KR100345830B1 - Method for assaying hepatitis C virus NS3 protease and inhibitor thereof by using fluorescence resonance energy transfer - Google Patents

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 이의 저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한 신규 형광 공명 에너지 전이 (이하 'FRET'라 약칭함) 기질; 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 비구조 단백질 3에 대한 저해화합물의 저해 활성을 측정하는 방법; 및 상기 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성저해제를 탐색·선별하는 방법에 관한 것이며, 본 발명에 의한 FRET 기질을 사용하여 종래에 비해 보다 정확하고 효율적으로 상기 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 이의 저해 화합물의 저해 활성을 측정할 수 있고 또한 본 발명에 의한 상기 방법은 궁극적으로 C형 간염 바이러스 치료제를 개발하는데 이용될 수 있다.The present invention relates to an enzyme activity of a non-structural protein 3 of hepatitis C virus and a method for measuring the inhibitory activity of the inhibitory compound. More specifically, the present invention relates to a novel fluorescent resonance energy Transition (hereinafter abbreviated as " FRET ")substrate; A method of measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 of the hepatitis C virus and the inhibitory activity of the inhibitory compound against the non-structural protein 3 using the FRET substrate; And a method for screening and screening an activity inhibitor of hepatitis C virus nonstructural protein 3 using the above method, and more particularly, to a method for screening and screening an activity inhibitor of hepatitis C virus non-structural protein 3 using the FRET substrate according to the present invention, The enzyme activity and the inhibitory activity of the inhibitory compound thereof can be measured, and the method according to the present invention can ultimately be used to develop a therapeutic agent for hepatitis C virus.

Description

형광 공명 에너지 전이를 이용한 Ｃ형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 이의 저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법{Method for assaying hepatitis C virus NS3 protease and inhibitor thereof by using fluorescence resonance energy transfer}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a method for assaying the inhibitory activity of hepatitis C virus NS3 protease by using fluorescence resonance energy transfer,

본 발명은 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 이의 저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한 신규 FRET 기질; 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 비구조 단백질 3에 대한 저해화합물의 저해 활성을 측정하는 방법; 및 상기 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성저해제를 탐색·선별하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an enzyme activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus and a method of measuring the inhibitory activity of the inhibitory compound, and more particularly, to a novel FRET substrate for evaluating the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus; A method of measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 of the hepatitis C virus and the inhibitory activity of the inhibitory compound against the non-structural protein 3 using the FRET substrate; And a method for screening and screening an activity inhibitor of hepatitis C virus non-structural protein 3 using the above method.

C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV)는 비A형 (non-A), 비B형 (non-B) 간염으로 알려진 간염의 주요 원인 바이러스로서, 급성간염 이외에도 간경화, 간암 등 심각한 질병을 일으킨다 (Alter. H. J.et al.,N. Eng. J. Med. 1989, 321: 1494-1500). C형 간염 바이러스의 감염율은 현재 전 세계 인구의 1%에 이르는 것으로 보고되었다 (Purcell,FEMS Microbial. Rev,1994, 14: 181-192; van der Poel,Hepatitis C Virus: Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, H. W. Reesink ed.1994, pp.137-193). 더욱이 C형 간염 바이러스에 감염되는 환자는 매년 약 백만명씩 증가하는 것으로 추정되며 (Alter. H. J., A. J. Zuckerman ed,Viral Hepatitis and Liver Disease,1988, pp. 537-542), 이 중 약 40∼50%는 만성 간염으로 진전되고 약 20% 정도는 간경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다 (Dienstag, J. L.,Semin.Liver. Dis.,1986, 6 : 67-81).Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of hepatitis, known as non-A and non-B hepatitis. It causes serious diseases such as liver cirrhosis and liver cancer in addition to acute hepatitis (Alter, HJ et al ., N. Eng. J. Med., 1989 , 321: 1494-1500). Hepatitis C virus infection rates are now reported to reach 1% of the world's population (Purcell, FEMS Microbial. Rev , 1994 , 14: 181-192; van der Poel, Hepatitis C Virus: Current Studies in Hematology and Blood Transfusion , HW Reesink ed., 1994 , pp. 137-193). Furthermore, the number of patients infected with the hepatitis C virus is estimated to increase by approximately 1 million per year (Alter, HJ, AJ Zuckerman ed, Viral Hepatitis and Liver Disease , 1988 , pp. 537-542) (Dienstag, JL, Semin.Liver. Dis. , 1986 , 6: 67-81) have been shown to progress to chronic hepatitis and about 20% to cirrhosis and liver cancer.

한편 C형 간염 바이러스의 감염에 대한 치료방법으로는 인터페론-알파 (interferon-α) 투여법이 거의 유일한데, 약 20%의 환자에게서만 효과를 나타내어 그 응용 범위가 좁다 (Hoofnagal. J. H.And. Intern. Med.1994, 39: 241-275).또한 인터페론-알파 투여법은 C형 간염 바이러스-1b형에 대해서는 효과가 가장 낮은데, C형 간염 바이러스-1b형은 세계적으로 가장 많이 발견되고 있으며 특히, 아시아, 아메리카, 유럽 지역에서 주된 유형으로서 간경화, 간암으로의 진전율이 높은 특징이 있다 (van Doorn. L. J.,review. J. Med. Virol.1994, 43: 345-356). 더욱이 최근에는 인터페론-내성 서열 (Interferon resistance sequence)을 갖는 HCV에 대해서는 상기 인터페론-알파 투여법이 효과가 없는 것으로 보고되었다. 이와 같이 C형 간염 바이러스의 만성적 감염에 대한 효과적이고 보편적인 치료방법은 아직 개발되어 있지 않은 실정으로, C형 간염 바이러스 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.Interferon-α administration is almost the only treatment method for hepatitis C virus infection, but its application is limited to about 20% of patients and its application range is narrow (Hoofnagal. JH And. Intern. . med 1994, 39:. 241-275 ) in addition, interferon-alpha administered is an effective method for hepatitis C virus type -1b best bit lower, hepatitis C virus -1b type is most often found around the world, especially Asia , The major type in the Americas and Europe is characterized by high rates of cirrhosis and liver cancer (van Doorn, LJ, review , J. Med. Virol ., 1994 , 43: 345-356). Furthermore, recently, it has been reported that the interferon-alpha administration method is not effective for HCV having an interferon resistance sequence. As such, an effective and universal treatment method for chronic infection of hepatitis C virus has not yet been developed, and development of a therapeutic agent for hepatitis C virus is urgently required.

C형 간염 바이러스는 비A형, 비B형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 접종하여 분리·회수할 수 있음이 보고되었다 (Bradley, D. W.et al.,Gastroenterology,1988, 88: 773-779). C형 간염 바이러스는 양성가닥 리보핵산 9400 염기로 이루어진 다단백질 (polyprotein)의 구조를 갖고 있으며, 3010∼3033개의 아미노산을 가지는 다단백질을 만들어 낸다 (Choo, Q. L.et al.,Science,1989, 244 : 359-362; Choo. Q. L.et al.,PNAS,1991, 88: 2451-2455). C형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비바이러스 (flaviviruses), 페스티바이러스 (pestiviruses)와 유사하기 때문에, C형 간염 바이러스는 플라비바이리대 (Flaviviridae)의 새로운 속 (genus)으로 분류되었다 (van Doorn,review. J. Med. Virol.,1994, 43: 345-356).Hepatitis C virus can be isolated and recovered by inoculating chimpanzees with plasma from non-A and non-B hepatitis patients (Bradley, DW et al ., Gastroenterology , 1988 , 88: 773-779). Hepatitis C virus has a structure of polyprotein consisting of 9,400 bases of positive strand ribonucleic acid and produces a multi-protein having 3010 to 3033 amino acids (Choo, QL et al ., Science , 1989 , 244: 359-362; Choo. QL et al. , PNAS , 1991 , 88: 2451-2455). Since the genetic structure of the hepatitis C virus is similar to that of flaviviruses and pestiviruses, the hepatitis C virus has been classified as a new genus of Flaviviridae (van Doorn, review, J. Med. Virol. , 1994 , 43: 345-356).

상기와 같은 다단백질 상에서 바이러스 구조 단백질은 아미노 말단에 존재하고 그 카복시 말단 쪽으로 C형 간염 바이러스의 증식에 필수적인 비구조 단백질들이 위치하고 있다 (도 1참조). 세포 내 신호 펩티드 분해효소 (signal peptidase)와 비구조 단백질 2-3, 비구조 단백질 3의 두 바이러스 단백질 분해 효소가 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단하여 전구체 다단백질로부터 9개의 숙성된 바이러스 단백질들을 만들어 낸다 (도 1참조). 특히 비구조 단백질 3 (또는 비구조 단백질 3 분해효소)은 하기표 1에 나타낸 바와 같이 비구조 단백질 3/4A. 4A/4B, 4B/5A, 5A/5B 4개의 절단 부위를 절단하며 (각각서열번호 1,서열번호 2,서열번호 3및서열번호 4참조), NS4A와 결합된 비구조 단백질 3/4A는 향상된 분해효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Hijikataet al.,PNAS,1991, 88: 5547-5551; Bartenschlargeret al.,J. Virol.,1994, 68: 5045-5055; Grakouiet al.,J. Virol.,1993, 67: 1385-95; Tomeiet al.,J. Virol.,1993, 67: 4017-4026).On the above polyprotein, the viral structural proteins are present at the amino terminus and non-structural proteins essential for the proliferation of hepatitis C virus toward the carboxy terminus are located (see FIG. 1 ). Two viral proteases, intracellular signal peptidases, non-structural proteins 2-3 and non-structural proteins 3, cleave specific regions of the precursor polyprotein to form nine aged viral proteins from the precursor polyprotein (See Fig. 1 ). In particular, the non-structural protein 3 (or non-structural protein 3 lyase) are non-structural protein 3 / 4A as shown in the following Table 1. 4A / 4B, 4B / 5A and 5A / 5B ( SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 , respectively) (Hijikata et al ., PNAS , 1991 , 88: 5547-5551; Bartenschlarger et al ., J. Virol. , 1994 , 68: 5045-5055; Grakoui et al ., J. Virol. , 1993 , 67: 1385-95; Tomei et al. , J. Virol ., 1993 , 67: 4017-4026).

