WO1997008194A1 - Novel fluorescent substrate for assaying activity of hepatitis c virus ns3 serine protease - Google Patents

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Yasuaki Shimizu
Yasuhiko Masuho
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Abstract

The invention has disclosed a substrate capable of extremely enhancing the substrate-incising activity of hepatitis C virus NS3 protease when treated with the NS3 protease in the presence of a peptide originating in hepatitis C NS4 and an amino acid sequence appropriate as the cleavage site of a peptide substrate to be used in a system for assaying the activity of the NS3 protease depending on changes in the fluorescence intensity. The invention has developed an NS3 protease assay system usable in screening NS3 protease inhibitors, which enables rapid, convenient, highly sensitive and multiple processing.

Description

明細書  Specification
C型肝炎ウィルス NS3セリンプロテア一ゼに対する蛍光性を有する Fluorescent against hepatitis C virus NS3 serine protease
新規な活性測定用基質 技術分野  New substrate for activity measurement
本発明は、 C型肝炎ウィルス （以下「HCV」 と略称することがある） NS4A由来べ プチド存在下で HCVの NS3プロテアーゼ活性を測定するための新規な修飾べプチド 、 該修飾べプチドと該 NS4A由来べプチドとを含むキット及び該修飾べプチドを用 いた該 NS4A由来ペプチドの存在下における該 NS3プロテアーゼの活性の測定方法 に関する。 技術背景  The present invention relates to a novel modified peptide for measuring the NS3 protease activity of HCV in the presence of a hepatitis C virus (hereinafter sometimes abbreviated as “HCV”) NS4A peptide, the modified peptide and the NS4A And a method for measuring the activity of the NS3 protease in the presence of the NS4A-derived peptide using the modified peptide. Technology background
C型肝炎ウィルス （Hepatitis C virus, HCV) は、 C型肝炎の原因ウィルスで ある。 C型肝炎は患者数が多い上、 慢性化しやすく、 肝硬変、 肝癌に移行する確 率が高いといわれ 〔H. J. Alter et al. , N. Engl. J. Med. 321, 1494-1500 (1 989) : I. Saito et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6547-6549 (1990) :K. Shimotohno, Semin. Virol. 4， 305-312 (1993)〕 、 その治療が重大な臨床上の問 題となっている。 従って、 その治療薬はエイズ治療薬と並んで、 現在最も希求さ れているウィルス疾患治療薬といえる。 現在、 C型肝炎の治療にはインターフエ ロンが使用されているが、 有効率が低く、 治療効果には限界があるといわれてい る。  Hepatitis C virus (HCV) is the causative virus of hepatitis C. It is said that hepatitis C has a large number of patients, tends to become chronic, and has a high probability of progressing to cirrhosis and liver cancer (HJ Alter et al., N. Engl. J. Med. 321, 1494-1500 (1 989) Natl. Acad. Sci. USA 87, 6547-6549 (1990): K. Shimotohno, Semin. Virol. 4, 305-312 (1993)] This is the problem above. Therefore, the drug can be said to be the most sought-after drug for viral diseases along with AIDS drug. At present, interferon is used for the treatment of hepatitis C, but its efficacy is low and its therapeutic effect is said to be limited.
HCVゲノムは、 9400塩基からなる一本鎖 RNA ( +鎖） 力、らなり、 約 3000アミノ酸 からなる一本のポリプロテインをコードしている。 この前駆体タンパクには、 N 末端より（NH - C- El- E2- NS2- NS3- NS4A- NS4B- NS5A- NS5B-(C00H)の順に 9 種類のウィルスタンパクが含まれる 〔M. J. Selby et al. , J. Gen. Virol. , 74, 1103-1113 (1993) :A. Grakoui et al. , J. Virol. , 67, 1385-1395 (1993) :L. To mei et al.， J. Virol.， 67， 4017- 4026 (1993)〕 。 宿主細胞由来のプロテア一ゼと ウィルス自身がコードしている 2種のプロテアーゼ （NS3プロテア一ゼと cprol) によりポリプロティンがプロセッシングを受け、 ウィルスの増殖に必要な夕ンパ ク質が供給される。 The HCV genome encodes a single-stranded RNA (+ strand) consisting of 9400 bases, and encodes a single polyprotein of about 3000 amino acids. This precursor protein contains nine types of viral proteins in order from the N-terminus (NH-C-El-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B- (C00H) [MJ Selby et al. , J. Gen. Virol., 74, 1103-1113 (1993): A. Grakoui et al., J. Virol., 67, 1385-1395 (1993): L. To mei et al., J. Virol., 67, 4017-4026 (1993)] . Polyproteins are processed by a host cell-derived protease and two proteases encoded by the virus itself (NS3 protease and cprol), providing the proteins necessary for virus growth.
非構造タンパク 3 (NS3) の N末側の 3分の 1に NS3プロテア一ゼ活性は存在し、 ゥ ィルス複製に必要なタンパク質をコ一ドする非構造領域内の 4力所 （それぞれの 切断部位は 「NS3/4A」 「NS4A/4B」 「NS4B/5A」 「NS5A/5B」 と呼ばれる） を切断す る 〔A. C. Grakoui et al.， J. Virol. 67, 2832-2843 (1993)〕 。 その結果 NS3か ら NS5Bの領域において、 NS3(p70)、 NS4A(p4)、 NS4B(p27)、 NS5A(p58/56)及び NS5 B(p66)の 5つのタンパク質が生じる（Hijikata L et aL . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 90, 10773(1993))。 NS3プロテア一ゼは、 単独では活性が弱く、 別の非構造タ ンパク質の 1つである NS4Aがコファクタ一 （補助因子） となりプロテア一ゼの基 質切断活性を増強することが知られている 〔C. Failla et al. , J. Virol. , 68, 3 753-3760 (1994)〕 。 NS3プロテアーゼで切断される 4力所の基質配列のうちトラ ンスに切断される 3力所 （NS4A/4B, NS4B/5A, NS5A/5B) については P1位がシステ ィンであり、 NS3プロテアーゼは今までに知られていない基質特異性を有している 。 このように、 NS3プロテア一ゼはウィルス増殖に必要であること、 また宿主のプ 口テア一ゼとは異なる基質特異性を有していることから、 抗 HCV薬の有力なターゲ ットの 1つと考えられている。 即ち、 NS3プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングに よって、 抗 HCV薬の有力な候補を見い出すことが可能であると考えられる。  NS3 protease activity is present in the N-terminal one-third of non-structural protein 3 (NS3), and the four sites within the non-structural region that encode proteins required for viral replication (each cleavage site) The site is called “NS3 / 4A”, “NS4A / 4B”, “NS4B / 5A”, “NS5A / 5B”) [AC Grakoui et al., J. Virol. 67, 2832-2843 (1993)]. As a result, in the region from NS3 to NS5B, five proteins, NS3 (p70), NS4A (p4), NS4B (p27), NS5A (p58 / 56) and NS5B (p66), are generated (Hijikata L et aL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10773 (1993)). It is known that NS3 protease has weak activity alone, and NS4A, another nonstructural protein, becomes a cofactor (cofactor) and enhances the protease cleavage activity. [C. Failla et al., J. Virol., 68, 3 753-3760 (1994)]. Of the four sites that are cleaved by NS3 protease, the three sites that are cleaved by trans (NS4A / 4B, NS4B / 5A, NS5A / 5B) are cysteine at the P1 position. It has an unknown substrate specificity. As described above, NS3 protease is necessary for virus growth and has a different substrate specificity from host protease, making it one of the potential targets for anti-HCV drugs. Is considered one. That is, it is considered that by screening for an NS3 protease inhibitor, a strong candidate for an anti-HCV drug can be found.
ところで、 NS3プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするためには、 HCV NS3プ 口テア一ゼの活性測定系が必要であることはいうまでもな 、が、 合成基質を用し、 た迅速で簡便な HCV NS3プロテアーゼの活性測定系は、 未だ確立されていないのが 現状である。 特に、 酵素活性測定用の合成基質は、 酵素に対する高度の感受性及 び高度の特異性、 水又は生物学的試験液に対する良好な溶解性及び消化物の易検 出性の 4点を満足することが重要であると 、われているカ^ これらの条件を満た す NS3プロテアーゼのための合成基質については全く知見がない。 By the way, it goes without saying that screening an NS3 protease inhibitor requires a system for measuring the activity of HCV NS3 protease. At present, a protease activity measurement system has not yet been established. In particular, synthetic substrates for measuring enzyme activity have high sensitivity and high specificity for enzymes, good solubility in water or biological test solutions, and easy detection of digests. It is important to satisfy the four points of excretion. There is no knowledge about a synthetic substrate for NS3 protease that satisfies these conditions.
これまで、 NS3プロテア一ゼ活性は、 インビトロ （in vitro) の転写一翻訳系又 は細胞内発現系で、 プロテア一ゼと基質を共発現し、 基質の切断を免疫沈降又は ウエスタンブロットで確認するという方法で行われていた 〔Y. Komoda et al. , J. Virol. 68, 7351-7357 (1994) :P. Bouffard et al. , Virology, 209, 52-59 (1995) ： B. Hahm et al. , J. Virol. , 69, 2534- 2539 (1995) :R. Bartenschlager et al. , J . Virol. , 68, 5045-5055 (1994) : L. Failla et al. , J. Virol.， 68， 3753-376 0 (1994) : Lin et al.， J. Virol.， 68， 5063-5073 (1994)〕 。 これらの方法は、 免疫沈降、 電気泳動の操作が必要なため、 阻害剤スクリーニングのための簡便な アツセィ法とは言い難い上に、 酵素と基質の発現量を判断しにくいことから、 酵 素学的な解析には向いていなかった。  To date, NS3 protease activity has been determined by co-expressing proteases and substrates in an in vitro transcription-translation system or intracellular expression system and confirming substrate cleavage by immunoprecipitation or Western blot. [Y. Komoda et al., J. Virol. 68, 7351-7357 (1994): P. Bouffard et al., Virology, 209, 52-59 (1995): B. Hahm et. al., J. Virol., 69, 2534-2539 (1995): R. Bartenschlager et al., J. Virol., 68, 5045-5055 (1994): L. Failla et al., J. Virol., 68, 3753-3760 (1994): Lin et al., J. Virol., 68, 5063-5073 (1994)]. Since these methods require immunoprecipitation and electrophoresis, they are not a simple Atsui method for screening inhibitors, and it is difficult to determine the expression levels of enzymes and substrates. It was not suitable for typical analysis.
