WO1998001153A1 - Medicinal compositions for extracorporeal blood circulation circuit and method for inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit - Google Patents

Medicinal compositions for extracorporeal blood circulation circuit and method for inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit Download PDF

Info

Publication number
WO1998001153A1
WO1998001153A1 PCT/JP1997/002009 JP9702009W WO9801153A1 WO 1998001153 A1 WO1998001153 A1 WO 1998001153A1 JP 9702009 W JP9702009 W JP 9702009W WO 9801153 A1 WO9801153 A1 WO 9801153A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pro
asp
thrombomodulin
blood
cys
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/002009
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Mitsunobu Mohri
Makoto Suzuki
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha filed Critical Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Publication of WO1998001153A1 publication Critical patent/WO1998001153A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/06—Use of macromolecular materials
    • A61L33/12—Polypeptides, proteins or derivatives thereof, e.g. degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Medicinal compositions for inhibiting blood coagulation to be injected into extracorporeal blood circulation circuits which contain as the active ingredient thrombomodulins having at least an amino acid sequence represented by the following formula (1): (W)-Pro-Cys-Phe-Arg-Ala-Asn-Cys-Glu-Tyr-Gln-Cys-Gln-Pro-Leu-(X)-Gln-Thr-Ser-Tyr-Leu-Cys-Val-Cys-Ala-Glu-Gly-Phe-Ala-Pro-Ile-Pro-His-Glu-Pro-His-Arg-Cys-Gln-Met-Phe-Cys-(Y)-Gln-Thr-Ala-Cys-Pro-Ala-Asp-Cys-Asp-Pro-Asn-Thr-Gln-Ala-Ser-Cys-Glu-Cys-Pro-Glu-Gly-Tyr-Ile-Leu-Asp-Asp-Gly-Phe-Ile-Cys-Thr-Asp-Ile-Asp-Glu-Cys-Glu-Asn-Gly-Gly-Phe-Cys-Ser-Gly-Val-Cys-His-Asn-Leu-Pro-Gly-Thr-Phe-Glu-Cys-Ile-Cys-Gly-Pro-Asp-Ser-Ala-Leu-(Z)-Arg-His-Ile-Gly-Thr-Asp-Cys, wherein (W) represents Val-Glu-Pro-Val-Asp, Glu-Pro-Val-Asp, Pro-Val-Asp, Val-Asp or Asp; (X) and (Y) are the same or different and each represents Asn, Gln, Ser, Ala or Gly; and (Z) represents Val or Ala. These compositions have excellent effects of inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuits typified by hemodialyzers, are highly safe, and can be easily handled in treatments, observation, etc.

Description

明 細 書 血液体外循環回路用医薬組成物及び血液体外循環回路の 血液凝固防止方法 産業上の利用分野 本発明は、 特定のァミノ酸配列からなるト口ンボモジュリンを有効成分とす る血液体外循環回路用の血液凝固防止のための血液体外循環回路用医薬組成物及 び血液体外循環回路の血液凝固防止方法に関する。 従来の技術 血液透析、 血液濾過、 血液透析濾過、 血漿交換及び免疫吸着などの血液浄化 療法の際、 開心術時における心肺バイパスの際などにおいて、 血液体外循環と呼 ばれる処置が必要とされることがある。 血液体外循環とは、 血液を生体内から体 外への人工血流路により、 一定の処置を行う装置、 例えば人工心肺装置、 血液浄 化装置等を経て、 生体内に再送入する循環回路からなるものである。 血液浄化装 置としては、 典型的には人工腎臓が挙げられる。 これらの血液体外循環は、 シャ ントゃ人工血管等のように恒常的に体内に移植する医用器材とは異なり、 一時的 に処置されるものであって、 特に血液浄化療法の際に用いられる血液透析におい ては、 定期的な処置毎に、 または必要に応じて、 体外循環回路の設置、 取り外し を繰り返すものである。  Description Pharmaceutical composition for extracorporeal blood circulation circuit and method for preventing blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit Industrial application Field of the Invention The present invention relates to an extracorporeal blood circulation circuit containing as an active ingredient tonbomodulin comprising a specific amino acid sequence. The present invention relates to a pharmaceutical composition for a blood extracorporeal circuit for preventing blood coagulation and a method for preventing blood coagulation in a blood extracorporeal circuit. Prior art In blood purification therapy such as hemodialysis, hemofiltration, hemodiafiltration, plasma exchange and immunoadsorption, and during cardiopulmonary bypass during open heart surgery, a treatment called extracorporeal blood is required. There is. The extracorporeal blood circulation is a device that performs a certain treatment by means of an artificial blood flow path from the inside of the body to the outside of the body, such as a heart-lung machine, a blood purification device, etc. It becomes. A blood purification device typically includes an artificial kidney. These extracorporeal blood circulations are temporarily treated, unlike medical devices that are constantly transplanted into the body, such as shunts and artificial blood vessels, and are treated temporarily. In dialysis, the extracorporeal circuit is repeatedly installed and removed at regular intervals or as necessary.
血液は異物と接触すると、 普通、 内因系の血液凝固カスケードが活性化され 、 最終的には流動性を失い凝固する。 血液体外循環時における人工血流路ゃ各種 装置からなる血液体外循環回路は、 異物であり、 血液はそれらに接触すると凝固 09 When blood comes in contact with foreign substances, the endogenous blood coagulation cascade is usually activated and eventually loses fluidity and coagulates. Artificial blood flow path during extracorporeal blood circulation 外 Extracorporeal blood circulation circuit composed of various devices is foreign matter, and blood coagulates when it comes into contact with them 09
することから、 何らかの方法により血液体外循環回路における血液凝固を防ぐ処 置が必要である。 Therefore, it is necessary to take some measures to prevent blood coagulation in the extracorporeal circuit.
通常上記の方法としては、 医用器材の表面に血液凝固防止薬を固定する方法 と、 循環血液中に血液凝固防止薬を投与する方法の 2つに大別されるが、 恒常的 に体内に移植する医用器材においては、 体内に一旦移植した場合に取り外しが容 易でないことから、 その医用器材の表面を血液凝固を防止する処理を行う必要が あり、 例えばその医用器材の表面に血液凝固を防止する薬剤等を固定化する方法 を用いることが一般的である。  Usually, the above methods can be broadly divided into two methods: fixing an anticoagulant drug on the surface of medical equipment and administering an anticoagulant drug to the circulating blood. Medical equipment that is not easily removable once implanted in the body, it is necessary to treat the surface of the medical equipment to prevent blood coagulation.For example, to prevent blood coagulation on the surface of the medical equipment It is common to use a method of immobilizing a drug or the like to be used.
これに対して、 血液体外循環においても上記と同様に、 体外循環回路の表面 に血液凝固を防止する薬剤等を固定化する方法も試みられているが、 使い捨てが 基本となることから、 コスト的に見合うものとはなり得ず、 またそれ以上の問題 として、 血液凝固を防止する薬剤を終始全く添加せずに血液体外循環を行いえる のかについての確実性は、 一般の臨床の場において保証されておらず、 仮に体外 循環回路の表面に血液凝固を防止する薬剤等を固定化してあっても、 血液体外循 環においては、 体外循環回路内に、 血液凝固を防止する薬剤を投与する方法が行 われている。  On the other hand, in the extracorporeal blood circulation, a method of immobilizing a drug or the like for preventing blood coagulation on the surface of the extracorporeal circuit has also been attempted in the same manner as described above. And, moreover, the certainty that blood extracorporeal circulation can be performed without the addition of any anticoagulant agent at all times is guaranteed in general clinical settings. Even if a drug or the like that prevents blood coagulation is immobilized on the surface of the extracorporeal circulation circuit, in the extracorporeal blood circulation, there is a method of administering a drug that prevents blood coagulation into the extracorporeal circulation circuit. Is being done.
従来、 血液体外循環時に投与される血液凝固防止薬として、 例えば未分画へ パリ ンや低分子へパリンが使用されている。 しかしながら、 これらの血液凝固防 止薬においては、 脂質代謝への悪影響が問題視されており、 また出血のリスクも 懸念されている。  Conventionally, as an anticoagulant administered during extracorporeal blood circulation, for example, unfractionated parin or low molecular weight heparin has been used. However, these anticoagulants are considered to have an adverse effect on lipid metabolism, and the risk of bleeding is also a concern.
また、 いくつかのセリンプロテアーゼ阻害剤もまた抗凝固作用を有しており 、 例えば、 フザン （一般名 ： メシル酸ナファモスタツ ト） は、 血液透析などの一 部の血液体外循環時に使用されている。 しかしながら、 フザンは、 抗凝固効果が 弱く、 血液体外循環終了後の回路内には多くの凝固が見られることが報告されて いる。 さらに、 フザンは医薬品としての安全性の面で懸念される。 フザンは副作 用の頻度が多く （血液体外循環用抗凝固薬としての臨床試験時における副作用頻 度は 8. 4 %) , またフザンの長期間の使用によりその代謝物が生体内に蓄積す ることも問題視されている。 発明が解決しょうとする課題 血液透析をはじめとする血液体外循環回路用の、 さらに安全性の高い血液凝 固防止のための医薬組成物及び血液体外循環回路の血液凝固防止方法が求められ ていた。 課題を解決するための手段 本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、 特定のアミ ノ酸配列からなる トロンボモジュリンを有効成分とする医薬組成物が、 血液透析 をはじめとする血液体外循環回路用の血液凝固防止効果に優れ、 従来の未分画へ パリ ンゃ低分子へパリ ンと比較して安全性に優れ、 さらに通常の卜ロンボモジュ リンである本発明の特定のァミノ酸配列以外のトロンボモジュ リ ンと比較しても 処置や観察等の取扱いに優れることを確認して本発明を完成するに至った。 即ち 、 本発明は、 少なくともアミノ酸配列として、 下記式 （ 1 ) Some serine protease inhibitors also have an anticoagulant effect; for example, Fuzan (generic name: nafamostat mesilate) is used during some extracorporeal blood circulations such as hemodialysis. However, it has been reported that Fuzan has a weak anticoagulant effect, and that a large amount of coagulation is observed in the circuit after the end of extracorporeal blood circulation. Furthermore, Fuzan is concerned about its safety as a pharmaceutical. Fuzan has many side effects (frequent side effects during clinical trials as an anticoagulant for extracorporeal blood circulation). It has also been regarded as a problem that its metabolites accumulate in the living body due to long-term use of Fuzan. PROBLEM TO BE SOLVED BY THE INVENTION There is a need for a more safe pharmaceutical composition for blood extracorporeal circulation circuits such as hemodialysis and for blood coagulation prevention and a method for preventing blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuits. . Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a pharmaceutical composition containing thrombomodulin having a specific amino acid sequence as an active ingredient has been developed, including hemodialysis. Is superior in anticoagulant effect for extracorporeal blood circulation circuits, and is more safe than conventional unfractionated parin® and low molecular weight parin. The present inventors have confirmed that they are superior in handling such as treatment and observation as compared with thrombomodulin other than the amino acid sequence, and have completed the present invention. That is, according to the present invention, at least an amino acid sequence represented by the following formula (1):
(W) -P r o-Cy s -Ph e-Ar g-A l a - As n— Cy s - G l u - (W) -Pro-Cys-Phe-Arg-Ala-Asn—Cys-Glu-
Ty r - G i n - Cy s - G i n Pr o-Leu - (X) — G i n - Th r - S e r -Ty r -L e u-Cy s Va 1 -Cy s - A 1 a—G l u— G l y— Phe - A l a— Pr o— I l e Pr o— H i s—G l u— P r o - H i s - Ar g-Cy s -G l n - e t Ph e— Cy s (Y) 一 G i n - Th r— A 1 a - Cy s— Pr o A l a As p-Cy s -As p-P r o— As n - Th r— G】 n— A l a - S e r Cy s— G l u— Cy s— P r o— G l u -Ty r-G in-Cy s-G in Pr o-Leu-(X) — G in-Th r-Ser-Ty r -L e u-Cy s Va 1 -Cy s-A 1 a—G lu — G ly— Phe-A la— Pr o— I le Pr o— H is—G lu— P ro-H is-Ar g-Cy s -G ln-et Ph e— Cy s (Y) i G in -Thr—A1a-Cys—ProAlaAsp-Cys-AspPro—Asn-Thr—G] n—Ala-SerCyS—Glu—Cys—P ro—G lu-
G l y— Ty r— I 1 e— L e u— As p— As p— G l y— Ph e— I 1 e Cy s-Th r -As p- I 1 e - As p G 1 υ - C y s G 1 u - A s n G l y-G l y-Ph e-Cy s -Se r G 1 y - V a 1 C y s - H i sG ly— Ty r— I 1 e— L eu— As p— As p— G ly— Ph e— I 1 e Cy s-Th r -As p- I 1 e-As p G 1 υ-Cy s G 1 u-A sn G lyG Ly y-Phe e-Cy s -Se r G 1 y-Va 1 Cys -H is
A s n - L e υ -P r o-G l y-Th r P h e— G 1 u C y s - I 1 e C y s - G 1 y— P r o— As p— S e r A 1 a - L e u (Z) — A r g H i s - I 1 e - G 1 y-Th r -As p C y s A sn-Le υ -ProGly-ThrPhe—G1uCys-I1eCys-G1y—Pro—Asp—Ser A1a-Leu (Z ) — A rg H is-I 1 e-G 1 y-Th r -As p Cys
( 1 ) (1)
〔式中、 （W) は、 Va l— G l u— P r o— Va l— As p、 G l u— P r o - V a 1 -As p, P r o— Va l— As p、 Va l— As p、 または As pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) と （Y) は、 互いに 異なる、 又は同一の、 As n、 G l n、 S e r、 A l a、 または G l yのいずれ かのァミ ノ酸残基を、 （Z) は、 V a 1、 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残 基を示す。 〕 で表されるアミノ酸配列からなる トロンボモジュ リ ンを有効成分と する医薬組成物を血液体外循環回路用内へ注入するための血液凝固防止用医薬組 成物に関する。 [Wherein (W) is Va l—G lu—Pro—Va—As p, G lu—Pro—Va 1—As p, Pro—Val—As p, Val—As (X) and (Y) are different from or the same as Asn, Gln, Ser, Ala, or Gly And (Z) represents an amino acid residue of either Va1 or A1a. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for injecting a pharmaceutical composition containing thrombomodulin having an amino acid sequence represented by the following formula into an extracorporeal blood circulation circuit.
更に本発明は、 少なく ともアミ ノ酸配列として、 下記式 （ 1 )  Further, the present invention provides the amino acid sequence represented by the following formula (1):
(W) — P r o - Cy s - Ph e - Ar g— A l a-As n-Cy s -G l υ- Ty r-G l n-Cy s -G l n-P r o-Le u - (X) —G l n— Th r— S e r -Ty r -L e u-Cy s -Va 1— Cy s - A l a - G 1 u - G 1 y - Ph e - A l a - P r o— I 1 e - P r o - H i s - G l u - Pr o - H i s - Ar g— Cy s - G i n - Me t - Ph e - Cy s— (Y) — G l n— Th r— A 1 a— Cy s— Pr o - A l a— As p— Cy s— As p— Pr o— As n - Th r— G i n— A l a— S e r - Cy s— G l u— Cy s - P r o— G l u - G 1 y - T y r - I 1 e - L e u - As p - As p - G l y_Ph e - I 1 e - Cy s— Th r— As p - I 1 e - As p— G l u - Cy s - G l u - As n - G l y-G l y-Ph e-Cy s -Se r -G l y-Va l -Cy s -H i s- As n— L e u— P r o— G l y— Th r— Ph e— G l u— Cy s— I 1 e - Cy s— G l y— P r o - As p— S e r - A l a— L e u— (Z) 一 Ar g— H i s - I 1 e— G l y— Th r— As p - Cy s (W) — Pro-Cy s-Ph e-Ar g— A la-As n-Cy s -G l υ- Ty rG l n-Cy s -G l nP ro-Le u-(X) —G ln—Th r—Ser -Ty r -L e u-Cy s -Va 1—Cy s -A la -G 1 u -G 1 y -Phe -A la -Pro—I 1 e- P ro-H is-G lu-Pr o-H is-Ar g— Cy s-G in-Met-Ph e-Cy s— (Y) — G ln— Th r— A 1 a— Cy s— Pr o-A la-As p-Cy s-As p-Pr o-As n-Th r-G in-A la-Ser-Cy s-G lu-Cy s-Pro-G lu-G 1 y-T yr-I 1 e-Leu-As p-As p-G l y_Ph e-I 1 e-Cy s— Th r— As p-I 1 e-As p— G lu-Cy s-G lu-As n-G l yG l y-Ph e-Cy s -Se r -G l y-Va l -Cy s -His- As n— L eu— P ro— G ly— Th r— Ph e— G lu— Cy s— I 1 e- Cy s—Gly—Pro-Asp—Ser-Ala—Leu— (Z) One Arg—His-I1e—Gly—Thr—Asp-Cys
( i ) (i)
〔式中、 （W) は、 Va l— G l u— Pr o— Va l— As p、 G l u— P r o - V a 1 - A s p , P r o— Va l— As p、 Va l— As p、 または As pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) と （Y) は、 互いに 異なる、 又は同一の、 As n、 G l n、 S e r, A l a, または G l yのいずれ かのァミノ酸残基を、 （Z) は、 Va 1、 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残 基を示す。 〕 で表されるアミノ酸配列からなるトロンボモジュリ ンを有効成分と する医薬組成物を血液体外循環回路用内に注入することを特徴とする血液体外循 環回路の血液凝固防止方法に関する。 [Wherein (W) is Va l—G lu—Pro—Va—Asp, Glu—Pro—Va 1—Asp, Pro—Val—Asp, Val—As (X) and (Y) are different from or the same as Asn, Gln, Ser, Ala, or Gly And (Z) represents an amino acid residue of either Va 1 or A 1a. A method for preventing blood coagulation in an extracorporeal blood circulation circuit, comprising injecting a pharmaceutical composition containing thrombomodulin having the amino acid sequence represented by the formula (1) as an active ingredient into an extracorporeal blood circulation circuit.
トロンボモジュリ ンは、 種々のものが知られているが、 もともと血管内皮細 胞上に発現している糖蛋白質であり、 トロンビンと特異的に結合し卜ロンビンの 抗凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロティン C活性化能を著しく促進 するコファクタ一活性を有している物質として発見された。 同様なコファクター 活性を有する物質を、 本発明においては、 同じく トロンボモジュ リ ンと呼ぶ。 本 発明者らは、 遺伝子工学的手法を用いてヒ ト肺 c DNAライブラリーから、 シグ ナルぺプチドを含むヒ 卜 トロンボモジユリ ン前駆体の遺伝子をクローニングし、 そしてトロンボモジュリ ンの全遺伝子配列を解析し、 シグナルべプチドを含む 5 75残基のァミノ酸配列を明らかにしている （特開平 1— 62 1 9号公報） 。  Although various types of thrombomodulin are known, thrombomodulin is a glycoprotein originally expressed on vascular endothelial cells, and specifically binds to thrombin to inhibit the anticoagulant activity of thrombin and at the same time to inhibit thrombin protein. It was discovered as a substance with cofactor activity that significantly promotes C-activating ability. In the present invention, a substance having a similar cofactor activity is also called thrombomodulin. The present inventors cloned a human thrombomodulin precursor gene containing a signal peptide from a human lung cDNA library using a genetic engineering technique, and then sequenced the entire gene sequence of thrombomodulin. The analysis revealed an amino acid sequence of 575 residues including a signal peptide (JP-A-1-6219).
また、 この特開平 1 - 62 1 9号公報においては、 膜結合部位を削除した可 溶型のぺプチドを開示するとともに、 これらの全長トロンボモジュリンを含む種 々のトロンボモジュリンを人工血管、 人工臓器、 カテーテルなどの医用人工材料 に結合させる旨についても開示されている。  Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-6219 discloses a soluble peptide from which a membrane-binding site has been deleted and various thrombomodulins including these full-length thrombomodulins can be used as artificial blood vessels, artificial organs, and catheters. It is also disclosed that it is bonded to medical artificial materials such as.
シグナルべプチドが切断されたトロンボモジュリンは、 N末端側より N末端 領域 （ドメイン 1 ) 、 6つの EGF様構造をもつ領域 （ドメイ ン 2) 、 0型糖鎖 付加領域 （ ドメイ ン 3 ) 、 膜貫通領域 （ドメイン 4 ) そして細胞質内領域 （ドメ イ ン 5) の 5つの領域から構成されており、 そしてトロンボモジュリ ンの最小活 性単位は、 6つの EG F様構造をもつ領域 （ドメイン 2) の中の N末端側から 4 、 5、 6番目であることが知られている 〔M. Z u s h iら、 J. B i o l . C h em. , 264, 1 035 1 - 1 0353 ( 1 989) , 特開平 5— 21 39 98号公報〕 。 また類似のトロンボモジュリンも知られている （特開平 2— 25 5699号公報、 特開平 5— 3 1 0787号公報） 。 細胞外領域 （ ドメイ ン 1、 ドメイン 2、 およびドメイン 3 ) のみからなるトロンボモジュリ ンは、 組換え技 術の応用により取得できること、 そしてその組換え体トロンボモジュリンは、 天 然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている。 Thrombomodulin from which the signal peptide has been cleaved has an N-terminal region (domain 1), a region with six EGF-like structures (domain 2), a 0-type sugar chain from the N-terminal side. It consists of five regions: an additional region (domain 3), a transmembrane region (domain 4), and a cytoplasmic region (domain 5). The minimum active unit of thrombomodulin is six EGF-like units. It is known to be the fourth, fifth, and sixth positions from the N-terminal side in the structural region (domain 2) [M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 264, 1035 1-1 0353 (1 989), Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-213998]. Similar thrombomodulins are also known (JP-A-2-255699, JP-A-5-310787). Thrombomodulin consisting only of extracellular regions (domain 1, domain 2, and domain 3) can be obtained by applying recombinant technology, and the recombinant thrombomodulin has the activity of natural thrombomodulin. Has been confirmed.
