während ca. 50 % der Aktivität durch die Elution mit EDTA von der Säule desorbiert werden konnten. Da jedoch mehr als 95 % des Proteins im Durchlauf und den Waschfraktionen der chromatographischen Reinigung enthalten waren, konnte die zu isolierende Enzymaktivität um einen Faktor 5 - 10 im Verhältnis zum Ausgang angereichert und gereinigt werden.About 50% of the amount of enzyme applied to the Willebrand factor column was found in the run and in the washing solutions, while about 50% of the activity could be desorbed from the column by elution with EDTA. However, since more than 95% of the protein was contained in the run and the wash fractions of the chromatographic purification, the enzyme activity to be isolated could be enriched and purified by a factor of 5-10 in relation to the output.
BEISPIEL 7 :EXAMPLE 7
Reinigung von plasmatischem Faktor VIIIPurification of plasma factor VIII
Ein plasmatisches Faktor VHI/von Willebrand-Faktor-Konzentrat (IMMUNATE; Fa. Immuno) wurde mit 5 ml destilliertem Wasser rekonstituiert. Diese Lösung enthielt 25 IE Faktor VHI/ml und 10 E vWF/ml (gemessen mit der Ristocetin Cofaktor-Methode) in einem Citrat-Glycin-Lysin-Puffer, pH 7,4. Durch Gelfiltration auf Sephadex G25 wurde der Faktor VHI/von Willebrand-Faktor- Komplex gegen einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, umgepuffert. Anschließend wurden 3 ml dieser Lösung direkt auf die Säule aus Beispiel 2 aufgebracht. Die Flußrate betrug 0,1 ml/min. Danach wurde mit 30 ml eines 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, nachgewaschen und anschließend mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris/HCl und 250 mM CaCl2 , eluiert. Bei der Elution wurden Fraktionen gesammelt und die optische Dichte bestimmt. In den Fraktionen unmittelbar nach Auftragen des Elutionspuffers konnte eine Erhöhung der UV-Absorption von 280 nm um 10 % gemessen werden, wobei das desorbierte Protein frei von von Willebrand-Faktor, gemessen in einem von Willebrand-Faktor-ELISA (Boehringer Mannheim) , war, während in den ersten zehn Eluatfraktionen ein Faktor VIII -Gehalt von ca. 0,2 E/ml durch Bestimmung mit einem chromogenen Faktor VIII-Test, Immunochrom FVIII:C (Fa. Immuno), festgestellt werden konnte. A plasmatic factor VHI / von Willebrand factor concentrate (IMMUNATE; Fa. Immuno) was reconstituted with 5 ml of distilled water. This solution contained 25 IU factor VHI / ml and 10 U vWF / ml (measured with the ristocetin cofactor method) in a citrate-glycine-lysine buffer, pH 7.4. The factor VHI / von Willebrand factor complex was buffered against a buffer containing 20 mM Tris / HCl, pH 7.5, by gel filtration on Sephadex G25. 3 ml of this solution were then applied directly to the column from Example 2. The flow rate was 0.1 ml / min. The mixture was then washed with 30 ml of a 20 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5, and then eluted with a buffer containing 20 mM Tris / HCl and 250 mM CaCl 2 . Fractions were collected during the elution and the optical density was determined. In the fractions immediately after application of the elution buffer, an increase in UV absorption of 280 nm by 10% was measured, the desorbed protein being free of Willebrand factor, measured in a von Willebrand factor ELISA (Boehringer Mannheim) , while in the first ten eluate fractions a factor VIII content of approx. 0.2 U / ml could be determined by determination with a chromogenic factor VIII test, immunochrome FVIII: C (from Immuno).

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e : Patent claims:
1. Von Willebrand Faktor-Derivat (vWF-Derivat) , bestehend aus rekombinantem von Willebrand Faktor (r-vWF) , immobilisiert an einen partikulären Träger oder ein Trägergel.1. Von Willebrand factor derivative (vWF derivative), consisting of recombinant von Willebrand factor (r-vWF), immobilized on a particulate carrier or a carrier gel.
2. vWF-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der partikuläre Träger oder das Trägergel ein Chromatographiematerial ist.2. vWF derivative according to claim 1, characterized in that the particulate carrier or the carrier gel is a chromatography material.
3. vWF-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das vWF-Derivat frei von Blutgerinnungsfaktor VIII ist.3. vWF derivative according to claim 1 or 2, characterized in that the vWF derivative is free of blood coagulation factor VIII.
4. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF durch chemische Bindung an den partikulären Träger oder das Trägergel fixiert ist.4. VWF derivative according to one of claims 1 to 3, characterized in that the r-vWF is fixed by chemical bonding to the particulate carrier or the carrier gel.
5. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF aus einer r-vWF-Fraktion mit einer geringen primären hämostatischen Aktivität, insbesondere einer niedermolekularen r-vWF-Fraktion, abgeleitet ist.5. VWF derivative according to one of claims 1 to 4, characterized in that the r-vWF is derived from an r-vWF fraction with a low primary hemostatic activity, in particular a low molecular weight r-vWF fraction.
6. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der partikuläre Träger oder das Trägergel ein organisches Polymer, insbesondere ein organisches Polymer auf Kohlehydratbasis, ist.6. VWF derivative according to one of claims 1 to 5, characterized in that the particulate carrier or the carrier gel is an organic polymer, in particular an organic polymer based on carbohydrates.
7. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF bzw. das Derivat virusinaktiviert ist .7. VWF derivative according to one of claims 1 to 6, characterized in that the r-vWF or the derivative is virus inactivated.
8. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in lagerstabiler Form, insbesondere als Lyophilisat, vorliegt.8. VWF derivative according to one of claims 1 to 7, characterized in that it is in storage-stable form, in particular as a lyophilisate.
9. Vorrichtung, umfassend einen Behälter und ein darin enthaltenes vWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Behälter eine Eingangsöffnung und eine Ausgangsöffnung aufweist, welche geeignet zur Durchleitung von Flüssigkeiten ausgebildet sind.9. An apparatus comprising a container and a vWF derivative contained therein according to any one of claims 1 to 8, wherein the container has an inlet opening and an outlet opening, which are suitable for the passage of liquids.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter als Affinitätssäule ausgebildet ist.10. The device according to claim 9, characterized in that the container is designed as an affinity column.
11. Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an den vWF binden, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:11. A method for isolating proteins that bind to the vWF, characterized by the following steps:
Bereitstellen einer Fraktion, welche Proteine enthält, die an den vWF binden,Providing a fraction containing proteins that bind to the vWF
Kontaktieren der Fraktion mit einem vWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Proteine an das vWF-Derivat gebunden werden,Contacting the fraction with a vWF derivative according to any one of claims 1 to 8, wherein the proteins are bound to the vWF derivative,
Abtrennen der nicht gebundenen Bestandteile undSeparating the unbound components and
Eluieren der Proteine vom vWF-Derivat.Elute the proteins from the vWF derivative.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine in konzentrierter Form vom vWF-Derivat eluiert werden.12. The method according to claim 11, characterized in that the proteins are eluted in concentrated form from the vWF derivative.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche ein biologisch aktives Protein mit Faktor VIII-Aktivität enthält, bereitgestellt wird und dieses Protein isoliert wird.13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that a fraction which contains a biologically active protein with factor VIII activity is provided and this protein is isolated.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Calcium- Ionen enthaltenden Puffer eluiert wird.14. The method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that is eluted with a buffer containing calcium ions.
15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche eine vWF-Multimerase enthält, bereitgestellt wird und dieses Protein isoliert wird.15. The method according to claim 11 or 12, characterized in that a fraction which contains a vWF multimerase is provided and this protein is isolated.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Puffer, welcher einen Chelatbild- ner für Metallionen, insbesondere EDTA, enthält, eluiert wird.16. The method according to any one of claims 11, 12 or 15, characterized in that is eluted with a buffer which contains a chelating agent for metal ions, in particular EDTA.
17. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche Antikörper gegen den vWF enthält, bereitgestellt wird und diese Proteine isoliert werden. 17. The method according to claim 11 or 12, characterized in that a fraction which contains antibodies against the vWF is provided and these proteins are isolated.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Puffer mit einem sauren pH, insbesondere im Bereich von pH 2 bis 5, eluiert wird.18. The method according to any one of claims 11, 12 or 17, characterized in that with a buffer with an acidic pH, in particular in the range of pH 2 to 5, is eluted.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, die aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers oder einer Zellkultur abgeleitet ist, bereitgestellt wird.19. The method according to any one of claims 11 to 18, characterized in that a fraction which is derived from a body fluid of a mammal or a cell culture is provided.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, enthaltend vWF und/oder den Faktor VIII/vWF-Komplex, bereitgestellt wird.20. The method according to any one of claims 11 to 19, characterized in that a fraction containing vWF and / or the factor VIII / vWF complex is provided.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer Ausbeute von mindestens 80 % gewonnen werden.21. The method according to any one of claims 11 to 20, characterized in that the proteins are obtained with a yield of at least 80%.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10 durchgeführt wird. 22. The method according to any one of claims 11 to 21, characterized in that it is carried out using a device according to claim 9 or 10.
PCT/AT1997/000253 1996-12-13 1997-11-19 Von willebrand factor derivative and method for isolating proteins WO1998025969A1 (en)

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