また、 合成べプチド基質を用 、た NS3プ口テアーゼのアツセィ系も報告されてい る 〔N. Kakiuchi et al. , B. B. R. ， 210， 1059-1065 (1995)〕 。 これは、 NS5A /5B間の配列を摸した 20ァミノ酸の N末端にダンシル基を導入した基質を用いた系 であるが、 基質の消化を逆相 HPLCで検出する必要があり、 活性測定にかなりの時 間と手間を要すること力、ら、 多くのサンプル数をこなす必要がある阻害剤のスク リーニングには適した方法とは言えな t、。  In addition, an atsushi system of NS3 peptide protease using a synthetic peptide substrate has been reported [N. Kakiuchi et al., BBR, 210, 1059-1065 (1995)]. This is a system that uses a substrate with a dansyl group introduced at the N-terminus of 20 amino acid, which mimics the sequence between NS5A and 5B.It is necessary to detect the digestion of the substrate by reversed-phase HPLC. The time-consuming and labor-intensive method, and the method that is not a good method for screening inhibitors that require large sample numbers.
分子内蛍光消光を利用した合成基質は既に知られており、 基質配列の切断点を 挟んで消光団と蛍光団を有し、 酵素による切断前は消光団により蛍光が抑えられ ているが、 切断後は消光が解除され蛍光強度が増加することを特徴としている。 この基質は、 ストロムライシン 1 (マトリックスプロテア一ゼ -3) CH. Nagase e t al. , J. B. C. 269, 20952-20957 (1994)〕 、 HIV (ヒト免疫不全ウィルス） プロ テアーゼ 〔特公平 6— 6 1 2 7 9号明細書 ZE. D. Matayoshi et al. , Science 247, 954-958 (1990)〕 、 ゥシファクター I X a yS . X a ^ 〔M. J. Castillo et al. , Biochemistry 22, 1021-1029 (1983)〕 等の活性測定に利用されている。 しか し、 NS3プロテア一ゼのァッセィのために分子内蛍光消光を利用した合成基質を利 用することについては従来報告がなかった。 Synthetic substrates utilizing intramolecular fluorescence quenching are already known, and have a quencher and a fluorophore across the cleavage point of the substrate sequence, and the fluorescence is suppressed by the quencher before cleavage by the enzyme. Thereafter, the quenching is released and the fluorescence intensity is increased. This substrate includes stromlysin 1 (matrix proteinase-3) CH. Nagase et al., JBC 269, 20952-20957 (1994)], HIV (human immunodeficiency virus) protease [Tokuhei 6-6 12 79, ZE.D.Matayoshi et al., Science 247, 954-958 (1990)], Psifactor IX ayS.Xa ^ (MJ Castillo et al., Biochemistry 22, 1021-1029 (1983) )] And the like. Only However, there has been no report on the use of a synthetic substrate that utilizes intramolecular fluorescence quenching for the NS3 protease assay.
本発明は、 NS3プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングに必要な、 迅速、 簡便、 高 感度かつ多処理可能な NS3プロテア一ゼのァッセィ系を開発すること、 特に該ァッ セィ系に用いられる新規な合成基質を提供することを課題とする。 発明の開示  The present invention is to develop a fast, simple, highly sensitive and multi-processable cascade system of NS3 protease necessary for screening of NS3 protease inhibitors, and in particular, a novel synthetic substrate used in the cascade system. The task is to provide Disclosure of the invention
我々は、 鋭意努力し基質及びアツセィ系の改良を行い、 迅速、 簡便、 高感度か つ多処理可能な NS3プロテアーゼのアツセィ系を完成させた。 以下、 本発明につい て詳述する。  We have worked diligently to improve the substrate and Atsushi system, and have completed a fast, simple, sensitive and multi-processable Atsushi system of NS3 protease. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明者らは、 効率のよい NS3プロテア一ゼのアツセィ系を開発することを目的 として好適な合成基質の探索を中心として研究を進めた。  The present inventors have conducted research mainly on the search for a suitable synthetic substrate for the purpose of developing an efficient NS3 protease protease system.
本発明者らは、 当初 NS3プロテア一ゼ単独を添加し、 分子内蛍光消光を利用した 合成基質を利用するアツセィ系を構築することを試みたが、 NS3プロテア一ゼはそ れ自身では基質切断活性が弱いため、 実用に足る効率の良いァッセィ系を構築す ることができなかった。 即ち、 NS3プロテアーゼ阻害剤を簡便かつ大量にスクリー ニングするためのアツセィ系を確立できなかった。 そこで、 本発明者等は、 さら に研究した結果、 NS4A存在下でァッセィ系を構築することに着目した。  The present inventors initially attempted to construct an Atsushi system using a synthetic substrate using intramolecular fluorescence quenching by adding NS3 protease alone, but NS3 protease itself cleaves the substrate. Due to the low activity, it was not possible to construct a practical and efficient assay system. That is, it was not possible to establish an Atsey system for screening NS3 protease inhibitors easily and in large amounts. Thus, the present inventors have further studied and as a result, have paid attention to constructing an assay system in the presence of NS4A.
前述のように、 従来 NS4A存在下で NS3プロテアーゼの活性が増強すること自体は 知られており、 この知見を NS3プロテアーゼの測定に応用しょうとする試みもなさ れてはいたが、 細胞内発現系を用いているため、 迅速で効率の良い大量スクリ一 ニングに適したアツセィ系は確立されていなかった。 本発明者らは、 酵素活性増 強に必要な NS4Aの配列は、 NS4Aの N末端から 22から 34番目に含まれることが示唆 されていた CC. Fail la et al. , J. Virol. , 68, 3753-3760(1994) :C. Lin et al. , J. Virol. 68, 8147- 8157(1994) :Y. Tanji et al. , J. Virol. , 69, 4017-4026(1995 )] ことから、 この配列を含む 18から 40番目のペプチド （LTTGSVVIVGRI ILSGRPAVV PD;以後 Γ4Α18- 40」 と略す） を合成し、 分子内蛍光消光を利用した合成基質を利 用するアツセィ系に添加したところ、 NS4A非存在下の該ァッセィ系では実用化に 至る程の効果は得られなかったが、 Γ4Α18- 40」 を酵素と等モル以上添加した場合 に、 NS3プロテア一ゼの基質切断活性が著しく増強されることを見い出し、 従来に ない新規な NS3プロテアーゼのアツセィ系を確立した。 即ち、 本発明者らによって 、 高感度で簡便であるため実用性の非常に高い分子内蛍光消光を利用した合成基 質を利用するアツセィ系を、 その実現が希求されていた HCVプロテア一ゼの活性測 定において利用することが、 初めて可能となった。 即ち、 本発明者らが、 C型肝 炎ウィルスにおいて、 初めて実用に耐えうる簡便で迅速なプロテアーゼのアツセ ィ系を確立したことに関する産業界への寄与は、 極めて多大なものがある。 As mentioned above, it has been known that NS3A activity is enhanced in the presence of NS4A, and attempts have been made to apply this finding to the measurement of NS3 protease. Therefore, no Atsey system suitable for rapid and efficient mass screening has been established. The present inventors have suggested that the sequence of NS4A necessary for enhancing the enzyme activity was included from the N-terminus of NS4A to positions 22 to 34. CC. Fail la et al., J. Virol., 68 , 3753-3760 (1994): C. Lin et al., J. Virol. 68, 8147-8157 (1994): Y. Tanji et al., J. Virol., 69, 4017-4026 (1995)] From the 18th to 40th peptide containing this sequence (LTTGSVVIVGRI ILSGRPAVV PD; hereafter abbreviated as “4Α18-40”), and added to an Atsushi system using a synthetic substrate utilizing intramolecular fluorescence quenching. However, it was found that when Γ4Α18-40 '' was added in an equimolar amount or more with the enzyme, the substrate cleavage activity of NS3 protease was significantly enhanced, and an unprecedented novel NS3 protease system was added. Established. In other words, the present inventors have developed an atsey system utilizing a synthetic substrate utilizing intramolecular fluorescence quenching which is highly sensitive and simple and is very practical because of the HCV protease which has been desired to be realized. For the first time, it can be used for activity measurement. That is, the present inventors have made a very large contribution to the industry in connection with establishing the first practical and easy protease-based protease system for hepatitis C virus that can be practically used.
本発明者らはこの系に適した分子内蛍光消光を利用した基質を探索した。 分子 内蛍光消光を利用した基質は、 酵素の認識配列を消光団と蛍光団の間に挿入する ことで得られる。 しかし、 消光団と蛍光団の間の空間的距離があまり大きすぎる と消光団による消光効果が得られず、 切断前のバックグラウンドが高くなり、 活 性測定用の基質として適さない。 本発明者らは、 NS3プロテアーゼの認識部位の 1 つであり、 N. Kakiuchi等が HPLCによる NS3プロテア一ゼのアツセィ系に用いた基 質配列 （GEAGDDIVPCSMSYTWTGAL) を基に、 切断に必要な最小単位を求めた。  The present inventors have searched for a substrate utilizing intramolecular fluorescence quenching suitable for this system. Substrates utilizing intramolecular fluorescence quenching can be obtained by inserting an enzyme recognition sequence between the quencher and the fluorophore. However, if the spatial distance between the quencher and the fluorophore is too large, the quenching effect of the quencher will not be obtained, and the background before cleavage will be high, making it unsuitable as a substrate for activity measurement. The present inventors believe that one of the recognition sites for NS3 protease is the minimum unit required for cleavage based on the basic sequence (GEAGDDIVPCSMSYTWTGAL) used by N. Kakiuchi et al. For the NS3 protease protease system by HPLC. I asked.
