WO1996005324A1

WO1996005324A1 - Procede de detection et trousse de diagnostic in vitro d'une predisposition a l'infarctus de myocarde

Info

Publication number: WO1996005324A1
Application number: PCT/FR1995/001065
Authority: WO
Inventors: Florent Soubrier; François CAMBIEN; Laurence Tirat
Original assignee: Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date: 1994-08-09
Filing date: 1995-08-08
Publication date: 1996-02-22
Also published as: FR2723590B1; FR2723590A1

Abstract

Procédé de détection in vitro d'une prédisposition à l'infarctus du myocarde caractérisé en ce qu'il met en ÷uvre simultanément la détection de deux marqueurs différents et corrélés: un polymorphisme Insertion/Délétion dans le gène de l'enzyme de convertion de l'angiotensine I; un polymorphisme du gène codant pour récepteur de l'angiotensin II de type AT1 au niveau de la position 1166 de la partie codante dudit gène.

Description

PROCEDE DE DETECTION ET TROUSSE DE DIAGNOSTIC IN VITRO D'UNE PREDISPOSITION A L'INFARCTUS DU MYOCARDE

La présente invention résulte de la découverte d'un effet synergique sur le risque d'infarctus du myocarde (IM) chez l'homme de la présence simultanée d'une part du génotype DD dans le gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 1 peptidyl dipeptidase A, EC3-4-15-1-2 (ACE) et d'autre part la présence d'une mutation ponctuelle en position 1166 de la partie codante du gène du récepteur de type 1 de l'angiotensine 2 (AT1 ) L'infarctus du myocarde chez l'homme résulte de multiples facteurs dont l'athérosclérose coronarienne, favorisée par les dyslipidémies et le tabagisme, la survenue de phénomènes thrombotiques locaux et la survenue d'un spasme coronarien Ces différents aspects physio-pathologiques sont mis en jeu par des facteurs génétiques et environnementaux Les facteurs environnementaux ont été parfaitement démontrés par la baisse de la fréquence des accidents coronariens grâce à des campagnes de prévention et par les études de populations transplantées Les facteurs génétiques ont également été caractérisés par les études familiales qui ont montré l'augmentation du risque relatif lié aux antécédents familiaux d'infarctus du myocarde

Génotype du gène de I'ACE et risque d'IM

Une première étude génétique a montré des corrélations significatives pour le taux de I'ACE (enzyme de conversion de l'angiotensine) entre sujets apparentés d'une même famille, c'est-à-dire entre parents et enfants et entre les enfants eux-mêmes

Les différences intenπdividuelles dans la concentration plasmatique en ACE sont déterminées en partie génétiquement (3, 4, 5, 6) , Des études de ségrégation suggèrent qu'environ 50% de la variabilité interindividuelle du niveau plasmatique d'ACE est attπbuable à un polymorphisme d'un gène majeur, supposé être un polymorphisme du gène de I'ACE S/s comme on le verra plus

Après que le gène de I'ACE ait été clone (7) un polymorphisme lié à la présence (insertion, I) ou à l'absence (délétion, D) d'un fragment de 287 paires de bases dans l'intron 16 du gène de I'ACE a été identifié (8) L'allèle délétion (D) est associé de façon co-dominante avec un niveau d'immunoréactivité (4) et d'activité (5,6) de I'ACE plasmatique et cellulaire plus élevé, c'est-à-dire que les niveaux d'ACE sont plus élevés chez les homozygotes pour l'allèle D que chez les homozygotes pour l'allèle I, et sont intermédiaires chez les hétérozygotes

A partir des données de l'analyse combinée de ségrégation et de liaison, il est proposé que le polymorphisme ACE/ID est probablement un marqueur neutre en déséquilibre de liaison avec un autre variant fonctionnel au sein du gène responsable des variations d'expression du gène (5)

Une étude récente ECTIM (Etude Cas Témoin de l'Infarctus du Myocarde), étude multicentπque, a été conçue pour identifier les variants de gènes candidats à la cause de la prédisposition de l'infarctus du myocarde Depuis l'étude originale de CAMBIEN et al (9), montrant l'association entre le génotype DD et l'infarctus du myocarde, certaines études (10 à 13) ont confirmé l'implication du polymorphisme ACE l/D dans la prédisposition aux maladies cardio-vasculaires alors que d'autres (14, 15) l'ont infirmée