本発明において、 トロンボモジュリ ンとは、 トロンビンによるプロテイン C の活性化を促進させる性質を有するものであり、 少なく ともアミ ノ酸配列として 、 式 （ 1 ) で表されるァミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリ ンは、 こ のトロンビンによるプロテイン Cの活性化を促進させる性質を勿論有している。  In the present invention, thrombomodulin has the property of promoting the activation of protein C by thrombin, and at least the amino acid sequence of the present invention comprising an amino acid sequence represented by the formula (1) is used as the amino acid sequence. Thrombomodulin naturally has the property of promoting the activation of protein C by thrombin.
式 （ 1) 中の （W) は、 Va l— G l u - P r o - Va l— As p、 G 1 υ -Pr o-Va l -As p. P r o— Va l— As p、 Va l— As p、 または A s pの何れかのぺプチド残基またはァミノ酸残基のいずれであっても、 （W) の部分のァミノ酸配列は、 公知である天然のトロンボモジュリンのアミノ酸配列 の部分配列と一致し、 本発明のトロンボモジュリ ンとしては、 式 （ 1 ) 中の （W) は上述に記載したいずれであってもかまわないが、 特に V a l -G l u-P r o 一 Va l— As p、 または As pが好ましい。  (W) in the equation (1) is Va l—G lu -Pro-Val—As p, G 1 υ -Pro-Val-As p. — Regardless of the peptide residue or amino acid residue of either Asp or Asp, the amino acid sequence of (W) is a partial sequence of the amino acid sequence of a known natural thrombomodulin. (W) in the formula (1) may be any of those described above, and in particular, Val-GluPro-Val-Asp, Or Asp is preferred.
式 （ 1 ) 中の、 （X) および （Y) は互いに異なる、 叉は同一の、 A s n、 G l n、 S e r、 A l a. または G l yのいずれかであってもよい。 好ましくは 、 天然のトロンボモジュリンのアミノ酸配列の部分配列と同一のアミノ酸、 すな わち （X) および （Y) がともに A s nである式 （ 1 ) に記載のァミノ酸配列か らなる本発明のトロンボモジュリ ンが好ましい。 式 （ 1 ) 中の （Z ) は、 V a 1、 A 1 aのどちらであってもよいか、 V a 1 であることが好ましい。 In the formula (1), (X) and (Y) may be different from each other or may be any one of Asn, Gln, Ser, Ala. And Gly. Preferably, the present invention comprises the amino acid sequence according to the formula (1), wherein the same amino acid as the partial sequence of the amino acid sequence of natural thrombomodulin, that is, both (X) and (Y) are Asn. Thrombomodulin is preferred. (Z) in the formula (1) may be either Va1 or A1a, or is preferably Va1.
また、 本発明のトロンボモジュリンは、 糖鎖を含んでいても含まなくてもよ い。  The thrombomodulin of the present invention may or may not contain a sugar chain.
本発明のトロンボモジユリンは、 血液体外循環回路内での血液凝固を有効に 防止し、 血液の流動性が低下することはなく、 血液体外循環回路内の血液凝固防 止のための医薬組成物たりえることが確認された。  The thrombomodulin of the present invention effectively prevents blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit, does not reduce blood fluidity, and prevents blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit. It was confirmed that it was possible.
血液体外循環とは、 血液が生体内から体外へと人工血流路により導き出され 、 一定の処置を行う装置、 例えば人工心肺装置、 血液浄化装置等を経て、 生体内 に再送入する循環回路からなるものであって、 シャントゃ人工血管等のように恒 常的に体内に移植する医用器材とは異なり、 一時的に処置されるものであって、 特に血液浄化療法の際に用いられる血液透析においては、 定期的な処置毎に、 ま たは必要に応じて、 体外循環回路の設置、 取り外しを繰り返すものである。 前述 の血液浄化装置としては、 人工腎臓が典型的な例として挙げられ、 その他に、 血 漿交換装置、 免疫吸着装置等も挙げられる。  Blood extracorporeal circulation is a circuit in which blood is guided out of the living body to the outside of the body by an artificial blood flow path and is re-introduced into the living body through a device that performs a certain treatment, such as an artificial heart-lung machine, a blood purification device, and the like. Unlike medical devices that are permanently implanted in the body, such as shunts and artificial blood vessels, they are treated temporarily and are used for hemodialysis, especially in blood purification therapy. , The installation and removal of the extracorporeal circulation circuit is repeated at regular intervals or as necessary. A typical example of the aforementioned blood purification device is an artificial kidney, and in addition, a plasma exchange device, an immunoadsorption device, and the like.
したがって、 体外循環回路を設置させた患者は、 その回路を用いる場合にの み血液凝固の問題を抱くのであって、 常時、 血液凝固を防止しなければならない 患者とは異なることが多いものである。  Therefore, patients who have an extracorporeal circuit have blood clotting problems only when using the circuit, and are often different from patients who must always prevent blood clotting. .
上述の従来公知のいずれのトロンボモジュリンも全て同様に、 血液体外循環 回路用の血液凝固防止のための医薬組成物として都合よく使用し得るかについて は、 従来全く予想されないものであって、 本発明によれば、 本発明のトロンボモ ジユリ ンが、 通常の卜ロンボモジュリン （ドメイン 1、 ドメイン 2、 およびドメ イン 3からなる トロンボモジュリン） に比べ、 血液体外循環終了後の止血の処置 や注意が明らかに少なくて済むものであるという極めて特徴的な性質であること を確認した。  Similarly, it is not expected at all that any of the above-mentioned conventionally known thrombomodulins can be conveniently used as a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for a blood extracorporeal circuit. According to the results, the thrombomodulin according to the present invention has significantly less treatment for hemostasis after blood extracorporeal circulation and less attention than the normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3). It was confirmed that this was a very characteristic property that it could be completed.
本発明の実施例に示した如く、 力二クイザル体外循環モデルにおいて、 その 血液体外循環回路内の血液凝固を防止するために、 通常のトロンボモジュ リ ン （ ドメイン 1、 ドメイン 2、 およびドメイン 3からなる ト口ンボモジュ リ ン） を用 いた場合、 体外循環終了後も長く、 血液中には、 その血液凝固抑制活性が残存し ており、 したがって、 通常のトロンボモジュリンを血液体外循環回路の血液凝固 防止に用いた場合には、 その体外循環終了後も長く、 出血の注意を必要としなけ ればならないと考えることができる。 ところ力、 本発明の式 （ 1 ) に示されるァ ミ ノ酸配列からなるトロンボモジュリンを用いた場合、 血液体外循環回路内の血 液凝固を有効に防止するが、 その体外循環終了後の血液中には血液凝固抑制活性 が認められなかった。 したがって、 体外循環終了後の止血等のための特別な観察 や処置が殆どいらないことを意味する。 As shown in the examples of the present invention, In order to prevent blood clotting in the extracorporeal circulation circuit, the use of normal thrombomodulin (a tombomodulin consisting of domain 1, domain 2 and domain 3) is long even after the end of extracorporeal circulation. Its anticoagulant activity remains in the blood, so if normal thrombomodulin is used to prevent blood coagulation in the extracorporeal circulation circuit, it will be long after the end of extracorporeal circulation and caution must be exercised for bleeding We can think that it must be done. However, when thrombomodulin having the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention is used, blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit is effectively prevented. Did not show any blood coagulation inhibitory activity. Therefore, it means that there is almost no need for special observation or treatment for hemostasis after the end of extracorporeal circulation.
上記の点とは別に、 本発明のトロンボモジュ リ ンは、 通常のトロンボモジュ リ ンとは異なる性質を有することを見い出した。 通常のトロンボモジュリ ンは、 血栓溶解物質であるティシュ 'プラスミノゲンァクチべ一ター （ t 一 P A ) のフ イブリ ン （血栓） 溶解の阻害作用があり、 この線溶阻害作用は、 通常のトロンボ モジュリ ンとトロンビンの複合体による、 血漿中のカルボキシぺプチダ一ゼ Bの 活性化を介したものであると考えられている。 何らかの原因にて微小な血栓が生 ずることは健常人においても考えられ、 通常は生体が有する線溶機構により除去 されていると考えられる。  Apart from the above points, it has been found that the thrombomodulin of the present invention has different properties from ordinary thrombomodulin. Ordinary thrombomodulin has an inhibitory effect on the dissolution of fibrin (thrombosis) of tissue thrombolytic substance tissue's plasminogen activator (t-PA). It is thought to be mediated by the activation of carboxypeptidase B in plasma by a complex of thrombin and thrombin. The occurrence of microthrombi for some reason is also considered in healthy individuals, and is usually considered to have been eliminated by the fibrinolytic mechanism of the living body.
一旦何らかの原因にて血栓が生じた状況において、 線溶阻害作用を有する薬 剤を使用していた場合には、 理論的には、 血栓が除去され得ないのであって、 何 らかの特別な処置を必要とし、 まして、 血栓溶解物質であるティシュ · プラスミ ノゲンァクチべ一ター （ t - P A ) 等により治療されている重篤な血栓症患者に 血液体外循環を行う場合に、 線溶阻害作用を有する血液体外循環回路用の血液凝 固防止のための医薬組成物を用いる場合には、 やはり何らかの特別な処置や観察 を必要とする不便さがある。  Once a thrombus has been formed for some reason and a drug that has a fibrinolytic inhibitory effect has been used, it is theoretically impossible for the thrombus to be removed. In the case of performing extracorporeal blood circulation in patients with severe thrombosis who are required to be treated and further treated with thrombolytic substance Tissue plasminogen activator (t-PA), etc. When a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for use in extracorporeal blood circulation circuits is used, there is still a disadvantage that some special treatment or observation is required.
しかしながら、 本発明の式 （ 1 ) で表されるァミノ酸配列からなる トロンボ モジュリンは、 通常のトロンボモジュリンとは異なり、 特別な処置や観察が不可 欠となる原因となる、 線溶阻害作用が認められなかった。 実施例に示すように、 通常のトロンボモジユリは、 血栓溶解物質である t—PAのフイブリ ン （血栓） 溶解の阻害作用があるのに対し、 本発明のトロンボモジュリンは、 その作用は全 く見られなかった。 However, a thrombo comprising the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention Modulin, unlike normal thrombomodulin, did not show a fibrinolytic inhibitory effect, which would require special treatment or observation. As shown in the Examples, ordinary thrombomoduli have an inhibitory effect on the dissolution of fibrin (thrombosis) of t-PA, a thrombolytic substance, whereas the thrombomodulin of the present invention has no effect on thrombomodulin. I couldn't.
以上のように、 本発明のトロンボモジュリンは、 他の薬剤、 あるいは通常の 卜ロンボモジュリの問題点を悉く クリア一し、 体外循環終了後の出血等の観察が 生じないという予想外の効果を示すものである。  As described above, the thrombomodulin of the present invention clears all the problems of other drugs or the usual thrombomodulin, and exhibits an unexpected effect of not observing bleeding after the end of extracorporeal circulation. is there.
本発明のトロンボモジュリ ンを調製するには、 公知の方法、 すなわち遺伝子 組換え技術、 またはペプチド合成技術を用いることにより、 製造することができ る。 通常は、 遺伝子組換え技術を用いて製造することが望ましい。  The thrombomodulin of the present invention can be produced by a known method, that is, by using a gene recombination technique or a peptide synthesis technique. Normally, it is desirable to produce using genetic recombination technology.
遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、 クロ一ニングさ れており、 そしてトロンボモジュリン、 さらには本発明のトロンボモジュリ ンの ようなトロンボモジュ リ ン断片物もまた、 遺伝子組換え技術を用いた製造例が開 示されており、 さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている （特開 平 1— 62 1 9号公報、 特開平 2— 255699号公報、 特開平 5— 2 1 399 8号公報、 特開平 5 - 3 1 0787号公報、 特開平 7 - 1 55 1 76号公報、 J . B i o l . Ch em. ， 264, 1 035 1 - 1 0353, 1 98 9) 。  The gene for thrombomodulin used in the gene recombination technique has been cloned, and thrombomodulin, and also thrombomodulin fragments such as the thrombomodulin of the present invention, are also produced by the production method using the gene recombination technique. And a purification method for obtaining the purified product are also known (JP-A-1-6219, JP-A-2-255699, JP-A-5-21399). 8, JP-A-5-310787, JP-A-7-155176, J. Biol. Chem., 264, 10351-1103353, 1989).
従って、 本発明のトロンボ乇ジュリンは、 上記の報告に記載されている方法 を用いることにより、 あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造する ことができる。 例えば、 特開平 1一 62 1 9号公報では、 全長のト口ンボモジュ リ ンをコ一ドする DN Aを含むプラスミ ド p S V 2 TMJ 2を含む、 E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 s t r a i n DH 5 (ATC C 寄託番 号 67283号） を開示しているが、 本出願人は、 再度、 同じ菌株 （E s c h e r i c h i a c o l i DH 5/p S V 2 TMJ 2) を日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番 3号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託 した。 寄託日は平成 8年 6月 1 9日であり、 受託番号は FERM BP— 557 0である。 この全長のトロンボモジュリンをコードする DNAを原料として、 公 知の遺伝子操作技術によって、 本発明のトロンボモジュリ ンを調製することがで きる。 Accordingly, the thrombodulin of the present invention can be produced by using the method described in the above report or by following the method described therein. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-16219 discloses that Escherichiacoli K-12 strain DH5 (ATC) containing plasmid p SV2TMJ2 containing DNA encoding full-length tombomodulin. C Deposit No. 67283), the applicant again made the same strain (Escherichiacoli DH5 / p SV2 TMJ 2) in 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposited at the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan did. The deposit date is June 19, 1996, and the deposit number is FERM BP-5557. Using the DNA encoding this full-length thrombomodulin as a raw material, the thrombomodulin of the present invention can be prepared by known gene manipulation techniques.
従来技術である部位特異的変異の手法により、 ある D N A中の任意の塩基配 列領域のみを削除したり、 また、 ある DNA中の任意の塩基を他の異なる塩基に 置換することができる。 例えば、 Ml 3ベクターを用いた部位特異的変異の手法 を用いて、 ある DN A中の任意の塩基配列領域のみを削除せしめたい場合には、 その削除せしめたい塩基配列領域を含む DN A断片がプラスミ KM— 1 3mp 1 8、 もしくは M— 1 3mp 1 9に挿入された組換え体プラスミ ドを得、 該プラス ミ ドのシングルストランド （一本鎖） DNAに、 5' 末端をリン酸化した、 削除 せしめる塩基配列領域の両端の塩基配列を直接に結合せしめた塩基配列に対して 相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド （以下、 デリーターと称す） と M 一 1 3プライマー （ユニバーサルプライマ一、 宝酒造社製、 カタログ番号 383 1 ) をァ二一ルさせる。  By a conventional site-specific mutation technique, it is possible to delete only an arbitrary base sequence region in a certain DNA, or to replace an arbitrary base in a certain DNA with another different base. For example, when it is desired to delete only an arbitrary nucleotide sequence region in a certain DNA using a site-directed mutagenesis method using an Ml3 vector, a DNA fragment containing the nucleotide sequence region to be deleted is obtained. Recombinant plasmid inserted into plasmid KM-13mp18 or M-13mp19 was obtained, and the single-stranded (single-stranded) DNA of the plasmid was phosphorylated at the 5 'end. An oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence directly linked to the base sequences at both ends of the base sequence region to be deleted (hereinafter referred to as “deleter”) and an M-13 primer (Universal Primer, Takara Shuzo Co., Ltd.) Made, catalog number 383 1).
次いで、 E. c 01 i DNAポリメラーゼ Iと T 4 DNAリガ一ゼを加え ることにより、 削除せしめる塩基配列領域のみが一本鎖 DNAのループ状となつ た、 二本鎖の環状 DNAをその反応液中に形成させる。 上記の二本鎖の環状 DN Aを含む反応液を E. c 01 i JM1 05 (フアルマシア社製、 カタログ番号 27 - 1 550 ) に加え、 寒天培地上にプラークを形成させ、 次いで32 Pでラベ ル化した上記のデリー夕一を用いてプラークハイプリダイゼ一ションをすること により、 目的の塩基配列からなる DN A断片が挿入されている組換え体プラスミ ドを含むクローンを選択することができる。 Then, by adding E.c01i DNA polymerase I and T4 DNA ligase, the double-stranded circular DNA in which only the base sequence region to be deleted becomes a single-stranded DNA loop was reacted. Form in liquid. The above two E. The reaction mixture containing a cyclic DN A strand c 01 i JM1 05 (Pharmacia Inc., Cat. No. 27 - 1 550) was added to allow for plaque formation on an agar medium, then with 32 P label By performing plaque hybridization using the above-mentioned modified Delhi, a clone containing a recombinant plasmid into which a DNA fragment comprising the target nucleotide sequence has been inserted can be selected. .
また、 ある DN A中の任意の塩基を他の異なる塩基に置換した DN Aを得る 場合には、 上記のデリー夕一の代わりに、 置換せしめたい塩基が目的の塩基に置 換してある、 置換せしめたい塩基の前後の塩基配列に対して相補的な塩基配列か らなるオリゴヌクレオチド （以下、 ミユーテ一ターと略する） を用いればよい。 部位特異的変異の手法の応用により、 2箇所以上の任意の塩基配列領域を削除し たり、 あるいは 2箇所以上の任意の塩基を他の異なる塩基に置換したりすること もできる。 When obtaining a DNA in which any base in a certain DNA is replaced with another different base, the base to be replaced has been replaced with the target base instead of the above-mentioned Delhi. Is the base sequence complementary to the base sequence before and after the base to be replaced? Oligonucleotides (hereinafter abbreviated as “mutator”) may be used. By applying the technique of site-specific mutation, two or more arbitrary base sequence regions can be deleted, or two or more arbitrary bases can be replaced with other different bases.
特開平 1 — 6 2 1 9号公報を参考として、 前述の全長のトロンボ乇ジュ リ ン をコードする DN Aを出発材料として、 上記に説明した部位特異的変異の手法を 用い、 （W) 力、 V a 1— G 1 u— P r 0— V a 1 — A s pであり、 （X) と （ Y) がともに A s nであり、 （Z) が V a 1である式 （ 1 ) に記載のァミノ酸配 列からなる本発明のトロンボモジュリ ンをコ一ドする DNAを作成すればよく、 例えば、 以下の方法が挙げられる。 全長のトロンボモジュリンをコードする DN Aをファージ M— 1 3mp 1 9に挿入した、 組換え体プラスミ ドを得、 続いて、 該プラスミ ドのシングルストランド DNAに、 5' 末端をリ ン酸化した配列番号 4の 1 _ 2 5の塩基配列からなるデリ夕一ターと M— 1 3プライマー （ュニバー サルプライマ一、 宝酒造社製、 カタログ番号 3 8 3 1 ) をァニールさせ、 さらに 続いて、 E. c o l i DNAポリメラ一ゼ I と T 4 DNAリガ一ゼを加えて、 その混合物中に組換え体プラスミ ドを生成させる。 その混合物を E. c 0 1 i JM 1 0 5 (フアルマシア社製、 カタログ番号 2 7 - 1 5 5 0 ) に加え、 寒天培 地上にプラークを形成させ、 32Pでラベル化した配列番号 4の i一 25の塩基配 列からなるオリゴヌクレオチドを用いてプラークハイプリダイゼ一ションをする ことにより、 所望の組換え体プラスミ ドを含むクローンを選択する。 With reference to JP-A-1-62219, using the above-described DNA encoding full-length thrombodulin as a starting material, the site-directed mutagenesis method described above was used to obtain (W) , V a1 — G 1 u — P r0 — V a1 — Asp, where (X) and (Y) are both A sn and (Z) is V a 1 What is necessary is just to prepare a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention comprising the described amino acid sequence, and for example, the following method can be mentioned. Recombinant plasmid in which DNA encoding full-length thrombomodulin was inserted into phage M-13mp19 was obtained. Subsequently, a single-strand DNA of the plasmid was phosphorylated at the 5 'end to obtain a sequence number. A primer consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of 4 and an M-13 primer (Universal Sal Primer, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., catalog number 3831) were annealed, followed by E. coli DNA polymerase. Add recombinant I and T4 DNA ligase to produce recombinant plasmid in the mixture. The mixture was added to E. c 0 1 i JM 105 (manufactured by Pharmacia, catalog No. 27-155), a plaque was formed on the agar medium, and 32 P-labeled SEQ ID NO: 4 A clone containing the desired recombinant plasmid is selected by plaque hybridization using an oligonucleotide consisting of i-125 base sequences.