これまでにも、 基質配列の変異体と NS3プロテアーゼを大腸菌又は動物細胞で共 発現させ、 切断に必要な配列の検討がなされている CY. Komoda et al. , J. Virol. 68, 7351-7357 (1994) :Y. Tan ji et al. , 145, J. Viol. 215- 219 (1994) : A. Alexan der et al. , Gene. 68, 7525-7533 (1994)〕 。 NS5A/5B切断部位の場合、 PI及び PI '位 （プロテア一ゼの基質中のアミノ酸残基を、 切断点から N末端に向かい Pl， P2 ，Ρ3 · · · と、 また C末端に向かい ΡΙ' , Ρ2' , Ρ3' · ■ · と呼ぶ） のアミノ酸配列が 切断に重要であることが報告されているが、 インビト口での合成べプチドを使用 した基質特異性の検討はなされていなかった。 本発明者らは、 合成ペプチドを基 質とした場合、 切断点から Ν末端側は、 Ρ4位のイソロイシンまでの配列 （IVPCSMS YKDK) を有していることが好ましいことを見出した。 また、 切断点から C末端側は 、 P3'位のセリンまでの配列 （SMS) を有しているのが好ましいが、 P4'位のチロシ ンまでの配列 (SMSY) を有しているとより好ましいということを見出した （後述 の実施例 1 ) 。 そこで、 上述の N末端側の配列と C末端側の配列を組み合わせると 好適なペプチド配列が得られると予想したが、 予想に反し、 切断に必要と思われ る P4から P4'までのべプチド配列は、 酵素消化を著しく受けにくいことが分かった (実施例 1、 表 1 . 1 5 ) 。 そこでさらに検討を加え、 P7〜P5に Lys- Asp- Lysを付 加した。 KDKIVPC- SMSYなる配列が、 蛍光基質の基本配列として適切であると判断 した。 そして、 本発明者らは鋭意検討の結果、 特に So far, mutants of the substrate sequence and NS3 protease have been co-expressed in Escherichia coli or animal cells, and the sequences required for cleavage have been studied.CY. Komoda et al., J. Virol. 68, 7351-7357 (1994): Y. Tanji et al., 145, J. Viol. 215-219 (1994): A. Alexan der et al., Gene. 68, 7525-7533 (1994)]. In the case of the NS5A / 5B cleavage site, PI and PI 'positions (Pl, P2, 基質 3 · · · from the cleavage point to the N-terminus and the C-terminus ア ミ ノ 酸' , Ρ2 ', Ρ3' · ■ ·) have been reported to be important for cleavage, but no substrate specificity studies using synthetic peptides at the in-vitro mouth have been made. When the synthetic peptide is used as a base, the present inventors assume that the sequence from the cleavage point to the Ν terminal side is from the Ρ4 position to isoleucine (IVPCSMS (YKDK) is preferred. Further, it is preferable that the C-terminal side from the cleavage point has a sequence (SMS) from P3 ′ to serine, but it is more preferable to have a sequence from P4 ′ to tyrosine (SMSY). It was found to be preferable (Example 1 described later). Therefore, it was predicted that a suitable peptide sequence could be obtained by combining the N-terminal sequence and the C-terminal sequence described above.Unexpectedly, however, the peptide sequence from P4 to P4 ', which is considered necessary for cleavage, was expected. Was found to be significantly less susceptible to enzymatic digestion (Example 1, Table 1.15). Therefore, further investigation was performed, and Lys-Asp-Lys was added to P7 to P5. The sequence KDKIVPC-SMSY was determined to be appropriate as the basic sequence of the fluorescent substrate. The present inventors have made intensive studies, and in particular,
( N末端） X-Asp-Lys-Ile-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-Y-Lys ( C末端） （配列番号 : 1 )  (N-terminal) X-Asp-Lys-Ile-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-Y-Lys (C-terminal) (SEQ ID NO: 1)
(式中の記号は、 Xは単結合又は Lysを、 Yは単結合又は Tyrを意味する。 ） なる配列の消化率が良好であることを見出した。  (In the symbols in the formula, X means a single bond or Lys, and Y means a single bond or Tyr.) It was found that the digestibility of the following sequence was good.
また、 前述のように、 プロテア一ゼアツセィのための合成基質は、 水又は生物 学的試験液に対する良好な溶解性を示すことが肝要である。 し力、し、 NS3プロテア ーゼの認識部位付近は、 親水性アミノ酸が乏しく、 NS3プロテア一ゼの認識部位付 近のァミノ酸配列を含む合成基質は難溶性であることが、 良好な合成基質開発の 障害となっていた。 本発明者らは、 鋭意実験を繰り返し、 特に P5位に Lysを配する ことで、 特異性が保たれたまま、 水溶性を維持することが可能であることを見出 した。  Also, as mentioned above, it is important that the synthetic substrate for proteases has good solubility in water or biological test solutions. A hydrophilic substrate is poor in the vicinity of the NS3 protease recognition site, and a synthetic substrate containing an amino acid sequence near the NS3 protease recognition site is poorly soluble. This was an obstacle to development. The present inventors have conducted intensive experiments and found that it is possible to maintain water solubility while maintaining specificity, particularly by arranging Lys at the P5 position.
具体的には、 本発明は、  Specifically, the present invention
( 1 ) C型肝炎ウィルス N S 4 A由来のぺプチド存在下で C型肝炎ウィルス N S 3プロテアーゼ活性を測定するための修飾べプチドであり、 分子内の官能基のい ずれかに蛍光団及び消光団がそれぞれ共有結合され、 蛍光団と消光団がそれぞれ 結合している残基との間 （結合している残基を含む） に下記アミノ酸配列 （ I ) を有する修飾べプチド、 N末端 X- Asp- Lys- Ile-Val- Pro- Cys- Ser- Met- Ser- Y- Lys C末端 (配列番号： 1 ) (1) A modified peptide for measuring the activity of hepatitis C virus NS3 protease in the presence of a peptide derived from hepatitis C virus NS4A, and a fluorophore and quenching at any of the functional groups in the molecule. A modified peptide having the following amino acid sequence (I) between the residues to which the fluorophore and the quencher are respectively bound (including the bound residues), N-terminal X-Asp-Lys-Ile-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-Y-Lys C-terminal (SEQ ID NO: 1)
( I )  (I)
(式中の記号は、 Xは単結合又は Lysを、 Yは単結合又は Tyrを意味する。 ） (In the symbols in the formula, X represents a single bond or Lys, and Y represents a single bond or Tyr.)
( 2 ) C型肝炎ウィルス N S 4 A由来ペプチド及び （1 ) に記載の修飾ペプチド を含む、 C型肝炎ウィルス N S 3プロテア一ゼ活性測定用キット、 及び (2) a kit for measuring hepatitis C virus NS3 protease activity, comprising a hepatitis C virus NS4A-derived peptide and the modified peptide according to (1); and
( 3 ) C型肝炎ウィルス N S 4 A由来ペプチド存在下で、 （1 ) の修飾ペプチド の切断を観察することを特徵とする、 C型肝炎ウィルス N S 3プロテアーゼ活性 の測定方法、 に関する。 なお、 C型肝炎ウィルスには亜型が存在するので、 該亜 型のァミノ酸配列に基づいて、 （ I ) のァミノ酸配列に置換、 欠失、 挿入などの 変異を加えた配列を有する修飾べプチドも、 本発明の修飾べプチドに包含される 又 NS3プロテア一ゼは、 NS5A/5B連結部以外にも NS4A/4B及び NS4B/5A連結部の配 列も基質とするため、 これらのアミノ酸に基づいて本発明と同様な手法で得られ る修飾ぺプチドも本発明に包含される。  (3) A method for measuring hepatitis C virus NS3 protease activity, which comprises observing cleavage of the modified peptide of (1) in the presence of a hepatitis C virus NS4A-derived peptide. Since hepatitis C virus has a subtype, a modification having a sequence obtained by adding a mutation such as substitution, deletion, or insertion to the amino acid sequence of (I) based on the amino acid sequence of the subtype. The peptides are also included in the modified peptides of the present invention.In addition, since NS3 protease is used as a substrate not only at the NS5A / 5B junction but also at the NS4A / 4B and NS4B / 5A junctions, these amino acids are used. Modified peptides obtained by the same method as the present invention based on the above are also included in the present invention.
本発明の合成ペプチド基質は、 H. Nagase等 〔J. B. C. , 269， 20952-20957 (1994 )] の方法を参考に、 消光団であるジニトロフユ二ル基を有するリジル基に逐次的 にアミノ酸を 「Fmoc法」又は 「Boc法」 に従いカツプリングしていく方法等により 合成することができる 〔泉屋 信夫等、 ペプチド合成の基礎と実験 （1985)〕 。  The synthetic peptide substrate of the present invention is obtained by sequentially adding an amino acid to a lysyl group having a dinitrophenyl group as a quencher by referring to the method of H. Nagase et al. [JBC, 269, 20952-20957 (1994)]. It can be synthesized by a method of coupling according to the “method” or the “Boc method” [Nobuo Izumiya, et al., Basics and experiments on peptide synthesis (1985)].