C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3에 의한 절단 부위Cleavage site by hepatitis C virus non-structural protein 3 절단부위Cutting site 절단부위의 서열 (20mer)The sequence at the cleavage site (20 mer) NS3/NS4ANS3 / NS4A CMSADLEVVT/STWVLVGGVLCMSADLEVVT / STWVLVGGVL NS4A/NS4BNS4A / NS4B YREFDEMEEC/ASHLPYIEQGYREFDEMEEC / ASHLPYIEQG NS4B/NS5ANS4B / NS5A WINEDCSTPC/SGSWLRDVWDWINEDCSTPC / SGSWLRDVWD NS5A/NS5BNS5A / NS5B EEASEDVVPC/SMSYSWTGALEEASEDVVPC / SMSYSWTGAL

C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3은 세린계 단백질 분해효소, NTP 분해효소 (NTPase), RNA 헬리카제 (helicase)의 아미노산 모티프를 가지고 있다. 구체적으로 비구조 단백질 3의 카복시 말단은 헬리카제로서의 기능을 가지고 있고 아미노 말단은 단백질 분해효소로서의 기능을 가지고 있는 것으로 알려졌다 (Kimet al.,BBRC,1995, 215: 160-165; Hanet al.,J. Gen. Virol. 1995, 76: 985-993). 이러한 구조의 비구조 단백질 3은 상기에서 언급한 바와 같이 전구체 다단백질을 절단하여 숙성된 비구조 단백질 3, 4A, 4B, 5A, 5B를 생성하는 역할을 하므로, 새로운 치료법의 중요한 대상이 되고 있다 (Kim, J. L.et al.,Cell,1996, 87: 343-355). 즉, C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 단백질 분해 활성을 저해하는 물질을 찾아냄으로써 새로운 C형 간염 바이러스 치료제를 개발할 수 있다. 이를 위해서는 먼저 비구조 단백질 3 분해효소의 활성을 저해하는 화합물의 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 방법이 개발되어야 한다.The non-structural protein 3 of hepatitis C virus has amino acid motifs of serine protease, NTPase, and helicase. Specifically, the carboxy terminus of the non-structural protein 3 has a function as a helicase and the amino terminus has a function as a protease (Kim et al. , BBRC , 1995 , 215: 160-165; Han et al. , J. Gen. Virol., 1995 , 76: 985-993). As described above, the non-structural protein 3 having such a structure is an important target of a new treatment method because it cleaves the precursor polyprotein to produce aged non-structural proteins 3, 4A, 4B, 5A and 5B Kim, JL et al. , Cell , 1996 , 87: 343-355). That is, a novel hepatitis C virus therapeutic agent can be developed by finding a substance that inhibits the proteolytic activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus. For this purpose, a method for efficiently evaluating the activity of a compound inhibiting the activity of non-structural protein 3 degrading enzyme should be developed.

현재 NS3의 생화학적 특징을 분석하고 이 단백질 분해효소의 저해제를 탐색하기 위해 사용되고 있는 합성 펩티드 기질은 자연적인 절단 위치를 가지고 있는 것이다. 일반적으로 이러한 합성 펩티드 기질은 단백질 분해효소에 의해 절단된 후 생성된 산물을 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)로 측정한다 (C. Steinkuhler,et al.,J. Virol.70 (1996) 6694-6700; J. A. Landro,et al.,Biochemistry36 (1997) 9340-9348). 그러나 이들 펩티드는 적어도 10% 이상이 가수분해 되어야만 반응 산물을 쉽게 검출해 낼 수 있는 단점이 있다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위하여 특별한 작용기를 갖는 합성 기질이 개발되었는데, 기질이 가수분해된 양에 따라 반응 진행도를 직접적이고 연속적으로 감지할 수 있어 따로 산물을 분리해 낼 필요가 없다. 구체적으로 이러한 합성 기질은 분자 내에 형광 제공자 (fluorescence donor)인 EDANS [5-[(2'-aminoethyl)amino] naphthalenesulfonic acid]와 형광 수용자 (fluorescence acceptor)인 DABCYL [4-[[4'-(dimethylamino)phenyl]azo]benzoic acid]을 가지고 있다. 이 기질에서는 분자 내 형광 제공자와 형광 수용자 사이에서 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, 이하 'FRET'라 약칭함)가 일어나므로 형광이 일어나지 않는다. 그러나 효소가 기질을 절단하여 산물이 생성되면, 형광 제공자의 형광이 분명히 나타나게 된다. 따라서 절단된 기질의 양에 비례하여 형광의 세기가 증가하므로, 이로부터 효소-기질간 반응에 관한 반응동력학적 정보를 얻을 수 있다.Currently, synthetic peptide substrates that are used to analyze the biochemical characteristics of NS3 and to search for inhibitors of this protease have natural cleavage sites. Generally, these synthetic peptide substrates are cleaved by proteolytic enzymes and the resulting products are measured by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (C. Steinkuhler, et al ., J. Virol. 70 ( 1996 ) 6694-6700; JA Landro, et al ., Biochemistry 36 ( 1997 ) 9340-9348). However, these peptides are disadvantageous in that the reaction products can be easily detected only when at least 10% of the peptides are hydrolyzed. In order to solve this problem, a synthetic substrate having a specific functional group has been developed. Since the reaction progress can be directly and continuously detected according to the amount of the substrate hydrolyzed, it is not necessary to separate the product separately. Specifically, these synthesized substrates contain EDANS [5 - [(2'-aminoethyl) amino] naphthalenesulfonic acid] and fluorescein acceptor DABCYL [4 - [[4 '- (dimethylamino ) phenyl] azo] benzoic acid. Fluorescence does not occur in this substrate because fluorescence resonance energy transfer (abbreviated as FRET) occurs between an intramolecular fluorescence provider and a fluorescent acceptor. However, when the enzyme cleaves the substrate and produces a product, the fluorescence of the fluorescent donor is apparent. Therefore, the intensity of fluorescence increases in proportion to the amount of the cleaved substrate, from which kinetic information about the enzyme-substrate reaction can be obtained.

종래 P1잔기 (Abu)와 P1' 잔기 (L-(+)-lactic acid) 사이에 에스테르 결합을 가진 FRET 기질이 보고된 바 있다 (Taliani, M.et al.,Anal. Biochem.,1996, 240: 60-67). 이 경우 P1과 P1' 사이에 에스테르 결합을 도입하여 효소의 공격에 의하여 이탈기 (leaving group)가 쉽게 빠져나갈 수 있어서 상대적으로 빠르게 아실-효소 중간체 (acyl-enzyme intermediate)를 형성하는 장점이 있으나, 에스테르 결합이 불안정하여 완충용액 상에서도 자발적 가수분해 반응 (spontaneous hydrolysis reaction)이 일어나 정확한 속도상수를 구하는데 단점을 가지고 있다. 특히 염기성 완충용액에서 문제가 되고 있다. 또한 이 경우에 기질에 의한 형광 간섭 효과 (fluorescence quenching effect)가 심각하게 나타나는 현상이 있어서 일정 농도 이상의 기질을 사용할 수 없는 단점을 포함하고 있다.Previously, FRET substrates with ester linkages between the P 1 residue (Abu) and the P 1 'residue (L - (+) - lactic acid) have been reported (Taliani, M. et al ., Anal. Biochem. , 1996 , 240: 60-67). In this case, an ester bond is introduced between P 1 and P 1 ', and the leaving group can easily escape due to the attack of the enzyme, so that an acyl-enzyme intermediate is formed relatively quickly However, since the ester bond is unstable, a spontaneous hydrolysis reaction occurs in the buffer solution, which has a disadvantage in obtaining an accurate rate constant. Especially in basic buffer solutions. Also, in this case, the fluorescence quenching effect due to the substrate is seriously observed, so that the substrate having a certain concentration or more can not be used.

이에 본 발명자들은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 효소 활성을 측정하고 이 단백질 분해효소에 대한 저해 화합물의 활성을 평가할 수 있는 보다 효율적인 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 새로운 FRET 기질을 합성하고 이 FRET 기질을 비구조 단백질 3과의 반응에 사용하는 경우 우수한 반응속도론적 상수를 얻을 수 있어, 궁극적으로는 상기 비구조 단백질 3의 저해제 및 C형 간염 바이러스의 치료제를 탐색·개발하는데 유용하게 이용될 수 있다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.As a result of efforts to develop a more efficient method for evaluating the activity of inhibitory compounds against hepatitis C virus non-structural protein 3 and evaluating the activity of inhibitory compounds against this protease, the present inventors synthesized a new FRET substrate, When the substrate is used for the reaction with the non-structural protein 3, excellent kinetic constants can be obtained, and ultimately, it can be usefully used for the search and development of an inhibitor of the non-structural protein 3 and a therapeutic agent for hepatitis C virus The present invention has been completed.