このようにして得られた組換え体プラスミ ドには、 天然の全長のトロンボモ ジュリ ンからトロンボモジュリ ンのドメイン 3、 ドメイン 4、 およびドメイン 5 をコードする DN A領域を削除した DN A ( ドメイ ン 1 と ドメイ ン 2からなる ト ロンボモジュリ ンをコードする DNA) を含有する。 続いて、 デリ夕一夕一とし ては配列番号 5の 1— 25の塩基配列からなるデリ夕一夕一を用いて、 上記で調 製した組換え体プラスミ ド中に含有されているドメイン 1 と ドメイン 2からなる トロンボモジユリ ンをコードする D N Aからドメイン 1 と ドメイン 2の一部をコ —ドする DNAを削除することにより、 （W) が Va 1 一 G 1 υ -P r o -Va 1 一 A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が Va 1であ る式 （ 1 ) に記載のァミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジユリンをコ一ド する DNAを含有する組換え体プラスミ ドを作成することができる。 The recombinant plasmid obtained in this manner includes a native full-length thrombomodulin from which the DNA regions encoding the thrombomodulin domains 3, 4, and 5 have been deleted (Domain 1). And DNA encoding thrombomodulin comprising domain 2). Subsequently, using the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 5 as the nucleotide sequence in the recombinant plasmid prepared above, the domain 1 contained in the recombinant plasmid prepared above was used. And consists of domain 2 By removing the DNA encoding domain 1 and part of domain 2 from the DNA encoding thrombomodulin, (W) is Va 1 -G 1 υ -Pro -Va 1 -A sp , (X) and (Y) are both A sn and (Z) is Va 1, which contains a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention, which comprises the amino acid sequence of the formula (1) according to the formula (1). A recombinant plasmid can be prepared.
また、 特開平 5 - 3 1 07 8 7号公報を参考として、 ミューテ一夕一を用い て、 天然のト口ンボモジュリンのァミノ酸配列の中でひとつのァミノ酸が置換さ れた、 変異型のトロンボモジユリ ンをコ一ドする DN Aを作成することができる 。 例えば、 （Z) が V a 1である式 （ 1 ) に記載のァミ ノ酸配列からなる本発明 のトロンボモジュリ ンをコードする上記の DNAから、 例えば、 （Z) が A 1 a である式 （ 1 ) に記載のァミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリ ンをコ ―ドする DN Aにするためには、 ミュ一テ一夕一として配列番号 8の 1 一 2 1の 塩基配列からなるミュ一テ一ターを用いればよい。  Also, with reference to Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-3108787, a mutant type in which one amino acid was substituted in the amino acid sequence of natural tombomodulin using mutes all over the world was used. A DNA encoding thrombomodulin can be created. For example, from the above-mentioned DNA encoding the thrombomodulin of the present invention consisting of the amino acid sequence according to the formula (1) wherein (Z) is Va1, for example, the formula wherein (Z) is A1a In order to obtain a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence described in (1), a mutagenesis sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is required. It is only necessary to use one meter.
このように、 部位特異的変異の手法を用いることにより、 式 （ 1 ) 中の （W) が V a 1 - G 1 υ - P r o - V a 1 -A s p, G 1 u - P r o - Va 1— A s p 、 P r o— Va l — A s p、 Va l — A s p、 または A s pのいずれかのぺプチ ド残基またはァミノ酸残基であっても、 また （X) や （Y) が A s n、 G 1 n、 S e r、 A l a、 または G l yのいずれかのァミノ酸残基であっても、 またさら には （Z) が Va 1 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残基であっても、 本発明 のトロンボモジュリンをコードする DNAを作成することができる。 また、 部位 特異的変異の手法を用いることなく、 有機化学合成によっても、 本発明のトロン ボモジュリ ンをコ一ドする DN Aを得ることができる。  Thus, by using the site-directed mutagenesis method, (W) in the formula (1) can be expressed as V a1 -G 1 υ -P ro -V a 1 -A sp, G 1 u- Va 1—Asp, Pro—Val—Asp, Val—Asp, or any of the peptide or amino acid residues of Asp, or (X) or (Y ) Is an amino acid residue of any of A sn, G1n, Ser, Ala, or Gly, and (Z) is an amino acid residue of either Va1 or A1a. Even with an acid residue, a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention can be prepared. Further, the DNA encoding the thrombomodulin of the present invention can be obtained by organic chemical synthesis without using a site-specific mutation technique.
本発明のトロンボモジユリ ンをコ一ドする DN Aは、 特開平 1— 6 2 1 9号 公報に代表される公知の方法にて、 複製可能な発現ベクターと結合せしめて、 複 製可能な組換え体 DNAとなすことができる。 さらに、 該組換え体 DNAは、 そ れによつて形質転換された微生物または細胞中で、 所望のぺプチドを発現させ、 その培養物またはその培養上澄液から所望のぺプチドを得ることができる。 The DNA encoding the thrombomodulin of the present invention can be replicated by linking it to a replicable expression vector by a known method typified by JP-A-1-62119. It can be recombinant DNA. Further, the recombinant DNA expresses a desired peptide in a microorganism or cell transformed thereby, The desired peptide can be obtained from the culture or the culture supernatant.
微生物または細胞を形質転換させる該組換え体 D N Aにおいて、 本発明のト ロンボモジュ リ ンをコードする D N Aの 5 ' 末端側にシグナルぺプチドをコ一ド する D N Aを接続することにより、 所望のペプチド、 すなわち本発明のトロンボ モジュリ ンは、 分泌された形態で、 その培養上澄液中から得ることができる。  In the recombinant DNA for transforming a microorganism or a cell, by connecting a DNA encoding a signal peptide to the 5 ′ end of the DNA encoding the thrombomodulin of the present invention, a desired peptide, That is, the thrombomodulin of the present invention can be obtained in a secreted form from the culture supernatant.
形質転換された微生物または細胞中で、 シグナルべプチドを N末端側に付加 されたペプチドからシグナルペプチドが切断されるか、 その切断は、 その微生物 または細胞の培養条件により、 所望の位置で切断されないこともありえるので、 そのような場合にはシグナルぺプチドとしては、 公知である天然のトロンボモジ ュリ ン由来のシグナルべプチドでなく ともよい。 例えば、 天然のトロンボモジュ リ ンのシグナルぺプチドょり 2っァミ ノ酸が少ない、 配列番号 3の 1 一 1 6のァ ミノ酸配列からなるシグナルべプチドをコ一ドする塩基配列を用いることができ る。 また、 その具体的な塩基配列としては配列番号 6の 1 - 4 8の塩基配列が例 示される。  In a transformed microorganism or cell, a signal peptide is cleaved from a peptide with a signal peptide added to the N-terminal side, or the cleavage is not cleaved at a desired position depending on the culture conditions of the microorganism or cell. In such a case, the signal peptide may not be a known natural thrombomodulin-derived signal peptide in such a case. For example, use a nucleotide sequence that encodes a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 116 of SEQ ID NO: 3, which has a small amount of the signal peptide of natural thrombomodulin. be able to. The specific nucleotide sequence is exemplified by the nucleotide sequence of 1-48 of SEQ ID NO: 6.
遺伝子組換え技術を用い、 本発明のトロンボモジュ リ ンが発現するように形 質転換した細胞の培養物、 またはその細胞の培養上澄液中に含まれる本発明のト ロンボモジュリ ンを精製するには、 一般的なタンパク質の精製方法、 例えば、 硫 安沈澱、 各種のカラムクロマトグラフィー （イオン交換カラムクロマトグラフィ 、 ァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーなど） 等を用いることにより、 その 精製品を取得することができる。 また、 公知の方法、 例えば、 特開平 1 — 6 2 1 9号公報の実施例 1 7に記載の方法である、 D I P— 卜ロンビン （ジイソプロピ ルホスホロ トロンビン） ァガロースクロマトグラフィ一により精製することがで きる。 また、 特開平 5 - 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 8に記載の方法である、 抗 卜ロンボ乇ジュ リン抗体カラムクロマトグラフィ一により精製できることも知ら れている。  To purify the thrombomodulin of the present invention contained in a culture of cells transformed to express the thrombomodulin of the present invention or a culture supernatant of the cells using a gene recombination technique. The purified product can be obtained by using a general protein purification method, for example, ammonium sulfate precipitation, various column chromatography (ion exchange column chromatography, affinity column chromatography, etc.). . Further, it can be purified by a known method, for example, DIP-thrombin (diisopropylphosphorothrombin) agarose chromatography, which is a method described in Example 17 of JP-A-1-62219. Wear. It is also known that the antibody can be purified by anti-trombodulin antibody column chromatography, which is the method described in Example 8 of JP-A-5-213998.
式 （ 1 ) のアミノ酸配列からなる本発明のト口ンボモジュリンを血液体外循 環時における体外回路内の血液凝固防止薬として用いる際には、 薬剤として一般 的に用いられる適当な担体叉は媒体、 例えば滅菌水や生理食塩水、 ショ糖やマン 二トール、 植物油、 無害性有機溶媒等、 さらには必要に応じて賦形剤、 着色剤、 乳化剤、 安定化剤または保存剤等と適宜組み合わせることができる。 すなわち、 上記における血液凝固を防止するのに、 有効な量の本発明のトロンボモジュリン を適当な量の担体叉は媒体と混ぜて、 血液体外循環用回路内に、 または患者に効 果的に投与するのに適した医薬組成物を調製することができる。 通常、 凍結乾燥 を行うことも好ましく、 その場合には、 用時溶解して用いることができる。 The extracellular blood circulation of the present invention comprising the amino acid sequence of formula (1) When used as an anticoagulant in the extracorporeal circuit during a cycle, a suitable carrier or medium generally used as a drug, such as sterile water or saline, sucrose or mannitol, vegetable oil, or harmless It can be appropriately combined with an organic solvent and the like, and if necessary, an excipient, a colorant, an emulsifier, a stabilizer or a preservative. That is, an effective amount of the thrombomodulin of the present invention is mixed with an appropriate amount of a carrier or medium to prevent blood coagulation as described above, and is effectively administered to a circuit for extracorporeal blood circulation or to a patient. A suitable pharmaceutical composition can be prepared. Usually, freeze-drying is also preferred, in which case it can be dissolved and used before use.
本発明の医薬組成物は、 従来技術で説明した医用器材に固定化させることな く、 組成物として血液体外循環用回路内に、 または患者に投与するものである。 本発明の医薬組成物は、 血液体外循環用回路内に、 またはペプチド医薬が一般に 使用されている投与法、 すなわち、 非経口投与法、 例えば、 静脈内投与、 筋肉内 投与、 皮下投与などによって投与することが望ましく、 通常は、 血液体外循環用 回路内に直接投与することが特に好ましい。 また場合によっては、 経口投与、 直 腸内投与、 鼻内投与、 舌下投与することも可能である。 血液体外循環用回路内に 直接投与する場合には、 血液を体外に導き出す循環用回路の出来るだけ体内に近 い部位において投与することが好ましいが、 血液透析等においては、 通常設けら れている注入口が利用できる。  The pharmaceutical composition of the present invention is to be administered as a composition into a circuit for extracorporeal blood circulation or to a patient without being immobilized on medical equipment described in the prior art. The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a circuit for extracorporeal blood circulation or by an administration method in which a peptide drug is generally used, that is, a parenteral administration method, for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration and the like. It is particularly preferable to administer the drug directly to the blood extracorporeal circuit. In some cases, oral, rectal, nasal, and sublingual administration is also possible. When administering blood directly into the circuit for extracorporeal circulation, it is preferable to administer it at a site as close to the body as possible in the circuit for circulation that leads blood out of the body.However, it is usually provided in hemodialysis etc. Inlet is available.
本発明の医薬組成物は、 1回の血液体外循環施行にあたり、 1回または必要 に応じて数回に分割して、 一度にあるいは持続的に投与される。 また、 血液体外 循環施行時間が 2 4時間 （一日） 以上を要する場合には、 一日あたり、 1回また は必要に応じて数回に分割して、 一度にあるいは持続的に投与される。 また、 通 常、 血液体外循環施行開始直前に、 体外循環回路内へ適量を一括投与し、 引き続 いて血液体外循環施行中に、 血液凝固を防止し得る適量を持続注入をすることが 好ましい。 例えば透析においては、 透析開始直前に、 体外循環回路内へ、 0 . 5 〜 7 m gを一括投与し、 引き続いて透析施行中に、 1〜7 m g Z h rの持続注入 を行うことが例示される。 The pharmaceutical composition of the present invention is administered once or continuously in one blood extracorporeal circulation once or divided into several times as necessary. If the extracorporeal blood circulation time is more than 24 hours (one day), it is administered once a day or divided into several times as needed, once or continuously. . In addition, usually, it is preferable to administer an appropriate amount at once into the extracorporeal circulation circuit immediately before the start of extracorporeal blood circulation, and to continuously inject an appropriate amount that can prevent blood coagulation during the extracorporeal blood circulation. For example, in dialysis, immediately before the start of dialysis, 0.5 to 7 mg is administered in a lump into the extracorporeal circuit, followed by continuous infusion of 1 to 7 mg Zhr during dialysis. Is exemplified.
本発明の医薬組成物の投与量は、 1回の血液体外循環施行、 または一日あた り、 l mg〜し 0 0 Omgが好ましいが、 患者の年齢、 体重、 症状等に応じて 適宜増減することができる。  The dose of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably from 1 mg to 100 mg per day after performing extracorporeal blood circulation or once a day, but it may be appropriately increased or decreased according to the patient's age, body weight, symptoms, etc. can do.
式 （ 1 ) のアミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリンは血液凝固を 防止する作用を有するので、 本発明の医薬組成物は、 血液体外循環回路の血液凝 固防止のため以外の方法として、 種々の血栓症の治療や予防をすることも期待で きる。 また輸血用血液の凝固防止薬として用いることもできる。 更に、 式 （ 1 ) のァミ ノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリンは、 血液中からの消失がは やく、 線溶阻害作用がないことから、 本発明の医薬組成物は、 血液体外循環以外 の場合、 例えば、 経皮経管冠動脈拡張術 （PTCA) や血栓溶解療法などのよう な血液再灌流療法時の場合などにおいても使用価値が高いと考えられる。 図面の簡単な説明 第 1図は、 E 4 5 6NNV— 1 1 4 · トロンビン複合体のプロティン C活性 化反応の速度論的解析の結果 （L i n ewe a v e r— B u r kの逆数プロッ 卜） を示す図である。 図中の Sは反応系内プロテイン C濃度を、 Vは活性化プロティ ン C生成速度を示す。  Since the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence of the formula (1) has an action of preventing blood coagulation, the pharmaceutical composition of the present invention can be used in various ways other than for preventing blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit. It can also be expected to treat and prevent thrombosis. It can also be used as an anticoagulant for blood for transfusion. Furthermore, the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence of the formula (1) is rapidly eliminated from the blood and has no fibrinolytic inhibitory action. In this case, it is considered to be highly useful, for example, in blood reperfusion therapy such as percutaneous transluminal coronary dilatation (PTCA) or thrombolysis. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the results of a kinetic analysis of the protein C activation reaction of the E456NNV-114-thrombin complex (the reciprocal plot of Lineweaver-Burk). FIG. S in the figure indicates the protein C concentration in the reaction system, and V indicates the activated protein C generation rate.
第 2図は、 通常のトロンボモジュ リ ン、 E 4 5 6 NNV— 1 1 4、 並びに E 4 5 6 NNV- 1 1 8を用いた時における、 血液体外循環中の体外回路内 の推 移を示した図である。  Fig. 2 shows the transit in the extracorporeal circuit during extracorporeal blood circulation when using a normal thrombomodulin, E455-NNV-114 and E456-NNV-118. FIG.
第 3図は、 通常のト口ンボモジュリン、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4、 並びに E 4 5 6 NNV- 1 1 8を用いた血液体外循環中の回路内血液の A PTT延長率、 並びに体外循環終了後の力二クイザル体内血液の A PTT延長率を示した結果で める o 第 4図は、 E 4 5 6 NNA— 1 1 4、 並びに E 4 5 6 NN A— 1 1 8を用い た血液体外循環中の回路内血液の A PTT延長率、 並びに体外循環終了後の力二 クィザル体内血液の A P TT延長率を示した結果である。 Fig. 3 shows the A PTT elongation rate of blood in the circuit during extracorporeal blood circulation using normal tombo modulin, E456 NNV-114, and E456 NNV-118. The results show the A PTT elongation rate of the blood in the cynomolgus monkey after the end of the circulation.o Fig. 4 shows the A PTT elongation rate of blood in the circuit during extracorporeal blood circulation using E455 NNA-114 and E456 NNA-118, and the force after termination of extracorporeal circulation. 2 These are the results showing the AP TT elongation rate of the blood of a quizal body.
第 5図は、 通常のトロンボモジュ リ ン、 並びに E 4 5 6 NNV- 1 1 4投与 後の力二クイザル血中濃度推移を示した結果である。  FIG. 5 shows the results of changes in blood concentrations of cynomolgus monkeys after administration of normal thrombomodulin and E456NNNV-114.
第 6図は、 E 4 5 6NNV— 1 1 4、 E 4 5 6 NNV- 1 1 8、 並びに E 4 5 6 SGV- 1 1 4投与後のラッ ト血中濃度推移を示した結果である。  FIG. 6 shows the results showing the changes in rat blood concentration after administration of E456NNN-114, E456NNV-118, and E456SGV-114.
第 7図は、 通常のトロンボモジュリ ン、 並びに E 4 5 6 NNV- 1 1 4の t 一 PAによるフィプリン溶解に及ぼす影響を調べた結果である。  FIG. 7 shows the results of investigating the effects of ordinary thrombomodulin and E456-NNV-114 on fibrin dissolution by t-PA.
第 8図は、 E 4 5 6 NNV— 1 1 8、 E 4 5 6 NNA— 1 1 4、 E 4 5 6 N NA- 1 1 8、 並びに E 4 5 6 S G V- 1 1 4の t— PAによるフィプリ ン溶解 に及ぼす影響を調べた結果である。  Fig. 8 shows the t-values of E4556NNV-118, E456NNA-114, E456NNA-118, and E456G SGV-114. This is the result of examining the effect of PA on fibrin dissolution.
第 9図は、 E 4 5 6 NNV— 1 1 4、 並びにフラグミ ンのラッ 卜血中 TGレ ベルに及ぼす影響をみた結果である。  Figure 9 shows the effects of E455-NNV-114 and fragmin on TG levels in rat blood.
第 1 0図は、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4、 並びにフラグミ ンのラ ッ ト血中 F F Aレベルに及ぼす影響をみた結果である。 発明の実施の態様 本発明を実施例により詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定さ れるものではない。 実施例 1  FIG. 10 shows the results of the effects of E456NNNV-114 and fragmin on rat blood FFA levels. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1
本発明のト口ンボモジュリンの発現べクタ一の構築 ( 1 ) (W) 力く、 V a 1 —G 1 u— P r 0— V a 1 — A s pであり、 （X) と (Y) がともに A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6NNV— 1 1 8) の発現ベクターの構築 Construction of expression vector of tombo modulin of the present invention (1) (W) Strongly, V a1 —G 1 u—Pr 0—V a1 —A sp, (X) and (Y) Are A sn and (Z) is V a 1 Of an expression vector for the gene (E455NNV-118)
特開平 1一 6 2 1 9号公報の参考例 3および実施例 1に記載された方法に準 じて、 プラスミ ド P SV2TMJ 2を得、 再度、 寄託をした [E s c h e r i c h i a c o l i DH 5/p SV2TMJ 2 (FER BP- 5 5 7 0 ) ] c 特開平 1 一 6 2 1 9号公報の実施例 1一 （4) 一 （a) に記載の方法に従つ て、 該プラスミ ド p SV 2TMJ 2 (FERM BP— 5 5 7 0) に含有する全 長トロンボモジュリンをコ一ドする DNAをプラスミ KM— 1 3mp 1 9 (宝酒 造社製） に揷入し、 そして配列番号 4の 1一 25の塩基配列からなるデリ一夕一 を用い、 組換え体プラスミ ド M— 1 3 TMD 3を得た。 該プラスミ M— 1 3 T MD 3は、 特開平 1— 6 2 1 9号公報の実施例 1 — (4) — (a) に記載されて いるように、 開始コ ドン （ATG) から始まる 1 8残基のァミノ酸からなる天然 のトロンボモジユリ ンのシグナルべプチドに続いて 4 6 2残基のァミノ酸からな る天然のトロンボモジュリンの部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有する D NA断片を有することを確認した。 According to the method described in Reference Example 3 and Example 1 of Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. Hei 16-219, a plasmid P SV2TMJ 2 was obtained and deposited again (Escherichiacoli DH 5 / p SV2TMJ 2 (FER BP-557 0)] c According to the method described in Example 11 (4) 1 (a) of Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 16-219, the plasmid p SV 2TMJ 2 ( The DNA encoding full-length thrombomodulin contained in FERM BP-555 / 70) is introduced into Plasmid KM-13mp19 (manufactured by Takara Shuzo), and 125 bases of SEQ ID NO: 4 A recombinant plasmid M-13 TMD3 was obtained using a deli consisting of a sequence. The plasmid M-13 TMD3 starts from the start codon (ATG) as described in Example 1 — (4) — (a) of JP-A-1-62219. D containing a nucleotide sequence encoding a natural thrombomodulin signal peptide consisting of eight amino acid residues followed by a natural thrombomodulin partial peptide consisting of 462 amino acid residues It was confirmed to have an NA fragment.
