WO1996004374A1 - Oligonucleotide reconnaissant une sequence d'acide nucleique a structure non lineaire, application a des fins therapeutiques et procede de preparation - Google Patents

Oligonucleotide reconnaissant une sequence d'acide nucleique a structure non lineaire, application a des fins therapeutiques et procede de preparation Download PDF

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WO1996004374A1
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oligonucleotide
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target sequence
oligonucleotides
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PCT/FR1995/001036
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Jean-Jacques Toulme
Rakesh Mishra
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Iserm)
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    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the present invention relates to oligonucleotide compounds, their applications, in particular for therapeutic purposes and a process for their preparation.
  • an oligonucleotide with a portion of a target nucleic acid can block an important biological process in which this nucleic acid, RNA or DNA, is engaged.
  • This so-called antisense strategy can make it possible to selectively regulate the expression of any gene whose primary sequence is known.
  • the association between the two sequences, antisense and target is based on the formation of a double-stranded structure involving base pairs Adenine-Thymine (Uracil) and Guanine-Cytosine through hydrogen bonds called "Watson-Crick".
  • the success of this approach depends in part on the accessibility of the targeted sequence, that is to say on its availability to engage the hydrogen bonds with the complementary sequence.
  • single-stranded nucleic acids in particular RNAs, adopt, as a result of complex folding, secondary or tertiary structures which can considerably weaken or even render inoperative the traditional antisense oligonucleotides, that is to say targeted on a single sequence strand. If the sequence targeted by the antisense oligonucleotide is involved in such structures, intramolecular folds compete with the association of the oligonucleotide with its target.
  • single-stranded, messenger, pre-messenger or viral RNAs can adopt, under defined environmental conditions, folded structures locally leading to complex conformations.
  • Hair pins and pseudo-knots are examples of such three-dimensional structures.
  • oligonucleotides Besides the so-called antisense approach, another application of oligonucleotides is based on DNA-protein recognition. In this approach, the oligonucleotide plays the role of protein trap, in particular transcription factors, according to unknown DNA-protein interaction modes. Techniques for selecting oligonucleotides recognizing a given peptide structure have been developed under various names: "SELEX” (1990, Science, 249, 505), “APTAMERES” (1990, Science, 250, 1104 and 1149), and “PET” (1992, TIBTECH, 10, 87). In these methods, a very large library of all possible random DNA sequences is generated by chemical synthesis.
  • sequences are screened through a column or a filter linked to the ligand (affinity chromatography) and this first selection makes it possible to retain a certain number of sequences having the desired good affinity.
  • This mixture is then amplified by PCR and the cycle is repeated. The successive stages of selection and amplification result in an exponential enrichment of the sequences having the desired function, until the predominance of the sequence having the strongest affinity.
  • This technique allows, in a first step, the selection of one or more oligonucleotide fragments which have good affinity with respect to the ligand and in a second step, these oligonucleotides are studied for their biological properties (inhibition, enzymatic activity).
  • oligonucleotide which does not necessarily take into account Watson-Crick type interactions (antisense approach) or Hoogsteen type (“triple helix” approach), that is to say the sequence is not necessarily deduced from the primary sequence of the target, has never been proposed.
  • the present invention relates to oligonucleotides which are not directed against a linear nucleic acid sequence but which take into account local non-linear structures, in particular the three-dimensional conformations of the target.
  • the subject of the present invention is an oligonucleotide called "Aptastruc", characterized in that it has an affinity for a target nucleic acid sequence DNA or RNA with non-linear structure.
  • affinity is understood here to mean that the oligonucleotide Aptastruc forms a stable complex with the target sequence. Affinity for the target can be determined by any known means: - either by a reduction in electrophoretic mobility, the complex migrating slower than the free target,
  • the oligonucleotide Aptastruc being retained in the column on a phase grafted with the target structure, - or by UV absorption spectrophotometry.
  • the dissociation of the complexes formed by nucleic acids is accompanied by an increase in absorbance at 260nm.
  • the recording of this parameter as a function of the temperature leads to melting curves characterized by an inflection point at a so-called half-transition temperature (Tm) when one is in the presence of a complex.
  • Tm half-transition temperature
  • oligonucleotides according to the present invention are not deduced from the primary sequence of the target according to the Watson-Crick or Hoogsteen pairing rules, but are selected by affinity, within a population generated at least in part by random synthesis. and conventional amplification techniques which make it possible, after cloning and sequencing, to identify so-called Aptastruc oligonucleotides, that is to say oligonucleotides capable of recognizing a non-linear structure.
  • the present invention in fact relates to the targeting of regions of nucleic acids with non-linear structure by oligonucleotides recognizing these regions obtained according to a two-step process: a) production of a population of oligonucleotides of sequences at least in part random, and b) selection by affinity within this population, of oligonucleotides capable of recognizing the region of non-linear structure.
  • the Aptastrucs oligonucleotides thus selected are then amplified, then clones and sequences.
  • An Aptastruc oligonucleotide according to the invention is therefore an oligonucleotide which interacts specifically with a non-linear structure.
  • the way in which it is obtained takes into account the three-dimensional peculiarities of the target without the sequence of the oligonucleotide Aptastruc being able to be predicted rationally taking into account current knowledge of the structures of nucleic acids.
  • the association between Aptastruc and its target involves elementary physicochemical interactions (hydrogen bonds, stacks) between nucleic bases, of the two partners. These complexes can possibly involve interactions not yet identified in the natural nucleic acid structures known to date.
  • the oligonucleotide Aptastruc according to the invention is characterized in that it comprises a nucleic base sequence which does not allow canonical interaction with the target sequence and that it forms a complex with said target sequence.
  • canonical interactions is understood here to mean the interactions involved in the formation of Watson-Crick type base pairs or of pyrimidine base triplets.
  • Purine Pyrimidine or Purine.
  • Purine Pyrimidine involving hydrogen bonds called Hoogsteen.
  • complex is understood to mean that the oligonucleotide according to the invention forms a complex which is sufficiently stable with the target sequence to present in particular reduced electrophoretic mobility on polyacrylamide gel under non-denaturing conditions when it is brought into contact with the target sequence.
  • the complexation according to the present invention can involve intramolecular hydrogen bonds between nucleic bases possibly very distant in the primary sequence. These hydrogen bonds can be unconventional, that is to say be formed between base pairs other than A-T (U) or G-C.
  • the structures in which they are involved may be of a type not identified to date.
  • existing conformational calculus methods may be unable to predict them.
  • the oligonucleotide according to the invention may optionally also contain a short sequence complementary to the target sequence called “anchor" which makes it possible to promote interaction and improve the kinetics of association in the selection process according to the invention: most of the complete sequence of the oligonucleotide being a sequence which does not allow canonical interaction.
  • the oligonucleotide according to the present invention may include a sequence complementary to a part of said linear single-stranded fragment of the target and the rest of the sequence - constituting its major part, in particular at least 70% - is a sequence which does not allow a canonical interaction with the target sequence.
  • the oligonucleotide forms a more stable complex with the target sequence than the complex formed by an oligonucleotide consisting of the only complementary sequence of said single-stranded fragment with a linear structure, with the same target sequence.
  • the comparison of the stability of the complexes formed by the two oligonucleotides (the oligonucleotide Aptastruc and the oligonucleotide complementary to the linear fragment) with the target sequence can be determined by measuring their half-transition temperature.
  • the sequence of the oligonucleotide Aptastruc is partly complementary to the sequence of said single-stranded region.
  • hairpin is understood here to mean a sequence comprising a non-self-paired loop, framed by 5 ′ and 3 ′ fragments which are paired with one another.
  • an Aptastruc oligonucleotide according to the invention comprises from 15 to 50 nucleotides.
  • the oligonucleotide can comprise a sequence complementary to the target sequence, it comprises in particular a fragment of 0 to 10 nucleotides complementary to a single-stranded region of the target sequence, which is coupled to a fragment of 10 to 35 non-complementary nucleotides of the primary sequence of the target sequence.
  • the association between the oligonucleotide Aptastruc and the target structure can inhibit a biological process: translation of an mRNA, maturation of a pre-RNA, reverse transcription of a retroviral RNA.
  • the Aptastruc / structure complex can prevent: a) the binding of a protein or an enzyme to the structure, b) the interaction or progression of a macromolecular complex, responsible for decrypting the genetic information carried by the target , or c) the transition of the structure from an X form to a Y form (signal).
  • the oligonucleotide Aptastruc can constitute a means of controlling the development of this pathogen.
  • the subject of the present invention is in particular an oligonucleotide, characterized in that the target sequence is a sequence with a non-linear structure of a DNA or RNA nucleic acid which controls the expression of a gene applied in human or animal pathology, and in that it allows the blocking of the development of a virus, a bacterium or a parasite.
  • An oligonucleotide according to the invention therefore constitutes a medicament, in particular anti-viral, anti-bacterial or anti-parasitic.
  • the Aptastrucs oligonucleotides can be conventional oligonucleotides obtained by synthesis or generated in situ by transcription of the appropriate sequence placed downstream of an appropriate promoter, or synthetic oligonucleotides chemically modified in particular on the phosphodiester backbone ( phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, methyl phosphonate bond), on sugar (2'-0-alkyl) or on the nucleoside in particular of anomerism ⁇ .
  • the Aptastrucs oligonucleotides can be active vectors such as ribozymes, or oligonucleotides conjugated to chemical groups capable of inducing cleavages or bypasses on the target.
  • nuclease-resistant Aptastrucs oligonucleotides are preferably used.
  • the initial production and selection process remains unchanged: a) synthesis of a population of ⁇ -phosphodiester oligonucleotides, b) selection by affinity for the target structure, c) cloning and sequencing.
  • the Aptastruc oligonucleotide Once the Aptastruc oligonucleotide has been identified, it can then be synthesized and used in ribo or deoxyribonucleotide series or even comprising any chemical modification capable of giving it an advantage over conventional oligomers, for example of the phosphorothioate or 2′-0 type. -methyl according to known methods.
  • An advantage of the Aptastrucs oligonucleotides therefore lies in the fact that no prior structural knowledge is in principle required both from the point of view of the target sequence and from the point of view of the oligonucleotide.
  • the present invention allows the selection of oligodeoxynucleotides directed against reasons essential to the development of a virus, in particular the Human Immunodeficiency virus.
  • the targets can be constituted by the PBS site (Primer Binding Site) on which the initiation of the cDNA copy is carried out before integration on the one hand and by an element of the retroviral genome before packaging on the other hand.
  • RNA elements can be defined on the basis of data from the literature.
  • the mini-exon sequence of the trypanosomatids In the protozoan parasites of the family of the trypanosomatids all the messenger RNAs begin with a single motif, 39 nucleotides in length, the mini-exon sequence. This sequence, acquired during a particular maturation process plays an essential role during splicing and translation. In leishmanias this mini-exon sequence adopts a hairpin structure which weakens the effect of conventional antisense oligonucleotides, that is to say complementary to the open pin. Indeed, the energy balance of the formation of the complex takes into account the energy to be supplied to break the base pairs of the rod of the pin.
  • an Aptastruc oligonucleotide recognizing this structure of the mini-exon sequence can stabilize the pin.
  • ribosomes have a limited capacity to break down secondary structures and decode the message.
  • the Aptastruc oligonucleotide attached to the mini-exon pin can block the translation of mRNAs and therefore the development of the parasite.
  • this sequence plays a key role during splicing.
  • an Aptastruc oligonucleotide attached to the mini-exon can block the maturation of messengers. All of these effects on the production of mature mRNA and on protein synthesis therefore make this oligonucleotide Aptastruc a leishmanicide molecule.
  • Certain leishmaniases are cutaneous or mucocutaneous in nature. Lesions and parasites are external, that is to say, accessible to light.
  • the Aptastruc Once the Aptastruc has been identified, it can be linked to a photosensitizer (psoralen group) during synthesis, thus generating a photoactivatable Aptastruc oligonucleotide which can be more effective than the unmodified Aptastruc oligonucleotide, since it is capable of definitively inactivating the target.
  • the oligonucleotide Aptastruc can be linked to cleavage agents of the metal complex type capable of producing cleavages by different mechanisms.
  • the regulation of gene expression in the human immunodeficiency retrovirus is ensured in particular by the binding of a protein called TAT on a particular sequence: the TAR sequence.
  • TAT a protein called TAT on a particular sequence: the TAR sequence.
  • This sequence is structured in the form of an imperfect pin, certain bases of the stem not being paired.
  • the position of the TAR nucleic bases interacting with the TAT protein was determined by systematic point mutation.
  • the key elements for the TAT-TAR interaction are known and it is known that in certain positions the substitution of one nucleic base by another (or its deletion) abolish the formation of the complex and consequently disturb the expression of retrovirus genes that depend on TAT.
  • the TAR structure can be interacted with an Aptastruc oligonucleotide.
  • the formation of the TAR-Aptastruc complex can disturb the binding of the TAT protein and therefore disturb the synthesis of viral proteins which depend on TAT.
  • the anti-TAR oligonucleotide Aptastruc can therefore constitute an anti-HIV molecule.
  • Other structures side effects have been identified in the HIV genome, particularly in the reverse transcription initiation (PBS) region. Under certain conditions, reverse transcriptase can be stopped by fixing an oligonucleotide. An anti-PBS Aptastruc oligonucleotide can therefore act as an inhibitor of reverse transcriptase. 3.
  • PBS reverse transcription initiation
  • IRE Iron Responsive Element
  • the IRE motif is a sequence which intervenes in the control of the expression of the ferritin and transferrin genes. We can fold this IRE sequence in the form of a hairpin. Located 5 'from the ferritin message, it modulates the level of translation of the ferritin mRNA; placed 3 'to the transferrin mRNA, it regulates its life time.
  • the element IRE is specifically recognized by a protein factor.
  • oligonucleotide Aptastruc and the wild-type gene can moreover be supplemented during the same operation: once the aptastruc sequence has been identified, a construction can be carried out placing this aptastruc downstream of an adequate promoter, leading, after transfection, to the in situ production of an Aptastruc oligoribonucleotide.
  • the present invention also relates to a process for the in vitro selection of an Aptastruc oligonucleotide, characterized in that: a) a population of candidate oligonucleotides of random sequences is prepared, b) this population of candidate oligonucleotides is placed in the presence of the target sequence, the candidates being in excess, preferably in large excess, relative to the target sequence, c ) the oligonucleotides which form a stable complex with the target sequence are isolated, d) the nucleic acid samples isolated in step c) are amplified, e) steps b) and c) are repeated several times, in particular repeats said steps from 1 to 30 times.
  • a population of oligonucleotides of random sequences is synthesized at random by simultaneous introduction of the four nucleotides for each position.
  • the mixture of candidates is brought into contact with the target sequence under conditions which impose competition between oligonucleotides for association with it.
  • the stable complexes formed can be isolated by affinity chromatography, by electrophoresis under non-denaturing conditions or even by retention on a nitro-cellulose filter.
  • the target sequence then eliminated and the candidates selected during a first cycle can be amplified by chain polymerization (PCR) using commercial Taq polymerase.
  • a second generation of candidates is then in turn subjected to the same selection-amplification process under the same conditions. This operation can be repeated x times (1 ⁇ x ⁇ 30).
  • the enrichment of the population is periodically evaluated in particular in terms of average affinity for the target, determined in a relative manner in particular by delayed mobility on electrophoresis gel. Following these x selection cycles, the candidates are cloned into an appropriate vector, of commercial origin and propagated in competent bacteria. Once the plasmids have been purified, the inserts will be sequenced.
  • the method according to the invention comprises the following steps: a) a population of candidate oligonucleotides having 5 'to 3' is prepared:
  • this population of candidate oligonucleotides is placed in the presence of the target sequence, and of a so-called selector oligonucleotide, said selector oligonucleotide being complementary to part of said first fragment, and the candidate and selector oligonucleotides being in excess relative to the target sequence, c) the sample of nucleic acids obtained in step b) is subjected to a step of digestion with an enzyme having as substrate the hybridization complex formed by the selector oligonucleotide and the part of said first strand of which it is complementary, so that the candidates having an affinity for the target sequence remain intact and the others after association with the selector are cut, d) primers 1 and 2 complementary to the 3 'and 5' ends of the candidate oligonucleotides are added respectively, said ends corresponding to said first and second restriction sites, e) an enzymatic a
  • This method has the advantage of avoiding an isolation step by separation of the oligonucleotides obtained after each selection / amplification cycle of steps b) to e).
  • FIG. 1 represents the sequences of the target nucleic acid fragment, of the candidate oligonucleotides, of the selector oligonucleotide, of primers 1 and 2 and of 3 aptastruc C 1 , C 2 and C 3 oligonucleotides described in the following example.
  • the selector binding site on the candidate oligonucleotides is highlighted and the site for attaching the candidates to the target is underlined.
  • the Sacl site used for the selection is framed.
  • the candidate variable region is indicated by ... NNN ... where N is A, C, G or T.
  • Figure 2 describes the diagram of the selection - amplification process.
  • FIG. 3 represents a hypothetical diagram of a possible double hairpin structure resulting from the formation of a complex between a target hairpin sequence and an Aptastruc oligonucleotide according to the present invention.
  • FIG. 4 represents an gel for analysis by electrophoresis of candidate oligonucleotides in the absence of the target sequence (see 1 to 3) or in the presence of the hairpin target sequence (see 4 to 6).
  • FIG. 5 represents hairpin target sequence fusion curves in the absence (O) or in the presence of the oligonucleotide Aptastruc C 3 (•).
  • the oligonucleotide concentrations were 0.7 ⁇ M in a 50 mM Tris buffer, HC1, pH 6 and 10 mM MgCl 2 .
  • the UV absorbance was recorded at 260 nm as a function of the temperature from 15 ° C.
  • the selection method according to the present invention was applied to a target sequence of about fifty nucleotides long.
  • This sequence is capable of folding back to give rise to a pin comprising: a) a loop of 8 nucleotides and, b) a rod formed of 13 paired base pairs.
  • This rod comprises on the upstream branch (5 ') a series of 10 purines (Pu) and of course, the downstream branch (3') comprises 10 pyrimidines (Py).
  • a series of six purines is located in a single strand portion at the base of the stem. This single stranded region is close to the 5 'end of the oligonucleotide. The six purines immediately precede the upstream branch.
  • Candidates 45 nucleotides long therefore have a fixed part on the 5 'side comprising a binding site for the primer used in PCR, a restriction site for the enzyme Sac I, and ten pyrimidines whose sequence is partly complementary of six single strand purines.
  • This 5 ′ fixed part is followed by a region of random composition of 16 bases and then by a 3 ′ fixed part comprising the binding site for the second PCR primer (FIG. 1).
  • the selection of candidates involves a selector oligonucleotide. The association of a candidate and the selector leads to the formation of a restriction site.
  • This restriction site is placed in such a way that the candidates fixed on the target structure cannot associate with the selector and are therefore protected from the action of Sac I. At the end of the selection, the candidates not associated with the target have therefore lost the 5 ′ primer attachment site and are therefore not amplified (FIG. 2). It is demonstrated that the Py-Pu structure of the target sequence can form a stable complex with an oligopyrimidine 26 nucleotides long. This oligopyrimidine forms, in its 5 ′ part, 6 Watson-Crick base pairs with the purine region in single strand of the Py-Pu pin of the target sequence. According to one hypothesis, the 3 ′ part of oligopyrimidine folds back to interact with the double strand comprising 16 purines. The whole constitutes a double pin complex (diagram 1, Figure 3) which can block chemical alkylation or digestion of the Py-Pu pin by the enzyme Rsa I which has a site near the loop.
  • primers 1 and 2 respectively complementary to the ends of the "candidates” and a selector.
  • This selector oligonucleotide forms, after attachment to the complementary part of the candidates, a restriction site for the enzyme Sac I.
  • Sac I The selector binding site is placed so that it is inaccessible when a candidate oligonucleotide is hybridized to the Py-Pu structure.
  • Ten clones were chosen at random and the sequence of the selected candidates was established. These candidates all have sequences which do not make it possible to predict an interaction with the target via Watson-Crick pairings or Hoogsteen bonds (direct or reverse). Three of the selected candidates were chemically synthesized and tested for their affinity for the Py-Pu pin which was used to select them. The variable region of 16 nucleotides of three of these candidates was determined. These sequences: 5 'TAC GAA CGT AGG CTAG, 5' ACC ATT GTG T GGGGTG and 5 'GAAC TAT AA CGT GG CA do not allow to propose a structure for complexes involving known interactions.
  • the oligonucleotides Ci , C 2 and C 3 of 26 nucleotides composed of the fixed motif of 10 pyrimidines followed on the 3 'side of one of the variable regions of 16 nucleotides determined above were synthesized ( Figure 1). Their interaction with the target structure was followed by electrophoresis on polyacrylamide gel under non-denaturing conditions ( Figure 3) and by thermal denaturation curve. The transition curves of FIG. 4 indicate a hyperchromism associated with the destruction of the C 3 - target complex by raising the temperature. A similar experiment was carried out with the hexamere 5 'CTCCCT.
  • a restriction site (Rsa 1) was placed in the stem of the Py-Pu pin, in the immediate vicinity of the loop (diagram 2, Figure 3).
  • the three candidates Ci, C 2 and C 3 prevent the action of Rsa 1 (These oligonucleotides have no effect on the activity of the enzyme on other sites).
  • oligonucleotides and enzymes The oligodeoxynucleotides were synthesized on an automated synthesizer, Millipore 7500 implementing synthetic chemistry with phophoramidite. A population of "candidate" oligonucleotides was prepared by introducing into the synthesizer a stoichiometric mixture of the four syn thons (A, T, G and C) at each of the positions of the sequence. All the oligonucleotides were purified in one step by HPLC on a reverse phase column eluted with a 0-50% acetonitrile gradient in a 100 mM ammonium acetate buffer, pH 7.
  • the oligonucleotides were analyzed by gel electrophoresis polyacrylamide / urea, after labeling at the 5 'end with [ 2 P] ⁇ ATP (HOTBq / mmol, NEN) and the T4 polynucleotide kinase, according to conventional protocols.
  • the polynucleotide kinase and the restriction enzyme Sac1 were obtained from Promega.
  • Taq polymerase was obtained from Stehelin et Cie.
  • the association between the hairpin target and the selected candidates was followed and visualized by gel electrophoresis under non-denaturing conditions.
  • the population of “candidate” oligonucleotides labeled at the 5 ′ end was mixed with an excess of target sequences (in excess of a factor of 10) in an acetate buffer, 50 mM Tris pH 6 containing 10 mM MgCl 2 . They were loaded onto a 15% polyacrylamide gel in the same buffer and exposed to 12 mA for 16 hours at 4 ° C.
  • the oligonucleotide complexes were also characterized by recording the melting curves followed by UV absorption.
  • a candidate / target mixture (1/1) (0.7 ⁇ M each) in a Tris 50 mM HC1 pH 6 buffer containing 10 mM MgCl 2 , placed in a quartz cell, with an optical path of 1 cm.
  • the assembly is arranged in a thermostatically controlled rack controlled by a HUBER controller. The temperature is raised by 0.5 ° C per minute while the absorbance is recorded at 260 nm.
  • the sequences of the target oligonucleotides, candidates and selectors are given in FIG. 1.
  • the mixture containing 33 nM of target and 16.6 ⁇ M of selector and candidates is heated for 5 minutes at 75 "C in a 50 mM Tris acetate buffer pH 6 containing 10 mM MgCl 2.
  • the mixture of oligonucleotides is then brought back to room temperature and placed on ice for at least 30 minutes After adding 20 units of Sacl enzyme the samples are incubated for 20 hours at 21 ° C. After digestion , the DNA is precipitated and redissolved in 10 ⁇ l of H 2 0 for amplification.
  • the DNA was amplified with Taq polymerase (0.25 ⁇ l) in the buffer provided with the enzyme in 50 ⁇ l of mixture of reaction containing 0.4 mM of each of the four NTPs and 1 ⁇ M of each primer After denaturation (10 minutes at 95 ° C) the enzyme is added and the amplification is carried out for 30 cycles (10 seconds at 95 ° C, 30 seconds rehybridization at 40 ° C, 30 seconds
  • the amplified mixture is precipitated with 60 ⁇ l of ethanol following the addition of 15 ⁇ l of 10 M ammonium acetate.
  • the precipitate is recovered by centrifugation on a micro-centrifuge, then washed with ethanol. 70% and dissolved in water for a second amplification step. This is carried out under the same conditions, except that only the primer 1 is then used.
  • the target structure used here was a DNA hairpin shown in FIG. 1 comprising a loop of 8 nucleotides and a rod formed of 13 base pairs. This stem is flanked on the upstream branch 5 ′ of a series of 10 bases comprising a sequence of 6 purines adjacent to the stem.
  • the selection of candidate oligonucleotides exhibiting an affinity for the target involves the use of a selector oligonucleotide which, after binding to a candidate, generates a SacI restriction site.
  • the 5 'GAGCTC sequence recognized by the enzyme is located in the sequence of the candidate oligonucleotide in such a position that the association of the target with the candidate prevents the binding of the selector and the cleavage of the candidate's 5' terminal part. by Sacl.
  • Sacl As the region corresponds to the binding site of one of the primers used for the PCR reaction, only the candidate oligonucleotides protected from digestion by Sac1, that is to say, bound to the target, are available for amplification ( Figure 2).
  • the candidates selected by SacI digestion are then amplified in two stages (see Material and Method above) to generate a population of candidates enriched in sequences recognizing the target structure. This mixture is used for a second selection cycle. Four identical selection cycles are carried out successively, at the end of which the selected candidates are cloned in the plasmid pUC19. DNA is extracted from the recombinant clones and the inserts are sequenced. Sequences of the 16 base region corresponding to the random fragments of three candidates are given below: 5 'TAC GAA CGT AGG CTA G 5' ACC ATT GTG TGG GGT G 5 'GAA CTA TAA CGT GGC A
  • oligonucleotides C ⁇ , C 2 and C 3 of the sequences identified above were synthesized chemically on an automatic synthesizer, and their ability to bind to the DNA target was studied (Figure 1). These oligonucleotides were designed by binding of the 16-mer sequences selected via the 5 'conserved motif CTCCCTTTTT capable of forming six base pairs with the 3' end of the target. As shown in Figure 3, each of the three candidates gave rise to a reduced mobility band on polyacrylamide gel after being mixed with the target sequence and subjected to electrophoresis on polyacrylamide gel under non-denaturing conditions. This reduced mobility indicates the formation of candidate / target stable hybrids under temperature (4 ° C) and ionic (50 mM Tris, 10 mM Mg2 +) conditions used for these experiments.
  • the melting curves of these complexes were also analyzed by UV absorption.
  • the target sequence alone has a half-hybridization temperature (Tm) of around 72 ° C corresponding to the unfolded hairpin structure.
  • Tm half-hybridization temperature
  • the melting curve still exhibited a high transition temperature.
  • the variation in absorbance at lower temperatures indicates a behavior different from that observed with the target alone.
  • a wide transition zone with a median point around 30 "C is observed with C 3 indicating the dissociation of a limited cooperative complex (Figure 5).
  • the Py-Pu pin described in FIG. 1 was used to generate an RNA target for the aptastrucs selected according to the process previously described. In fact, it is a deleted derivative of the three base pairs CAT / GTA near the loop. This Py-Pa / ⁇ pin was inserted into the "polylinker" region of the pGEM-luc vector (PROMEGA), that is to say downstream of the SD6 promoter and of the sequence coding for luciferase. This in vitro construction and the messages thus obtained were expressed in acellular extract (wheat germs). The luciferase activity was followed by luminometry in the absence and in the presence of aptastruc oligonucleotides.
  • the HIV genome "TAR" sequence is the binding site of a viral protein (tat).
  • the tat-TAR pair is an important element for controlling the expression of retrovirus genes.
  • a ligand which binds strongly and specifically to the TAR sequence could therefore block the function ensured by the tat protein.
  • the TAR motif is made up of a structured element of an imperfect hairpin. This element was chosen as target for oligonucleotides selected in vitro, from a random population, according to the method described.

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Abstract

La présente invention a pour objet un oligonucléotide dit Aptastruc caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'acide nucléique ADN ou ARN à structure non linéaire. En particulier, il est constitué au moins en partie, d'une séquence de bases nucléiques qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible et il forme un complexe avec ladite séquence cible.

Description

"OLIGONUCLEOTIDE RECONNAISSANT UNE SEQUENCE D'ACIDE NUCLEIQUE A STRUCTURE NON LINEAIRE, APPLICATION A DES FINS THERAPEUTIQUES ET
PROCEDE DE PREPARATION"
La présente invention concerne des composés oligonucléotidiques, leurs applications, notamment à des fins thérapeutiques ainsi qu'un procédé de préparation.
L'association d'un oligonucleotide avec une portion d'un acide nucléique cible peut bloquer un processus biologique important dans lequel cet acide nucléique, ARN ou ADN, est engagé. Cette stratégie, dite antisens, peut permettre de réguler de façon sélective l'expression de tout gène dont la séquence primaire est connue. Dans cette approche devenue classique, l'association entre les deux séquences, antisens et cible, repose sur la formation de structure en double brin impliquant des paires de bases Adénine-Thymine (Uracile) et Guanine-Cytosine par le biais de liaisons hydrogènes dites de "Watson-Crick". Le succès de cette approche dépend en partie de l'accessibilité de la séquence ciblée, c'est-à-dire de sa disponibilité pour engager les liaisons hydrogènes avec la séquence complémentaire. Or les acides nucléiques monocaténaires, tout particulièrement les ARN, adoptent, par suite de repliements complexes, des structures secondaires ou tertiaires qui peuvent considérablement affaiblir ou même rendre inopérants les oligonucléotides antisens traditionnels, c'est-à-dire ciblés sur une séquence en simple brin. Si la séquence visée par l'oligonucléotide antisens est impliquée dans de telles structures les repliements intra-moléculaires entrent en compétition avec l'association de l'oligonucléotide à sa cible.
En particulier, les ARN monocaténaires, messagers, pré-messagers ou viraux peuvent adopter, dans des conditions d'environnement défini, des structures repliées conduisant localement à des conformations complexes. Les épingles à cheveux et les pseudo-noeuds constituent des exemples de telles structures tridimensionnelles.
A côté de l'approche dite antisens, une autre application des oligonucléotides est fondée sur la reconnaissance ADN-protéines. Dans cette approche l'oligonucléotide joue le rôle de piège à protéines, notamment des facteurs de transcription, selon des modes d'interaction ADN-protéine inconnus. Des techniques pour sélectionner des oligonucléotides reconnaissant une structure peptidique donnée ont été développées sous divers noms : "SELEX" ( 1990, Science, 249, 505), "APTAMERES" ( 1990, Science, 250, 1104 et 1149), et "PET" (1992, TIBTECH, 10, 87). Dans ces méthodes on génère par la synthèse chimique une bibliothèque très large de toutes les séquences aléatoires possibles d'ADN. Ces séquences sont criblées à travers une colonne ou un filtre lié au ligand (chromatographie d'affinité) et cette première sélection permet de retenir un certain nombre de séquences possédant la bonne affinité recherchée. Ce mélange est ensuite amplifié par PCR et le cycle est recommencé. Les étapes successives de sélection et d'amplification résultent en un enrichissement exponentiel des séquences possédant la fonction recherchée, jusqu'à prédominance de la séquence possédant la plus forte affinité. Cette technique permet dans une première étape, la sélection d'un ou de plusieurs fragments oligonucléotidiques qui présentent la bonne affinité vis à vis du ligand et dans une deuxième étape, ces oligonucléotides sont étudiés pour leurs propriétés biologiques (inhibition, activité enzymatique).
Le ciblage de régions d'acide nucléique à structure non linéaire par un oligonucleotide ne tenant pas nécessairement compte des interactions de type Watson-Crick (approche antisens) ou Hoogsteen (approche "triple hélice"), c'est-à-dire dont la séquence n'est pas nécessairement déduite de la séquence primaire de la cible, n'a jamais été proposé.
La présente invention concerne des oligonucléotides qui ne sont pas dirigés contre une séquence linéaire d'acide nucléique mais prennent en compte les structures locales non linéaires notamment les conformations tridimentionnelles de la cible.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un oligonucleotide dit "Aptastruc", caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'acide nucléique ADN ou ARN à structure non linéaire.
On entend ici par "affinité" le fait que l'oligonucléotide Aptastruc forme un complexe stable avec la séquence cible. L'affinité pour la cible peut être déterminée par tout moyen connu : - soit par une réduction de mobilité électrophorétique, le complexe migrant moins vite que la cible libre,
- soit par chromatographie, l'oligonucléotide Aptastruc étant retenu dans la colonne sur une phase greffée avec la structure cible, - soit par spectrophotométrie d'absorption UV. La dissociation des complexes formés par les acides nucléiques s'accompagne d'une augmentation d'absorbance à 260nm. L'enregistrement de ce paramètre en fonction de la température conduit à des courbes de fusion caractérisées par un point d'inflexion à une température dite de demi- transition (Tm) lorsqu'on se trouve en présence d'un complexe.
Les oligonucléotides, selon la présente invention ne sont pas déduits de la séquence primaire de la cible selon les règles d'appariement Watson- Crick ou Hoogsteen, mais sont sélectionnés par affinité, au sein d'une population générée au moins en partie par synthèse aléatoire et des techniques classiques d'amplification qui permettent après clonage et séquençage, d'identifier des oligonucléotides dits Aptastruc, c'est-à-dire des oligonucléotides aptes à reconnaître une structure non linéaire.
La présente invention concerne en effet le ciblage de régions d'acides nucléiques à structure non linéaire par des oligonucléotides reconnaissant ces régions obtenues selon un processus en deux étapes : a) production d'une population d'oligonucléotides de séquences au moins en partie aléatoire, et b) sélection par affinité au sein de cette population, des oligonucléotides aptes à reconnaître la région à structure non linéaire. Les oligonucléotides Aptastrucs ainsi sélectionnés sont alors amplifiés, puis clones et séquences.
Un oligonucleotide Aptastruc, selon l'invention est donc un oligonucleotide interagissant spécifiquement avec une structure non linéaire. La façon dont il est obtenu, prend en compte les particularités tridimensionnelles de la cible sans que la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc puisse être prédite de façon rationnelle compte tenu des connaissances actuelles sur les structures des acides nucléiques. En particulier, l'association entre l'Aptastruc et sa cible met en jeu des interactions physico-chimiques élémentaires (liaisons hydrogènes, empilements) entre bases nucléiques, des deux partenaires. Ces complexes peuvent éventuellement faire intervenir des interactions non encore identifiées dans les structures d'acides nucléiques naturels connues à ce jour. En particulier, l'oligonucléotide Aptastruc selon l'invention est caractérisé en ce qu'ilcomporte une séquence de bases nucléiques qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible et qu' il forme un complexe avec ladite séquence cible.
On entend ici par "interactions canoniques", les interactions mises en jeu dans la formation de paires de base du type Watson-Crick ou de triplets de bases Pyrimidine. Purine. Pyrimidine ou Purine. Purine. Pyrimidine faisant intervenir des liaisons hydrogènes dites Hoogsteen.
On entend par "complexe" que l'oligonucléotide selon l'invention forme un complexe suffisamment stable avec la séquence cible pour présenter notamment une mobilité electrophorétique réduite sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes lorsqu'il est mis en présence de la séquence cible.
La complexation selon la présente invention peut faire intervenir des liaisons hydrogènes intramoléculaires entre bases nucléiques éventuellement très éloignées dans la séquence primaire. Ces liaisons hydrogènes peuvent être non conventionnelles, c'est-à-dire être formées entre paires de bases autres que A-T(U) ou G-C. Les structures dans lesquelles elles sont impliquées peuvent être d'un type non identifié à ce jour. Enfin, les méthodes de calcul conformationnel existantes peuvent être incapables de les prédire.
L'oligonucléotide selon l'invention, peut éventuellement comporter en outre une courte séquence complémentaire de la séquence cible appelée "ancre" qui permet de favoriser l'interaction et améliorer la cinétique d'association dans le procédé de sélection selon l'invention : la majeure partie de la séquence complète de l'oligonucléotide étant une séquence qui ne permet pas d'interaction canonique.
En particulier, lorsque l'on a certaines données sur la séquence cible, notamment lorsque la séquence cible, bien que comportant une structure non linéaire, comporte également un fragment simple brin à structure linéaire adjacent à ladite structure non linéaire, l'oligonucléotide selon la présente invention peut comporter une séquence complémentaire d'une partie dudit fragment simple brin linéaire de la cible et le reste de la séquence -constituant sa majeure partie, notamment au moins 70 %- est une séquence qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible. Ainsi l'oligonucléotide forme un complexe plus stable avec la séquence cible que le complexe formé par un oligonucleotide constitué par la seule séquence complémentaire dudit fragment simple brin à structure linéaire, avec la même séquence cible.
Comme mentionné précédemment, la comparaison de la stabilité des complexes formés par les deux oligonucléotides (l'oligonucléotide Aptastruc et l'oligonucléotide complémentaire du fragment linéaire) avec la séquence cible peut être déterminée par la mesure de leur température de demi-transition.
On peut également réaliser des expériences de compétition entre les deux oligonucléotides par chromatographie ou par mobilité sur gel d'électrophorèse. Pour ce faire, on dose les quantités respectives d'oligonucléotides non retenues par la colonne de chromatographie comportant une phase greffée avec la séquence cible ou les quantités respectives d'oligonucléotides nécessaires pour ralentir la mobilité de la séquence cible sur gel d'électrophorèse.
Lorsque la séquence cible présente une structure auto- appariée en épingle à cheveux prolongée par une région simple brin non appariée, la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc est pour partie complémentaire de la séquence de ladite région simple brin. On entend ici par "épingle à cheveux" une séquence comportant une boucle non auto appariée, encadrée par des fragments 5' et 3' qui sont appariés entre eux.
De façon appropriée, un oligonucleotide Aptastruc selon l'invention comporte de 15 à 50 nucléotides. Lorsque l'oligonucléotide peut comporter une séquence complémentaire de la séquence cible, il comprend en particulier un fragment de 0 à 10 nucléotides complémentaires d'une région simple brin de la séquence cible, lequel est couplé à un fragment de 10 à 35 nucléotides non complémentaires de la séquence primaire de la séquence cible. L'association entre l'oligonucléotide Aptastruc et la structure cible peut inhiber un processus biologique : traduction d'un ARNm, maturation d*un pré-ARN, transcription inverse d'un ARN rétroviral. Le complexe Aptastruc/structure peut empêcher : a) la fixation d'une protéine ou d'une enzyme sur la structure , b) l'interaction ou la progression d'un complexe macromoléculaire, chargé de décrypter l'information génétique portée par la cible, ou c) la transition de la structure d'une forme X vers une forme Y (signal).
Si la structure cible appartient à un pathogène, l'oligonucléotide Aptastruc peut constituer un moyen de contrôler le développement de ce pathogène.
La présente invention a en particulier pour objet un oligonucleotide, caractérisé en ce que la séquence cible est une séquence à structure non linéaire d'un acide nucléique ADN ou ARN qui commande l'expression d'un gène appliqué dans une pathologie humaine ou animale, et en ce qu'il permet le blocage du développement d'un virus, d'une bactérie ou d'un parasite. Un oligonucleotide selon l'invention, constitue donc un médicament, notamment anti-viral, anti-bactérien ou anti¬ parasitaire.
D'un point de vue chimique, les oligonucléotides Aptastrucs peuvent être des oligonucléotides conventionnels obtenus par synthèse ou générés in situ par transcription de la séquence adéquate placée en aval d'un promoteur approprié, ou des oligonucléotides synthétiques chimiquement modifiés notamment sur le squelette phosphodiester (liaison phosphoramidate, phosphorothioate, phosphorodithioate, methyl phosphonate), sur le sucre (2'-0-alkyl) ou sur le nucléoside en particulier d'anomérie α. En outre, les oligonucléotides Aptastrucs peuvent être des vecteurs actifs tels que ribozymes, ou oligonucléotides conjugés à des groupements chimiques susceptibles d'induire des coupures ou des pontages sur la cible.
Pour les applications in vivo on utilise de préférence des oligonucléotides Aptastrucs résistants aux nucléases. Le processus initial de production et de sélection reste inchangé : a) synthèse d'une population d'oligonucléotides en série phosphodiester β , b) sélection par affinité pour la structure cible, c) clonage et séquençage.
Une fois l'oligonucléotide Aptastruc identifié, il peut alors être synthétisé et utilisé en série ribo ou désoxyribo-nucléotide ou même comportant toute modification chimique susceptible de lui conférer un avantage par rapport aux oligomères conventionnels, par exemple du type phosphorothioate ou 2'-0-méthyl selon des méthodes connues.
Un intérêt des oligonucléotides Aptastrucs réside donc dans le fait qu'aucune connaissance structurale préalable n'est en principe requise tant du point de vue de la séquence cible que du point de vue de l'oligonucléotide. La présente invention permet la sélection d'oligodésoxynucléotides dirigés contre des motifs essentiels au développement d'un virus, notamment du virus de l'Immunodéficience Humaine. Les cibles peuvent être constituées par le site PBS (Primer Binding Site) sur lequel est réalisé l'initiation de la copie ADNc avant intégration d'une part et par un élément du génome rétroviral avant encapsidation d'autre part.
D'autres éléments ARN fonctionnels peuvent être définis sur la base des données de la littérature.
On cite en particulier les exemples suivants. 1. La séquence mini-exon des trypanosomatidés Chez les parasites protozoaires de la famille des trypanosomatidés tous les ARN messagers commencent par un même motif, long de 39 nucléotides, la séquence mini-exon. Cette séquence, acquise lors d'un processus de maturation particulier joue un rôle essentiel lors de l'épissage et de la traduction. Chez les leishmanies cette séquence mini- exon adopte une structure en épingle à cheveux qui affaiblit l'effet des oligonucléotides antisens conventionnels, cest-à-dire complémentaires de l'épingle ouverte. En effet, le bilan énergétique de la formation du complexe prend en compte l'énergie à fournir pour rompre les paires de bases de la tige de l'épingle. Un oligonucleotide Aptastruc reconnaissant cette structure de la séquence mini-exon peut au contraire stabiliser l'épingle. On sait que les ribosomes ont une capacité limitée pour rompre les structures secondaires, et décoder le message. En dehors de tout autre effet l'oligonucléotide Aptastruc fixé à l'épingle mini-exon peut bloquer la traduction des ARNm et donc le développement du parasite. Bien que peu de choses soient connues sur le rôle du mini-exon, il est clair que cette séquence joue un rôle clé lors de l'épissage. Selon la présente invention, un oligonucleotide Aptastruc fixé au mini-exon peut bloquer la maturation des messagers. L'ensemble de ces effets sur la production d'ARNm mûrs et sur la synthèse protéique fait donc de cette oligonucleotide Aptastruc une molécule leishmanicide.
Certaines leishmanioses sont de nature cutanées ou cutanéomuqueuses. Les lésions et les parasites sont externes, c'est-à-dire accessibles à la lumière. Une fois l'Aptastruc identifié on peut lors de la synthèse lui lier un photosensibilisateur (groupement psoralène), générant ainsi un oligonucleotide Aptastruc photoactivable qui peut être plus efficace que l'oligonucléotide Aptastruc non modifié, puisque susceptible d'inactiver définitivement la cible. Pour d'autres applications (leishmanioses viscérales, par exemple) on peut lier l'oligonucléotide Aptastruc à des agents de coupure du type complexe métallique capables de produire des coupures par différents mécanismes. 2. La séquence TAR du rétrovirus HIV
La régulation de l'expression des gènes chez le rétrovirus de l'immunodéficience humaine (VIH) est assurée notamment par la fixation d'une protéine appelée TAT sur une séquence particulière : la séquence TAR. Cette séquence est structurée sous forme d'épingle imparfaite, certaines bases de la tige n'étant pas appariées. La position des bases nucléiques de TAR interagissant avec la protéine TAT a été déterminée par mutation ponctuelle systématique. Les éléments clés pour l'interaction TAT-TAR sont connus et l'on sait qu'en certaines positions la substitution d'une base nucléique par une autre (ou sa délétion) abolissent la formation du complexe et par conséquent perturbent l'expression des gènes du rétrovirus qui dépendent de TAT. La structure TAR peut faire l'objet d'une interaction avec un oligonucleotide Aptastruc. La formation du complexe TAR-Aptastruc peut perturber la fixation de la protéine TAT et donc dérégler la synthèse des protéines virales qui dépendent de TAT. Compte tenu du rôle joué par TAT, l'oligonucléotide Aptastruc anti-TAR peut donc constituer une molécule anti-HIV. D'autres structures secondaires ont été identifiées dans le génome de HIV, en particulier dans la région d'initiation de la transcription inverse (PBS). Sous certaines conditions, la transcriptase inverse peut être arrêtée par fixation d'un oligonucleotide. Un oligonucleotide Aptastruc anti-structure PBS peut donc agir comme inhibiteur de la transcriptase inverse. 3. L'élément IRE
Si la plupart des éléments de régulation de l'expression des gènes se trouvent au niveau de la transcription, des éléments intervenant au niveau de la traduction commencent à être identifiés. Ces motifs, situés soit en amont soit en aval de la séquence codante, agissent au niveau de la traductibilité ou de la stabilité de l'ARN messager qui les contient. Ainsi le motif IRE (Iron Responsive Elément) est une séquence qui intervient dans le contrôle de l'expression des gènes de la ferritine et de la transferrine. On peut replier cette séquence IRE sous forme d'une épingle à cheveux. Située en 5' du message de la ferritine, elle module le niveau de traduction de l'ARNm de la ferritine ; placée en 3' de l'ARNm de la transferrine, elle régule son temps de vie. On sait depuis peu que l'élément IRE est reconnu spécifiquement par un facteur protéique. La fixation d'une protéine sur l'élément IRE en absence de fer bloque la traduction de la ferritine et protège l'ARNm de la transferrine. En présence de fer, le facteur protéique se dissocie de l'élément IRE entraînant la synthèse de ferritine et la dégradation de l'ARNm de la transferrine. On peut donc sélectionner un oligonucleotide Aptastruc contre l'élément IRE. Le complexe Aptastruc- IRE perturbe la fixation du facteur protéique et, probablement, la régulation des messages correspondants. Certains désordres métaboliques du fer pourraient trouver leur origine dans des éléments IRE défectueux.
Dans ce cas on peut cibler ces IRE mutants par un oligonucléotides
Aptastruc et réintroduire un gène fonctionnel par thérapie génique.
L'oligonucléotide Aptastruc et le gène sauvage peuvent d'ailleurs être suppléés au cours de la même opération : une fois la séquence aptastruc identifiée, on peut réaliser une construction plaçant cet aptastruc en aval d'un promoteur adéquat, conduisant, après transfection, à la production in situ d'un oligoribonucléotide Aptastruc.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection in vitro d'un oligonucleotide Aptastruc, caractérisé en ce que : a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats de séquences aléatoires, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, les candidats étant en excès, de préférence large excès, par rapport à la séquence cible, c) on isole les oligonucléotides qui forment un complexe stable avec la séquence cible, d) on amplifie les échantillons d'acides nucléiques isolés à l'étape c), e) on réitère plusieurs fois les étapes b) et c), en particulier on réitère de 1 à 30 fois lesdites étapes.
Une population d'oligonucléotides de séquences aléatoires est synthétisée au hasard par introduction simultanée des quatre nucléotides pour chaque position. Le mélange de candidats est mis en présence de la séquence cible dans des conditions qui imposent une compétition entre oligonucléotides pour l'association à celle-ci. Les complexes stables formés peuvent être isolés par chromatographie d'affinité, par électrophorèse en conditions non dénaturantes ou encore par rétention sur filtre de nitro-cellulose. La séquence cible alors éliminée et les candidats sélectionnés au cours d'un premier cycle peuvent être amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR) à l'aide de Taq polymérase commerciale. Une seconde génération de candidats est alors à son tour soumise au même processus de sélection- amplification selon les mêmes conditions. Cette opération peut être répétée x fois ( 1 < x < 30). L'enrichissement de la population est périodiquement évalué notamment en terme d'affinité moyenne pour la cible, déterminée de façon relative notamment par mobilité retardée sur gel d'électrophorèse. A la suite de ces x cycles de sélection, les candidats sont clones dans un vecteur approprié, d'origine commerciale et propagés dans des bactéries compétentes. Une fois les plasmides purifiés, les inserts seront séquences.
Dans un mode de réalisation particulier le procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes : a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats présentant de 5' en 3' :
- une séquence correspondant à un premier site de restriction ; - un premier fragment de séquences complémentaires d'une partie d'un fragment simple brin à structure linéaire de la séquence cible ;
- un second fragment de séquences aléatoires, et - une séquence correspondant à un deuxième site de restriction. b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, et d'un oligonucleotide dit sélecteur, ledit oligonucleotide sélecteur étant complémentaire à une partie dudit premier fragment, et les oligonucléotides candidats et sélecteurs étant en excès par rapport à la séquence cible, c) on soumet l'échantillon d'acides nucléiques obtenus à l'étape b) à une étape de digestion par une enzyme ayant pour substrat le complexe d'hybridation formé par l'oligonucléotide sélecteur et la partie dudit premier brin dont il est complémentaire, de sorte que les candidats ayant une affinité pour la séquence cible restent intacts et les autres après association au sélecteur sont coupés, d) on ajoute des amorces 1 et 2 complémentaires respectivement des extrémités 3' et 5' des oligonucléotides candidats, lesdites extrémités correspondant auxdits premier et deuxième sites de restriction, e) on effectue une amplification enzymatique de l'ADN de l'échantillon, f) on réitère éventuellement les étapes b) à e) plusieurs fois, notamment de 1 à 30 fois, et g) on isole une oligonucleotide parmi ceux obtenus à l'étape f). On peut identifier l'oligonucléotide par clonage et séquençage.
Ce procédé présente l'avantage d'éviter une étape d'isolation par séparation des oligonucléotides obtenus après chaque cycle de sélection/amplification des étapes b) à e).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de l'exemple détaillé de réalisation qui va suivre, relatif à la reconnaissance d'une épingle à cheveux Py-Pu. La figure 1 représente les séquences du fragment d'acide nucléique cible, des oligonucléotides candidats, de l'oligonucléotide sélecteur, des amorces 1 et 2 et de 3 oligonucléotides aptastrucs C 1, C2 et C3 décrits dans l'exemple qui suit. Le site de liaison du sélecteur sur les oligonucléotides candidats est surligné et le site de fixation des candidats sur la cible est souligné. Le site Sacl utilisé pour la sélection est encadré. La région variable des candidats est indiquée par ...NNN... où N est A, C, G ou T.
La figure 2 décrit le schéma du procédé de sélection - amplification.
La figure 3 représente un schéma hypothétique d'une possible structure double épingle à cheveux résultant de la formation d'un complexe entre une séquence cible en épingle à cheveux et un oligonucleotide Aptastruc selon la présente invention. La figure 4 représente un gel d'analyse par électrophorèse d'oligonucléotides candidats en absence de la séquence cible (voir 1 à 3) ou en présence de la séquence cible en épingle à cheveux (voir 4 à 6).
La figure 5 représente des courbes de fusion de séquence cible en épingle à cheveux en l'absence (O) ou en présence de l'oligonucléotide Aptastruc C3 (•). Les concentrations en oligonucléotides étaient de 0,7 μM dans un tampon Tris50 mM, HC1, pH 6 et 10 mM MgCl2. L'absorbance UV a été enregistrée à 260 nm en fonction de la température à partir de 15°C.
EXEMPLE I
On a appliqué le procédé de sélection selon la présente invention à une séquence cible longue d'une cinquantaine de nucléotides. Cette séquence est susceptible de se replier pour donner naissance à une épingle comportant : a) une boucle de 8 nucléotides et, b) une tige formée de 13 paires de bases appariées. Cette tige comporte sur la branche amont (5 ') une suite de 10 purines (Pu) et bien sûr, la branche aval (3') comprend 10 pyrimidines (Py). En outre, une série de six purines est située dans une partie en simple brin à la base de la tige. Cette région simple brin est proche de l'extrémité 5 ' de l'oligonucléotide. Les six purines précèdent immédiatement la branche amont. On a donc une succession de 16 purines dont les 10 dernières sont appariées par liaisons hydrogènes classiques (Watson-Crick). Les candidats longs de 45 nucléotides, comportent donc une partie fixe du côté 5' comprenant un site de fixation pour l'amorce utilisée en PCR, un site de restriction pour l'enzyme Sac I, et dix pyrimidines dont la séquence est en partie complémentaire de six purines en simple brin. Cette partie fixe 5' est suivie d'une région de composition aléatoire de 16 bases puis d'une partie fixe en 3' comprenant le site de fixation pour la deuxième amorce PCR (Fig 1 ). La sélection des candidats, décrite dans la figure 2, implique un oligonucleotide sélecteur. L'association d'un candidat et du sélecteur conduit à la formation d'un site de restriction. Ce site de restriction est placé de telle façon que les candidats fixés sur la structure cible ne peuvent s'associer au sélecteur et sont donc protégés de l'action de Sac I. A l'issue de la sélection les candidats non associés à la cible ont donc perdu le site de fixation de l'amorce 5' et ne sont donc pas amplifiés (Fig. 2). On démontre que la structure Py-Pu de la séquence cible peut former un complexe stable avec un oligopyrimidine long de 26 nucléotides. Cet oligopyrimidine forme, dans sa partie 5 ', 6 paires de bases Watson-Crick avec la région purine en simple brin de l'épingle Py-Pu de la séquence cible. Selon une hypothèse, la partie 3' de l 'oligopyrimidine se replie pour interagir avec le double brin comportant 16 purines. L'ensemble constitue un complexe double épingle (schéma 1, Figure 3) qui peut bloquer l'alkylation chimique ou la digestion de l'épingle Py-Pu par l'enzyme Rsa I qui possède un site à proximité de la boucle.
Pour générer des oligonucléotides Aptastrucs, dans un premier temps, on produit une population d'oligodésoxyribonucléotides synthétiques conventionnels longs de 45 nucléotides composés (de 5' vers
3') : a) d'une séquence comportant un site de clonage et de restriction et un site de fixation de la première amorce PCR b) des six pyrimidines complémentaires de la séquence purine en simple brin à la base de l'épingle Py-Pu, c) de quatre thymines constituant la boucle dans le complexe double épingle, d) d'une série de seize nucléotides aléatoires, un mélange des quatre synthons étant introduit systématiquement à chacune de ces seize positions, et e) d'une séquence comportant sites de restriction et de clonage et le site de fixation de la seconde amorce PCR (schéma 2, Figure 3).
On dispose en outre de deux amorces 1 et 2, complémentaires respectivement des extrémités des "candidats" et d'un sélecteur. Cet oligonucleotide sélecteur forme, après fixation à la partie complémentaire des candidats, un site de restriction pour l'enzyme Sac I. Le site de fixation du sélecteur est placé de telle sorte qu'il soit inaccessible lorsqu'un oligonucleotide candidat est hybride à la structure Py-Pu.
Des candidats Aptastrucs (c'est-à-dire une population de 416 = 4,29.109 oligonucléotides) ont été testés sur la structure Py-Pu, en présence du sélecteur. Ce mélange est ensuite soumis à l'action de Sac I. Les candidats ayant une affinité pour la structure Py-Pu restent intacts tandis que les autres, après association au sélecteur, sont coupés. Les amorces 1 et 2 sont alors ajoutées pour amplification par PCR (polymérisation en chaîne). Les candidats ayant fixé le sélecteur ne seront pas amplifiés puisque l'action de Sac I élimine la séquence de fixation de l'amorce 1. Après trois cycles (sélection/amplification), les candidats sont clones dans pUC19. Le plasmide est propagé dans E. coli et l'insert est séquence.
1. Effet biologique des Aptastrucs sélectionnés sur l'épingle Py- Pu
On a choisi dix clones au hasard et établi la séquence des candidats sélectionnés. Ces candidats ont tous des séquences qui ne permettent pas de prévoir une interaction avec la cible via des appariements Watson-Crick ou des liaison Hoogsteen (directs ou inverses). Trois des candidats sélectionnés ont été synthétisés chimiquement et testés pour leur affinité pour l'épingle Py-Pu qui avait servi à les sélectionner. La région variable de 16 nucléotides de trois de ces candidats a été déterminée. Ces séquences : 5' TAC GAA CGT AGG CTAG, 5' ACC ATT GTG T GGGGTG et 5' GAAC TAT AA CGT GG CA ne permettent pas de proposer une structure pour les complexes faisant intervenir des interactions connues. Les oligonucléotides Ci, C2 et C3 de 26 nucléotides composés du motif fixe de 10 pyrimidines suivis du côté 3' de l'une des régions variables de 16 nucléotides déterminées ci-dessus ont été synthétisés (Figure 1). Leur interaction avec la structure cible a été suivie par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes (Figure 3) et par courbe de dénaturation thermique. Les courbes de transition de la figure 4 indiquent un hyperchromisme associé à la destruction du complexe C3- cible par élévation de la température. Une expérience analogue a été réalisée avec l'hexamere 5 'CTCCCT. Aucune transition ne peut être décelée dans la région (t=35°C) où une variation d'absorbance a été détectée avec C3, indiquant que dans ce dernier cas l 'hyperchromisme observé n'est pas dû à la seule rupture des six paires de bases Watson-Crick. Les deux méthodes électrophorèse et absorption UV, montrent que les trois candidats forment des complexes avec l'épingle cible. Les oligomères C ι>C2 et C3 déplacent l'hexamere complémentaire de la région en simple brin à la base de l'épingle. Des expériences de compétition ont montré que les complexes entre les candidats C ι, C et C3 et la cible font intervenir des interactions plus fortes que les six paires pyrimidine-purines adjacentes à la tige de l'épingle.
Les trois candidats baptisés C i , C2 et C3 ont une mobilité electrophorétique ralentie, sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, lorsqu'ils sont mis en présence de la cible Py-Pu, indiquant la formation de complexes. 2. Blocage d'une enzyme de restriction
Un site de restriction (Rsa 1) a été placé dans la tige de l'épingle Py-Pu, à proximité immédiate de la boucle (schéma 2, Figure 3). Les trois candidats Ci, C 2 et C3, empêchent l'action de Rsa 1 (Ces oligonucléotides n'ont aucun effet sur l'activité de l'enzyme sur d'autres sites).
3. Matériels et méthodes 3.1. Oligonucléotides et enzymes Les oligodésoxynucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur automatisé, Millipore 7500 mettant en oeuvre la chimie de synthèse au phophoramidite. On a préparé une population d'oligonucléotides "candidats" en introduisant dans le synthétiseur un mélange stoechiométrique des quatre syn thons (A, T, G et C) à chacune des positions de la séquence. Tous les oligonucléotides ont été purifiés en une étape par HPLC sur colonne à phase inverse éluée avec un gradient d'acétonitrile 0- 50 % dans un tampon d'acétate d'amonium 100 mM pH 7. Les oligonucléotides ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide/urée, après marquage à l'extrémité 5' avec des [ 2P] γ ATP ( HOTBq/mmole, NEN) et la polynucléotide kinase de T4, selon les protocoles conventionnels. La polynucléotide kinase et l'enzyme de restriction Sacl ont été obtenus chez Promega. La Taq polymérase a été obtenue chez Stehelin et Cie.
3.2. Analyse des hybrides
L'association entre la cible en épingle à cheveux et les candidats sélectionnés a été suivie et visualisée par électrophorèse sur gel dans des conditions non dénaturantes. La population d'oligonucléotides "candidats" marqués à l'extrémité 5' a été mélangée avec un excès de séquences cibles (en excès d'un facteur 10) dans un tampon acétate, Tris 50 mM pH 6 contenant 10 mM de MgCl2. Ils ont été chargés sur un gel de polyacrylamide 15 % dans le même tampon et exposés à 12 mA pendant 16 heures à 4° C. Les complexes d'oligonucléotides ont également été caractérisés par enregistrement des courbes de fusion suivies par absorption UV. Un mélange candidats/cibles ( 1/1 ) (0,7 μM chacun) dans un tampon Tris 50 mM HC1 pH 6 contenant 10 mM MgCl2, placés dans une cellule de quartz, de trajet optique 1 cm. L'ensemble est disposé dans un portoir thermostaté piloté par un contrôleur HUBER. La température est élevée de 0,5°C par minute pendant que l'absorbance est enregistrée à 260 nm.
3.3. Sélection Les séquences des oligonucléotides cibles, candidats et sélecteurs sont données sur la figure 1. Le mélange contenant 33 nM de cible et 16, 6 μM de sélecteur et candidats est chauffé pendant 5 minutes à 75 "C dans un tampon 50mM Tris acétate pH 6 contenant 10 mM MgCl2. Le mélange d'oligonucléotides est ensuite ramené à température ambiante et mis sur la glace pendant 30 minutes au moins. Après adition de 20 unités d'enzyme Sacl les échantillons sont incubés pendant 20 heures à 21°C. Après digestion, l'ADN est mis à précipiter et redissous dans 10 μl d'H20 pour ampification. L'ADN a été amplifié avec la Taq polymérase (0,25u) dans le tampon fournit avec l'enzyme dans 50 μl de mélange de réaction contenant 0,4 mM de chacun des quatres NTPs et 1 μM de chaque amorce. Après dénaturation ( 10 minutes à 95°C) l'enzyme est ajoutée et l'amplification est effectuée pendant 30 cycles (10 secondes à 95°C, 30 secondes réhybridation à 40°C, 30 secondes à 72°C). Le mélange amplifié est précipité par 60 μl d'éthanol suivant l'addition de 15 μl d'acétate ammonium 10 M. Le précipité est récupéré par centrifuguation sur un micro-centrifugeur, puis lavé avec de l'éthanol 70 % et dissous dans de l'eau pour une deuxième étape d'amplification. Ceci est effectué dans les mêmes conditions, excepté que l'on utilise alors uniquement l'amorce 1.
3.4. Clonage et séquençage
Après quatre cycles de sélection, l'ADN généré par amplification en présence des deux amorces 1 et 2, a été digéré Sacl et Ndell, puis clone dans le plasmide pUC1 , digéré par Sacl et BamHI. Ndell et BamHI génèrent des sites compatibles pour la ligation. Des colonies blanches ont été sélectionnées, le plasmide a été isolé, les inserts séquences en utilisant un kit basé sur la méthode de terminaison de chaînes dideoxy. 4. Résultats La structure cible utilisée ici était une épingle à cheveux d'ADN représentée sur la figure 1 comportant une boucle de 8 nucléotides et une tige formée de 13 paires de bases. Cette tige est flanquée sur la branche amont 5' d'une suite de 10 bases comprenant une séquence de 6 purines adjacentes à la tige. Les candidats longs de 45 nucléotides comprenaient de 5' à 3' :
1. Un site de liaison d'amorce 5' pour la réaction PCR et un site de restriction Sacl ;
2. Six pyrimidines complémentaires de la séquence purine en simple brin à la base de l'épingle à cheveux ;
3. Quatre thymines ;
4. Seize nucléotides aléatoires, un mélange de quatre synthons étant introduit systématiquement à chacune de seize positions ;
5. Un site de liaison de l'amorce 3', contenant un site de clonage Ndell (Figure 1). La synthèse de la population de candidats a été effectuée à une échelle de 0.2 μmole. En conséquence, on s'attend à voir apparaître 2,8 x 107 fois chacune des 4,29 x 109 séquences possibles.
4.1. Sélection d'oligonucléotides Aptastruc
La sélection des candidats oligonucléotides présentant une affinité pour la cible implique l'utilisation d'un oligonucleotide sélecteur qui après liaison à un candidat génère un site de restriction Sacl. La séquence 5 ' GAGCTC reconnue par l'enzyme est située dans la séquence de l'oligonucléotide candidat à une telle position que l'association de la cible avec le candidat empêche la liaison du sélecteur et le clivage de la partie 5' terminale du candidat par Sacl. Comme la région correspond au site de liaison d'une des amorces utilisées pour la réaction PCR, seuls les oligonucléotides candidats protégés de la digestion par Sacl, c'est-à-dire, liés à la cible, sont disponibles pour l'amplification (Figure 2).
Les candidats sélectionnés par digestion Sacl, sont ensuite amplifiés en deux étapes (voir Matériel et Méthode ci-dessus) pour générer une population de candidats enrichis en séquences reconnaissant la structure cible. Ce mélange est utilisé pour un deuxième cycle de sélection. Quatre cycles identiques de sélection sont effectués successivement à la fin desquels les candidats sélectionnés sont clones dans le plasmide pUC19. L'ADN est extrait des clones recombinants et les inserts sont séquences. Des séquences de la région de 16 bases correspondant aux fragments aléatoires de trois candidats sont données ci-dessous : 5' TAC GAA CGT AGG CTA G 5 ' ACC ATT GTG TGG GGT G 5 ' GAA CTA TAA CGT GGC A
4.2. Liaisons des candidats sélectionnés à la cible
Trois oligonucléotides 26 mère C ι, C2 et C3 des séquences identifiées ci-dessus ont été synthétisés chimiquement sur un synthétiseur automatique, et on a étudié leur faculté de se lier à la cible d'ADN (Figure 1). Ces oligonucléotides ont été conçus par liaison des séquences 16-mère sélectionnées par le biais du motif conservé 5' CTCCCTTTTT capable de former six paires de bases avec l'extrémité 3' de la cible. Comme montré sur la Figure 3, chacun des trois candidats donnait lieu à une bande de mobilité réduite sur gel de polyacrylamide après avoir été mélangé à la séquence cible et soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions non dénaturantes. Cette mobilité réduite indique la formation d'hybrides stables candidats/cibles dans des conditions de température (4°C) et ionique (50 mM Tris, 10 mM Mg2+) utiisés pour ces expériences.
On a également effectué l'analyse des courbes de fusion de ces complexes par absorption UV. La séquence cible seule présente une température de demi hybridation (Tm) d'environ 72°C correspondant à la structure en épingle à cheveux non repliée. En présence de l'un des candidats C ιr C 2 ou C3, la courbe de fusion présentait encore une température de transition élevée. En outre, la variation de l'absorbance à des températures inférieures, indique un comportement différent de celui observé avec la cible seule. En particulier une zone de transition large avec un point médiant autour de 30"C est observé avec C3 indiquant la dissociation d'un complexe de coopérativité limité (Figure 5).
Les propriétés observées des complexes formés avec C i, C 2 ou C3 n'étaient pas seulement dues à la formation de six paires de bases avec la région mono brin 3' de la tige de la cible. On a effectué les expériences de compétition suivantes. Un excès de 10 fois de l'hexamere 5' CTCCCT par rapport à C2 était nécessaire pour réduire de 50 % la quantité de complexes
C2-cible. 4.3. Effet des candidats Aptastrucs sur la traduction
L'épingle Py-Pu décrite sur la figure 1 a été utilisée pour générer une cible ARN pour les aptastrucs sélectionnés selon le processus préalablement décrit. En fait, il s'agit d'un dérivé délété des trois paires de bases CAT/GTA à proximité de la boucle. Cette épingle Py-Pa/Δ a été insérée dans la région "polylinker" du vecteur pGEM-luc (PROMEGA), c'est-à-dire en aval du promoteur SD6 et de la séquence codant pour la luciférase. Cette construction in vitro et les messages ainsi obtenus ont été exprimés en extrait acellulaire (germes de blé). L'activité luciférase a été suivie par la luminométrie en absence et en présence d'oligonucléotides aptastrucs. Les premiers résultats montrent que le candidat Cl produit une inhibition de l'activité luciférase. Cet effet est spécifique : aucun effet de Cl n'est détecté sur l'expression de la luciférase exprimée à partir du plasmide parent pGEM-luc ne portant pas l'épingle cible de Cl. En outre, il faut noter que l'effet sur pGEM-luc Py-Pu Δ est plus important que celui produit par des 26 mère susceptibles de faire un complexe double épingle via des interactions canoniques décrites dans Brossalina et Toulmé, 1993, J. Am. Chem. Soc, et démontre donc l'intérêt des oligonucléotides aptastrucs comme inhibiteur spécifique de l'expression des gènes. EXEMPLE II : Sélection in vitro d'Aptstrucs anti-TAR
La séquence "TAR" du génome du VIH est le site de fixation d'une protéine virale (tat). Le couple tat-TAR constitue un élément important pour le contrôle de l'expression des gènes du rétrovirus. Un ligand qui se fixerait fortement et spécifiquement sur la séquence TAR pourrait donc bloquer la fonction assurée par la protéine tat. Le motif TAR est constitué par un élément structuré en épingle à cheveux imparfaite. Cet élément a été choisi comme cible pour des oligonucléotides sélectionnés in vitro, au sein d'une population aléatoire, selon le procédé décrit. La séquence aléatoire est longue de 15 nucléotides. Une population de 415 = i(07 109 candidats a donc été générée par synthèse chimique. Cette portion aléatoire est associée à un motif fixe de 6 nucléotides servant à ancrer les candidats sur la cible. Quatre familles de 415 candidats ont été conçues et testées qui diffèrent par la séquence l'ancre, complémentaire au sens Watson-Crick, de différentes parties de l'épingle TAR. Ces familles ont nécessité l'emploi d'oligonucléotide sélecteur et d'enzyme de sélection différents. Au terme du processus de sélection / amplification, 28 candidats ont été identifiés : 12 pour la famille I, 7 pour la famille II, 3 pour la famille III et 6 pour la famille IV. Leurs séquences sont indiquées ci- dessous. Il est remarquable que la même séquence a été sélectionnée plusieurs fois. Par exemple, les trois candidats de la famille III sont identiques. Les candidats synthétisés de façon définie se sont révélés aptes à se fixer à l'épingle TAR et à entrer en compétition avec un polypeptide dérivé de tat, se fixant sur le motif TAR.
Dans les séquences des 28 candidats anti-TAR ci-après, le motif de six nucléotides en italique (à droite en 3' ou à gauche en 5') correspond à l'ancre et est donc commun à tous les candidats d'une famille. FAMILLE I TCCCAGTCπCACTGGGATGG
TCCCA GCGCA GCCA TCGA CTT
TCCCA GGTGA CGGGπAA CA T
TCCCA GGGA GGGA TCTA TTCC
TCCCAGAGTGTCATCCTGGCT
TCCCA GTGGCCCCGCA GTGTC
TCCCA GA GGCCGCTGCAA TGT
TCCCA GAA TGGTGTTGCTCCG
TCCCA GGA GTGTCAA TCGGGT TCCCAGGATGTCATAACACCT
TCCCA GTTTCCGAA TGGCGGT
TCCCA GTTCGTCTTGGTTCGT FAMILLE II
TGGGA TA TCCA GCTGTCCCA G TGGGATA TCGAGCGCTCCCAG
TCAA TGTGCCAA TGCTCCCA G
CGGA CA GCGCCTTCπCCCA G
GTGGCA GAA GCTCTTTCCCA G
GGCAA TTCGA TGTCA TCCCA G TGGGTGGTTTGGGTCTCCCAG FAMILLE III
A GGTGCTTGGA GCCGTAA CCA A GGTGCTTGGA GCCGTAA CCA A GGTGCTTGGA GCCGTAA CCA FAMILLE IV
TCTA CGCCGCA TCGGGGTCG TCTAA CTTTGGCGGGTCTCTC TCTAA CGGTGCGCGGGTGTCC TCTAA CGAA CTTCGGTTTCA TCTAACTTTGGCGGGTCTCTG
TCTAA CGGGTGCCTA CTCGTT
IDENTIFICATEUR DE SEQUENCE ( 1 ) INFORMATIONS GENERALES :
(i) DEPOSANT:
(A) NOM : INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA
RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
(B) RUE : 101 Rue de Tolbiac
(C) VILLE : PARIS
(D) ETAT OU PROVINCE :
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75654
(G) TELEPHONE : 45 23 6000 (H) TELEFAX : 45 846856
( ii ) TITRE DE L'INVENTION : OUGO APTASTRUCS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES :
( i v ) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : DISQUETTE
(B) ORDINATEUR : MAC INTOSH
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : MAC OS - SYSTEME 7
(D) LOGICIEL : WORD PERFECT VERSION 2.0.
( v ) DATE DE LA DEMANDE ACTUELLE : ( A ) NUMERO DE LA DEMANDE : (B) DATEDU DEPOT:
(vi ) DATE DE LA DEMANDE ANTERIEURE : ( A ) NUMERO DE LA DEMANDE :
( B) DATE DE DEFOT :
(C) CLASSIFICATION :
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ.ID N° : 1 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ.ID N° : 1 :
TCCCAGTCTTCACTGGGATGG ( 3 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 2 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 2 : TCCCAGCGCAGCCATCGACTT (4) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 3 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 3 : TCCCAGGTGACGGGTTAACAT ( 5 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 4 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
( B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 4 :
TCCCAGGGAGGGATCTATTCC
(6) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 5 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
( B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI ( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 5 : TCCCAGAGTGTCATCCTGGCT (7) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 6 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 6 : TCCCAGTGGCCCCGCAGTGTC ( 8 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 7 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 7 : TCCCA GAGGCCGCTGCAATGT
(9) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 8 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : UAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 8 :
TCCCAGAATGGTGTTGCTCCG (10) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 9 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR: 21 nucléotides
(B) TYPE: ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 9 :
TCCCAGGAGTGTCAATCGGGT
(11) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 10 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR: 21 nucléotides
(B) TYPE: ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE :LIAISONAUGENETARDUVIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 10 :
TCCCAGGATGTCATAACACCT
(12) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 11 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR: 21 nucléotides
(B) TYPE: ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N" : 11 :
TCCCAGTTTCCGAATGGCGGT
(13) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 12 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR: 21 nucléotides
(B) TYPE: ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI'SENS : OUI (iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 12 : TCCCAGTTCGTCTTGGTTCGT
(14) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 13 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
( B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 13 :
TGGGATATCCAGCTGTCCCAG
( 15) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 14 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : UAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 14 :
TGGGATATCGAGCGCTCCCAG
(16) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 15 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
( ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 15 :
TCAATGTGCCAATGCTCCCAG 2 6
(17) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 16 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 16 :
CGGACAGCGCCTTCTTCCCAG
(18) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 17 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
(iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 17 :
GTGGCAGAAGCTCTTTCCCAG
(19) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 18 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 18 :
GGCAATTCGATGTCATCCCAG
(20) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 19 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI (iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 19 : TGGGTGGTTTGGGTCTCCCAG (21) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 20 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 20 : AGGTGCTTGGAGCCGTAACCA (22 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N° : 21 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH ( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 21 : AGGTGCTTGGAGCCGTAACCA (23 ) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 22 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii ) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 22 :
AGGTGCTTGGAGCCGTAACCA (24) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 23 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE 1A SEQUENCE : SEQID N° : 23 :
TCTAACGCCGCATCGGGGTCG
(25) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 24 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 24 :
TCTAACTTTGGCGGGTCTCTC
(26) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 25 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( i v ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 25 :
TCTAACGGTGCGCGGGTGTCC
(27) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 26 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI (iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH (iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 26 : TCTAACGAACTTCGGTTTCA
(28) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 27 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
( iii ) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 27 :
TCTAACTTTGGCGGGTCTCTG
(29) INFORMATIONS POUR LA SEQID N° : 28 :
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 21 nucléotides
(B) TYPE : ADN
(C) NOMBRE DE BRINS : 1
(ii) ANTI-SENS : OUI
(iii) CARACTERISTIQUE : LIAISON AU GENE TAR DU VIH
( iv ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID N° : 28 :
TCTAACGGGTGCCTACTCGTT

Claims

REVENDICATIONS
1. Oligonucleotide Aptastruc caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'acide nucléiqie ADN ou ARN à structure non linéaire, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases nucléiques qui ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible et qu'il forme un complexe avec ladite séquence cible.
2. Oligonucleotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour une séquence cible d'ADN ou d'ARN comportant un fragment simple brin à structure linéaire adjacent à une structure non linéaire, et il comporte une séquence complémentaire d'une partie dudit fragment simple brin linéaire de la cible et le reste de la séquence de l'oligonucléotide constituant sa majeure partie, ne permet pas une interaction canonique avec la séquence cible.
3. Oligonucleotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il forme un complexe avec la séquence cible plus stable que le complexe formé par un oligonucleotide constitué par la seule séquence complémentaire dudit fragment simple brin à structure linéaire, avec la même séquence cible.
4. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence cible présente une structure auto-appariée en épingle à cheveux prolongée par une région simple brin non appariée et la séquence de l'oligonucléotide Aptastruc est pour partie complémentaire de la séquence de ladite région simple brin.
5. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte de 15 à 50 nucléotides.
6. Oligonucleotide selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte un fragment de 0 à 10 nucléotides de séquences complémentaires à une région simple brin de la séquence cible, couplé à un fragment de 10 à 35 nucléotides non complémentaires de la séquence primaire de la séquence cible.
7. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence cible est une séquence à structure non linéaire d'un acide nucléique ADN ou ARN qui commande l'expression d'un gène appliqué dans une pathologie humaine ou animale.
8. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il permet le blocage du développement d'un virus, d'une bactérie ou d'un parasite.
9. A titre de médicament un oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Procédé de préparation par sélection in vitro d'un oligonucleotide selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que : a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats de séquences aléatoires, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, les candidats étant en excès par rapport à la séquence cible, et c) on isole les oligonucléotides qui forment un complexe stable avec la séquence cible, et d) on amplifie les échantillons d'acide nucléique obtenu à l'étape c), e) on réitère plusieurs fois les étapes b) et c), en particulier de 1 à
30 fois,
1 1. Procédé de préparation d'un oligonucleotide selon la revendication 10, caractérisé en ce que : a) on prépare une population d'oligonucléotides candidats présentant de 5' en 3' :
- une séquence correspondant à un premier site de restriction ;
- un premier fragment de séquences complémentaires d'une partie d'un fragment simple brin à structure linéaire de la séquence cible ;
- un second fragment de séquences aléatoires, et - une séquence correspondant à un deuxième site de restriction, b) on met cette population d'oligonucléotides candidats en présence de la séquence cible, et d'un oligonucleotide sélecteur, ledit oligonucleotide sélecteur étant complémentaire à une partie dudit premier fragment, les oligonucléotides candidats et sélecteurs étant en excès par rapport à la cible. c) on soumet l'échantillon d'acide nucléique obtenu à l'étape b) à une étape de digestion par une enzyme ayant pour substrat le complexe d'hybridation formé par l'oligonucléotide sélecteur et la partie dudit premier brin dont il est complémentaire, de sorte que les candidats ayant une affinité pour la séquence cible restent intacts et les autres après association au sélecteur sont coupés. d) on ajoute des amorces 1 et 2 complémentaires respectivement des extrémités 3 ' et 5' des oligonucléotides candidats, lesdites extrémités correspondant auxdits premier et deuxième sites de restriction. e) on effectue une amplification enzymatique de l'ADN de l'échantillon. f) on réitère éventuellement les étapes b) à e) plusieurs fois, notamment de 1 à 30 fois, et g) on isole un oligonucleotide parmi ceux obtenus à l'étape f).
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