본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한 신규 FRET 기질을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel FRET substrate for the evaluation of the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus.

또한 본 발명의 목적은 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 비구조 단백질 3에 대한 저해화합물의 저해 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 of hepatitis C virus and the inhibitory activity of the inhibitory compound against non-structural protein 3 using the FRET substrate.

또한 본 발명의 목적은 상기 비구조 단백질 3에 대한 저해화합물의 저해 활성을 측정하는 방법을 이용하여, C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성저해제를 탐색·선별하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening and screening an activity inhibitor of hepatitis C virus non-structural protein 3 using a method for measuring the inhibitory activity of the inhibitory compound against the non-structural protein 3.

도 1은 C형 간염 바이러스 다단백질의 구조와 비구조 단백질 3에 의한 절단부위를 나타낸 것이고, 1 shows the structure of the hepatitis C virus multi-protein and the site of cleavage by the non-structural protein 3,

도 2는 본 발명에 의한 형광 공명 에너지 전이 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기질 (DABCYL)-EDVVPC(S-Me)SMSE(-EDANS)-CO2H의 농도에 따른 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성 변화를 나타낸 딕슨 플랏 (Dixon plot)이다. 2 is a graph showing changes in the activity of protease 4A-NS3 according to the concentration of fluorescence resonance energy transfer (DABCYL) -EDVVPC (S-Me) SMSE (-EDANS) -CO 2 H according to the present invention. Is a Dixon plot.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한 신규 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기질을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a new FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) substrate for evaluating the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus.

구체적으로 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 FRET 기질 [DABCYL-DEMEECASHD(-EDANS)-CO2H]을 제공한다.Specifically, the present invention provides a novel FRET substrate (DABCYL-DEMEECASHD (-EDANS) -CO 2 H] represented by the following formula (1).

또한 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 신규 FRET 기질 [DABCYL-EDVVPCSMSE(-EDANS)-CO2H]을 제공한다.The present invention also provides a novel FRET substrate (DABCYL-EDVVPCSMSE (-EDANS) -CO 2 H] represented by the following formula (2).

또한 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 신규 FRET 기질 [DABCYL-DEMEEAbuASHD(-EDANS)-CO2H]을 제공한다. 이 때 Abu는 2-아미노부틸산 (2-aminobutyric acid)를 의미한다.The present invention also provides a novel FRET substrate (DABCYL-DEMEEAbuASHD (-EDANS) -CO 2 H) represented by the following formula (3). At this time, Abu means 2-aminobutyric acid.

또한 본 발명은 하기 화학식 4로 표시되는 신규 FRET 기질 [DABCYL-EDVVPC(S-Me)SMSE(-EDANS)-CO2H]을 제공한다.The present invention also provides a novel FRET substrate [DABCYL-EDVVPC (S-Me) SMSE (-EDANS) -CO 2 H]

본 발명은 또한 상기 FRET 기질을 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3과 반응시키고 형광을 측정하여 상기 비구조 단백질 3의 효소 활성을 측정하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 by reacting the FRET substrate with the non-structural protein 3 of hepatitis C virus and measuring fluorescence.

또한 본 발명은 상기 FRET 기질을 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3 및 이의 활성저해 화합물과 반응시키고 형광을 측정하여 상기 활성저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for measuring the inhibitory activity of the above-mentioned active inhibitory compound by reacting the FRET substrate with non-structural protein 3 of hepatitis C virus and its activity inhibitor compound and measuring fluorescence.

또한 본 발명은 상기 활성저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법을 사용하여 상기 바이러스 비구조 단백질 3의 활성저해제를 탐색·선별하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening and screening for an activity inhibitor of the non-viral structural protein 3 using a method for measuring the inhibitory activity of the active inhibitory compound.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 의한 상기 FRET 기질, 즉 형광 기질은 10개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 4A/4B 또는 5A/5B 펩타이드의 아미노 말단에 발색체 (chromophore)인 DABCYL기 [4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoyl]를 갖고 있고, 카르복시 말단의 곁가지에 형광기인 EDANS기 [5-(2-aminoethylamino)-1-naphthalenesulfonic acid]를 갖고 있다. 단백질 분해효소에 의해 기질이 분해되면 형광 공명 에너지 전이 효과 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)가 중단되고 이로 인해 형광 현상이 증가하므로, 형광 분광기로 형광의 변화를 측정하여 단백질 분해효소에 의한 기질의 분해 속도를 구할 수 있다.The FRET substrate according to the present invention, that is, the fluorescent substrate is composed of 10 amino acids, and the DABCYL group [4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoyl], which is a chromophore at the amino terminal of 4A / 4B or 5A / 5B peptide, And has EDANS group [5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid] which is a fluorescent group in the side chain of the carboxy terminal. When the substrate is decomposed by the proteolytic enzyme, the fluorescence resonance energy transfer is stopped and the fluorescence phenomenon is increased. Therefore, the change of the fluorescence by the fluorescence spectrometer is measured and the decomposition rate of the substrate by the protease Can be obtained.

본 발명에서 사용한 단백질 분해효소 4A-NS3는 대한민국 특허 출원번호 제97-59161호에 기술된 바와 같이, NS3의 아미노 말단에 4A 펩타이드를 공유결합으로 배치시켜 NS3와 4A가 분자내 결합으로 쉽게 복합체 (Complex)를 이루도록 제작된 변형체 효소이다. 이 효소는 비구조 단백질 4A가 비구조 단백질 3의 아미노 말단과 더욱 인접하게 존재하므로 그 활성이 증대되어 C형 간염 바이러스의 증식 억제제 또는 치료제를 탐색·선별하는데 유용하게 사용될 수 있다.The proteolytic enzyme 4A-NS3 used in the present invention was prepared by arranging a 4A peptide covalently at the amino terminal of NS3, as described in Korean Patent Application No. 97-59161, whereby NS3 and 4A were easily conjugated to each other Complex). Since the non-structural protein 4A is more adjacent to the amino terminal of the non-structural protein 3, the activity of the non-structural protein 4A is increased, and thus the enzyme can be usefully used to search for and select a growth inhibitor or therapeutic agent for hepatitis C virus.

또한 본 발명에서는 상기 FRET 기질의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preparing the FRET substrate.

구체적으로 본 발명에 의한 FRET 기질의 제조방법은Specifically, the method for producing a FRET substrate according to the present invention comprises

1) Fmoc-(acid)-OtBu를 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산 [5-(2-aminoethylamino)-1-naphthalenesulfonic acid]과 반응시켜 펩티드 커플링 (peptide coupling)에 의해 EDANS기를 붙이는 단계;1) Fmoc- (acid) -OtBu is reacted with 5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid [5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid] Attaching an EDANS group;

2) 고체상 합성법 (solid phase systhesis)으로 펩티드 합성기 (peptide synthesizer)를 사용하여 Fmoc 커플링 (Fmoc Coupling)에 의해 10-mer 펩티드를 합성하는 단계;2) synthesizing a 10-mer peptide by Fmoc coupling using a peptide synthesizer as a solid phase systhesis;

3) 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산 [4-(4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid]과 반응시켜 아미노 말단에 DABCYL기를 펩티드 커플링으로 붙이는 단계; 및3) reacting 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid [4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid] to attach a DABCYL group to the amino terminus by peptide coupling; And

4) 각각의 작용기를 보호하고 있는 보호기 (protection group)를 제거하는 단계로 이루어진다.4) removing the protection group protecting each functional group.

상기와 같이 제조된 FRET 펩티드 기질은 통상의 정제방법, 예를 들어 HPLC로 분리하여 정제할 수 있다.The FRET peptide substrate prepared as described above can be purified by a conventional purification method, for example, HPLC.

본 발명에서는 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스 비구조 단백질3의 활성을 측정한다. 구체적으로 상기 FRET 기질을 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3과 반응시키고 형광을 측정한다. 상기 비구조 단백질 3과 반응시키기 전후 시간에 따른 형광 세기의 변화로부터 기질-효소 간 반응동력학적 상수들을 얻을 수 있다. 그 결과, 종래의 펩티드 기질에 비하여 Km값이 약 16∼120배 감소하고, kcat값이 약 0.35∼10배, kcat/Km값이 약 8∼1200배 증가하였다 (C. Steinkuhler,et al.,J. Virol.70 (1996) 6694-6700; J. A. Landro,et al.,Biochemistry36 (1997) 9340-9348). Km값은 작을수록, kcat값은 클수록 효소-기질 간 반응속도가 빠르다는 것을 의미하며, 특히 kcat/Km값이 클수록 낮은 농도의 기질에서도 효소에 의한 분해반응이 빠르다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명에 의한 FRET 기질을 사용함으로써 상기 비구조 단백질 3의 생화학적 특성, 즉 비구조 단백질 3의 단백질 분해 활성을 보다 빠르고 정확하게, 또한 저농도의 기질에 대해서도 안정적이고 효율적으로 측정할 수 있다.In the present invention, the activity of hepatitis C virus non-structural protein 3 is measured using the FRET substrate. Specifically, the FRET substrate is reacted with hepatitis C virus non-structural protein 3 and fluorescence is measured. Substrate-enzyme kinetic constants can be obtained from changes in fluorescence intensity with time before and after the reaction with the non-structural protein 3. As a result, the K m value decreased about 16 to 120 times, the k cat value was about 0.35 to 10 times, and the k cat / K m value was about 8 to 1200 times that of the conventional peptide substrate (C. Steinkuhler, et al ., J. Virol. 70 ( 1996 ) 6694-6700; JA Landro, et al ., Biochemistry 36 ( 1997 ) 9340-9348). The smaller the K m value, the larger the k cat value means that the enzyme-substrate reaction rate is faster, and the larger the k cat / K m value, the faster the enzymatic degradation reaction is at lower concentrations . Therefore, by using the FRET substrate according to the present invention, the biochemical characteristics of the non-structural protein 3, that is, the proteolytic activity of the non-structural protein 3 can be measured more quickly and accurately and stably and efficiently even at a low concentration of the substrate.

