WO1997007813A1

WO1997007813A1 - Agent de fecondite

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Publication number: WO1997007813A1
Application number: PCT/JP1996/002412
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Terao; Naohiro Kanayama; Masanobu Naruto; Tatsuya Kaneko
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1995-08-28
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 1997-03-06
Also published as: US6013252A; AU6836896A; CA2203768A1; EP0790061A1

Description

明細書

受胎促進剤技術分野

本発明は卵子、卵胞の発育の促進と子宮内膜の肥厚ならびに間質の水腫化による钦化の促進によって受精卵の着床を促進する作用を合わせ持つ白血球遊走因子あるいはその誘発物質を有効成分とする受胎促進剤に関する。特に哺乳類の受胎促進の医療的処置に関する。

背景技術

一般的に妊娠の成立のためには以下の条件が必要と言われている。

( 1 ) 射精精液の中に充分な運動能と受精能を有する精子が一定数以上存在すること、

( 2 ) 卵胞および卵子が正常に発育、成熟し、受精分割能を有する卵が排卵されること、

( 3 ) 卵管の形態および機能が正常に保たれていること、

( 4 ) 胚の着床とその維持のために、子宮の形態および機能が正常であることしかしながら、現在では 1 0組の夫婦の内 1組は、上記の条件のひとつあるいはいくつかを満たせず不妊症であると言われている。原因を大きく分けると女性側の因子が 4 0 %、男性側の因子が 2 5 %、両者に原因がある場合が 2 5 %、原因不明が 1 0 %である。

この様な原因のうち、排卵すべき卵子が全くない、手術で摘出したため子宮がない、無精子症など治療が不可能なものを絶対的不妊と呼ぶ。以前は両側の卵管を摘出したものは絶対的不妊であつたが、体外受精（IVF=in vitro ferti l izati on) 、胚移植（ET=embryo transfer) により妊娠 ·出産が出来るようになった。この体外受精 ·胚移植法の出現により今まで妊娠が不可能であった卵管閉鎖、乏精子症などの妊娠も可能となっている。しかし、体外受精の妊娠率は全体外受精数の約 2 0〜 3 0 %、さらに出生にまで至るのは 5〜： 1 0 %にとどまっている。これは受精させた卵を子宮に戻すときにうまく着床しないことが原因の一つとして考えられている。また原因不明のいわゆる機能性不妊の原因のなかでも着床障害の割台が高いのではないかとも指摘されている。

ヒト以外の動物に於いても人工授精が行われる場合が少なくないが、その受胎率ならびに出産率は必ずしも満足のいくものではなく、とくに希少種の保護 ·繁殖を目的とする場合には残存個体の高齢化などから時間的な制約があり、問題となっている。これもヒ卜の場合と同様、前述の妊娠成立の各ステップにおける条件が十分に満足されないためによると考えられている。

卵子は卵母細胞から、卵母細胞は卵原細胞からと、一連の発達段階を経て形成される。哺乳動物では出生直前もしくは直後に卵原細胞の分裂は停止し、減数分裂型の細胞である卵母細胞となる。卵母細胞は第 1減数分裂前期の後半に達すると染色体の変化は先に進むことなく休止し（第 1次減数分裂休止）、核の容積が増大し卵核（もしくは卵核胞 - germinal vesicl e ) と呼ばれるようになる。ついで卵母細胞は脳下垂体ホルモンのゴナド卜口ピンに反応して減数分裂を再開する。多くの哺乳類では卵巣からの排卵前に卵胞内で減数分裂を再開し、卵核を崩壊（ germina l vesicle breakdown ) し第 1減数分裂中期、後期、終期を経て第 1極体（ f irst polar body ) を放出し、第 2減数分裂中期に達して染色体の動きは休止する（第 2次減数分裂休止）。第 2減数分裂は受精によって再開し第 2 極体を放出、減数分裂は完了する（鈴木善祐編、実験生殖生理学の展開、 1 1 — 1 6、ソフトサイエンス社、 1 9 8 2 ) 。卵子成熟の研究は主に in vitro の培養系でおこなわれてきており、以下の 3つの手法が実験目的に応じて採用されている。

( 1 ) 卵胞から分離した卵母細胞を種々の条件下で培養する方法であり、卵子の成熟に影響する因子の解析に利用される。

( 2 ) 卵母細胞と卵胞膜細胞（theca cel l s)を共培養したり、卵胞細胞の condi tioned medium 中で卵母細胞を培養する方法。卵胞膜細胞の影響の解析に使用される。

( 3 ) 器管培養（organ cul ture)とも言う方法で、卵母細胞を含む卵胞ごと体外で培養する方法。卵胞膜を通過あるいは介して卵子の成熟に影響する因子の解析に利用される。

受胎の前半のステップとして先ず、健常な卵子の成熟過程の存在が必須である。成熟卵子とは受精により第 2極体を放出させ減数分裂を完了させると共に受精を成立させ（受精能）、さらに受精刺激によって発生しうる能力（発生能）を有する卵子のことである。