続いて、 上記のプラスミ KM— 1 3 TMD 3と配列番号 5の 1 — 2 5の塩基 配列からなるデリ一ターを用い、 特開平 1— 6 2 1 9号公報の実施例 1 一 （5) — (a) に記載の方法に従い、 組換え体プラスミ KM— 1 3 TMD 5を得た。 該 プラスミ ド M— 1 3 TMD 5は、 特開平 1 一 6 2 1 9号公報の実施例 1一 （ 5 ) - (a) に記載されているように、 開始コドン （ATG) から始まる 1 8残基の ァミノ酸からなる天然のトロンボモジュリンのシグナルべプチドに続いて本発明 卜口ンボモジュリン E 4 5 6 NNV- 1 1 8をコ一ドする塩基配列を含有する D N A断片を有することを確認した。 さらに続いて、 特開平 1 一 6 2 1 9号公報の 実施例 1 — (5) - (b) に記載の方法により、 上記の DNA断片をプラスミ ド p S V 2 - d h f r (ATC C 3 7 1 4 6 ) に揷入し、 本発明トロンボモジュ リ ンE 4 5 6 NNV— 1 1 8の発現べクタ一 p S V 2 TMD 5を構築した。  Subsequently, Example 11 (5) of Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-6219 was used using the above plasmid KM-13 TMD3 and a director consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 5. — Recombinant Plasmid KM—13 TMD5 was obtained according to the method described in (a). The plasmid M-13 TMD5 starts from the start codon (ATG) as described in Example 11 (5)-(a) of JP-A-16219. It was confirmed that there was a DNA fragment containing a nucleotide sequence coding for the native thrombomodulin E4556-NNV-118 following the signal peptide of natural thrombomodulin consisting of the amino acid residue. Subsequently, the above DNA fragment was converted into plasmid pSV2-dhfr (ATC C371) by the method described in Example 1 of Japanese Patent Application Laid-Open No. The expression vector pSV2TMD5 of the thrombomodulin E456-NNV-118 of the present invention was constructed.
(2) (W) が A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリン （E 4 5 6 NNV- 1 1 4 ) の発現 ベクターの構築 (2) (W) is Asp, (X) and (Y) are both Asn, (Z) Of the expression vector of the thrombomodulin (E456NNNV-114) of the present invention, wherein
実施例 1一 （ 1 ) で得られた組換え体プラスミ KM— 1 3TMD 3と、 配列 番号 7の 1 一 25の塩基配列からなるデリー夕一を用い、 特開平 5 - 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 1一 （ 1 ) 一 （b) に記載の方法により、 組換え体プラスミ ド M- 1 3 TMD 7を得た。 該プラスミ KM— 1 3 TMD 7は、 特開平 5 - 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 1— ( 1 ) — (b) に記載されているように、 開始コドン (ATG) から始まる 1 8残基のァミノ酸からなる天然のトロンボモジュリ ンの シグナルぺプチドに続いて本発明トロンボモジュリ ン E 4 5 6 NNV- 1 1 4を コードする塩基配列を含有する DNA断片を有することを確認した。 続いて、 特 開平 5 - 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 1 一 （ 1 ) 一 (b) に記載の方法により、 上記の DN A断片をプラスミ ド p SV2— d h f r (ATCC 3 7 1 4 6) に 揷入し、 本発明トロンボモジュリ ン E 4 5 6 NNV- 1 1 4の発現べクタ一 p S V 2TMD 7を構築した。  Example 11 Using the recombinant Plasmid KM-13TMD3 obtained in (1) and Delhi consisting of 125 base sequences of SEQ ID NO: 7, JP-A-5-213 998 The recombinant plasmid M- 13 TMD7 was obtained by the method described in Example 11 (1) -1 (b) of the publication. The plasmid KM-13 TMD7 starts with the start codon (ATG) as described in Example 1- (1)-(b) of JP-A-5-213998. It was confirmed that there was a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the thrombomodulin E465 NNV-114 of the present invention following the signal peptide of natural thrombomodulin consisting of eight amino acids. Subsequently, the above DNA fragment was converted to plasmid p SV2-dhfr (ATCC 371) by the method described in Example 11 (1) 1-1 (b) of JP-A-5-213 998. The expression vector pSV2TMD7 of the present thrombomodulin E465-NNV-114 was constructed.
( 3) (W) 力 \ Va l— G l u— P r o— V a l — A s pであり、 （X) と (Y) がともに A s nであり、 （Z) が A 1 aである本発明のトロンボモジユリ ン （E 4 5 6NNA— 1 1 8) の発現べクタ一の構築  (3) The present invention in which (W) force is \ Val-Glu-Pro-Val-Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is A1a. Of an expression vector for thrombomodulin (E465NNA-118)
実施例 1 一 （ 1 ) で得られた組換え体プラスミ KM— 1 3 TMD 5と配列番 号 8の 1— 2 1の塩基配列からなるミユーテ一夕一を用いる以外は、 特開平 1 一 6 2 1 9号公報の実施例 1一 （4) 一 （a) と実質的に同様の方法を用いること により、 上記のプラスミ KM— 1 3 TMD 5の一部の塩基を他の塩基に置換した 組換え体プラスミ M— 1 3 TMM 1を得た。 該プラスミ KM— 1 3 TM 1は 、 開始コ ドン （ATG) から始まる 1 8残基のアミノ酸からなる天然のトロンボ モジユリ ンのシグナルぺプチドに続いて本発明のトロンボモジュリ ン E 4 5 6N NA- 1 1 8をコードする塩基配列を含有する DNA断片を有することを確認し た。 すなわち、 該プラスミ ド M— 1 3 TMM 1は、 式 （ 1 ) 中の （Z) のァミノ 酸に相当するコ ドン以外は、 実施例 1 一 （ 1 ) で得られたプラスミ KM— 1 3 T MD 5と同一の塩基配列を有するものであった。 続いて、 プラスミ KM— 1 3 T D 5の代わりにプラスミ KM— 1 3 TMM 1を用いること以外は、 特開平 1 一 6 2 1 9号公報の実施例 1一 （5) — (b) に記載の方法に従い、 本発明トロン ボモジュ リ ン E 4 5 6 NNA- 1 1 8の発現ベクター p S V 2 TMM 1を構築し た。 Example 11 Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. H11-116 except that the recombinant Plasmid KM- 13 TMD obtained in (1) and a mute consisting of the nucleotide sequence of 1-21 of SEQ ID NO: 8 were used. By using a method substantially similar to that of Example 11 (4) -1 (a) of JP-A-19, a part of the base of the above plasmid KM-13 TMD5 was replaced with another base. Recombinant Plasmid M-13 TMM 1 was obtained. The plasmid KM- 13 TM1 is composed of a natural thrombomodulin signal peptide consisting of 18 amino acids starting from the initiation codon (ATG), followed by a thrombomodulin E450NNA-1 of the present invention. It was confirmed to have a DNA fragment containing the base sequence encoding 18. That is, the plasmid M-13 TMM 1 is the amino of (Z) in the formula (1). Except for the codon corresponding to the acid, it had the same nucleotide sequence as the plasmid KM-13 TMD5 obtained in Example 11 (1). Then, Example 11 (5) — (b) of Japanese Patent Application Laid-Open No. H6-12619 was used except that Plasmi KM-13 TDM1 was used instead of Plasmi KM-13TD5. According to the method described above, an expression vector pSV2TMM1 for the thrombomodulin E456NNA-118 of the present invention was constructed.
(4) (W) が A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が A 1 aである本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6 NNA— 1 1 4) の発現 ベクターの構築  (4) The thrombomodulin of the present invention (E455NNA—114) in which (W) is Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is A1a. Construction of expression vector
プラスミ KM— 1 3 TMD 5の代わりに実施例 1一 （ 2) で得られた組換え 体プラスミ KM— 1 3 TMD 7を用いること以外は、 実施例 1 一 （ 3) の方法に 従い、 組換え体プラスミ KM— 1 3 TMM 2を得た。 該プラスミ KM— 1 3 TM M2は、 開始コ ドン （ATG) から始まる 1 8残基のァミノ酸からなる天然の卜 ロンボモジュリ ンのシグナルぺプチドに続いて本発明のトロンボモジュリン E 4 5 6NNA- 1 1 4をコ一ドする塩基配列を含有する DN A断片を有することを 確認した。 続いて、 プラスミ KM— 1 3 TMD 5の代わりにプラスミ KM— 1 3 TMM 2を用いること以外は、 特開平 1— 6 2 1 9号公報の実施例 1 _ ( 5) - (b) に記載の方法に従い、 本発明トロンボモジュリ ン E 4 5 6 NNA - 1 1 4 の発現べクタ一 P SV 2TMM2を構築した。  The procedure of Example 11 (3) was repeated, except that the recombinant Plasmid KM-13 TMD7 obtained in Example 11 (2) was used instead of Plasmid KM-13 TMD 5. The recombinant Plasmid KM—13 TMM 2 was obtained. The plasmid KM- 13 TM M2 is composed of the signal peptide of natural thrombomodulin consisting of 18 amino acids starting from the initiation codon (ATG), followed by the thrombomodulin E465NNA-11 of the present invention. It was confirmed to have a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding 4. Subsequently, except that Plasmi KM-13 TMM 2 was used instead of Plasmi KM-13 TMD 5, it was described in Example 1 _ (5)-(b) of Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-61219. According to the method described above, an expression vector PSV2TMM2 for the thrombomodulin E465NNA-114 of the present invention was constructed.
( 5) (W) が Va 1 — A s pであり、 （X ) と （ Y) がともに A s nであり、 (Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6 NNV- 1 1 5) の発現ベクターの構築  (5) The thrombomodulin of the present invention (E456NNNV-) in which (W) is Va 1 — Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Va1 1) Construction of expression vector of 5)
特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報の実施例 （ 1 ) 一 （ a ) に記載の方法により 、 組換え体プラスミ KM— 1 3 TMD 6を得た。 すなわち、 部位特異的変異の手 法により、 配列番号 9の 1一 2 5の塩基配列からなるデリ—夕一を用いて、 実施 例 1一 （ 1 ) で得られたプラスミ ド M— 1 3 TMD 5の一部の DNA断片が削除 された該プラスミ KM— 1 3 TMD 6を得た。 続いて、 特開平 2— 2 5 5 6 9 9 号公報の実施例 （ 1 ) 一 （b) に記載の方法により、 （W) が Va 1 - A s pで あり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のト ロンボモジュ リ ン （E 4 5 6NNV— 1 1 5) の発現ベクター p S V 2 TMD 6 を構築した。 Recombinant Plasmid KM-13 TMD6 was obtained by the method described in Example (1) -a) of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-255569. In other words, the plasmid M- 13 TMD obtained in Example 11 (1) was obtained by a site-specific mutagenesis method using a delivery sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 to 125. 5.Some DNA fragments deleted The obtained plasmid KM-13 TMD 6 was obtained. Subsequently, according to the method described in Examples (1) -1 (b) of JP-A-2-255569, (W) is Va 1 -Asp, and (X) and (Y) The expression vector pSV2TMD6 of the thrombomodulin (E456NNV-115) of the present invention in which both are Asn and (Z) is Va1 was constructed.
( 6) (W) が P r 0— Va 1 — A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュ リ ン （E 4 5 6 NNV - 1 1 6) の発現ベクターの構築  (6) The thrombomodulin of the present invention (W) is Pr0—Va1—Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Va1. Construction of expression vector for E4 5 6 NNV-1 1 6)
配列番号 1 0の 1 一 25の塩基配列からなるデリー夕一を用いること以外は 、 上記の実施例 1 - （5) と実質的に同様の方法により、 組換え体プラスミ KM 一 1 3 TMD 9を得、 続いて、 プラスミ KM— 1 3 TMD 9をプラスミ KM— 1 3 TMD 6の代わりに用いること以外は、 上記の実施例 1 一 （ 5 ) の方法により 、 （W) が P r 0— V a 1 — A s pであり、 （X) と （ Y) がともに A s nであ り、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6 NNV— 1 1 6) の発現べクタ一 p S V 2 TMD 9を構築した。  A recombinant Plasmid KM-13 TMD9 was prepared in substantially the same manner as in Example 1- (5) above except that Delhi consisting of the nucleotide sequence of 125 of SEQ ID NO: 10 was used. Then, except that Plasmi KM-13 TMD 9 is used in place of Plasmi KM-13 TMD 6, the method of Example 11 (5) above shows that (W) is V a1 — Asp, (X) and (Y) are both A sn, and (Z) is V a1 of the thrombomodulin of the present invention (E456NNNV—116). The expression vector pSV2TMD9 was constructed.
( 7) (W) が G 1 u— P r 0— V a 1 — A s pであり、 （X) と （Y) かと もに A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のト口ンボモジュリン （E 4 5 6NNV— 1 1 7) の発現べクタ一の構築  (7) The present invention in which (W) is G 1 u—P r 0—V a 1 —A sp, (X) and (Y) are both A sn, and (Z) is V a 1 Of expression vector of Escherichia coli nbomodulin (E456NNNV-117)
配列番号 1 1の 1 — 2 5の塩基配列からなるデリ一夕一を用いること以外は 、 上記の実施例 1— ( 5) と実質的に同様の方法により、 組換え体プラスミ M - 1 3 TMD 1 0を得、 続いて、 プラスミ M— 1 3 TMD 1 0をプラスミ KM - 1 3 TMD 6の代わりに用いること以外は、 上記の実施例 1一 （ 5) の方法に より、 （W) が G 1 u— P r o— V a 1— A s pであり、 （X) と （Y) がとも に A s nであり、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリン （E 4 5 6 NNV- 1 1 7) の発現べクタ一 p SV 2TMD 1 0を構築した。  Except for using a deli sequence consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 11, the recombinant Plasmid M-13 was produced in substantially the same manner as in Example 1- (5) above. TMD 10 was obtained, and then, except that Plasmid M-13 TMD 10 was used in place of Plasmid KM-13 TMD 6, (W) Is G 1 u—Pro—V a 1—A sp, (X) and (Y) are both A sn, and (Z) is V a 1. An expression vector p SV2TMD10 of NNV-117) was constructed.
( 8) (W) が A s pであり、 （X) が A s nであり、 （Y) が G i n、 また は S e r、 または A 1 a、 または G 1 yであり、 （Z) が Va 1である本発明の トロンボモジュ リ ン （E 4 5 6NQV— 1 1 4、 または E 4 5 6 NSV— 1 1 4 、 または E 4 5 6 NAV— 1 1 4、 または E 4 5 6NGV— 1 1 4 ) の発現べク 夕一の構築 (8) (W) is Asp, (X) is Asn, (Y) is Gin, and Is Ser, or A 1 a, or G 1 y, and the thrombomodulin of the present invention (E 456 NQV—114 or E 456 NSV—11) in which (Z) is Va 1 4, or E 456 NAV—114, or E 456NGV—114)
配列番号 1 2の 1 一 2 1の塩基配列からなるミュ一テ一夕一を用いること以 外は、 上記の実施例 1 一 （ 4 ) と実質的に同様の方法により、 プラスミ ド M - 1 3 TMD 7の一部の塩基を他の塩基に置換した組換え体プラスミ ド M - 1 3 TM M3を得た。 該プラスミ KM— 1 3 TMM3をプラスミ ド M— 1 3 TMM2の代 わりに用いること以外は、 上記の実施例 1 — (4) の方法により、 （W) か A s pであり、 （X) が A s nであり、 （Y) が G i nであり、 （Z) が V a lであ る本発明のトロンボモジュリン （E 4 5 6 NQ V— 1 1 4 ) の発現べクタ一 p S V 2 TMM3を構築した。  Plasmid M-1 was prepared in substantially the same manner as in Example 11 (4) above, except that the mutant consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 was used. Recombinant plasmid M-13TMM3 in which some bases of 3TMD7 were substituted with other bases was obtained. Except that the plasmid KM-13 TMM3 is used instead of the plasmid M-13 TMM2, (W) or Asp is obtained by the method of Example 1- (4) above, and (X) is A An expression vector pSV2TMM3 of the thrombomodulin (E456NQV-114) of the present invention, which is sn, (Y) is Gin, and (Z) is Val, was constructed. .
上記に習い、 配列番号 1 3の 1 一 2 1の塩基配列からなるミューテ—ター、 または配列番号 1 4の 1 一 2 1の塩基配列からなるミューテ一夕一、 または配列 番号 1 5の 1 一 2 1の塩基配列からなるミュ一テ一夕一を用いることにより、 プ ラスミ KM— 1 3 TMD 7の一部の塩基を他の塩基に置換した組換え体プラスミ ド M— 1 3 TMM4、 または M— 1 3 TM 5. または M— 1 3 T MM 6を得、 続いて、 本発明のトロンボモジュリン E 4 5 6 NSV— 1 1 4、 または E 4 5 6 NAV- 1 1 4、 または E 4 5 6 NGV— 1 1 の発現べクタ一 p S V 2 TMM 4、 または p S V 2 TMM5、 または p S V 2 TMM 6を構築した。  Following the above, a mutator consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 13-1-1, 21 or a mute consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 14-1-1, or SEQ ID NO: 15-1-1 The recombinant plasmid M—13 TMM4, in which a part of the base of the plasmid KM—13 TMD7 is replaced with another base, by using the mutant consisting of the base sequence of 21 M— 13 TM 5. or M— 13 T MM 6 followed by the thrombomodulin E 456 NSV—114 or E 456 NAV-114 or E 45 of the present invention. The expression vector of 6 NGV—11, p SV 2 TMM 4, or p SV 2 TMM 5, or p SV 2 TMM 6, was constructed.
( 9 ) (W) が A s pであり、 （X) が G 1 n、 または S e r、 または A 1 a 、 または G l yであり、 （Y) が A s nであり、 （ Z ) が V a 1である本発明の トロンボモジュリ ン （E 4 5 6 QNV— 1 1 4、 または E 4 5 6 SNV— 1 1 4 、 または E 4 5 6 ANV— 1 1 4、 または E 4 5 6 GNV— 1 1 4 ) の発現べク ターの構築  (9) (W) is Asp, (X) is G1n, or Ser, or A1a, or Gly, (Y) is Asn, (Z) is Va The thrombomodulin of the present invention which is 1 (E456QNV—114, or E456SNV—114, or E456ANV—114, or E456GNV—11 4) Construction of expression vector
上記の実施例 1 一 （ 8 ) に習い、 配列番号 1 6の 1 一 2 1、 または配列番号 i 7の 1— 2 1、 または配列番号 1 8の 1 一 2 1、 または配列番号 1 9の 1— 2 1の塩基配列からなるミューテ一夕一を用いて、 （W) が A s pであり、 （X) 力 G 1 n、 または S e r、 または A 1 a、 または G 1 yであり、 （Y) か A s n であり、 （Z) が Va 1である本発明のトロンボモジュリン （E 4 5 6 QNV— 1 1 4、 または E 4 5 6 SNV— 1 1 4、 または E 4 5 6 AN V— 1 1 4、 また は E 4 5 6 GNV— 1 1 4 ) の発現べクタ一 p S V 2 TMM 7、 または p S V 2 TMM8、 または p SV 2 TMM9、 または p SV 2TMM l 0を構築した。 Following Example 11- (8) above, one of SEQ ID NO: 16 and one of SEQ ID NO: 21 (W) is Asp, using a mute sequence consisting of the base sequence of 1-21 of i7, or 1-21 of SEQ ID NO: 18, or 1-21 of SEQ ID NO: 19. (X) the force G1n, or Ser, or A1a, or G1y, (Y) or Asn, and (Z) Va1 the thrombomodulin (E45) of the present invention. 6 Expression vector of QNV—114, or E456 SNV—114, or E456ANV—114, or E456GNV—114) p SV 2 TMM 7, or pSV2TMM8, or pSV2TMM9, or pSV2TMM10 was constructed.
( 1 0) (W) か A s pであり、 （X) が S e rであり、 （Y) が G l yであ り、 （Z) が V a 1である本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6 S G V— 1 1 4) の発現ベクターの構築  (10) (W) or Asp, (X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z) is Va1. 6 Construction of expression vector for SGV-114)
プラスミ ド M— 1 3 TMM6 (上記の実施例 1 一 （ 8) で得られたもの） と 配列番号 1 7の 1一 2 1の塩基配列からなるミュ一テ一夕一を用いること以外は 、 上記の実施例 1 一 （ 4) と実質的に同様の方法により、 組換え体プラスミ KM 一 1 3 TMM 1 1を得、 続いて上記の実施例 1 — ( 1 ) の要領で、 （W) が A s Pであり、 （X) が S e rであり、 （Y) が G l yであり、 （Z) が Va lであ る本発明のトロンボモジュリ ン （E 4 5 6 SGV— 1 1 4) の発現べクタ一 p S V 2 TMM 1 1を構築した。  Except using plasmid M—13 TMM6 (obtained in Example 11 (8) above) and a mutant consisting of the nucleotide sequence of 121 of SEQ ID NO: 17 Recombinant Plasmid KM-13 TMM 11 was obtained in substantially the same manner as in Example 11 (4) above, and then (W) Is As P, (X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z) is Val. The thrombomodulin of the present invention (E456SGV—114) The expression vector pSV2TMM11 was constructed.