Le taux plasmatique de I'ACE et le polymorphisme ACE l/D sur le risque d'infarctus du myocarde ont été testés par régression logistique ajustée sur la population , les deux variables ont été testées séparément du fait de l'importante corrélation qui existe entre elles , dans un groupe d'individus dont l'âge est inférieur à 55 ans, le niveau plasmatique d'ACE était une bonne prédiction d'infarctus du myocarde alors que le polymorphisme ACE l/D ne l'était pas La situation opposée a été observée dans le groupe d'âges supérieur à 55 ans le polymorphisme ACE l/D était lié au risque alors que le taux plasmatique d'ACE ne l'était pas

Une conséquence de ces deux observations opposées est que le polymorphisme ACE l/D est seulement faiblement associé avec le risque d'infarctus du myocarde dans la population totale

Génotype du gène de l'AT1 et risque d'IM

Le récepteur de l'angiotensine II qui intervient dans l'action de vasoconstriction du système rénine-angiotensine, représente également un candidat intéressant comme facteur génétique à l'infarctus du myocarde Deux sous-types de récepteurs membranaires ont été identifiés AT1 et AT2 (16) Chez l'homme le récepteur AT1 de l'angiotensine II est présent essentiellement dans les vaisseaux des cellules musculaires lisses et le récepteur AT2 est présent dans l'utérus, le cerveau et la moelle osseuse La stucture du gène du récepteur AT1 de l'angiotensine II a été décrite (17,18) La totalité des actions démontrées de l'angiotensine II dans le système rénine-angiotensine sont exercées via le récepteur AT1 Le cDNA codant pour l'AT1 humain a été clone (17) et un polymorphisme situé dans la région 3' non traduite a été identifié correspondant à une transversion de base de l'adénine vers la cytosine (A=>C) en position 1166 (19), cette position étant définie, selon la numérotation de Furuta et al (18) comme 1166 lème nucléotide suivant le codon d'initiation ATG du récepteur AT1 de l'angiotensine II, autrement dit de la partie codante du gène L'identification de cette mutation ponctuelle et de son lien éventuel avec un risque d'hypertension artérielle a été réalisée par une succession de 3 étapes a) une amplification par PCR du gène de l'AT1 en utilisant 8 couples d'oligonucleotides comme amorces d'amplification de fragments d'environ 300 paires de base, b) une détection des mutations par la technique SSCP ( pour Single Strand Confirmation Polymorphism) (20) c) un séquençage direct des produits d'amplification par PCR Le rôle physiologique du récepteur AT1 suggère que des variants du gène de l'AT1 pourraient être candidats également comme facteur de risque à l'infarctus du myocarde

Interaction entre le polymorphisme l/D de I'ACE et celui de la position 1166 de la partie codante du gène du récepteur AT1 de l'angiotensine

Dans la population collectée, dans l'étude ECTIM, le génotype et la fréquence allé que du polymorphisme de l'AT1 ne diffèrent pas entre les patients ayant présenté un infarctus du myocarde et les populations contrôles, dans ces deux populations la fréquence de l'allèle ¹166c de l'AT1 étant de 0,69/0,31 versus 0 71/0 29 respectivement

Cependant une interaction significative (P<0 05) a été détectée entre I'ACE et le polymorphisme de l'AT1 sur les risques de l'infarctus du myocarde , en particulier l'association entre le génotype ACE/DD et l'infarctus du myocarde apparaît restreinte à des sujets porteurs de l'allèle AT1/^{1 1}66c avec un effet marque de dosage d'alléle