受胎の後半のステツプは受精卵が卵管を移動し子宮壁へ着床する反応であり、女性側においてこの両ステップのどちらかにでも障害があれば受胎は成立しない力、、障害の程度にもよるが極めて低率になる。着床は受精卵と子宮内膜の接着現象と理解されている。着床時には受精卵の受け皿である子宮内膜が十分に肥厚し間質が水腫伏になり軟化していなければならない。排卵期に間質が膨化していないと受精卵が着床しにくいことが報告されている。上述したヒ卜不妊症の場合、その原因により様々な治療が行われる。例えば乏精子症あるいは精子無力症の場合は、排卵日に用手的に採取した精子を子宮内腔あるいは卵管内に注入し、卵管内で自然に受精が成立することを期待する。現在では細菌による感染の危険性があるために射精精液そのものは用いず、洗浄濃縮した精子が用いられる。しかし、妊娠が成立するまでに数回から十数回を要する場合が多く、その場合の一つに着床がうまく行かないことが考えられている。

また、体外受精 ·胚移植は卵管閉鎖、乏精子症などで他の治療法が有効でない場合に行われるが、これは体外に取り出した卵子に精子を媒精して受精させた後、分割発育した胚を経膣的に子宮壁に移植するものである。実際には（1 ) 過排卵刺激と採卵時期の決定、（2 ) 採卵手術、（3 ) 卵子の追加成熟培養、（4 ) 良好精子の回収と受精能獲得、（5 ) 体外受精、（6 ) 受精卵の培養、（7 ) 胚移植、（8 ) 黄体期管理のそれぞれ重要な過程を経て行われる。これらの過程全てが完全に遂行されなければ妊娠成立は期待できない。この場合、過排卵刺激を行つた性周期は着床の内分泌環境が非生理的であるため、黄体期管理として黄体の形成、すなわち子宮内膜の肥厚および間質の钦化のために胚移植後 1週間程度のプロゲステロンなどのホルモン療法を行うが、妊娠率は前述のように満足できるものでなく、更なる方法の改良が求められている。

体外受精 ·胚移植法の変法として assisted reproductive technology と総称される関連技術が開発されている。これには体外受精後に、分割前あるいは分割発育後の受精卵を卵管に移植する接合子卵管内移植や採取した卵子を早期に精子と共に卵管内に移植する配偶子卵管内移植法がある。これらはより生理的な妊娠過程に近い方法であるが、受精卵の着床に関しては改良されておらず改善の余地がある。

一方、細菌やウィルスの感染や外傷だけでなく、自己免疫反応による組織損傷などに於いては生体防御反応としての炎症反応が観察されるが、このとき特異的な末梢白血球が炎症部位へ浸潤する。この白血球の遊走には炎症部位で産生されるケモカイン（白血球走化性因子）が重要な働きをしている。ケモカインの中の —つがインターロイキン- 8 ( inter l eukin-8) であり、その過剰な産生が様々な炎症性疾患を引き起こすものと考えられている。

インターロイキン- 8は生体内では単球およびマクロファージ、リンパ球と言つた血球系の細胞の他に、線維芽細胞、各種腫瘍細胞など様々な細胞から、 IL - 1, TNF, LPSなどの刺激により産生されることが報告されている。そのため急性炎症形成の重要な mediatorと推察され、その産生異常によりいくつかの疾患への関与が考えられている。例えば、リューマチ性関節炎、痛風性関節炎、喘息、敗血症、免疫血管炎、肝炎、腎盂腎炎などがある。しかし、未だ基礎的なレベルでの活性の検出が知られるのみで、それらの疾患の病的プロセスの進行にどの様に関与しているかは明らかになっていない。インターロイキン- 8は好中球、リンパ球を遊走させ、好中球や他の単核球などを活性化させる作用を持つケモカインである。ケモカインは走化性（もしくはケモタキシスともいう）を示す生理活性物質（もしくはサイトカインという）の意味である。インターロイキン- 8はアミノ酸 6 9ないし 7 7個からなるタンパク質である。 Ύミノ酸の数は細胞内あるいは細胞外の酵素によるプロセシングによって主に N末端が切断を受けるので場合により異なる。インターロイキン- 8は当初 M D N C Fの名前で報告され（K. Ma tsushima ら、 J. Exp. Med. , 167. 1883. 1988) 、その後、別の研究者によっても他の名前で発見され同定されたが、インターロイキン- 8の名前で統一された（ G. Larsenら、 Science, 243, 1464, 1989 ) 。インターロイキン- 8はそのアミノ酸数とシスティン残基の配置が類似した C X Cケモカインフアミリ一の一員である。 C X Cケモカインファミリ一は互いにァミノ酸レベルで 3 0 %程度のホモ口ジーを有し、 4個のシスティン残基の位置が一致する一群の低分子量タンパク晳の総称である。インタ一ロイキン- 8の他に、このファミリ一に属する他のタンパク質としては、 7 IP- 10, GR0( α、 β、 r ) 、 PF-4, NAP- 10などがインタ一口ィキン- 8の構造的類縁対として知られている（N.Mukaida ら、 Microbiol. Irani unol. , 36, 773.1992 ) 。 C X Cケモカインファミリ一は Ν末端側アミノ酸配列中にシスティンが 1個のアミノ酸を挟んで 2個繫がる特徴を有する。 C X Cケモ力インはまた /9ケモカインともよばれる U. J. Oppenheimら、 Annual. Rev. Immu nol., 9, 617, 1991 ) 。

