WO1998001151A1

WO1998001151A1 - Nouvelle utilisation de la famille mk comme facteur hematopoietique

Info

Publication number: WO1998001151A1
Application number: PCT/JP1997/002401
Authority: WO
Inventors: Makoto Kikuchi; Shinya Ikematsu; Munehiro Oda; Sadatoshi Sakuma; Takashi Muramatsu
Original assignee: Meiji Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 1998-01-15
Also published as: AU3459397A; US6383480B1; US6939669B2; DE69733694T2; ATE299030T1; EP0937461B1; US20020132984A1; AU733451B2; DE69733694D1; EP0937461A4; EP0937461A1; CA2260014A1

Description

明細書

M Kフアミリ一の造血因子としての新規な用途技術分野

本発明は、哺乳類における造血組織、末梢血、又はさい帯血中の造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖 ·分化を、他の造血因子とともに相乗的に促進する MKの新たな用途に関する。背景技術

血液中には、赤血球、白血球、血小板など形態や機能の異なるさまざまな血球が存在し、生体のホメォスターシスを維持するうえで重要な役割を果たしているが、これらの成熟血球は、それぞれ固有の寿命がある。従って、血球数が一定に維持されるためには、寿命によって失われた分に相当する数の血球がたえず生産されなければならない。

健常人では、赤血球 2 X 10^{1 1}個、白血球 10^{1 1}個、血小板 l Z X IO ^{1 1}個もの膨大な数が日々産生されると推定されている。このような膨大な数の血球が枯渴することなく長期間にわたって生産されるシステムの中心にあるのが、造血幹細胞 (hematopoietic stem cells) である。造血幹細胞は、自己を複製する（self - r enewal ) 能力と、赤血球、顆粒球、血小板、リンパ球、など各種成熟血球に分化する能力（multipotentiality) とを合わせもつ細胞である。造血幹細胞（多能性幹細胞）は、増殖しながら自己複製能を失い、特定の血球系への分化の方向が決定づけられた血球前駆細胞（commited stem cells) となる。血球前駆細胞は、さらに成熟した末梢血球に分ィ匕していく。

造血幹細胞から血球前駆細胞を経て、成熟した各種血球に増殖 ·分化していく造血系システムの各段階は、多数のサイトカインによる調節を受けていることが差替え用紙（規則 26) 明らかになつている。このような造血系に関与するサイト力インは、現在、 20種以上明らかになっているが（別所正美：医学のあゆみ · 180( 13) : 802-806、 1997 ) 、これらは、全て遗伝子がクローニングされ、遺伝子組み換え技術により、大量生産が可能となっている。造血幹細胞を中心に造血の初期に作用する因子として最も注目されているサイトカインは、 SCF (stem cell factor) と flk-2リガンドである。 SCFは、既知のサイトカインの中で最も未分化な造血幹細胞に作用する因子であり、マウス、ヒトいずれにおいても、 IL-1、 IL- 3、 IL-4、 IL- 5、 IL-6、 IL-7、 IL- 11、 G- CSF、 GM- CSF、 EP0、など多くのサイトカインと相乗作用を示し、 CFU-BL (blast colony-forming unit) 、 CFU-Mix (colony forming unit-mixed) 、 BFU-e (burst forming unit- erythrocyte) 、 CFU-GM (colony forming unit-g ranulocyte/macrophage) 、 CFU-Eo (eosinophil colony-forming unit) 、 CFU-M eg (colony forming unit-megakaryocyte) などのコロニー? 15成を著明に促迤 3 るが、 SCF単独でのコロニー刺激活性は弱いことが示されている（Tsuji，K. , et al . , Blood, 78: 1223, 1991 ; Shioharu,M. ,et al . , Blood, 81 : 1453, 1993; Kubo, T. and N akahat a , T . , la t . Hemato 1. , 58 : 153 , 1993 ) 。しかしながら、 SCFは、造血幹細胞の in vitro増幅には、現時点で、最も重要なサイトカインであると考えられている flk- 2リガンドは.、その遺伝子がクロ一ニング（Lyman, S,D.， et al . , Blood, 8 3 :2795, 1994) されてからまだ日が浅いことからその生物活性は明らかにされていないが、 SCFと同様に、多くのサイト力インと相乗作用を示し、ヒト造血幹細胞の in vitro増幅に重要な因子となる可能性を秘めている。

これらの造血因子のいくつかは臨床応用されており、赤血球の産生を促進する EPO (erythropoietin) は腎性貧血に、好中球の産生を促進する G-CSF (granuloc yte colony-stimulating factor) は、癌化学療法後の好中球減少症に対する治療薬として用いられ、患者の生活の質（quality of l ife) の改善に役立っている。さらに最近では、 TPO (thrombopoietin) が血小板産生を促進することから、血小差替え用紙（規則 26) 板減少症に対する臨床応用が検討されている。

