WO1996003996A1 - Deuterium-containing pharmaceutical compositions for destroying tumors - Google Patents

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WO1996003996A1
WO1996003996A1 PCT/EP1995/003100 EP9503100W WO9603996A1 WO 1996003996 A1 WO1996003996 A1 WO 1996003996A1 EP 9503100 W EP9503100 W EP 9503100W WO 9603996 A1 WO9603996 A1 WO 9603996A1
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deuterium
cells
tumor
pharmaceutical composition
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PCT/EP1995/003100
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Ulrich Bogdahn
Albrecht Bauer
Axel Haase
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Ulrich Bogdahn
Albrecht Bauer
Axel Haase
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients

Definitions

  • the invention relates to the use of a pharmaceutical composition containing deuterium and / or deuterated substances and / or substances which enrich or release deuterium for the selective killing of tumor cells and / or tumor metastases or for the prevention of metastasis and / or local recurrence of tumors and their regrowth.
  • Previous tumor therapeutic agents also suffer from the disadvantage of causing high side effects even in the lowest concentrations, in particular immune suppression and changes in the blood count and bone marrow depression as well as induction of new tumors.
  • the present invention is therefore based on the object of exerting a selective and cytotoxic effect on tumor cells and / or metastases and of largely leaving the growth of normal cells unaffected and of preventing the metastasis and / or recurrence of tumors and / or their regrowth. This would also avoid some of the side effects known for tumor therapeutics.
  • the direct cytotoxic effect can be demonstrated in vitro on cell culture material.
  • Cells are killed in vitro by adding a deuterium-containing substance or compound to the culture medium.
  • the following% by volume are to be understood as follows.
  • Substance containing 100% by volume of deuterium means that all H atoms at one (or more) specific positions are replaced by D atoms.
  • D atoms For example, contains pure D 2 O, molecular weight 20.03 g / mol, 2 atoms of deuterium (4 g / mol) and one atom of oxygen (1 6 g / mol). If the concentration of a "deuterium-containing substance" is therefore determined, its pure deuterium content in this example is only a maximum of 20% by weight, corresponding to 100% by volume.
  • a suitable concentration for killing over 95% of cells for example the tumor HTZ-1 9 (malignant melanoma), under suitable culture conditions as a monolayer is over 50% by volume of D 2 0 or 99.86 g of deuterium per kg of active substance or another deuterium-containing substance with H atoms replaced by D at a certain point in 50% by volume, preferably over 70% by volume (1 39.81 g deuterium / kg), very preferably over 90% by volume (1 79.75 g deuterium / kg).
  • higher or lower concentrations are also suitable for killing tumor cells to a greater or lesser extent.
  • deuterium has a cytotoxic effect on tumor cells by inhibiting DNA synthesis [ 3 H-thymidine incorporation, Coligan, JE, Kruisbeek, AM, Margulies, DH Shevach, EM, Strober, W., Current Protocols Immunology , NIH Monographie, J. Wiley & Sons, New York, 1 992], and also demonstrated by cell membrane defect [trypan blue staining, GK Smith, Duch, DS, Dev, IK Kaufmann, SH, Metabolie Effects and Kill of Human T-Cell Leukemia by 5-Deaza acyclotetrahydrofolate, a Specific Inhibitor of Glycineamide Ribonucleotide Transformylase, Cancer Res.
  • deuterium-containing substances are suitable for producing a therapeutic agent for killing tumor cells and / or metastases and for preventing metastases and / or the local recurrence of tumors and their regrowth.
  • a therapeutic agent is particularly suitable for the therapy of malignant melanomas, gliomas and astrocytomas, bronchial carcinomas (in particular small-cell bronchial carcinomas), neuroblastomas and carcinomas of the gastrointestinal tract.
  • deuterium or deuterium-containing or deuterium-releasing or deuterium-enriching substances are usually combined with auxiliaries, fillers and / or additives (for example flavorings, electrolytes, nutrients, vitamins, substances which influence absorption) in one, preferably sterile , isotonic and / or pyrogen-free, pharmaceutical preparation or formulation used, preferably in the form of suppositories, ointments, solutions, dispersions and emulsions, aerosols, foams, particulate agents (for example granules, agglomerates, powder, microbeads and adsorbates), pills , Lozenges, tablets, dragees, capsules or microcapsules, types of chewing gum, tissue, leaf or thread bases, with bandages or bandages, for smoking or inhaling and in carriers, such as liposomes.
  • auxiliaries for example flavorings, electrolytes, nutrients, vitamins, substances which influence absorption
  • the administration is preferably local, intracutaneous or transcutaneous;
  • For systemic use preferably intravenously, by partially exchanging the body water or blood water content (e.g. by dialysis), intraarterially, orally, rectally; for use in cavities, preferably intrapleural, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal, intracavitary, in operating theaters.
  • Use in operating theaters is preferably used to prevent relapse of the removed tumor, i.e. to prevent local recurrence and regrowth of the tumor.
  • Extracorporeal killing of tumor cells is also possible (e.g. "purging" in bone marrow neoplasia).
  • deuterium or deuterium-containing or deuterium-releasing or deuterium-enriching substances are also combined with other active substances, preferably other cytostatics or tumor therapeutics.
  • the newly discovered effect of cell killing and the tumor specificity mean that additive or superadditive (synergistic) effects can be achieved in combination with other cytostatics and tumor therapeutics. This is preferably done by attacking the cytoskeleton, especially by attacking the tubulin.
  • a reduction in the dose of the combined cytostatic / tumor therapeutic can be expected from a combination with deuterium-containing therapeutic agents according to the invention consequently also a reduction in the side effects, which often restrict therapy.
  • cytostatics / tumor therapeutics are promising, based on the same or similar principles of action as deuterium, namely cell killing (also apoptosis).
  • TGF-ß tumor growth factor ß
  • TNF tumor necrosis factor
  • Substances that attack the tubulin cytoskeleton e.g. Vinca alkaloids, taxol, taxol derivatives and colchicine and colchicine derivatives
  • Alkylating agents such as Cyclophosphamide, busulfan, ACNU and other nitrous urea derivatives
  • Purine and pyrimidine antagonists such as e.g. Azathioprine, 6-mercaptopurine, cytarabine
  • the hemotoxic / immunosuppressive (side) effect is restrictive of therapy.
  • Such an effect is not to be expected from deuterium or deuterium-containing or enriching substances for normal cells, as shown for normal brain cells and in particular lymphocytes (example 6), ie tumor cells are selectively killed.
  • the treatment of tumor-infiltrated bone marrow or bone marrow stem cells before bone marrow transplantation ("purging") is used for the selective elimination of tumor cells possible, which can be done intracorporeally as well as extracorporeally.
  • the same effect can therefore be achieved by combining such tumor therapeutic agents with deuterium or deuterium-containing and releasing substances at a lower dose.
  • a greater anti-tumor effect than previously possible can be achieved by combining it with deuterium.
  • Deuterated tumor therapeutic agents are therefore particularly suitable for combination with
  • Antimetabolites such as Methotrexate, thioguanine
  • Alkaloids such as Vinblastine, vincristine, taxol
  • Antibiotics with tumor therapeutic potency such as Daunorubicin, Bleomycin, Epirubicin
  • bone marrow depressive tumor therapeutics such as Hydroxyurea, procarbazine and alkylating agents, and purine / pyrimidine derivatives.
  • a synergistic or potentiating effect also results when the pharmaceutical composition is used in combination with irradiation methods such as gamma radiation, electron radiation ( ⁇ -radiation), neutrons and corpuscular radiation.
  • irradiation methods such as gamma radiation, electron radiation ( ⁇ -radiation), neutrons and corpuscular radiation.
  • the cell proliferation was determined by means of 3 H-thymidine incorporation, as described for example in "Bogdahn, U., R. Apfel, M. Hahn, M. Gorlach, C. Bohl, J. Hoppe and R. Martin: Autocrine tumor cell growth inhibiting activities from Human Malignant Melanoma, Cancer Res. 49, 5358-5363 (1,989) ". Growth and survival curves are based on cell counting with trypan blue dye.
  • Solid tumors such as glioblastoma multiforme, astrocytoma, malignant melanoma, small cell bronchial carcinoma, colon carcinoma, are preferred.
  • cells from normal brain after skull trauma, normal brain or IL-2 stimulated (freshly isolated) lymphocytes, PHA stimulated (freshly isolated) lymphocytes can be used.
  • the effect of deuterium on cells is preferably achieved with D 2 0.
  • the suitably concentrated D 2 0 was preferably produced in the experiment by diluting high-purity D 2 0 (> 99%) with H 2 0.
  • D 2 0 intended for therapy is preferably produced directly in the desired concentration.
  • the effect of deuterium according to the invention can also be achieved by other substances which contain deuterium or which release or enrich deuterium in a suitable manner. This includes all conceivable inorganic or organic compounds that contain deuterium, z. B.
  • deuterated amino acids such as deuterated glutamine, deuterated alanine and deuterated glutamate
  • deuterated sugars such as deuterated glucose, deuterated fructose
  • deuterated fats deuterated DNA or RNA building blocks
  • deuterated metabolic products eg deuterated pyruvate, deuterated lactate
  • Fig. 5, 6, 1 1, 1 7, 21, 25 survival rate of tumor cells in relation to the length of stay in media containing deuterium
  • Fig. 7, 8, 1 2, 1 8, 22, 26 survival fraction of tumor cells in relation to the length of stay in deuterium-containing media
  • Fig. 27a + b Cell cycle of untreated HTZ-1 9 melanoma cells
  • Fig.28a + b Cell cycle of HTZ-1 9 melanoma cells after 3 days in 50 vol% D 2 O
  • Fig.29a + b Cell cycle of HTZ-1 9 melanoma cells after 3
  • Fig. 31 Migration area of a tumor
  • Fig. 32 Comparison of the number of liver metastases in untreated test animals and with D 2 0-treated test animals after implantation of a sarcoma M 5076
  • Fig. 33 Comparison of the number of surviving test animals after intraperitoneal implantation of a sarcoma M 5076
  • HTZ-209B, HTZ 243, HTZ 1 9, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 or HT 29 cells are each used for at least 24 hours in microculture plates with 96 wells (Costar, Zurich) sown in 200 ⁇ ⁇ culture medium with a density of 3000 cells per well [according to Chambard et al. J. Cell. Physiol. 1 35 (1 988), 1 01 -1 07].
  • the culture medium consists of Dulbecco's MEM with 1 0% FCS addition, 1% vitamins, 1% non-essential amino acids and 0.3% L-glutamine.
  • Deuterated media are produced using MEM powder medium and heat-sterilized D 2 O as well as Ultra Pure Water for dilution with identical additives as conventional culture medium.
  • the cells are in deuterated medium in the desired concentration / 03996 PC17EP95 / 03100
  • HTB 69 malignant melanoma 71
  • HTZ-1 9, HTZ 209, HTZ are used analogously to Example 1 243, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 or HT 29 cells sown for at least 24 hours in microculture plates with 96 wells or in microculture plates with 24 wells with a density of 1 0,000 cells per well.
  • the culture medium consists of Dulbeccos MEM with 10% FCS addition, 1% vitamins, 1% non-essential amino acids and 0.3% L-glutamine.
  • a medium change is then carried out and deuterated medium is added in the desired concentration.
  • the cells are incubated in a concentrated medium in the desired concentration for a defined period of time at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the cells are then detached with trypsin and trypan blue (Trypan Blue Stain 0.4%, Sigma Chemicals St. Louis) is added in a defined volume.
  • trypsin Trypan Blue Stain 0.4%, Sigma Chemicals St. Louis
  • the cell number of vital and damaged cells is counted in the Fuchs-Rosenthal chamber and plotted as a growth curve or survival curve.
  • the surviving fraction ie the proportion of surviving cells of the treated group compared to untreated controls, can be given after 3 or 6 days of incubation with 90% by volume of D 2 O medium.
  • HTZ 209 glioblastoma multiforme 0.55 0.07
  • HTZ 1 9 malignant melanoma 0.25 0.05
  • CFE Coldy Forming Efficiency
  • Fig. 30 From Fig. 30 it can be seen that the two tested tumors HT-29 (colon carcinoma) and HTZ1 9 (malignant melanoma) show a high effectiveness of D 2 0 and below 90 vol% D 2 0 there is a decrease by 4 or 5 powers of ten of vital colony-forming tumor cells.
  • HTZ-1 9 and HTB-69 Two different tumors, HTZ-1 9 and HTB-69, were tested.
  • the tumors were expanded in MEM with 10 vol .-% FCS addition.
  • 3 H thyrridine assays were carried out in 96-well plates, growth curves in some cases also in 24-well plates.
  • the growth curves (Fig. 3,4) for HTZ-1 9 showed a significant slowdown in growth at 50% by volume D 2 0 (99.86 g deuterium / kg), at 90% by volume D 2 0 ( 1 79.75 g D 2 O / kg) the growth stagnated over the full observation period of 1 3 days.
  • HTB-69 showed a clear absolute decrease in cell count, while the untreated controls showed exponential growth.
  • the resulting overall effect from deuterium was measured as a surviving fraction (Fig. 7,8); after 6 days in 90% by volume of deuterium medium, the survival fraction for HTZ-19 was 0.04, for HTB 0.07, after 12 days for both tumors it was less than 0.01. This means a decrease in vital tumor cells under deuterium treatment of more than two powers of ten (2 log-cell kill).
  • the survival fraction of HTB-69 was already less than 0.5 after 1 day.
  • Figures 27a, 28a, 29a show the frequency distributions ("distribution") of HTZ-19 melanoma cells in the cell cycle.
  • a compensation curve (diagram: dashed line) is calculated from the primary data of the frequency of the occurrence of a certain amount of DNA (shown in the diagram as individual measuring points).
  • the distribution functions of the individual cell cycle compartments (diagram: solid lines for G, S and G 2 phase) are adapted to this compensation curve and the relative frequencies are determined from these distribution functions. This results in the percentage distribution of the cells over the cell cycle compartments, which can be read on the edge of the figures.
  • Figures 27a-29a always show the number of cells (ordinate) depending on their DNA content (abscissa). The ordinate unit is therefore the cell number, the abscissa unit is the relative DNA content in arbitrary units of the fluorescence intensity.
  • Figures 27b, 28b, 29b show the intensity of the ethidium bromide fluorescence as ordinate ("Y axis") and the intensity of the maximum fluorescence as abscissa ("X axis").
  • the number of cells is indicated by the blackening and the point density.
  • the intensity for both axes results from the content of fluorescence-stained DNA. In the case of ethidium bromide fluorescence, the intensity is therefore proportional to the DNA content of non-vital cells.
  • the 3 H-thymidine incorporation (Fig. 9) shows an almost linear dose-response relationship which is largely independent of time. A saturation behavior has already occurred on the time scale 1 to 6 days, the effects are evident very quickly in the range of hours. In the case of HTZ-25, a very high effect was achieved with 94% inhibition after exposure to 90% by volume of D 2 0 (1 79.75 g of deuterium / kg) in the medium for 6 days.
  • the growth curves show a clear decrease in the treated cells with good growth of the untreated tumor cells.
  • the survival rate (Fig. 1 1) drops to 80%, with flow cytometry being able to show a cell kill percentage of 56% after 2 days.
  • the survival fraction (Fig. 1 2) reaches 0, 1 7, and 1 3 after 6 days Days even 0.09, so that the overall effect on the tumor cells at least 90 vol .-% D 2 0 concentration represents a full order of magnitude reduction of vital tumor cells.
  • Colon carcinomas of the ATCC cell lines CaCo-2 and HT-29 were tested.
  • the tumors were expanded in MEM with 10 vol% FCS.
  • 3 H thymidine assays and growth curves were carried out in 96-well plates.
  • the 3 H-thymidine incorporation (Fig. 13, 14) shows an almost linear dose-effect relationship which also tends to be largely independent of time.
  • the effects are evidently also expressed in the range of hours, but the full expression is achieved, in particular in the case of CaCo-2 cells, only after 3 days of incubation.
  • HT-29 an extremely high effect could be achieved with 98% inhibition after 6 days exposure of 90 vol.% D 2 0 (1 79.75 g deuterium / kg) in the medium, CaCo-2 achieved with 94% inhibition similar values after 6 days of incubation.
  • the growth curves (Fig. 1 5, 1 6) indicate a fulminant absolute decline in the cells in both colon carcinomas, while the untreated controls are in exponential growth.
  • the survival rate (Fig. 1 7) shows a clear decrease, in particular with CaCo-2, with 39% survival rate, a significant cell kill was achieved after 9 days of treatment.
  • the survival fraction (Fig. 1 8) shows values of less than 0.1 in both colon carcinomas after 3 days (CaCo-2: 0.08, HT-29: 0.04), after 9 days it was in both tumors even below 0.01, ie two powers of ten, reduction of vital tumor cells at 90 vol.% D 2 0 concentration.
  • Example e Lymphocytes (control; normal cells)
  • Freshly isolated blood lymphocytes were tested, expanded according to the Ficoll gradient in RPMI medium with 10% by volume of human AB serum addition.
  • the lymphocytes were stimulated with interleukin 2 (IL-2) or phythaemagglutinin (PHA).
  • IL-2 interleukin 2
  • PHA phythaemagglutinin
  • IL-2 stimulated lymphocytes showed time-dependent behavior; at 3 and 6 days there was inhibition, a maximum of 65% inhibition was determined at 90% by volume of deuterium.
  • the growth curves show a decrease compared to the controls both with 50 vol.% (99.86 g deuterium / kg) and with 90 vol.% Deuterated medium, but this is significantly less pronounced than with the tested tumors.
  • the survival rate (Fig. 21) as a measure of the cell death caused by deuterium is significantly reduced only in the IL-2-stimulated cells in 90% by volume of deuterium; there were values up to 60% "survival rate" corresponding to 40 % killed cells measured with 6d IL-2 stimulation.
  • the survival fraction (Fig. 22) was also reduced only in IL-2 stimulated lymphocytes (up to 0.36 at 6d in 90 vol.% Deuterium medium with II-2 stimulation).
  • the PHA-stimulated cells remain largely unaffected (0 , 8 with 6d PHA stumulation in 90 vol.% Deuterium).
  • the system of stimulated lymphocytes lags significantly behind the effects on tumor cells with regard to the inhibition of proliferation and cytotoxicity caused by deuterium.
  • the deuterium-mediated effects are not dependent on proliferation, or at least not all differential effects are only caused by the greater proliferation in tumor cells: the IL-2-stimulated cells with the lower division rate are more strongly inhibited and show higher cell-kill Sensitivity "as the rapidly dividing PHA-stimulated lymphocytes, which are stimulated even in growth by low doses of deuterium and have hardly any" cell kill ".
  • glioblastoma glioblastoma multiforme
  • astrocytoma HTZ-243 astrocytoma WHO grade III
  • the 3 H-thymidine incorporation (Fig. 23) shows a clear shoulder formation in the dose range between 1 and 50 vol.% D 2 O, which is largely independent of time.
  • a very clear tumor selectivity can be seen, in particular when using D 2 0 over 6 days, with HTZ-243 having already achieved 10% D 2 0 over 60% inhibition.
  • the growth curves (Fig. 24) indicate an absolute decline in the cells in both gliomas, especially HTZ-209, while the untreated controls are in exponential growth.
  • the survival rate (Fig. 25) shows a clear decrease in both tumors, especially in HTZ-209, with 33% survival rate, a high degree of tumor cell kill was achieved after 6 days of treatment.
  • the survival fraction (Fig. 26) shows an almost linear decline in both brain tumors, and after 6 days for HTZ-209 values below 0, 10, i.e. a full power of ten decrease in vital tumor cells.
  • lymphocytes in which both "growth arrest” and “cell kill” are significantly less pronounced in the more rapidly proliferating PHA-stimulated cells, indicate that the extent of the effects is not only dependent on the proliferation rate. / 03996 PC17EP95 / 03100
  • a suitable method for checking the effect of a cytostatic on the ability to migrate and thus the metastasis of a tumor is to assess the migration of tumor spheroids.
  • Tumor cells are converted back into uncoated plates after the formation of spheroids on agricultured 48-well plates. The tumor cells return to adherent growth within 72 hours; the area covered is a measure of the migration and invasion behavior of a tumor and thus of its ability to metastasize and its inhibition.
  • Fig. 31 it can be seen that D 2 0 leads to a reduction in the migration area to 20% of the otherwise occupied area after 72 hours, which corresponds to a significant reduction in the ability to metastasize or to form metastases.
  • the cells migrated to this area, which was reduced to 20%, are also devitalized (demonstrated by trypan blue staining), since D 2 0, in particular, completely kills off the migrating cells.
  • the use of D 2 O therefore prevents potential metastasis.
  • sarcoma M 5076 was implanted subcutaneously in mice. Half of these mice were treated with 50% by volume D 2 O.
  • mice were given 10 5 cells of sarcoma M 5076 intraperitoneally. Half of the mice (8 animals) became 50% by volume D 2 0, the other / 03996 PC17EP95 / 031 0

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Abstract

The invention pertains to the use of a pharmaceutical composition containing deuterium and/or deuterated substances and/or substances that enrich or release deuterium to selectively destroy tumor cells and/or tumor metastases or to prevent metastasizing and/or local recurrence of tumors as well as their regrowth.

Description

DEUTERIUM ENTHALTENDE PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR ABTOETUNG VON TUMOREN DEUTERIUM-CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR KILLING TUMORS
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammen¬ setzung enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anreichern bzw. freisetzen, zur selektiven Abtötung von Tumorzellen und/oder Tumormetastasen bzw. zur Verhinderung der Me- tastasierung und/oder des lokalen Wiederauftretens von Tumoren sowie deren Nachwachsen.The invention relates to the use of a pharmaceutical composition containing deuterium and / or deuterated substances and / or substances which enrich or release deuterium for the selective killing of tumor cells and / or tumor metastases or for the prevention of metastasis and / or local recurrence of tumors and their regrowth.
Die bisher entwickelten Tumortherapeutika und Zytostatika leiden alle an dem Nachteil, daß sie nicht ausreichend selektiv zwischen Tumorzelle und gesunder Zelle unterscheiden. Die bisher entwickelten Tumortherapeutika und Zyto¬ statika leiden zudem an dem Nachteil, daß sie gegen Hirntumoren, dort ins¬ besondere Glioblastome, sowie gegen Melanome nur ungenügend wirksam sind, und eine Tumorprogression nur ungenügend verlangsamen. Dies zeigen insbesondere die mittleren Überlebenszeiten bei Glioblastom- und Melanom- Patienten von unter einem Jahr. Ebenso sind Tumortherapeutika gegen Bron¬ chialkarzinome und Karzinome des Magen-Darm-Traktes nur ungenügend wirksam.The tumor therapeutics and cytostatics developed so far all suffer from the disadvantage that they do not differentiate sufficiently between the tumor cell and the healthy cell. The tumor therapeutics and cytostatic agents developed hitherto also suffer from the disadvantage that they are only insufficiently effective against brain tumors, in particular glioblastomas there, and against melanomas, and do not slow tumor progression sufficiently. This is shown in particular by the mean survival times of less than one year in glioblastoma and melanoma patients. Tumor therapeutic agents against bronchial carcinomas and carcinomas of the gastrointestinal tract are also insufficiently effective.
Bisherige Tumortherapeutika leiden zudem unter dem Nachteil, bereits in geringsten Konzentrationen hohe Nebenwirkungen, insbesondere Immunsup- pression und Blutbildveränderungen und Knochenmarksdepression sowie Induktion von neuen Tumoren zu verursachen.Previous tumor therapeutic agents also suffer from the disadvantage of causing high side effects even in the lowest concentrations, in particular immune suppression and changes in the blood count and bone marrow depression as well as induction of new tumors.
Es wurden bereits einige Versuche unternommen, eine Tumortherapie mit D20 durchzuführen. Diese blieben jedoch bisher erfolglos bzw. führten zu wider¬ sprüchlichen Ergebnissen. So berichtet z.B. Barbour (Barbour, H. und Allen, E. Tumor growth one fifth saturated with deuterium oxide (heavy water) , Am. J. Cancer 32, 1 938) über das langsamere Wachstum der implantierten Tumoren, kommt jedoch zu dem Schluß, daß die Überlebensspanne der tumortragenden Tiere durch D20 Anwendung dosisabhängig verkürzt wurde, daß also keine erfolgreiche Behandlung möglich ist. Insbesondere hohe D20 Konzentrationen werden stets als toxisch eingestuft.Some attempts have already been made to treat tumors with D 2 0 perform. However, these have so far been unsuccessful or have led to contradictory results. For example, Barbour (Barbour, H. and Allen, E. Tumor growth one fifth saturated with deuterium oxide (heavy water), Am. J. Cancer 32, 1 938) reports on the slower growth of the implanted tumors, but comes to the conclusion that the survival span of the tumor-bearing animals was reduced in a dose-dependent manner by D 2 0 application, so that no successful treatment is possible. In particular, high D 2 0 concentrations are always classified as toxic.
Neueste Literatur zum Thema D20 und Tumor belegen, daß der Entzug von D20 das Tumorwachstum im Mausmodell inhibiert (Somlyai, G ., Jansco, G., Jakli, G., et al. : Naturally occuring deuterium is essential for the normal growth rate of cells, FEBS 31 7, 1 -4 ( 1 993)), und das Vorhandensein von D20 notwen¬ dige Voraussetzung für das Tumorwachstum ist.The latest literature on D 2 0 and tumor shows that the withdrawal of D 2 0 inhibits tumor growth in the mouse model (Somlyai, G., Jansco, G., Jakli, G., et al.: Naturally occuring deuterium is essential for the normal growth rate of cells, FEBS 31 7, 1 -4 (1 993)), and the presence of D 2 0 is a necessary prerequisite for tumor growth.
Bisherige Untersuchungen zu D2O zeigten also, daß D2O als Tumortherapeuti- kum nur wenig geeignet erschien.Previous studies on D 2 O thus showed that D 2 O appeared to be of little use as a tumor therapeutic.
Explizit wird in der Literatur auch mehrfach auf die Reversibilität der Deuteri- umeffekte hingewiesen (Gross, P.R. et al., Mitotic Arrest by Deuterium Oxide, Science 1 31 , 37-39, 1 960).The reversibility of the deuterium effects is explicitly mentioned several times in the literature (Gross, P.R. et al., Mitotic Arrest by Deuterium Oxide, Science 1 31, 37-39, 1 960).
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine selektive und zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen und/oder Metastasen auszuüben und das Wachstum normaler Zellen weitgehend unbeeinflußt zu lassen sowie die Metastasierung und/oder das Wiederauftreten von Tumoren und/oder deren Nachwachsen zu verhindern. Dadurch würden auch einige der bei Tumorthe¬ rapeutika bekannten Nebenwirkungen vermieden.The present invention is therefore based on the object of exerting a selective and cytotoxic effect on tumor cells and / or metastases and of largely leaving the growth of normal cells unaffected and of preventing the metastasis and / or recurrence of tumors and / or their regrowth. This would also avoid some of the side effects known for tumor therapeutics.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung einer pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 1 ,2,9 oder 10 d.h. durch die Ver¬ wendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anrei- ehern bzw. freisetzen. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.This object is achieved by the use of a pharmaceutical composition according to patent claims 1, 2, 9 or 10, ie by the use of a pharmaceutical composition containing deuterium and / or deuterated substances and / or substances which induce deuterium. honor or release. Preferred embodiments result from the subclaims.
Systematische Untersuchungen zum Einsatz von Deuterium-enthaltenden Substanzen als Therapeutikum gegen Tumoren wurden bisher nicht durch¬ geführt, unklar war bisher insbesondere, ob Unterschiede in der Beeinflussung des Wachstums von Tumorzellen und normalen Zellen bestehen.Systematic studies on the use of deuterium-containing substances as a therapeutic agent against tumors have not yet been carried out, and it has so far been unclear whether differences exist in influencing the growth of tumor cells and normal cells.
Daher wurden von dem Anmelder systematische Studien über das Verhalten von Tumorzellen unter Deuteriumeinfluß durchgeführt.Therefore, the applicant has carried out systematic studies on the behavior of tumor cells under the influence of deuterium.
Überraschenderweise wurde dabei eine direkte zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen festgestellt. Zudem wurde überraschend festgestellt, daß die direkte zytotoxische Wirkung von Deuterium stark selektiv auf Tumorzellen ist, d.h. daß diese in wesentlich stärkerem Maße abgetötet werden als vergleich¬ bare Normalzellpopulationen. Überraschenderweise wurde zudem festgestellt, daß die bekannten Effekte der Zellzyklusarretierung und der Wachstumshem¬ mung ebenfalls in hohem Maße selektiv für Tumorzellen sind, d.h. daß Zell¬ zyklusarretierung und Wachstumshemmung auf Tumorzellen sehr viel stärker ausgeprägt ist als auf Normalzellen und somit eine selektive Wirkung auf Tumorzellen vorliegt.Surprisingly, a direct cytotoxic effect on tumor cells was found. In addition, it was surprisingly found that the direct cytotoxic effect of deuterium is highly selective on tumor cells, i.e. that they are killed to a much greater extent than comparable normal cell populations. Surprisingly, it was also found that the known effects of cell cycle arrest and growth inhibition are likewise highly selective for tumor cells, i.e. that cell cycle arrest and growth inhibition are much more pronounced on tumor cells than on normal cells and thus there is a selective effect on tumor cells.
Die direkte zytotoxische Wirkung kann in vitro an Zellkuiturmaterial nach¬ gewiesen werden. Dabei werden Zellen in vitro durch Zusatz einer Deuterium- enthaltenden Substanz bzw. Verbindung zum Kulturmedium abgetötet. Die nachfolgenden Vol.-% Angaben sind wie folgt zu verstehen. 100 Vol.-% Deuterium enthaltende Substanz bedeutet, daß dort alle H-Atome an einer (oder mehreren) bestimmten Stellen durch D-Atome ersetzt sind. Beispiels¬ weise enthält reines D2O, Molgewicht 20.03 g/mol, 2 Atome Deuterium (4g/mol) und ein Atom Sauerstoff ( 1 6 g/mol). Wird daher die Konzentration einer "Deuterium enthaltenden Substanz" festgelegt, beträgt ihr Gehalt an reinem Deuterium in diesem Beispielsfall nur maximal 20 Gew.-%, entspre¬ chend 1 00 Vol-%. Eine geeignete Konzentration zur Abtötung von über 95 % Zellen, z.B. des Tumors HTZ-1 9 (malignes Melanom) , unter geeigneten Kulturbedingungen als Monolayer ist über 50 Vol-% D20 bzw. 99,86 g Deuterium pro kg Wirksub¬ stanz oder eine andere Deuterium-enthaltende Substanz mit an einer bestimm- ten Stelle durch D ersetzten H-Atomen in 50 % Volumenanteil, vorzugsweise über 70 Vol-% ( 1 39,81 g Deuterium/kg), ganz bevorzugt über 90 Vol-% ( 1 79,75 g Deuterium/kg). Höhere oder geringere Konzentrationen sind jedoch ebenfalls zur Abtötung von Tumorzellen in höherem bzw. geringerem Umfang geeignet.The direct cytotoxic effect can be demonstrated in vitro on cell culture material. Cells are killed in vitro by adding a deuterium-containing substance or compound to the culture medium. The following% by volume are to be understood as follows. Substance containing 100% by volume of deuterium means that all H atoms at one (or more) specific positions are replaced by D atoms. For example, contains pure D 2 O, molecular weight 20.03 g / mol, 2 atoms of deuterium (4 g / mol) and one atom of oxygen (1 6 g / mol). If the concentration of a "deuterium-containing substance" is therefore determined, its pure deuterium content in this example is only a maximum of 20% by weight, corresponding to 100% by volume. A suitable concentration for killing over 95% of cells, for example the tumor HTZ-1 9 (malignant melanoma), under suitable culture conditions as a monolayer is over 50% by volume of D 2 0 or 99.86 g of deuterium per kg of active substance or another deuterium-containing substance with H atoms replaced by D at a certain point in 50% by volume, preferably over 70% by volume (1 39.81 g deuterium / kg), very preferably over 90% by volume (1 79.75 g deuterium / kg). However, higher or lower concentrations are also suitable for killing tumor cells to a greater or lesser extent.
Bei einer Konzentration von ca. 1 0 Vol.-% ( 1 9,97 g Deuterium/kg) D20 oder Deuterium-enthaltender Substanz wurden bei Normalgliazellen HTZ-1 40 im gleichen Zeitraum nur 5% Wachstumshemmung, aber keine Zellabtötung, beobachtet.At a concentration of approx. 10% by volume (1 9.97 g deuterium / kg) D 2 0 or deuterium-containing substance, only 5% growth inhibition, but no cell killing, was observed in normal glial cells HTZ-1 40 in the same period .
Es hat sich gezeigt, daß Deuterium auf Tumorzellen eine zytotoxische Wirkung nachgewiesen durch Hemmung der DNA-Synthese [3H-Thymidin-Einbau, Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H. Shevach, E.M., Strober, W., Current Protocols Immunology, NIH Monographie, J. Wiley & Sons, New York, 1 992], sowie nachgewiesen durch Zellmembrandefekt [Trypanblau-Färbung, G. K. Smith, Duch, D.S., Dev, I.K. Kaufmann, S.H., Metabolie Effects and Kill of Human T-Cell Leukemia by 5-Deaza acyclotetrahydrofolate, a Specific Inhibitor of Glycineamide Ribonucleotide Transformylase, Cancer Res. 52, 4895-4903, ( 1 992)] hat. Das Überleben von normalen, nicht entarteten Zellen wird dagegen nur in geringerem Umfang beeinflußt. Daher eignen sich Deuteri¬ um-enthaltende Substanzen zur Herstellung eines Therapeutikums zur Ab¬ tötung von Tumorzellen und/oder Metastasen sowie zur Verhinderung von Metastasen und/oder des lokalen Wiederauftretens von Tumoren und deren Nachwachsen. Insbesondere ist ein solches Therapeutikum zur Therapie von malignen Melanomen, Gliomen und Astrozytomen, Bronchialkarzinomen (ins¬ besondere kleinzellige Bronchialkarzinome), Neuroblastomen, sowie Karzino¬ men des Magen-Darm-Traktes geeignet. Für die therapeutische Anwendung werden Deuterium oder deuteriumhaltige bzw. deuteriumfreisetzende oder deuteriumanreichernde Substanzen üblicher¬ weise mit Hilfs-, Füll- und/oder Zusatzstoffen (z.B. Geschmacksstoffe, Elek- trolyte, Nährstoffe, Vitamine, resorbtionsbeeinflussende Substanzen) zu- sammen in einer, vorzugsweise sterilen, isotonen und/oder pyrogenfreien, pharmazeutischen Zubereitung bzw. Formulierung verwendet, vorzugsweise in Form von Zäpfchen, Salben, Lösungen, Dispersionen und Emulsionen, Aeroso¬ len, Schäumen, teilchenförmigen Mitteln (z.B. Granulaten, Agglomeraten, Puder, Mikroperlen und Adsorbaten) , Pillen, Pastillen, Tabletten, Dragees, Kapseln bzw. Mikrokapseln, Kaugummiarten, Gewebe-, Blatt- oder Faden¬ grundlagen, mit Bandagen oder Verbänden, zum Rauchen oder Inhalieren sowie in Carriern, wie z.B. Liposomen.It has been shown that deuterium has a cytotoxic effect on tumor cells by inhibiting DNA synthesis [ 3 H-thymidine incorporation, Coligan, JE, Kruisbeek, AM, Margulies, DH Shevach, EM, Strober, W., Current Protocols Immunology , NIH Monographie, J. Wiley & Sons, New York, 1 992], and also demonstrated by cell membrane defect [trypan blue staining, GK Smith, Duch, DS, Dev, IK Kaufmann, SH, Metabolie Effects and Kill of Human T-Cell Leukemia by 5-Deaza acyclotetrahydrofolate, a Specific Inhibitor of Glycineamide Ribonucleotide Transformylase, Cancer Res. 52, 4895-4903, (1 992)]. However, the survival of normal, non-degenerate cells is only affected to a lesser extent. Therefore, deuterium-containing substances are suitable for producing a therapeutic agent for killing tumor cells and / or metastases and for preventing metastases and / or the local recurrence of tumors and their regrowth. Such a therapeutic agent is particularly suitable for the therapy of malignant melanomas, gliomas and astrocytomas, bronchial carcinomas (in particular small-cell bronchial carcinomas), neuroblastomas and carcinomas of the gastrointestinal tract. For therapeutic use, deuterium or deuterium-containing or deuterium-releasing or deuterium-enriching substances are usually combined with auxiliaries, fillers and / or additives (for example flavorings, electrolytes, nutrients, vitamins, substances which influence absorption) in one, preferably sterile , isotonic and / or pyrogen-free, pharmaceutical preparation or formulation used, preferably in the form of suppositories, ointments, solutions, dispersions and emulsions, aerosols, foams, particulate agents (for example granules, agglomerates, powder, microbeads and adsorbates), pills , Lozenges, tablets, dragees, capsules or microcapsules, types of chewing gum, tissue, leaf or thread bases, with bandages or bandages, for smoking or inhaling and in carriers, such as liposomes.
Die Verabreichung erfolgt zur Therapie vorzugsweise lokal, intracutan oder transcutan; zur systemischen Anwendung vorzugsweise intravenös, durch teilweisen Austausch des Körperwasser- oder Blutwasseranteils (z.B. per Dialyse), intraarteriell, oral, rectal; zur Anwendung in Hohlräumen vorzugs¬ weise intrapleural, intrathekal, intraventriculär, intraperitoneal, intracavitär, in OP-Höhlen. Die Anwendung in OP-Höhlen dient vorzugsweise zur Rezidiv- prophylaxe des entfernten Tumors, d.h. zur Verhinderung des lokalen Wieder¬ auftretens und Nachwachsens des Tumors. Möglich ist auch die extrakorporale Abtötung von Tumorzellen (z.B. "purging" bei Knochenmarksneoplasien) .For therapy, the administration is preferably local, intracutaneous or transcutaneous; For systemic use, preferably intravenously, by partially exchanging the body water or blood water content (e.g. by dialysis), intraarterially, orally, rectally; for use in cavities, preferably intrapleural, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal, intracavitary, in operating theaters. Use in operating theaters is preferably used to prevent relapse of the removed tumor, i.e. to prevent local recurrence and regrowth of the tumor. Extracorporeal killing of tumor cells is also possible (e.g. "purging" in bone marrow neoplasia).
Für therapeutische Anwendungen werden Deuterium oder deuteriumhaltige bzw. deuteriumfreisetzende oder deuteriumanreichernde Substanzen auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert, vorzugsweise anderen Zytostatika oder Tumortherapeutika. Durch den neuentdeckten Effekt der Zellabtötung sowie die Tumorspezifität können additive bzw. überadditive (synergistische) Wir¬ kungen in Kombination mit anderen Zytostatika und Tumortherapeutika er- reicht werden. Dies geschieht vorzugsweise durch Angriff auf das Zytoskelett, insbesondere durch Angriff am Tubulin. Insbesondere ist von einer Kombina¬ tion mit erfindungsgemäßen deuteriumhaltigen Therapeutika eine Reduktion der Dosis des kombinierten Zytostatikums/Tumortherapeutikums zu erwarten und demzufolge auch eine Minderung der oft Therapie-einschränkenden Neben¬ wirkungen.For therapeutic applications, deuterium or deuterium-containing or deuterium-releasing or deuterium-enriching substances are also combined with other active substances, preferably other cytostatics or tumor therapeutics. The newly discovered effect of cell killing and the tumor specificity mean that additive or superadditive (synergistic) effects can be achieved in combination with other cytostatics and tumor therapeutics. This is preferably done by attacking the cytoskeleton, especially by attacking the tubulin. In particular, a reduction in the dose of the combined cytostatic / tumor therapeutic can be expected from a combination with deuterium-containing therapeutic agents according to the invention consequently also a reduction in the side effects, which often restrict therapy.
Insbesondere ist eine Kombination mit Zytostatika/Tumortherapeutika erfolg- versprechend, die auf gleichen oder ähnlichen Wirkprinzipien wie Deuterium beruhen, nämlich Zellabtötung (auch Apoptose) .In particular, a combination with cytostatics / tumor therapeutics is promising, based on the same or similar principles of action as deuterium, namely cell killing (also apoptosis).
Beispiele für mögliche Kombinationspartner sind daher:Examples of possible combination partners are:
- Zelltodauslösende Substanzen: wie z.B. Adriamycin, Cisplatin, Cyclo- sporin A, Vinca-Alkaloide- substances that cause cell death: such as Adriamycin, cisplatin, cyclosporin A, vinca alkaloids
Inhibierende Wachstumsfaktoren, die Zelltod auslösen können: wie z.B. TGF-ß (Tumor growth factor ß), TNF (Tumor necrosis factor)Inhibitory growth factors that can trigger cell death: such as TGF-ß (tumor growth factor ß), TNF (tumor necrosis factor)
Substanzen, die am Tubulin-Zytoskelett angreifen, wie z.B. Vinca-Alka¬ loide, Taxol, Taxol-Derivate sowie Colchicin und Colchicin-DerivateSubstances that attack the tubulin cytoskeleton, e.g. Vinca alkaloids, taxol, taxol derivatives and colchicine and colchicine derivatives
Alkylantien: wie z.B. Cyclophosphamid, Busulfan, ACNU und andere NitroseharnstoffderivateAlkylating agents: such as Cyclophosphamide, busulfan, ACNU and other nitrous urea derivatives
Purin und Pyrimidin-Antagonisten wie z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin, CytarabinPurine and pyrimidine antagonists such as e.g. Azathioprine, 6-mercaptopurine, cytarabine
Therapieeinschränkend ist bei vielen Zytostatika/Tumortherapeutika die häma- totoxische/immunsuppresive (Neben-)Wirkung (Verminderung der Blutzell¬ zahlen/insbesondere Lymphozyten, sowie Knochenmarksdepression). Eine solche Wirkung ist von Deuterium bzw. Deuteriumhaltigen oder anreichernden Substanzen für Normalzellen, wie für Normalhirnzellen und insbesondere Lymphozyten (Beispiel 6) gezeigt, nicht zu erwarten, d.h. Tumorzellen werden selektiv abgetötet. Aus diesem Grund ist auch die Behandlung von tumorös infiltriertem Knochenmark bzw. Knochenmarksstammzellen vor Knochenmark¬ stransplantationen ("purging") zur selektiven Eliminierung von Tumorzellen möglich, wobei dies intrakorporal als auch extrakorporal geschehen kann. Eine gleiche Wirkung kann daher durch Kombination solcher Tumortherapeutika mit Deuterium bzw. deuteriumhaltigen und freisetzenden Substanzen bei geringerer Dosis erzielt werden. Bei gleicher Dosis kann durch die Kombination mit Deuterium ein größerer Antitumor-Effekt als bisher möglich erreicht werden.For many cytostatics / tumor therapeutics, the hemotoxic / immunosuppressive (side) effect (reduction in the number of blood cells / in particular lymphocytes and bone marrow depression) is restrictive of therapy. Such an effect is not to be expected from deuterium or deuterium-containing or enriching substances for normal cells, as shown for normal brain cells and in particular lymphocytes (example 6), ie tumor cells are selectively killed. For this reason, the treatment of tumor-infiltrated bone marrow or bone marrow stem cells before bone marrow transplantation ("purging") is used for the selective elimination of tumor cells possible, which can be done intracorporeally as well as extracorporeally. The same effect can therefore be achieved by combining such tumor therapeutic agents with deuterium or deuterium-containing and releasing substances at a lower dose. At the same dose, a greater anti-tumor effect than previously possible can be achieved by combining it with deuterium.
Deuterierte Tumortherapeutika sind daher insbesondere geeignet zur Kom¬ bination mitDeuterated tumor therapeutic agents are therefore particularly suitable for combination with
- Antimetaboliten: wie z.B. Methotrexat, ThioguaninAntimetabolites: such as Methotrexate, thioguanine
Alkaloide: wie z.B. Vinblastin, Vincristin, TaxolAlkaloids: such as Vinblastine, vincristine, taxol
Antibiotika mit Tumor-therapeutischer Potenz: wie z.B. Daunorubicin, Bleomycin, EpirubicinAntibiotics with tumor therapeutic potency: such as Daunorubicin, Bleomycin, Epirubicin
verschiedenen anderen Knochenmarks-depressiv wirkenden Tumor¬ therapeutika, wie z.B. Hydroxyharnstoff, Procarbazin sowie Alkylantien, und Purin/Pyrimidinderivate.various other bone marrow depressive tumor therapeutics, such as Hydroxyurea, procarbazine and alkylating agents, and purine / pyrimidine derivatives.
Eine synergistische oder potenzierende Wirkung ergibt sich auch bei Einsatz der pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit Bestrahlungs¬ methoden, wie Gammastrahlung, Elektronenstrahlung (ß-Strahlung), Neutronen und Korpuskularstrahlung.A synergistic or potentiating effect also results when the pharmaceutical composition is used in combination with irradiation methods such as gamma radiation, electron radiation (β-radiation), neutrons and corpuscular radiation.
Die Zeilproliferation wurde mittels 3H-Thymidin-Einbau, wie z.B. in "Bogdahn, U., R. Apfel, M. Hahn, M. Gorlach, C. Bohl, J. Hoppe und R. Martin: Autocrine tumor cell growth inhibiting activities from Human Malignant Melanoma, Cancer Res. 49, 5358-5363 ( 1 989)" dargestellt, gemessen. Wachstums- und Überlebenskurven liegen Zellzählung mit Trypanblau-Farbstoff zugrunde.The cell proliferation was determined by means of 3 H-thymidine incorporation, as described for example in "Bogdahn, U., R. Apfel, M. Hahn, M. Gorlach, C. Bohl, J. Hoppe and R. Martin: Autocrine tumor cell growth inhibiting activities from Human Malignant Melanoma, Cancer Res. 49, 5358-5363 (1,989) ". Growth and survival curves are based on cell counting with trypan blue dye.
Vorzugsweise werden solide Tumore, wie z.B. Glioblastoma multiforme, Astro- zytom, malignes Melanom, kleinzelliges Bronchialkarzinom, Colonkarzinom, Sarkome, Mammakarzinome, Zervixkarzinome, Uteruskarzinome, Prostatakarzi¬ nome, Schilddrüsenkarzinome, Pankreaskarzinome sowie Malignome des hämatopoetischen und lymphopoetischen Systems, durch die erfindungsgemä¬ ße Zusammensetzung therapiert.Solid tumors, such as glioblastoma multiforme, astrocytoma, malignant melanoma, small cell bronchial carcinoma, colon carcinoma, are preferred. Sarcomas, breast cancers, cervical cancers, uterine cancers, prostate cancers, thyroid cancers, pancreatic cancers as well as malignancies of the hematopoietic and lymphopoietic system, treated by the composition according to the invention.
Als Kontrolle für Normalzellen können Zellen aus Normalhirn (nach Schädel- Hirn-Trauma), Normalhirn oder IL-2 stimulierte (frisch isolierte) Lymphozyten, PHA stimulierte (frisch isolierte) Lymphozyten verwendet werden.As a control for normal cells, cells from normal brain (after skull trauma), normal brain or IL-2 stimulated (freshly isolated) lymphocytes, PHA stimulated (freshly isolated) lymphocytes can be used.
Die Wirkung von Deuterium auf Zellen wird vorzugsweise mit D20 erreicht. Die Herstellung des geeignet konzentrierten D20 erfolgte im Experiment vorzugs¬ weise durch Verdünnen von hochreinem D20 ( > 99%) mit H20. Zur Therapie bestimmtes D20 wird vorzugsweise direkt in der gewünschten Konzentration hergestellt. Die erfindungsgemäße Wirkung von Deuterium kann aber auch durch andere, Deuterium enthaltende oder Deuterium in geeigneter Weise freisetzende oder anreichernde Substanzen erzielt werden. Darunter sind alle denkbaren anorganischen oder organischen Verbindungen, die Deuterium enthalten, zu verstehen, z. B. insbesondere deuterierte Aminosäuren (wie z.B. deuteriertes Glutamin, deuteriertes Alanin und deuteriertes Glutamat), deute- rierte Zucker (wie z.B. deuterierte Glucose, deuterierte Fructose), deuterierte Fette, deuterierte DNA- oder RNA-Bausteine (z.B. deuteriertes Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin, Uracil) sowie deuterierte Stoffwechselprodukte (z.B. deuteriertes Pyruvat, deuteriertes Lactat) sowie deuterierte Stoffwechsel¬ produkte des Intermediärstoffwechsels.The effect of deuterium on cells is preferably achieved with D 2 0. The suitably concentrated D 2 0 was preferably produced in the experiment by diluting high-purity D 2 0 (> 99%) with H 2 0. D 2 0 intended for therapy is preferably produced directly in the desired concentration. However, the effect of deuterium according to the invention can also be achieved by other substances which contain deuterium or which release or enrich deuterium in a suitable manner. This includes all conceivable inorganic or organic compounds that contain deuterium, z. B. especially deuterated amino acids (such as deuterated glutamine, deuterated alanine and deuterated glutamate), deuterated sugars (such as deuterated glucose, deuterated fructose), deuterated fats, deuterated DNA or RNA building blocks (eg deuterated adenine, guanine, cytosine , Thymidine, uracil) and deuterated metabolic products (eg deuterated pyruvate, deuterated lactate) and deuterated metabolic products of the intermediate metabolism.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß durch Anwendung von D20 und anderen deuterierten Verbindungen überraschenderweise eine erfolgreiche Therapie von Tumoren und Metastasen möglich ist. Eine Metastasierung wird vollständig verhindert.In summary, it can be stated that the use of D 2 0 and other deuterated compounds surprisingly enables successful therapy of tumors and metastases. Metastasis is completely prevented.
Neben einer Wachstumsverlangsamung wird überraschenderweise auch eine irreversible Zerstörung von Tumoren bzw. Tumorzellen durch den Effekt des "cell-kill" beobachtet. Der Effekt der Zelltötung ist dabei tumorspezifisch, eine Abtötung von gesunden Zellen wird nur in einem nicht relevanten Umfang beobachtet.In addition to a slowdown in growth, an irreversible destruction of tumors or tumor cells by the effect of "cell kill" is also surprisingly observed. The effect of cell killing is tumor-specific, one The killing of healthy cells is only observed to an insignificant extent.
Entgegen früher Annahmen weist D20 in einer therapeutisch wirksamen Dosis, d.h. in einer Dosis bei der eine -Abtötung von Tumorzellen beobachtet wird, eine ausreichende Verträglichkeit auf, so daß eine Anwendung über längere Behandlungszeiträume bis zur vollständigen Heilung möglich ist.Contrary to earlier assumptions has D 2 0 in a therapeutically effective dose, ie, is observed at a dose at which a -Abtötung of tumor cells, a sufficient compatibility, so that an application over prolonged periods of treatment until complete cure is possible.
Die Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den anhängenden Abbildungen erläutert. Die Abbildungen zeigen:The invention will now be further elucidated by the following examples in connection with the attached figures. The pictures show:
Abb. 1 , 2, 9, 1 3, 14, 1 9, 23: 3H-Thymidin-Einbau in Relation zur Deuteri¬ um-Konzentration,Fig. 1, 2, 9, 1 3, 14, 1 9, 23: 3 H-thymidine incorporation in relation to the deuterium concentration,
Abb. 3, 4, 1 0, 1 5, 1 6, 20, 24: Wachstumskurven von Tumorzellen undFig. 3, 4, 1 0, 1 5, 1 6, 20, 24: growth curves of tumor cells and
Kontrollen,Controls,
Abb. 5, 6, 1 1 , 1 7, 21 , 25: Überlebensrate von Tumorzellen in Relation zur Aufenthaltsdauer in Deuterium-enthalten- den Medien,Fig. 5, 6, 1 1, 1 7, 21, 25: survival rate of tumor cells in relation to the length of stay in media containing deuterium,
Abb. 7, 8, 1 2, 1 8, 22, 26: Überlebensfraktion von Tumorzellen in Rela¬ tion zur Aufenthaltsdauer in Deuterium-ent- haltenden MedienFig. 7, 8, 1 2, 1 8, 22, 26: survival fraction of tumor cells in relation to the length of stay in deuterium-containing media
Abb. 27a + b: Zellzyklus von unbehandelten HTZ-1 9-Mela- nomzellenFig. 27a + b: Cell cycle of untreated HTZ-1 9 melanoma cells
Abb. 28a + b: Zellzyklus von HTZ-1 9-Melanomzellen nach 3 Tagen in 50 Vol-% D2OFig.28a + b: Cell cycle of HTZ-1 9 melanoma cells after 3 days in 50 vol% D 2 O
Abb. 29a + b: Zellzyklus von HTZ-1 9-Melanomzellen nach 3Fig.29a + b: Cell cycle of HTZ-1 9 melanoma cells after 3
Tagen in 90 Vol-% D2O Abb. 30: Koloniebildungsrate in Soft AgarDays in 90 vol% D 2 O Fig. 30: Colony formation rate in soft agar
Abb. 31 : Migrationsfläche eines TumorsFig. 31: Migration area of a tumor
Abb. 32: Vergleich der Anzahl von Lebermetastasen bei unbehandelten Versuchstieren und mit D20-behandelten Versuchstieren nach Im¬ plantation eines Sarkoms M 5076Fig. 32: Comparison of the number of liver metastases in untreated test animals and with D 2 0-treated test animals after implantation of a sarcoma M 5076
Abb. 33: Vergleich der Anzahl überlebender Versuchs¬ tiere nach intraperitonealer Implantation eines Sarkoms M 5076Fig. 33: Comparison of the number of surviving test animals after intraperitoneal implantation of a sarcoma M 5076
Beispiel :For example:
Bestimmung der Wirkung von Deuterium auf TumorzeilenDetermination of the effect of deuterium on tumor lines
Zur Bestimmung der Wirkung von Deuterium auf Tumorzellen werden exponen- tiell wachsende HTZ-209B, HTZ 243, HTZ 1 9, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 oder HT 29 Zellen für jeweils mindestens 24 Stunden in Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen (wells) (Costar, Zürich) in 200 μ\ Kulturmedium mit einer Dichte von 3000 Zellen pro well ausgesät [nach Chambard et al. J. Cell. Physiol. 1 35 ( 1 988), 1 01 -1 07]. Das Kulturmedium besteht aus Dulbeccos MEM mit 1 0% FCS-Zusatz, 1 % Vitaminen, 1 % nichtessentielle Aminosäuren sowie 0,3% L- Glutamin.To determine the effect of deuterium on tumor cells, exponentially growing HTZ-209B, HTZ 243, HTZ 1 9, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 or HT 29 cells are each used for at least 24 hours in microculture plates with 96 wells (Costar, Zurich) sown in 200 μ \ culture medium with a density of 3000 cells per well [according to Chambard et al. J. Cell. Physiol. 1 35 (1 988), 1 01 -1 07]. The culture medium consists of Dulbecco's MEM with 1 0% FCS addition, 1% vitamins, 1% non-essential amino acids and 0.3% L-glutamine.
Danach wird ein Mediumwechsel durchgeführt und deuteriertes Medium zugesetzt. Deuterierte Medien werden unter Verwendung von MEM-Pulver- medium und hitzesterilisiertem D2O sowie Ultra Pure Water zur Verdünnung mit identischen Zusätzen, wie konventionelles Kulturmedium, hergestellt.A medium change is then carried out and deuterated medium is added. Deuterated media are produced using MEM powder medium and heat-sterilized D 2 O as well as Ultra Pure Water for dilution with identical additives as conventional culture medium.
Die Zellen werden in deuteriertem Medium in der gewünschten Konzentration /03996 PC17EP95/03100The cells are in deuterated medium in the desired concentration / 03996 PC17EP95 / 03100
- 1 1 - für einen definierten Zeitraum bei 37 °C, 5% C02, inkubiert. Nach Zugabe von 1μCi 3H-Thymidin (spez. Aktivität 23 Ci/mol, Amersham Buchler, Braun¬ schweig) pro well werden die Zellen 1 6 Stunden weiter inkubiert und anschlie¬ ßend wird der 3H-Thymidin-Einbau in die zelluläre DNA nach Säurefällung in üblicher Weise mittels Flüssigszintillationszähler gemessen. Die Wirkung von Deuterium wird als Prozentsatz des 3H-Thymidin-Einbaus der behandelten Zellen gegenüber dem 3H-Thymidin-Einbau in unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt.- 1 1 - incubated for a defined period at 37 ° C, 5% C0 2 . After the addition of 1 μCi 3 H-thymidine (specific activity 23 Ci / mol, Amersham Buchler, Braun¬ schweig) per well, the cells are incubated for a further 16 hours and the 3 H-thymidine incorporation into the cellular DNA is then carried out after acid precipitation in the usual way measured using a liquid scintillation counter. The effect of deuterium is expressed as a percentage of the 3 H-thymidine incorporation of the treated cells compared to the 3 H-thymidine incorporation in untreated control cells.
Unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von D20 kann eine Konzen¬ tration ermittelt werden, bei welcher der 3H-Thymidin-Einbau um 50% gegen¬ über der unbehandelten Kontrolle gehemmt wird. (IC 50 Wert).Using different concentrations of D 2 0, a concentration can be determined in which the 3 H-thymidine incorporation is inhibited by 50% compared to the untreated control. (IC 50 value).
Tumor IC 50 [Vol -% D20]Tumor IC 50 [% D 2 0]
HTZ 209 Glioblastoma multiforme 41HTZ 209 Glioblastoma multiforme 41
HTZ 243 Astrozytom, WHO III 9HTZ 243 Astrocytoma, WHO III 9
HTZ 1 9 malignes Melanom 49HTZ 1 9 malignant melanoma 49
HTB 69 malignes Melanom 71HTB 69 malignant melanoma 71
HTZ 25 Bronchialkarzinom 39HTZ 25 bronchial carcinoma 39
CaCo-2 Colonkarzinom 45CaCo-2 colon carcinoma 45
HT 29 Colonkarzinom 42HT 29 colon carcinoma 42
Beispiel 2:Example 2:
Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von Deuterium auf TumorzellenDetermination of the cytotoxic activity of deuterium on tumor cells
Zur Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von Deuterium auf Tumorzellen werden analog Beispiel 1 exponentiell wachsende HTZ- 1 9, HTZ 209, HTZ 243, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 oder HT 29 Zellen für mindestens 24 Stunden in Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen (wells) oder in Mikrokulturplatten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 1 0.000 Zellen pro well ausgesät. Das Kulturmedium besteht analog Beispiel 1 aus Dulbeccos MEM mit 10% FCS Zusatz, 1 % Vitaminen, 1 % nichtessentiellen Aminosäuren sowie 0,3% L- Glutamin. Danach wird ein Mediumwechsel durchgeführt und deuteriertes Medium in gewünschter Konzentration zugesetzt. Die Zellen werden in deute- riertem Medium in der gewünschten Konzentration für einen definierten Zeit¬ raum bei 37 °C, 5% C02, inkubiert. Danach werden die Zellen mit Trypsin abgelöst und in einem definierten Volumen mit Trypanblau (Trypan Blue Stain 0,4%, Sigma Chemicals St. Louis) versetzt. Die Zellzahl vitaler sowie geschä¬ digter Zellen wird in der Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt und als Wachtums- kurve bzw. Überlebenskurve aufgetragen. Als ein Maß für die Wirkung auf verschiedene Tumorzellkulturen kann die "surviving fraction", also der Anteil überlebender Zellen der behandelten Gruppe gegenüber unbehandelten Kon¬ trollen, nach 3 bzw. 6 Tagen Inkubation mit 90 Vol-% D20-Medium angegeben werden.To determine the cytotoxic effect of deuterium on tumor cells, exponentially growing HTZ-1 9, HTZ 209, HTZ are used analogously to Example 1 243, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 or HT 29 cells sown for at least 24 hours in microculture plates with 96 wells or in microculture plates with 24 wells with a density of 1 0,000 cells per well. As in Example 1, the culture medium consists of Dulbeccos MEM with 10% FCS addition, 1% vitamins, 1% non-essential amino acids and 0.3% L-glutamine. A medium change is then carried out and deuterated medium is added in the desired concentration. The cells are incubated in a concentrated medium in the desired concentration for a defined period of time at 37 ° C., 5% CO 2 . The cells are then detached with trypsin and trypan blue (Trypan Blue Stain 0.4%, Sigma Chemicals St. Louis) is added in a defined volume. The cell number of vital and damaged cells is counted in the Fuchs-Rosenthal chamber and plotted as a growth curve or survival curve. As a measure of the effect on different tumor cell cultures, the surviving fraction, ie the proportion of surviving cells of the treated group compared to untreated controls, can be given after 3 or 6 days of incubation with 90% by volume of D 2 O medium.
Tumor SF 3d SF 6d [90 Voi-% D20]Tumor SF 3d SF 6d [90 Voi-% D 2 0]
HTZ 209 Glioblastoma multiforme 0,55 0,07HTZ 209 glioblastoma multiforme 0.55 0.07
HTZ 243 Astrozytom, WHO III 0,58 0,32HTZ 243 astrocytoma, WHO III 0.58 0.32
HTZ 1 9 malignes Melanom 0,25 0,05HTZ 1 9 malignant melanoma 0.25 0.05
HTB 69 malignes Melanom 0, 14 0,08HTB 69 malignant melanoma 0.14 0.08
HTZ 25 Bronchialkarzinom 0,35 0, 20HTZ 25 bronchial carcinoma 0.35 0, 20
CaCo-2 Colonkarzinom 0,08 0,05CaCo-2 colon cancer 0.08 0.05
HT 29 Colonkarzinom 0,04 0,01 Eine weitere geeignete Methode zur Überprüfung der Wirksamkeit eines Zyto- statikums ist die Koloniebildung in Soft Agar. Nach Aussäen einer definierten Zahl von Zellen wird nach 3 Wochen die Zahl der gebildeten Kolonien ausge¬ zählt und im Verhältnis zur Kontrolle als "Colony Forming Efficiency" (CFE) ausgewertet.HT 29 colon carcinoma 0.04 0.01 Another suitable method for checking the effectiveness of a cytostatic is colony formation in soft agar. After sowing a defined number of cells, the number of colonies formed is counted after 3 weeks and evaluated in relation to the control as "Colony Forming Efficiency" (CFE).
Aus Abb. 30 sieht man, daß es bei den beiden getesteten Tumoren HT-29 (Colonkarzinom) und HTZ1 9 (malignes Melanom) zu einer hohen Wirksamkeit von D20 kommt und unter 90 Vol-% D20 ist ein Rückgang um 4 bzw. 5 Zehnerpotenzen vitaler koloniebildender Tumorzellen festzustellen.From Fig. 30 it can be seen that the two tested tumors HT-29 (colon carcinoma) and HTZ1 9 (malignant melanoma) show a high effectiveness of D 2 0 and below 90 vol% D 2 0 there is a decrease by 4 or 5 powers of ten of vital colony-forming tumor cells.
Beispiel 3: MelanomeExample 3: Melanoma
Getestet wurden zwei verschiedene Tumoren, HTZ-1 9 und HTB-69. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS Zusatz expandiert. 3H Thyrr.idin Assays wurden in 96-well-Platten, Wachstumskurven z.T. auch in 24-well- Platten durchgeführt.Two different tumors, HTZ-1 9 and HTB-69, were tested. The tumors were expanded in MEM with 10 vol .-% FCS addition. 3 H thyrridine assays were carried out in 96-well plates, growth curves in some cases also in 24-well plates.
Mittels 3H-Thymidin-Einbau (Abb. 1 ,2) als Modell für die Proliferationsaktivität konnte bei beiden Tumoren eine Inhibition von über 90 % bei 6-tägiger Exposi¬ tion mit 90 Vol.-% Deuterium (D2O) im Medium nachgewiesen werden (HTZ- 1 9: 91 % HTB-69:96%).By means of 3 H-thymidine incorporation (Fig. 1, 2) as a model for the proliferation activity, an inhibition of over 90% with 6-day exposure with 90 vol.% Deuterium (D 2 O) in the medium could be achieved in both tumors can be detected (HTZ-1 9: 91% HTB-69: 96%).
Die Wachstumskurven (Abb. 3,4) zeigten bei HTZ-1 9 bereits bei 50 Vol.-% D20 (99,86 g Deuterium/kg) eine deutliche Verlangsamung des Wachstums, bei 90 Vol.-% D20 ( 1 79,75 g D2O/kg) kam es zur Stagnation des Wachstums über den vollen Beobachtungszeitraum von 1 3 Tagen. Bei HTB-69 konnte ein deutlicher absoluter Rückgang der Zellzahl verzeichnet werden, während die unbehandelten Kontrollen exponentielle Vermehrung zeigten.The growth curves (Fig. 3,4) for HTZ-1 9 showed a significant slowdown in growth at 50% by volume D 2 0 (99.86 g deuterium / kg), at 90% by volume D 2 0 ( 1 79.75 g D 2 O / kg) the growth stagnated over the full observation period of 1 3 days. HTB-69 showed a clear absolute decrease in cell count, while the untreated controls showed exponential growth.
Die Überlebensrate (Abb. 5,6), ("surviving rate") stellt ein Maß für den durch Deuterium ausgelösten Zelltod dar: Nach 6 Tagen in 90 Vol.-% Deuteriumme- dium zeigten sich bei HTZ- 1 9 68% tote Zellen (sr = 32), bei HTB-69 58% tote (sr = 42%), nach 12 Tagen wurden 78% bzw. 73% tote Zellen registriert (ermittelt mittels Trypanblau-Zellzählung) .The surviving rate (Fig. 5,6), ("surviving rate") represents a measure of the cell death caused by deuterium: after 6 days in 90 vol .-% deuterium dium were found in HTZ-1 9 68% dead cells (sr = 32), in HTB-69 58% dead cells (sr = 42%), after 12 days 78% and 73% dead cells were registered (determined using trypan blue Cell count).
Der resultierende Gesamteffekt durch Deuterium wurde als Überlebensfraktion (Abb. 7,8) ("surviving fraction") gemessen; nach 6 Tagen in 90 Vol.-% Deute¬ riummedium ergab sich bei HTZ-1 9 eine Überlebensfraktion von 0,04, bei HTB 0,07, nach 1 2 Tagen bei beiden Tumoren kleiner als 0,01 . Dies bedeutet einen Rückgang vitaler Tumorzellen unter Deuteriumbehandlung von mehr als zwei Zehnerpotenzen (2 log-cell kill). Bereits nach 1 Tag lag bei HTB-69 die Über¬ lebensfraktion unter 0,5.The resulting overall effect from deuterium was measured as a surviving fraction (Fig. 7,8); after 6 days in 90% by volume of deuterium medium, the survival fraction for HTZ-19 was 0.04, for HTB 0.07, after 12 days for both tumors it was less than 0.01. This means a decrease in vital tumor cells under deuterium treatment of more than two powers of ten (2 log-cell kill). The survival fraction of HTB-69 was already less than 0.5 after 1 day.
Zur Verifizierung der aus Zellzählung und Wachstumskurven erhaltenen Infor¬ mation wurden Versuche mittels Durchflußzytometrie durchgeführt. Zusätzlich zur Information über die Vitalität der Zellen erhält man dabei bei Verwendung entsprechender Farbstoffe die Information über den DNA-Gehalt der Zelle, und damit über ihre Zugehörigkeit zu einer bestimmten Phase des Zellzyklus. Für diese Untersuchungen wurde Hoechst 33342 als unspezifischer DNA Marker zusammen mit Ethidiumbromid als Vitalitätsmarker eingesetzt. Stellvertretend für alle Ergebnisse aus Durchflußzytometrieexperimenten sollen hier die Ergeb¬ nisse am Melanom HTZ-1 9 dargestellt werden.Experiments were carried out by means of flow cytometry to verify the information obtained from cell counting and growth curves. In addition to information about the vitality of the cells, the use of appropriate dyes provides information about the DNA content of the cell, and thus about its belonging to a certain phase of the cell cycle. For these investigations, Hoechst 33342 was used as a non-specific DNA marker together with ethidium bromide as a vitality marker. Representative of all results from flow cytometry experiments, the results of the melanoma HTZ-19 are to be presented here.
In den Abbildungen 27a, 28a, 29a werden die Häufigkeitsverteilungen ("Ver¬ teilung") von HTZ-19 Melanomzellen im Zellzyklus vorgestellt. Aus den primä- ren Daten der Häufigkeit des Auftretens einer bestimmten DNA-Menge (im Diagramm als einzelne Meßpunkte dargestellt) wird eine Ausgleichskurve (Diagramm: gestrichelte Linie) errechnet. An diese Ausgleichskurve werden die Verteilungsfunktionen der einzelnen Zellzykluskompartimente (Diagramm: durchgezogene Linien je für G- , S und G2 Phase) angepaßt und aus diesen Verteilungsfunktionen die relativen Häufigkeiten ermittelt. Damit ergibt sich die prozentuale Verteilung der Zellen auf die Zellzykluskompartimente, die jeweils am Rand der Abbildungen ablesbar ist. Dargestellt wird in den Abbildungen 27a-29a immer die Anzahl der Zellen (Ordinate) in Abhängigkeit ihres DNA-Gehalts (Abszisse). Die Einheit der Ordinate ist daher die Zellzahl, die Einheit der Abszisse ist der relative DNA- Gehalt in willkürlichen Einheiten der Fluoreszenzintensität.Figures 27a, 28a, 29a show the frequency distributions ("distribution") of HTZ-19 melanoma cells in the cell cycle. A compensation curve (diagram: dashed line) is calculated from the primary data of the frequency of the occurrence of a certain amount of DNA (shown in the diagram as individual measuring points). The distribution functions of the individual cell cycle compartments (diagram: solid lines for G, S and G 2 phase) are adapted to this compensation curve and the relative frequencies are determined from these distribution functions. This results in the percentage distribution of the cells over the cell cycle compartments, which can be read on the edge of the figures. Figures 27a-29a always show the number of cells (ordinate) depending on their DNA content (abscissa). The ordinate unit is therefore the cell number, the abscissa unit is the relative DNA content in arbitrary units of the fluorescence intensity.
Die Verteilung der untersuch* -n HTZ-1 9 Zellen ergab bei unbehandelten Zellen einen Anteil von 58, 1 % in d . 3--Phase, 30,3% in der S-Phase und 1 1 ,6% in der G2-Phase (Abb. 27a).The distribution of the investigated * -n HTZ-19 cells resulted in a proportion of 58.1% in untreated cells in d. 3 - phase, 30.3% in the S phase and 11.6% in the G 2 phase (Fig.27a).
Nach 3-tägiger andlung rr, . 50 V D20 erc sich eine Zellzykluszu- sammensetzur einem Anteil vor 1 % in der ^hasr 2, 4% in der S-After 3 days of change rr. 50 VD 2 0 erc a cell cycle composition with a share of 1% in the ^ hasr 2, 4% in the S-
Phase und 9,5C, . der G2-Phase (A 28a). Sor urd _-h die Einwir¬ kung von 50 V % D20 der Antei; er Zellen ir : G- .se erhöht, die Anteile der S-Pf.ase und G2-Phase Zellen jedoch v*. .linde' .Phase and 9.5 C ,. the G 2 phase (A 28a). Sor urd _-h the effect of 50 V% D 2 0 of the share; er cells ir: G- .se increased, but the proportions of S-Pf.ase and G 2 -phase cells v *. .linde '.
Eine 3-tägige Behandlung der gleichen Zeilen mit 90 Vol-% D2O zeigte eine weitere Reduzierung der Anzahl der Zellen in der G2-Phase auf nur noch 2,8%, der Rest der Zellen befand sich in der frühen S-Phase und in der GrPhase (Abb. 29a). Eine Differenzierung zwischen G,-Phase und S-Phase Zellen ist bei einem derartigen Zellzyklusverlauf schwierig und unter Umständen artifiziell. Sicherlich kann zusammenfassend aus den Zellzyklusexperimenten der Schluß einer Verminderung von Zellen der G2-Phase und einer dosisabhängigen Akku¬ mulierung von HTZ-1 9 Melanomzellen in der G Phase und/oder der frühen S- Phase gezogen werden.A 3-day treatment of the same lines with 90% by volume D 2 O showed a further reduction in the number of cells in the G 2 phase to only 2.8%, the rest of the cells were in the early S phase and in the G r phase (Fig.29a). A differentiation between G, -Phase and S-Phase cells is difficult with such a cell cycle and may be artificial. In summary, the cell cycle experiments can certainly be used to conclude that there is a reduction in cells of the G 2 phase and a dose-dependent accumulation of HTZ-19 melanoma cells in the G phase and / or the early S phase.
Mittels gleichzeitiger Anwendung von Ethidiumbromid und Hoechst 33342 als Doppelfluoreszenz und zweidimensionaler Auftragung der Meßdaten erhält man eine gleichzeitige Aussage über •""'NΛ-Menge und Vita'ität von Zellen.By simultaneous application of ethidium bromide and Hoechst 33342 as a double fluorescence and two-dimensional plot of the measured data to obtain a simultaneous statement about • "" 'NΛ amount and Vita'ität of cells.
Die Abbildungen 27b, 28b, 29b zeigen als Ordinate ("Y-Achse") die Intensität der Ethidiumbromid-Fluoreszenz und als Abszisse ("X-Achse") die Intensität der Hoechstfluoreszenz. Die Anzahl der Zellen wird durch die chwärzung und die Punktdichte angegeben. Für beide Achsen ergibt sich die Intensität entsprechend dem Gehalt an fluo¬ reszenzgefärbter DNA. Im Falle der Ethidiumbromidfluoreszenz ist die Intensität daher proportional dem DNA-Gehalt nicht-vitaler Zellen.Figures 27b, 28b, 29b show the intensity of the ethidium bromide fluorescence as ordinate ("Y axis") and the intensity of the maximum fluorescence as abscissa ("X axis"). The number of cells is indicated by the blackening and the point density. The intensity for both axes results from the content of fluorescence-stained DNA. In the case of ethidium bromide fluorescence, the intensity is therefore proportional to the DNA content of non-vital cells.
Für unbehandelte HTZ-1 9 Zellen ergibt sich ein normaler Zellzyklus der vitalen Zellen (Abb. 27b, Bereich 1 bzw. als Projektion A), nur vereinzelt finden sich nicht-vitale Zellen (markierter Bereich 2, insgesamt 1 ,2%). Die Verteilung der Ethidiumbromidfluoreszenz (B) zeigt ebenfalls die Vitalität der Probe an.For untreated HTZ-1 9 cells there is a normal cell cycle of the vital cells (Fig. 27b, area 1 or as projection A), only non-vital cells (marked area 2, a total of 1.2%) are found. The distribution of the ethidium bromide fluorescence (B) also shows the vitality of the sample.
Ein völlig anderes Bild ergibt sich nach 3-tägiger Behandlung mit 90 Vol-% D2O (Abb. 29b): Nahezu alle Zellen sind nicht mehr vital und zeigen daher Ethidium¬ bromidfluoreszenz.A completely different picture emerges after 3 days of treatment with 90% by volume D 2 O (Fig. 29b): Almost all cells are no longer vital and therefore show ethidium bromide fluorescence.
Eine Auswertung der Überlebensrate dieser beiden Experimente ergibt mit 97,8% nicht-vitalen Zellen in D2O gegenüber 1 ,2% in der Kontrollgruppe eine Überlebensrate von 3,8%.An evaluation of the survival rate of these two experiments shows a survival rate of 3.8% with 97.8% non-vital cells in D 2 O compared to 1.2% in the control group.
Demgegenüber wurde mit Trypan Blau Zellzählung bei HTZ-1 9 Zellen nach 3- tägiger Behandlung noch eine Überlebensrate von 72,8% gemessen, die Auswirkung von D2O dementsprechend unterschätzt.In contrast, a survival rate of 72.8% was measured with Trypan blue cell counting in HTZ-19 cells after 3 days of treatment, and the effect of D 2 O was accordingly underestimated.
Auffällig ist die Zellzyklusverteilung der abgetöteten Zellen: Fast alle Zellen befinden sich in der G Phase, eine definierte G2-Phase ist kaum zu erkennen. Dieses Ergebnis zeigt eine wichtige Zusatzinformation zur Zellzyklusdarstellung der 90 Vol-% D20 behandelten Zellen (Abb. 29a): Es handelt sich bei dieser Zellzyklusanalyse um die Verteilung nicht mehr vitaler Zellen!The cell cycle distribution of the killed cells is striking: almost all cells are in the G phase, a defined G 2 phase is hardly recognizable. This result shows important additional information for the cell cycle display of the 90 vol% D 2 0 treated cells (Fig. 29a): This cell cycle analysis is the distribution of cells that are no longer vital!
Nach Behandlung mit 50 Vol-% D2O für drei Tage ergibt sich auch ein Anteil nicht-vitaler Zellen. Auffällig ist wiederum deren Verteilung: Wie nach den Zelizyklusergebnissen (Abb. 28a) und der Beschränkung abgetöteter Zellen auf das G Kompartiment (Abb. 28b) erwartet, zeigt der Zellzyklus nicht-vitaler Zellen nennenswerte Anzahl nur in der GrPhase (und evtl. frühe S-Phase), ein G2-peak ist kaum auszumachen. Unerwartet erscheint jedoch ein zusätzliches Intensitätsmaximum mit etwas geringerer Fluoreszenzintensität als in den Zellen der G Phase (Abb. 28b) . Dies kann ein Hinweis auf fragmentierte DNA darstellen.After treatment with 50% by volume D 2 O for three days, there is also a proportion of non-vital cells. Their distribution is again striking: As expected after the cell cycle results (Fig. 28a) and the restriction of killed cells to the G compartment (Fig. 28b), the cell cycle of non-vital cells shows significant numbers only in the G r phase (and possibly early S phase), a G 2 peak is hardly noticeable. However, an additional one appears unexpectedly Intensity maximum with somewhat lower fluorescence intensity than in the cells of the G phase (Fig. 28b). This may indicate fragmented DNA.
Zusammenfassend läßt sich bei Melanomen ein ganz klares Potential für Deuterium-Einsatz erkennen: eine bei 50-90 Vol.-% Deuterium hohe Inhibition als Ausdruck für "growth arrest" und ein hoher Anteil "cell kill" führen zu einem deutlichen Rückgang an vitalen Tumorzellen.In summary, there is a very clear potential for deuterium use in melanoma: a high inhibition at 50-90 vol .-% deuterium as an expression for "growth arrest" and a high proportion "cell kill" lead to a significant decline in vital tumor cells .
Diese Untersuchungen wurden mit ähnlichen Ergebnissen auch an anderen Tumorzellen durchgeführt.These investigations were carried out on other tumor cells with similar results.
Beispiel 4: Kleinzelliges BronchialkarzinomExample 4: Small Cell Bronchial Carcinoma
Getestet wurden Zellen des kleinzelligen Bronchialkarzinoms HTZ-25. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expandiert. 3H Thymidin Assays sowie Wachstumskurven wurden in 96-well-Platten durchgeführt.Cells from small cell bronchial carcinoma HTZ-25 were tested. The tumors were expanded in MEM with 10 vol% FCS. 3 H thymidine assays and growth curves were carried out in 96-well plates.
Der 3H-Thymidin-Einbau (Abb. 9) zeigt eine nahezu lineare Dosis-Wirkungs¬ beziehung die weitgehend zeitunabhängig ist. In der Zeitskala 1 bis 6 Tage ist also bereits ein Sättigungsverhalten eingetreten, die Ausprägung der Effekte erfolgt offensichtlich sehr rasch im Bereich von Stunden. Bei HTZ-25 konnte mit 94 % Inhibition ein sehr hoher Effekt nach 6-tägiger Exposition von 90 Vol.-% D20 ( 1 79,75 g Deuterium/kg) im Medium erzielt werden.The 3 H-thymidine incorporation (Fig. 9) shows an almost linear dose-response relationship which is largely independent of time. A saturation behavior has already occurred on the time scale 1 to 6 days, the effects are evident very quickly in the range of hours. In the case of HTZ-25, a very high effect was achieved with 94% inhibition after exposure to 90% by volume of D 2 0 (1 79.75 g of deuterium / kg) in the medium for 6 days.
Die Wachstumskurven (Abb. 10) zeigen einen deutlichen Rückgang der behan¬ delten Zellen bei gutem Wachstum der unbehandelten Tumorzellen.The growth curves (Fig. 10) show a clear decrease in the treated cells with good growth of the untreated tumor cells.
Die Überlebensrate (Abb. 1 1 ) sinkt auf 80 %, wobei mit Durchflußzytometrie ein "Cell-Kill"-Anteil von 56% nach 2 Tagen gezeigt werden konnte.The survival rate (Fig. 1 1) drops to 80%, with flow cytometry being able to show a cell kill percentage of 56% after 2 days.
Die Überlebensfraktion (Abb. 1 2) erreicht bereits nach 6 Tagen 0, 1 7, nach 1 3 Tagen sogar 0,09, so daß der gesamte Effekt auf die Tumorzellen zumindest bei 90 Vol.-% D20-Konzentration eine volle Zehnerpotenz Reduktion vitaler Tumorzellen bedeutet.The survival fraction (Fig. 1 2) reaches 0, 1 7, and 1 3 after 6 days Days even 0.09, so that the overall effect on the tumor cells at least 90 vol .-% D 2 0 concentration represents a full order of magnitude reduction of vital tumor cells.
Zusammenfassend läßt sich beim kleinzelligen Bronchialkarzinom feststellen, daß ein insgesamt guter Effekt nicht alleine durch die Proliferationshemmung entsteht, sondern auch ein nennenswerter "cell kill" beobachtet werden konnte.In summary, in the case of small-cell bronchial carcinoma, it can be stated that an overall good effect is not caused solely by the inhibition of proliferation, but that a notable "cell kill" was also observed.
Beispiel 5: ColonkarzinomeExample 5: Colon carcinomas
Getestet wurden die Colonkarzinome der ATCC Zellinien CaCo-2 und HT-29. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expandiert. 3H Thymidin Assays sowie Wachstumskurven wurden in 96-well-Platten durchgeführt.Colon carcinomas of the ATCC cell lines CaCo-2 and HT-29 were tested. The tumors were expanded in MEM with 10 vol% FCS. 3 H thymidine assays and growth curves were carried out in 96-well plates.
Der 3H-Thymidin-Einbau (Abb. 13, 14) zeigt eine nahezu lineare Dosis-Wir¬ kungs-Beziehung die tendenziell ebenfalls weitgehend zeitunabhängig ist. Die Ausprägung der Effekte erfolgt offensichtlich ebenfalls im Bereich von Stun- den, die volle Ausprägung wird insbesondere bei CaCo-2 Zellen jedoch erst nach 3-tägiger Inkubation erreicht. Bei HT-29 konnte mit 98 % Inhibition ein ausgesprochen hoher Effekt nach 6-tägiger Exposition von 90 Vol.-% D20 ( 1 79,75 g Deuterium/kg) im Medium erzielt werden, CaCo-2 erreichte mit 94 % Inhibition nach 6 Tagen Inkubation ähnliche Werte.The 3 H-thymidine incorporation (Fig. 13, 14) shows an almost linear dose-effect relationship which also tends to be largely independent of time. The effects are evidently also expressed in the range of hours, but the full expression is achieved, in particular in the case of CaCo-2 cells, only after 3 days of incubation. With HT-29 an extremely high effect could be achieved with 98% inhibition after 6 days exposure of 90 vol.% D 2 0 (1 79.75 g deuterium / kg) in the medium, CaCo-2 achieved with 94% inhibition similar values after 6 days of incubation.
Die Wachstumskurven (Abb. 1 5, 1 6) zeigen einen fulminanten absoluten Rückgang der Zellen bei beiden Colonkarzinomen an, während sich die unbe¬ handelten Kontrollen in exponentiellem Wachstum befinden.The growth curves (Fig. 1 5, 1 6) indicate a fulminant absolute decline in the cells in both colon carcinomas, while the untreated controls are in exponential growth.
Die Überlebensrate (Abb. 1 7) zeigt einen deutlichen Abfall, insbesondere bei CaCo-2 wurde mit 39 % Überlebensrate nach 9 Behandlungstagen ein signifi¬ kanter "cell kill" erreicht. Die Überlebensfraktion (Abb. 1 8) zeigt bereits nach 3 Tagen bei beiden Colon¬ karzinomen Werte unter 0, 1 0 (CaCo-2: 0,08, HT-29: 0,04), nach 9 Tagen lag sie bei beiden Tumoren sogar unter 0,01 also zwei Zehnerpotenzen Reduktion vitaler Tumorzellen bei 90 Vol.-% D20-Konzentration.The survival rate (Fig. 1 7) shows a clear decrease, in particular with CaCo-2, with 39% survival rate, a significant cell kill was achieved after 9 days of treatment. The survival fraction (Fig. 1 8) shows values of less than 0.1 in both colon carcinomas after 3 days (CaCo-2: 0.08, HT-29: 0.04), after 9 days it was in both tumors even below 0.01, ie two powers of ten, reduction of vital tumor cells at 90 vol.% D 2 0 concentration.
Zusammenfassend läßt sich bei Colonkarzinomen feststellen, daß durch den "cell kill" eine maximale Wirkung bei Colonkarzinomen entsteht.In summary, it can be stated in colon carcinomas that the "cell kill" has a maximum effect in colon carcinomas.
Beispiel e: Lymphozyten (Kontrolle; normale Zellen)Example e: Lymphocytes (control; normal cells)
Getestet wurden frisch isolierte Blutlymphozyten, nach Ficoll-Gradient in RPMI- Medium mit 10 Vol.-% humanem AB-Serum-Zusatz expandiert. Die Lymphozy¬ ten wurden mit Interleukin 2 (IL-2) bzw. Phythämagglutinin (PHA) stimuliert.Freshly isolated blood lymphocytes were tested, expanded according to the Ficoll gradient in RPMI medium with 10% by volume of human AB serum addition. The lymphocytes were stimulated with interleukin 2 (IL-2) or phythaemagglutinin (PHA).
Bei den 3H Thymidin-Assays (Abb. 1 9) als Modell für die Proliferationsrate zeigte sich für einen Zeitraum von 2-6 Tagen, daß es bei allen PHA-stimulier- ten Lymphozyten bei Behandlung mit 90 Vol.-% Deuteriummedium ( 1 79,75 g Deuterium/kg) zum Auftreten von Inhibitionseffekten kam. Jedoch auch nach 6 Tagen Einwirkdauer lag die Inhibition noch unter 60 %.In the 3 H thymidine assays (Fig. 19) as a model for the proliferation rate, it was shown for a period of 2-6 days that it was found in all PHA-stimulated lymphocytes when treated with 90% by volume of deuterium medium (1 79.75 g deuterium / kg), inhibition effects occurred. However, even after 6 days of exposure, the inhibition was still below 60%.
IL-2 stimulierte Lymphozyten zeigten zeitabhängiges Verhalten; bei 3 und 6 Tagen zeigte sich Inhibition, maximal wurde 65 % Inhibition bei 90 Vol.-% Deuterium ermittelt.IL-2 stimulated lymphocytes showed time-dependent behavior; at 3 and 6 days there was inhibition, a maximum of 65% inhibition was determined at 90% by volume of deuterium.
Die Wachstumskurven (Abb. 20) zeigen zwar sowohl bei 50 Vol.-% (99,86 g Deuterium/kg) als auch bei 90 VoI.-% deuteriertem Medium einen Abfall gegenüber den Kontrollen, dieser ist jedoch deutlich weniger ausgeprägt als bei den getesteten Tumoren.The growth curves (Fig. 20) show a decrease compared to the controls both with 50 vol.% (99.86 g deuterium / kg) and with 90 vol.% Deuterated medium, but this is significantly less pronounced than with the tested tumors.
Die Überlebensrate (Abb. 21 ) als Maß für den durch Deuterium ausgelösten Zelltod wird nur bei den IL-2 stimulierten Zellen in 90 Vol.-% Deuterium signifi¬ kant erniedrigt; es wurden Werte bis 60 % "Überlebensrate" entsprechend 40 % abgetötete Zellen bei 6d IL-2 Stimulation gemessen.The survival rate (Fig. 21) as a measure of the cell death caused by deuterium is significantly reduced only in the IL-2-stimulated cells in 90% by volume of deuterium; there were values up to 60% "survival rate" corresponding to 40 % killed cells measured with 6d IL-2 stimulation.
Die Überlebensfraktion (Abb. 22) wurde ebenfalls nur bei IL-2 stimulierten Lymphozyten erniedrigt (bis zu 0, 36 bei 6d in 90 Vol.-% Deuteriummedium unter ll-2-Stimulation) die PHA stimulierten Zellen bleiben weitgehend unbeein- fluß (0,8 bei 6d PHA-Stumulation in 90 Vol.-% Deuterium).The survival fraction (Fig. 22) was also reduced only in IL-2 stimulated lymphocytes (up to 0.36 at 6d in 90 vol.% Deuterium medium with II-2 stimulation). The PHA-stimulated cells remain largely unaffected (0 , 8 with 6d PHA stumulation in 90 vol.% Deuterium).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das System stimulierter Lymphozyten bezüglich der durch Deuterium verursachten Proliferationshem- mung und Zytotoxizität deutlich hinter den Effekten auf Tumorzellen zurück¬ bleibt. Diese Versuche zeigen, daß die Deuterium vermittelten Effekte nicht proliferationsabhängig sind, oder zumindest nicht alle differentiellen Effekte nur durch die stärkere Proliferation bei Tumorzellen verursacht werden: Die IL-2- stimulierten Zellen mit der niedrigeren Teilungsrate werden stärker gehemmt und zeigen höhere "cell-kill-Empfindlichkeit" als die sich schnell teilenden PHA- stimulierten Lymphozyten, die durch niedrige Dosen von Deuterium sogar im Wachstum stimuliert werden und kaum "cell kill" aufweisen.In summary, it can be stated that the system of stimulated lymphocytes lags significantly behind the effects on tumor cells with regard to the inhibition of proliferation and cytotoxicity caused by deuterium. These experiments show that the deuterium-mediated effects are not dependent on proliferation, or at least not all differential effects are only caused by the greater proliferation in tumor cells: the IL-2-stimulated cells with the lower division rate are more strongly inhibited and show higher cell-kill Sensitivity "as the rapidly dividing PHA-stimulated lymphocytes, which are stimulated even in growth by low doses of deuterium and have hardly any" cell kill ".
Beispiel 7: GliomeExample 7: Gliomas
Getestet wurden Zellen des Glioblastoms (Glioblastoma multiforme) HTZ-209 und des Astrozytoms HTZ-243 (Astrozytoma WHO Grad III). Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expandiert. 3H Thymidin Assays wurden in 96-well-Platten durchgeführt, Wachstumskurven wurden in 24- und 96-well- Platten durchgeführt.Cells of the glioblastoma (glioblastoma multiforme) HTZ-209 and the astrocytoma HTZ-243 (astrocytoma WHO grade III) were tested. The tumors were expanded in MEM with 10 vol% FCS. 3 H thymidine assays were carried out in 96-well plates, growth curves were carried out in 24 and 96-well plates.
Der 3H-Thymidin-Einbau (Abb. 23) zeigt eine deutliche Schulterbildung im Dosisbereich zwischen 1 und 50 Vol.-% D2O die weitgehend zeitunabhängig ist. Hier zeigt sich eine ganz deutliche Tumorselektivität insbesondere in der Anwendung von D20 über 6 Tage, wobei bei HTZ-243 bereits mit 10 % D20 über 60 % Inhibition erreicht wurde. Die Wachstumskurven (Abb. 24) zeigen einen absoluten Rückgang der Zellen bei beiden Gliomen, besonders HTZ-209 an, während sich die unbehandelten Kontrollen in exponentiellem Wachstum befinden.The 3 H-thymidine incorporation (Fig. 23) shows a clear shoulder formation in the dose range between 1 and 50 vol.% D 2 O, which is largely independent of time. Here a very clear tumor selectivity can be seen, in particular when using D 2 0 over 6 days, with HTZ-243 having already achieved 10% D 2 0 over 60% inhibition. The growth curves (Fig. 24) indicate an absolute decline in the cells in both gliomas, especially HTZ-209, while the untreated controls are in exponential growth.
Die Überlebensrate (Abb. 25) zeigt einen deutlichen Abfall bei beiden Tumoren, insbesondere bei HTZ-209 wurde mit 33 % survival rate nach 6 Behandungs- tagen ein hohes Ausmaß an Abtötung von Tumorzellen erreicht.The survival rate (Fig. 25) shows a clear decrease in both tumors, especially in HTZ-209, with 33% survival rate, a high degree of tumor cell kill was achieved after 6 days of treatment.
Die Überlebensfraktion (Abb. 26) zeigt bei beiden Hirntumoren einen nahezu linearen Abfall, und erreicht nach 6 Tagen für HTZ-209 Werte unter 0, 10, also eine volle Zehnerpotenz Rückgang an vitalen Tumorzellen.The survival fraction (Fig. 26) shows an almost linear decline in both brain tumors, and after 6 days for HTZ-209 values below 0, 10, i.e. a full power of ten decrease in vital tumor cells.
Zusammenfassend läßt sich bei den untersuchten Hirntumoren feststellen, daß durch die Abtötung von Tumorzellen ein therapeutischer Erfolg erzielt werden kann.In summary, it can be stated in the brain tumors examined that therapeutic success can be achieved by killing tumor cells.
Es konnte ganz klar durch die Beispiele 1 -7 gezeigt werden, daß für die Wir¬ kung von Deuterium auf Zellen zwei völlig verschiedene Mechanismen vor¬ liegen: Der Effekt der Teilungsarretierung ("growth arrest") und der von den Erfindern erstmals entdeckte Effekt der direkten Zelltötung ("cell kill") .It could be clearly demonstrated by Examples 1-7 that there are two completely different mechanisms for the action of deuterium on cells: the effect of the growth arrest and the effect of the first discovered by the inventors direct cell kill ("cell kill").
Die Spezifität der Effekte auf bestimmte Zellgruppen wurde in der Literatur bisher nicht systematisch untersucht. Auch hier konnten erstmals Hinweise auf ein tumorspezifisches Verhalten ermittelt werden.The specificity of the effects on certain cell groups has not been systematically examined in the literature. Here too, indications of tumor-specific behavior could be determined for the first time.
Hinweise, daß die Ausprägung der Effekte nicht nur proliferationsratenabhän- gig ist, geben die Lymphozyten, bei denen sowohl "growth arrest" als auch "cell kill" bei den schneller proliferierenden PHA-stimulierten Zellen deutlich geringer ausgeprägt sind. /03996 PC17EP95/03100The lymphocytes, in which both "growth arrest" and "cell kill" are significantly less pronounced in the more rapidly proliferating PHA-stimulated cells, indicate that the extent of the effects is not only dependent on the proliferation rate. / 03996 PC17EP95 / 03100
- 22 - Beispiel 8: Verhinderung der Metastasierung- 22 - Example 8: Prevention of metastasis
Eine geeignete Methode zur Überprüfung der Wirkung eines Zytostatikums auf die Migrationsfähigkeit und damit die Metastasierung eines Tumors ist die Beurteilung der Migration von Tumorsphäroiden. Tumorzellen werden nach Bildung von Sphäroiden auf agrarbeschichteten 48 well Platten wieder in unbeschichtete Platten umgesetzt. Innerhalb von 72 Stunden gehen die Tu¬ morzellen wieder zu adhärentem Wachstum über; die dabei bedeckte Fläche ist ein Maß für das Migrations- und Invasionsverhalten eines Tumors und damit für seine Metastasierungsfähigkeit und ihre Hemmung.A suitable method for checking the effect of a cytostatic on the ability to migrate and thus the metastasis of a tumor is to assess the migration of tumor spheroids. Tumor cells are converted back into uncoated plates after the formation of spheroids on agricultured 48-well plates. The tumor cells return to adherent growth within 72 hours; the area covered is a measure of the migration and invasion behavior of a tumor and thus of its ability to metastasize and its inhibition.
In Abb. 31 ist zu sehen, daß durch D20 nach 72 Std. eine Verringerung der Migrationsfläche auf 20% der sonst besetzten Fläche eintritt, was einer we¬ sentlichen Verringerung der Metastasierungsfähigkeit bzw. Metastasenbildung entspricht. Die in diese auf 20% reduzierte Fläche migrierten Zellen sind zudem devital (nachgewiesen mittels Trypanblau-Anfärbung), da D20 insbesonderedie migrierenden Zellen vollständig abtötet. Durch den D2O Einsatz wird daher eine potentielle Metastasierung verhindert.In Fig. 31 it can be seen that D 2 0 leads to a reduction in the migration area to 20% of the otherwise occupied area after 72 hours, which corresponds to a significant reduction in the ability to metastasize or to form metastases. The cells migrated to this area, which was reduced to 20%, are also devitalized (demonstrated by trypan blue staining), since D 2 0, in particular, completely kills off the migrating cells. The use of D 2 O therefore prevents potential metastasis.
In einem anderen Experiment wurde Mäusen das Sarkom M 5076 subcutan implantiert. Die Hälfte dieser Mäuse wurde mit 50 Vol-% D2O behandelt.In another experiment, sarcoma M 5076 was implanted subcutaneously in mice. Half of these mice were treated with 50% by volume D 2 O.
Aus Abb. 32 sieht man, daß die mit D2O behandelten Tiere keine Lebermeta¬ stasen entwickelten, während die unbehandelten Kontrolltiere bis zu 500 Lebermetastasen bekamen. Durchschnittlich zeigten sich bei den Kontrollen 1 9,5 Lebermetastasen. Die Anwendung von D2O verhindert also die Metasta¬ sierung völlig.From Fig. 32 it can be seen that the animals treated with D 2 O did not develop liver metastases, while the untreated control animals got up to 500 liver metastases. The controls showed an average of 1 9.5 liver metastases. The use of D 2 O thus completely prevents metastasis.
Beispiel 9: Überprüfung der Wirksamkeit im TiermodellExample 9: Checking the effectiveness in the animal model
1 6 Mäusen wurden 105 Zellen des Sarkoms M 5076 intraperitoneal verab¬ reicht. Der einen Hälfte der Mäuse (8 Tiere) wurde 50 Vol-% D20, der anderen /03996 PC17EP95/031 01 6 mice were given 10 5 cells of sarcoma M 5076 intraperitoneally. Half of the mice (8 animals) became 50% by volume D 2 0, the other / 03996 PC17EP95 / 031 0
- 23 - Hälfte (8 Tiere) normales Wasser als Trinkwasser gegeben (Kontrolle) .- 23 - half (8 animals) given normal water as drinking water (control).
Aus Abb. 33 sieht man, daß von den 8 Kontrolltieren 30 Tage nach der Im¬ plantation nur noch 2 lebten, während von den D20-behandelten Tieren noch 7 am Leben waren. Nach 35 Tagen wurde die Behandlung abgebrochen. An diesem Tag lebte nur noch 1 Kontrollmaus, aber immer noch 7 D20-behandelte Mäuse. Die am Ende des Experiments noch lebenden 6 Tiere aus der D20- Gruppe können im Sinne des Versuchs als geheilt gelten. From Fig. 33 we see that 30 days after the Im¬ of the eight control animals plantation only two survived, while another 7 were from the D 2 0-treated animals alive. Treatment was discontinued after 35 days. That day only 1 control mouse was alive, but still 7 D 2 0-treated mice. The 6 animals from the D 2 0 group still alive at the end of the experiment can be considered cured for the purposes of the experiment.

Claims

Patentansprüche claims
1 . Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die1 . Use of a pharmaceutical composition containing deuterium and / or deuterated substances and / or substances which
Deuterium anreichern bzw. freisetzen zur selektiven Abtötung von Tumorzellen und/oder Tumormetastasen.Enrich or release deuterium for the selective killing of tumor cells and / or tumor metastases.
2. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die2. Use of a pharmaceutical composition containing deuterium and / or deuterated substances and / or substances that
Deuterium anreichern bzw. freisetzen zur Verhinderung der Metastasie¬ rung und/oder des lokalen Wiederauftretens von Tumoren sowie deren Nachwachsen.Enrich or release deuterium to prevent metastasis and / or local recurrence of tumors and their regrowth.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zur Abtötung von entarteten Zellen in Konzentrationen über 50 Vol.-% (99,86 g Deuterium/kg) D20 oder eine andere Deuterium-enthaltende Substanz mit 50 % durch D ersetz¬ ten H-Atomen angewendet wird.3. Use according to claim 1 or 2, characterized in that the pharmaceutical composition for killing degenerate cells in concentrations above 50 vol .-% (99.86 g deuterium / kg) D 2 0 or another deuterium-containing substance with 50 % is replaced by D replaced H atoms.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -3, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Zäpfchen, Salben, Lösungen, Dispersionen oder Emulsionen, Aerosolen, Schäu¬ men, teiiehenförmigen Mitteln, Pillen, Pastillen Tabletten, Dragees, Kapseln bzw. Mikrokapseln, Kaugummiarten, Gewebe-, Blatt-, oder Fa¬ dengrundlagen in Bandagen oder Verbänden, zum Rauchen oder Inhalie¬ ren sowie in Carriern angewendet wird.4. Use according to any one of claims 1 -3, characterized in that the pharmaceutical composition in the form of suppositories, ointments, solutions, dispersions or emulsions, aerosols, foams, tablets, tablets, pills, lozenges tablets, dragees, capsules or Microcapsules, types of chewing gum, tissue, sheet or thread bases in bandages or bandages, for smoking or inhalation and in carriers are used.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -4, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zur Therapie lokal, intracu- tan, transcutan; zur systemischen Anwendung intravenös, durch teilwei¬ sen Austausch des Körperwasser- oder Blutwasseranteils, intraarteriell, oral, rectal; zur Anwendung in Hohlräumen, intrapleural, intrathekal, intraventrikulär, intraperitoneal, intracavitär, in OP-Höhlen verabreicht wird sowie für die extrakorporale Abtötung von Tumorzellen verwendet wird.5. Use according to one of claims 1-4, characterized in that the pharmaceutical composition for therapy locally, intracutaneously, transcutaneously; for systemic use intravenously, by partially exchanging the body water or blood water content, intraarterially, orally, rectally; for use in cavities, intrapleural, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal, intracavitary, administered in operating theaters and used for the extracorporeal killing of tumor cells.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -5 zur Therapie von malignen Melanomen, Gliomen, Astrozytomen, Bronchialkarzinomen, Neuroblasto- men, Magen-Darm-Karzinomen, Sarkomen, Malignomen des hämatopoe- tischen und lymphopoetischen Systems, Mammakarzinomen, Zervixkar- zinomen, Uteruskarzinomen, Prostatakarzinomen, Schilddrüsenkarzino- men sowie Pankreaskarzinomen.6. Use according to one of claims 1-5 for the therapy of malignant melanomas, gliomas, astrocytomas, bronchial carcinomas, neuroblastomas, gastrointestinal carcinomas, sarcomas, malignancies of the hematopoietic and lymphopoietic system, breast carcinomas, cervical carcinomas, uterine carcinomas , Prostate cancer, thyroid cancer and pancreatic cancer.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich Zytostatika oder Tumortherapeutika enthält.7. Use according to any one of claims 1-6, characterized in that the pharmaceutical composition additionally contains cytostatics or tumor therapeutics.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -7 in Kombination mit Bestrah¬ lungsmethoden.8. Use according to any one of claims 1-7 in combination with irradiation methods.
9. Verwendung von Deuterium und/oder deuterierten Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anreichern bzw. freisetzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur selektiven Abtötung von Tumorzellen und/oder Tumormetastasen.9. Use of deuterium and / or deuterated substances and / or substances which enrich or release deuterium for the production of a pharmaceutical composition for the selective killing of tumor cells and / or tumor metastases.
10. Verwendung von Deuterium und/oder deuterierten Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anreichern bzw. freisetzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung der Me¬ tastasierung und/oder des lokalen Wiederauftretens von Tumoren sowie deren Nachwachsen.10. Use of deuterium and / or deuterated substances and / or substances which enrich or release deuterium for the production of a pharmaceutical composition for preventing meestasis and / or local recurrence of tumors and their regrowth.
1 1 . Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zur Abtötung von entarteten Zellen in Konzentrationen über 50 Vol.-% (99,86 g Deuterium/kg) D20 oder eine andere Deuterium-enthaltende Substanz mit 50 % durch D ersetzten H-Atomen angewendet wird.1 1. Use according to claim 9 or 10, characterized in that the pharmaceutical composition for killing degenerate cells in concentrations above 50% by volume (99.86 g deuterium / kg) D 2 0 or another deuterium-containing substance with 50% D replaced H atoms is applied.
1 2. Verwendung nach einem der Ansprüche 9-1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Zäpfchen, Salben , Lösungen , Dispersionen oder Emulsionen , Aerosolen ,1 2. Use according to any one of claims 9-1 1, characterized in that the pharmaceutical composition in the form of suppositories, ointments, solutions, dispersions or emulsions, aerosols,
Schäumen, teilchenförmigen Mitteln, Pillen, Pastillen Tabletten, Dragees, Kapseln bzw. Mikrokapseln, Kaugummiarten, Gewebe-, Blatt-, oder Fa¬ dengrundlagen in Bandagen oder Verbänden, zum Rauchen oder Inhalie¬ ren sowie in Carriern angewendet wird.Foams, particulate agents, pills, lozenges, tablets, dragees, capsules or microcapsules, types of chewing gum, tissue, sheet or thread bases in bandages or bandages, for smoking or inhalation and in carriers are used.
1 3. Verwendung nach einem der Ansprüche 9-1 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zur Therapie lokal, intracu- tan, transcutan; zur systemischen Anwendung intravenös, durch teilwei¬ sen Austausch des Körperwasser- oder Blutwasseranteils, intraarteriell, oral, rectal; zur Anwendung in Hohlräumen, intrapleural, intrathekal, intraventrikulär, intraperitoneal, intracavitär, in OP-Höhlen verabreicht wird sowie für die extrakorporale Abtötung von Tumorzellen verwendet wird.1 3. Use according to any one of claims 9-1 2, characterized in that the pharmaceutical composition for therapy locally, intracutaneously, transcutaneously; for systemic use intravenously, by partially exchanging the body water or blood water content, intraarterially, orally, rectally; for use in cavities, intrapleural, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal, intracavitary, administered in operating theaters and used for the extracorporeal killing of tumor cells.
1 4. Verwendung nach einem der Ansprüche 9-1 3 zur Therapie von malig¬ nen Melanomen, Gliomen, Astrozytomen, Bronchialkarzinomen, Neuro- blastomen sowie Magen-Darm-Karzinomen, Sarkomen, Malignomen des hämatopoetischen und lymphopoetischen Systems, Mammakarzinomen, Zervixkarzinomen, Uteruskarzinomen, Prostatakarzinomen, Schilddrüsen- karzinomen sowie Pankreaskarzinomen.1 4. Use according to any one of claims 9-1 3 for the therapy of malignant melanoma, glioma, astrocytoma, bronchial carcinoma, neuroblastoma and gastrointestinal carcinoma, sarcoma, malignancy of the hematopoietic and lymphopoietic system, breast cancer, cervical cancer, uterine cancer , Prostate cancer, thyroid cancer and pancreatic cancer.
1 5. Verwendung nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich Zytostatika oder Tumortherapeutika enthält.1 5. Use according to any one of claims 9-14, characterized in that the pharmaceutical composition additionally contains cytostatics or tumor therapeutics.
1 6. Verwendung nach einem der Ansprüche 9- 1 5 in Kombination mit Be¬ strahlungsmethoden. 1 6. Use according to any one of claims 9- 1 5 in combination with irradiation methods.
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