単球遊走活性因子（以下、 MCAFと略す）は、生体内では単球およびマクロファージ、リンパ球と言った血球系の細胞の他に、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、各種腫瘍細胞など様々な細胞から I L一 1, TN F, I F N-r , L P Sなどの刺激により産生されることが報告されている。単球活性化因子はまた MC P— 1 (monocyte chemoattractant protein - 1) や G D C F (glioma - der ived monocyte chemotactic factor) とも称され、アミノ酸 7 6個力、らなるタンパク質であり 4個のシスティン残基を持つ。 MCAF、 MC P— 1、 G D C Fについてはその同定と遣伝子クローニングが報告されている（K.Matsushima ら、 J. E xp. Med. , 169, 1485.1989. , Υ. Furutani ζ>_Ν Biochem. Biophys. Res. Commun. , 159, 249, 1989. , E.R.Robinson ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1850, 19 89.， T. Yoshimura ら、 FEBS Letters, 244, 487, 1989 ) 。以下、本発明では M C P— 1 , G D C Fを含めて M C A Fと称する。

MCAFはそのアミノ酸数とシスティン残基の配置が類似した、 CCケモカインファミリィ二の一員である。 CCケモカインフアミリ一は互いにァミノ酸レベルで 3 0%程度のホモロジ一を有し、 4個のシスティン残基の位置が一致する一群の低分子量タンパクの総称である。 MC A Fの他にこのフアミリーに属する他のタンパクとしては、ヒトでは RANTES, LD78, ACT2, 1-309, MCP - 2， MCP-3 などが、またマウスでは JE, MIP-1 a . MIP-1 β, TCA-3 などが M C A Fの構造類縁体として知られている（N. Mukaidaら、 Microbiol. Immunol. , 36, 773-789, 1992) 。 CCケモカインフアミリーは N末端側のァミノ酸配列中にシスティンが 2個繋がる特徴を有する。 CCケモカインはまた/ S- ケモカインとも呼ばれる（J.J.Oppe nheim ら， Annual Rev. Immunol. , 9, 617, 1991)₀ 本発明者らはィンターロイキン- 8の膣坐薬をゥサギに投与すると子宮頸管の熟化を引き起こすことを報告してきた（El Maradnyら、 Am. J. Obstet. Gynecol. , 171, 77, 1994 ) 。つまり子宮頸管熟化は分娩に必須であり、子宮頸管熟化不全は現在難産の最も主要な要因である。インターロイキン- 8の局所投与により頸管に好中球等の炎症性細胞が遊走し、そこから放出されるコラゲナーゼ、エラスターゼなどにより間質のコラーゲンが分解し、また水分量が増加し子宮頸管熟化が起こる。し力、し、インターロイキン- 8または M C A Fによる卵子形成、成熟から受精、受胎成立に至るステツプに対する効果に関しては知られていない。このように受胎率を向上させる手段としては、例えば第 1減数分裂再開誘起物質としてはサイクリック AMP 、カルシウムイオン、プロスタグランジン、コレラトキシン、フオルスコリンなどが、卵胞の発達には卵胞刺激ホルモン（ FS1I = fo l l icl e stimul ating hormone) などが、受精卵の発生能にはエス卜ロジェンなど力《、受精卵の着床にはステロイド剤などによる黄体期管理などが知られている。しかし、これらの方法では満足できる妊娠率が得られなかったり、その使用で発現する副作用の面から実際には使用できなかったり、使用が制限されていたりする。発明の開示

本発明は、白血球遊走因子あるいはその誘発物質を有効成分とする受胎促進剤に関する。図面の簡単な説明

第 1図は本発明の実施例 1の結果を示す。 A群はインターロイキン- 8投与、 B群は生理的食塩水を投与したものであり、横軸に母体当たりの胎児数を、縦軸にその胎児数を保有した母体数を示した。

第 2.図は本発明の実施例 5の結果を示す。 Aはコントロール（非投与、 0時間目）の卵巣のへマ卜キシリンェォジン染色切片、 Bは h C G投与後 1 0時間目の卵巣のへマトキシリンェォジン染色切片、 Cはインタ一ロイキン- 8投与後 1 0 時間目の卵巣のへマトキシリンェォジン染色切片を表し、図中のバーは 2 0 O i!D を表す。

発明を実施するための最良の形態

本発明者らは妊娠における排卵の過程にサイトカインが関与していたり、受精卵の着床過程において子宮内膜が生理的炎症状態にあることに着目し、白血球を遊走 ·活性化させるインタ一ロイキン- 8や M C A Fが妊娠成立の各ステツプ