一方、造血幹細胞は、造血系の全ての細胞を再構築できることから、造血系腫瘍に対して造血幹細胞移植が広く行われている。最近では、末梢血幹細胞移植が急速に普及しつつあり、造血器腫瘍をはじめとした化学療法感受性悪性腫瘍に対する有力な根本的治療として注目を集めている。さらに、将来的な展望として細胞治療（cell therapy) や遺伝子治療（gene therapy) の多くに、造血幹細胞移植が取り入れられることが予想される。そのためには、造血幹細胞の in vitroにおける増幅法の確立が必要である。しかしながら、いまなおヒト造血幹細胞は単離されておらず、造血幹細胞がどの程度自己複製を繰り返せるかなどの点についても不明である。発明の開示

本発明は、既知のサイト力インと組合わせて用いることにより、造血幹細胞、又は造血前駆細胞の増殖、分化を、相乗的に促進させることのできる新たなサイトカインを提供することを目的とする。

また、本発明は顆粒球 ·単球系前駆細胞の増殖、分化を促進する新たなサイ卜カインを提供することを目的とする。

さらにまた、本発明は、既知のサイト力インと組合わせて用いることにより、赤芽球前駆細胞の増殖、分化を促進する新たなサイトカインを提供することを目的とする。

本発明者らは、ミツドカイン（midkine: MK) 又はブレイオト口フィン（pleio trophin: PTN) と呼ばれる新しい成長因子が、マウスゃヒトなど哺乳類の造血幹細胞及び造血前駆細胞（造血系細胞ともいう）に対し、 in vitroで単独で増殖 ' 分化促進効果を示し、 SCF、 M-CSF, G-CSF、 GM-CSF, IL_3、 IL- 6などと組合わせた場合には、造血系の細胞に対し、極めて顕著な相乗的増殖、分化促進効果をもたらすことを見出した。さらにまた、 MK、又は PTNが哺乳類の好中球減少症に対し、差替え用紙（規則 26) 急速な好中球回復促進効果を有することを見出した。

以下本発明を詳細に説明する。

MKは、レチノイン酸によるマウス胚性腫瘍細胞の分化過程で早期に発現が誘導される遺伝子の産物として発見された（Kadomatsu， K. et al .， Biochem. Bioph ys. Res. Co画 n.， 151 : 1312-1318, 1988)。 PTNは、神絰突起伸長能を持つへバリン結合性タンパク質として、新生ラヅ卜の脳に発見された（Rauvaa, H. _} EMBO J. , 8: 2933-2941， 1989)。 MKと PTNは、 45%の相同性（アミノ酸配列）を示すへパリン結合性の新しいクラスの成長分化因子で、 MKフアミリーと呼ばれている。

MKと PTNは発生過程では、それぞれ特徴的な発現パターンを示し、分化の遂行に重要な生理活性を担うことが予想される。

本発明者らは、このような MKファミリ一の生物活性に着目し、哺乳類の骨髄細胞ゃ、末梢血幹細胞に対する MKファミリーの造血因子としての増殖 ·分化作用を検討した。一般に、造血因子が骨髄中の造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖 '分化過程のいかなる段階で関与し、機能しているかは、これら造血因子の存在下に、一定数の骨 M3胞を半固形培地で培養し、形成されるコロニーを構成する細胞を検索し、コロニー数を算定することにより知ることができる。これらのコロニー形成法では、 1個の造血前駆細胞が、増殖、分裂、成熟して多数の成熟血球からなる 1個のコロニーを形成することが、数多くの直接又は間接の方法で証明されている。コロニー形成法には、顆粒球 'マクロファージ系、赤芽球系、巨核芽球系など造血各系の細胞について、独自の方法があり、それぞれ各造血系の刺激因子が用いられる。

顆粒球 ·マクロファージ系の前駆細胞である CFU- GMは、好中球系前駆細胞である CFU-Gと単球系前駆細胞である CFU-Mへと分化するが、そのためには、それぞれに対応した特異的な CSF ( colony- stimulating factor) の存在が必要で、 CFU-GM には GM-CSFが、 CFU-Gには G-CSFが、また CFU-Mには M- CSFが必要であると考えられている。これらの CSFの中には、前駆細胞を成熟細胞に分化させる作用だけではな差替え用紙（規則 26) く、成熟血球の機能を活性化する作用を有しているものもある。

CFU-GMの培養は、骨髄の有核細胞を用いて、軟寒天法又はメチルセルロース法により行われるが、いずれの方法でも、生じるコロニーは、顆粒球系とマクロファ一ジ系の様々な分化段階の細胞群であり、造血幹細胞から一段分化した前駆細胞を測定することになる。これらのコロニーを釣り上げて染色してみると、顆粒球からなる Gコロニ一、マクロファ一ジからなる Mコロニー、両者の混合した GMコロニーなどが存在している。ヒトの場合、コロニーの大きさは小さく、 40個以上の細胞の集団をコロニー、それ以下の集積性の低い集団はクラス夕一と呼び、それぞれを区別している。

MKが、骨髄細胞の増殖活性をもっかどうかを調べるために、マウスの骨髄細胞に対して、 M T T法により細胞増殖測定を実施した結果、 MKを、 5、 50、 500、 50 00ng/mlの濃度で添加した系は、 MK無添加の系に対して、 1.6〜2倍の増殖活性を示し、 5〜500ngでは、活性上昇に濃度依存性がみられる