또한 본 발명에서는 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3에 대한 활성저해 화합물의 저해활성을 측정하는 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for measuring the inhibitory activity of an activity inhibitor compound against hepatitis C virus non-structural protein 3 using the FRET substrate.

구체적으로 상기 FRET 기질을 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3 및 이의 저해 화합물과 함께 반응시키고 형광을 측정한다. 반응 전후 시간에 따른 형광 세기의 변화를 측정하고, 이것을 저해 화합물을 첨가하지 않은 기질-효소간 반응에서 얻은 결과와 비교하여 상기 저해 화합물이 상기 비구조 단백질 3의 효소 활성을 저해하는 정도를 알아낼 수 있다. 본 발명에 의한 상기 FRET 기질은 저농도에서도 비구조 단백질 3의 활성을 효율적이고 정확하게 측정할 수 있으므로, 비구조 단백질 3에 대한 저해 화합물의 저해활성 또한 보다 정확하고 효율적으로 측정할 수 있다.Specifically, the FRET substrate is reacted with non-structural protein 3 of hepatitis C virus and its inhibitory compound, and fluorescence is measured. The change in fluorescence intensity according to the time before and after the reaction was measured and compared with the result obtained in the substrate-enzyme reaction without addition of the inhibitor compound, the degree of inhibition of the enzyme activity of the non- have. Since the FRET substrate according to the present invention can efficiently and accurately measure the activity of the nonstructural protein 3 even at a low concentration, the inhibitory activity of the inhibitory compound against the nonstructural protein 3 can be measured more accurately and efficiently.

따라서 본 발명에서는 상기 FRET 기질을 사용하여 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 효소 활성 및 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법을 제공한다.Thus, the present invention provides a method for measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 of hepatitis C virus and the inhibitory activity of the activity inhibitor of the hepatitis C virus non-structural protein 3 using the FRET substrate.

또한 본 발명은 상기 방법을 이용하여, C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3에 대한 활성저해제를 탐색·선별하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening and screening an activity inhibitor against hepatitis C virus non-structural protein 3 using the above method.

본 발명에 의한 상기 FRET 기질을 사용하는 상기 방법은, 궁극적으로는 C형 간염 바이러스의 증식 억제제 및 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.The above method using the FRET substrate according to the present invention can ultimately be usefully used to develop a proliferation inhibitor and therapeutic agent for hepatitis C virus.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples illustrate the present invention and the contents of the present invention are not limited by the examples.

<실시예 1> FRET 기질의 합성 1: DABCYL-DEMEECASHD(-EDANS)-COExample 1 Synthesis of FRET Substrate 1: DABCYL-DEMEECASHD (-EDANS) -CO 22 HH

Fmoc-Asp-OtBu (Novabiochem사,La Jolla, CA 92039, 미국) 2.06g을 DMF(dimethyl formamide) 30ml에 녹이고, HOBT (1-hydroxy benzotriazole) 0.68g과 N,N'-diisopropylcarbodiimide 1.03g을 첨가하여 상온에서 20분간 교반한 후, DIEA (diisopropylethylamine) 1.29g과 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 1.57g을 가한 후 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 감압하에서 DMF를 제거하고 메틸렌클로라이드 30ml와 Trifluoroacetic acid 30ml에 녹여 상온에서 2시간 동안 교반한 후 30ml 메탄올을 첨가하여 생성물을 결정화시킨 후, 필터하고 디에틸에테르로 씻어낸 후 무색의 고체 2.39g을 얻었다.2.06 g of Fmoc-Asp-OtBu (Novabiochem, La Jolla, CA 92039, USA) was dissolved in 30 ml of DMF, and 0.68 g of HOBT (1-hydroxy benzotriazole) and 1.03 g of N, N'-diisopropylcarbodiimide After stirring for 20 minutes at room temperature, 1.29 g of DIEA (diisopropylethylamine) and 1.57 g of 5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA) Lt; / RTI &gt; DMF was removed under reduced pressure and dissolved in 30 ml of methylene chloride and 30 ml of trifluoroacetic acid. After stirring at room temperature for 2 hours, 30 ml of methanol was added to crystallize the product, which was then filtered and washed with diethyl ether to obtain 2.39 g of a colorless solid .

상기에서 얻어진 생성물과 Fmoc 펩티드 Reagents (Advanced ChemTech사, Louisville, KY 40228, 미국)를 사용하여 펩티드 합성기 (431A Peptide synthesizer; Applied Biosystems)로 1mM 스케일로 DABCYL-DEMEECASHD-EDANS를 합성하기 위하여 10-머 펩티드가 레진에 붙어있는 상태인H2N-D(OtBu)-E(OtBu)-M-E(OtBu)-E(OtBu)-C(Trt)-A-S(tBu)-H(Trt)-D(OtBu)(-EDANS)-Rinkamide resin을 얻었다.To synthesize DABCYL-DEMEECASHD-EDANS on a 1 mM scale with a peptide synthesizer (431A Peptide synthesizer; Applied Biosystems) using the product obtained above and Fmoc peptide Reagents (Advanced ChemTech, Louisville, KY 40228, USA), 10- (OtBu) -E (OtBu) -E (OtBu) -C (Trt) -AS (tBu) -H (Trt) EDANS) -inkamide resin.

상기에서 얻어진 생성물을 DMF 50ml에 녹이고 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 9.50g, diisopropylethylamine 12.9g, HOBT 4.73g, HBTU (O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 13.3g을 가한 후, 상온에서 15시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄과 메탄올로 차례로 씻어냈다.The resulting product was dissolved in 50 ml of DMF and 9.50 g of 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA), 12.9 g of diisopropylethylamine, 4.73 g of HOBT, 1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) was added thereto. The mixture was stirred at room temperature for 15 hours, and washed successively with dichloromethane and methanol.

상기에서 얻어진 생성물을 30ml 혼합용매 (trifluoroacetic acid: TIS:water = 9.25: 0.25: 0.5)에 녹여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 용매를 제거하고 에틸에테르를 가하여 결정으로 석출시켰다.The product obtained above was dissolved in 30 ml of trifluoroacetic acid (TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5) and allowed to react at room temperature for 2 hours. The solvent was removed and ethyl ether was added to precipitate crystals.

상기에서 얻은 최종 산물은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 역상 HPLC (Waters, Delta Prep 4000, 사용용매 물/아세토나이트릴)로 분리하였고, 최종 산물 DABCYL-DEMEECASHD(-EDANS)-CO2H에 대한 FAB-MS 데이터를 얻어 합성을 확인하였다 (계산된 분자량 1598, 측정된 분자량 MH+ 1599).The final product thus obtained was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), separated by reverse phase HPLC (Waters, Delta Prep 4000, solvent / acetonitrile used), and the final product, DABCYL-DEMEECASHD (-EDANS) -CO2H, Data were obtained and the synthesis was confirmed (calculated molecular weight 1598, measured molecular weight MH + 1599).

<실시예 2> FRET 기질의 합성 2: DABCYL-EDVVPCSMSE(-EDANS)-COExample 2: Synthesis of FRET substrate 2: DABCYL-EDVVPCSMSE (-EDANS) -CO 22 HH

Fmoc-Glu-OtBu (Novabiochem사,La Jolla, CA 92039, 미국) 1.49g을 DMF (dimethyl formamide) 30ml에 녹이고, HOBT (1-hydroxy benzotriazole) 0.68g과 N,N'-diisopropylcarbodiimide 1.03g을 첨가하여 상온에서 20분간 교반한 후, DIEA (diisopropylethylamine) 1.29g과 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 1.57g을 가한 후 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 감압하에서 DMF를 제거하고 메틸렌클로라이드 30ml와 Trifluoroacetic acid 30ml에 녹여 상온에서 2시간 동안 교반한 후 30ml 메탄올을 첨가하여 생성물을 결정화시킨 후, 필터하고 디에틸에테르로 씻어낸 후 무색의 고체 2.42g을 얻었다.1.49 g of Fmoc-Glu-OtBu (Novabiochem, La Jolla, CA 92039, USA) was dissolved in 30 ml of DMF and 0.68 g of HOBT (1-hydroxy benzotriazole) and 1.03 g of N, N'-diisopropylcarbodiimide After stirring for 20 minutes at room temperature, 1.29 g of DIEA (diisopropylethylamine) and 1.57 g of 5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA) Lt; / RTI &gt; DMF was removed under reduced pressure and dissolved in 30 ml of methylene chloride and 30 ml of trifluoroacetic acid. After stirring at room temperature for 2 hours, 30 ml of methanol was added to crystallize the product, which was then filtered and washed with diethyl ether to obtain 2.42 g of a colorless solid .