(卵胞の発育、減数分裂の再開、受精卵着床など）において優れた効果を示し、しかも単一物質投与において受胎率向上を図れる事実を見いだし本発明を完成させた。すなわち本発明の受胎促進とは未受精卵の成熟促進、受精卵の着床促進の両ステツプを意味する。

本発明の後半ステップとして受精卵着床促進については、子宮内膜近傍に局所的に白血球遊走因子を投与することによって生体反応を起こさせることであり、狙いは局所的に白血球を遊走させることである。白血球遊走因子とは白血球走性（leukocytotaxia)を白血球に誘発する物質全ての総称であり、ある種の微生物や炎症組織内に形成される種々の物質を指し、例えばインターロイキン- 8 およびその類似のケモカインが挙げられる。インターロイキン- 8に類似のケモ力インとはインターロイキン- 8フアミリー、即ち C X Cケモカインに属するケモカイン（例えば、 G C P _ 2， G R 0 a, G R O /S, G RO r , P F 4, N A P - 2, E N A - 7 8, I P— 1 0， M I G, P B P, C T A P - HI, S D F - l a, S O F - 1 β) および MC A F (もしくは M C P— 1、即ち単球走化性活性化因子もしくは単球走化性タンパク質一 1) ファミリー、即ち C Cケモカインに属するケモカイン（例えば hM I P— l a, h M I P— l /g、 M C P— 2， M C P— 3, RA NT E S, I一 3 0 9) を意味する（Drug & Development, 7, 57 -65, 1996)。 M C A Fは単球 ·マクロファージを遊走 ·活性化して生理的炎症を惹起することが知られているが、この過程において副次的にィンターロイキン -

8が生産されることが見いだされている。したがって M C A Fおよびこの生理作用を有する類縁体も、間接的に子宮内膜の肥厚化および間質の钦化を引き起こし受精卵の着床促進に使用できる。中でも、 I L _ 8もしくは MC A Fを用いるのが好ましい。

また、白血球遊走因子の生産を誘導する物質、例えば、インターロイキン一 1、インターフュロン 7や腫瘍壊死因子（T N F ) 、さらに、ケモカインと類似の生理作用を有する白血球走化性物質である血小板活性化因子（P A F ) 、エンドトキシンの一種である L P S なども好ましく用いられる。

インターロイキン- 8または M C A Fを用いる場合、天然に存在するものを一般的に行われている方法、例えばカラムクロマ卜グラフィ一などにより分離精製して得ることが出来るが、これらを生産する細胞の細胞培養もしくは化学合成もしくは遺伝子組換え技術により得られたものであってもよく、特表平 3— 5 0 5 0 3 7、特表平 4— 5 0 0 1 5 6、特開平 2— 2 0 7 7 8 8等にその製法が開示されている。また既にこれらの物質は米国 Oncogene Science 社、米国 PEPR0TEC 社などから市販されているので、それらを用いても良い。

また、ヒ卜あるいは投与対象動物由来のものに限らず、免疫応答過剰の問題など人体あるいは投与対象動物の体に対する不都合な影響を解決できるものであれば、他の動物由来のィンターロイキン一 8または M C A Fを用いることも可能である。さらにはそのァミノ酸配列を一力所もしくは二力所以上置換、挿入、欠失もしくは修飾したもの、またはその構造体のァミノ酸配列の一部から成るぺプチドであっても活性を発現するものであれば本発明の実施に用いることが出来る。また、インターロイキン- 8あるいは M C A Fを単一成分として直接子宮に投与することも可能であるが、両者の複合剤あるいは各々の物質と同一薬効もしくは類似薬効を有する成分との複合剤も投与可能である。

また、本発明の薬剤の製剤化に於いて通常使用されている賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、安定化剤などを添加することも可能である。本発明に係る受胎促進剤の剤型は本発明の目的を達成できる限り特に限定されないが、通常用いられる方法により、子宮内散布液などの液体剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲルなどの半固形剤、膣錠、膣用カプセル剤、ペッサリー剤、膣坐剤、などの固形剤にすることが出来る。又、液体剤や半固形剤などのように子宮頸管拡張器に塗布することが出来るような剤型の場合は子宮頸管拡張器を用いて投与することも可能である。ここで塗布とは薬剤を拡張器等の一面に塗り付けることだけでなく、拡張器等に薬剤の適当な含浸手段を設けて薬剤を含浸させた場合などを含む。又、ダグラス窩よりなどの腹腔内投与も可能である。もちろん、一部本発明の実施例にも示したごとく本発明の目的を達成するために、局所投与以外に腹腔内投与、静脈内投与、経口投与、経肺投与に適した剤型も用い得るのはいうまでもない。