Le tableau 1 ci-dessous représente l'analyse statistique de l'association entre l'infarctus du myocarde et le génotype ACE/DD en fonction du génotype AT1 par analyse de régression multiple , la première ligne de ce tableau concerne les résultats obtenus sur une population rassemblant tout les sujets La deuxième ligne représente les résultats obtenus dans le groupe à bas risque et la troisième ligne ceux obtenus dans le groupe à haut risque La population participant à l'étude ECTIM a été décrite dans (21 ) brièvement les cas d'infarctus du myocarde ont été recrutés entre 1989 et 1991 à partir de registres Monica à Belfast (Irlande), à Lille (France), Strasbourg (France) Toulouse (France) Des hommes âgés entre 25 et 64 ans ayant survécu à u infarctus du myocarde ont été recrutés trois à neuf mois après leur infarctus , l groupe contrôle a été obtenu à partir de listes électorales en France et e Irlande Afin d'augmenter l'homogénéité ethnique des familles de patients et d contrôles, ces familles doivent avoir résidé dans la même région pendant a moins deux générations et leur quatre grands-parents doivent être nés e Europe ou dans une entité historique de l'Ulster Tous les participants sont de Européens blancs Le nombre de patients avec infarctus du myocarde et dan les contrôles inclus dans ces analyses ont été respectivement 201 et 180 d Belfast, 65 et 148 de Lille, 203 et 189 de Strasbourg, et 144 et 206 de Toulouse Le polymorphisme ACE l/D a été analysé par amplification de l'ADN telle qu décrite dans (22) Le polymorphisme de l'AT1 1 166 =>C a été analysé par la méthod d'hybridation par oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO) selon le techniques décrites dans le chapitre Matériels et Méthodes ci-dessous

Tableau 1 : Distribution des Génotypes ACE dans les cas et les contrôles en fonction du génotype AT1 et du risque potentiel.

AT1 génotype

AA AC CC Cas Contrôles Cas Contrôles Cas Contrôles

Génotype ACE Tous sujets

DD 86 108 99 86 14 5

ID + II 197 247 187 233 30 44 ratios de Odds^* 1.05 (0.75 - 1.49) 1.52 (1.06 -2.18) 3.95(1.26-12.37)

Groupes à bas risques#

DD 13 30 21 14 5 3

ID+II 22 68 19 62 1 8 ratios de Odds^* 1.64 (0.68 - 3.92) 7.03 (2.61 - 18.98) 13.33-

Groupes à hauts risques#

DD 73 78 78 72 9 2

ID+II 175 179 168 171 29 36 ratios de Odds^* 1.01 (0.69 - 1 49) 1.16 (0,78 - 1.72) 5.59-

* « Odds Ratios » calculés en fonction de la population et de l'âge (Intervalle de confiance de 95% entre parenthèses)

# Sujets avec BMI < 26Kg m^-2 , niveau d' ApoB < 125mg dl^_1 , et non traités avec des médicaments hypolipidémiquant

- Test de Fisher exact, p=0.005

-§ Sujets qui ne sont pas dans le groupe à "bas-risque"

Les résultats ci-dessus montrent que dans la population dans son ensemble le « Odds Ratio » (qui donne une idée du risque relatif), entre le génotype ACE/DD et l'infarctus du myocarde varie de 1.05 chez les sujets ne portant pas l'allèle AT1/^{1 166}C à 1.52 (p=0,02) chez les hétérozygotes pour cet allèle à 3.95 (p=0,02) chez les homozygotes. Dans chaque génotype, l'association est homogène entre les différentes populations.

Dans la mesure où II a été montré que le polymorphisme ACE est important dans les populations considérées comme à bas risque selon les critères classiques, l'analyse a été répétée dans les deux groupes à risque comme définies dans (9) , toujours dans le tableau 1 et dans la ligne du groupe à haut risque, l'association entre le génotype ACE/DD et l'IM est présent seulement chez les sujets homozygotes pour l'allèle AT1/^{1 166}C (odds ratio de 5,59, p=0.05) Dans le groupe à bas risque, l'interaction est encore plus marquée, les ratios de odds pour l'IM associé avec le génotype ACE/DD variant de 1 ,64 dans les non porteurs de l'allèle AT1/^{1 166}C à 7,03 (p>10^-4) chez les hétérozygotes et 13,33 (p=005) chez les homozygotes.