各種サイトカインの存在下でヒトの末梢血単核球に対するコロニーアツセィにおいては、図 1に示すように、サイ卜力インを加えない系は全くコロニーを形成しないが、 MKを添加した系は、 GM-CSF、 IL-3を添加した系と同様に、コロニー形成能を示す。コロニーの大きさは、 G- CSF、 GM-CSFs IL-3等のサイトカインを添加した系よりも大きい傾向にある。これらの結果は、 MKが、単独でヒト末梢血幹細胞、又は造血前駆細胞の生存維持、あるいは増殖促進作用を有することを示している。さらに、 MKと、 M-CSF、 G- CSF、 GM-CSF, IL-3、 IL- 6などのサイトカインとを組合わせると、コロニー形成能が相乗的に促進される。例えば、 MKと、 G-CSF、 GM-CSF, 或いは LI-3とを組合わせた場合、 MKヽ G-CSF, GM-CSF或いは IL- 3それぞれ単独の場合の約？〜 9倍もコロニー数が増加する。また、 MK + GM- CSF + IL-3+ IL-6 の組合わせは、 GM-CSF + IL- 3+ IL-6の組合わせに比して、コロニー形成数が顕著に増加しており、 MK + G- CSF + IL- 6の組合わせは、 G-CSF + IL-6の組合わせに比してコロニ一数が顕著に増加している。同様に、各種サイトカインの存在下で、図差替え用紙（規則 26) 1とは別のヒ卜の末梢血単核球に対するコロニーアツセィを行い、コロニ一を構成する細胞を形態的に検索すると、図 2に示すように、 M、 GM-CSF IL- 3、それぞれ単独の場合は、 GMコロニーが形成され、 G-CSF単独の場合は主として Gコロニ —が形成される。 MK + G-CSF + GM-CSFの組合わせ、或いは MK+G-CSFの組合わせは、 G-CSF単独の場合に比べて、 Gコロニー数が顕著に増加している。すなわち、 MK は、 G-CSFの CFU-GMの増殖 ·分化 ·成熟を相乗的に促進して、末梢血中の好中級数を増加させると考えられる。

各種サイトカイン存在下での、ヒト末梢血幹細胞の 2週間の液体培養後の細胞を特殊染色し観察すると、図 3に示すように、 MK添加の系では、顆粒球（好中球 ) が圧倒的に多く親察され、 MKが好中球の増殖に作用していることが明らかである。特に、 MK + G-CSF + GM-CSF + SCF + IL-3+ IL-6の組合わせの場合には、極めて顕著な好中球の増殖、分化促進が観察される。

また、上記液体培養後、コロニーアツセィを行うと、 MK添加の系では、非添加の系に比べて、培養皿への接着度が増しており、 MKが間質細胞系（スト口一マ細胞系）の増殖をも促進していると考えられる。 IL- 6のみの場合は、コロニーはマクロファ一ジ系であるが、 MK + IL-6の場合は、コロニーの半数は、顆粒球系のコロニーが形成される。これらの結果からも、 MKが、顆粒球の増殖、分化促進に関与していることが示されている。

MKのこのような顕著な好中球産生促進が in vivoでも発揮されるかどうかは、例えば、抗癌剤の投与や、放射線照射により、造血系にダメージを与えたマウスに対して、 MKを投与し好中球の回復状況を調べることができる。マウスに MKを 13日間連続投与し、投与後 5日目に、抗癌剤のシクロホスフアミド（Cyclophosphajni de; CY) を投与し、適当な時期に採血して血球を調べると、予測したように、好中球数の回復が顕著に促進されている（表 1 ) 。

差替え用紙（規則 26) 表 1

白血球数（ / μ Ι ) 好中球数（ / μ Ι )

Day 0 ！ 2 4 7 ！ 9 Day 0 ！ 2 4 7 9 レ ont rol 6100 6400 i 6820! 8220! 5120 Control 158o! 1663! 20461 2606 1204

CY 2000! 104θ! 4020! 6560 CY 1330! m l 2471 4203

CY 4 M 1840 1100! 10460Ϊ 7640 CY + MK i 1077! 91： 7013 5486

M 6280 7500 4520! 64801 5100 •MK H38! 292o! 1652! 2201 2227

MKの、造血系細胞に対する作用を、より in vivoに近い状態で調べるためには、例えば、 Epo、 IL-3、 IL-6及び SCFを含むメチルセルロース培地、「MethoCult GF M3434 (Stem Cell Technologies Inc.製） j を用いたコロニーアツセィによって可能と考えられる。この培地（M3434培地という）は、赤血球系、白血球系、血小板系の前駆細胞を増殖、分化させうると考えられる。