以上のような製剤を調製するためには、上記成分の他に、一般に医薬品製剤の添加物として用いられている成分を配合して目的とする剤型にすることが出来る。これらの成分としては例えば、動植物油（大豆油、ヤシ油、牛脂、合成グリセラィドなど）、炭化水素（流動パラフィン、スクワレン、固形パラフィンなど）、エステル油（ミリスチン酸ォクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなど）、高級アルコール（セトステリアルアルコール、ベへニルアルコールなど）、シリコン樹脂、シリコンオイル、界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）、水溶性高分子（ヒドロキシェチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビ二ルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなど）、アルコール（ェチルアルコール、イソプロピルアルコールなど）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなど）、糖（グルコース、しょ糖など）、無機粉体（無水ゲイ酸、ゲイ酸アルミニウムマグネシウム、ゲイ酸アルミニウムなど）、精製水などが上げられる。 pH調製のためには無機酸（塩酸、リン酸など）、無機酸のアルカリ金属塩（リン酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化ナトリウムなど）、有機酸（低級脂肪酸、クェン酸、乳酸など）、有機酸のアル力リ金属塩（クェン酸ナトリウム、乳酸ナ卜リウムなど）、有機塩基 (アルギニン、エタノールァミンなど）などを用いることが出来る。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加する事が出来る。実際の添加物は本発明が対象とする疾患の治療剤の剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。また、一般に市販されている坐剤成分（ミツバ社製ウイテブゾール）に混合することによつても容易に本発明の目的を持った製剤とすることが出来る。また本発明における子宮頸管拡張器としてはラミナリア · ジャポニカなどの植物の他に従来用いられている合成樹脂（吸水性樹脂であるか熱可塑性樹脂であるか，水の膨潤 ·不膨濶性、基体がスポンジ伏であるか繊維質であるかなどを問わない）や高分子吸収体からなる拡張器の他に、当該目的に使用出来る物であれば特に材質、形状は問わない。インタ一ロイキン- 8および M C A Fの配合量は、投与対象たる女性の年齢、生殖器管の状態、例えば卵巣機能の状態、子宮内膜の肥厚の程度や体の健康状態により異なるが、例えば l p g〜： L O m g / k g、好ましくは 1 0 O p g ~ 1 m g / K g、さらに好ましくは 1 n g〜 1 0 g / k gであるが、この範囲に特に限定されず目的とする薬理効果を発揮するのに必要な量を配合すればよい。また、その他の白血球遊走因子あるいはその誘発物質の投与量は医療担当者によって最終的には決定される。

本発明は妊娠に関連した本発明の化合物の使用を提供するものである。さらに本発明は卵子の成熟、受精卵の着床促進のための内科的、外科的および診断的処置に関連した本発明の化合物の使用を提供する。従って、本発明はヒトでは以下のように使用することが出来るが、これに限定されるものではない。

( 1 ) 例えば機能性不妊など、精子、卵子が共に異常がないにもかかわらず不妊である場合において、性交前または性交後に本発明の化合物を投与することにより卵子の発育を促進させ、且つ/あるいは受精卵の着床を促進し妊娠、受胎の向上を図る。

( 2 ) 男性、女性のどちらか、あるいは双方に不妊の原因がある場合又は原因が不明である場合の、人工授精の際に、あるいは体外受精 ·胚移植法やその変法である接合子卵管内移植や配偶子卵管内移植などのようなヒ卜体外受精の際に in V itroでの卵子の処置に、あるいは Zおよびその前後または同時に母体の膣、子宮およびその近傍に本発明の化合物を投与することで卵子の発育を促進させ、さらに受精卵の着床を促進し妊娠、受胎率を向上させる。

以上に記載した発明はヒ卜以外の動物に対して実施することもできる。つまり、インターロイキン- 8あるいは M C A Fを有効成分とする受胎促進剤を in vitro で予め採取した卵子の処置で、あるいはノおよび直接動物に投与することで卵子の発育、受精卵の着床過程における治療 ·手術 ·処置に用いることが出来る。すなわち、ゥシ、ゥマ、ブタなどの家畜、ィヌ、ネコなどのコンパニオンアニマル、ジャイアントパンダ、トラ、サイなどの野生動物において、その繁殖を目的として使用するものである。これらの動物の繁殖は、優良な家畜の食肉、乳の安価な提供、優れた性質の血統の維持、稀少動物の保護などに繫がり、人類にとって有益である。本発明の化合物は動物では以下のように使用出来るが、これに限定されるものではない。

( 1 ) 動物の性交前または性交後に本発明の化合物を投与することにより卵子を発育させ受精卵の着床を促進し妊娠、受胎立率の向上を図る。

( 2 ) 動物における人工受精あるいは体外受精の際に、母体より採取した卵子の in vi tro での処置、あるいは/および直接母体の膣又は子宮およびその近傍に本発明の化合物を投与することにより卵子の発育を促し、かつ受精卵の着床を促進し妊娠受胎の成立を促進する。

実施例

以下本発明の効果を示すために実施例を挙げる。但し、下記実施例は例示のためにのみ示すものであり、いかなる意味に於ても限定的に解釈されるものではない。なお実施例において、インタ一ロイキン— 8および M C A Fは Dr. K. Matsush imaより提供されたものを使用した（K. Matsushima, J. J. Oppenheim CYTOKINE, 1, 2 -13, 1989)。

実施例 1 インタ一ロイキン- 8による受精卵着床促進効果

受精卵着床におけるィンターロイキン- 8の効果を観察するためにラットを用いて以下の実験を行った。

( 1 ) 方法

実験は 1 4匹の Wi ster cl eanラッ卜（雌、 1 0週令）を 7匹づっ A, B 群の 2群に分けて行った。 A 群（インターロイキン- 8投与群）の雌 1匹づっをケージに収容した後、 Wister cleanラッ卜の雄 1匹づっをそれぞれのケージに同居させた。毎朝交尾の有無を膣スメァ検査で確認し、交尾が確認されたら雌雄を別居させた。交尾確認後の雌に直ちにィンターロイキン- 8を 1 0 g Z O . 2 ml 生理食塩水で腹腔内に投与し 1 0日間観察した。 1 0日目に雌を剖検し妊娠胎児数を算ぇた。 B 群（コントロール群）の雌 1匹づっをケージに収容した後、 Wister clean ラッ卜の雄 1匹づっをそれぞれのケージに同居させた。毎朝交尾の有無を膣スメァ検査で確認し、交尾が確認されたら雌雄を別居させた。交尾確認後の雌に直ちに生理食塩水 0.2 mlを腹腔内に投与し 1 0日間観察した。 1 0日目に雌を剖検し妊娠胎児数を算えた。

(2) 結果

ラットは双角子宮を持ち、一般的な雌一匹当たりの妊娠胎児数は 9〜 1 1匹前後である。 A 群の妊娠胎児数は 1 2± 0. 6匹で、 B 群のそれは 1 0± 1.4匹となりインターロイキン- 8投与群で妊娠胎児数の増加が見られた（P< 0. 068) 。 A群と B群のヒストグラムを図 1に示す。インターロイキン— 8投与群では 1 例をのぞき他の個体では母体 1匹あたり 1 2匹以上の胎児を受胎し明らかな受胎率の向上が認められた。また、インタ一ロイキン- 8の投与により流産を示したラットはいなかった。実施例 2 ラットを用いたインターロイキン- 8投与による組織学的変化の観察子宮内膜へのインターロイキン- 8の効果を組織学的に観察するためにラッ卜を用いて以下の実験を行った。

(1) 方法

実験は 6匹の Wister cleanラット（雌、 1 0週令）を 3匹づっ A, B の 2群に分けて行った。 A 群（インターロイキン- 8投与群）には腹腔内にィンターロイキン - 8を 1 O ig/0.2 ml 生理食塩水で注入し、 1 2時間後に子宮、子宮内膜の状態を観察した。さらに、これらを 1 0%中性緩衝ホルマリンで固定後、へマトキシリンェォジン染色を施し顕微鏡下で組織学的変化を観察した。 B 群（コント口一ル群）の各個体には同様に生理的食塩水のみを 0.2 m l腹腔内に注入し、 1 2時間後に子宮、子宮内膜の伏態を観察した。さらに、これらを 1 0%中性緩衝ホルマリンで固定後、へマトキシリンェォジン染色を施し顕微鏡下で組織学的変化を観察した。

(2) 結果

A 群の子宮内膜は著明に膨化し水腫状になり、さらに内膜の肥厚が認められた。これはヒ卜における受精卵着床時の内膜の状態に類似していた。一方、 B 群（コントロール群）では内膜の膨化、肥厚といった所見は見られなかった。実施例 3 インターロイキン- 8投与ゥサギでの子宮内膜の組織学的変化の観子宮内膜へのィンターロイキン- 8の効果を組織学的に観察するためにゥサギを用いて以下の実験を行った。

(1) 方法

6羽のニュージーランドホワイトゥサギ（雌、体重 3 k g) を 3羽づっ A，B の 2群に分けて行った。 A群（インターロイキン- 8投与群）には 50°Cで溶解したウイテプゾ一ル W35 (ミツバ） 100〃1 に l〃 gのインターロイキン- 8を添加、十分に撹拌混合に坐薬用のコンテナ一に入れ、 4°Cにて冷蔵し固化した坐薬をゥサギ膣内に連日 3日間挿入した。 4日目に剖検を行い摘出子宮を肉眼観察、さらに 10%中性緩衝フオルマリンにて固定後、作成した組織切片をへマトキシリンェォジン染色し顕微鏡下で組織学的変化を観察した。 B群（コントロール群）には A群と同様に作成した基剤のみより成る坐剤をゥサギ膣内に挿入、同様の方法で剖検ならびに組織学的観察を行った。

(2) 結果

実施例 2と同様に、 A群での子宮内膜は著明に膨化、水腫状となり子宮内膜の肥厚が認められた。坐薬という形式の投与でも子宮内膜に受精卵着床時に類似した変化を誘発することが可能であることが示された。一方、 B群（コントロール群）ではこれらの変化は全く見られなかった。実施例 4 ラッ卜での MC A Fによる組織学的変化の観察実験

ラッ卜子宮内膜への MC A Fによる組織学的変化を観察するため以下の実験を行った。

( 1 ) 方法

実験は 6匹の Wister cleanラット（雌、 10週令）を 3匹づっ A, B の 2群に分けて行った。 A 群（MC AF投与群）には腹腔内に MC AFを 10 n g/0.2 ml 生理食塩水で注入し、 12時間後に子宮、子宮内膜の状態を観察した。さらに、これらを 10%中性緩衝ホルマリンで固定後、へマ卜キシリンェォジン染色を施し顕微鏡下で組織学的変化を観察した。 B 群（コン卜ロール群）の各個体には同様に生理的食塩水のみを 0.2 m l腹腔内に注入し、 1 2時間後に子宮、子宮内膜の状態を観察した。さらに、これらを 1 0%中性緩衝ホルマリンで固定後、へマトキシリンェォジン染色を施し顕微鏡下で組織学的変化を観察した。

(2) 結果

A 群の子宮内膜は著明に膨化し水腫状になり、さらに内膜の肥厚が認められた。これはヒ卜における受精卵着床時の内膜の状態に類似していた。一方、 B 群（コン卜ロール群）では内膜の膨化、肥厚といった所見は見られなかった。実施例 5 卵巣の卵母細胞発育に及ぼすインタ一ロイキン- 8の作用（in vivo 投与）

(1) 方法

未成熟の 27日〜 28日齢 Wister clean ラット 1 2匹に妊馬血清性性線刺激ホノレモン (PMSG = pregnant mare serum gonadotropin, Sigma, St. Louis, Mo ) を 1 5国際単位を投与し、ついでその 48時間後に 1 5国際単位のヒト胎盤性性線朿 [|激ホノレモン ( hCG = human chorionic gonadotropin, Sigma, St. Louis, M o ) もしくは 1 7 /z g のインターロイキン- 8を腹腔内投与する事を基本条件として実験を行った。 hCG もしくはインタ一ロイキン- 8投与後、経時的に卵巣を摘出し 3. 5%パラホルムアルデヒド（PH 7.4) で 24時間固定した。アルコール上昇系列で脱水、パラフィンに包埋、厚さ 4 の切片を作成、脱パラフィン、親水化後へマ卜キシリンェォジン染色を行い顕微鏡下で減数分裂の核ステージおよびグラーフ卵胞（ Graafian follicle )中の卵丘- 卵母細胞複合体 cumulus oocyte complex ) fe察した ₀ 減数分裂の再開 (resumption of mei osis )は個々の卵母細胞の卵核（ germinal vesicle ) の欠落で判定した。

(2) 結果

.摘出卵巣の最大直径部分の切片像を図 2に示す。 h C G投与前の正常なグラーフ卵胞中の全ての卵母細胞は正常な卵核を保有していた（図 2A) 。 h C G投与 1 0時間後には卵核は消失し、大多数の卵細胞は第 1次極体を押し出していた ( extrude ：)。図 2 Bに示したように hCG 投与によってラッ卜の卵胞は著しく発達する事は対照に比べれば明らかである。これは、従来からよく知られている成績に良く一致している。一方、 h CGに代え、インターロイキン- 8を投与しても h C Gに匹敵する卵胞の発育が認められた（図 2 C) 。 h CG投与による卵核の崩壊は 72%であり、インターロイキン- 8投与による卵核の崩壊は 54%であつた。

さらに、 h CGあるいはインターロイキン- 8投与後の卵母細胞の数および卵核の崩壊数の経時的変化を表 1および表 2に示す。

すなわち、インタ一ロイキン- 8には h C Gに匹敵する卵子を成熟させる効果があり、成熟卵胞内で減数分裂を再開させ、卵核を崩壊させ、第 1減数分裂中期、後期、終期を経て第 1極体を放出させ第 2減数分裂中期から第 2次減数分裂休止期に至らせる効果が明らかに認められた。実施例 6 卵丘- 卵母細胞複合体膨張（ cumulus- oocyte complex expansion ) に及ぼすインターロイキン- 8の in vitro での作用

(1) 方法

PMS G投与 48時間後のラッ卜から卵巣を摘出、個々のグラーフ卵胞から穿刺により卵丘- 卵母細胞複合体を取り出し、イーグルの Minimum Essential edi um (MEM, Nissui Pharmaceutical Co. Ltd. , Japan )ίこ分散させ、さら iこマイク口ピぺッ卜でこれらを採取し蒸発を防ぐために表面をシリコンオイル（Aldrich Chemicals Co. USA ) で覆った 50；(1の MEM 中に移した。培養は血清非添加の培地中で 5%炭酸ガス一 9 5%空気のもと 37°Cで 2 0時間行った。インターロイキン- 8添加量は 1 0 Ong/ml とした。

(2) 結果

血清が存在すると卵丘- 卵母細胞複合体は in vitro培養を 20時間も行うと卵丘膨張（ cumulus expansion ：)が生ずる。一方、血清が存在しないと卵丘膨張反応は生じないことが知られており本実験でもそれが再現された。この血清の存在しない状態にィンターロイキン- 8を添加して培養したところ卵丘膨張あるいは粘液分泌が誘発された。即ち、インタ一ロイキン- 8は卵丘- 卵母細胞に直接作用し効果を発現することが明らかになった。実施例 7 インタ一ロイキン- 8の卵巣組織および卵巣細胞における分布卵巣におけるィンターロイキン- 8の分布および産生部位を明らかにするために組織および細胞レベルでの免疫組織染色を行った。

(1) 方法

linster cleanラットより卵巣を摘出し実施例 5記載の方法により厚さ 4 m の連続切片を作成した。本切片をポリクローナルラットインターロイキン- 8ゥ

6 サギ抗体（10mg/ml ) と一晚、 4 °Cでインキュベーションした。ついで、同切片をリン酸緩衝食塩水（pH 7. 2、以下 P B Sと略す）で 5回洗浄し、 1 0 0倍希釈したフルォレツセィンィソチオシァネート結合ゥサギィムノグロプリン G と共に 2 3 °C、 3時間、遮光下でインキュベーションした。切片を再度、 P B Sで洗浄後、グリセリン- P B S ( 1 ： 1、 v/v ) で封入し蛍光顕微鏡（Axiophoto, Car 1 Zeiss, Germany) で観察した。

一方、顆粒細胞および卵胞膜間質細胞の調製は Li, Y-Xらの方法（Li，Y- X. et al. , Mol . Cel l . Endocrinol. , 54, 221, 1987) に従って行った。以下、概略を記す。 2 8ゲージ皮下注射針で目的の卵胞を穿刺し、内容物を MEM 培地中に取り出した。卵丘- 卵子を含まない顆粒膜細胞を遠心操作により集めた。残った卵巣を同針で充分に穿刺し、数回洗浄を繰り返して残った顆粒膜細胞を除去した。その後、卵巣組織を 0 . 0 8 %コラゲナーゼで 3 7 °C、 5分間ィンキュベーシヨンした。解離してきた細胞を捨て、卵巣組織フラグメントをさらに 0 . 4%コラゲナ一ゼ溶液で 3 7 °C、 1時間インキュベーション、卵胞膜間質細胞を採取した。これらの細胞を 5 %ゥシ胎児血清を含む M E M培地に 1 0万個/ ml で分散させ、 4穴のラブテクチャンバ一（Nunk, Napervi l le, IL) にまき 5 %炭酸ガスインキュべ一ター中で培養を開始した。 2 4時間後に培地を血清を含まない新しいものに変え、さらに 4 8時間培養後に上記の免疫抗体染色を行った。

( 2 ) 結果

インターロイキン- 8は排卵前および排卵時の卵巣において卵胞膜細胞に分布していた。 h C G投与により染色強度は増加した。卵胞中のインターロイキン- 8 の分布は明確ではなかった。卵胞の発達に伴い、発達卵胞の卵胞膜細胞層にインタ一ロイキン- 8の分布が局在して染め出されてきた。ラッ卜の未成熟卵巣でィンターロイキン- 8が産生されているか否かを卵胞膜細胞を血清非存在下で培養た。その結果、培養上清中にラッ卜インターロイキン- 8が含まれていること力く ELISA および SDS- PAGEで確認された。細胞レベルでの検討の結果、インタ一ロイキン一 8は細胞質に特に多く局在していた。

以上の成績は卵子の正常な発育の過程において卵巣内での内因性 I L— 8が重要な役割を果たしていることおよび内因性 I L一 8の産生細胞として卵胞膜細胞 (theca cel l s)が有力な候補であることを明らかに示している。産業上の利用可能性

本発明により、白血球遊走因子の受胎促進作用が明らかになった。卵子成熟、卵胞発育作用にとどまらず、受精卵の子宮内膜への着床促進作用を有することから、ヒトおよび動物の不妊治療、人工授精に関連した医薬および使用方法としての有用性が示された。

8

Claims

請求の範囲

1 . 白血球遊走因子あるいはその誘発物質を有効成分とする受胎促進剤。

2 . 白血球遊走因子がインターロイキン- 8もしくは単球遊走活性因子である請求の範囲第 1項記載の受胎促進剤。

3 . 白血球遊走因子誘発物質がィンターロイキン一 1、腫瘍壊死因子、インタフェロン 7、血小板活性化因子、もしくはエンドトキシンである請求の範囲第 1項記載の受胎促進剤。

4 . 受胎促進が未受精卵成熟促進および/または受精卵着床促進であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の受胎促進剤。

5 . 未受精卵または受精卵がヒ卜由来である請求の範囲第 4項記載の受胎促進剤。

6 . 未受精卵または受精卵がヒト以外の動物由来である請求の範囲第 4項記載の受胎促進剤。

7 . 白血球遊走因子あるいはその誘発物質の有効量を薬理学的に許容される担体中に含む、受胎を促進するための組成物。

8 . 不妊患者に有効量の白血球遊走因子あるいはその誘発物質を投与することからなる、受胎を促進する方法。