Etant donnée l'interaction très forte observée dans le groupe à bas risque trouvée ci-dessus, il a été examiné si cette interaction était présente dans les différentes populations de l'étude ECTIM. Dans trois des quatres populations citées ci-dessus l'effet du génotype ACE/DD sur le risque de IM est considérablement augmenté chez les porteurs de l'allèle AT1/1166Q comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous qui représente la distribution du génotype ACE chez les patients (cas) et dans le groupe contrôle de différentes populations à bas risque en fonction du génotype AT1

Tableau 2 : Distribution de génotypes ACE concernant les cas et contrôles des différentes populations du groupe à "bas-risques", en fonction du génotype AT1

Belfast Lille Strasbourg Toulouse Tous sujets

Cas/ Contrôles Cas/Contrôles Cas/Contrôles Cas/Contrôles CasContrôles

Génotype Génotype AT1 = AA ACE

DD 2 10 1 7 4 5 6 8 13 30 ID + II 8 11 1 14 7 15 6 28 22 68 Odds ratios 0.28 2.00 1.71 3.50 1.64(0.68-3.92)

*

Génotype AT1 = AC + CC

DD 11 3 5 5 6 2 4 7 26 17 ID+II 8 28 0 13 7 10 5 19 20 70 Odds ratios 12.83 § x — 4.29 2.17 7.02(2.88-17.07)

*

* « Odds Ratio » calculés en fonction de la population et de l'âge (Intervalle de confiance de 95% entre parenthèses) § Test de Fisher exact, p<0.005 - Test de Fisher exact, p=0.007

En dépit de fluctuations dans l'amplitude des odds ratio aucune hétérogénéité significative n'a été détectée dans les populations et les odds ratios combinés chez les porteurs de l'allèle AT1/^{1 166}C a été estimée à 7,02 (p>10"⁴).Ce type d'analyse a été confirmée après l'exclusion de Lille du fait d'un odds ratio infini estimé dans cette population.

Dans les contrôles du groupe à haut risque, il y a un déficit inattendu et significatif des sujets simultanément homozygotes pour l'ACE/DD et pour l'allèle ATi/1166c et ce déficit a été observé dans toutes les populations et une des hypothèses de ce déficit pourrait être que le risque est tellement grand que les individus concernés auraient déjà développé la maladie sinon même seraient morts de cette maladie. L'association déjà trouvée entre le polymorphisme ACEI/D et une histoire parentale de l'IM (2) a été réexaminée à la lumière des résultats ECTIM ci- dessus, les résultats étant donnés dans le tableau 3 ci-après représentant la distribution du génotype ACE en fonction de l'histoire parentale des infarctus du myocarde en fonction du génotype AT1 la colonne de gauche représentant le génotype sauvage et la colonne de droite le mélange d'hétérozygotes et d'homozygotes CC

Tableau 3 : Distribution des génotypes ACE en fonction de l'historique parental de l'infarctus du myocarde fatal dans les contrôles pat le génotype AT1.

Génotype AT1

AA AC+CC Histoire parentale Histoire parentale

Génotype ACE OUI NON OUI NON

DD 16 91 15 73

ID 20 144 24 171

11 6 58 5 63

^*Odds Ratio

DD/II 2 22 (0 78 - 6 30) 3 62 (1 16 -11 29) § ID/II 1 81 (0 66 - 4 96) 2 05 (0,71 -5 90)

^* « Odds Ratio » calculés en fonction de la population et de l'âge (Intervalle de confiance de 95% entre parenthèses) § p<0 03

Le odds ratio entre le génotype ACE/DD et l'histoire parentale semble être plus élevé dans le groupe contrôle portant l'allèle AT1/1166Q q_ue dans _ceux q_{UI ne} |_e portent pas (3,62 versus 2 05), cette différence n'étant pas très significative Cependant II doit être souligné que la dilution des gènes entre les générations au niveau de deux loci induit une diminution considérable de la sensibilité de la méthode comparée à l'étude ECTIM citée ci-dessus et dont les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 qui est une approche directe

Si sur le plan phénotypique on sait que l'allèle D de I'ACE est associé à une augmentation du taux plasmatique de I'ACE dans le plasma et dans certaines cellules, aucun phénotype de l'AT1 n'a pu être associé avec la présence de l'allèle ^{1 1}6⁶C Dans la mesure où le polymorphisme du gène de l'AT1 n'a pas d'effet direct sur le risque d'IM mais module le risque relatif conféré par l'allèle D de I'ACE, ces études permettent de conclure que l'allèle AT1/¹166c est associée avec une réponse modifiée du récepteur AT1 à l'angiotensine II Ces deux modifications génétiques peuvent donc entraîner un déséquilibre et c'est cette synergie entre ces deux types de mutation qui altérerait la régulation du gène de l'AT1 en réponse à la stimulation par l'angiotensine II, cette dernière hormone pouvant être synthétisée de façon accrue en présence du génotype D du gène de I'ACE