상기에서 얻어진 생성물과 Fmoc 펩티드 Reagents (Advanced ChemTech사, Louisville, KY 40228, 미국)를 사용하여 펩티드 합성기 (431A Peptidesynthesizer; Applied Biosystems)로 1mM 스케일로 DABCYL-EDVVPCSMSE-EDANS를 합성하기 위하여 10-머 펩티드가 레진에 붙어있는 상태인H2N-E(OtBu)-D(OtBu)-V-V-P-C(Trt)-S(tBu)-M-S(tBu)-E(OtBu)(-EDANS)-Rinkamide resin을 얻었다.To synthesize DABCYL-EDVVPCSMSE-EDANS on a 1 mM scale with a peptide synthesizer (431A Peptidesynthesizer; Applied Biosystems) using the product obtained above and Fmoc peptide Reagents (Advanced ChemTech, Louisville, KY 40228, USA), 10- (OtBu) -D (OtBu) -VVPC (Trt) -S (tBu) -MS (tBu) -E (OtBu) (- EDANS) -Rinkamide resin was obtained.

상기에서 얻어진 생성물을 DMF 50ml에 녹이고 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 9.50g, diisopropylethylamine 12.9g, HOBT 4.73g, HBTU (O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 13.3g을 가한 후, 상온에서 15시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄과 메탄올로 차례로 씻어냈다.The resulting product was dissolved in 50 ml of DMF and 9.50 g of 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA), 12.9 g of diisopropylethylamine, 4.73 g of HOBT, 1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) was added thereto. The mixture was stirred at room temperature for 15 hours, and washed successively with dichloromethane and methanol.

상기에서 얻어진 생성물을 30ml 혼합용매 (trifluoroacetic acid: TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5)에 녹여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 용매를 제거하고 에틸에테르를 가하여 결정으로 석출시켰다.The product obtained above was dissolved in 30 ml of trifluoroacetic acid (TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5) and allowed to react at room temperature for 2 hours. The solvent was removed and ethyl ether was added to precipitate crystals.

상기에서 얻은 최종 산물은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 역상 HPLC (Waters, Delta Prep 4000, 사용용매 물/아세토나이트릴)로 분리하였고, 최종 산물 DABCYL-DEMEECASHD(-EDANS)-CO2H에 대한 FAB-MS 데이터를 얻어 합성을 확인하였다 (계산된 분자량 1528, 측정된 분자량 MH+ 1529).The final product thus obtained was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), separated by reverse phase HPLC (Waters, Delta Prep 4000, solvent / acetonitrile used), and the final product, DABCYL-DEMEECASHD (-EDANS) -CO2H, Data were obtained to confirm the synthesis (calculated molecular weight 1528, measured molecular weight MH + 1529).

<실시예 3> FRET 기질의 합성 3: DABCYL-DEMEEAbuASHD(-EDANS)-COExample 3: Synthesis of FRET substrate 3: DABCYL-DEMEEAbuASHD (-EDANS) -CO 22 HH

Fmoc-Asp-OtBu (Novabiochem사,La Jolla, CA 92039, 미국) 2.06g을 DMF (dimethyl formamide) 30ml에 녹이고, HOBT (1-hydroxy benzotriazole) 0.68g과N,N'-diisopropylcarbodiimide 1.03g을 첨가하여 상온에서 20분간 교반한 후, DIEA (diisopropylethylamine) 1.29g과 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 1.57g을 가한 후 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 감압하에서 DMF를 제거하고 메틸렌클로라이드 30ml와 Trifluoroacetic acid 30ml에 녹여 상온에서 2시간 동안 교반한 후 30ml 메탄올을 첨가하여 생성물을 결정화시킨 후, 필터하고 디에틸에테르로 씻어낸 후 무색의 고체 2.39g을 얻었다.2.06 g of Fmoc-Asp-OtBu (Novabiochem, La Jolla, CA 92039, USA) was dissolved in 30 ml of DMF, and 0.68 g of HOBT (1-hydroxy benzotriazole) and 1.03 g of N, N'-diisopropylcarbodiimide After stirring for 20 minutes at room temperature, 1.29 g of DIEA (diisopropylethylamine) and 1.57 g of 5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA) Lt; / RTI &gt; DMF was removed under reduced pressure and dissolved in 30 ml of methylene chloride and 30 ml of trifluoroacetic acid. After stirring at room temperature for 2 hours, 30 ml of methanol was added to crystallize the product, which was then filtered and washed with diethyl ether to obtain 2.39 g of a colorless solid .

상기에서 얻어진 생성물과 Fomc-Abu-OH (Advanced ChemTech사, Louisville, KY 40228, 미국)를 포함하는 Fmoc 펩티드 Reagents (Advanced ChemTech사, Louisville, KY 40228, 미국)를 사용하여 펩티드 합성기 (431A Peptide synthesizer; Applied Biosystems)로 1mM 스케일로 DABCYL-DEMEEAbuASHD-EDANS를 합성하기 위하여 10-머 펩티드가 레진에 붙어있는 상태인H2N-D(OtBu)-E(OtBu)-M-E(OtBu)-E(OtBu)-Abu-A-S(tBu)-H(Trt)-D(OtBu)(-EDANS)-Rinkamide resin을 얻었다.A peptide synthesizer (431A Peptide Synthesizer) was synthesized using Fmoc Peptide Reagents (Advanced ChemTech, Louisville, KY 40228, USA) containing the product obtained above and Fomc-Abu-OH (Advanced ChemTech, Louisville, KY 40228, (OtBu) -E (OtBu) -E (OtBu) -Abu (10) where 10 -members are attached to the resin to synthesize DABCYL-DEMEEAbuASHD- -AS (tBu) -H (Trt) -D (OtBu) (-EDANS) -Rinkamide resin.

상기에서 얻어진 생성물을 DMF 50ml에 녹이고 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 9.50g, diisopropylethylamine 12.9g, HOBT 4.73g, HBTU (O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 13.3g을 가한 후, 상온에서 15시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄과 메탄올로 차례로 씻어냈다.The resulting product was dissolved in 50 ml of DMF and 9.50 g of 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA), 12.9 g of diisopropylethylamine, 4.73 g of HOBT, 1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) was added thereto. The mixture was stirred at room temperature for 15 hours, and washed successively with dichloromethane and methanol.

상기에서 얻어진 생성물을 30ml 혼합용매 (trifluoroacetic acid: TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5)에 녹여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 용매를 제거하고 에틸에테르를 가하여 결정으로 석출시켰다.The product obtained above was dissolved in 30 ml of trifluoroacetic acid (TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5) and allowed to react at room temperature for 2 hours. The solvent was removed and ethyl ether was added to precipitate crystals.

상기에서 얻은 최종 산물은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 역상 HPLC (Waters, Delta Prep 4000, 사용용매 물/아세토나이트릴)로 분리하였고, 최종 산물 DABCYL-DEMEEAbuASHD(-EDANS)-CO2H에 대한 FAB-MS 데이터를 얻어 합성을 확인하였다 (계산된 분자량 1580, 측정된 분자량 MH+ 1581).The final product thus obtained was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and separated by reverse phase HPLC (Waters, Delta Prep 4000, solvent / acetonitrile used). FAB-MS Data were obtained and the synthesis was confirmed (calculated molecular weight 1580, measured molecular weight MH + 1581).

<실시예 4> FRET 기질의 합성4: DABCYL-EDVVPC(S-Me)SMSE(-EDANS)-COExample 4 Synthesis of FRET Substrate 4 DABCYL-EDVVPC (S-Me) SMSE (-EDANS) -CO 22 HH

Fmoc-Glu-OtBu (Novabiochem사,La Jolla, CA 92039, 미국) 1.49g을 DMF (dimethyl formamide) 30ml에 녹이고, HOBT (1-hydroxy benzotriazole) 0.68g과 N,N'-diisopropylcarbodiimide 1.03g을 첨가하여 상온에서 20분간 교반한 후, DIEA (diisopropylethylamine) 1.29g과 5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술폰산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 1.57g을 가한 후 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 감압하에서 DMF를 제거하고 메틸렌클로라이드 30ml와 Trifluoroacetic acid 30ml에 녹여 상온에서 2시간 동안 교반한 후 30ml 메탄올을 첨가하여 생성물을 결정화시킨 후, 필터하고 디에틸에테르로 씻어낸 후 무색의 고체 Fmoc-Glu (-EDABS)-CO2tBu 2.42g을 얻었다.1.49 g of Fmoc-Glu-OtBu (Novabiochem, La Jolla, CA 92039, USA) was dissolved in 30 ml of DMF and 0.68 g of HOBT (1-hydroxy benzotriazole) and 1.03 g of N, N'-diisopropylcarbodiimide After stirring for 20 minutes at room temperature, 1.29 g of DIEA (diisopropylethylamine) and 1.57 g of 5- (2-aminoethylamino) -1-naphthalenesulfonic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA) Lt; / RTI &gt; DMF was removed under reduced pressure, and the mixture was dissolved in 30 ml of methylene chloride and 30 ml of trifluoroacetic acid. After stirring at room temperature for 2 hours, 30 ml of methanol was added to crystallize the product. The product was filtered and washed with diethyl ether to obtain a colorless solid Fmoc-Glu -EDABS) -CO2tBu.

S-Methyl-L-cysteine (Aldrich사, Milwaukee, WI 53233, 미국) 1.35g과 칼륨카보네이트 3.45g을 40ml의 (물/디옥센 6:4)에 녹인 후 섭씨 0도에서 9-fluorenylmethyl chroloformate 2.85g을 넣고 2시간동안 반응시키고, 남은 9-fluorenylmethyl chroloformate은 디에틸에테르로 추출하여 제거하고 6N HCl용액으로 산성화시킨 후 메틸렌클로라이드로 추출하여 Fomc-Cys(S-Me)-OH를 3.36g 합성하였다.1.35 g of S-Methyl-L-cysteine (Aldrich, Milwaukee, WI 53233, USA) and 3.45 g of potassium carbonate were dissolved in 40 ml of water / dioxane 6: 4 and then 2.85 g of 9-fluorenylmethyl chroloformate And the remaining 9-fluorenylmethyl chroloformate was extracted with diethyl ether, acidified with 6N HCl solution, and extracted with methylene chloride to synthesize 3.36 g of Fomc-Cys (S-Me) -OH.

상기에서 얻은 Fmoc-Glu (-EDABS)-CO2tBu, Fomc-Cys(S-Me)-OH, Fmoc 펩티드 Reagents (Advanced ChemTech사, Louisville, KY 40228, 미국)를 사용하여 펩티드 합성기 (431A Peptide synthesizer; Applied Biosystems)로 1mM 스케일로 DABCYL-EDVVPC(S-Me)SMSE-EDANS를 합성하기 위하여 10-머 펩티드가 레진에 붙어있는 상태인H2N-E(OtBu)-D(OtBu)-V-V-P-C(S-Me)-S(tBu)-M-S(tBu)-E(OtBu)(-EDANS)-Rinkamide resin을 얻었다.The peptide synthesizer (431A Peptide synthesizer; Applied Biosystems) was synthesized using Fmoc-Glu (-EDABS) -CO2tBu, Fomc-Cys (S-Me) -OH and Fmoc peptide Reagents (Advanced ChemTech, Louisville, KY 40228, (OtBu) -DV (OtBu) -VVPC (S-Me) in which 10 -members are attached to the resin to synthesize DABCYL-EDVVPC (S-Me) SMSE- -S (tBu) -MS (tBu) -E (OtBu) (-EDANS) -Rinkamide resin.

상기에서 얻어진 생성물을 DMF 50ml에 녹이고 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산 (Sigma사, St. Louis, MO 63178, 미국) 9.50g, diisopropylethylamine 12.9g, HOBT 4.73g, HBTU (O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 13.3g을 가한 후, 상온에서 15시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄과 메탄올로 차례로 씻어냈다.The resulting product was dissolved in 50 ml of DMF and 9.50 g of 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (Sigma, St. Louis, MO 63178, USA), 12.9 g of diisopropylethylamine, 4.73 g of HOBT, 1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) was added thereto. The mixture was stirred at room temperature for 15 hours, and washed successively with dichloromethane and methanol.

상기에서 얻어진 생성물을 30ml 혼합용매 (trifluoroacetic acid: TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5)에 녹여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 용매를 제거하고 에틸에테르를 가하여 결정으로 석출시켰다.The product obtained above was dissolved in 30 ml of trifluoroacetic acid (TIS: water = 9.25: 0.25: 0.5) and allowed to react at room temperature for 2 hours. The solvent was removed and ethyl ether was added to precipitate crystals.

상기에서 얻은 최종 산물은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 역상 HPLC (Waters, Delta Prep 4000, 사용용매 물/아세토나이트릴)로 분리하였고, 최종 산물 DABCYL-DEMEEC(S-Me)ASHD(-EDANS)-CO2H에 대한 FAB-MS 데이터를 얻어 합성을 확인하였다 (계산된 분자량 1542, 측정된 분자량 MH+ 1543).The final product thus obtained was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and separated by reverse phase HPLC (Waters, Delta Prep 4000, solvent / acetonitrile used). The final product DABCYL-DEMEEC (S-Me) ASHD (-EDANS) FAB-MS data for CO2H was obtained and the synthesis was confirmed (calculated molecular weight 1542, measured molecular weight MH + 1543).

<실시예 5> FRET 기질을 사용한 단백질 분해효소의 활성 측정 1<Example 5> Measurement of protease activity using FRET substrate 1

상기 실시예 1에서 합성된 FRET 기질 [(DABCYL)-DEMEECASHD(-EDANS)-CO2H]을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성을 측정하였다.The activity of the protease 4A-NS3 was measured by the following method using the FRET substrate [(DABCYL) -DEMEECASHD (-EDANS) -CO 2 H] synthesized in Example 1 as described below.

상기 기질은 비구조 단백질 3의 효소분해 작용에 의해 (DABCYL)-DEMEEC-CO2H와 NH2-ASHD(-EDANS)-CO2H로 분해된다.The substrate is degraded to (DABCYL) -DEMEEC-CO 2 H and NH 2 -ASHD (-EDANS) -CO 2 H by enzymatic degradation of nonstructural protein 3.

50 mM Tris, 10 mM DTT (dithreitol), 2% CHAPS [3-[(3-cholamidopropyl)- dimethyl ammonio]-1-propane-sulfonate], 50% 글리세롤 (Glycerol)을 포함하는 pH 7.6의 완충용액에 상기 실시예 1의 기질 0.1∼5 μM, 단백질 분해효소 4A-NS3 10 nM 및 1% DMSO (dimethylsulfoxide)를 포함하는 용액 200 ㎕를 넣고, 30 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 형광 분광기 (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)로 형광을 측정하여 단백질 분해효소 4A-NS3와 기질 사이의 반응을 관찰하였다. 이 때 들뜸파장 (excitation wavelength)을 350 nm로 하여 방출파장 (emission wavelength) 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 마이클리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 식을 만족하는 리네위버-버크 플랏 (Lineweaver-Burk Plot)으로부터 얻어진 반응속도론적 상수들은 하기표 2에 나타내었다.To a buffer solution of pH 7.6 containing 50 mM Tris, 10 mM DTT (dithreitol), 2% CHAPS [3- (3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1- propane- sulfonate], 50% glycerol 200 μl of a solution containing 0.1 to 5 μM of the substrate of Example 1, 10 nM of protease 4A-NS3 and 1% of DMSO (dimethyl sulfoxide) was added and reacted at 30 ° C. for 5 minutes. Fluorescence was measured with a fluorescence spectrometer (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer) and the reaction between protease 4A-NS3 and substrate was observed. At this time, the absorbance was measured at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 480 nm. As a result, the kinetic constants obtained from the Lineweaver-Burk Plot satisfying the Michaelis-Menten equation are shown in Table 2 below.

FRET 기질 (DABCYL)-DEMEECASHD(-EDANS)-CO2H를 사용한 경우 단백질 분해효소 4A-NS3의 반응속도론적 상수The kinetic constants of the proteolytic enzyme 4A-NS3 when FRET substrate (DABCYL) -DEMEECASHD (-EDANS) -CO 2 H was used 기질temperament 효소enzyme Km K m kcat k cat kcat/Km k cat / K m 실시예 1의4A/4B 형광기질The 4A / 4B fluorescent substrate of Example 1 4A-NS34A-NS3 0.644 μM0.644 μM 5.13 min-1 5.13 min -1 133,000 M-1s-1 133,000 M -1 s -1 4A/4B 펩티드 기질* 4A / 4B peptide substrate * NS3/4ANS3 / 4A 42.8 μM42.8 [mu] M 1.40 min-1 1.40 min -1 545 M-1s-1 545 M -1 s -1 * C. Steinkuhler,et al.,J. Virol.70 (1996) 6694-6700* C. Steinkuhler, et al ., J. Virol. 70 (1996) 6694-6700

상기표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 형광기질을 사용했을 때 종래의 4A/4B 펩티드 기질을 사용했을 때에 비하여 Km값이 120배 감소, kcat값이 10배 증가하여 결국 kcat/Km값이 약 1200배 증가하였다. 따라서 본 발명에 의한 형광기질을 사용함으로써 저농도의 기질에 대해서도 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성을 빠르고 정확하게 측정할 수 있다.As can be seen from Table 2, the present time have used a fluorogenic substrate according to the invention than when using a conventional 4A / 4B peptide substrate K m value is 120-fold reduction, k cat value is increased 10-fold after all k cat / K m value increased about 1200 times. Therefore, the activity of the hepatitis C virus non-structural protein 3 can be measured rapidly and accurately even with a low concentration of the substrate by using the fluorescent substance according to the present invention.

<실시예 6> FRET 기질을 사용한 단백질 분해효소의 활성 측정 2<Example 6> Measurement of protease activity using FRET substrate 2

상기 실시예 2에서 합성된 FRET 기질 [(DABCYL)-EDVVPCSMSE(-EDANS)-CO2H]을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성을 측정하였다.The Example 2 synthesis of FRET substrates protease activity of NS3-4A in the same manner and to use the [(DABCYL) -EDVVPCSMSE (-EDANS) -CO 2 H] in was measured.

상기 기질은 비구조 단백질 3의 효소분해 작용에 의해 (DABCYL)-EDVVPC-CO2H와 NH2-SMSE(-EDANS)-CO2H로 분해된다.The substrate is degraded to (DABCYL) -EDVVPC-CO 2 H and NH 2 -SMSE (-EDANS) -CO 2 H by enzymatic degradation of nonstructural protein 3.

50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS, 20% 글리세롤을 포함하는 pH 7.6의 완충용액에 상기 실시예 2의 기질 0.1∼5 μM, 단백질 분해효소 4A-NS3 10 nM 및 1% DMSO를 포함하는 용액 200 ㎕를 넣고, 30 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 형광 분광기 (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)로 형광을 측정하여 단백질 분해효소 4A-NS3와 기질 사이의 반응을 관찰하였다. 이 때 들뜸파장을 350 nm로 하여 방출파장 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 마이클리스-멘텐 식을 만족하는 리네위버-버크 플랏으로부터 얻어진 반응속도론적 상수들은 하기표 3에 나타내었다.To the buffer solution at pH 7.6 containing 50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS and 20% glycerol, 0.1 to 5 μM of the substrate of Example 2, 10 nM of protease 4A-NS3 and 1% Was added, and the mixture was allowed to react at 30 DEG C for 5 minutes. Fluorescence was measured with a fluorescence spectrometer (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer) and the reaction between protease 4A-NS3 and substrate was observed. At this time, absorbance was measured at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 480 nm. The kinetic constants obtained from the Lineweaver-Burkplats satisfying the Michaelis-Menten equation are shown in Table 3 below.

FRET 기질 (DABCYL)-EDVVPCSMSE(-EDANS)-CO2H를 사용한 경우 단백질 분해효소 4A-NS3의 반응속도론적 상수The kinetic constants of the proteolytic enzyme 4A-NS3 when using the FRET substrate (DABCYL) -EDVVPCSMSE (-EDANS) -CO 2 H 기질temperament 효소enzyme Km K m kcat k cat kcat/Km k cat / K m 실시예 2의5A/5B 형광기질The 5A / 5B fluorescent substrate of Example 2 4A-NS34A-NS3 1.96 μM1.96 [mu] M 47.2 min-1 47.2 min -1 401,000 M-1s-1 401,000 M -1 s -1 5A/5B 펩티드 기질* 5A / 5B peptide substrate * NS3/4ANS3 / 4A 32 μM32 μM 36.6 min-1 36.6 min -1 20,000 M-1s-1 20,000 M -1 s -1 * J. A. Landro,et al.,Biochemistry36 (1997) 9340-9348* JA Landro, et al ., Biochemistry 36 (1997) 9340-9348

상기표 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 형광기질을 사용했을 때 종래의 5A/5B 펩티드 기질을 사용했을 때에 비하여 Km값이 16배 감소, kcat값이 1.2배 증가하여 결국 kcat/Km값이 약 20배 증가하였다. 따라서 본 발명에 의한 형광기질을 사용함으로써 저농도의 기질에 대해서도 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성을 빠르고 정확하게 측정할 수 있다.As can be seen in Table 3, by the present, when used fluorogenic substrate according to the invention than when using conventional 5A / 5B peptide substrate K m values are 16-fold reduction, k cat value is increased by 1.2 times after all k cat / K m value increased about 20 times. Therefore, the activity of the hepatitis C virus non-structural protein 3 can be measured rapidly and accurately even with a low concentration of the substrate by using the fluorescent substance according to the present invention.

<실시예 7> FRET 기질을 사용한 단백질 분해효소의 활성 측정 3Example 7 Measurement of Protease Activity Using FRET Substrate 3

상기 실시예 3에서 합성된 FRET 기질 [(DABCYL)-DEMEEAbuASHD(-EDANS)-CO2H]을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성을 측정하였다.The FRET embodiment the substrate prepared in Example 3 protease activity of NS3-4A in the same manner and to use the [(DABCYL) -DEMEEAbuASHD (-EDANS) -CO 2 H] was measured.

상기 기질은 비구조 단백질 3의 효소분해 작용에 의해 (DABCYL)-DEMEEAbu-CO2H와 NH2-ASHD(-EDANS)-CO2H로 분해된다.The substrate is degraded to (DABCYL) -DEMEEAbu-CO 2 H and NH 2 -ASHD (-EDANS) -CO 2 H by enzymatic degradation of nonstructural protein 3.

50 mM Tris, 10 mM DTT, 2% CHAPS, 50% 글리세롤을 포함하는 pH 7.6의 완충용액에 상기 실시예 3의 기질 0.1∼5 μM, 단백질 분해효소 4A-NS3 10 nM 및 1% DMSO를 포함하는 용액 200 ㎕를 넣고, 30 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 형광 분광기 (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)로 형광을 측정하여 단백질 분해효소 4A-NS3와 기질 사이의 반응을 관찰하였다. 이 때 들뜸파장을 350 nm로 하여 방출파장 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 마이클리스-멘텐 식을 만족하는 리네위버-버크 플랏으로부터 얻어진 반응속도론적 상수들은 하기표 4에 나타내었다.To the buffer solution at pH 7.6 containing 50 mM Tris, 10 mM DTT, 2% CHAPS, and 50% glycerol, 0.1 to 5 μM of the substrate of Example 3, 10 nM of protease 4A-NS3 and 1% Was added, and the mixture was allowed to react at 30 DEG C for 5 minutes. Fluorescence was measured with a fluorescence spectrometer (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer) and the reaction between protease 4A-NS3 and substrate was observed. At this time, absorbance was measured at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 480 nm. The kinetic constants obtained from the Lineweaver-Burkplats satisfying the Michaelis-Menten equation are shown in Table 4 below.

FRET 기질 (DABCYL)-DEMEEAbuASHD(-EDANS)-CO2H를 사용한 경우 단백질 분해효소 4A-NS3의 반응속도론적 상수The kinetic constant of protease 4A-NS3 when using FRET substrate (DABCYL) -DEMEEAbuASHD (-EDANS) -CO 2 H 기질temperament 효소enzyme Km K m kcat k cat kcat/Km k cat / K m 실시예 3의4A/4B 형광기질The 4A / 4B fluorescent substrate of Example 3 4A-NS34A-NS3 4.08 μM4.08 μM 0.0593 min-1 0.0593 min -1 242 M-1s-1 242 M -1 s -1 4A/4B 펩티드 기질* 4A / 4B peptide substrate * NS3/4ANS3 / 4A 96.7 μM96.7 [mu] M 0.17 min-1 0.17 min -1 29.6 M-1s-1 29.6 M -1 s -1 * C. Steinkuhler,et al.,J. Virol.70 (1996) 6694-6700* C. Steinkuhler, et al ., J. Virol. 70 (1996) 6694-6700

상기표 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 형광기질을 사용했을 때 종래의 4A/4B 펩티드 기질을 사용했을 때에 비하여 Km값이 23배 감소, kcat값이 0.35배증가하여 결국 kcat/Km값이 약 8배 증가하였다. 따라서 본 발명에 의한 형광기질을 사용함으로써 저농도의 기질에 대해서도 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성을 빠르고 정확하게 측정할 수 있다.As can be seen in Table 4, in the present, when used fluorogenic substrate according to the invention than when using a conventional 4A / 4B peptide substrate K m values are 23-fold reduction, k cat value is increased 0.35 fold after all k cat / K m value increased about 8 times. Therefore, the activity of the hepatitis C virus non-structural protein 3 can be measured rapidly and accurately even with a low concentration of the substrate by using the fluorescent substance according to the present invention.

<실시예 8> FRET 기질을 사용한 단백질 분해효소의 활성 측정 4<Example 8> Measurement of protease activity using FRET substrate 4

상기 실시예 4에서 합성된 FRET 기질 [(DABCYL)-EDVVPC(S-Me)SMSE (-EDANS)-CO2H]을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성을 측정하였다.The activity of the protease 4A-NS3 was measured by the following method using the FRET substrate [(DABCYL) -EDVVPC (S-Me) SMSE (-EDANS) -CO 2 H] synthesized in Example 4 .

상기 기질은 비구조 단백질 3의 효소분해 작용에 의해 (DABCYL)-EDVVPC(S-Me)-CO2H와 NH2-SMSE(-EDANS)-CO2H로 분해된다.The substrate is degraded to (DABCYL) -EDVVPC (S-Me) -CO 2 H and NH 2 -SMSE (-EDANS) -CO 2 H by enzymatic degradation of non-structural protein 3.

50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS, 20% 글리세롤을 포함하는 pH 7.6의 완충용액에 상기 실시예 4의 기질 0.1∼5 μM, 단백질 분해효소 4A-NS3 10 nM 및 1% DMSO를 포함하는 용액 200 ㎕를 넣고, 30 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 형광 분광기 (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)로 형광을 측정하여 단백질 분해효소 4A-NS3와 기질 사이의 반응을 관찰하였다. 이 때 들뜸파장을 350 nm로 하여 방출파장 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 마이클리스-멘텐 식을 만족하는 리네위버-버크 플랏으로부터 얻어진 반응속도론적 상수들은 하기표 5에 나타내었다.To the buffer solution at pH 7.6 containing 50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS and 20% glycerol, 0.1 to 5 μM of the substrate of Example 4, 10 nM of protease 4A-NS3 and 1% Was added, and the mixture was allowed to react at 30 DEG C for 5 minutes. Fluorescence was measured with a fluorescence spectrometer (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer) and the reaction between protease 4A-NS3 and substrate was observed. At this time, absorbance was measured at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 480 nm. As a result, the kinetic constants obtained from the Lineweaver-Burkplats satisfying the Michaelis-Menten equation are shown in Table 5 below.

FRET 기질 (DABCYL)-EDVVPC(S-Me)SMSE(-EDANS)-CO2H를 사용한 경우 단백질 분해효소 4A-NS3의 반응속도론적 상수FRET substrate (DABCYL) -EDVVPC (S-Me) When using SMSE (-EDANS) -CO 2 H, kinetic constants of protease 4A-NS3 기질temperament 효소enzyme Km K m kcat k cat kcat/Km k cat / K m 실시예 4의5A/5B 형광기질The 5A / 5B fluorescent substrate of Example 4 4A-NS34A-NS3 2.18 μM2.18 [mu] M 4.34 min-1 4.34 min -1 33,000 M-1s-1 33,000 M -1 s -1 5A/5B 펩티드 기질* 5A / 5B peptide substrate * NS3/4ANS3 / 4A 130 μM130 μM 2.94 min-1 2.94 min -1 385 M-1s-1 385 M -1 s -1 * J. A. Landro,et al.,Biochemistry36 (1997) 9340-9348* JA Landro, et al ., Biochemistry 36 (1997) 9340-9348

상기표 5에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 형광기질을 사용했을 때 종래의 5A/5B 펩티드 기질을 사용했을 때에 비하여 Km값이 59배 감소, kcat값이 1.5배 증가하여 결국 kcat/Km값이 약 85배 증가하였다. 따라서 본 발명에 의한 형광기질을 사용함으로써 저농도의 기질에 대해서도 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 활성을 빠르고 정확하게 측정할 수 있다.As can be seen from Table 5, in the present, when used fluorogenic substrate according to the invention than when using conventional 5A / 5B peptide substrate K m values are 59-fold reduction, k cat value is increased by 1.5 times after all k cat / K m value increased about 85 times. Therefore, the activity of the hepatitis C virus non-structural protein 3 can be measured rapidly and accurately even with a low concentration of the substrate by using the fluorescent substance according to the present invention.

<실시예 9> 단백질 분해효소 4A-NS3에 대한 저해 화합물의 활성 측정<Example 9> Measurement of activity of inhibitory compound against protease 4A-NS3

상기 실시예 2에서 합성된 FRET 형광기질 [(DABCYL)-EDVVPCSMSE (-EDANS)-CO2H]을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 단백질 분해효소 4A-NS3에 대한 저해 화합물의 활성을 측정하였다.Using the FRET fluorescent substrate [(DABCYL) -EDVVPCSMSE (-EDANS) -CO 2 H] synthesized in Example 2 above, the activity of the inhibitory compound against protease 4A-NS3 was measured by the following method.

50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS, 20% 글리세롤을 포함하는 pH 7.6의 완충용액에, 상기 기질 5 μM, 단백질 분해효소 4A-NS3 10 nM, 10% DMSO를 포함하는 용액 200 ㎕를 넣고 여기에 저해 화합물 Ac-D-E(d)-L-I-Cha-C-OH (펩타이드 합성기로 합성함, E(d)는 d form의 Glu, Cha는 cyclohexylalanine을 말함)을 0∼100 nM의농도로 각각 첨가하여, 30 ℃에서 5분 동안 반응시켰다. 형광 분광기 (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)로 형광을 측정하여 상기 저해 화합물이 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. 이 때 들뜸파장을 350 nm로 하여 방출파장 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.To the buffer solution at pH 7.6 containing 50 mM Tris, 10 mM DTT, 0.5% CHAPS and 20% glycerol, 200 μl of a solution containing 5 μM of the substrate, 10 nM of protease 4A-NS3 and 10% DMSO was added The inhibitory compound Ac-DE (d) -Li-Cha-C-OH (synthesized by a peptide synthesizer, E (d) refers to Glu in d form and Cha refers to cyclohexylalanine) at a concentration of 0 to 100 nM And the mixture was reacted at 30 DEG C for 5 minutes. Fluorescence was measured with a fluorescence spectrometer (AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer) and the effect of the inhibitory compound on the activity of protease 4A-NS3 was observed. At this time, absorbance was measured at an excitation wavelength of 350 nm and an emission wavelength of 480 nm.

저해 화합물의 농도에 대한 단백질 분해효소 4A-NS3의 활성 변화를도 2에 딕슨 플랏 (Dixon Plot)으로 나타내었다.The activity of protease 4A-NS3 in relation to the concentration of the inhibitory compound is shown in Fig. 2 as Dixon Plot.

딕슨 플랏은 하기 수학식 1에 의해 표시된다.The Dickson plat is expressed by the following equation (1).

1/v = (Km/V)(1/V)(1/Ki)[I] + (1/V)(1 + Km/S) 1 / v = (K m / V) (1 / V) (1 / K i) [I] + (1 / V) (1 + K m / S)

[I] : 저해 화합물의 농도[I]: concentration of inhibitory compound

S : 기질의 농도S: concentration of substrate

V : 최대 반응속도V: maximum reaction rate

Km: 미카엘리스 상수K m : Michaelis constant

Vi: 해리 상수V i : dissociation constant

v : 반응속도v: reaction rate

상기 식에서 1/v = 0일 때 [I] = - (1 + S/Km)Ki이므로, [I]값 (딕슨 플랏으로부터 얻음), Km값 (실시예 6으로부터 1.96 μM), S값 (5 μM)으로부터 7.93 nM의Ki값을 얻을 수 있다. 또한 하기 수학식 2에 의해 상기 저해 화합물의 IC50을 구할 수 있다.Wherein R 1 / v = 0 be when [I] = - (1 + S / K m) because K i, [I] values (obtained from the Dixon plot), K m value (1.96 μM from Example 6), S From the value (5 μM), a K i value of 7.93 nM can be obtained. The IC 50 of the inhibiting compound can also be obtained by the following formula (2).

IC50= (1 + S/Km)Ki IC 50 = (1 + S / K m ) K i

그 결과, 단백질 분해효소 4A-NS3에 대한 상기 저해 화합물의 IC50은 24.1 nM로 계산되었다. 상기와 같은 방법에 의해 저해 화합물의 IC50을 용이하게 구할 수 있으며, 따라서 이를 이용하여 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3에 대한 저해 화합물의 저해 활성을 판단할 수 있었다. 또한 상기 방법을 이용하여 궁극적으로는 C형 간염 바이러스의 증식 억제제 또는 치료제를 개발하는데 이용할 수 있음을 알 수 있었다.As a result, the IC 50 of the inhibitory compound against protease 4A-NS3 was calculated as 24.1 nM. The IC 50 of the inhibitory compound can be easily obtained by the above method, and thus the inhibitory activity of the inhibitory compound against the hepatitis C virus non-structural protein 3 can be determined. In addition, it has been found that the above method can ultimately be used to develop a proliferation inhibitor or therapeutic agent for hepatitis C virus.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 신규 FRET 기질을 사용함으로써 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3의 효소 활성을 종래에 비하여 보다 정확하고 효율적으로 측정할 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 신규 FRET 기질은 상기 비구조 단백질 3의 활성저해 화합물을 탐색·선별하는데 이용할 수 있으며, 궁극적으로는 C형 간염 바이러스의 증식 억제제 및 치료제를 개발하는데 유용하게 이용할 수 있다.As described above, the enzyme activity of hepatitis C virus non-structural protein 3 can be measured more accurately and efficiently than the conventional method by using the novel FRET substrate according to the present invention. Therefore, the novel FRET substrate according to the present invention can be used for screening and screening the activity-inhibiting compounds of the non-structural protein 3, and ultimately, can be usefully used for developing a proliferation inhibitor and therapeutic agent for hepatitis C virus.

Claims (7)

C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한, 하기 화학식 1로 표시되는 신규 형광 공명 에너지 전이 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, 이하 'FRET'라 약칭함) 기질.A novel fluorescence resonance energy transfer (hereinafter abbreviated as FRET) substrate for evaluating the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus, represented by the following formula (1). 화학식 1Formula 1 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한, 하기 화학식 2로 표시되는 신규 FRET 기질.A novel FRET substrate represented by the following formula (2) for evaluation of the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus. 화학식 2(2) C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한, 하기 화학식 3으로 표시되는 신규 FRET 기질.A novel FRET substrate represented by the following formula (3) for evaluation of the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus. 화학식 3(3) C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3의 활성 평가를 위한, 하기 화학식 4로 표시되는 신규 FRET 기질.A novel FRET substrate for evaluation of the activity of non-structural protein 3 of hepatitis C virus, 화학식 4Formula 4 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항 또는 제 4 항의 FRET 기질을 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3과 반응시키고 형광을 측정하여 상기 비구조 단백질 3의 효소 활성을 측정하는 방법.A method for measuring the enzyme activity of the non-structural protein 3 by reacting the FRET substrate of claim 1, 2, 3 or 4 with the non-structural protein 3 of hepatitis C virus and measuring fluorescence. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항 또는 제 4 항의 FRET 기질을 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3 및 이의 활성저해 화합물과 반응시키고 형광을 측정하여, 상기 활성저해 화합물의 저해 활성을 측정하는 방법.The FRET substrate of any one of claims 1, 2, 3, or 4 is reacted with a non-structural protein 3 of hepatitis C virus and an activity inhibitor thereof, and fluorescence is measured to measure the inhibitory activity of the activity inhibitor compound Way. 제 6 항의 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3에 대한 활성저해제를 탐색·선별하는 방법.A method for screening and screening an activity inhibitor for non-structural protein 3 of hepatitis C virus using the method of claim 6.
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