M3434培地に MKを添加した系により、マウス脾臓細胞のコロニーアツセィを行つた結果を、図 4及び図 5に示す。図 4は、 CFU-GMまたは CFU-Gのコロニー数を示す。 M3434培地のみでも、 CFU-GMまたは CFU-Gコロニー形成能を持つが、 MKを添加した系では、全般にコロニー数は、 M3434培地のみに比べて増えている。特に、 MKを l〜10ng/mL添加した場合、 8、 1 0日目のコロニー数が 2〜 3倍と顕著に増加している。図 5は、混合コロニー形成細胞 (colony- forming unit-mixed: CFU-Mix) の数を示す。 CFU-Mixは、 in vitroのコロニーアツセィで確認できる最も未分化な細胞 CFU-BL (blast colony-forming units) よりも自己複製能は低く、やや分化した段階の多能性幹細胞で、赤血球系、白血球系、血小板系の細胞に分化していくことのできる細胞が含まれていると考えられている。 MKを添加した系では、顕著に CFU-Mixコロニーの数が増加している。すなわち MKは、少なくとも IL- 3、 IL-6、差替え用紙（規則 26) SCF及び Epoと併用することにより、造血幹細胞、或いはそれに近い未熟な造血系の細胞の増殖、分化を顕著に促進すると考えられる。このことは、骨髄移植や末梢血幹細胞移植、或いは、造血幹細胞への遺伝子導入のための造血幹細胞の in V itro増殖に非常に有用であると考えられる。

次に、本発明者らは、造血系の細胞では、末梢の成熟した細胞ほど抗癌剤に感受性であるという性質を利用し、抗癌剤による造血幹細胞又は造血前駆細胞の濃縮を試みた。すなわち、シクロホスフアミドをマウスに投与し、投与後のマウス脾細胞を用いてコロニーアツセィを行った。結果を図 6及び 7に示す。図 6では、 MKを添加した系は、無添加の系に比べて CFU-Mix及び CFU-Gの数が 2倍以上増加している。この実験からも、 MKが、造血幹細胞や造血前駆細胞の増殖促進作用を有することが明らかである。

非ホジキン性リンパ腫（NHL) 患者の末梢血細胞について、 MethoCult H4230 ( Stem Cel l Technologies Inc .製; Methylcellulose(0.9%) , 2-Me rcaptoe thano 1 ( 1 0-4M),L-Glutamine(2mM) , Fetal Bovine Serum (30¾) , Bovine Serum Albumin( l ) 構成された培地で CSFや EPOは含んでいない培地）を用いて検討を行った。 MethoC ult H4230のみ、 H4230 +MK、 H4230+G-CSF添加、 H4230+MK+G- CSF、という組合わせで、コロニーアツセィを行った。患者の末梢血幹細胞中の CD34陽性細胞の割合は 1.4%である。結果を図 8に示す。 MK単独では、殆どコロニーは形成されないが、 MK + G- CSFの場合は極めて顕著なコロニー形成能を示し、そして、その数は G -CSF単独の場合よりも 2倍以上であることが明かである。アツセィ開始 10日目以降、コロニー形成数の伸びが、 G-CSF単独よりも MK + G-CSFの群の方が落ちる傾向が見られる。 10日目以降のコロニーを顕微鏡下で観察すると、 MK+G-CSF群では、コロニーの成熟が G-CSF単独よりも早まっている傾向が見られる。よって、 10日目以降、コロニー形成数の伸びが、 G-CSF単独よりも MK+G-CSF群で落ちるのは、コロニーの成熟が早まっている為であると考えられる。

上記のコロニーアツセィで注目すべきことは、 MKを添加した群と添加しない群差替え用紙（規則 26) とを比較すると、常に形成されるコロニー 1つ 1つの大きさが MK無添加群よりも大きくなるということである。このことを定量的に調べるために、上記患者の末梢血幹細胞コロニーァヅセィで、 MKのみ、 G-CSFのみ、 MK+G-CSF、それぞれについて、 14曰目に形成されたコロニーの中で大きなもの 3つを選び、各々、顕微鏡下で吸い上げ、血球計算盤でその構成細胞数を数え平均値を算出した。結果を図 9に示す。 G-CSF単独で形成されるコロニーよりも、 MK+G- CSFで形成されるコロニーの方が、構成細胞数が多いことが明かである。コロニーサイズが大きいということは、その構成細胞数も多いということである。これらの結果からも、 MKが、造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖 ·分化に作用することが明かである。

次に、ヒト健常者の末梢血についても同様にコロニーアツセィを行った。この健常者の末梢血中の CD34陽性細胞の割合は 0.4%であった。結果を図 1 0に示す。

MKのみでもコロニーが形成され、 10及び 14日目では、 MKの濃度依存的にコロニー形成数が増加している。 MK + G- CSFでは、 10日目までに、最高で G-CSF単独の 2倍以上のコロニーが形成されている。これらの結果から、健常者の細胞でも患者の細胞でも、 MK添加の場合の活性は同じ傾向を示すことが明かである。