( 1 1 ) E 4 5 6 NNV- 1 1 8、 または E 4 5 6NNV— 1 1 4、 または E 4 5 6 S G V- 1 1 4の本発明のトロンボモジュリ ンを、 配列番号 3の 1 — 1 6 のァミ ノ酸配列からなるシグナルべプチドを利用して発現そして分泌させるため の発現べクタ一  (1 1) The thrombomodulin of the present invention of E456NNN-118 or E456NNV-114 or E456SGV-114 is represented by Expression vector for expression and secretion using a signal peptide consisting of 6 amino acid sequences
配列番号 20の 1 — 2 5の塩基配列からなるデリー夕一を用いること以外は 、 上記の実施例 1一 （3) と実質的に同様の方法により、 組換え体プラスミ KM 一 1 3 STMD 5を得た。 該プラスミ ド M— 1 3 STMD 5をプラスミ KM— 1 3 TMD 5の代わりに用いること以外は、 上記の実施例 1一 （ 1 ) の方法により 、 本発明のトロンボモジュリン E 4 5 6 NNV— 1 1 8を、 配列番号 3の 1 一 1 6のァミノ酸配列からなるシグナルべプチドを利用して発現そして分泌させるた めの発現ベクターの発現ベクター P S V 2 STMD 5を構築した。 Except for using Delhi consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 20, the recombinant Plasmid KM-13 STMD5 was prepared in substantially the same manner as in Example 11 (3) above. I got The thrombomodulin E456-NNV-11 of the present invention was obtained by the method of Example 11- (1) above, except that the plasmid M-13 STMD5 was used instead of the plasmid KM-13 TMD5. 8 to SEQ ID NO: 3 1 1 1 An expression vector PSV2STMD5 was constructed for expression and secretion using a signal peptide consisting of 6 amino acid sequences.
上記の要領で、 配列番号 2 1の 1 - 2 5の塩基配列からなるデリ—ターを用 いること以外は、 上記の実施例 1 一 （4 ) と実質的に同じ方法により、 組換え体 プラスミ KM— 1 3 S TMD 7を得た。 続いて、 該プラスミ KM— 1 3 STMD 7をプラスミ KM— 1 3 TMD 7の代わりに用いること以外は、 上記の実施例 1 - ( 2) の方法により、 本発明のトロンボモジュリン E 4 5 6 NNV- 1 1 4を 、 配列番号 3の 1 — 1 6のアミ ノ酸配列からなるシグナルペプチドを利用して発 現そして分泌させるための発現べクタ一の発現ベクター P SV 2 STM7を構築 した。  In the same manner as in Example 11 (4) above, except that a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 21 was used in the manner described above, the recombinant plasmid was used. KM-13S TMD 7 was obtained. Subsequently, the thrombomodulin E450-NNV- of the present invention was obtained by the method of Example 1- (2) above, except that the plasmid KM-13 STMD7 was used instead of the plasmid KM-13 TMD7. An expression vector PSV2STM7 for expressing and secreting 114 using a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1 to 16 of SEQ ID NO: 3 was constructed.
また、 上記の要領で、 配列番号 2 1の 1 一 2 5の塩基配列からなるデリ一夕 一とプラスミ ド M— 1 3 TMM 1 1を用いること以外は、 上記の実施例 1 一 （ 4 ) と実質的に同じ方法により、 組換え体プラスミ KM— 1 3 STMM 1 1を得た。 さらに引き続いて、 該プラスミ KM— 1 3 STMM 1 1をプラスミ KM— 1 3 T MD 7の代わりに用いること以外は、 上記の実施例 1 一 （ 2) の方法に従い、 本 発明のトロンボモジュリン E 4 5 6 S G V- 1 1 4を、 配列番号 3の 1 一 1 6の ァミノ酸配列からなるシグナルべプチドを利用して発現そして分泌させるための 発現ベクターの発現ベクター P SV 2 STMM 1 1を構築した。 実施例 2  In the same manner as in Example 11 (4), except that the deli overnight consisting of the nucleotide sequence of 125 of SEQ ID NO: 21 and the plasmid M-13 TMM 11 are used in the above manner. Recombinant Plasmid KM-13 STMM11 was obtained in substantially the same manner as described above. Subsequently, the thrombomodulin E45 of the present invention was prepared according to the method of Example 11 (2) above, except that the plasmid KM-13 STMM11 was used instead of the plasmid KM-13TMD7. An expression vector P SV 2 STMM 11 was constructed for expression and secretion of 6 SG V-114 using a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 116 of SEQ ID NO: 3. . Example 2
本発明のト口ンボモジュリ ンの生産  Production of the tonbomodulin of the present invention
( 1 ) 本発明のトロンボモジュリ ンの COS— 1細胞による生産  (1) Production of thrombomodulin of the present invention by COS-1 cells
実施例 1 一 （ 1 ) から実施例 1 一 （ 1 1 ) で得られた、 本発明のトロンボモ ジュリ ンの発現ベクターを用い、 特開平 7 - 1 5 5 1 7 6号公報の実施例 2に記 載の方法に従い、 本発明のトロンボモジュ リ ンを生産させた。 また、 その培養上 澄液を一部サンプリングし、 特開平 7— 1 5 5 1 7 6号公報の参考例 1 に記載の 方法で、 ト口ンボモジュリ ンのコファクタ一活性、 すなわちトロンビンによるプ 口ティン Cの活性化を促進する作用を測定した。 Example 11 Using the thrombomodulin expression vector of the present invention obtained in Example 11 (1) to Example 11 (11), the method was applied to Example 2 of JP-A-7-155176. According to the method described, the thrombomodulin of the present invention was produced. In addition, a part of the culture supernatant was sampled and described in Reference Example 1 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-155176. The method was used to measure the cofactor one activity of tonbo-modomodulin, ie, the effect of thrombin to promote the activation of protin-tin C.
実施例 1一 （ 1 ) から実施例 1一 （ 1 1 ) で得られた、 それぞれの発現べク 夕一で形質転換されたそれぞれの COS - 1細胞の培養上澄液には、 全て、 トロ ンボモジュリ ンのコファクタ一活性、 すなわちトロンビンによるプロティン Cの 活性化を促進する作用が検出された。  The culture supernatants of the respective COS-1 cells transformed in each of the expression vectors obtained in Example 11 (1) to Example 11 (11) A cofactor-one activity of nombomodulin, that is, an effect of promoting protein C activation by thrombin, was detected.
このように、 実施例 1一 （ 1 ) から実施例 1一 （ 1 1 ) で得られた発現べク 夕一中にコードされた、 それぞれの本発明のトロンボモジュリンは、 それぞれの 発現べクタ一で形質転換された細胞によって生産され、 そして生産されたそれぞ れの本発明のトロンボモジュリ ンの全ては、 トロンボモジュリンの活性、 すなわ ちトロンビンによるプロティン Cの活性化を促進する作用を有していることが確 Thus, each of the thrombomodulins of the present invention, encoded in the expression vectors obtained in Examples 11 (1) to 11 (1 1), can be expressed in each of the expression vectors. All of the thrombomodulins of the present invention produced and produced by the transformed cells have an action of promoting the activity of thrombomodulin, that is, the activation of protein C by thrombin. Sure
5 ?"れた 0 5? "Was 0
従って、 式 （ 1 ) 中の （W) が Va l— G l u-Pr o-Va 1 -As p, G l u - P r o— Va l— As p、 P r o - Va l - As p、 Va l— As p、 または A s pのいずれかのぺプチド残基またはァミノ酸残基であっても、 また、 (X) や （Y) が互いに異なる、 又は同一の、 As n、 G l n、 S e r、 A l a 、 または G 1 yのいずれかのアミノ酸残基であっても、 またさらには （Z) 力、 V a 1、 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残基であっても、 式 （ 1 ) に記載の ァミノ酸配列からなる本発明の卜口ンボモジュリ ンは、 ト口ンボモジュリンの活 性、 すなわちトロンビンによるプロテイン Cの活性化を促進する作用を有してい るものと判断された。  Therefore, (W) in equation (1) is Va l—Glu-Pro-Va 1 -Asp, Glu-Pro—Val—Asp, Pro-Val-Asp, Va l— Asp, Asp, or Asp, any peptide residue or amino acid residue, or (X) or (Y) different from or identical to each other, As n, G ln, S er, A la, or G 1 y amino acid residue, or even (Z) force, V a 1, or A 1 a amino acid residue, It has been determined that the tonbomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence represented by the formula (1) has the activity of tonbomodulin, that is, the action of promoting the activation of protein C by thrombin. .
(2) 本発明のトロンボモジユリ ンの CH0細胞による生産  (2) Production of thrombomodulin of the present invention by CH0 cells
実施例 1で得た発現べクタ一を用い、 特開平 7 - 1 55 1 76号公報の実施 例 7に記載の方法に従った。 実施例 3 Using the expression vector obtained in Example 1, the method described in Example 7 of JP-A-7-155176 was used. Example 3
本発明のトロンボモジュ リ ンの精製  Purification of the thrombomodulin of the present invention
実施例 2で生産させた本発明のトロンボモジュ リ ン、 すなわち本発明のト口 ンボモジュリ ンの発現ベクターでトランスフエク トした C〇 S— 1細胞、 または 本発明の卜ロンボモジユリ ンの発現ベクターでトランスフォームした CHO細胞 が生産した、 培養上澄液中に存在する本発明のトロンボモジュリ ンの精製は、 本 発明のト口ンボモジュリンが含まれるその培養上澄液を、 D I P— トロンビン一 ァガロースのカラムクロマトグラフィ一にかけて調製した。  Transformation with the thrombomodulin of the present invention produced in Example 2, ie, C〇S-1 cells transfected with the expression vector of the thrombomodulin of the present invention, or with the expression vector of thrombomodulin of the present invention. Purification of the thrombomodulin of the present invention, which is present in the culture supernatant produced by the formed CHO cells, comprises purifying the culture supernatant containing the tombo thrombomodulin of the present invention by DIP-thrombin-agarose column chromatography. Prepared.
すなわち、 ェヌ ' エル ' エスモン （N. L. E smon) ら （ザ ジャーナ ル ォブ バイオロジカル ケミストリー （J. B i o l . C h em. ) 、 25 7巻、 85 9頁 （ 1 982年） ） の方法に準じて作製した D I P—トロンビン （ ジイソプロピルホスホロ トロンビン （d i i s op r opy l ph o s ph o r o t h r omb i n) ) を、 ピー クオ ト レカサス （P. Cu a t r e c a s a s) の方法 （ザ ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリ一 （J. B i 01. C h em. ) 、 24 5巻、 359頁 （ 1 970年） ） に準じてブロムシァ ン化したァガロースに結合させて D I P— トロンビンーァガロースを作製した。  That is, the method of N.L.Esmon et al. (The Journal of Biological Chemistry, 257, 859, 1982) DIP-thrombin (diisopropyl phosphoro thrombin (diis opropy lph os ph ph orothr omb in)) prepared according to the method described in P. Cu atrecasas (The Journal of Biological Chemistry) (J. Bi 01. Chem.), 245, p. 359 (1970)), and DIP-thrombin agarose was prepared.
次に、 D I P— トロンビン-ァガロースをカラムに充塡して D I P— トロン ビン—ァガロースカラムを作製して室温で 0. 1M塩化ナ ト リウム、 0. 5mM 塩化カルシウム、 1 mMベンズアミジン塩酸を含む 0. 02M卜リス塩酸緩衝液 (pH 7. 5 ) でカラムを平衡化した。 次いで、 上記の本発明のトロンボモジュ リンを含む培養上澄液をカラムに供した。 カラムを 0. 2M塩化ナトリウム、 0 . 5 mlv [塩化カルシウム、 i mMベンズアミ ジン塩酸を含む 0. 02 Mトリス塩 酸緩衝液 （pH7. 5) で洗浄した後、 1M塩化ナ ト リウム、 0. ImM ED TA、 1 mMベンズアミ ジン塩酸を含む 0. 02Μト リス塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) で溶出してフラクショ ン化した。 溶出によって得られる各フラクションにつ いて、 特開平 1一 62 1 9号公報の参考例 1に記載の方法で、 トロンビンのプロ ティン Cの活性化を促進させる作用を測定した。 同時に島津製作所 （日本） 製ス ぺク トロフォ トメーター UV— 24 0を用いて各フラクションの波長 28 0 nm における吸収度を測定した。 活性のある画分を回収し、 0. 1 M塩化ナ ト リウム 、 0. 5mM塩化カルシウムを含む 0. 0 2Mト リス塩酸緩衝液 （pH 7. 5) で透析した。 Next, the column is filled with DIP-thrombin-agarose to prepare a DIP-thrombin-agarose column, and contains 0.1 M sodium chloride, 0.5 mM calcium chloride, and 1 mM benzamidine hydrochloride at room temperature. The column was equilibrated with Tris-HCl buffer (pH 7.5). Next, the culture supernatant containing the above-described thrombomodulin of the present invention was applied to a column. The column was washed with 0.2 M sodium chloride, 0.5 mlv (0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing calcium chloride and i mM benzamidine hydrochloride), and then washed with 1 M sodium chloride, 0.5 M Fractionation was performed by elution with a 0.02Μ tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) containing ImM EDTA and 1 mM benzamidine hydrochloride. For each fraction obtained by elution, the method described in Reference Example 1 of Japanese Patent Application Laid-open No. The effect of promoting the activation of Tin C was measured. At the same time, the absorbance of each fraction at a wavelength of 280 nm was measured using a spectrophotometer UV-240 manufactured by Shimadzu (Japan). The active fraction was collected and dialyzed against a 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.1 M sodium chloride and 0.5 mM calcium chloride.
得られた透析液を 2回目の D I P— トロンビン—ァガロースカラムクロマト グラフィ一に供した。 すなわち、 透析液を D I P - トロンビンーァガロースカラ 厶に通し、 0. 2 M塩化ナ ト リウム、 0. 5 mM塩化カルシウムを含む 0. 0 2 M卜 リス塩酸緩衝液 （pH 7. 5) で洗浄後、 さらに 0. 2 M塩化ナト リウム、 0. 5mM EDTAを含む 0. 0 2 Mトリス塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) で洗浄 した。 次いで、 1 M塩化ナト リウム、 0. 5mM £ 丁八を含む0. 0 2Mト リス塩酸緩衝液 （PH 7. 5) で溶出した。 活性画分を回収し、 凍結乾燥して、 一 8 0てで凍結保存し、 以下精製品として用いた。 この製品の分子吸光係数を一 般的な蛋白質の分子吸光係数にならい、 1 0. 0と規定して、 それに基づき精製 品の量を決定した。 実施例 4  The obtained dialysate was subjected to a second DIP-thrombin-agarose column chromatography. That is, the dialysate is passed through a DIP-thrombin-agarose column, and then diluted with 0.2 M sodium chloride buffer (pH 7.5) containing 0.2 M sodium chloride and 0.5 mM calcium chloride. After washing, the plate was further washed with a 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2 M sodium chloride and 0.5 mM EDTA. Subsequently, elution was carried out with a 0.02 M Tris-HCl buffer (PH 7.5) containing 1 M sodium chloride and 0.5 mM. The active fraction was collected, lyophilized, frozen and stored at 180 ° C, and used as a purified product. The molecular extinction coefficient of this product was determined to be 10.0 according to the molecular extinction coefficient of a general protein, and the amount of the purified product was determined based on it. Example 4
本発明のトロンボモジュ リ ンのトロンビンに対する親和性 本発明のトロンボモジュリ ンのトロンビンに対する親和性は、 本発明のト口 ンボモジュリ ンとトロンビンをいくつかの比で存在させ、 それぞれの時に形成さ れる本発明のトロンボモジュリン ■ トロンビン複合体の量を求めることによって 調べた。 本発明トロンボモジュ リ ン ' トロンビン複合体の形成量は、 活性化プロ ティン C生成速度を指標として求めた。  Affinity of the thrombomodulin of the present invention for thrombin The affinity of the thrombomodulin of the present invention for thrombin is determined by allowing the thrombomodulin of the present invention and thrombin to exist in several ratios and forming the thrombin in each case. The thrombomodulin was tested by determining the amount of thrombin complex. The amount of the thrombomodulin 'thrombin complex of the present invention was determined using the rate of activated protein C production as an index.
0. 1 % (W/V) ゥシ血清アルブミ ン （以下、 BSAと略す） 、 1 0 0m M塩化ナトリゥム並びに 5mM塩化カルシウムを含む pH 7. 4の 2 OmMトリ ス塩酸緩衝液 （以下、 緩衝液 Aと略す） 中にて、 本発明のトロンボモジュリ ンと ヒ 卜 · トロンビン （S i gma社製） 、 及びヒ ト · プロテイン C (Am e r i c a n d i a gn o s t i c s社製） を混合後、 直ちに 3 7 °Cで保温した。 その 混合液中には、 0. 6 5 nM ヒ ト ' トロンビン、 6 5 nMヒ ト ' プロテイン C 、 及び種々の濃度の本発明のト αンボモジュリンを含むようにした。 5分、 1 0 分、 そして 2 0分後、 この混合液 1 0 0〃 1に 2 0〃 1のノバスタン （アルガト ロバン 1 0 mgZ2 Om I Zバイアル、 三菱化学社製） を加え 3 7でで 3 0秒間 保温し、 続いて 1 0 0〃 1の 5mM S - 2 3 6 6 (第一化学薬品社製） を含む 緩衝液 Aを加え、 さらに 3 7 °Cで保温した。 1 0分後 5 0 1の酢酸を加え、 波 長 4 0 5 nmの吸光度を測定し、 既知濃度の活性化ヒ トプトティン Cを用いて作 成した検量線より、 生成された活性化プロテイン Cの濃度を求め、 その生成速度 を算出した。 活性化プロテイン Cは、 プロテイン Cを終濃度 1 O UZm lの PR OTAC (P e n t a p h a r m社製） で 3 7。 5分間処置することによって 調製した。 活性化プロテイン Cの生成速度は、 時間に比例して活性化プロテイン C濃度が上昇している範囲内で求めた。 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1% (W / V) serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), 100 mM sodium chloride and 5 mM calcium chloride at pH 7.4 Liquid A) and the thrombomodulin of the present invention Immediately after mixing human thrombin (manufactured by Sigma) and human protein C (manufactured by Americandia gnostics), the mixture was kept at 37 ° C. The mixture was made to contain 0.65 nM human 'thrombin, 65 nM human' protein C, and various concentrations of the tonbomodulin of the present invention. After 5 minutes, 10 minutes, and 20 minutes, add 100% Novastan (Argatroban 10 mg Z2 Om IZ vial, Mitsubishi Chemical Corporation) to 100% of this mixture, and use 3 to 3 After keeping the temperature for 0 second, buffer A containing 100 mM 1 mM S-2236 (Daiichi Pure Chemicals) was added, and the temperature was further kept at 37 ° C. After 10 minutes, add 501 acetic acid, measure the absorbance at a wavelength of 405 nm, and determine the amount of activated protein C that was generated from the calibration curve that was generated using activated human cytochrome C at a known concentration. The concentration was determined and the production rate was calculated. Activated protein C was obtained by converting protein C into PROTAC (Pentapharm) at a final concentration of 1 O UZml. Prepared by treating for 5 minutes. The production rate of activated protein C was determined within the range where the concentration of activated protein C increased in proportion to time.
横軸には反応液中の本発明のトロンボモジュリン濃度の逆数、 そして縦軸に はその時における活性化プロテイン C生成速度の逆数をプロッ トし、 その相関直 線が交差する横軸の点より、 本発明のトロンボモジュ リ ンのトロンビンに対する 親和性 （K d値） を算出した。  The abscissa plots the reciprocal of the thrombomodulin concentration of the present invention in the reaction solution, and the ordinate plots the reciprocal of the activated protein C production rate at that time.From the point on the abscissa where the correlation line intersects, The affinity (Kd value) of the thrombomodulin of the invention for thrombin was calculated.
その結果、 E 4 5 6NNV— 1 1 8、 E 4 5 6 NNV— 1 1 4のトロンビン に対する親和性 （Kd値） は、 それぞれ 8 nM、 1 0 nMであり、 また、 式 （ 1 ) 中の （W) は、 Va l — G l u— P r o— Va l — A s p、 G l u— P r o— V a 1 -A s p, P r o—Va l —As p、 Va l — A s p、 または A s pのい ずれかであっても トロンビンに対する親和性には、 相違はなかった。  As a result, the affinities (Kd values) of E456NNV-118 and E456NNV-114 for thrombin are 8 nM and 10 nM, respectively, and the expression (1) (W) is Va l—G lu—Pro—Val—A sp, G lu—Pro—V a 1 -A sp, P ro—V a l—As p, Va l—A sp, or A There was no difference in the affinity for thrombin with either sp.
また、 （Z) が E 4 5 6NNV— 1 1 8や E 4 5 6NNV— 1 1 4とは異な る本発明の卜ロンボモジュ リ ン、 E 4 5 6 NNA- 1 1 8 ( (W) 力 \ V a 1 — G l u— P r o— Va 1 — A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり 、 (Z) が A 1 aである式 （ 1 ) のアミノ酸配列で表される本発明のトロンボモ ジュリ ン） 、 並びに E 4 5 6 NNA- 1 1 4 ( (W) 力く、 A s pであり、 （X) と （Y) がともに A s nであり、 （Z) が A 1 aである式 （ 1 ) のアミノ酸配列 で表される本発明のトロンボモジュリン） のトロンビンに対する親和性は、 E 4 5 6 NNV- 1 1 8や E 4 5 6 NNV— 1 1 4のトロンビンに対する親和性と同 程度のものであった。 In addition, the thrombomodulin of the present invention, in which (Z) is different from E456NNN-118 or E456NNV-114, E456NNA-118 ((W) force \ V a 1 — G lu— P ro— Va 1 — A sp, (X) and (Y) are both A sn , (Z) is A1a, the thrombomodulin of the present invention represented by the amino acid sequence of the formula (1)), and E4566NNA-114 ((W) vigorously Asp. , (X) and (Y) are both A sn, and (Z) is A 1a. The affinity of the thrombomodulin of the present invention represented by the amino acid sequence of the formula (1) for thrombin is E 45 The affinity of thrombin for 6NNV-118 and E456NNNV-114 was comparable.