「Fmoc法」 の場合、 側鎖の保護を必要とするアミノ酸は、 Fmoc- Lys (Boc) -OH ， Fraoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc- Cys (Trt) -OH, Fmoc- Ser (tBu) -OH, Fmoc- Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH等を用いる。 「Boc法」 の場合、 Boc-Lys (2- CI - Z) -OH, Boc- Asp (OBzl) -0H， Boc- Cys (p eBzl) -OH, Boc- Ser (Bzl) - OH, Bo c-Tyr (2-Br-Z) -OH, Boc-Glu (OBzl) -OH, Boc- Met (0) -OH等を用いる。 「Fmo c」 の場合、 アミノ酸の活性化剤には、 HOBt, NMM又は H0Bt， DIEA, NMMの組み合わ せを用いることが可能である。 カップリング反応には、 あらかじめアミノ酸をそ れぞれ PyBOP/BOP又は TBTUと混合したものに、 先に示した活性化剤を加えて行う。 また、 反応、 洗浄溶媒には、 MF以外にも使用可能で、 ジメチルァセトアミ ド、 N -メチルピロリ ドンなどがその例である。 ペプチドの MOCAc化後、 レジンからの切 り出しと側鎖の脱保護はトリフルォロ酢酸により行う。 In the case of the “Fmoc method”, amino acids requiring side chain protection are Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fraoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH, Fmoc- Ser (tBu ) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH or the like is used. In the case of "Boc method", Boc-Lys (2-CI-Z) -OH, Boc-Asp (OBzl) -0H, Boc-Cys (peBzl) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc Use -Tyr (2-Br-Z) -OH, Boc-Glu (OBzl) -OH, Boc-Met (0) -OH or the like. In the case of "Fmoc", a combination of HOBt, NMM or H0Bt, DIEA, NMM can be used as an activator for amino acids. The coupling reaction is performed by adding the activator shown above to a mixture of amino acids in advance with PyBOP / BOP or TBTU, respectively. In addition, MF, dimethylacetamide, N -Methylpyrrolidone is an example. After MOCAc formation of the peptide, exclusion from the resin and deprotection of the side chain are performed with trifluoroacetic acid.
本発明における基質の蛍光団は、 蛍光性を有する基であり、 具体的には、 M0CA c ( (7-methoxycouiar in-4-yl ) acetyl) ヽ EMNS (5 - [ (2-aminoethyl) amino) n aphthalene-1 sulfonic acid) 、 Abz (2-aminobenzoyl group) ヽ 又はそれと同等 の効果を有する基である。 好適には MOCAcである。 なお、 蛍光とは、 光の吸収によ り分子や原子が光を放出することをいう （生化学辞典、 第 2版 (1992) ) 。 消光団 は、 蛍光消光 （生化学辞典、 第 2版 (1992)) の性質を有する基であり、 具体的には ヽ Drip (2, 4-dinitrophenyU ヽ DABCYL (4- (4-dimethylaminophenylazo benzoic acid) 、 Nba (4-nitrobenzylamide) など、 又それら同等の効果を有する基であ る。 好ましくは Dnpである。 本発明における蛍光団と消光団の組合せは、 MOCAcと Dripが好適である。  The fluorophore of the substrate in the present invention is a group having a fluorescent property, specifically, M0CA c ((7-methoxycouiar in-4-yl) acetyl) ヽ EMNS (5-[(2-aminoethyl) amino) naphthalene-1 sulfonic acid), Abz (2-aminobenzoyl group) ヽ or a group having an equivalent effect. Preferably, it is MOCAc. The term “fluorescence” means that molecules and atoms emit light by absorbing light (Biochemical Dictionary, 2nd edition (1992)). The quencher is a group having the property of fluorescence quenching (Biochemical Dictionary, 2nd edition (1992)), specifically, ヽ Drip (2, 4-dinitrophenyU) ヽ DABCYL (4- (4-dimethylaminophenylazo benzoic acid) , Nba (4-nitrobenzylamide), etc., and groups having the same effect, preferably Dnp The combination of a fluorophore and a quencher in the present invention is preferably MOCAc and Drip.
分子内の官能基とは、 本発明の修飾ペプチドの C末端、 N末端のカルボキシル 基、 ァミノ基の他、 修飾べプチド内に存在する一級アミノ基、 カルボキシル基、 又は水酸基である。 具体的には、 リジン残基のアミノ基、 セリン残基又はチロシ ン残基の水酸基、 ァスパラギン酸残基の力ルボキシル基等である。  The functional group in the molecule is a primary amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group present in the modified peptide, in addition to the carboxyl group and the amino group at the C-terminal and the N-terminal of the modified peptide of the present invention. Specific examples include an amino group of a lysine residue, a hydroxyl group of a serine residue or a tyrosine residue, and a hydroxyl group of an aspartic acid residue.
なお、 本明細書における化合物の略号は以下の意味である。 「Fmoc」 は 9-フル ォレニルメ トキシカルボニル、 「0叩」 は2，4-ジニトロフヱニル、 「DMPAMP」 は 4 - (2' , 4' -ジメ トキシフエ二ルアミノメチル）フエノキシ、 「DMF」 は Ν, Ν-ジメチル ホルムアミ ド、 「DIPCDI」 は Ν，Ν' -ジイソプロピルカルボジイミ ド、 「H0Bt」 は 1 -ヒドロキシベンゾトリアゾール、 「DIEA」 は N，N -ジイソプロピルェチルアミン、 「題 M」 は N-メチルモルフォリン、 「PyB0P」 はべンゾトリアゾル- 1-ィル-ォキシ トリスピロリジノホスホニゥムへキサフルォ口リン化物塩、 「B0P」 はべンゾトリ ァゾル -1-ィルォキシトリスジメチルァミノホスホニゥムへキサフルォロリン化物 塩、 「删」 は 「2-(1Η-ベンゾトリアゾ一ル -1-ィル） -1, 1, 3, 3，-テトラメチルゥ ロニゥム テトラフルォロボレート （2-C1H- Benzotriazole-卜 yl)- 1， 1， 3， 3, - tetr amethyluronium tetrafluoroborate) 」 、 「DCM」 はジクロロメタンをそれぞれ表 す。 In addition, the abbreviation of the compound in this specification has the following meaning. “Fmoc” is 9-fluorenyl methoxycarbonyl, “0 tap” is 2,4-dinitrophenyl, “DMPAMP” is 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenylaminomethyl) phenoxy, “DMF” is Ν, Ν- Dimethylformamide, “DIPCDI” is Ν, Ν'-diisopropylcarbodiimide, “H0Bt” is 1-hydroxybenzotriazole, “DIEA” is N, N-diisopropylethylamine, “Title M” is N-methyl Morpholine, “PyB0P” is benzotriazole-1-yl-oxytrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphide salt, “B0P” is benzotriazole-1-yloxytrisdimethylaminophosphonium Xafluorophosphoride salt, “删” means “2- (1Η-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3, -tetramethylperonium tetrafluoroborate (2-C1H-benzotriazole-yl) -1, 1 , 3, 3,-tetr amethyluronium tetrafluoroborate) ”and“ DCM ”represent dichloromethane, respectively.
また、 本明細書において、 アミノ酸の 1文字表記及び 3文字表記は、 「生化学 辞典 （第 2版） 、 東京化学同人、 1 9 9 0年、 第 1 4 6 8頁」 に記載のものに従  In the present specification, the one-letter and three-letter codes for amino acids are those described in “Biochemical Dictionary (2nd edition), Tokyo Kagaku Dojin, 1990, p. 1468”. Obedience
NS4A由来べプチド存在下で本発明の基質を用いると、 NS3プロテアーゼの活性を 、 基質切断に伴い上昇する蛍光強度から簡便に測定でき、 HPLCなどの煩雑な操作 が不要である。 また、 96穴プレート上での消化反応、 それに続く蛍光強度の測定 が可能であることからも大量のサンプルの測定を迅速に行うことができる。 さら に、 20merの合成基質を用いた HPLCによるアツセィ法では、 酵素濃度、 基質濃度を それぞれ終濃度 80 /i g/ml, 86 / M用いているが、 本発明の基質では酵素濃度、 基質 濃度の終濃度がそれぞれ 8 g/ml, 250nMで充分測定可能であり、 従来のアツセィ 系に比して高感度であると言える。 When the substrate of the present invention is used in the presence of the NS4A-derived peptide, the activity of NS3 protease can be easily measured from the fluorescence intensity that increases with cleavage of the substrate, and no complicated operation such as HPLC is required. In addition, the digestion reaction on a 96-well plate and the subsequent measurement of the fluorescence intensity are possible, so that a large amount of sample can be measured quickly. Furthermore, in the Atsey method by HPLC using a 20-mer synthetic substrate, the enzyme concentration and the substrate concentration are 80 / ig / ml and 86 / M, respectively, respectively. The final concentrations of 8 g / ml and 250 nM can be measured sufficiently, and it can be said that the sensitivity is higher than that of the conventional Atsushi system.
本発明における NS4Aとは、 前述の如く HCVウィルスの非構造夕ンパクが NS3プロ テアーゼにより消化された結果生じる断片、 非構造タンパク 4A (NS4A) を意味し 、 親水性領域と疎水性領域をもつ全長 5 4アミノ酸のタンパクを意味する。  NS4A in the present invention refers to a fragment, a non-structural protein 4A (NS4A) obtained as a result of digestion of the non-structural protein of HCV virus with NS3 protease as described above, and has a full-length having a hydrophilic region and a hydrophobic region. It means a protein of 54 amino acids.
なお、 本発明のアツセィ系に添加する NS4A配列は 「4A18-40」 に限らず、 N末端 から 22から 34番目を含む NS4A由来の断片であればいずれの断片でもかまわない。  The NS4A sequence to be added to the Atsushi system of the present invention is not limited to “4A18-40”, and any fragment may be used as long as it is an NS4A-derived fragment including the 22nd to 34th positions from the N-terminal.