更に、 MKとフアミリーを形成するブレイォトロフィン（Pleiotrophin; PTN )について、上記健常者の末梢血を用いて、同様にコロニーアツセィを行った。ここで用いた PTNは、組換え PTN (Pleiotrophin , recombinant human( Sf21-derived) ;L ot GH055011 ) (R&D Systems )である。結果を図 11に示す。 MKと同様に PTN単独でもコロニー形成能を示し、そのコロニー形成数が格段に多い。また、 G-CSFとのコロ二一形成促進の相乗作用も、 MKと同様に認められる。この結果から、 PTNは MKと同様に造血幹細胞、造血前駆細胞の増殖■分化促進作用をもつことが明かである。次に、 IL-3、 SCF、 G-CSF及び EP0を含む血液幹細胞アツセィ培地、コンプリートタイプ（Lot. No. 96101601；極東製薬工業株式会社）を用いて、健常者の末梢血細胞のコロニーアツセィを行った。このァヅセィは、より In vivoに近い状態のァッセィと考えられる。 MKについての結果を図 12及び 13に、 PTNについての結果を図差替え用紙（規則 26) 14及び 15に示す。 MK + IL-3、 MK + SCF, MK + G-CSFのいずれの組合わせでも BFU-Eが増加したことはなかった。しかし、 MK +EP0、 PTN+EP0という組合わせが BFU-Eを増加させるのではないかと推測された。赤芽球系前駆細胞の BFU-Eは、培養 14日目に形成され、 5 ~ 7日目に形成される CFU-Eよりも未分化なものであることが知られている。極東のコンプリート培地に MK又は PTNを添加しておくと、培養開始後 1 2日目にコンプリート培地のみに比べて、最高で 2倍以上の BFU-Eが確認される。この結果から、少なくとも完全培地中に MKを添加すると、赤芽球系の細胞の増殖も促進することが考えられる。

以上述べたことから、 MKファミリ一は、哺乳動物の造血組織における造血幹細胞及び造血前駆細胞に作用して、それらを維持及び増殖 ·分化させる機能を持ち、さらに MKと、 SCF、 M- CSF、 G-CSF、 GM- CSF、 IL-3、 IL- 6などのサイトカインとを組合わせることにより、上記機能を相乗的又は相加的に高めることができることが明らかである。特に、多能性幹細胞に極めて近い CFU-Mixに対し、より in vivo に近い状態で顕著な増殖促進効果を示す。また、顆粒球 ·マクロファージ系前駆細胞の増殖分化を促進し、 in vivoにおける好中球減少症モデルに対して顕著な好中球増加促進作用を持つ。このような MKファミリ一を単独で、又は SCF、 M-CSF 、 G-CSF, GM-CSF, IL-3、 IL- 6などのサイトカインの一つ以上と組合わせて臨床応用することが期待でき、特に骨髄移植や末梢血及び臍帯血由来幹細胞移植における幹細胞の体外造血幹細胞移植（ex vivo expansion) に用いることが期待できる。また、癌の化学療法における好中球減少症、難治症貧血、白血病などの患者の治療 ·予防に用いることが期待できる。さらにまた、将来は造血幹細胞を標的とした遺伝子治療のための幹細胞増殖に用いることが期待できる。とりわけ、 MKと G- CSFを組合わせて、癌の化学療法における用量密度（dose density) を高めることは極めて有望であり、抗癌剤の増量又は投与期間の短縮による化学療法の効果増強が期待できる。

本発明に用いる MK及び PTNは、天然由来又は遺伝子組換えの何れも用いることが差替え用紙（規則 26) できる。組換え MKフアミリーとは、天然に存在する MK又は PTNと十分な同一性を有し、同等の生物活性を有することを意味する。このような MK又は PTNには、誘導体及び類縁体が含まれる。精製された哺乳類の MK又は PTNとは、例えばマウス又はヒト由来のものを意味するが、これらに限定されるものではない。また、本発明の MK又は PTNには、グルコシル化 MK又は PTN、及び非グルコシル化 MK又は PTNが含まれる。図面の簡単な説明

図 1は、ヒ卜末梢血単核球のコロニー形成能に対する、 MK、 G-CSF、 GM-CSF. M - CSF、 IL- 3及び IL- 6の、単独、又はこれらの組合せによる効果を示す。

図 2は、図 1の実験とは異なるヒ卜末梢血単核球のコロニー形成能に対する、 Gコロニー、 GMコロニ一、及び Mコロニー形成能に対する、 MK、 G- CSF、 GM-CSF、 M -CSF、 IL-3及び SCFの、単独又これらの組合せによる効果を示す。

図 3は、 MK、 G-CSF、 GM-CSF、 IL- 3、 IL_6、及び SCFの、単独又はこれらの組合せにより、ヒ卜末梢血単核球を 2週間液体培養した後、エステラーゼ二重染色を行うことにより計測した顆粒球、単球又はマクロファージ、及びその他の細胞の数を示す。

図 4は、 MKの造血系細胞に対する増殖促進作用を、より in vivoに近い状態で調べるために、マウス脾臓細胞を、 EP0、 IL-3 IL- 6及び SCFを含む完全メチルセルロース培地（MethoCult GF M3434) に MKを添加した系で 12日間培養したときの、コロニー形成能に対する MKの効果を示す。

図 5は、図 4と同様な実験における、 CFU-Mixコロニー形成能に対する MKの効果を示す。

図 6は、抗癌剤シクロホスフアミド投与後 4日目のマウスの骨髄細胞を、 EP0、 IL-3、 IL-6、及び SCFを含む完全メチルセルロース培地（MethoCult GF M3434) に MKを添加した系で 14日間培養したときの、 CFU-Gコロニー形成能に対する MKの効差替え用紙（規則 26) 果を示す。