さらには、 （X) と （Y) が E 4 5 6 NNV— 1 1 4とは異なる本発明のト ロンポモジュリ ン、 E 4 5 6 S GV— 1 1 ( (W) 力く、 A s pであり、 （X) が S e rであり、 （Y) が G l yであり、 （Z) が V a 1である本発明のトロン ボモジュ リ ン） のトロンビンに対する親和性 （K d値） は、 1 5 nMであり、 そ れは上記の本発明のトロンボモジュリンと同程度のものであった。 実施例 5  Furthermore, the trombomodulin of the present invention, in which (X) and (Y) are different from E456NNN-114, E456S GV-11 ((W) powerful, Asp , (X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z) is Va1. The affinity (K d value) of thrombomodulin for thrombin is 15 nM, which was comparable to the thrombomodulin of the present invention described above. Example 5
本発明のトロンボモジュ リ ン ' トロンビン複合体のプロティン C  Thrombomodulin of the present invention Protein C of thrombin complex
活性化反応における速度論的パラメーター  Kinetic parameters in the activation reaction
本発明のトロンボモジュリ ン （終濃度 2 0 nM) とトロンビン （終濃度 2. 3 nM) . そしてプロテイン C (終濃度 2〜 i 2〃M) を混合後、 直ちに 3 7 °C で保温した。 1、 2、 3、 4分後 （反応系内プロテイン C濃度が 5；/Μ以上の場 合） もしくは 1、 3、 5、 7分後 （反応系内プロテイン C濃度が 5 M以下の場 合） 、 その混合液 1 0 1に 5 0 1のノバスタンを含む溶液 （ 0. 1 mgZm 1 となるように緩衝液 Aで希釈した） を加え、 3 7°Cで 30秒間保温し、 続いて 1 0 0 1の 501^ S— 2 3 6 6 (第一化学薬品社製） を含む緩衝液 Aを加え 、 さらに 3 7 °Cで保温した。 1 0分後 5 0 / 1の酢酸を加え、 波長 4 0 5 nmの 吸光度を測定し、 上記の実施例 4と同様にして種々のプロテイン C濃度における 時の活性化プロテイン C生成速度を算出した。  Immediately after mixing the thrombomodulin of the present invention (final concentration: 20 nM), thrombin (final concentration: 2.3 nM) and protein C (final concentration: 2-i2〃M), the mixture was immediately incubated at 37 ° C. After 1, 2, 3, 4 minutes (when the protein C concentration in the reaction system is 5; / Μ or more) or after 1, 3, 5, 7 minutes (when the protein C concentration in the reaction system is 5 M or less) A solution containing 501 novastane (diluted with buffer A to 0.1 mgZm 1) was added to 101, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 seconds. Buffer A containing 501 ^ S—2366 (manufactured by Daiichi Kagaku) was added, and the mixture was further kept at 37 ° C. After 10 minutes, 50/1 acetic acid was added, the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured, and the activated protein C generation rate at various protein C concentrations was calculated in the same manner as in Example 4 above. .
種々のプロテイン C濃度 （S) で求めた、 活性化プロテイン C生成速度 （V) の測定値を用い、 1 /S v. s . 1 ZVのプロッ ト （L i n e we a V e r— Bu r kの逆数プロッ ト、 S ：反応系内プロテイン C濃度、 V ：活性化プロティ ン C生成速度） をし、 本発明のトロンボモジュ リ ン ' トロンビン複合体のプロテ イン C活性化反応における速度論的パラメ一夕一、 Km値 （本発明トロンボモジ ユリ ン · トロンビン複合体のプロテイン Cに対する親和性） および速度定数 k c a tを求めた。 その結果、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4 · トロンビン複合体のプロテ イン C活性化反応における速度論的パラメーター、 Km値および k c a tは、 そ れぞれ 1 2〃M、 3 5m i n 'であった。 Activated protein C production rate (V) determined at various protein C concentrations (S) 1 / Sv.s. 1 ZV plot (Linewea Verr—reciprocal plot of bulk, S: protein C concentration in the reaction system, V: activated protein C production) Kinetic parameters in the protein C activation reaction of the thrombomodulin 'thrombin complex of the present invention, and the Km value (affinity of the thrombomodulin / thrombin complex of the present invention for protein C). ) And the rate constant kcat were determined. As a result, the kinetic parameters, Km value, and kcat for the protein C activation reaction of the E456NNNV-11 thrombin complex were 12〃M and 35min, respectively. Was.
式 （ 1 ) 中の （W) が E 4 5 6 NNV- 1 1 4とは異なる本発明のトロンボ モジュ リ ン、 E 4 5 6 NNV- 1 1 8においては、 Km値、 k c a tは、 1 3 M、 4 5m i n-1であった。 また、 式 （ 1 ) 中の （X) 、 (Y) 並びに （Ζ) は Ε 4 5 6 NNV- 1 1 4や E 4 5 6NNV— 1 1 8と同じであり、 （W) のみが E 4 5 6 NNV- 1 1 4や E 4 5 6 NNV- 1 1 8とは異なる本発明のトロンボ モジュ リ ン （E 4 5 6 NNV— 1 1 5、 E 4 5 6 NNV- 1 1 6、 E 4 5 6 NN V - 1 1 7) においても、 それぞれの Km値、 および k c a tの値は、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4や E 4 5 6 NNV- 1 1 8の Km値、 および k c a tの値と同程 度であった。 In the thrombomodulin of the present invention, in which (W) in the formula (1) is different from E4566NNV-114, E4566NNV-118, the Km value and kcat are 13 M, 45 min- 1 . (X), (Y) and (Ζ) in the formula (1) are the same as Ε456NNNV-114 and E456NNN-118, and only (W) is E4 The thrombomodulin of the present invention, which is different from 56 NNV-114 and E456-NNV-118 (E456-NNV-115, E456-NNV-116, E4 In the case of 5 NN V-1 17), the Km value and kcat value are the Km value and kcat value of E 456 NNV-114 and E 456 NNV-118, respectively. It was about the same.
さらに、 式 （ 1 ) 中の （Z) が E 4 5 6 NNV— 1 1 8や E 4 5 6 NNV— 1 1 4 ( (Z) が V a 1 ) とは異なる本発明のト口ンボモジュリ ン、 E 4 5 6 N NA— 1 1 8、 並びに E 4 5 6 NNA— 1 1 4 ( (Z) が A 1 a ) においても、 それぞれの Km値、 及び k c a tの値は、 上記の値と同程度であった。  Further, (Z) in the formula (1) is different from E456-NNV-118 or E455-NNV-114 ((Z) is Va1). , E455NNA-118, and E456NNA-114 ((Z) is A1a), the respective Km and kcat values are the same as above. It was about.
また更には、 式 （ 1 ) 中の （X) が S e rであり、 （Y) が G 1 yである本 発明のトロンボモジュリン （E 4 5 6 SGV— 1 1 ) の Km値、 k c a tは、 それぞれ 1 5 /ζΜ、 4 9m i η_'であり、 アミノ酸配列が全て天然の公知のトロ ンボモジュリンと同一である本発明のトロンボモジュリン （Ε 4 5 6 NNV- 1 1 8、 Ε 4 5 6 NNV 1 1 4、 Ε 4 5 6 NNV- 1 1 5、 Ε 4 5 6 NNV- 1 1 6、 および E 4 56 NNV— 1 1 7) のそれと同程度であった。 Furthermore, the Km value and kcat of the thrombomodulin (E456GVV-11) of the present invention in which (X) in the formula (1) is Ser and (Y) is G1y are respectively Thrombomodulin of the present invention (Ε456 NNV-118, Ε456 NNV114) whose amino acid sequence is the same as that of a naturally-known known thrombomodulin. , Ε4 5 6 NNV- 1 1, Ε4 5 6 NNV- 1 1 6, and E 4 56 NNV—1 17).
実施例 4および実施例 5で示したように、 式 （ 1 ) 中の （W) は、 Va 1 - G l u - P r o— Va l - As p、 G l u— Pr o - Va l— As p、 P r o - Va l—As p、 Va l—As p、 または A s pもいずれであっても、 トロンビ ンに対する親和性、 プロテイン C活性化反応におけるパラメ一夕一 （Km値や k c a t ) には違いはなかった。 また、 （Z) が Vaし または A l aのいずれで あっても、 トロンビンに対する親和性、 プロテイン C活性化反応におけるパラメ 一夕一 （Km値や k c a t) には違いはなかった。  As shown in Example 4 and Example 5, (W) in equation (1) is Va 1 -Glu-Pro-Val-Asp, Glu-Pro-Val-Asp. , Pro-Val-Asp, Val-Asp, or Asp, the affinity for thrombin and the parameters (Km and kcat) in the protein C activation reaction There was no difference. Also, whether (Z) was Va or Ala, there was no difference in the affinity for thrombin and the parameters (Km value and kcat) in the protein C activation reaction.
これらのことから、 式 （ 1 ) 中の （W) は V a 1— G 1 u— P r 0— V a 1 -As p, G l u - P r o - Va l— As p、 P r o— Va l— As p、 Va l 一 A s p、 または A s pも何れであっても、 更には （Z) は V a 1または A 1 a のいずれであっても、 本発明のトロンボモジュリンの、 トロンビンによるプロテ イン Cの活性化を促進する作用の強さは同じであることがわかった。  From these facts, (W) in the equation (1) is V a 1—G 1 u—P r 0—V a 1—As p, G lu—Pro—Val—As p, P ro—V a l-Asp, Val-l Asp, or Asp, and (Z) whether it is Va1 or A1a, the thrombomodulin of the present invention is protected by thrombin. The strength of the action promoting the activation of in C was found to be the same.
さらには、 （X) が S e rであり、 （Y) が G 1 yである本発明のトロンボ モジュリ ン （£ 45630 ー 1 1 4) においても、 ァミノ酸配列が全て天然の 公知のトロンボモジュ リンと同一である本発明のトロンボモジュリン （E 456 NNV- 1 1 8や E 45 6 NNV 1 1 4など） と同様に、 トロンビンによるプロ ティン Cの活性化を促進する作用を有し、 その作用の程度は同等なものであるこ とがわかった。 実施例 6  Furthermore, in the thrombomodulin of the present invention (£ 45630-114) in which (X) is Ser and (Y) is G1y, the known thrombomodulin in which the amino acid sequence is all natural Like the thrombomodulins of the present invention (E456NNV-118, E456NNV114, etc.) which are the same as those of the present invention, they have the effect of promoting the activation of protein C by thrombin, and the degree of the effect Was found to be equivalent. Example 6
本発明のトロンボモジュリンの血液体外循環  Extracorporeal blood circulation of thrombomodulin of the present invention
モデルにおける効果  Effects in the model
ペントバルビタール麻酔下 （ 25mgZk g、 静脈内投与） の力二クイザル (体重 3〜5 k g) の外頸動静脈に力ニューレを挿入し、 動物用ダイァライザ一 (MCA- 0. 05乙、 膜面積0. 05 ΙΏ 2 、 泉ェ医科工業社製） を組み込んだ 血液回路 （プライ ミ ング容量約 25 m 泉ェ医科工業社製） に接続した。 血液 体外循環は、 ポンプを用い頸動脈より血液を毎分 1 5m lの速度で導き、 ダイァ ライザ一を経て、 頸静脈へ返血した。 透析液にはキンダリー液 AF - 2号 （扶桑 薬品社製） を用い、 毎分 5 Om 1の速度で循環した。 透析時間は 1 20分間とし た。 Under pentobarbital anesthesia (25 mg Zkg, intravenous administration), a force-neuurer was inserted into the external jugular artery and vein of a cynomolgus monkey (body weight 3 to 5 kg), and an animal dialyzer (MCA-0.05 O, membrane area 0. 05 ΙΏ 2 , manufactured by Izumi Medical Industry Co., Ltd.) It was connected to a blood circuit (priming capacity approx. 25 m, manufactured by Izumi Medical Industry Co., Ltd.). Blood extracorporeal circulation was performed using a pump to draw blood from the carotid artery at a rate of 15 ml / min, and returned to the jugular vein via a dialyzer. The dialysate was circulated at a rate of 5 Om 1 per minute using Kinderly AF-2, a product of Fuso Pharmaceutical Co., Ltd. The dialysis time was set to 120 minutes.
本発明のトロンボモジュリ ンは、 体外循環開始直前に、 血液回路の頸動脈に 近い箇所より回路内へ投与し、 引き続いて血液体外循環中は同箇所より回路内に 持続投与し、 回路内循環中の血液の凝固時間 （活性化部分トロンボプラスチン時 間、 以下 APTTと略す） が、 血液体外循環開始前の力二クイザル体内血液の A PTTの 1 5 0 %前後となるようにした。 通常のトロンボモジュリ ン （ドメイン 1、 ドメイン 2、 およびドメイン 3からなるトロンボモジュ リ ン） についても、 血液体外循環中における回路内循環中の血液の A PTTか、 血液体外循環開始前 の 1 5 0 %前後となるように回路内に投与した。 本発明のトロンボモジュリン、 および通常のトロンボモジュリンの回路内の血液凝固防止効果をみるために、 血 液体外循環中の回路内圧を測定した。  The thrombomodulin of the present invention is administered immediately before the start of extracorporeal circulation into the blood circuit from a location near the carotid artery, and then continuously administered into the circuit from the same location during extracorporeal blood circulation. The coagulation time of the blood (activated partial thromboplastin time, hereinafter abbreviated as APTT) was set to be about 150% of the APTT of the blood in the primate monkey monkey before the start of extracorporeal blood circulation. For normal thrombomodulin (thrombomodulin consisting of domain 1, domain 2, and domain 3), the APTT of blood in the circuit during extracorporeal blood circulation or 150% of the blood before the start of extracorporeal blood circulation The administration was performed in the circuit so as to be before and after. In order to see the blood coagulation preventing effect of the thrombomodulin of the present invention and the ordinary thrombomodulin in the circuit, the circuit pressure during extracorporeal blood circulation was measured.
血液体外循環開始前の力二クイザル体内血液の A P T Tを測定するための血 液は、 大腿静脈より、 そして血液体外循環中における回路内循環中の血液の A P TTを測定するための血液は、 ダイァライザ一通過後の血液回路部位 （頸静脈へ 返血する手前に位置するところ） より採血した。 採血した血液は、 9分の 1量の 3. 8 %クェン酸ナトリウムと混合し、 続いて遠心により血漿を得、 その血漿を 用い、 APTTを測定した。 また、 血液体外循環終了後においても、 力二クイザ ルの大腿静脈より採血し、 体外循環終了後の力二クィザル体内血液の A P T Tを 調べた。 APTTは体外診断用医薬品デ一タフアイ ■ APTT (国際試薬社製） を用い、 添付の操作方法に準じて測定した。  The blood for measuring the APTT of blood in the monkey monkey prior to the start of extracorporeal blood circulation is from the femoral vein, and the blood for measuring the APTT of blood circulating in the circuit during extracorporeal blood circulation is a dialyzer. Blood was collected from the blood circuit site after one pass (located just before returning blood to the jugular vein). The collected blood was mixed with one-ninth volume of 3.8% sodium citrate, followed by centrifugation to obtain plasma, and APTT was measured using the plasma. Even after the end of extracorporeal circulation, blood was collected from the femoral vein of the quiz and the APTTT of the blood in the quiz monkey after the end of the extracorporeal circulation was examined. APTT was measured using in vitro diagnostic drug data ■ APTT (manufactured by Kokusai Reagents) in accordance with the attached operation method.
本試験に用いた、 本発明のトロンボモジュリン、 及び上記の通常のトロンボ モジュリンは、 特開平 1一 6 2 1 9号公報に記載の方法、 または本発明の実施例 CT/JP97/02009 The thrombomodulin of the present invention used in this test, and the above-mentioned ordinary thrombomodulin, were prepared by the method described in JP-A No. CT / JP97 / 02009
32 32
3に示した方法により、 それぞれの形質転換細胞の培養上澄液より精製した。 Purified from the culture supernatant of each transformed cell by the method shown in 3.
通常のトロンボモジュリンは、 血液体外循環中の回路内圧の上昇を抑制した Ordinary thrombomodulin suppressed the rise in intra-circuit pressure during extracorporeal blood circulation
(第 2図参照） 。 しかしながら、 その終了後 6 0分においても、 力二クイザル体 内血液の凝固時間 （APTT) の延長が見られた （第 3図参照） 。 このように、 通常のトロンボモジュリンを用いた場合、 体外循環終了後も長く、 血液中には、 その血液凝固抑制活性が残存しており、 したがって、 通常のトロンボ乇ジュ リ ン を血液体外循環回路の血液凝固防止に用いた場合には、 出血の注意を必要としな ければならないと考えられた。 一方、 本発明のトロンボモジュ リ ン、 E 4 5 6 N NV- 1 1 4または E 4 5 6 NNV- 1 1 8を用いた場合、 血液体外循環中の回 路内圧の上昇を抑制し （第 2図参照） 、 そして体外循環終了 3 0分後の力二クイ ザル体内血液の凝固時間 （APTT) は、 すでに体外循環開始前のレベル （基礎 値） に回復していた （第 3図参照） 。 (See Figure 2). However, even after 60 minutes, the coagulation time (APTT) of the blood in the cynomolgus monkey body was prolonged (see Fig. 3). Thus, when normal thrombomodulin is used, it is long after the end of extracorporeal circulation, and its blood coagulation inhibitory activity remains in the blood. When used for anticoagulation, it was considered that bleeding must be taken care of. On the other hand, when the thrombomodulin of the present invention, E456NNN-114 or E456NNV-118, is used, it is possible to suppress an increase in circuit pressure during extracorporeal blood circulation (see The clotting time (APTT) of the blood in the quiz monkey 30 minutes after the end of extracorporeal circulation had already recovered to the level (basal value) before the start of extracorporeal circulation (see Fig. 3). .
式 （ 1 ) 中の （Z) 力、 上記の E 4 5 6 NNV- 1 1 4や E 4 5 6 NNV— The (Z) force in Eq. (1), the above E 456 NNV- 114 or E 456 NNV—
1 1 8とは異なる本発明のトロンボモジュリン、 E 4 5 6 NNA— 1 1 4、 また は E 4 5 6NNA— 1 1 8を用いた場合においても、 E 4 5 6NNV— 1 1 4や E 4 5 6 NNV- 1 1 8と同様に血液体外循環中の回路内圧の上昇を抑制した。 そして、 第 4図に示すように、 E 4 5 6NNA— 1 1 4、 または E 4 5 6NNA 一 1 1 8を用いた体外循環においても、 サル体内血液の凝固時間 （APTT) は 、 体外循環終了 3 0分後ですでに体外循環開始前のレベル （基礎値） に回復して いた。 Even when the thrombomodulin of the present invention different from 118, E456NNA-114 or E456NNA-118 is used, E456NNNV-114 or E45 6 In the same way as NNV-118, the increase in circuit pressure during extracorporeal blood circulation was suppressed. In addition, as shown in FIG. 4, in extracorporeal circulation using E456NNA-114 or E456NNA-118, the blood coagulation time (APTT) of the monkey's body blood is determined by the end of extracorporeal circulation. After 30 minutes, the level had already returned to the level before the start of extracorporeal circulation (basal value).
このように、 本発明のトロンボモジュリンは、 血液体外循環回路内の血液凝 固を効果的に防止し、 そして体外循環終了後の止血の処置や注意が、 通常のトロ ンボモジュリ ンよりも少ないことがわかった。 実施例 7  Thus, it can be seen that the thrombomodulin of the present invention effectively prevents blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit, and requires less hemostasis treatment and attention after the end of extracorporeal circulation than normal thrombomodulin. Was. Example 7
本発明のトロンボモジュリンの静脈内投与後の血中濃度推移 ( 1 ) 力ニイクザルにおける血中濃度推移 Changes in blood concentration after intravenous administration of the thrombomodulin of the present invention (1) Changes in blood levels in cynomolgus monkeys
無麻酔下の力二クイザル （体重 2. 5〜3. 5 k g) の後肢小伏在静脈内に 本発明のトロンボモジュ リ ン、 または通常のトロンボモジュ リ ン （ 1 0 OmM塩 化ナ トリウムを含む pH 7. 4の 2 OmMリン酸緩衝液で 0. 5mg/m lに調 製した） を 0. 1 mgZk g単回投与した。 投与後、 第 5図中に示した時間に、 後肢小伏在静脈もしくは大腿静脈より採血した。 血液は 9分の 1量の 3. 8 %ク ェン酸ナトリウムと混合し、 続いて遠心により血漿を得、 血漿中の本発明のトロ ンボモジュリ ン、 または通常のトロンボモジユリ ンの濃度を測定した。  The thrombomodulin of the present invention or normal thrombomodulin (10 OmM sodium chloride) was injected into the hindlimb small saphenous vein of a non-anesthetized cynomolgus monkey (body weight: 2.5 to 3.5 kg). (Prepared at 0.5 mg / ml with 2 OmM phosphate buffer at pH 7.4) containing 0.1 mg Zkg. After administration, blood was collected from the hind limb small saphenous vein or femoral vein at the times shown in FIG. Blood is mixed with 1/9 volume of 3.8% sodium citrate, followed by centrifugation to obtain plasma and measure the concentration of thrombomodulin of the present invention or normal thrombomodulin in plasma did.