4A21-40, 4A18-37, 4A18- 34， 4A21-34, 4A22- 34などがその例である。 （4Aの後の 数字は、 各 NS4A断片の N末と C末の、 NS4Aの N末端から数えたアミノ酸番号を示す。 4A21-40, 4A18-37, 4A18-34, 4A21-34, and 4A22-34 are examples. (The number after 4A indicates the amino acid number at the N-terminal and C-terminal of each NS4A fragment counted from the N-terminal of NS4A.
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図 1は、 式①についてのマススぺクトロメ トリーを示す図である。  FIG. 1 is a diagram showing mass spectrometry for equation (1).
図 2は、 式②についてのマススぺクトロメ 卜リーを示す図である。  FIG. 2 is a diagram showing mass spectrometry for equation (2).
図 3は、 式③についてのマススぺクトロメ トリーを示す図である。 図 4は、 式②の NS3プロテア一ゼによる消化産物の、 蛍光、 励起波長のスぺクト ラムを示す図である。 FIG. 3 is a diagram showing mass spectrometry for equation (3). FIG. 4 is a diagram showing a spectrum of fluorescence and excitation wavelength of a digestion product of NS3 protease of formula (2).
図 5は、 式②を基質として用いたときの NS3プロテア一ゼの濃度を変化させたと きの蛍光強度の経時的変化を示す図である。  FIG. 5 is a graph showing the time-dependent change in the fluorescence intensity when the concentration of NS3 protease is changed when the formula ② is used as a substrate.
図 6は、 式②を基質として用いたときの、 4A18-40存在、 非存在下における、 蛍 光強度の経時的変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 6 is a diagram showing the change over time in the fluorescence intensity in the presence and absence of 4A18-40 when using formula II as a substrate. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明を以下、 実施例により説明するが、 本発明はこれら実施例に限定される ものではない。  Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[比較例]  [Comparative example]
NS3プロテア一ゼ活性を測定するための蛍光基質を作成するに当たり、 基質配列 をどこまで短くできるかについて検討を行った。 HCV NS3プロテアーゼの認識配列 の 1つである非構造タンパク質 NS5A/5B間の配列を基に、 下記表 1のべプチドの合 成を行った。 また、 N末端、 C末端の小文字で表したリジン及びァスパラギン酸は 、 水溶性を増すために人為的に付加したものであり、 天然の基質配列とは異なる 酵素反応液 (50mM Tris · HC1 (ρΗ7· 6) ， 30mM NaCl, 2m DTT) に MBP- NS3 (終 濃度 2. 2 u M) を加え、 47. 5 1とした。 25°Cで 30分間予加温後、 以下に示すぺプチ ド基質をそれぞれ 2. 5 ^ 1 (終濃度 100 M) 加え、 25°Cで 6時間消化反応を行った 。 反応の停止は、 5M酢酸を 1 // 1添加することで行った。 反応停止後の反応液は、 逆相 HPLCで分離して、 基質の消化率を酵素未消化時の基質のピーク面積に対する 減少率から求めた。 この結果を後述の表 1の dNS4A-の項目に示す。 4A18- 40非存在 下でぺプチド基質は十分切れなかった。  In preparing a fluorescent substrate for measuring NS3 protease activity, we examined how short the substrate sequence could be. Based on the sequence between the nonstructural proteins NS5A / 5B, one of the recognition sequences of the HCV NS3 protease, the peptides shown in Table 1 below were synthesized. Also, lysine and aspartic acid represented by lowercase letters at the N- and C-termini are artificially added to increase water solubility, and are different from the natural substrate sequence in an enzyme reaction solution (50 mM TrisHC1 (ρΗ7 · 6), 30mM NaCl, 2m DTT) and MBP-NS3 (final concentration: 2.2uM) to make 47.5. After preheating at 25 ° C for 30 minutes, the following peptide substrates were added at 2.5 ^ 1 (final concentration: 100 M), respectively, and digestion was performed at 25 ° C for 6 hours. The reaction was stopped by adding 1 // 1 of 5 M acetic acid. The reaction solution after the termination of the reaction was separated by reversed-phase HPLC, and the digestibility of the substrate was determined from the decrease rate relative to the peak area of the substrate when the enzyme was not digested. The results are shown in the item of dNS4A- in Table 1 below. In the absence of 4A18-40, the peptide substrate was not sufficiently cleaved.
[実施例 1 ] 4A18- 40存在下における HCV NS3プロテアーゼ酵素反応の有効性及 c NS3プロテア一ゼによる切断に必要な基皙の最小単位の同定 4A18- 40存在下における HCV NS3プロテアーゼ酵素反応の有効性を検討した。 酵素反応液 (50mM Tris · HC1 (pH7. 6)， 30mM NaCl, 2mM DTT) に MBP-NS3 (終 濃度 2. 2 M) 、 4A18-40 (終濃度 4. 4 ^ M, 酵素濃度の 2倍モル量） を加え、 47. 5 ^ 1とした。 25°Cで 30分間予加温後、 以下に示すペプチド基質をそれぞれ 2. 5 1 (終 濃度 100 //M) 加え、 25°Cで 6時間消化反応を行った。 反応の停止は、 5M酢酸を 1 1添加することで行った。 反応停止後の反応液は、 逆相 HPLCで分離して、 基質の 消化率を酵素未消化時の基質のピーク面積に対する減少率から求めた。 この結果 を後述の表 1の dNS4A+の項目に示す。 Example 1 Efficacy of HCV NS3 Protease Enzyme Reaction in the Presence of 4A18-40 and Identification of the Minimum Unit of Base Required for Cleavage by cNS3 Protease The effectiveness of HCV NS3 protease enzyme reaction in the presence of 4A18-40 was examined. Enzyme reaction solution (50 mM TrisHC1 (pH 7.6), 30 mM NaCl, 2 mM DTT) in MBP-NS3 (final concentration 2.2 M), 4A18-40 (final concentration 4.4 ^ M, twice the enzyme concentration) (Molar amount) to give 47.5 ^ 1. After preheating at 25 ° C for 30 minutes, the following peptide substrates were added in 2.51 (final concentration 100 // M), respectively, and digestion reaction was performed at 25 ° C for 6 hours. The reaction was stopped by adding 11 of 5M acetic acid. The reaction solution after the termination of the reaction was separated by reversed-phase HPLC, and the digestibility of the substrate was determined from the reduction ratio relative to the peak area of the substrate when the enzyme was not digested. The results are shown in the dNS4A + item in Table 1 below.
以上より、 実施例 1では 4 A 1 8 - 4 0存在下の方が非存在下に比べ酵素反応 時間を短縮できたことから、 本発明の目的とする大量のサンプルを迅速にスクリ —ニングすることを可能とした。  As described above, in Example 1, the enzymatic reaction time was shorter in the presence of 4A18-40 than in the absence of 4A18-40. Made it possible.
又実施例 1より、 4 A 1 8— 4 0を存在させることにより短鎖のペプチド （基 質） でも HCV NS3プロテアーゼ活性を測定することを可能にした。  Also, from Example 1, the presence of 4A18-40 made it possible to measure HCV NS3 protease activity even with a short-chain peptide (substrate).
更に、 HCV NS3プロテアーゼ活性測定用蛍光基質を作成するに当たり、 その基質 配列が該プロテアーゼ切断点から N末端に向かい P 6位までのアミノ酸残基を有 し、 かつ切断点から P 3 ' 位までのアミノ酸残基を有しているのが好ましく、 P 6から P 4 ' までァミノ酸残基を有しているのがより好ましいことを見出した。 Further, in preparing a fluorescent substrate for measuring HCV NS3 protease activity, the substrate sequence has amino acid residues from the cleavage point of the protease to the N-terminus up to position P6, and the amino acid residues from the cleavage point to the position P3 ′. It has been found that they preferably have amino acid residues, and more preferably have amino acid residues from P6 to P4 '.