Description de l'invention

L'invention résulte de la découverte de l'interaction du génotype ACE/DD et de l'allèle AT1/^{1 1}^C dans la prédisposition à l'infarctus du myocarde chez l'homme et met en oeuvre son application dans le diagnostic ou le pronostic de cette prédisposition La présente invention est donc relative à un procédé de détection m vitro dans le plasma ou dans les cellules d'une prédisposition à l'infarctus du myocarde et caractérisé en ce qu'il met en oeuvre simultanément la détection de deux marqueurs génétiques différents et corrélés - un polymorphisme Insertion/Délétion dans le gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et,

- un polymorphisme du gène du récepteur de l'angiotensine II

Simultanément signifie dans la présente invention que le résultat de la détection n'est analysé qu'après obtention de chaque résultat de polymorphisme cité ci- dessus et quel que soit le moment de la réalisation d'une des détections Le procédé de détection selon l'invention est caractérisé en ce que

- la détection du polymorphisme du récepteur de l'AT1 est réalisée par la détection du génotype en position 1166 de la partie codante du gène de l'AT1 , comme il était montré dans les différentes études citées plus haut c'est cette transmission et uniquement celle-ci qui est corrélée avec le génotype de I'ACE l/D dans la prédisposition à l'infarctus du myocarde La détection du polymorphisme ACE l/D est réalisée par les technique aujourd'hui classiques de biologie moléculaire par amplification d'ADN d préférence par la technique PCR telle que décrite dans la référence (7)

L'étude de la transversion de A => C en position 1166 du gène de l'AT est réalisée par la succession d'étapes suivantes .

- amplification enzymatique du gène AT1 , réalisée notamment par l méthode PCR, utilisant un couple d'amorces permettant l'amplification d'un région contenant le nucleotide 1166 de la région codante du gène de l'AT1

- l'hybridation spécifique d'allèles (ASO) Le cas échéant, d'autres type de technologie peuvent être utilisées la détection par SSCP (pour "Singl

Strand Conformation Polymorphism" ou "polymorphisme conformationnel simpl chaîne") suivi d'un séquençage directe des variants électrophorétiques U exemple particulier de toutes ces techniques est décrit dans le chapitre Matériel et Méthodes ci-dessous La demande de brevet PCT/FR92/00574 décrit des fragments d'AD comprenant au moins 8 nucléotides contenus dans, bordant ou extérieurs L'insertion comprise entre les nucléotides 1451-1738 de l'intron 16 de I'ACE, e des paires de ces fragments utilisables dans une amplification PCR de la régio d'insertion sont également décrits Le texte de cette demande PCT est incorpor dans la présente demande par référence, ainsi que les couple d'oligonucleotides utilisables dans une amplification PCR

Dans l'hybridation spécifique d'allèle, l'oligonucléotide utilisé a un longueur de 10 à 40 nucléotides incluant naturellement la position 1166 du gène , un oligonucleotide préfère est un oligonucléotide de 15 mer dans lequel le nucleotide 1166 polymorphe est au centre, et dont la séquence est la suivante AATGAGCATTAGCTA pour l'allèle sauvage et ATTGAGCÇTTAGCTA pour l'allèle mute

Le génotype est ensuite identifié par hybridation spécifique de chacun des allèles Ces sondes doivent être marquées soit par un procédé radioactif (phosphore 32, phosphore 33, souffre 35, éventuellement tntium) ou non radioactif tel que le système ECL pour la détection par chemolumminescence (Amersham) ou encore le système de marquage à la digoxigéπine commercialisé par Boehπnger La révélation de l'hybridation est réalisée en accord avec le type de marquage utilise Font également partie de l'invention les trousses de diagnostic in vitro d'une prédisposition à l'infarctus du myocarde chez l'homme comprenant au moins - un couple d'amorces d'amplification par PCR spécifique de la région d'insertion ou de délétion comprise entre les nucléotides 1451 et 1738 du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine,

- un couple d'amorces spécifiques permettant d'amplifier un fragment de 120 paires de base du gène l'AT1 , un exemple de ce couple d'amorces pouvant être le suivant 5' AGGAGAAATGTTCCAAGGGACAA 3' et 5' GTATTCCATGTGAAACAGCTCCA 3',