(2) ラッ 卜における血中濃度推移  (2) Changes in blood concentration in rat
麻酔下のラッ ト （SD系、 雄、 体重 1 8 0〜2 5 0 g) の尾静脈内に本発明 のトロンボモジュ リ ン （生理食塩水で 0. 1 mg/m 1に濃度調製した） を 0. 1 mg/k g単回投与した。 投与後 2、 5、 1 5、 3 0、 6 0分に、 頸静脈より へパリン採血した。 へパリン添加血は遠心し、 血漿を得、 血漿中の本発明のトロ ンボモジュ リ ンの濃度を測定した。  Thrombomodulin of the present invention (adjusted to a concentration of 0.1 mg / m1 in saline) in the tail vein of an anesthetized rat (SD strain, male, weighing 180-250 g) Was administered in a single dose of 0.1 mg / kg. Heparin blood was collected from the jugular vein at 2, 5, 15, 30, and 60 minutes after administration. Heparinized blood was centrifuged to obtain plasma, and the concentration of the thrombomodulin of the present invention in the plasma was measured.
血漿中の本発明のトロンボモジュ リ ン、 または通常のトロンボモジュ リ ンの 濃度は、 ェンサイムィ厶ノアッセィ （E L I S A) により測定した。 E L I S A は、 特開平 5— 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 1一 （ 4 ) に記載の方法に準じて行 つた。 投与前の力二クイザル、 またはラッ ト血漿中には、 本発明のトロンボモジ ュ リ ン、 または通常のトロンボモジュ リ ンは検出されなかった。  The concentration of the thrombomodulin of the present invention or normal thrombomodulin in plasma was measured by Enzyme Immunoassay (ELISA). ELISA was carried out according to the method described in Example 11 (4) of JP-A-5-213998. No thrombomodulin of the present invention or normal thrombomodulin was detected in primate monkey or rat plasma before administration.
第 5図には、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4、 または通常トロンボモジュ リ ンをカ 二クイザル静脈内に投与した後の血中濃度推移を示した。 通常トロンボモジュリ ンは血液中からの消失が遅いのに対して、 E 4 5 6 NNV - 1 1 4は血液中から 速やかに消失された。 最初の採血時点 （投与 2分後） での血中濃度からその半分 に低下するまでの時間は、 通常のトロンボモジユリンでは約 4時間であるのに対 して、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4では約 1 0分であった。 尚、 通常のトロンボモジ ュリ ンの力二クイザルにおける上記の結果は、 以前に報告されているラッ トにお ける結果と同様であった （Th r omb. H a em o s t . , 6 7, 3 6 6— 3 7 0， 1 9 9 2) o FIG. 5 shows changes in blood concentration after intravenous administration of E456NNNV-114 or normal thrombomodulin to cynomolgus monkeys. Normally, thrombomodulin disappeared from the blood slowly, whereas E456NNN-114 was rapidly cleared from the blood. The time required for the blood concentration at the time of the first blood collection (2 minutes after administration) to drop to half of that is about 4 hours for normal thrombomodulin, whereas that for E456-NNV-1 In 14 it was about 10 minutes. The above results in normal thrombomodulin force-frog monkeys have been reported in rats previously reported. (Thromb. Haemost., 6 7, 3 6 6—37 0, 1992) o
E 4 5 6 NNV— 1 1 4は、 第 5図で示した力二クイザルにおける結果と同 様に、 ラ ッ トにおいても血中から速やかに消失された （第 6図参照） 。 また、 式 ( 1 ) 中の （W) が、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4 とは異なる本発明のト口ンボ乇ジ ュリ ン、 E 4 5 6 NNV— 1 1 8もまた、 同様に血中からの消失が速かった （第 6図参照） 。 さらには、 式 （ 1 ) 中の （X) 並びに （Y) のァミノ酸が、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4とは異なる本発明のトロンボモジュリ ン、 E 4 5 6 S GV- 1 1 4 もまた、 血中からの消失が速かった （第 6図参照） 。 E 4 5 6NNV— 1 1 4、 E 4 5 6 NNV— 1 1 8、 そして E 4 5 6 SGV— 1 1 のすベては、 ラ ッ ト血中より速やかに消失し、 最初の採血時点 （投与 2分後） での血中濃度からそ の半分に低下するまでの時間は、 6〜8分の間にあった。  E455-NNV-114 was rapidly cleared from the blood in rats, as was the case in the cynomolgus monkeys shown in Fig. 5 (see Fig. 6). In addition, the tongue bodulin of the present invention, in which (W) in the formula (1) is different from E4566NNV-114, E456NNN-118, is also the same. It rapidly disappeared from the blood (see Fig. 6). Furthermore, the thrombomodulin of the present invention, E456 SGV-114, in which the amino acids of (X) and (Y) in the formula (1) are different from E456 NNV-114, is also provided. It disappeared quickly from the blood (see Fig. 6). All of the E4.56NNV-114, E456NNNV-118, and E456SGV-11 disappeared more rapidly than the rat blood at the time of the first blood draw ( The time required for the blood concentration to drop to half that at 2 minutes after administration) was between 6 and 8 minutes.
またさらには、 式 （ 1 ) 中の （Z) 力、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4や E 4 5 6 NNV— 1 1 8 とは異なる本発明のトロンボモジュリ ン、 E 4 5 6 NNA— 1 1 4や E 4 5 6 NNA - 1 1 8においても、 ラ ッ ト血中より速やかに消失し、 最初 の採血時点 （投与 2分後） での血中濃度からその半分に低下するまでの時間は、 6〜 8分の間にあった。  Furthermore, the (Z) force in the formula (1), the thrombomodulin of the present invention different from the E456NNN-114 and E456NNV-118, the E456NNA-1 In 14 and E456NNA-118, the time it takes for the blood to disappear more rapidly than in rat blood and to drop from the blood concentration at the first blood sampling (2 minutes after administration) to half that of blood Was between 6 and 8 minutes.
このように、 本発明のトロンボモジュリンは、 通常のトロンボモジュリン （ ドメイン 1、 ドメイン 2およびドメイン 3からなる トロンボモジュリン） とは異 なり、 血中からの消失がはやい性質を有していた。 そして、 式 （ 1 ) 中の （W) 、 (X) 、 (Y) 、 および （Z) が、 本発明に記載したぺプチド、 またはァミノ 酸のいずれであっても、 式 （ 1 ) で表されるァミノ酸配列からなる本発明のトロ ンボモジュリ ンは、 血中からの消失がはやい性質を有するものと考えられた。 実施例 8  Thus, the thrombomodulin of the present invention was different from normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3) and had a property of rapidly disappearing from the blood. And, even if (W), (X), (Y) and (Z) in the formula (1) are any of the peptides or amino acids described in the present invention, the formula (1) It was considered that the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence obtained had a property of rapidly disappearing from the blood. Example 8
本発明のトロンボモジュリンの線溶系に及ぼす影響 組織プラスミノーゲンァクチべ一夕一 （以下、 t — PAと略す） のフィプリ ンクロッ ト溶解に及ぼす影響は、 以下のようにして調べた。 すなわち、 ヒ ト乏血 小板血漿を 0. 1 5 M塩化ナ ト リウムを含む p H 7. 3の 2 0mM HE P ES 緩衝液 （以下、 HBSと略する） で 3. 2倍に希釈した血漿希釈液を 9 6穴マイ クロプレー卜の各ゥエルに 1 6 0〃 1ずつ分注し、 さらに本発明のトロンボモジ ュリ ン、 または通常のトロンボモジュリン （ドメイン 1、 ドメイン 2およびドメ ィン 3からなる トロンボモジュリン） を含む溶液 （ 0. 1 %B S Aを含む HB S で濃度調製した） 2 0 1を加えて混合した。 3 7°Cで 2 - 3分保温後、 t 一 P Aと塩化カルシウムを含む溶液、 2 0 1を加えて混合した （ t一 PAと塩化力 ルシゥムの終濃度は、 それぞれ 1 0 0 n g/ 1、 1 0 mMである） 。 その混合 液は、 3 7°Cで保温し、 同時にマイクロプレートリーダ一 M— Tm a Xを用い、 各ゥエルの波長 4 0 5 nmの吸光度を、 1分毎に 1 2 0分間測定した。 Effect of thrombomodulin of the present invention on fibrinolytic system The effect of tissue plasminogen activator (hereinafter abbreviated as t-PA) on fibrin clot dissolution was examined as follows. That is, human ischemic platelet plasma was diluted 3.2-fold with 20 mM HE PES buffer (hereinafter abbreviated as HBS) containing 0.15 M sodium chloride at pH 7.3. The plasma diluent was dispensed into each well of a 96-well microplate in a quantity of 160 μl, and the thrombomodulin of the present invention or ordinary thrombomodulin (comprising domain 1, domain 2 and domain 3) (Thrombomodulin) (concentration adjusted with HBS containing 0.1% BSA) was added and mixed. After keeping at 37 ° C for 2-3 minutes, a solution containing t-PA and calcium chloride, 201, was added and mixed (the final concentrations of t-PA and chloride were 100 ng / l respectively. , 10 mM). The mixture was kept at 37 ° C, and at the same time, the absorbance at a wavelength of 405 nm of each well was measured for 120 minutes every minute using a microplate reader M-Tmax.
吸光度は、 はじめフイブリ ンクロッ トの形成に伴って上昇し、 その後、 t— PAの存在によりフィプリ ンクロッ トは溶解されるため、 吸光度は低下する。 第 7図には、 フイブリンクロッ 卜形成後からクロッ トが完全に溶解するまでの時間 、 すなわち吸光度が最大を示した時点から吸光度が基礎値 （測定開始直後の吸光 度） までに低下するまでの時間について、 本発明のトロンボモジュ リ ン （E 4 5 6NNV- 1 1 4) 、 または通常のトロンボモジュリ ンの各々の濃度における結 果を示した。 E 4 5 6 NNV- 1 1 4は、 通常のト口ンボモジュリ ンでみられる 、 t —P Aによるフイブリン溶解を阻害する作用が欠如していた （第 7図参照） 。  The absorbance first increases with the formation of fibrin clot, and then decreases because fibrin clot is dissolved by the presence of t-PA. Figure 7 shows the time from the formation of the fibrous clot to the complete dissolution of the clot, that is, the time from when the absorbance reached its maximum to when the absorbance decreased to the basal value (absorbance immediately after the start of measurement). With respect to time, the results at the respective concentrations of the thrombomodulin of the present invention (E456NNV-114) or the normal thrombomodulin are shown. E456-NNV-114 lacked the effect of inhibiting fibrin lysis by t-PA, which is observed in normal tonbomodulin (see FIG. 7).
また、 E 4 5 6 NNV— 1 1 8、 E 4 5 6 NNA- 1 1 4、 E 4 5 6 NNA - 1 1 8. E 4 5 6 SGV- 1 1 4についても試験したところ、 E 4 5 6 NNV - 1 1 4と同様に t— PAによるフィプリン溶解を阻害する作用が欠如していた (第 8図参照） 。  In addition, when E4.55NNV—118, E456NNA-1114, E456NNA-11.8 and E456SGV114 were tested, 6 As in NNV-114, the inhibitory effect on fibrin dissolution by t-PA was lacking (see FIG. 8).
このように、 本発明のトロンボモジュリンは、 通常のト口ンボモジュリン （ ドメイン 1、 ドメイン 2およびドメイン 3からなるトロンボモジュ リ ン） とは異 なり、 t一 PAによるフイブリ ン溶解を阻害する作用が欠如している、 すなわち 線溶阻害作用が欠如しているという性質を有していることがわかった。 そして、 式 （ 1 ) 中の （W) 、 （X) 、 (Y) 、 および （Z) 、 本発明に記載したぺプ チド、 またはァミノ酸のいずれであっても、 式 （ 1 ) で表されるアミノ酸配列か らなる本発明のトロンボモジュリ ンは、 線溶阻害作用が欠如しているものと考え られた。 実施例 9 As described above, the thrombomodulin of the present invention is different from the normal tongue thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3). Thus, it was found that t-PA lacks the action of inhibiting fibrinolysis, that is, it has the property of lacking the fibrinolysis inhibitory action. And, regardless of (W), (X), (Y), and (Z) in the formula (1), the peptide or the amino acid described in the present invention, the formula (1) It was considered that the thrombomodulin of the present invention consisting of the amino acid sequence shown above lacked the fibrinolytic inhibitory action. Example 9
本発明のトロンボモジュリン断片物の急性毒性  Acute toxicity of thrombomodulin fragments of the invention
本発明のトロンボモジユリ ンの急性毒性を調べた。 各群 3匹の雄性 SDラッ ト （5週令） を用いて、 E 4 5 6 NNV— 1 1 4を 9 0mg/k g、 1 8 Omg Zk gの用量にて静脈内投与し、 1 4日後までの観察を行ったが、 毒性や死亡例 は 1例も認められなかった。 また、 E 4 5 6 NNV— 1 1 8、 E 4 5 6 NNA- 1 1 4、 E 4 5 6 NNA— 1 1 8、 E 4 5 6 S G V- 1 1 4についても試験した ところ、 E 4 5 6 NNV- 1 1 4と同様に、 毒性や死亡例は 1例も認められなか つ Ί乙.。  The acute toxicity of the thrombomodulin of the present invention was examined. E4556NNV-114 was administered intravenously at a dose of 90 mg / kg and 18 Omg Zkg using three male SD rats (5 weeks old) of each group, and 14 days later. Observation up to but no toxicity or death was observed. E 456 NNV-118, E 456 NNA-114, E 456 NNA-118, E 456 SGV-114 were also tested. 5 6 Similar to NNV-114, no toxicity or death was observed in any one case.
したがって、 本発明のトロンボモジュリ ンは、 毒性のない、 安全性の高いも のであることが確認された。 実施例 1 0  Therefore, the thrombomodulin of the present invention was confirmed to be non-toxic and highly safe. Example 10
本発明のトロンボモジュリ ンの抗原性試験  Antigenicity test of thrombomodulin of the present invention
E 4 5 6 NNV- 1 1 4の免疫原性を調べた。 力二クイザル （雄性、 体重約 3. 5 k g) を用いて、 E 4 5 6NN— 1 1 4を 0. 5mg/k g、 5mg/k gの用量にて、 一日一回、 2週間、 0. 6 6m 1 Zkg/h rの投与速度で 3時 間静脈内持続投与した （各投与群 2匹） 。 投与開始前、 投与開始 6、 1 3日目、 2週間の連投終了後に 6、 1 3日目に採血し、 血清を得、 その血清は抗体価測定 用に供した。 その結果、 抗体産出能は陰性であった。 The immunogenicity of E455 NNV-114 was examined. E-456NN-114 was administered at 0.5 mg / kg and 5 mg / kg once daily for 2 weeks in male cynomolgus monkeys (male, about 3.5 kg in weight). Intravenous administration was continued for 3 hours at a dose rate of 66 m1 Zkg / hr (2 animals in each administration group). Blood is collected before administration, on days 6 and 13 after administration, and on days 6 and 13 after two weeks of continuous administration, and serum is obtained, and the serum is measured for antibody titer Served for As a result, the antibody production ability was negative.
したがって、 本発明のトロンボモジュ リ ンには、 抗原性はないことが確認さ  Therefore, it was confirmed that the thrombomodulin of the present invention has no antigenicity.
実施例 1 1 Example 1 1
本発明のトロンボモジュ リ ンのラッ ト血中脂質  Rat blood lipid of thrombomodulin of the present invention
レベルに及ぼす影響  Effect on level
本発明のトロンボモジュリン、 またはフラグミ ン （フラグミンは、 血液透析 時の回路内の血液凝固防止のために、 臨床的に用いられている低分子へパリ ンで ある。 一股名 ： ダルテパリ ンナトリウム） を、 麻酔下のラッ 卜に静脈内投与した The thrombomodulin or fragmin of the present invention (fragmin is a low-molecular-weight heparin that is clinically used to prevent blood coagulation in a circuit during hemodialysis. One name: dalteparin sodium) Was administered intravenously to a rat under anesthesia.
。 投与前、 投与後 5、 1 0、 30分に、 ラッ トの静脈より採血し、 血中のトリグ リセライ ド （TG) 、 並びに遊離脂肪酸 （FFA) を測定した。 TG、 並びに F F Aの測定は、 それぞれ体外診断用医薬品アナソルブ TG— 2 (第一化学薬品社 製） 、 体外診断用医薬品アナソルブ NEF A (第一化学薬品社製） を用いて行つ た。 本発明のトロンボモジュリ ン、 またはフラグミ ン投与後のラッ ト血中 TG、 および F FAレベルの変化は、 投与前の血中 TG、 および FFAレベルを 1 00 %として表示した。 . Before administration, 5, 10, and 30 minutes after administration, blood was collected from the vein of the rat, and triglyceride (TG) and free fatty acid (FFA) in the blood were measured. TG and FFA were measured using an in vitro diagnostic drug Anasorb TG-2 (manufactured by Daiichi Kagaku) and an in vitro diagnostic drug Anasolve NEFAA (manufactured by Daiichi Kagaku), respectively. Changes in rat blood TG and FFA levels after administration of the thrombomodulin or fragmin of the present invention were expressed with the blood TG and FFA levels before administration as 100%.
第 9図および第 1 0図に示すように、 フラグミ ン （20単位 Zk g) の投与 は、 ラッ ト血中の TGを低下させ、 FFAを上昇させた。 尚、 フラグミ ンの投与 量 20単位 Zk gは、 1回の血液透析に使用される量の約 3分の 1に相当するも のである。 一方、 E 456 NNV- 1 1 4は、 実施例 6の体外循環モデルにおい て回路内血液凝固を防止できた量よりも多い量 （lmg/kg) を投与しても、 ラッ ト血中の TG、 並びに FFAのレベルに全く影響を及ぼさなかった。  As shown in FIGS. 9 and 10, administration of fragmin (20 units Zkg) reduced TG in rat blood and increased FFA. In addition, the dose of 20 units of fragmin Zkg is equivalent to about one third of the amount used for one hemodialysis. On the other hand, E 456 NNV-114 showed that TG in rat blood was not increased even when a larger amount (lmg / kg) was administered than in the extracorporeal circulation model of , And had no effect on FFA levels.
したがって、 本発明のトロンボモジユリンは、 既存薬であるフラグミ ンとは 異なり、 血中の脂質レベルに何ら影響をもたらさないことが確認できた。 実施例 1 2 Therefore, it was confirmed that the thrombomodulin of the present invention did not have any effect on blood lipid levels, unlike the existing drug fragmin. Example 1 2
組 成 例  Composition example
塩化ナトリウム 8. 78 mgZm 1およびリ ン酸二水素ナト リ ウム 2. 4 0 mgZm 1を含有する水溶液の pHを水酸化ナトリウムにて pH 7. 3とし、 こ の水溶液にて、 精製した本発明トロンボモジュ リ ンを溶解し （トロンボモジユ リ ンとして 3. 3 5mg/m 1 ) 、 本発明の組成物 （溶液） を調製した。  The pH of an aqueous solution containing 8.78 mg Zm 1 of sodium chloride and 2.40 mg Zm 1 of sodium dihydrogen phosphate was adjusted to pH 7.3 with sodium hydroxide, and the present invention was purified using this aqueous solution. Thrombomodulin was dissolved (3.35 mg / m 1 as thrombomodulin) to prepare a composition (solution) of the present invention.