ぺプチドの配列 消化率 （％) Peptide sequence Digestibility (%)
dNS4+/dNS4-  dNS4 + / dNS4-
1. GEAGDDIVPC-SMSYTWTGAL (配列番号： 2) 85/191. GEAGDDIVPC-SMSYTWTGAL (SEQ ID NO: 2) 85/19
2. EAGDDIVPC-SMSYTWTGA (配列番号： 3) 92/142. EAGDDIVPC-SMSYTWTGA (SEQ ID NO: 3) 92/14
3. AGDDIVPC- SMSYTWTG (配列番号： 4) 75/8 3. AGDDIVPC- SMSYTWTG (SEQ ID NO: 4) 75/8
4. GDDIVPC-SMSYTWT (配列番号： 5) 59/nd 4. GDDIVPC-SMSYTWT (SEQ ID NO: 5) 59 / nd
5. GDDIVPC-SMSYTW (配列番号： 6) 44/4 5. GDDIVPC-SMSYTW (SEQ ID NO: 6) 44/4
6. kkGDDIVPC-SMSYT (配列番号： 7) 88/nd 6. kkGDDIVPC-SMSYT (SEQ ID NO: 7) 88 / nd
7. kkGDDIVPC-SMSY (配列番号： 8) 89/7 7. kkGDDIVPC-SMSY (SEQ ID NO: 8) 89/7
8. kkGDDIVPC-S S (配列番号： 9) 9/0  8. kkGDDIVPC-S S (SEQ ID NO: 9) 9/0
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10. GDDIVPC-SMS (配列番号： 11) 22/2  10. GDDIVPC-SMS (SEQ ID NO: 11) 22/2
11. DDIVPC-SMSYkdk (配列番号： 12) 62/5  11. DDIVPC-SMSYkdk (SEQ ID NO: 12) 62/5
12. IVPC-SMSYkdk (配列番号： 13) 49/9  12. IVPC-SMSYkdk (SEQ ID NO: 13) 49/9
13. VPC-SMSYkd (配列番号： 14) 2/0  13. VPC-SMSYkd (SEQ ID NO: 14) 2/0
14. IVPC-SMSYk (配列番号： 15) 6/2  14. IVPC-SMSYk (SEQ ID NO: 15) 6/2
15. IVPC-SMSY (配列番号： 16) 3/0  15. IVPC-SMSY (SEQ ID NO: 16) 3/0
16. kDklVPC-SMSY (配列番号： 17) 85/8 dNS4A+： 4A18-4D存在下、 dNS4A-： 4A18- 40非存在下、 n d ：試験せず  16. kDklVPC-SMSY (SEQ ID NO: 17) 85/8 dNS4A +: in the presence of 4A18-4D, dNS4A-: in the absence of 4A18-40, n d: not tested
「実施例 2 1 分子内 ¾光消光を利用した基晳を用いた NS3プロテアーゼの活性の 滅 (I) Fmoc-Lys (Dnp) の調製 "Example 21. Inhibition of NS3 Protease Activity Using a Substrate Using Intramolecular Light Quenching" (I) Preparation of Fmoc-Lys (Dnp)
Fmoc N-ヒドロキシスクシニミ ドエステル 1. 89g (5. 60mmol) を 30mlのジメ トキ シェタンに溶解し、 この溶液を 4 °Cに冷却した。 得られた溶液に、 Lys (Dnp) (シ グマ） 1. 63g (4. 67mmol) の溶解した 10%炭酸ナトリゥム溶液 10mlをゆつくりと添 加した。 4 °Cにおける 2時間の反応に続き、 室温にて 15時間反応させた。 反応液を 瀘過し、 瀘液に濃塩酸 （12N) を加え、 pH3にした後、 ジメ トキシェタンを減圧留 去した。 この溶液を酢酸ェチルで抽出し、 その後酢酸ェチル層を減圧留去した。 1.89 g (5.60 mmol) of Fmoc N-hydroxysuccinimide ester was dissolved in 30 ml of dimethoxetane, and the solution was cooled to 4 ° C. To the obtained solution, 10 ml of a 10% sodium carbonate solution in which 1.63 g (4.67 mmol) of Lys (Dnp) (Sigma) was slowly added. Following a 2 hour reaction at 4 ° C, the reaction was carried out at room temperature for 15 hours. The reaction solution was filtered, concentrated hydrochloric acid (12N) was added to the filtrate to adjust the pH to 3, and dimethoxetane was distilled off under reduced pressure. This solution was extracted with ethyl acetate, and then the ethyl acetate layer was distilled off under reduced pressure.
(I I) Fmoc-Lys (Dnp)- MPAMPの調製 (II) Preparation of Fmoc-Lys (Dnp) -MPAMP
Fmoc- DMPAMPレジン （ノノ バイオケム） 2. Og (0. 86mmol) を 20mlのピペリジン- DMF (1 : 1) に 30分間作用させ、 脱保護を行った後、 DMFで 3回洗浄した。 Fmoc- Ly s (Dnp) (0. 2g; 3. 5ramol) と HOBt (0. 536g; 3. 5mraol) を 20mlの DCM- DMF (1 : 1) に 溶解し、 この溶液をレジンに添加した。 さらに、 DIPCDI (0. 548ml ; 3. 5匪 ol) を加 え、 4. 5時間反応を行った。 生成物である Fmoc- Lys(Dnp)- DMPAMPを DMFと DCMで洗浄 して、 減圧下、 乾燥を行った。  Fmoc-DMPAMP resin (Nono BioChem) 2. Og (0.86 mmol) was allowed to act on 20 ml of piperidine-DMF (1: 1) for 30 minutes to perform deprotection, followed by washing with DMF three times. Fmoc-Lys (Dnp) (0.2 g; 3.5 ramol) and HOBt (0.536 g; 3.5 mraol) were dissolved in 20 ml of DCM-DMF (1: 1), and this solution was added to the resin. Further, DIPCDI (0.548 ml; 3.5 bandol) was added, and the reaction was performed for 4.5 hours. The product, Fmoc-Lys (Dnp) -DMPAMP, was washed with DMF and DCM, and dried under reduced pressure.
(I II) 蛍光ペプチド基質の合成と精製  (I II) Synthesis and purification of fluorescent peptide substrate
Fmoc-Lys(Dnp)- DMPAMP35mgを出発物質 （担体） として用い、 マルチプルべプチ ドシンセサイザー （PSSM- 8;島津製作所） により Fmoc法、 標準サイクル 〔PSSM- 8シ ステム取り扱い説明書； 島津製作所〕 で、 ペプチド鎖の伸長を行った。 式①の場 合、 順次、 Tyr， Ser, Met, Ser， Cys, Pro, Val, lie, Lys, Aspを付加し、 式② の場合にはさらに Lysを付加した。 式③の場合には、 順次、 Ser, Met, Ser, Cys, Pro, Val, lie, Lys, Aspを付加した。  Using Fmoc-Lys (Dnp) -DMPAMP 35mg as a starting material (carrier), using the multiple peptide synthesizer (PSSM-8; Shimadzu), Fmoc method, standard cycle [PSSM-8 system instruction manual; Shimadzu] The peptide chain was extended. In equation (1), Tyr, Ser, Met, Ser, Cys, Pro, Val, lie, Lys, and Asp were added in order, and in equation (2), Lys was further added. In the case of equation (3), Ser, Met, Ser, Cys, Pro, Val, lie, Lys, and Asp were added in order.
ペプチド合成終了後ヽ 7- methoxyco丽 rin- 4- acetic acidを添カロしヽ 2から 4時 間カツプリング反応を行い、 N末端のアミノ基に MOCAc基を導入した。 MPAMPから の切り出し及びアミノ酸の側鎖の脱保護は、 トリフルォロ酢酸を用いて 「D. S. Ki ng et al.， Int. J. Pept. Protein. Res. , 36, 255-266(1990)」 の方法を参考に行った さらに、 ペプチドは、 逆相の HPLC (ODS-80Tm, 2. 15 x 30cm ； 東ソ一社製） によ り精製した。 その際、 0. 1% TFA含有ァセトニトリルを 30分間に 0から 60%まで流 10ml/分で変化させて、 ペプチドを溶出後、 ？東結乾燥を行った。 その結果、 式① 、 ②及び式③をそれぞれ、 15mg、 16mg、 12mg得た。 After completion of peptide synthesis, coupling reaction was performed with か ら 7-methoxyco ヽ rin-4-acetic acid for 2 to 4 hours to introduce a MOCAc group into the N-terminal amino group. Cleavage from MPAMP and deprotection of the side chain of the amino acid were carried out using trifluoroacetic acid according to the method described in “DS Kitchen et al., Int. J. Pept. Protein. Res., 36, 255-266 (1990)”. Further, the peptide was analyzed by reversed-phase HPLC (ODS-80Tm, 2.15 x 30 cm; manufactured by Tosoh Corporation). Purified. At that time, 0.1% TFA-containing acetonitrile was changed from 0 to 60% in 30 minutes at a flow rate of 10 ml / min. Higashi Yui dried. As a result, formulas (1), (2) and (3) were obtained in 15 mg, 16 mg and 12 mg, respectively.
式① MOCAc- Asp- Lys-Ile- Val- Pro- Cys- Ser-Met- Ser- Tyr- Lys(Dnp)-丽2 (配列番 号： 1 8 ) Formula ① MOCAc-Asp-Lys-Ile-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-Lys (Dnp)-丽2 (SEQ ID NO: 18)
式② MOCAc-Lys- Asp-Lys- lie- Val- Pro- Cys- Ser-Met- Ser- Tyr- Lys(Dnp)-NH2 (配 列番号： 1 9 ) Formula ② MOCAc-Lys- Asp-Lys- lie- Val- Pro- Cys- Ser-Met- Ser- Tyr- Lys (Dnp) -NH 2 ( SEQ ID NO: 1 9)
式③ MOCAc- Asp- Lys- lie- Val- Pro- Cys- Ser- Met- Ser- Lys(Dnp)- NH2 (配列番号： 2 0 ) Formula ③ MOCAc-Asp-Lys-lie-Val-Pro-Cys-Ser-Met-Ser-Lys (Dnp) -NH 2 (SEQ ID NO: 20)
(IV)完成した合成基質の確認  (IV) Confirmation of completed synthetic substrate
1 ) マススぺク卜ロメ トリ一  1) Mass spectrometry
「エレクトロンスプレー （ESI ) マススぺクトロメ トリー」 により該基質の分子 量の確認を行った。 式①、 ②、 及び式③ともに理論上の分子量と一致した （図 1 、 図 2及び図 3 )。  The molecular weight of the substrate was confirmed by “electron spray (ESI) mass spectrometry”. Equations (1), (2), and (3) were consistent with the theoretical molecular weights (Figures 1, 2, and 3).
2 ) アミノ酸組成分析  2) Amino acid composition analysis
ピコタグワークステーション及びグラジェントシステム （共にウォーターズ社 製） を用い、 ピコタグアミノ酸分析法により該基質のアミノ酸組成分析を行つ た。 The amino acid composition of the substrate was analyzed by a picotag amino acid analysis method using a picotag workstation and a gradient system (both manufactured by Waters).