- une sonde spécifique de l'allèle sauvage constituée de 10 à 40 nucléotides et dont un exemple particulier peut être l'oligo-nucléotide suivant AATGAGCATTAGCTA et dans lequel le A représente la base en position 1166,

- une sonde spécifique de l'allèle mutant dont la longueur est la même que celle de l'allèle sauvage et dans lequel le A en position centrale tel que souligné est remplacé par un C de la façon suivante CCTGCGCÇTTAGCTC Chacune de ces sondes doit être marquée pour détecter l'hybridation soit par marquage froid (différentes méthodes existant) ou radioactif

La trousse peut comprendre en outre tout les réactifs nécessaires d'une part à l'amplification génique et d'autre part à l'hybridation moléculaire de type

ASO , mais l'expérimentateur peut également utiliser tout réactif habituellement utilisé au laboratoire

L'invention est également relative à l'utilisation d'une trousse de diagnostic pour l'évaluation d'une prédisposition génétique à l'infarctus du myocarde chez l'homme

Une fois cette double détection et analyse génotypique réalisées, le médecin prescripteur pourra prescrire les mesures requises spécifiques pour la prévention du risque d'infarctus du myocarde , certains médicaments efficaces tels les inhibiteurs d'ACE ou les bloquants du récepteur de l'angiotensine II sont déjà disponibles

L'utilisation de tels médicaments pour prévenir ou traiter les incidents cardio- vasculaires touchant les personnes ayant simultanément l'homozygotie pour l'allèle ACE/DD et l'allèle AT1/^{1 166}C fait partie de l'invention

Les exemples suivants de mise en oeuvre du procédé de l'invention et de l'utilisation de la trousse de diagnostic de l'invention permettront d'illustrer l'invention sans lui donner de caractère limitatif

Exemple 1 Analyse génotypique du gène de I'ACE et de son polymorphisme Insertion/Délétion L'ADN génomique est préparée à partir de cellules blanches du sang par extraction phenolique et l'analyse génotypique du polymorphisme ACE l/D est réalisée comme décrite dans (8) et la demande de brevet PCT/FR92/10574.

En particulier, un couple d'amorces qui permet d'amplifier les séquences de I'ACE est :

5' CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT 3' et 5' GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT 3', Exemple 2 : Détermination du génotype 1166 a) Amplification enzymatique des segments du gène A partir de la structure génomique connue du gène du récepteur AT1 (18) une amplification enzymatique de la région transcrite en 3' a été réalisée en utilisant 50 ng d'ADN dans un volume total de 25 μl contenant 50 mM de KCL, 5 iτiM de tris-HCI (PH8.3), 0,01 de gélatine, 1 ,5 de MgCI , 50 μM de dNTP, 10 pM de chacune des amorces, 0,5 unités de Taq polymérase (Boerhinger, Mannheim). Les amorces utilisées sont AATGCTTGTAGCCAAAGTCACCT et TTCATACTCATTCAAGGTAGTCT. b) hybridation par un oligonucléotique spécifique d'allèle (ASO)

Après amplification enzymatique du DNA, les produits de PCR sont dénaturés dans 04M NAOH, 25mM EDTA, puis déposés en double sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham, France) neutralisés dans 3 M d'acétate de sodium (pH5.5) et fixés à la lumière ultra-violette. Chaque membrane est ensuite hybridée de 3' à 16 heures dans du polyéthylène glycol 7%, SDS10% avec des sondes oligonucléoditiques de 15 paires de base marquées avec du γ-32p ATP. Ces sondes sont : pour le polymorphisme à ^{1 166}A=>C AATGAGCATTAGCTA et

AATGAGCCTTAGCTA, correspondant à la séquence de l'allèle 1166 sauvage et mutant. Les membranes sont ensuite lavées deux fois à température ambiante dans 2X SSC, 0,1% SDS, et à 42°C et 46°C pour respectivement les sondes 1166 A sauvage ou ^{1 1}^⁶C mutante. Exemple 3 : Analyse génotypique des allèles CA du récepteur AT1.

L'analyse génotypique du récepteur AT1 est établie par amplification enzymatique d'un fragment de 120 paires de base comprenant une répétition du nucleotide hautement informative dans la région en 3' du gène du récepteur. Les amorces sont les suivantes : 5'-AGGAGAAATGTTCCAAGGGACAA-3', 5'-GTATTCCATGTGAAACAGCTCCA-3' et la PCR est réalisée avec 50ng d'ADN génomique dans un volume total de 25μl contenant 50 mM de KCI, 5mM de tris-HCL pH 8.3, 0,01 % de gélatine, 1 ,5 mM MgCI2, 50μM de dNTP, 10 pM de chaque amorce, et 0,5 Unités de taq polymérase (Boerhinger, Mannheim). Après une étape initiale de denaturation de 4mn à 94°C, 30 cycles de PCR successivement à 94°C pendant 20s et 56°c pendant 30° ont été réalisés. Ensuite 50μl de formamide ont été ajoutés à chacune des réactions et après denaturation à 94°C pendant 4mn, 5μl sont chargés sur un gel de polyacrylamide de 6% contenant 7M durée. L'électrophorèse a été réalisé à 60 watts pendant 4 heures et les autoradiographies pendant 15h.

REFERENCES

(1) Roncaglioni MC, Santoro LS, D'Avanzo B, et al Rôle of family history in

5 patients with myocardial mfarction An Ita an case-control study Circulation , 85_ 2065-2072 (1992)

(2) Marenberg ME, Risch N, Berkman LF, Floderus B, de Faire U Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twms

10 N Engl J Med , 330.(13) 1041 -1046 (1994)

(3) Cambien F, Alhenc-Gelas F, Herbeth B et al Familial resemblance of plasma angiotensm-converting enzyme level the Nancy study Am J Hum Genêt , 43 774-780 (1988)

15

(4) Rigat B Hubert C, Alheπc-Gelas F et al An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin l-convertιng enzyme gène accouting for half the vanance of sérum enzyme levels J Clin Invest , 86 1343-1346 (1990)

20 (5) Tiret L Rigat B Visvikis S et al Evidence from combined ségrégation an nkage analysis that a variant of the angiotensin l-convertιng enzyme (ACE) gène controls plasma ACE Am J Hum Genêt , 51 197-205 (1992)

(6) Costerousse O Allegπni J, Lopez M, Alhenc-Gelas F Angiotensin I- 25 converting enzyme in human circulating mononuclear cells genetic polymorphism of expression in T lymphocytes Biochem J , 290 33-40 (1993)

(7) Soubπer F, Alheπc-Gelas F, Hubert C et al Two putative active centers in human angiotensin l-convertιng enzyme revealed by molecular cloning Proc

30 Natn Acad Sci USA , 85 9386- 9390 (1988)

(8) Rigat B Hubert C, Corvol P, Soubπer F PCR détection of the insertion/deletion polymorphism In the human angiotensin converting enzyme gène Nucleic Acids Res , 20 1433 (1992) j.">

(9) Cambien, F et al Nature , 359 641-644 (1992)

(10) Evans, A E ét al Quat J Med , 87 21 1 -214 (1994) (11) Ohishi, M ét al Nature Genetics , 5 324-325 51993)

(12) Ludwmg, E H et al Circulation , 88 (suppl ), I-364 (1993)

(13) Bohn, M , Berge, K E , Bakken, A , Eπkssen, J & Berg, K Clin Genêt , 44 298-301 (1993)

(14) Bohn, M , Berge, K E , Bakken, A , Eπkssen, J & Berg, K Clin Genêt , 44 292-297 (1993)

(15) Kreutz, R et al Circulation , 88 (Suppl ), 1-510 (1993)

(16) Chiu AT, Herblm WF, Me Call DE, Ardeck RJ, Caπni DJ Duncia JV, Pease LJ, Wong PC, Wexier RR, Johnson AL, Timmermans PBMWM Identification of angiotensin II receptor subtypes Biochem Biophys Res Commun , 165 196- 203 (1989)

(17) Takayanagi R, Ohnaka K, Sakai Y, Nakao R, Yanase T, Haji M, Inagami T, Furuta H, Gou D-F, Nakamuta M, Nawata H Molecular cloning, séquence analysis and expression of a cDNA encoding human type-1 angiotensin II receptor Biochem Biophys Res Commun , 183 910-916 (1992)

(18) Furuta H, Deng-Fu G, Inagami T Molecular cloning and sequencing of the gène encoding human angiotensin II type I receptor Biochem Biophys Res

Commun , 183 8-13 (1992)

(19) Bonnardeau, A, Davies, E , Jeunemaitre, X Fery, l , Charru, A ,Clauser, E , Tiret, L , Cambien, F , Corvol, P , Soubπer, F Angiotensin II type I receptor gène polymorphisms m human essential hypertension Hypertension , 24 63-69 (1994)

(20) Oπta M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T Détection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as smgle-strand conformation polymorphisms Proc Natl Acad Sci USA , 86 2766-2770 (1989)

(21 ) Parra, H J ét al Arteπosc Thromb 12 701-707, (1992) (22) Tiret, L. et AL. Lancet. 341 •^' 991-992 (1993).

Claims

Revendications :

1. Procédé de détection in vitro d'une prédisposition à l'infarctus du myocarde caractérisé en ce qu'il met en oeuvre simultanément la détection de deux

; marqueurs différents et corrélés :

- un polymorphisme Insertion/Délétion dans le gène de l'enzyme de convertion de l'angiotensine I.

- un polymorphisme du gène codant pour récepteur de l'angiotensine II de type AT1.

2. Procédé selon le revendication 1 caractérisé en ce que la détection du polymorphisme du gène de l'AT1 est réalisée par la détection de la transversion A=>C en position 1166 à partir de l'ATG initiateur de l'ARN messager de l'AT1.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le polymorphisme ACE l/D est analysé par amplification d'ADN, notamment par la technique PCR, et la transversion A= C en position 1166 par amplification enzymatique de type PCR suivie par une hybridation avec un oligonucléotide spécifique d'allèle dont la séquence comprend 10 à 40 nucléotides incluant la position 1166 de la partie codante du gène de l'AT1.

4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'oligonucléotide spécifique d'allèle a l'une des séquences suivantes : AATGAGCATTAGCTA, ou AATGAGCÇTTAGCTA, le A et le C soulignés correspondant à la position 1166 dont la transition A=>C est recherchée.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'amplification enzymatique du gène de l'AT1 est réalisée en utilisant une paire d'amorces permettant l'amplification d'une région contenant le nucleotide 1166 de la région codante du gène de I7VT1.

6. Trousse de diagnostic in vitro d'une prédisposition à l'infarctus du myocarde chez l'homme comprenant au moins :

- une couple d'amorces d'amplification enzymatique spécifique de la région d'insertion/délétion du gène de l'enzyme de convertion de l'angiotensine (ACE),

- un couple d'amorces d'amplification enzymatique d'une région contenant le nucleotide 1166 de la partie codante du gène de l'AT - une sonde spécifique de l'allèle sauvage ou mutant dont la séquence comprend 10 à 40 nucléotides incluant la position 1166 de la partie codante du gène de l'AT1.

7. Trousse de diagnostic selon la revendication 6 caractérisée en ce que le couple d'amorces utilisé pour l'amplification enzymatique de l'AT1 est : 5' AGGAGAAATGTTCCAAGGGACAA 3" et 5' GTATTCCATGTGAAACAGCTCCA 3' et la sonde spécifique de l'allèle sauvage ou mutant a la séquence suivante : AATGAGCATTAGCTA pour le sauvage et AATGAGCCTTAGCTA pour le mutant en position 1166 de la région codante du gène du récepteur AT1.

8. Trousse de diagnostic selon la revendication 6 caractérisée en ce que le couple d'amorces utilisé pour l'amplification enzymatique de I'ACE est : 5' CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3'et 5' GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3",

9. Trousse selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que l'oligonucléotide spécifique d'allèle est marqué, notamment par un marqueur radioactif, enzymatique ou colorimétrique.

10. Trousse selon l'une des revendications 6 à 9 caractérisée en ce que le couple d'amorces utilisé pour l'amplification du gène AT1 est constitué des amorces 5' AATGCTTGTAGCCAAAGTCACCT 3' et 5' TTCATACTCATTCAAGGTAGTCT 3",

11. Utilisation d'une trousse de diagnostic selon l'une des revendications 6 à 10 pour le diagnostic du risque d'un infarctus du myocarde chez l'homme.