上記の本発明のトロンボモジュ リ ンを含有する組成物は、 投与前に、 生理食 塩水にて、 本発明トロンボモジュリ ン 1 mgZm 1の濃度に希釈し、 例えば透析 においては、 透析開始直前に、 体外循環回路内へ、 3mg (トロンボモジュリ ン 量として） を一括投与し、 引き続いて透析施行中に、 2mg/h r (トロンボモ ジュリ ン量として） の持続注入を行う。 発明の効果  The composition containing the above-mentioned thrombomodulin of the present invention is diluted with physiological saline to a concentration of 1 mg Zm1 of the present invention before administration, for example, in dialysis, immediately before the start of dialysis, Administer 3 mg (as the amount of thrombomodulin) into the circulatory circuit in a lump, followed by continuous infusion of 2 mg / hr (as the amount of thrombomodulin) during dialysis. The invention's effect
本発明により、 有効であつて安全性の高い血液体外循環回路用の血液凝固防 止のための医薬組成物を提供することができ、 しかも該組成物を血液体外循環回 路内に注入することにより、 血液凝固防止方法をも提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an effective and highly safe pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for a blood extracorporeal circuit, and to inject the composition into the extracorporeal circuit. Accordingly, a method for preventing blood coagulation can also be provided.
r i ^L - ourn r i ^ L-ourn
Z - ¼ 3S 911
Figure imgf000041_0001
Z-¼ 3S 911
Figure imgf000041_0001
0Π 901 001 V na ¾iv s dsy OJd s 9Π SAQ n{0 9Md OJd 0Π 901 001 V na ¾iv s dsy OJd s 9Π SAQ n {0 9Md OJd
96 06 98 96 06 98
Π9Ί usv SIH SA3 八 19 S sAQ aqj Aio io usy nig s dsy 08 91 OA 39 Π9Ί usv SIH SA3 8 19 S sAQ aqj Aio io usy nig s dsy 08 91 OA 39
911 dsv 9Π 3Md dsy dsv naq d\] αλχ λιο nio。 s 911 dsv 9Π 3Md dsy dsv naq d \] αλχ λιο nio. s
09 99 OS 09 99 OS
"19 sAo J9S ¾iv uio J¾ usy OJJ dsy s dsy ¾IV SAQ BIV J¾ "19 sAo J9S ¾iv uio J¾ usy OJJ dsy s dsy ¾IV SAQ BIV J¾
^ 9δ uiO usv SA3 3qd 9}¾ ui SAQ SIH OJd n S?H OJ^ d\\ ojj ¾iv  ^ 9δ uiO usv SA3 3qd 9} ¾ ui SAQ SIH OJd n S? H OJ ^ d \\ ojj ¾iv
OS 92 OS OS 92 OS
9ild ^IO ni9 BIV SAQ ΐ¾Λ SAQ naq JAI S JMl uio usv OJJ UI9ild ^ IO ni9 BIV SAQ ΐ¾Λ SAQ naq JAI S JMl uio usv OJJ UI
9Ϊ 01 9 ΐ s^O «10 J "10 usv BIV 3JV s OJd dsy ί¾Λ 。· "10 Λ urn 葛 g蚩 ·' mcowm m 11. - ourn9Ϊ 01 9 ΐ s ^ O «10 J " 10 usv BIV 3JV s OJd dsy ί¾Λ. "" 10 Λ urn kuzu g chi · 'mcowm m 11.-ourn
8 1 ΐ ： ？ mm 8 1 ΐ:? mm
6 ε6 ε
rO/i.6<If/XDd £SII0/86OA\ 配列の種類：蛋白質 rO / i.6 <If / XDd £ SII0 / 86OA \ Sequence type: protein
配列 Array
Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro し eu Asn Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro eu Asn
1 5 10 151 5 10 15
Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro lie Pro Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro lie Pro
20 25 30  20 25 30
His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro  His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro
35 40 45  35 40 45
Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly
50 55 60 50 55 60
Tyr lie Leu Asp Asp Gly Phe lie Cys Thr Asp lie Asp Glu Cys Glu 65 70 75 80 Tyr lie Leu Asp Asp Gly Phe lie Cys Thr Asp lie Asp Glu Cys Glu 65 70 75 80
Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe
85 90 95 85 90 95
Glu Cys lie Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His lie Gly Thr Glu Cys lie Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His lie Gly Thr
100 105 110  100 105 110
Asp Cys  Asp Cys
114 配列番号 ： 3  114 SEQ ID NO: 3
配列の長さ ： 1 6 Array length: 1 6
配列の型 ： アミノ酸 Sequence type: amino acid
配列の種類：ぺプチド Sequence type: peptide
配列 Array
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 配列番号 ： 4 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 SEQ ID NO: 4
配列の長さ ： 25 Array length: 25
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GGAGGCCGCT CAACAGTCGG TGCCA 25 配列番号 ： 5  GGAGGCCGCT CAACAGTCGG TGCCA 25 SEQ ID NO: 5
配列の長さ ： 2 5 Array length: 2 5
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
CACGGGCTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 配列番号 ： 6  CACGGGCTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 6
配列の長さ ： 4 8 Array length: 4 8
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG GCCTGGGG 48 配列番号 ： 7  ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG GCCTGGGG 48 SEQ ID NO: 7
配列の長さ ： 2 5 Array length: 2 5
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA 配列 Sequence type: DNA Array
GAAGCACGGG TCGGGGAACC CCAGG 25 配列番号 ： 8  GAAGCACGGG TCGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 8
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
AATGTGGCGG GCAAGGGCCG A 21 配列番号 ： 9  AATGTGGCGG GCAAGGGCCG A 21 SEQ ID NO: 9
配列の長さ ： 2 5 Array length: 2 5
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GCACGGGTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 配列番号 ： 1 0  GCACGGGTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 10
配列の長さ ： 2 5 Array length: 2 5
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
CGGGTCCACG GGGGGGAACC CCAGG 25 配列番号 ： 1 1  CGGGTCCACG GGGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 1 1
配列の長さ ： 2 5 配列の型 ：塩基配列 Array length: 2 5 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GTCCACGGGC TCGGGGAACC CCAGG 25 配列番号 ： 1 2  GTCCACGGGC TCGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 1 2
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GGCAGTCTGT TGGCAAAACA T 21 配列番号 ： 1 3  GGCAGTCTGT TGGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 1 3
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GGCAGTCTGG CTGCAAAACA T 21 配列番号 ： 1 4  GGCAGTCTGG CTGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 14
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GGCAGTCTGG GCGCAAAACA T 21 配列番号 ： 1 5 GGCAGTCTGG GCGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 1 5
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GGCAGTCTGG CCGCAAAACA T 21 配列番号 ： 1 6  GGCAGTCTGG CCGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 16
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DN A Sequence type: DN A
配列 Array
GCTAGTTTGC TGCAGGGGCT G 21 配列番号 ： 1 7  GCTAGTTTGC TGCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 17
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GCTAGTTTGG CTCAGGGGCT G 21 配列番号 1 8  GCTAGTTTGG CTCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 18
配列の長さ 2 1  Array length 2 1
配列の型 塩基配列  Sequence type Base sequence
配列の種類 DNA 配列 Sequence type DNA Array
GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 配列番号 ： 1 9  GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 19
配列の長さ ： 2 1 Array length: 2 1
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 配列番号 2 0  GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 20
配列の長さ 2 5 Array length 2 5
配列の型 塩基配列 Sequence type Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
CACGGGCTCC ACCCCCAGGC CGGCC 25 配列番号 ： 2 1  CACGGGCTCC ACCCCCAGGC CGGCC 25 SEQ ID NO: 2 1
配列の長さ ： 2 5 Array length: 2 5
配列の型 ：塩基配列 Sequence type: Base sequence
配列の種類： DNA Sequence type: DNA
配列 Array
GAAGCACGGG TCCCCCAGGC CGGCC 25  GAAGCACGGG TCCCCCAGGC CGGCC 25

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1. 少なく ともァミノ酸配列として、 下記式 （ 1 ) 1. At least as an amino acid sequence, the following formula (1)
(W) — P r o - Cy s— Ph e—Ar g - A l a— As n— Cy s— G l u - Ty r— G】 n - Cy s—G l n - Pr o - L e u - （X) - G i n - Th r - S e r -Ty r -L e u-Cy s -Va 1—Cy s A l a— G l u - G l y - P h e - A 1 a— P r o - I 1 e - Pr o - H i s - G 1 u— P r o— H i s - Ar g— Cy s— G i n - Me t— Ph e - Cy s - (Y) —G i n - Th r - A l a - Cy s— Pr o A l a— As p— Cy s As p— Pr o— As n— Th r - G i n— A l a— S e r - Cy s - G l u— Cy s— P r o— G l u— G 1 y -Ty r - I 1 e - Le u - As p— As p - G l y— Ph e— I 1 e - Cy s— Th r— As p— I 1 e— As p— G l u-Cy s -G l υ-As n- G l y - G l y - Ph e— Cy s— S e r— G l y— Va l - Cy s— H i s - As n— L e u— P r o— G l y— Th r— Ph e - G l u— Cy s— I 1 e - Cy s - G l y - P r o— As p - Se r— A l a— Le u - (Z) — Ar g— H i s— I l e - G l y— Th r - As p - Cy s  (W) — Pro-Cy s — Ph e — Ar g-A la — As n — Cy s — G lu-Ty r — G] n-Cy s — G ln-Pr o-L eu-(X) -G in -Th r -Ser -Ty r -L e u-Cy s -Va 1—Cy s A la—G lu -G ly -P he -A 1a—P ro -I 1 e -Pro -H is-G 1 u-Pro-H is-Ar g-Cy s-G in-Met-Ph e-Cy s-(Y)-G in-Th r-A la-Cy s-Pr o A la— As p— Cy s As p— Pr o— As n— Th r-G in— A la— Ser- Cy s-G lu— Cy s— Pro— G lu— G 1 y-Ty r -I1e-Leu-Asp-Asp-Gly-Phe-I1e-Cys-Thr-Asp-I1e-Asp-Glu-Cys-Gl υ -As n-Gly-Gly-Phe—Cys—Ser—Gly—Val-Cys—His-Asn—Leu—Pro—Gly—Thr—Phe-G lu—Cy s—I 1 e—Cy s—G ly—Pro—Asp—Ser—A la—Le u— (Z) —Ar g—His—I le—G ly—Th r—As p-Cy s
( 1 ) (1)
〔式中、 （W) は、 Va l - G l u— P r o— Va l - As p、 G l u— Pr o 一 Va l— As p、 P r o— Va l— As p、 Va l— As p、 または As pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) と （Y) は、 互いに 異なる、 又は同一の、 As n、 G 1 n、 S e r, A 1 a、 または G 1 yのいずれ かのァミノ酸残基を、 （Z) は、 V a 1、 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残 基を示す。 〕 で表されるァミノ酸配列からなるトロンボモジュリ ンを有効成分と する血液体外循環回路内へ注入するための血液凝固防止用医薬組成物。 [Wherein (W) is Va l-G lu-Pro-Va l-As p, G lu-Pr o V a l-As p, Pro-V a l-As p, V a l-As p Or (A) a peptide residue or an amino acid residue of Asp, and (X) and (Y) are different or identical to each other, Asn, G1n, Ser, A1a, or G 1 y represents any amino acid residue, and (Z) represents Va 1 or A 1 a. ] A pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for injecting into a blood extracorporeal circuit, comprising as an active ingredient thrombomodulin comprising an amino acid sequence represented by the formula:
2. (X) および （Y) 力^ ともに A s nである請求の範囲 1項に記載の血 液体外循環回路内へ注入するための血液凝固防止用医薬組成物。 2. The blood according to claim 1, wherein both (X) and (Y) forces are A sn. A pharmaceutical composition for preventing blood coagulation to be injected into an extra-liquid circulation circuit.
3. (Z) 力 Va 1である請求の範囲 1項または 2項に記載の血液体外循 環回路内へ注入するための血液凝固防止用医薬組成物。 3. The pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for injection into the extracorporeal blood circulation circuit according to claim 1 or 2, wherein the pharmaceutical composition has (Z) force Va1.
4. (W) 力く、 Va l— G l u— P r o—Va l— As p、 または As pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) および （Y) 力^ と もに As nであり、 （Z) 力、 Va 1である請求の範囲 1項〜 3項のいずれかに 記載の血液体外循環回路内へ注入するための血液凝固防止用医薬組成物。 4. (W) Strong, Va l—G lu—Pro—Va l—Asp or any of Asp or Asp peptide residues or amino acid residues, with (X) and (Y) force ^ The pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for injecting into a blood extracorporeal circuit according to any one of claims 1 to 3, wherein the pharmaceutical composition is mainly Asn, (Z) force, and Va1.
5. (W) 力、 As pであり、 （X) および （Y) がともに As nであり、 (Z) が Va 1である請求の範囲 1項に記載の血液体外循環回路内へ注入するた めの血液凝固防止用医薬組成物。 5. The (W) force, Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Va1, injected into the extracorporeal blood circuit according to claim 1. Composition for preventing blood coagulation.
6. 持続的注入のための請求の範囲 1項〜 5項のいずれかに記載の血液体外 循環回路内へ注入するための血液凝固防止用医薬組成物。 6. The pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for injecting into a blood extracorporeal circuit according to any one of claims 1 to 5 for continuous infusion.
7. 少なく ともァミノ酸配列として、 下記式 （ 1 ) 7. At least as an amino acid sequence, the following formula (1)
(W) 一 P r o - Cy s— Ph e—Ar g - A l a—As n— Cy s— G l u - Ty r— G l n— Cy s— G i n— Pr o— Le u— (X) -G l n-Th r - S e r-Ty r -Le u-Cy s -Va l—Cy s— A l a— G l u - G 1 y - P h e - A 1 a— P r o - I 1 e - Pr o - H i s - G l u - P r o— H i s - Ar g— Cy s - G i n - Me t - Ph e - Cy s— (Y) 一 G i n - Th r - A l a— Cy s - Pr o - A l a— As p— Cy s - As p - Pr o - As n— Th r - G l n - A 1 a-S e r -Cy s -G l u - Cy s - P r o - G l u - G l y— Ty r— I 1 e— L e u— As p— As p— G l y— Ph e— I 1 e - Cy s -Th r -A s p - I 1 e— A s p - G l u - C y s - G 1 u - A s n - G l y -G l y- Ph e - C y s - S e r -G l y-Va l -C y s -H i s - A s n -L e u - P r o -G l y-Th r - P h e -G l u— C y s - I 1 e - C y s -G l y - P r o -A s p - S e r -A l a -L e u - (Z) - A r g— H i s - I 1 e -G 1 y-Th r -A s p -C y s (W) I Pro-Cy s— Ph e—Ar g-A la—As n— Cy s— G lu-Ty r— G ln— Cy s— G in—Pro— Le u— (X)- G l n-Th r-S e r-Ty r -Le u-Cy s -Va l—Cy s— A la— G lu-G 1 y-P he-A 1 a— P ro-I 1 e- Pr o-H is-G lu-Pro-H is-Ar g-Cy s-G in-Met-Ph e-Cy s-(Y) G in-Th r-A la-Cy s-Pr o-A la-As p-Cy s-As p-Pr o-As n-Th r-G ln-A 1 a Ser-Cys-G lu-Cy s-Pro-G lu-G ly-Ty r— I 1 e— L eu— As p— As p— G ly— Ph e— I 1 e- Cy s -Th r -A sp -I 1 e—A sp -G lu -C ys -G 1 u -A sn -G ly -G ly -P h -C ys -Ser -G ly -Va l -C ys -H is -A sn -L eu -Pro -G l y-Th r -P he -G lu—C ys -I 1 e -C ys -G ly -P ro -A sp -S er -A la -L eu-(Z)-A rg— H is-I 1 e -G 1 y-Th r -A sp -C ys
( 1 ) (1)
〔式中、 （W) は、 Va l — G l u— P r o—Va l — A s p、 G l u— P r o 一 Va l — A s p、 P r o— Va l — A s p、 Va l — A s p、 または A s pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) と （Y) は、 互いに 異なる、 又は同一の、 A s n、 G 1 n、 S e r、 A l a, または G 1 yのいずれ かのァミノ酸残基を、 （Z) は、 V a 1、 または A 1 aのいずれかのァミノ酸残 基を示す。 〕 で表されるアミノ酸配列からなる 卜ロンボモジュ リ ンを有効成分と する医薬組成物を血液体外循環回路内に注入することを特徴とする血液体外循環 回路の血液凝固防止方法。 (Where (W) is Va l — G lu — Pro — Va l — A sp, G lu — P ro one Va l — A sp, P ro — Va l — A sp, Val — A sp Or (A) a peptide residue or an amino acid residue of Asp, and (X) and (Y) are different from or the same as each other, Asn, G1n, Ser, Ala, or G1. (y) represents any amino acid residue of y, and (Z) represents any amino acid residue of Va1 or A1a. ] A method for preventing blood coagulation in an extracorporeal blood circulation circuit, comprising injecting a pharmaceutical composition comprising trombomodulin having the amino acid sequence represented by the formula (1) as an active ingredient into the extracorporeal blood circulation circuit.
8. (X) および （Y) 力 \ ともに A s nである請求の範囲 7項に記載の血 液体外循環回路内へ注入することを特徴とする血液体外循環回路の血液凝固防止 方法。 8. The method for preventing blood coagulation in an extracorporeal blood circulation circuit according to claim 7, wherein both (X) and (Y) powers are Asn.
9. (Z) 力、 Va 1である請求の範囲 7項または 8項に記載の血液体外循 環回路内へ注入することを特徴とする血液体外循環回路の血液凝固防止方法。 9. The method for preventing blood coagulation in an extracorporeal blood circulation circuit according to claim 7, wherein the (Z) force, Va1, is injected into the extracorporeal blood circulation circuit.
1 0. (W) 、 Va l — G l u— P r o— Va l — A s p、 または A s pの いずれかのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、 （X) および （γ) が、 と もに A s nであり、 （Z) 力、 Va 1である請求の範囲 7項〜 9項のいずれかに 記載の血液体外循環回路内へ注入することを特徴とする血液体外循環回路の血液 凝固防止方法。 10 (W), Va l — G lu — Pro — Va l — Asp or any peptide residue or amino acid residue of Asp, where (X) and (γ) are both The blood in the extracorporeal blood circuit according to any one of claims 7 to 9, wherein A is sn, (Z) force, and Va1. Coagulation prevention method.
1 1. (W) 力 \ A s pであり、 （X) および （Y) がともに A s nであり、 (Z) が Va 1である請求の範囲 7項に記載の血液体外循環回路内へ注入するこ とを特徴とする血液体外循環回路の血液凝固防止方法。 1 1. Injection into the extracorporeal blood circuit according to claim 7, wherein (W) force \ A sp, (X) and (Y) are both A sn and (Z) is Va 1 A method for preventing blood coagulation in a blood extracorporeal circuit.
1 2. 持続的注入のための請求の範囲 7項〜 1 1項のいずれかに記載の血液体 外循環回路内へ注入することを特徴とする血液体外循環回路の血液凝固防止方法 c 1 2. A method for preventing blood coagulation c in a blood extracorporeal circuit characterized by injecting into the extracorporeal blood circuit according to any one of claims 7 to 11 for continuous infusion.
PCT/JP1997/002009 1996-07-03 1997-06-11 Medicinal compositions for extracorporeal blood circulation circuit and method for inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit WO1998001153A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP17318796A JP2002241400A (en) 1996-07-03 1996-07-03 Blood coagulation-preventing medicinal composition for blood extracorporeal circulation route
JP8/173187 1996-07-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998001153A1 true WO1998001153A1 (en) 1998-01-15

Family

ID=15955712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1997/002009 WO1998001153A1 (en) 1996-07-03 1997-06-11 Medicinal compositions for extracorporeal blood circulation circuit and method for inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2002241400A (en)
WO (1) WO1998001153A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6693186B2 (en) * 1998-09-01 2004-02-17 Antex Biologics Inc Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4834812B2 (en) * 2005-03-30 2011-12-14 東レ株式会社 Auxiliary device for extracorporeal circulation medical column

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS646219A (en) * 1987-01-08 1989-01-10 Asahi Chemical Ind Peptide having promoting action on activation of protein c by thrombin
JPH02255699A (en) * 1989-03-28 1990-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd New anticoagulant and preparation thereof
JPH0413145U (en) * 1990-05-25 1992-02-03
JPH06197958A (en) * 1992-09-11 1994-07-19 Fresenius Ag Device for removing aluminum ion from blood and solution to be used in said device
JPH07155176A (en) * 1994-05-31 1995-06-20 Asahi Chem Ind Co Ltd Cultured product containing peptide having activity to promote activation of protein c by thrombin
JPH07224100A (en) * 1994-02-14 1995-08-22 Kowa Co Novel thrombomodulines

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS646219A (en) * 1987-01-08 1989-01-10 Asahi Chemical Ind Peptide having promoting action on activation of protein c by thrombin
JPH02255699A (en) * 1989-03-28 1990-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd New anticoagulant and preparation thereof
JPH0413145U (en) * 1990-05-25 1992-02-03
JPH06197958A (en) * 1992-09-11 1994-07-19 Fresenius Ag Device for removing aluminum ion from blood and solution to be used in said device
JPH07224100A (en) * 1994-02-14 1995-08-22 Kowa Co Novel thrombomodulines
JPH07155176A (en) * 1994-05-31 1995-06-20 Asahi Chem Ind Co Ltd Cultured product containing peptide having activity to promote activation of protein c by thrombin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZUSHI M., ET AL.: "The last three consecutive epidermal growth factor-like structures of human thrombomodulin comprise the minimum functional domain for protein C-activating cofactor activity and anticoagulant activity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 264, 1989, pages 10351 - 10353 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6693186B2 (en) * 1998-09-01 2004-02-17 Antex Biologics Inc Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002241400A (en) 2002-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Markwardt et al. Pharmacological studies on the antithrombotic action of hirudin in experimental animals
DE60219611T2 (en) MODIFIED ANNEXIN PROTEINS AND PREVENTION AND TREATMENT OF THROMBOSE
EP2698378B1 (en) Anticoagulant polypeptide and applications thereof
JPH05508150A (en) Oxidation-resistant thrombomodulin analogs
JPH09504696A (en) Human Kunitz-type protease inhibitor
KR101672108B1 (en) Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis
US5731288A (en) Compositions containing contortrostatin and methods for the use thereof
IE60544B1 (en) Variants of hirudin, their use and their preparation
CN111770767B (en) Extracorporeal device and matrix for removing plasmin from biological fluids, method and use thereof
AU2007305550B2 (en) Agent for Therapy and/or Improvement of Disseminated Intravascular Coagulation
JP2002517197A (en) Protease inhibitor peptide
WO1998001153A1 (en) Medicinal compositions for extracorporeal blood circulation circuit and method for inhibiting blood coagulation in extracorporeal blood circulation circuit
CA2343716C (en) Contortrostatin (cn) and methods for its use in preventing metastasis and other conditions
WO1994002165A1 (en) Blood coagulation normalizer containing tcf-ii as active ingredient
Mann Recombinant human activated protein C in severe sepsis
JPH08511157A (en) Novel polypeptide having XA factor inhibitory activity
US6239101B1 (en) Thrombin binding polypeptides
GB2260702A (en) Treatment of haemophilia B with factor IX
WO2020084853A1 (en) Drug for treating and/or improving septicemia associated with coagulation abnormality
MXPA01003292A (en) Contortrostatin (cn) and methods for its use in preventing metastasis and other conditions
JPH07224100A (en) Novel thrombomodulines
PT788546E (en) Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA