WO1998006825A1 - Artificial rheumatic pannus tissues and diagnostic method for detecting rheumatoid arthritis - Google Patents

Artificial rheumatic pannus tissues and diagnostic method for detecting rheumatoid arthritis Download PDF

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WO1998006825A1
WO1998006825A1 PCT/EP1997/004308 EP9704308W WO9806825A1 WO 1998006825 A1 WO1998006825 A1 WO 1998006825A1 EP 9704308 W EP9704308 W EP 9704308W WO 9806825 A1 WO9806825 A1 WO 9806825A1
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rheumatic
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Harald Illges
Inga Melchers
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KLINIKUM DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITäT FREIBURG
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to rheumatic pannus tissue which forms pannus-like villi and preferably contains HLA class II positive acrophage-like cells and vimentin-producing fibroblast-like cells, a method for producing the rheumatic pannus tissue and the use of the rheumatic pannus tissue to find pharmacologically active substances.
  • Rheumatoid arthritis affects approximately 1 to 2% of the population. It is a chronic systemic disease in which the joints are progressively destroyed. The causes of the development of rheumatoid arthritis are still unknown. However, it is known that the destruction of the joint (cartilage) is directly related to the uncontrolled growth of pannus tissue. To date, various animal models play an important role in understanding the Pathogenesis of rheumatoid arthritis. These are essentially three groups of animal models (Kaklamanis, PH.M. (1992), Clinical Rheumatology 11, 41-47, No. 1):
  • SCID mice Induction of rheumatoid arthritis by transplantation of pannus-like human synovial tissue into immunodeficient mice.
  • the disadvantage of the first method is that the injection of fibrin into rabbits and guinea pigs induces rheu atoid arthritis which, although histologically similar to that of humans, differs in the serological and systemic parameters.
  • the situation is comparable when methylated bovine serum albumin is injected into the knee joints of C57B1 / 6 mice.
  • the injection of different collagens into mouse and rat strains also leads to rheumatoid arthritis and polyarthritis with a similar phenotype, but the success of the experiment is strongly dependent on the genetic background of the animals and the type of collagen used.
  • the induction of rheumatoid arthritis is reversed gender-specifically as in humans.
  • a disadvantage of the second method is that the injection of pathogenic germs and cell wall products of pathogenic germs in rats, rabbits and mice cause symptoms similar to rheumatoid arthritis, but the systemic distribution of the points of attack differs from human rheumatoid arthritis.
  • pannus-like human synovial tissue a loose and cell-rich connective tissue of the inner layer of the joint capsule, which is a vascular-rich, inflammatory-reactive Connective tissue formation (pannus) under the kidney of immunodeficient mice with and without human cartilage shows that these tissues can survive in part and attack cartilage transplanted with it.
  • the disadvantage of this method is that cells of the immune system that populate the pannus die at an early stage. It sometimes takes over 300 days to perform the analysis.
  • pannus tissue there is an impoverishment of the cellular diversity of the pannus tissue, in particular the ly phoid portion. A dedifferentiation of the pannus tissue in the mouse is also observed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-289288 describes a method for testing anti-rheumatic drugs. According to the registration from LTT Research Laboratories, synovial tissue from patients with chronic rheumatoid arthritis is shredded and then the cells grow out of the shredded tissue in the culture dish. With this procedure, there is a risk that many smaller aggregates or small pieces still present will later become a germ center for the subsequently observed tissue and thus avoid initial steps in the development of pannus tissue in vitro.
  • the object of the present invention is therefore to provide an in vitro model of rheumatoid arthritis which does not have the disadvantages of the animal models described above.
  • the invention therefore relates to a method for producing rheumatic pannus tissue, in which synovial cells from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial cells, are isolated and cultured without changing the cell culture medium until pannus-like villi are formed.
  • the synovial cells can be isolated using a synovial punctate, for example.
  • the cells are preferably contained in the synovial fluid, the synovial fluid, it being particularly advantageous to deplete the lymphocytes also contained therein, for example via a Ficoll gradient.
  • the gradient can be formed in the centrifuge at approximately 2300 revolutions / minute within approximately 10 minutes.
  • the lymphocytes that are in the interphase are discarded or further examined in the diagnostic procedure described later.
  • Granulocytes, macrophages and synovial fibroblasts are mainly found in the sediment of the Ficoll gradient. It is then advantageous to wash the sediment with PBS, for example, an isotonic and phosphate-buffered saline solution.
  • the washed sediment is taken up in cell culture medium and cultivated in cell culture vessels until pannus-like villi are formed.
  • the number of cells at the beginning of the cultivation is preferably approximately 1 x 10 cells / ml.
  • lymphocytes in the synovial fluid fluctuates very strongly, sometimes up to a factor of 100. Accordingly, there are punctures that contain almost no lymphocytes, whereas other punctates have an extraordinarily high number of lymphocytes. The situation is similar with synovial tissue. There the lymphocytes occur at least partially in follicles and therefore it is sometimes difficult to find places with lymphocytes. According to the invention, the lymphocytes are depleted in a very preferred embodiment via a Ficoll gradient. This makes it possible to standardize the tissue obtainable according to the invention. The aspect of standardization is in terms of the number of lymphocytes of considerable importance because the lymphocytes are a source of different cytokines, which may result in differences in the testing of the different substances.
  • synovial cells are also contained in solid synovial tissue. Therefore, these can also be obtained by isolating synovial tissue from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial tissue.
  • the tissue is preferably mechanically disrupted by small cutting and then the isolated synovial tissue is passed through a sieve.
  • Commercially available sieves can be used as sieves for processing fabrics, which generally have a mesh size of approximately 50 mesh. Lymphocytes and cell particles or cell aggregates are preferably separated. Then the mechanically separated synovial tissue is again cultivated without changing the cell culture medium until pannus-like villi are formed.
  • the synovial tissue is essentially not treated with enzymes, in particular proteinases, especially Dispase II (Boehringer Mannheim) and trypsin, because the treatment with enzymes, especially if the tissue is divided at the beginning of the cultivation, prevents the formation of pannus-like villi, although a pure fibroblast culture can be obtained quickly.
  • enzymes in particular proteinases, especially Dispase II (Boehringer Mannheim) and trypsin
  • the cell culture vessels are advantageously made of plastic and the cultivation generally takes place under standard conditions (37 ° C., 5% CO 2 , water-saturated atmosphere) in a commercially available cell culture medium, for example Iscove's Modified Dulbeccos Eagle Medium from Gibco / BRL, Eggenstein. According to the manufacturer, glutanin, periullin and streptomyrin are added to the medium.
  • the Medium also contains approximately 10% FCS (fetal calf serum).
  • FCS fetal calf serum
  • the cultures can be kept alive for several months. For example, cultures could be kept alive for up to five months without undifferentiation.
  • the differentiation processes are carried out after approx. completed four to six weeks, with preliminary stages of comb-like tissue formation already being observed after about two to four weeks.
  • pannus tissues produced according to the invention preferably contain HLA class II positive macrophage-like cells and vimentin-producing fibroblast-like cells, which are generally the main constituent of the rheumatic pannus tissue.
  • HLA class II positive cells can easily be detected, for example, with antibodies directed against MHC II antigens.
  • a commonly available antibody is, for example, an antibody of the hybridoma L243, which is listed in the American Type Culture Collection under the name ATCC HB55.
  • the antibodies are preferably included, for example Marked biotin.
  • streptavidin peroxidase which is coupled to the antibody via the biotin-streptavidin bond, and the peroxidase substrate 9-ethyl-carbazol-3-ylamine, the color changes to red, which is easy to see (see FIG. 1) .
  • rheumatic pannus tissue which was produced by one of the methods described above. It is particularly advantageous here if the rheumatic pannus tissue is made from isolated synovial fluid.
  • pharmacological or immunological reagents can now be tested for their pharmacological, in particular antirheumatic, anti-inflammatory and / or antiproliferative effect.
  • the substances mentioned can also be tested to determine whether they can reduce the tumor-like growth of the pannus tissue.
  • Certain substances that induce biomolecules can also be added in order to subsequently test the influence of the processes described by the substances mentioned.
  • rheumatic pannus tissue for testing substances for a pharmacological, in particular antirheumatic, anti-inflammatory and / or antiproliferative effect and methods for finding pharmacologically active substances.
  • isolated synovial cells from synovial tissue or preferably synovial fluid from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial cells are cultivated without changing the cell culture medium, as described in more detail above, one or more substances are added in therapeutically effective amounts and it is observed whether or not preferably about 4 to 6, especially about 2 to 4 weeks pannus-like Can train villi.
  • the cytostatic methotrexate (4-amino-4-deoxy-10-methylfolic acid), which slows the progression of rheumatoid arthritis in the patient (0.4 ⁇ M / gram body weight), differentiates the pannus-like tissue in the culture described above is prevented even at an approx. 40 x lower dose than applied to the patient.
  • the concentration of methotrexate in the cultures was approximately 0.01 ⁇ M / ml to 1 ⁇ M / ml.
  • one or more substances are added to the rheumatic pannus tissue according to the invention in therapeutically effective amounts.
  • the cultures of the pannus tissue are preferably 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old.
  • the tissue is then cultivated as described in more detail above, and the cultures are examined for whether the substances can slow down, prevent or even reverse the growth of the pannus tissue.
  • the invention therefore also relates to a test kit which contains a sufficient amount of a rheumatic pannus tissue produced according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, in particular cell culture medium.
  • the pannus tissue is preferably 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old.
  • Fig. 1 The cell cultures were grown on a glass slide. The cells were then stained with an antibody that recognizes the .MHC class II antigens. In this case, these antigens are an indicator of macrophages. As can be seen, the round cells, which are macrophages, are MHC II positive.
  • Fig. 2 From this figure you can see that after 3 to 4 weeks the fibroblasts grow to certain places and lines, form crests and pannus-like villi appear on these crests.
  • the villi or bodies are several millimeters in size, which means that they are not quite within the range of the depth of field of the lens and therefore appear as dark bodies.
  • Fig. 5 This figure shows a frozen section which was stained with antibody against the MHCII antigens. The macrophages can be stained and the fibroblasts cannot.
  • the present invention further relates to a method and a diagnostic agent for in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, which is characterized in that the absence or a reduction in the number of CD21 on B cells is detected in synovial fluid.
  • Rheumatoid arthritis affects approximately 1 to 2% of the population. In practice, however, rheumatoid arthritis is very difficult to isolate from other inflammatory diseases of the joints, such as e.g. reactive arthritis or psoriasis. In general, a number of criteria are used, which are more or less subjective and, together, do not provide any clear indication of the particular form of the disease (see, for example, Arnett FC et al. (1988) "Arthritis and Rheumatism", vol. 31, 315-324, No. 3, or Seitz M. (1995), "Rheumatoid Arthritis” in Clinical Immunology (Peter, HH ed.), 327-337, Chapter 23), Urban and Schwarzenberg Verlag Kunststoff - Vienna - Baltimore). In detail, these are the following criteria:
  • a further object of the present invention is therefore to provide an in vitro diagnostic method which has a higher sensitivity and specificity than known methods.
  • CD21 which is also referred to as complement receptor 2
  • complement receptor 2 is the receptor for the complement component of the immune complexes (Fearon, D.T. & Carter, R.H. (1995), Annu. Rev. Immuno1. 13, 127-149).
  • the immune complexes which consist of complement and antibody to which the antigen is bound, have a regulating effect on the B cells.
  • CD21 is essential for the functioning of the immune system. For example, genetically engineered soluble CD21 inhibits the T cell-dependent immune response in mice. CD21 is pronounced on mature B cells and is switched off when differentiated from the plasma cell.
  • CD21 is the receptor for that
  • Epstein-Barr virus a receptor for HIV and it binds ⁇ -interferon.
  • CD21 is found on the synovial B cells of non-rheumatoid arthritis diseases.
  • the B cells of the peripheral blood of the examined patients and of healthy volunteers carried CD21 on their surface, which means that the patients with rheumatoid Arthritis is not a genetic defect, but that the lack of CD21 on the surface of synovial B cells is causally related to rheumatoid arthritis. It was also found that when different monoclonal antibodies against different epitopes of CD21 were used, the same reactivities were found, which means that CD21 is not blocked by a ligand.
  • the present invention therefore relates to a method for the in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, which contains the following steps carried out in succession:
  • the mononuclear cells which are mononuclear immune cells, before the detection reaction to B-cell-specific CD21, in particular via a Ficoll gradient or by sorting on, for example, CD19 + cells in the flow cytometer, especially by magnetic sorting using magnetic antibodies against z. B. CD19 or a combination of these methods.
  • the mononuclear cells are in the interphase of the gradient.
  • the enriched mononuclear cells are no longer used, but they are used in the present embodiment. The two methods can therefore advantageously be combined with one another.
  • the number of enriched mononuclear cells from punctate is in a range from 10 ⁇ to 10 7 cells.
  • the B cells When enriched in the flow cytometer, the B cells can be brought to a very high level of purity, which greatly facilitates the evaluation.
  • a magnetic one is preferred Sorting system in which antibodies against CD19 are coupled with tiny magnetic particles, since this method is very fast and provides a sufficiently high level of B cell purity. Due to the binding of the agnetized antibodies to CD19 on B cells, these can easily be enriched in the punctate, for example within about 30 minutes to over 50% purity, starting from approximately 1% B cells. Magnetic sorting also enables B cells from 10 9 or more cells to be enriched several times.
  • the CD21 is detected with monoclonal antibodies, which are preferably labeled, for example fluorescently labeled.
  • monoclonal antibodies which are preferably labeled, for example fluorescently labeled.
  • suitable fluorescence-labeled antibodies are the fluorescein-labeled anti-CD21 antibodies manufactured by Halan Sera-Lab Ltd., England.
  • fluorescent dyes are phycoerythrin or rhodamine.
  • the labeling of the cells is preferably carried out in a buffer solution, for example PBS in the presence of approx. 5-10% foreign protein such as e.g. B. fetal calf serum (FCS), and azide, a respiratory chain inhibitor, in a concentration of preferably about 0.01%.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are still alive, but they have lost the ability to remove surface molecules such as e.g. B. internalize the CD21 so that the results cannot be falsified.
  • the cells are preferably washed with the same buffer and then analyzed.
  • Examples of suitable analysis methods are analysis in the flow cytometer or under the fluorescence microscope or the ELISA test.
  • the detection of fluorescence-labeled B cells is preferably carried out in a flow cytometer or under a fluorescence microscope. In the flow cytometer, for example, more than 1000 cells per second can be analyzed with high resolution, the entire procedure generally only taking about one hour.
  • B cells that do not carry CD21 it is also advantageous to detect the B cells, for example, via other B cell-specific antigens, such as CD19 or CD20. It is particularly preferred here if the labeling of CD21 is different from the labeling of CD19 and / or CD20.
  • the different molecules can be detected simultaneously by, for example, different fluorescent labels, preferably fluorescein in combination with phycoerythrin.
  • the detection of the B cells via CD19 and / or CD20 also serves in particular as a control for successful labeling of the B cells.
  • Another object of the invention is the use of antibodies, in particular monoclonal antibodies, against CD21 for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of rheumatoid arthritis.
  • the diagnostic agent preferably contains not only anti-CD21 antibodies, but also antibodies against other B cell-specific antigens, such as CD19 and / or CD20.
  • Another object of the invention is therefore also a diagnostic agent containing antibodies against CD21 and antibodies against other B cell-specific antigens, preferably against CD19 and / or CD20.
  • the antibodies are preferably monoclonal antibodies, which are in particular labeled, preferably fluorescence-labeled.
  • a diagnostic agent according to the invention essentially comprises labeled antibodies and optionally additives or auxiliaries known to the person skilled in the art. If the diagnostic agent is, for example, an immunofluorescence test kit, fluorescent dyes, for example fluorescein, are bound or conjugated to the antibodies. This diagnostic is particularly suitable for the analysis of B cell-specific antigens in a flow cytometer or under a fluorescence microscope. If the diagnostic agent is, for example, a radioimmuno test kit, the antibodies are labeled with radioactive isotopes.
  • the B-cell-specific antigens can be detected with high sensitivity via the radioactive labeling of the antibodies.
  • the diagnostic can also be an enzyme immunoassay kit (ELISA), in which the antibodies are coupled with an enzyme, for example with the alkaline phosphatase. In the presence of 4-nitrophenyl phosphate as a possible substrate, the antibody-bound enzyme produces a yellow color.
  • ELISA enzyme immunoassay kit
  • the antibody-bound B cell-specific antigens can be easily detected in the spectrophotometer using the color marking.
  • Step 1 shows the puncturing and taking of the respective sample.
  • Step 2 represents the enrichment of the mononuclear cells via a Ficoll gradient.
  • SFL means synovial fluid lymphocytes and PBL peripheral blood lymphocytes.
  • Step 3 shows the staining of the B cells with specific antibodies directed against CD21. The thick circles correspond to the B cells, the thin circles to other cells and the filled circles of the B cells stained by anti-CD21 antibodies.
  • the following graphic shows so-called contour plots, whereby the B cells have been stained differently by fluorochro e both with antibodies against CD21 and against CD19.
  • the antibodies against CD21 carried fluorescein (FL) and the antibodies against CD19 carried phycoerythrin (PE) as fluorescent dyes.
  • the fluorescence activated cell sorter FACScan
  • Around 10,000 measured cells are recorded in these contour plots, the lines corresponding to the contour lines of a topographical map corresponding to the number of individual points.
  • the right diagram shows such B cells which have been labeled with anti-CD21 antibody, the signal shifting from the left to the right lower quadrant.
  • Synovial punctate and blood were taken from a patient and applied separately to Ficoll pads. The mixture was then centrifuged at 2,300 rpm for 10 minutes at room temperature and then the rotor was allowed to run down without a brake. The mononuclear cells that were in the interphase were removed and the B cells were further enriched using a magnetic sorting system. Anti-CD19 antibodies were used for this purpose, to which tiny magnetic particles are coupled. The degree of enrichment was approximately 50% starting from approximately 1% B cells in the punctate. Then 1-3 x 10 5 cells were collected in 96-well microtiter plates by centrifugation.
  • the cells were on ice and in the dark with titrated fluorescein-labeled anti-CD21 antibody (VTF-598, Halan Sera-Lab Ltd. England) and with Phycoerythrin labeled anti-CD19 antibody (Dako-CD19, Dako, Denmark) for 20 minutes in PBS (8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na HP04, 0.24g KH 2 P0 4 , pH 7.4 with HC1 adjusted and made up to 11 with distilled water) + 2% FCS with 0.01% sodium azide. The cells were then washed with the same buffer, resuspended and analyzed in the FACScan (Becton Dickinson) or under the fluorescence microscope.
  • FACScan Becton Dickinson
  • B cells from the synovial punctate cannot be stained with anti-CD21 antibodies.
  • the B cells from the blood can be stained with anti-CD21 antibodies.
  • Other cell types showed no staining with anti-CD21 antibody in the blood and synovial punctate samples examined.

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Abstract

The invention concerns rheumatic pannus tissue which forms pannus-type villi and preferably contains class II HLA positive macrophage-type cells and vimentin-producing fibroblast-type cells. The invention also concerns a process for preparing rheumatic pannus tissue, and the use of rheumatic pannus tissue for discovering pharmacologically effective substances. The invention further concerns a method and diagnostic procedure for the in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, which method is characterized in that the absence of or reduction in the number of CD21 on B-cells in the synovial fluid is detected.

Description

Künstliches rheumatisches Pannusgewebe und diagnostisches Verfahren zum Nachweis der rheumatischen Arthritis Artificial rheumatic pannus tissue and diagnostic procedure for the detection of rheumatic arthritis
Die vorliegende Erfindung betrifft rheumatisches Pannusgewebe, das pannusahnliche Villi ausbildet und vorzugsweise HLA Klasse II positive akrophagenartige Zellen und Vimentin- produzierende fibroblastenartige Zellen enthält, ein Verfahren zur Herstellung des rheumatischen Pannusgewebes und die Verwendung des rheumatischen Pannusgewebes zum Auffinden pharmakologisch wirksamer Substanzen.The present invention relates to rheumatic pannus tissue which forms pannus-like villi and preferably contains HLA class II positive acrophage-like cells and vimentin-producing fibroblast-like cells, a method for producing the rheumatic pannus tissue and the use of the rheumatic pannus tissue to find pharmacologically active substances.
Die rheumatoide Arthritis betrifft ca. 1 bis 2 % der Bevölkerung. Sie ist eine chronisch systemische Krankheit, bei der die Gelenke progressiv zerstört werden. Die Ursachen für die Entwicklung einer rheumatoiden Arthritis sind nach wie vor unbekannt. Jedoch weiß man, daß die Zerstörung des Gelenks (Knorpels) mit dem unkontrollierten Wachstum von Pannusgewebe direkt zusammenhängt. Bis heute spielen verschiedene Tiermodelle eine wichtige Rolle bei dem Verständnis der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis. Hierbei handelt es sich im wesenlichen um drei Gruppen von Tiermodellen (Kaklamanis, PH.M. (1992), Clinical Rheumatology 11, 41-47, No . 1):Rheumatoid arthritis affects approximately 1 to 2% of the population. It is a chronic systemic disease in which the joints are progressively destroyed. The causes of the development of rheumatoid arthritis are still unknown. However, it is known that the destruction of the joint (cartilage) is directly related to the uncontrolled growth of pannus tissue. To date, various animal models play an important role in understanding the Pathogenesis of rheumatoid arthritis. These are essentially three groups of animal models (Kaklamanis, PH.M. (1992), Clinical Rheumatology 11, 41-47, No. 1):
1. Induzierung der rheumatoiden Arthritis durch Immunisierung mit Proteinen,1. induction of rheumatoid arthritis by immunization with proteins,
2. Induzierung der rheumatoiden Arthritis durch pathogene Keime und2. Induction of rheumatoid arthritis by pathogenic germs and
3. Induzierung der rheumatoiden Arthritis durch Transplantation von pannusartigem humanem Synovialgewebe in immundefiziente Mäuse (sogenannte SCID Mäuse).3. Induction of rheumatoid arthritis by transplantation of pannus-like human synovial tissue into immunodeficient mice (so-called SCID mice).
Nachteil der ersten Methode ist, daß die Injektion von Fibrin in Kaninchen und Meerschweinchen eine rheu atoide Arthritis induziert, die zwar histologisch der des Menschen ähnelt, aber sich in den serologischen und systemischen Parametern unterscheidet. Vergleichbar verhält es sich bei der Injektion von methyliertem bovinem Serumalbumin in die Kniegelenke von C57B1/6 Mäusen. Die Injektion von verschiedenen Collagenen in Mäuse- und Rattenstämme führt zwar auch zu einer rheumatoiden Arthritis und Polyarthritis mit ähnlichem Phänotyp, aber der Erfolg des Experiments ist vom genetischen Hintergrund der Tiere und der Art des eingesetzten Collagens stark abhängig. Insbesondere ist die Induktion der rheumatoiden Arthritis geschlechtsspezifisch umgekehrt wie beim Menschen.The disadvantage of the first method is that the injection of fibrin into rabbits and guinea pigs induces rheu atoid arthritis which, although histologically similar to that of humans, differs in the serological and systemic parameters. The situation is comparable when methylated bovine serum albumin is injected into the knee joints of C57B1 / 6 mice. The injection of different collagens into mouse and rat strains also leads to rheumatoid arthritis and polyarthritis with a similar phenotype, but the success of the experiment is strongly dependent on the genetic background of the animals and the type of collagen used. In particular, the induction of rheumatoid arthritis is reversed gender-specifically as in humans.
Nachteil der zweiten Methode ist, daß die Injektion pathogener Keime und Zellwandprodukte von pathogenen Keimen in Ratten, Kaninchen und Mäusen zwar rheumatoid Arthritis-ähnliche Symptome hervorrufen, jedoch die systemische Verteilung der Angriffspunkte sich von der humanen rheumatoiden Arthritis unterscheiden .A disadvantage of the second method is that the injection of pathogenic germs and cell wall products of pathogenic germs in rats, rabbits and mice cause symptoms similar to rheumatoid arthritis, but the systemic distribution of the points of attack differs from human rheumatoid arthritis.
Die Transplantation von pannusartigem humanem Synovialgewebe, einem lockeren und zellreichen Bindegewebe der Innenschicht der Gelenkkapsel, welches eine gefäßreiche, entzündlich-reaktive Bindegewebsbildung (Pannus) aufweist, unter die Niere von immundefizienten Mäusen mit und ohne humanem Knorpel zeigt, daß diese Gewebe zum Teil überleben und ittransplantierten Knorpel angreifen können. Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß Zellen des Immunsystems, die den Pannus bevölkern, schon in frühem Stadium absterben. Man benötigt daher zum Teil über 300 Tage, um die Analyse durchzuführen. Zudem findet eine Verarmung der zellulären Vielfalt des Pannusgewebes statt, insbesondere des ly phoiden Anteils . Ebenso wird eine Entdifferenzierung des Pannusgewebes in der Maus beobachtet.The transplantation of pannus-like human synovial tissue, a loose and cell-rich connective tissue of the inner layer of the joint capsule, which is a vascular-rich, inflammatory-reactive Connective tissue formation (pannus) under the kidney of immunodeficient mice with and without human cartilage shows that these tissues can survive in part and attack cartilage transplanted with it. The disadvantage of this method, however, is that cells of the immune system that populate the pannus die at an early stage. It sometimes takes over 300 days to perform the analysis. In addition, there is an impoverishment of the cellular diversity of the pannus tissue, in particular the ly phoid portion. A dedifferentiation of the pannus tissue in the mouse is also observed.
Allen drei Modellen ist gemeinsam, daß sie die humane rheumatoide Arthritis nicht exakt wiederspiegeln. Auch benötigen die einzelnen Methoden meist 3 bis 10 Monate bis zur Auswertung. Ferner verursacht die Haltung von Tieren große Kosten, die Resultate variieren und man benötigt entsprechend große Versuchsansätze. Ebenso werden die klinischen und systemischen Eigenschaften der humanen rheumatoiden Arthritis nicht ausreichend wiedergegeben, um auf die heuman rheumatoide Arthritis direkte Rückschlüsse ziehen zu können.All three models have in common that they do not exactly reflect human rheumatoid arthritis. The individual methods also usually take 3 to 10 months to evaluate. Furthermore, keeping animals causes great costs, the results vary, and large experimental approaches are required. Likewise, the clinical and systemic properties of human rheumatoid arthritis are not sufficiently reproduced in order to draw direct conclusions about heuman rheumatoid arthritis.
In der japanischen Of fenlegungsschrift 07-289288 wird ein Verfahren zur Testung von antirheumatisch wirksamen Arzneimitteln beschrieben. Gemäß der Anmeldung von LTT Research Laboratories wird Synovialgewebe von Patienten mit chronischer rheumatoider Arthritis zerkleinert und anschließend wachsen die Zellen aus dem zerkleinerten Gewebe in der Kulturschale aus. Bei dieser Vorgehensweise besteht die Gefahr, daß später viele kleinere Aggregate bzw. noch vorhandene kleine Stücke zu einem Keimzentrum für das anschließend beobachtete Gewebe werden und damit initiale Schritte bei der Entstehung von Pannusgewebe in vitro umgangen werden.Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-289288 describes a method for testing anti-rheumatic drugs. According to the registration from LTT Research Laboratories, synovial tissue from patients with chronic rheumatoid arthritis is shredded and then the cells grow out of the shredded tissue in the culture dish. With this procedure, there is a risk that many smaller aggregates or small pieces still present will later become a germ center for the subsequently observed tissue and thus avoid initial steps in the development of pannus tissue in vitro.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein in-vitro- Modell der rheumatoiden Arthritis bereitzustellen, das die Nachteile der oben geschilderten Tiermodelle nicht besitzt. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von rheumatischem Pannusgewebe, bei dem Synovialzellen aus Säugetieren mit rheumatoider Arthritis, insbesondere menschliche Synovialzellen, isoliert und ohne Wechsel des Zellkulturmediums bis zur Ausbildung pannusähnlicher Villi kultiviert werden. Die Synovialzellen können beispielsweise mittels eines Synovialpunktats isoliert werden. Vorzugsweise sind die Zellen in der Synovialflüssigkeit , der Gelenkschmiere, enthalten, wobei es besonders vorteilhaft ist, die ebenso darin enthaltenen Ly phozyten beispielsweise über einen Ficollgradienten abzureichern. Der Gradient kann beispielsweise bei ca. 2300 Umdrehungen/Minute innerhalb von ca. 10 Minuten in der Zentrifuge gebildet werden. Die Lymphozyten, die sich in der Interphase befinden, werden verworfen oder bei dem später beschriebenen diagnostischen Verfahren weiter untersucht. Im Sediment des Ficollgradienten befinden sich im wesentlichen Granulozyten, Makrophagen und synoviale Fibroblasten. Anschließend ist es vorteilhaft, das Sediment beispielsweise mit PBS, einer isotonischen und phosphatgepufferten Salzlösung, zu waschen. Das gewaschene Sediment wird in Zellkulturmedium aufgenommen und in Zellkulturgefäßen bis zur Ausbildung pannusähnlicher Villi kultiviert. Die Zellzahl am Anfang der Kultivierung beträgt vorzugsweise ca. 1 x 10 Zellen/ml.The object of the present invention is therefore to provide an in vitro model of rheumatoid arthritis which does not have the disadvantages of the animal models described above. The invention therefore relates to a method for producing rheumatic pannus tissue, in which synovial cells from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial cells, are isolated and cultured without changing the cell culture medium until pannus-like villi are formed. The synovial cells can be isolated using a synovial punctate, for example. The cells are preferably contained in the synovial fluid, the synovial fluid, it being particularly advantageous to deplete the lymphocytes also contained therein, for example via a Ficoll gradient. For example, the gradient can be formed in the centrifuge at approximately 2300 revolutions / minute within approximately 10 minutes. The lymphocytes that are in the interphase are discarded or further examined in the diagnostic procedure described later. Granulocytes, macrophages and synovial fibroblasts are mainly found in the sediment of the Ficoll gradient. It is then advantageous to wash the sediment with PBS, for example, an isotonic and phosphate-buffered saline solution. The washed sediment is taken up in cell culture medium and cultivated in cell culture vessels until pannus-like villi are formed. The number of cells at the beginning of the cultivation is preferably approximately 1 x 10 cells / ml.
In der Synovialflüssigkeit schwankt der Anteil der Lymphozyten sehr stark, teilweise bis um den Faktor 100. Demzufolge gibt es Punktate, die fast keine Lymphozyten enthalten, wohingegen andere Punktate eine außerordentlich hohe Lymphozytenzahl aufweisen. Mit dem Synovialgewebe verhält es sich ähnlich. Dort kommen die Lymphozyten zumindest teilweise in Follikeln vor und daher ist es manchmal schwierig, Stellen mit Lymphozyten zu finden. Erfindungsgemäß werden die Lymphozyten in ganz bevorzugter Ausführungsform über einen Ficollgradienten abgereichert . Dadurch ist es möglich, das erfindungsgemäß erhältliche Gewebe zu standardisieren. Der Aspekt der Standardisierung ist im Hinblick auf die Anzahl der Lymphozyten von erheblicher Bedeutung, weil die Lymphozyten eine Quelle von verschiedenen Zytokinen sind, durch die sich Unterschiede bei der Testung der verschiedenen Substanzen ergeben können.The proportion of lymphocytes in the synovial fluid fluctuates very strongly, sometimes up to a factor of 100. Accordingly, there are punctures that contain almost no lymphocytes, whereas other punctates have an extraordinarily high number of lymphocytes. The situation is similar with synovial tissue. There the lymphocytes occur at least partially in follicles and therefore it is sometimes difficult to find places with lymphocytes. According to the invention, the lymphocytes are depleted in a very preferred embodiment via a Ficoll gradient. This makes it possible to standardize the tissue obtainable according to the invention. The aspect of standardization is in terms of the number of lymphocytes of considerable importance because the lymphocytes are a source of different cytokines, which may result in differences in the testing of the different substances.
Die Synovialzellen sind jedoch auch in festem Synovialgewebe enthalten. Daher können diese auch dadurch gewonnen werden, daß Synovialgewebe aus Säugetieren mit rheumatoider Arthritis, insbesondere menschliches Synovialgewebe, isoliert wird. Vorzugsweise wird das Gewebe mechanisch durch Kleinschneiden aufgeschlossen und danach wird das isolierte Synovialgewebe durch ein Sieb passiert. Als Siebe können handelsübliche Siebe zur Aufarbeitung von Geweben verwendet werden, die im allgemeinen eine Maschengröße von ca. 50 mesh besitzen. Bevorzugt werden nun Lymphozyten sowie Zellpartikel oder Zellaggregate abgetrennt. Anschließend wird das mechanisch separierte Synovialgewebe wiederum ohne Wechsel des Zellkulturmediums bis zur Ausbildung pannusähnlicher Villi kultiviert .However, the synovial cells are also contained in solid synovial tissue. Therefore, these can also be obtained by isolating synovial tissue from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial tissue. The tissue is preferably mechanically disrupted by small cutting and then the isolated synovial tissue is passed through a sieve. Commercially available sieves can be used as sieves for processing fabrics, which generally have a mesh size of approximately 50 mesh. Lymphocytes and cell particles or cell aggregates are preferably separated. Then the mechanically separated synovial tissue is again cultivated without changing the cell culture medium until pannus-like villi are formed.
Wesentlich bei diesem Verfahren ist es, daß das Synovialgewebe im wesentlichen nicht mit Enzymen, insbesondere Proteinasen, vor allem Dispase II (Boehringer Mannheim) und Trypsin, behandelt wird, denn die Behandlung mit Enzymen, insbesondere wenn das Gewebe am Anfang der Kultivierung geteilt wird, verhindert die Ausbildung pannusähnlicher Villi, obwohl schnell eine reine Fibroblastenkultur erhalten werden kann. Eine sanfte Behandlung mit Enzymen, d.h. eine Behandlung mit einer geringeren Konzentration und/oder mit kürzeren Inkubationszeiten als allgemein üblich, dürfte jedoch die Ausbildung pannusähnlicher Villi nicht verhindern.It is essential in this process that the synovial tissue is essentially not treated with enzymes, in particular proteinases, especially Dispase II (Boehringer Mannheim) and trypsin, because the treatment with enzymes, especially if the tissue is divided at the beginning of the cultivation, prevents the formation of pannus-like villi, although a pure fibroblast culture can be obtained quickly. Gentle treatment with enzymes, i.e. treatment with a lower concentration and / or with shorter incubation times than usual is not likely to prevent the formation of pannus-like villi.
Die Zellkulturgefäße sind vorteilhafterweise aus Plastik und die Kultivierung findet im allgemeinen unter Standardbedingungen (37°C, 5 % C02, wassergesättigte Atmosphäre) in einem handelsüblichen Zellkulturmedium, z.B. Iscove's Modified Dulbeccos Eagle Medium der Fa. Gibco/BRL, Eggenstein statt. Dem Medium wird nach den Angaben des Herstellers Glutanin, Periullin und Streptomyrin zugegeben. Das Medium enthält auch ca. 10 % FCS (fötales Kälberserum). Bei der Kultivierung ist es wesentlich, daß das Zellkulturmedium bis zur Ausbildung pannusahnliche Zotten, sogenannter Villi, vorzugsweise in den ersten zwei bis drei Wochen nicht gewechselt wird. Nach zwei bis drei Wochen kann man bereits ein geordnetes und paralleles Wachstum und danach ein gerichtetes Wachstum der synovialen Fibroblasten beobachten. Dabei entstehen an den Orten, an denen sich die Fibroblasten treffen, Kämme, auf denen sich dann die pannusähnlichen Villi ausbilden. Ein weiteres spezifisches Merkmal ist, daß sich auf einer Seite des Kammes eine Fläche befindet, die frei von Zellen ist, während die andere Seite weiterhin konfluent ist.The cell culture vessels are advantageously made of plastic and the cultivation generally takes place under standard conditions (37 ° C., 5% CO 2 , water-saturated atmosphere) in a commercially available cell culture medium, for example Iscove's Modified Dulbeccos Eagle Medium from Gibco / BRL, Eggenstein. According to the manufacturer, glutanin, periullin and streptomyrin are added to the medium. The Medium also contains approximately 10% FCS (fetal calf serum). In the cultivation, it is essential that the cell culture medium is not changed until the formation of villus-like villi, so-called villi, preferably in the first two to three weeks. After two to three weeks you can already see an orderly and parallel growth and then a directional growth of the synovial fibroblasts. This creates combs at the places where the fibroblasts meet, on which the pannus-like villi form. Another specific feature is that there is an area free of cells on one side of the comb, while the other side is still confluent.
Erst wenn sich erste Anzeichen von einem möglichen Zelltod, z.B. durch einen nicht perfekten Phasenkontrast der Fibroblasten und der darauf adhärierenden Makrophagen unter dem Mikroskop, ergeben, wird neues Medium dazugegeben, ohne das alte Medium zu verwerfen. Auf diese Art lassen sich die Kulturen über mehrere Monate am Leben erhalten. Beispielsweise konnten auf diese Weise die Kulturen bis zu fünf Monate am Leben erhalten bleiben, ohne zu Entdifferenzieren. Im allgemeinen sind die Differenzierungsvorgänge nach ca . vier bis sechs Wochen abgeschlossen, wobei bereits nach ca. zwei bis vier Wochen Vorstufen der kammartigen Gewebebildung beobachtet wurden .Only when the first signs of possible cell death, e.g. due to an imperfect phase contrast of the fibroblasts and the macrophages adhering to them under the microscope, new medium is added without discarding the old medium. In this way, the cultures can be kept alive for several months. For example, cultures could be kept alive for up to five months without undifferentiation. In general, the differentiation processes are carried out after approx. completed four to six weeks, with preliminary stages of comb-like tissue formation already being observed after about two to four weeks.
Die erfindungsgemäß hergestellten Pannusgewebe enthalten vorzugsweise HLA Klasse II positive makrophagenartige Zellen und Vimentin-produzierende fibroblastenartige Zellen, welche im allgemeinen Hauptbestandteil des rheumatischen Pannusgewebes sind.The pannus tissues produced according to the invention preferably contain HLA class II positive macrophage-like cells and vimentin-producing fibroblast-like cells, which are generally the main constituent of the rheumatic pannus tissue.
HLA Klasse II positive Zellen lassen sich leicht beispielsweise mit gegen MHC II Antigene gerichtete Antikörper nachweisen. Ein allgemein erhältlicher Antikörper ist beispielsweise ein Antikörper des Hybridoms L243, welches bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC HB55 geführt wird. Vorzugsweise sind die Antikörper beispielsweise mit Biotin markiert. In Anwesenheit von Streptavidin-Peroxidase, welche über die Biotin-Streptavidin Bindung an den Antikörper gekoppelt wird, und dem Peroxidase-Substrat 9-Ethyl-Carbazol-3- ylamin erfolgt ein Farbumschlag nach rot, der leicht zu erkennen ist (siehe Figur 1).HLA class II positive cells can easily be detected, for example, with antibodies directed against MHC II antigens. A commonly available antibody is, for example, an antibody of the hybridoma L243, which is listed in the American Type Culture Collection under the name ATCC HB55. The antibodies are preferably included, for example Marked biotin. In the presence of streptavidin peroxidase, which is coupled to the antibody via the biotin-streptavidin bond, and the peroxidase substrate 9-ethyl-carbazol-3-ylamine, the color changes to red, which is easy to see (see FIG. 1) .
Ein weiterer Gegenstand sind daher auch rheumatisches Pannusgewebe, das nach einem der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn das rheumatische Pannusgewebe aus isolierter Synovialflüssigkeit hergestellt wird.Another subject is therefore also rheumatic pannus tissue, which was produced by one of the methods described above. It is particularly advantageous here if the rheumatic pannus tissue is made from isolated synovial fluid.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen rheumatischen Pannusgewebes können nun phar akologische oder immunologische Reagenzien auf deren pharmakologische, insbesondere antirheumatische, antiinflam atorische und/oder antiproliferative Wirkung getestet werden. Die genannten Substanzen können auch dahingehend getestet werden, ob sie das tumorartige Wachstum des Pannusgewebes zurückführen können. Es können auch bestimmte Substanzen, die Biomoleküle induzieren, zugegeben werden, um anschließend die Beeinflussung der beschriebenen Prozesse durch die genannten Substanzen zu testen.With the help of the rheumatic pannus tissue according to the invention, pharmacological or immunological reagents can now be tested for their pharmacological, in particular antirheumatic, anti-inflammatory and / or antiproliferative effect. The substances mentioned can also be tested to determine whether they can reduce the tumor-like growth of the pannus tissue. Certain substances that induce biomolecules can also be added in order to subsequently test the influence of the processes described by the substances mentioned.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind daher die Verwendung des erfindungsgemäßen rheumatischen Pannusgewebes zum Testen von Substanzen auf eine pharmakologische, insbesondere antirheumatische, antiinflammatorische und/oder antiproliferative Wirkung und Verfahren zum Auffinden pharmakologisch wirksamer Substanzen.Further subjects of the present invention are therefore the use of the rheumatic pannus tissue according to the invention for testing substances for a pharmacological, in particular antirheumatic, anti-inflammatory and / or antiproliferative effect and methods for finding pharmacologically active substances.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren werden isolierte Synovialzellen aus Synovialgewebe oder vorzugsweise Synovialflüssigkeit aus Säugetieren mit rheumatoider Arthritis, insbesondere menschliche Synovialzellen, ohne Wechsel des Zellkulturmediums wie oben näher beschrieben kultiviert, werden eine oder mehrere Substanzen in therapeutisch wirksamen Mengen hinzugegeben und es wird beobachtet, ob sich nach vorzugsweise ca. 4 bis 6, insbesondere ca. 2 bis 4 Wochen pannusahnliche Villi ausbilden können. Auf diese Weise wurde beispielsweise gefunden, daß das Cytostatikum Methotrexat ( 4-Amino-4-desoxy- 10-methylfolsäure) , welches das Fortschreiten der rheumatoiden Arthritis beim Patienten (0,4 μM/Gramm Körpergewicht) verlangsamt, die Differenzierung des pannusartigen Gewebes in der oben beschriebenen Kultur bereits bei einer ca. 40 x geringeren Dosis als beim Patienten angewandt verhindert. Die Konzentration von Methotrexat in den Kulturen lag bei ca. 0,01 μM/ml bis 1 μM/ml.In a method according to the invention, isolated synovial cells from synovial tissue or preferably synovial fluid from mammals with rheumatoid arthritis, in particular human synovial cells, are cultivated without changing the cell culture medium, as described in more detail above, one or more substances are added in therapeutically effective amounts and it is observed whether or not preferably about 4 to 6, especially about 2 to 4 weeks pannus-like Can train villi. In this way it was found, for example, that the cytostatic methotrexate (4-amino-4-deoxy-10-methylfolic acid), which slows the progression of rheumatoid arthritis in the patient (0.4 μM / gram body weight), differentiates the pannus-like tissue in the culture described above is prevented even at an approx. 40 x lower dose than applied to the patient. The concentration of methotrexate in the cultures was approximately 0.01 μM / ml to 1 μM / ml.
Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren werden ein oder mehrere Substanzen zu dem erfindungsgemäßen rheumatischen Pannusgewebe in therapeutisch wirksamen Mengen hinzugegeben. Die Kulturen des Pannusgewebes sind vorzugsweise 2 bis 4 Wochen, insbesondere 4 bis 6 Wochen, vor allem mehr als 6 Wochen alt. Anschließend wird das Gewebe wie oben näher beschrieben kultiviert und die Kulturen werden daraufhin untersucht, ob die Substanzen das Wachstum des Pannusgewebes verlangsamen, verhindern oder sogar rückgängig machen können.In another method according to the invention, one or more substances are added to the rheumatic pannus tissue according to the invention in therapeutically effective amounts. The cultures of the pannus tissue are preferably 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old. The tissue is then cultivated as described in more detail above, and the cultures are examined for whether the substances can slow down, prevent or even reverse the growth of the pannus tissue.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Testkit, der ein erfindungsgemäß hergestelltes rheumatisches Pannusgewebe und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, insbesondere Zellkulturmedium in ausreichender Menge enthält. Das Pannusgewebe ist vorzugsweise 2 bis 4 Wochen, insbesondere 4 bis 6 Wochen, vor allem mehr als 6 Wochen alt. The invention therefore also relates to a test kit which contains a sufficient amount of a rheumatic pannus tissue produced according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, in particular cell culture medium. The pannus tissue is preferably 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old.
Beschreibung der FigurenDescription of the figures
Fig. 1: Die Zellkulturen wurden auf einem Glasobjektträger wachsengelassen. Anschließend wurden die Zellen mit einem Antikörper, der die Antigene der .MHC Klasse II erkennt, gefärbt. Diese Antigene sind in diesem Fall ein Indikator für Makrophagen. Wie man erkennt, sind die runden Zellen, die Makrophagen sind, MHC II-positiv.Fig. 1: The cell cultures were grown on a glass slide. The cells were then stained with an antibody that recognizes the .MHC class II antigens. In this case, these antigens are an indicator of macrophages. As can be seen, the round cells, which are macrophages, are MHC II positive.
Fig. 2: Anhand dieser Figur erkennt man, daß nach 3 bis 4 Wochen die Fibroblasten auf bestimmte Stellen und Linien zuwachsen, Kämme bilden und pannusahnliche Villi auf diesen Kämmen entstehen. Die Villi oder Körperchen sind mehrere Millimeter groß, wodurch sie nicht ganz innerhalb des Bereichs der Schärfentiefe des Objektivs sind und daher als dunkle Körper erscheinen.Fig. 2: From this figure you can see that after 3 to 4 weeks the fibroblasts grow to certain places and lines, form crests and pannus-like villi appear on these crests. The villi or bodies are several millimeters in size, which means that they are not quite within the range of the depth of field of the lens and therefore appear as dark bodies.
Fig. 3 und 4: Diese Figuren zeigen Gefrierschnitte durch die Villi. Die Schnitte werden mit Giemsa gefärbt. Man erkennt deutlich, daß die Villi eine zelluläre Struktur besitzen und daß sich in den äußeren Schichten die Zellen eher "lagig" anordnen, ganz analog den Villi in rheumatischen Gelenken.3 and 4: These figures show frozen sections through the villi. The cuts are dyed with Giemsa. It can be clearly seen that the villi have a cellular structure and that the cells in the outer layers are arranged in a more "layered" manner, just like the villi in rheumatic joints.
Fig. 5: Diese Figur zeigt einen Gefrierschnitt, der mit Antikörper gegen die MHCII Antigene gefärbt wurde. Dabei lassen sich die Makrophagen färben und die Fibroblasten nicht. Fig. 5: This figure shows a frozen section which was stained with antibody against the MHCII antigens. The macrophages can be stained and the fibroblasts cannot.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren und ein Diagnostikum zur in vitro Diagnose von rheumatoider Arthritis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Abwesenheit oder eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen in synovialer Flüssigkeit nachgewiesen wird.The present invention further relates to a method and a diagnostic agent for in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, which is characterized in that the absence or a reduction in the number of CD21 on B cells is detected in synovial fluid.
Die rheumatoide Arthritis betrifft circa 1 bis 2 % der Bevölkerung. In der Praxis ist es jedoch sehr schwer, die rheumatoide Arthritis von anderen entzündlichen Erkrankungen der Gelenke, wie z.B. der reaktiven Arthritis oder der Psoriasis, zu unterscheiden. Im allgemeinen werden eine Reihe von Kriterien herangezogen, die mehr oder weniger subjektiv sind und auch zusammen keinen eindeutigen Hinweis auf die jeweilige Form der Krankheit geben (siehe hierzu z.B. Arnett F.C. et al. (1988) "Arthritis and Rheumatism" , Vol. 31, 315- 324, No. 3, oder Seitz M. (1995), "Rheumatoide Arthritis" in Klinische Immunologie (Peter, H.H. ed.), 327-337, Kapitel 23), Urban und Schwarzenberg Verlag München - Wien - Baltimore) . Im einzelnen handelt es sich hierbei um folgende Kriterien:Rheumatoid arthritis affects approximately 1 to 2% of the population. In practice, however, rheumatoid arthritis is very difficult to isolate from other inflammatory diseases of the joints, such as e.g. reactive arthritis or psoriasis. In general, a number of criteria are used, which are more or less subjective and, together, do not provide any clear indication of the particular form of the disease (see, for example, Arnett FC et al. (1988) "Arthritis and Rheumatism", vol. 31, 315-324, No. 3, or Seitz M. (1995), "Rheumatoid Arthritis" in Clinical Immunology (Peter, HH ed.), 327-337, Chapter 23), Urban and Schwarzenberg Verlag Munich - Vienna - Baltimore). In detail, these are the following criteria:
1. Morgensteifigkeit von mindestens einer Stunde;1. morning stiffness of at least one hour;
2. Weichteilschwellung oder Gelenkerguß gleichzeitig in wenigstens drei Gelenksregionen;2. Soft tissue swelling or joint effusion in at least three joint regions at the same time;
3. Weichteilschwellung oder Gelenkerguß wenigstens in einem Bereich von Handgelenken, PIP- oder MCP-Gelenken;3. Soft tissue swelling or joint effusion in at least one area of wrists, PIP or MCP joints;
4. symetrische Schwellungen/Arthritis derselben Gelenkbereiche auf beiden Seiten des Körpers;4. symmetrical swelling / arthritis of the same joint areas on both sides of the body;
5. subkutane Rheumaknoten über Knochenvorsprüngen, Streckseiten oder in gelenknahen Regionen;5. subcutaneous rheumatoid knots above bone protrusions, extensor sides or in regions close to the joints;
6. Nachweis von Rheumafaktortitern; und6. Evidence of rheumatoid factor titers; and
7. typische radiologische Veränderungen. Hier müssen die Kriterien Nr. 1-4 wenigstens sechs Wochen lang vorhanden gewesen sein. Die Sensitivität dieser Methode liegt bei 91-94 %, die Spezifität bei 89 % im Vergleich zu nicht- rheumatoiden entzündlich-rheumatischen Erkrankungen.7. typical radiological changes. Criteria 1-4 must have been present here for at least six weeks. The sensitivity of this method is 91-94%, the specificity 89% compared to non-rheumatoid inflammatory rheumatic diseases.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein in vitro Diagnoseverfahren zur Verfügung zu stellen, das eine höhere Sensitivität und Spezifität als bekannte Methoden besitzt .A further object of the present invention is therefore to provide an in vitro diagnostic method which has a higher sensitivity and specificity than known methods.
CD21, der auch als Komplementrezeptor 2 bezeichnet wird, ist der Rezeptor für den Komplementbestandteil der Immunkomplexe (Fearon, D.T. & Carter, R.H. (1995), Annu . Rev . Immuno1. 13, 127-149). Die Immunkomplexe, die aus Komplement und Antikörper, an denen das Antigen gebunden ist, bestehen, wirken regulierend auf die B-Zellen. Hierbei ist CD21 essentiell für das Funktionieren der Immunabwehr. So inhibiert beispielsweise gentechnisch hergestelltes lösliches CD21 in Mäusen die T- zellabhängige Immunantwort. CD21 ist auf reifen B-Zellen ausgeprägt und wird bei der Differenzierung zur Plasmazelle abgeschaltet. Darüber hinaus ist CD21 der Rezeptor für dasCD21, which is also referred to as complement receptor 2, is the receptor for the complement component of the immune complexes (Fearon, D.T. & Carter, R.H. (1995), Annu. Rev. Immuno1. 13, 127-149). The immune complexes, which consist of complement and antibody to which the antigen is bound, have a regulating effect on the B cells. CD21 is essential for the functioning of the immune system. For example, genetically engineered soluble CD21 inhibits the T cell-dependent immune response in mice. CD21 is pronounced on mature B cells and is switched off when differentiated from the plasma cell. In addition, CD21 is the receptor for that
Epstein-Barr-Virus , ein Rezeptor für HIV und er bindet α- Interferon.Epstein-Barr virus, a receptor for HIV and it binds α-interferon.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich bei der Analyse der lymphoiden Zellen aus Synovialpunktaten von Patienten verschiedener Erkrankungen der Gelenke CD21 nicht bzw. in einer verringerten Anzahl auf der Oberfläche synovialer B-Zellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis befindet. Das Synovialpunktat besteht aus der Synovialflüssigkeit , der sogenannten Gelenkschmiere.It has now surprisingly been found that when analyzing the lymphoid cells from synovial punctures from patients with various diseases of the joints, CD21 is not found or is found in a reduced number on the surface of synovial B cells from patients with rheumatoid arthritis. The synovial puncture consists of the synovial fluid, the so-called joint lubricant.
Im Unterschied dazu befindet sich CD21 auf den synovialen B- Zellen von nicht rheumatoiden Arthritiserkrankungen. Zudem trugen die B-Zellen des peripheren Blutes der untersuchten Patienten und von gesunden Probanden CD21 auf ihrer Oberfläche, was bedeutet, daß es sich bei den Patienten mit rheumatoider Arthritis nicht um einen genetischen Defekt handelt, sondern daß das Fehlen von CD21 auf der Oberfläche synovialer B-Zellen ursächlich mit der rheumatoiden Arthritis zusammenhängt. Ebenso wurde gefunden, daß bei der Verwendung von verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epitope von CD21 die gleichen Reaktivitäten festgestellt wurden, was bedeutet, daß CD21 nicht durch einen Liganden blockiert ist.In contrast, CD21 is found on the synovial B cells of non-rheumatoid arthritis diseases. In addition, the B cells of the peripheral blood of the examined patients and of healthy volunteers carried CD21 on their surface, which means that the patients with rheumatoid Arthritis is not a genetic defect, but that the lack of CD21 on the surface of synovial B cells is causally related to rheumatoid arthritis. It was also found that when different monoclonal antibodies against different epitopes of CD21 were used, the same reactivities were found, which means that CD21 is not blocked by a ligand.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von rheumatoider Arthritis, welches folgende nacheinander ausgeführte Schritte enthält:The present invention therefore relates to a method for the in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, which contains the following steps carried out in succession:
a) Isolieren ononukleärer Zellen, insbesondere B-Zellen aus der synovialen Flüssigkeit; unda) isolating ononuclear cells, in particular B cells, from the synovial fluid; and
b) Nachweis auf .Abwesenheit bzw. eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen.b) Evidence of absence or a reduction in the number of CD21 on B cells.
Vorzugsweise werden die mononukleären Zellen, welche einkernige Immunzellen sind, vor der Nachweisreaktion auf B- zellspezifisches CD21, insbesondere über einen Ficollgradienten oder durch Sortierung auf beispielsweise CD19+-Zellen im Durchflußcytometer , vor allem durch magnetische Sortierung anhand magnetischer Antikörper gegen z. B. CD19 bzw. eine Kombination dieser Methoden angereichert. Bei der Anreicherung über einen Ficollgradienten befinden sich die mononukleären Zellen in der Interphase des Gradienten. Bei der vorstehend beschriebenen Aus führungs form der Erfindung werden die angereicherten mononukleären Zellen nicht weiterverwendet, wohl aber bei der vorliegenden Ausführungsform. Die beiden Verfahren können daher vorteilhafterweise miteinander kombiniert werden. Die Zahl der angereicherten mononukleären Zellen aus Punktaten liegt hierbei in einem Bereich von 10^ bis 107 Zellen. Bei der Anreicherung im Durchflußcytometer lassen sich die B-Zellen auf eine sehr hohe Reinheit bringen, was die Auswertung sehr erleichtert. Bevorzugt ist vor allem ein magnetisches Sortiersystem, bei dem Antikörper gegen CD19 mit winzigen magnetischen Partikeln gekoppelt sind, da diese Methode sehr schnell ist und eine ausreichend hohe Reinheit an B-Zellen liefert. Aufgrund der Bindung der agnetisierten Antikörper an CD19 auf B-Zellen lassen sich diese leicht beispielsweise innerhalb von ca. 30 Minuten auf über ca. 50%ige Reinheit ausgehend von ca. 1% B-Zellen im Punktat anreichern. Die magnetische Sortierung ermöglicht auch eine mehrmalige Anreicherung von B-Zellen aus 109 oder mehr Zellen.Preferably, the mononuclear cells, which are mononuclear immune cells, before the detection reaction to B-cell-specific CD21, in particular via a Ficoll gradient or by sorting on, for example, CD19 + cells in the flow cytometer, especially by magnetic sorting using magnetic antibodies against z. B. CD19 or a combination of these methods. When enriched via a Ficoll gradient, the mononuclear cells are in the interphase of the gradient. In the embodiment of the invention described above, the enriched mononuclear cells are no longer used, but they are used in the present embodiment. The two methods can therefore advantageously be combined with one another. The number of enriched mononuclear cells from punctate is in a range from 10 ^ to 10 7 cells. When enriched in the flow cytometer, the B cells can be brought to a very high level of purity, which greatly facilitates the evaluation. A magnetic one is preferred Sorting system in which antibodies against CD19 are coupled with tiny magnetic particles, since this method is very fast and provides a sufficiently high level of B cell purity. Due to the binding of the agnetized antibodies to CD19 on B cells, these can easily be enriched in the punctate, for example within about 30 minutes to over 50% purity, starting from approximately 1% B cells. Magnetic sorting also enables B cells from 10 9 or more cells to be enriched several times.
Es ist weiterhin vorteilhaft, die angereicherten mononukleären Zellen beispielsweise zweimal mit PBS, einer isotonischen phosphatgepufferten Salzlösung, zu waschen.It is furthermore advantageous to wash the enriched mononuclear cells twice, for example, with PBS, an isotonic phosphate-buffered saline solution.
Im allgemeinen wird das CD21 mit monoklonalen Antikörpern, welche vorzugsweise markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert, sind, nachgewiesen. Ein Beispiel für geeignete fluoreszenzmarkierte Antikörper sind die von der Fa. Halan Sera-Lab Ltd., England hergestellten fluorescein- markierten Anti-CD21-Antikörper . Weitere Beispiele von Fluoreszenzfarbstoffen sind Phycoerythrin oder Rhodamin. Die Markierung der Zellen wird vorzugsweise in einer Pufferlösung, beispielsweise PBS in Anwesenheit von ca. 5-10% Fremdprotein wie z. B. fötalem Kälberserum (FCS), und Azid, einem Atmungsketteninhibitor, in einer Konzentration von vorzugsweise ca. 0,01% durchgeführt. Bei dieser Konzentration bleiben die Zellen noch am Leben, jedoch haben sie die Fähigkeit verloren, Oberflächenmoleküle wie z. B. das CD21 zu internalisieren, so daß die Ergebnisse hierdurch nicht verfälscht werden können. Nach der Inkubation mit den markierten Antikörpern werden die Zellen vorzugsweise mit dem gleichen Puffer gewaschen und anschließend analysiert.In general, the CD21 is detected with monoclonal antibodies, which are preferably labeled, for example fluorescently labeled. An example of suitable fluorescence-labeled antibodies are the fluorescein-labeled anti-CD21 antibodies manufactured by Halan Sera-Lab Ltd., England. Other examples of fluorescent dyes are phycoerythrin or rhodamine. The labeling of the cells is preferably carried out in a buffer solution, for example PBS in the presence of approx. 5-10% foreign protein such as e.g. B. fetal calf serum (FCS), and azide, a respiratory chain inhibitor, in a concentration of preferably about 0.01%. At this concentration, the cells are still alive, but they have lost the ability to remove surface molecules such as e.g. B. internalize the CD21 so that the results cannot be falsified. After incubation with the labeled antibodies, the cells are preferably washed with the same buffer and then analyzed.
Als Analysemethoden eignen sich beispielsweise die Analyse im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop oder der ELISA-Test. Der Nachweis von fluoreszenz- arkierten B-Zellen erfolgt vorzugsweise im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop. Im Durchflußcytometer können beispielsweise mit hoher Auflösung mehr als 1000 Zellen pro Sekunde analysiert werden, wobei in der Regel das gesamte Verfahren nur ca. eine Stunde dauert.Examples of suitable analysis methods are analysis in the flow cytometer or under the fluorescence microscope or the ELISA test. The detection of fluorescence-labeled B cells is preferably carried out in a flow cytometer or under a fluorescence microscope. In the flow cytometer, for example, more than 1000 cells per second can be analyzed with high resolution, the entire procedure generally only taking about one hour.
Um die Anwesenheit von B-Zellen, die kein CD21 tragen, nachzuweisen, ist es weiterhin vorteilhaft, die B-Zellen beispielsweise über andere B-Zell-spezifische Antigene, wie CD19 oder CD20, nachzuweisen. Hierbei ist es insbesondere bevorzugt, wenn die Markierung von CD21 eine andere ist, als die Markierung von CD19 und/oder CD20. Durch beispielsweise unterschiedliche Fluroeszenzmarkierungen , vorzugsweise Fluorescein in Kombination mit Phycoerythrin, können die verschiedenen Moleküle gleichzeitig nachgewiesen werden. Der Nachweis der B-Zellen über CD19 und/oder CD20 dient auch insbesondere als Kontrolle für eine erfolgreiche Markierung der B-Zellen.In order to detect the presence of B cells that do not carry CD21, it is also advantageous to detect the B cells, for example, via other B cell-specific antigens, such as CD19 or CD20. It is particularly preferred here if the labeling of CD21 is different from the labeling of CD19 and / or CD20. The different molecules can be detected simultaneously by, for example, different fluorescent labels, preferably fluorescein in combination with phycoerythrin. The detection of the B cells via CD19 and / or CD20 also serves in particular as a control for successful labeling of the B cells.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, gegen CD21 zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose der rheumatoiden Arthritis. Vorzugsweise enthält das Diagnostikum nicht nur Anti-CD21-Antikörper , sondern auch Antikörper gegen andere B-Zell-spezifischen Antigene, wie CD19 und/oder CD20. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung auch ein Diagnostikum enthaltend Antikörper gegen CD21 und Antikörper gegen andere B-Zell-spezifischen Antigene, vorzugsweise gegen CD19 und/oder CD20. Die Antikörper sind wiederum vorzugsweise monoklonale Antikörper, die insbesondere markiert, vorzugsweise fluoreszenzmarkiert sind. Es ist vor allem bevorzugt, wenn die Markierung der gegen CD21-gerichteten Antikörper eine andere ist als die Markierung der Antikörper gegen das oder die anderen B-Zell-spezifischen Antigene. Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt im wesentlichen markierte Antikörper und gegebenenfalls dem Fachmann bekannte Zusatz- bzw. Hilfsstoffe. Ist das Diagnostikum beispielsweise ein Immunofluoreszenz-Testkit, so sind an die Antikörper Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Fluorescein, gebunden bzw. konjugiert. Dieses Diagnostikum eignet sich insbesondere für die Analyse der B-Zell-spezifischen Antigene im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop. Ist das Diagnostikum beispielsweise ein Radioimmuno-Testkit, so sind die Antikörper mit radioaktiven Isotopen markiert. Über die radioaktive Markierung der Antikörper lassen sich die B-Zell- spezifischen Antigene mit hoher Sensitivität nachweisen. Das Diagnostikum kann auch ein Enzymimmuno-Testkit (ELISA) sein, bei dem die Antikörper mit einem Enzym gekoppelt werden, beispielsweise mit der alkalischen Phosphatase. In Anwesenheit von 4-Nitrophenylphosphat als ein mögliches Substrat entsteht durch das Antikörper-gebundene Enzym eine gelbe Farbe. Über die Farbmarkierung lassen sich die Antikörper-gebundenen B-Zell- spezifischen Antigene leicht im Spektrophotometer nachweisen.Another object of the invention is the use of antibodies, in particular monoclonal antibodies, against CD21 for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of rheumatoid arthritis. The diagnostic agent preferably contains not only anti-CD21 antibodies, but also antibodies against other B cell-specific antigens, such as CD19 and / or CD20. Another object of the invention is therefore also a diagnostic agent containing antibodies against CD21 and antibodies against other B cell-specific antigens, preferably against CD19 and / or CD20. Again, the antibodies are preferably monoclonal antibodies, which are in particular labeled, preferably fluorescence-labeled. It is particularly preferred if the labeling of the antibodies directed against CD21 is different from the labeling of the antibodies against the one or more other B cell-specific antigens. A diagnostic agent according to the invention essentially comprises labeled antibodies and optionally additives or auxiliaries known to the person skilled in the art. If the diagnostic agent is, for example, an immunofluorescence test kit, fluorescent dyes, for example fluorescein, are bound or conjugated to the antibodies. This diagnostic is particularly suitable for the analysis of B cell-specific antigens in a flow cytometer or under a fluorescence microscope. If the diagnostic agent is, for example, a radioimmuno test kit, the antibodies are labeled with radioactive isotopes. The B-cell-specific antigens can be detected with high sensitivity via the radioactive labeling of the antibodies. The diagnostic can also be an enzyme immunoassay kit (ELISA), in which the antibodies are coupled with an enzyme, for example with the alkaline phosphatase. In the presence of 4-nitrophenyl phosphate as a possible substrate, the antibody-bound enzyme produces a yellow color. The antibody-bound B cell-specific antigens can be easily detected in the spectrophotometer using the color marking.
Die Figur und das folgende Beispiel sollen nun die Diagnosemethode näher erläutern:The figure and the following example are now intended to explain the diagnostic method in more detail:
Beschreibung der Figur:Description of the figure:
Fig. 6: Schematische Darstellung des Verlaufs des Diagnoseverfahrens :6: Schematic representation of the course of the diagnostic procedure:
Schritt 1 stellt das Punktieren und die Entnahme der jeweiligen Probe dar.Step 1 shows the puncturing and taking of the respective sample.
Schritt 2 stellt die Anreicherung der mononukleären Zellen über einen Ficollgradienten dar. Hierbei bedeutet SFL synoviale Flüssigkeitslymphozyten und PBL periphere Blutlymphozyten. Schritt 3 stellt die Färbung der B-Zellen mit spezifischen, gegen CD21 gerichtete Antikörper dar. Die dicken Kreise entsprechen den B-Zellen, die dünnen Kreise anderen Zellen und die gefüllten Kreise den durch Anti-CD21-Antikörper gefärbten B-Zellen.Step 2 represents the enrichment of the mononuclear cells via a Ficoll gradient. Here, SFL means synovial fluid lymphocytes and PBL peripheral blood lymphocytes. Step 3 shows the staining of the B cells with specific antibodies directed against CD21. The thick circles correspond to the B cells, the thin circles to other cells and the filled circles of the B cells stained by anti-CD21 antibodies.
Die anschließende Graphik zeigt sogenannte Konturplots, wobei die B-Zellen sowohl mit Antikörper gegen CD21 und gegen CD19 unterschiedlich durch Fluorochro e gefärbt worden sind. Die Antikörper gegen CD21 trugen Fluorescein (FL) und die Antikörper gegen CD19 trugen Phycoerythrin ( PE ) als Fluoreszenzfarbstoffe. Der fluoreszenzaktivierte Zellsortierer (FACScan) mißt die Fluoreszenzintensität einzelner Zellen, in diesem Fall gleichzeitig die Fluoreszenzintensität von Fluorescein und Phycoerythrin. Dabei sind ca. 10.000 gemessene Zellen in diesen Konturplots aufgezeichnet, wobei die Linien ähnlich den Höhenlinien einer topographischen Karte der Menge an Einzelpunkten entspricht. Im linken Diagramm sieht man die Zellen aus dem Synovialpunktat , die keine CD21-Markierung tragen. Im rechten Diagramm sieht man solche B-Zellen, die mit Anti-CD21-Antikörper markiert worden sind, wobei sich das Signal von dem linken in den rechten unteren Quadranten verschob.The following graphic shows so-called contour plots, whereby the B cells have been stained differently by fluorochro e both with antibodies against CD21 and against CD19. The antibodies against CD21 carried fluorescein (FL) and the antibodies against CD19 carried phycoerythrin (PE) as fluorescent dyes. The fluorescence activated cell sorter (FACScan) measures the fluorescence intensity of individual cells, in this case simultaneously the fluorescence intensity of fluorescein and phycoerythrin. Around 10,000 measured cells are recorded in these contour plots, the lines corresponding to the contour lines of a topographical map corresponding to the number of individual points. In the diagram on the left you can see the cells from the synovial puncture that do not carry the CD21 label. The right diagram shows such B cells which have been labeled with anti-CD21 antibody, the signal shifting from the left to the right lower quadrant.
Beispiel :For example:
Einem Patienten wurde Synovialpunktat und Blut entnommen und getrennt auf Ficollkissen aufgetragen. Danach wurde bei 2.300 Umdrehungen/Minute für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend ließ man den Rotor ohne Bremse auslaufen. Die mononukleären Zellen, die sich in der Interphase befanden, wurden entnommen und die B-Zellen mittels eines magnetischen Sortiersystems weiter angereichert. Hierzu wurden Anti-CD19-Antikorper verwendet, an die winzige magnetische Partikel gekoppelt sind. Der Anreicherungsgrad betrug ca. 50% ausgehend von ca. 1% B-Zellen im Punktat. Anschließend wurden 1-3 x 105 Zellen in 96 Loch-Mikrotiterplatten durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden auf Eis und im Dunkeln mit austitrierten fluorescein-markierten Anti-CD21- Antikörper (VTF-598, Halan Sera-Lab Ltd. England) und mit Phycoerythrin markierten Anti-CD19-Antikörper (Dako-CD19, Dako, Dänemark) für 20 Minuten in PBS (8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na HP04, 0,24g KH2P04, pH 7,4 mit HC1 eingestelllt und auf 11 mit destilliertem Wasser aufgefüllt) + 2 % FCS mit 0,01 % Natriumazid inkubiert. Danach wurden die Zellen mit dem gleichen Puffer gewaschen, resuspendiert und im FACScan (Becton Dickinson) oder unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert.Synovial punctate and blood were taken from a patient and applied separately to Ficoll pads. The mixture was then centrifuged at 2,300 rpm for 10 minutes at room temperature and then the rotor was allowed to run down without a brake. The mononuclear cells that were in the interphase were removed and the B cells were further enriched using a magnetic sorting system. Anti-CD19 antibodies were used for this purpose, to which tiny magnetic particles are coupled. The degree of enrichment was approximately 50% starting from approximately 1% B cells in the punctate. Then 1-3 x 10 5 cells were collected in 96-well microtiter plates by centrifugation. The cells were on ice and in the dark with titrated fluorescein-labeled anti-CD21 antibody (VTF-598, Halan Sera-Lab Ltd. England) and with Phycoerythrin labeled anti-CD19 antibody (Dako-CD19, Dako, Denmark) for 20 minutes in PBS (8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na HP04, 0.24g KH 2 P0 4 , pH 7.4 with HC1 adjusted and made up to 11 with distilled water) + 2% FCS with 0.01% sodium azide. The cells were then washed with the same buffer, resuspended and analyzed in the FACScan (Becton Dickinson) or under the fluorescence microscope.
Dabei zeigte sich, daß die B-Zellen aus dem Synovialpunktat sich nicht mit Anti-CD21-Antikörper färben lassen. Demgegenüber lassen sich die B-Zellen aus dem Blut mit Anti-CD21-Antikörper anfärben. Andere Zellarten zeigten in den untersuchten Proben aus Blut und Synovialpunktat keine Färbung mit Anti-CD21- Antikörper . It was found that the B cells from the synovial punctate cannot be stained with anti-CD21 antibodies. In contrast, the B cells from the blood can be stained with anti-CD21 antibodies. Other cell types showed no staining with anti-CD21 antibody in the blood and synovial punctate samples examined.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Herstellung von rheumatischem Pannusgewebe, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst Synovialzellen aus Säugetieren mit rheumatoider Arthritis isoliert werden und anschließend die isolierten Zellen ohne Wechsel des Zellkulturmediums bis zur Ausbildung pannusähnlicher Villi kultiviert werden.1. A process for the production of rheumatic pannus tissue, characterized in that first synovial cells from mammals with rheumatoid arthritis are isolated and then the isolated cells are cultivated without changing the cell culture medium until the formation of pannus-like villi.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synovialzellen in Synovialflüssigkeit enthalten sind.2. The method according to claim 1, characterized in that the synovial cells are contained in synovial fluid.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten aus der Synovialflüssigkeit abgereichert werden.3. The method according to claim 2, characterized in that the lymphocytes are depleted from the synovial fluid.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten über einen Ficollgradienten abgereichert werden und das Sediment des Ficollgradienten kultiviert wird.4. The method according to claim 3, characterized in that the lymphocytes are depleted via a Ficoll gradient and the sediment of the Ficoll gradient is cultivated.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Sediment des Ficollgradienten gewaschen wird.5. The method according to claim 4, characterized in that the sediment of the Ficoll gradient is washed.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Sediment Granulozyten, Makrophagen und synoviale Fibroblasten enthält.6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that the sediment contains granulocytes, macrophages and synovial fibroblasts.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synovialzellen in Synovialgewebe enthalten sind und das Synovialgewebe im wesentlichen nicht mit Enzymen behandelt wird .7. The method according to claim 1, characterized in that the synovial cells are contained in synovial tissue and the synovial tissue is essentially not treated with enzymes.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Synovialgewebe mechanisch separiert wird. 8. The method according to claim 7, characterized in that the synovial tissue is mechanically separated.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Pannusgewebe, HLA Klasse II positive akrophagenartige Zellen und Vimentin-produzierende fibroblastenartige Zellen enthält.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the pannus tissue, HLA class II contains positive acrophage-like cells and vimentin-producing fibroblast-like cells.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um menschliches Pannusgewebe handelt .10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it is human pannus tissue.
11. Rheumatisches Pannusgewebe erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.11. Rheumatic pannus tissue obtainable by a process according to one of claims 1 to 10.
12. Verwendung des rheumatischen Pannusgewebes gemäß Anspruch 11 zum Testen von Substanzen auf eine pharmakologische Wirkung.12. Use of the rheumatic pannus tissue according to claim 11 for testing substances for a pharmacological effect.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmakologische Wirkung eine antirheumatische, antiinflammatorische und/oder antiproliferative Wirkung ist.13. Use according to claim 12, characterized in that the pharmacological effect is an antirheumatic, anti-inflammatory and / or antiproliferative effect.
14. Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch wirksamen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß Synovialzellen aus Säugetieren mit rheumatoider Arthritis isoliert werden, anschließend die Synovialzellen ohne Wechsel des Zellkulturmediums kultiviert werden und ein oder mehrere auf die pharmakologische Wirkung zu testende Substanzen hinzugegeben werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Synovialzellen ohne Wechsel des Zellkulturmediums bis zur möglichen Ausbildung pannusähnlicher Villi kultiviert werden.14. A method for finding pharmacologically active substances, characterized in that synovial cells are isolated from mammals with rheumatoid arthritis, then the synovial cells are cultivated without changing the cell culture medium and one or more substances to be tested for the pharmacological effect are added, characterized in that the synovial cells can be cultivated without changing the cell culture medium until pannus-like villi are formed.
15. Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch wirksamen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß rheumatisches Pannusgewebe gemäß Anspruch 11 ohne Wechsel des Zellkulturmediums kultiviert und ein oder mehrere auf die pharmakologische Wirkung zu testende Substanzen hinzugegeben werden . 15. A method for finding pharmacologically active substances, characterized in that rheumatic pannus tissue according to claim 11 is cultivated without changing the cell culture medium and one or more substances to be tested for the pharmacological effect are added.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturen des rheumatischen Pannusgewebes vorzugsweise 2 bis 4 Wochen, insbesondere 4 bis 6 Wochen, vor allem mehr als 6 Wochen alt sind.16. Use according to claim 15, characterized in that the cultures of the rheumatic pannus tissue are preferably 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old.
17. Testkit enthaltend rheumatisches Pannusgewebe gemäß Anspruch 11 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe.17. Test kit containing rheumatic pannus tissue according to claim 11 and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries.
18. Testkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Pannusgewebe 2 bis 4 Wochen, insbesondere 4 bis 6 Wochen, vor allem mehr als 6 Wochen alt ist.18. Test kit according to claim 17, characterized in that the pannus tissue is 2 to 4 weeks, in particular 4 to 6 weeks, especially more than 6 weeks old.
19. Verfahren zur in vitro Diagnose von rheumatoider Arthritis, enthaltend folgende Schritte:19. A method for in vitro diagnosis of rheumatoid arthritis, comprising the following steps:
a) Isolieren mononukleärer Zellen aus der synovialen Flüssigkeit; unda) isolating mononuclear cells from the synovial fluid; and
b) Nachweis auf Abwesenheit von CD21 auf B-Zellen bzw. auf eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen.b) Evidence of the absence of CD21 on B cells or a reduction in the number of CD21 on B cells.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen vor dem Nachweis angereichert werden.20. The method according to claim 19, characterized in that the mononuclear cells are enriched before detection.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen über einen Ficollgradienten angereichert werden .21. The method according to claim 20, characterized in that the mononuclear cells are enriched via a Ficoll gradient.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die angereicherten mononukleären Zellen vor dem Nachweis gewaschen werden.22. The method according to claim 20 or 21, characterized in that the enriched mononuclear cells are washed before detection.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19-22, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Nachweis in Anwesenheit von Azid durchgeführt wird. 23. The method according to any one of claims 19-22, characterized in that said detection is carried out in the presence of azide.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis von CD21 auf B-Zellen mit Antikörpern gegen CD21 erfolgt.24. The method according to any one of claims 19-23, characterized in that the detection of CD21 on B cells is carried out with antibodies against CD21.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.25. The method according to claim 24, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Antikörper markiert ist.26. The method according to claim 24 or 25, characterized in that said antibody is labeled.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper fluoreszenzmarkiert ist.27. The method according to claim 26, characterized in that the antibody is fluorescence-labeled.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 19-27, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen B-Zellen sind.28. The method according to any one of claims 19-27, characterized in that the mononuclear cells are B cells.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen zusätzlich über ein anderes B-zellspezifisches Antigen nachgewiesen werden.29. The method according to claim 28, characterized in that the B cells are additionally detected via another B cell-specific antigen.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das andere B-zellspezifische Antigen CD19 oder CD20 ist.30. The method according to claim 29, characterized in that the other B cell-specific antigen is CD19 or CD20.
31. Verwendung von Antikörper gegen CD21 zur Herstellung eines Diagnostikums zum in vitro Nachweis der rheumatoiden Arthritis.31. Use of antibodies against CD21 for the production of a diagnostic agent for the in vitro detection of rheumatoid arthritis.
32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.32. Use according to claim 31, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody.
33. Diagnostikum enthaltend Antikörper gegen CD21 und Antikörper gegen ein anderes B-Zell-spezifisches Antigen.33. Diagnostic agent containing antibodies against CD21 and antibodies against another B cell-specific antigen.
34. Diagnostikum nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das andere B-Zell-spezifische Antigen CD19 oder CD20 ist. 34. Diagnostic agent according to claim 33, characterized in that the other B cell-specific antigen is CD19 or CD20.
35. Diagnostikum nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoklonale Antikörper sind. 35. Diagnostic agent according to claim 34, characterized in that the antibodies are monoclonal antibodies.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002061420A2 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Oligene Gmbh Vitro in a cell interaction culture system for testing and developing medicaments

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07289288A (en) * 1994-04-27 1995-11-07 L T T Kenkyusho:Kk Method for evaluating effect of antirheumatic medicine

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07289288A (en) * 1994-04-27 1995-11-07 L T T Kenkyusho:Kk Method for evaluating effect of antirheumatic medicine

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE CHEMABS CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; FRYE ET AL: "AN IN VITRO MODEL FOR STUDYING MECHANISMS UNDERLYING SYNOVIOCYTE-MEDIATED CARTILAGE INVASION IN RHEUMATOID ARTHRITIS", XP002050184 *
KAKLAMANIS ET AL: "EXPERIMENTAL ANIMAL MODELS RESEMBLING RHEUMATOID ARTHRITIS", CLINICAL RHEUMATOLOGY, vol. 11, 1992, pages 41 - 47, XP002050181 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 96, no. 3 29 March 1996 (1996-03-29) *
PATHOL. ONCOL. RES., vol. 2, no. 3, 1996, pages 157 - 166 *
SCHULTZ ET AL: "DEVELOPMENT OF AN ARTIFICIAL PANNUS MODEL FOR DESTRUCTIVE JOINT DISEASES", ARTHRITIS AND RHEUMATISM, vol. 39, no. 9, September 1996 (1996-09-01), pages S36, XP002050182 *
SCHULTZ ET AL: "DEVELOPMENT OF IN VITRO MODEL SYSTEMS FOR DESTRUCTIVE JOINT DISEASES", ARTHRITIS AND RHEUMATISM, vol. 40, no. 8, August 1997 (1997-08-01), pages 1420 - 1428, XP002050183 *
STEPHAN ET AL: "TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM B LYMPHOPROLIFERATIVE SYNDROME BY LOCAL INFUSION OF A B CELL-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY", TRANSPLANTATION, vol. 54, 1992, pages 246 - 249, XP002050179 *
WILSON ET AL: "DECREASED EXPRESSION OF THE C3B/C4B RECEPTOR (CR1) AND THE C3D RECEPTOR (CR2) ON B LYMPHOCYTES AND OF CR1 ON NEUTROPHILS OF PATIENTS WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHROMATOSUS", ARTHRITIS AND RHEUMATISM, vol. 29, 1986, pages 739 - 747, XP002050180 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002061420A2 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Oligene Gmbh Vitro in a cell interaction culture system for testing and developing medicaments
WO2002061420A3 (en) * 2001-01-31 2002-09-26 Thomas Haeupl Vitro in a cell interaction culture system for testing and developing medicaments

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