式① 式② 式③ Formula ② Formula ② Formula ③
Asp 1.00(1) 1.00(1) 0.95(1) Asp 1.00 (1) 1.00 (1) 0.95 (1)
Ser 1.82(2) 1.83(2) 1.87(2)  Ser 1.82 (2) 1.83 (2) 1.87 (2)
Val 0.76(1) 0.74(1) 0.83(1)  Val 0.76 (1) 0.74 (1) 0.83 (1)
Met 0.94(1) 0.94(1) 1.00(1)  Met 0.94 (1) 0.94 (1) 1.00 (1)
lie 0.73(1) 0.72(1) 0.80(1)  lie 0.73 (1) 0.72 (1) 0.80 (1)
Tyr 1.02(1) 1.02(1) 0.00(0)  Tyr 1.02 (1) 1.02 (1) 0.00 (0)
Lys 1.02(1) 2.05(2) 1.11(1)  Lys 1.02 (1) 2.05 (2) 1.11 (1)
Cys 0.89(1) 0.88(1) 1.03(1)  Cys 0.89 (1) 0.88 (1) 1.03 (1)
Pro 1.03(1) 1.01(1) 1.07(1)  Pro 1.03 (1) 1.01 (1) 1.07 (1)
NH3 1.24(1) 1.23(1) 1.36(1) カツコ内の値は、 合成基質中に含まれる数を示す。 式①、 ②及び、 式③、 共に、 アミノ酸配列から予想されるアミノ酸組成を有し ていた。 NH 3 1.24 (1) 1.23 (1) 1.36 (1) The value in Kazuko indicates the number contained in the synthetic substrate. Both formulas (2) and (3) and formula (3) had the amino acid composition predicted from the amino acid sequence.
(V) HPLCによる該基質消化の確認  (V) Confirmation of the substrate digestion by HPLC
50mM PBS緩衝液 (2πιΜ DTTを含む） に MBP - NS3 (終濃度 2.2 M)、 4A18-40 (終濃 度 22 M, 酵素濃度の 10倍モル量） を加え、 47.5 /1とした。 25°Cで 30分間予加温 後、 式①又は② （終濃度 ΙΟΟ^Μ) を加え、 37°Cで 30分間又は 1時間、 基質消化反 応を行った。 反応時間終了後、 4°Cに冷却した後、 直ちに、 酵素反応溶液の 5分の 1量を逆相 HPLCで分離して、 基質の消化率を酵素未消化時の基質のピーク面積に対 する減少率から求めた。 その結果、 どちらの基質も 1時間後には 100%の基質消化 が見られており、 本発明の基質は NS3プロテア一ゼの基質として適していることが 判明した。 表 3 消化率 （％) MBP-NS3 (final concentration 2.2 M) and 4A18-40 (final concentration 22 M, 10-fold molar amount of enzyme concentration) were added to 50 mM PBS buffer (containing 2πιΜ DTT) to give 47.5 / 1. After preheating at 25 ° C for 30 minutes, the formula (1) or (2) (final concentration 加 え ^ 加 え) was added, and the substrate digestion reaction was performed at 37 ° C for 30 minutes or 1 hour. Immediately after cooling to 4 ° C after the reaction time, 1/5 of the enzyme reaction solution is separated by reversed-phase HPLC, and the digestibility of the substrate is compared to the peak area of the substrate when the enzyme is not digested. It was determined from the reduction rate. As a result, both substrates are 100% digested after 1 hour Thus, the substrate of the present invention was found to be suitable as a substrate for NS3 protease. Table 3 Digestibility (%)
30分 1時間 式① 41. 5 100 30 minutes 1 hour formula① 41. 5 100
式② 100 100  Formula ② 100 100
(VI) 基質を用いた NS3プロテア一ゼの活性測定 (VI) NS3 protease assay using substrates
本発明の基質の消化物が最大の蛍光強度を示す励起、 蛍光波長を調べた。 [実 施 1 ] の消化反応 1時間後の式②サンプルを 1000倍希釈して検討に用いた。 一般 的には、 MOCAc基が最大の蛍光強度を与える励起、 蛍光波長はそれぞれ 328nm , 39 3nmと言われている。 そこで、 まず、 励起波長を 328nmに固定して、 蛍光波長を 35 0から 500nmまで変化させて、 スぺクトラムを調べた。 さらに、 蛍光波長を 393ηπιに 固定して励起波長を 250から 350mnまで変化させた。 その結果、 励起、 蛍光波長を それぞれ 318nm、 395nmに設定したときに蛍光強度は最大値を示した。 ただし、 29 Onm付近に見られているもう一つのピークは、 酵素液由来のピークであり、 基質を 加えず酵素のみを反応溶液に加え、 励起波長 318nmで蛍光波長のスぺクトラムを調 ベると蛍光はほとんど検出されなかったので、 基質の蛍光スぺクトラムと重なる ことはない。 式①及び式③も同じ結果を示した。 よって、 本発明の基質の蛍光測 定には、 励起、 蛍光波長それぞれ 318nm、 395nmを用いることにした （図 4参照） 次に、 本発明による合成基質を用いて、 NS3プロテアーゼの活性測定を 96穴型プ レートリーダーで行った。 The excitation and fluorescence wavelengths at which the digest of the substrate of the present invention showed the maximum fluorescence intensity were examined. One hour after the digestion reaction of [Example 1], the formula II sample was diluted 1000-fold and used for the study. Generally, it is said that the excitation and emission wavelengths at which the MOCAc group gives the maximum fluorescence intensity are 328 nm and 393 nm, respectively. Therefore, first, the excitation wavelength was fixed at 328 nm, and the fluorescence wavelength was changed from 350 to 500 nm, and the spectrum was examined. Furthermore, the excitation wavelength was changed from 250 to 350 mn while the fluorescence wavelength was fixed at 393ηπι. As a result, the fluorescence intensity showed the maximum value when the excitation and fluorescence wavelengths were set to 318 nm and 395 nm, respectively. However, the other peak around 29 Onm is the peak derived from the enzyme solution, and only the enzyme is added to the reaction solution without adding the substrate, and the spectrum of the fluorescence wavelength is examined at an excitation wavelength of 318 nm. And fluorescence were hardly detected, and thus did not overlap with the fluorescence spectrum of the substrate. Equations (2) and (3) showed the same result. Therefore, the excitation and emission wavelengths of 318 nm and 395 nm were used for the fluorescence measurement of the substrate of the present invention (see FIG. 4). Next, the activity of NS3 protease was measured with a 96-well plate reader using the synthetic substrate according to the present invention.
エツペンドルフチューブに 1 μも I μΛ MBP- NS3を 4 ;z l、 900 Μ 4A18- 40 (DMSO中 ) を 1入れ、 50mM PBS緩衝液 （2mM DTTを含む） を加えて正確に 97. 5 μ 1とする 。 25°Cで 30分間予加温する。 この混合液を 96穴型プレートに移し、 蛍光分光光度 計に設置した後、 10 / Mの式①、 式②又は式③の蛍光ペプチド基質 （DMS0中） 2. 5 1を加えて、 酵素反応を 37°Cで 60分間実施した。 この間、 蛍光強度の変化を経時 的に励起波長 318nm、 蛍光波長 395nmで 10分ごとに測定した結果、 経時的に蛍光強 度の増加が認められた。 式②の蛍光べプチド基質を用いたときの結果を図 5に示 す。 また、 酵素の終濃度を変化させた場合、 濃度依存的に基質の消化、 つまり蛍 光強度の増加が見られた。 なお、 大量のサンプルをスクリーニングする系では、 アツセィに使用する酵素量が少量であることが望ましいが、 本実験の結果、 20 ;/ g/mlの酵素量でも、 十分実施可能であることが判明した。  Put 1 μl of I μΛ MBP-NS3; 1 μl of 900 μl 4A18-40 (in DMSO) into an Eppendorf tube, add 9 mM 4A18-40 (in DMSO), add exactly 97.5 μl by adding 50 mM PBS buffer (including 2 mM DTT). 1 Preheat at 25 ° C for 30 minutes. Transfer this mixture to a 96-well plate, place it on a fluorescence spectrophotometer, and add 2.51 of 10 / M fluorescent peptide substrate of formula (1), formula (2) or formula (3) (in DMS0) to perform enzyme reaction. Was performed at 37 ° C. for 60 minutes. During this time, the change in fluorescence intensity was measured over time at an excitation wavelength of 318 nm and a fluorescence wavelength of 395 nm every 10 minutes, and as a result, the fluorescence intensity increased over time. Figure 5 shows the results when using the fluorescent peptide substrate of formula II. In addition, when the final concentration of the enzyme was changed, digestion of the substrate, that is, an increase in fluorescence intensity, was observed in a concentration-dependent manner. In a system that screens a large number of samples, it is desirable that the amount of enzyme used in the assay be small, but the results of this experiment showed that an enzyme amount of 20; / g / ml can be used satisfactorily. did.
(VI I ) NS3プロテアーゼの活性に対する NS4Aの影響  (VI I) Effect of NS4A on NS3 protease activity
96穴黒色プレー卜のゥヱルに 2 i g / 1の MBP- NS3を 1 1、 1. 44mMの 4A18- 40水溶 液を 1 1を入れ、 2mM DTTを含む PBS緩衝液を加えて正確に 199 1とする。 同時に コントロールとして 4A18- 40を含まない酵素のみを添加したゥエルも用意する。 2 5°Cで 5分間放置後、 100 / Mの式①、 式②又は式③の蛍光ペプチド基質 （DMSO中） 1 1を加えて、 酵素反応を 37°Cで約 1 0 0分間実施した。 この間、 蛍光強度の変 化を蛍光プレートリーダー （Floustar、 TECAN社製） を用いて経時的に励起波長 3 20nm、 蛍光波長 405nmでの蛍光強度を測定した。 式②の蛍光ペプチド基質を用いた ときの結果を図 6に示す。  In a 96-well black plate, add 11 of 2 ig / 1 MBP-NS3 and 11 of 1.44 mM 4A18-40 aqueous solution, add PBS buffer containing 2 mM DTT and add exactly 1991. I do. At the same time, prepare a well to which only the enzyme without 4A18-40 was added as a control. 25 After standing at 5 ° C for 5 minutes, 100 / M of the fluorescent peptide substrate of formula (1), (2) or (3) (in DMSO) was added, and the enzyme reaction was carried out at 37 ° C for about 100 minutes. . During this period, the change in the fluorescence intensity was measured over time using a fluorescence plate reader (Floustar, manufactured by TECAN) at an excitation wavelength of 320 nm and a fluorescence wavelength of 405 nm. Figure 6 shows the results when the fluorescent peptide substrate of the formula (2) was used.
図 6に示されるように式②の蛍光べプチド基質は NS4A由来のぺプチド断片存在 下での酵素消化によってのみ充分な蛍光強度を示した。 また、 式①、 式③の蛍光 ぺプチド基質についても同様の結果が得られた。 産業上の利用の可能性 As shown in FIG. 6, the fluorescent peptide substrate of the formula II showed sufficient fluorescence intensity only by enzymatic digestion in the presence of the NS4A-derived peptide fragment. Similar results were obtained for the fluorescent peptide substrates of formulas (2) and (3). Industrial applicability
NS4A由来べプチド存在下において、 本発明の基質を用いて NS3プロテア一ゼの活 性測定を行うことによって、 迅速で、 かつ選択性が高い、 NS3プロテア一ゼの活性 測定を行うことができるようになった。 また、 蛍光を直接観察することで基質の 切断が定量できるので、 HPLCなどの煩雑な操作なしの極めて簡便な測定が可能と なつた。 本発明を利用することによって、 抗 HCV剤として利用可能な NS3プロテア ーゼの阻害剤のスクリーニングが、 容易に行えるようになった。 By measuring the activity of NS3 protease using the substrate of the present invention in the presence of the NS4A-derived peptide, it is possible to measure the activity of NS3 protease quickly and with high selectivity. Became. In addition, since the cleavage of the substrate can be quantified by directly observing the fluorescence, extremely simple measurement without complicated operations such as HPLC has become possible. By using the present invention, screening of an NS3 protease inhibitor that can be used as an anti-HCV agent can be easily performed.
配列表 Sequence listing
(2)配列番号： 1の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 1
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 12  (A) Sequence length: 12
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 1 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 1
Xaa Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Xaa Lys Xaa Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Xaa Lys
1 5 10 配列の特徴  1 5 10 Sequence Features
存在位置： 1  Location: 1
他の特徵： Xaaは単結合又は Lysを意味する。 存在位置： 11  Other features: Xaa means a single bond or Lys. Location: 11
他の特徴： Xaaは単結合又は Tyrを意味する。  Other features: Xaa means a single bond or Tyr.
(2)配列番号： 2の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 2
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 20  (A) Array length: 20
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 2 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 2:
Gly Glu Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ala Leu Gly Glu Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ala Leu
20  20
(2)配列番号： 3の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 3:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 18  (A) Sequence length: 18
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 3 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 3
Glu Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp ThrGlu Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr
1 5 10 151 5 10 15
Gly Ala Gly Ala
(2)配列番号： 4の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 4:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 16  (A) Array length: 16
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 4 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 4:
Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly 1 5 10 15 Ala Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly 1 5 10 15
(2)配列番号： 5の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 5:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 14  (A) Length of array: 14
(B)配列の型： アミノ酸 (D)トポロジー： 直鎖状 (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 5 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 5:
Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 1 5 10 Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 1 5 10
(2)配列番号： 6の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 6:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 13  (A) Length of array: 13
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 6 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 6:
Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 1 5 10 Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 1 5 10
(2)配列番号： Ίの情報： (2) SEQ ID NO: Ί Information:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 14  (A) Length of array: 14
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 7 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 7:
Lys Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr 1 5 10 Lys Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr 1 5 10
(2)配列番号： 8の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 8:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ ： 13 (B)配列の型： アミノ酸 (A) Array length: 13 (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 8 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 8:
Lys Lys Gly Asp Asp He Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 1 5 10 Lys Lys Gly Asp Asp He Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 1 5 10
(2)配列番号： 9の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 9:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 12  (A) Sequence length: 12
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 9 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 9:
Lys Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser 1 5 10 Lys Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser 1 5 10
(2)配列番号： 1 0の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 10:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 11  (A) Length of array: 11
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 1 0 :  (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 10:
Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Lys Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser
1 5 10  1 5 10
(2)配列番号： 1 1の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 11:
(i)配列の特性： (A)配列の長さ： 10 (i) Sequence characteristics: (A) Array length: 10
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号 : 1 1 ：  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 11:
Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Gly Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser
1 5 10  1 5 10
(2)配列番号： 1 2の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 12:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ ： 13  (A) Array length: 13
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 1 2 :  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 12
Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp Lys 1 5 10 Asp Asp lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp Lys 1 5 10
(2)配列番号： 1 3の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 13:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 11  (A) Length of array: 11
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 1 3 :  (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 13
lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp Lys
1 5 10  1 5 10
(2)配列番号： 1 4の情報： (i)配列の特性： (2) Information of SEQ ID NO: 14: (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 9  (A) Sequence length: 9
(B)配列の型： アミノ酸 (D)トポロジー： 直鎖状 (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 14 : Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp 1 5 (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 14: Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys Asp 15
(2)配列番号： 15の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 15:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 9  (A) Sequence length: 9
(B)配列の型： アミノ酸 (D)トポロジー： 直鎖状 (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 15 : lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 1 5 (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 15: lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 15
(2)配列番号： 16の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 16:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 8  (A) Array length: 8
(B)配列の型： アミノ酸 (D)トポロジー： 直鎖状  (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 16 : Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 1 5 (2)配列番号： 17の情報： (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 16: Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 15 (2) Information of SEQ ID NO: 17:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 11  (A) Length of array: 11
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号 : 17 :  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 17:
Lys Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 1 5 10 Lys Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr 1 5 10
(2)配列番号： 18の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 18:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 11  (A) Length of array: 11
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 18 :  (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 18:
Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 1 5 10 Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 1 5 10
(2)配列番号： 19の情報： (2) Information of SEQ ID NO: 19:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 12  (A) Sequence length: 12
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 19 :  (Xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 19:
Lys Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 1 5 10 (2)配列番号： 20の情報： Lys Asp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Lys 1 5 10 (2) Information of SEQ ID NO: 20:
(i)配列の特性：  (i) Sequence characteristics:
(A)配列の長さ： 10  (A) Array length: 10
(B)配列の型： アミノ酸  (B) Sequence type: amino acid
(D)トポロジー： 直鎖状  (D) Topology: linear
(Xi)配列の記載：配列番号： 20 : (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 20:
sp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Lys 1 5 10  sp Lys lie Val Pro Cys Ser Met Ser Lys 1 5 10

Claims

求の範囲 Scope
1 . C型肝炎ウィルス N S 4 Α由来のぺプチド存在下で C型肝炎ウィルス N S 3 プロテア一ゼ活性を測定するための修飾べプチドであり、 分子内の官能基のいず れかに蛍光団及び消光団がそれぞれ共有結合され、 蛍光団と消光団がそれぞれ結 合している残基との間 （結合している残基を含む） に下記アミノ酸配列 （I ) を 有する修飾べプチド。 1. A modified peptide for measuring the activity of hepatitis C virus NS3 protease in the presence of a peptide derived from hepatitis C virus NS4Α. And a modified peptide having the following amino acid sequence (I) between the fluorophore and the residue to which the quencher is bound (including the binding residue), wherein the quencher is covalently bound to the residue.
N末端 X- Asp- Lys- lie- Val- Pro- Cys- Ser-Met- Ser- Y- Lys C末端  N-terminal X- Asp- Lys- lie- Val- Pro- Cys- Ser-Met- Ser- Y- Lys C-terminal
( I )  (I)
(式中の記号は、 Xは単結合又は Lysを、 Yは単結合又は Tyrを意味する。 ） (In the symbols in the formula, X represents a single bond or Lys, and Y represents a single bond or Tyr.)
2 . C型肝炎ウィルス N S 4 A由来べプチド及び請求の範囲 1に記載の修飾ぺプ チドを含む、 C型肝炎ウィルス N S 3プロテア一ゼ活性測定用キット。 2. A kit for measuring hepatitis C virus NS3 protease activity, comprising a hepatitis C virus NS4A-derived peptide and the modified peptide according to claim 1.
3 . C型肝炎ウィルス N S 4 A由来べプチド存在下で、 請求の範囲 1の修飾ぺプ チドの切断を観察することを特徴とする、 C型肝炎ウィルス N S 3プロテアーゼ 活性の測定方法。  3. A method for measuring hepatitis C virus NS3 protease activity, comprising observing cleavage of the modified peptide of claim 1 in the presence of a hepatitis C virus NS4A-derived peptide.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763196A (en) * 1996-01-26 1998-06-09 Boehringer Mannheim Corporation Assays using cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5976857A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5976783A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Bis-maleimido cross-linking agents
US6387686B2 (en) 2000-02-25 2002-05-14 Biofocus Discovery Limited Methods and compositions for identifying a polynucleotide encoding a protease
JP2010502184A (en) * 2006-08-28 2010-01-28 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Method for identifying protease inhibitors

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03172196A (en) * 1989-11-03 1991-07-25 Abbott Lab Fluorescent substrate and detection of proteolytic enzyme using same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03172196A (en) * 1989-11-03 1991-07-25 Abbott Lab Fluorescent substrate and detection of proteolytic enzyme using same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Vol. 210, No. 3, (25.03.95), N. KAKIUCHI et al., "Bacterial Expression and Analysis of Cleavage Activity of HCV Serine Proteinase", p. 1059-1065. *
JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 68, No. 11, (1994), Y. KOMADA et al., "Substrate Requirements of Hepatitis C Virus Serine Proteinase for Intermolecular Polypeptide Cleavage in Escherichia Coli", p. 7351-7357. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763196A (en) * 1996-01-26 1998-06-09 Boehringer Mannheim Corporation Assays using cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5976857A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5976783A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Bis-maleimido cross-linking agents
US6387686B2 (en) 2000-02-25 2002-05-14 Biofocus Discovery Limited Methods and compositions for identifying a polynucleotide encoding a protease
JP2010502184A (en) * 2006-08-28 2010-01-28 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Method for identifying protease inhibitors

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