図 7は、図 6と同様な実験における、 CFU-Mixコロニー形成能に対する MKの効果を示す。

図 8は、非ホジキン性リンパ腫患者の末梢血を、コロニー測定用メチルセル口 —ス培地（MethoCult H4230) に、 MK、 G-CSF, 又は MK+G-CSFを添加した系で 14日間培養したときの、コロニー形成能に対する MKの効果を示す。

図 9は、図 8と同様な実験における、 14日目の、培地のみ、 G-CSF及び M +G - C SFの場合のコロニーの構成細胞数を示す。

図 10は、健常者の末梢血を、コロニー測定用メチルセルロース培地（MethoCul t H4230) に、 MK、 G-CSF又は MK +G-CSFを添加した系を用いて培養したときの、コロニー形成能に対する、これらのサイトカインの効果を示す。

図 1 1は、図 1 0と同様の実験において、 MKに換えて PTNを用いた結果を示す。図 1 2は、図 1 0の実験と同じヒ卜由来のヒト末梢血を、 EP0、 IL-3、 G-CSF及び SCFを含む血液幹細胞アツセィ培地に、 MKを添加した系で培養したときの、 CFU -Eコロニー幵城能に対する MKの効果を示す。

図 1 3は、図 1 2と同様の実験における、 CFU-Eよりもさらに未分化な BFU-Eコ口二一形成能に対する MKの効果を示す。

図 1 4は、図 1 0の実験と同じ健常者の末梢血を、図 10の実験と同じ培地に、 MKに換えて PTNを添加した系で培養したときの、 PTNの CFU-Eコロニー形成能に対する効果を示す。

図 1 5は、図 1 4と同様の実験における、 BFU-Eコロニー形成能に対する PTNの効果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。本実施例に用いた MKは、特願平 7-255354の配列番号 3に記載のヒト MKである。差替え用紙（規則 26) 実施例 1 好中球減少症モデルに対する Mの好中球回復促進効果

好中球減少症は、感染防御に最も重要な役割を担っている好中球が選択的に消失し又は著しく低下している疾患である。以下に、正常マウスに抗癌剤を投与し作製した好中球減少モデルに対して、 MKを投与し、好中球回復促進効果を調べた例を示す。

12週令の ICRマウス（雄）に、抗癌剤であるシクロホスフアミド（Cydophosph amide： CY) を投与し、好中球減少モデルマウスを作製した。マウスは、 1群 5匹とし、（1 ) 無処置群（コントロール群）、（2) CY投与群、（3) CY+MK投与群及び（4) MK単独投与群、の 4群に分けた。 MKは、生理食塩水で希釈し、 0. 1ml/匹、 300 zg/kgを腹腔内に 13日間連続投与した。連続投与 5日目の 6時間後に、 CYを、 LD₅。値の 2/3にあたる 266mg/kgを投与した。 CY投与日を、 DayOとし、 Day0、 Day 2 、 Day 4 Day 7及び Day 9の 5回採血を行い、白血球数、好中球数、リンパ球数及び赤血球数を測定した。結果を前記の表 1に示した。 CY投与群及び CY+MK投与群においては、コントロール群に比較して、リンパ球は、 Day 2で最低値を示し、 D ay 9までその数は、回復しなかった。好中球は、 Day4で最低値を示したが、 Day 7 では、コントロール群の 2.8倍の数値を示した。

実施例 2 ヒ卜末梢血単核球に対する MK及び他のサイトカインのコロニー形成促進作用

ヒト末梢血幹細胞 (peripheral blood stem cel l： PBSC) 採取には、骨髄から末梢血への PBSCの動員が必要である。血液学的定常状態に、造血因子である G- CSFを投与し、末梢血へ PBSCの動員を図り、へパリン採血した。末梢血を、分離剤を用いて単核球層に分画した。分画した単核球層をリン酸バッファ一（PBS) で混和し、 4 °Cにて 1500rpm、 5分間遠心した。遠心後、上清を捨て、この操作を数回繰り返して細胞を洗浄した。 10%FBSを含む培養液に細胞を浮遊させた後、血球計数装置 K-800で細胞数をカウントした。最終的に 10%FBSを含む培養液で細胞濃度を 1x10 VmLに調製した。差替え用紙（規則 26) 試験物質は、 MK： 50 g/mLs G-CSF： lOng/mL, GM-CSF： 10ng/mL, M-CSF： 50ng /mL、 IL-3： lOng/mL, IL-6： lOOng/nL及び SCF： 10ng/mL、を用いた。試験物質の調製は、イソコフ改変ダルベッコ培地（IMDM) で最終濃度の 10倍濃度の溶液を調製し、測定系を構成する総量の 10%量を添加することで上記の濃度とした。

コロニ一アツセィは FBS含有メチルセルロース培地を用いた。メチルセルロース溶液の調製は、メチルセルロース粉末（3500〜5600cps、東京化成工業）を 2 %となるように加え、調製した。

上記のように各々調製したものを 1本のチューブに必要量ずつ採った。すなわち、最終濃度がチューブ内で、細胞 lxl0⁵/mL、 FBS20%、 10%FBSを含む培養液を 20%、メチルセルロース 0.8%になるように混合し、試験物質を上記の濃度を加えた。ボルテックスミキサーで十分に混和した後、プラスチック培養皿（Falcon社； 1008) に 18番針のついた注射器で分注した。 5%二酸化炭素濃度、 37°C、 100% 湿潤の培養器中で、 2週間培養した。培養 2週間目に、形成されたコロニーの数を、倒立顕微鏡（100倍）を使用して計測した。結果を図 1に示す。

また、上記とは別の健常人の末梢血単核球について、 G-CSF、 GM- CSF及び M- CSF のコロニーアツセィを同様の方法で実施した。結果を図 2に示す。

実施例 3 MK及び他のサイトカイン存在下でのヒト末梢単核球の液体培養

ヒト末梢血単核球及び試験物質の調製方法は、実施例 2と同様である。細胞 1.

5xl0⁵/mL、 FBS30%、 10%BSA10%を含んだ培養液とし、試験物質を上記の濃度で加え、ブラスチック培養皿（Falcon社； 1008) に播種した。培養は、 5 %二酸化炭素濃度、 37 、 100%湿潤の培養器中で 2週間行った。

培養 2週間目に、各培養皿よりすべての細胞を回収した。培養皿に接着している細胞については、 0.25%トリプシン/ EDTA処理し、回収した。各チューブに回収された細胞は、一度 4 °C、 800回転の遠心操作で細胞を集め、同量の培養液に再懸濁した。血球計算盤を用い、細胞数を計測した。

細胞数計測のために集めた細胞を、サイトスビン操作でスライドガラス上に再差替え用紙（規則 26) 度集めた。エステラーゼ二重染色（エステラーゼ染色キット及びエステラーゼ AS - D染色キット：武藤化学薬品）を行った。視野を変え、細胞を染色性により顆粒球、単球、マクロファージ及びその他に識別した。結果を図 3に示す。

実施例 4 より in vivoに近い状態での MKの造血促進作用

8週令の BDF1マウス（雌）の脾臓を、クリーンベンチ内で無菌的に取り出し、シャーレ中で針（テルモ、 22Gxl 1/4" (0.70x32讓））を用いて IMDM (GIBCO BR L) 中に細胞をしごき出した。脾臓中の細胞は、 IOMLの IMDMでチューブ中に回収し、よくビペッティングした後、 Cell strainer (FALCON 2350,70>am) を通過させた。血球計算盤で単核細胞数を算定し、 IMDMで lxlO⁶細胞/ mLに調製し、細胞浮遊液とした。試料液として、同じく IMDMで MK100ng/nL、 lmg/mL, 10mg/mL溶液を調製した。

メチルセルロース培地として、完全培地である MethoCult GF M3434 (Methylce 1 lulose-0.9% , 2-ME-10-4M, L-Glutamine-2mM, FBS,BSA-1 %， EPO. , Insul injransf errin，IL-3，IL-6，SCFを含む； Stem Cell Technologies社) を使用した。上記で調製した細胞を最終濃度 lxlO⁵細胞 /mL、 MKを 1、 10、 lOOng/mLとなるように加え、実施例 2と同様の方法でコロニーアツセィを行った。結果を図 4及び図 5に示す。実施例 5 より in vivoに近い状態での MKの造血促進作用（造血幹細胞又は造血前駆細胞を濃縮）

骨髄細胞中の造血前駆細胞を濃縮する目的で、 8週令の BDF1マウス（メス） 5 匹にエンドキサン末（劇日本薬局方「シクロホスフアミド」； CY) を lmg/匹で投与した。投与から 4日後マウス骨髄から、常法に従って、細胞を調製した。細胞は IMDMで 2xl0⁴細胞/ mLに調製した。以後のコロニーアツセィの方法は、実施例 4 に準じた。結果を図 6及び図 7に示す。

実施例 6 非ホジキンりンパ腫患者末梢血単核球のコロニー形成に対する MK及び他のサイトカインの効果

培地として、メチルセルロース培地である MethoCult H4230 (Methylcellulose 差替え用紙（規則 26) -0.9% , Z-Mercaptoethanol-10-4M,L-Glutamine-2mM,FBS-30% .Bovine Serum Alb umin-1 %；すべて最終濃度で含む： Stem Cell Technologies社）を用いた。結果を、図 8及び図 9に示す。

実施例 7 健常人の末梢血単核球のコロニー形成に対する MK及び PTNの効果

実施例 6と同様の培地を用いてコロニーアツセィを実施した。結果を図 1 0及び図 1 1に示す。

実施例 8 健常人の末梢血単核球の赤芽球系コロニー形成に対する MK及び PTNの効里

完全培地として、血液幹細胞アツセィ培地（コンプリート夕イブ：極東製薬ェ業株式会社； FCS-30%，BSA-1%，2-ME-10-4M, IMDM，PS溶液， Methylcel lulose- 1.2% ， IL-3-lOng/mL， G-CSF-10ng/mL， EP0. -2U/mL， SCF-50ng/mL ) を用いてコロニーアツセィを実施した。結果を、図 1 2、図 1 3、図 1 4及び図 1 5に示す。産業上の利用の可能性

MKファミリーは、哺乳動物の造血組織における造血幹細胞や各血球系の前駆細胞に作用して、それらを維持及び増殖 ·分化させる機能を持ち、さらに MKと、 SC F、 M-CSF、 G-CSF、 GM- CSF、 IL-3、 IL- 6などのサイトカインとを組合わせることにより、上記機能を相乗的又は相加的に高めることができる。特に、多能性幹細胞に極めて近い CFU-Mixに対し、より in vivoに近い状態で顕著な増殖促進効果を示す。また、顆粒球 ·マクロファージ系前駆細胞の増殖 ·分化を促進し、 in vivoにおける好中球減少症に対して顕著な好中球増加作用を持つ。従って、本発明の、 MKファミリーを単独で含む薬剤組成物、又は MKファミリ一を SCF、 M-CSF, G-CSF、 GM-CSF、 IL-3、 IL- 6などのサイト力インの- つ以上と組合わせて含む薬剤組成物は、臨床応用することができ、特に骨髄移植や末梢血及び臍帯血由来幹細胞移植における幹細胞の体外造血幹細胞移植に用いることが期待できる。また、癌の化学療法における好中球減少症、難治症貧血、白血病などの患者の治療 ·予防に用差替え用紙（規則 26) いることが期待できる。さらにまた、造血幹細胞を標的とした遺伝子治療のため幹細胞増殖に用いることが期待できる。

差替え用紙（規則 26)

Claims

請求の範囲

I . M Kフアミリーに属するタンパク質を有効成分とする哺乳類の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増殖 ·分化促進剤。

2 . M Kフアミリーに属するタンパク質とさらに一つ又は複数の他の造血因子とから成るものを有効成分とする請求項 1記載の増殖 ·分化促進剤。

3 . 他の造血因子が IL- 3、 IL- 6、 G-CSF, GM- CSF、 M-CSF, SCF及び EP0からなる群から選択される、請求項 2記載の増殖 ·分化促進剤。

4 . 他の造血因子が IL-3、 IL_6、 SCF及び EP0である、請求項 3記載の増殖 .分化促進剤。

5 . 他の造血因子が IL-3、 IL_6、 G-CSF、 GM-CSF及び SCFである、請求項 3記載の増殖 ·分化促進剤。

6 . 他の造血因子が G-CSFである、請求項 3記載の増殖 ·分化促進剤。

7 . 造血幹細胞が CFU-mixである、請求項 1〜 6のいずれかに記載の増殖 ·分化促進剤。

8 . 哺乳類の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増殖 ·分化促進剤の調製のための、 M Kファミリ一に属するタンパク質の使用。

9 . M Kファミリーに属するタンパク質を投与することを含む、哺乳類の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増殖 ·分化を促進する方法。

1 0 . 哺乳類の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増殖 ·分化促進剤の調製のための、 M Kフアミリーに属するタンパク質とさらに一つ又は複数の他の造血因子とから成るものの使用。

I I . M Kファミリ一に属するタンパク質とさらに一つ又は複数の他の造血因子とから成るものを投与することを含む、哺乳類の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を増殖 ·分化を促進する方法。

1 2 . M Kフアミリーに属するタンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから差替え用紙（規則 26) 成るものを有効成分とする、哺乳動物の好中球減少症を治療するための薬剤組成物。

1 3 . 他の造血因子が G- CSFである、請求項 1 2記載の薬剤組成物。

1 4 . 哺乳動物の好中球減少症を治療するための薬剤組成物を調製するための、 M Kフアミリーに属するタンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから成るものの使用。

1 5 . M Kフアミリーに属するタンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから成るものを投与することを含む、哺乳動物の好中球減少症を治療する方法。

1 6 . M Kフアミリーに属するタンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから成るものを有効成分とする、骨髄移植及び末梢血幹細胞のために造血幹細胞を体外で増殖させる（ex vivo expansion) ための薬剤組成物。

1 7 . 他の造血因子が IL- 3、 IL-6、 G- CSF、 GM-CSFM- CSF、 SCF及び EPOからなる群から選択される、請求項 1 6記載の薬剤組成物。

1 8 . 他の造血因子が IL- 3、 IL-6、 SCF及び EPOである、請求項 1 7記載の薬剤組成物。

1 9 . 骨髄移植及び末梢血幹細胞のために造血幹細胞を体外で増殖させる（ex V ivo expansion) ための薬剤組成物を調製するための、 M Kファミリ一に属する夕ンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから成るものの使用。

2 0 . M Kフアミリーに属するタンパク質と一つ又は複数の他の造血因子とから成るものを投与することを含む、骨髄移植及び末梢血幹細胞のために造血幹細胞を体外で増殖させる（ex vivo expansion) 方法。

差替え用紙（規則 26)