WO1995034812A1 - METHOD OF ASSAYING SPECIFIC IgM ANTIBODY AND REAGENT THEREFOR - Google Patents

METHOD OF ASSAYING SPECIFIC IgM ANTIBODY AND REAGENT THEREFOR Download PDF

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WO1995034812A1 PCT/JP1995/001191 JP9501191W WO9534812A1 WO 1995034812 A1 WO1995034812 A1 WO 1995034812A1 JP 9501191 W JP9501191 W JP 9501191W WO 9534812 A1 WO9534812 A1 WO 9534812A1
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    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854Immunoglobulins

Abstract

The invention provides a method of detecting a specific IgM in an infectious disease at an acute stage, e.g., a HAV-related antibody, a method of permitting a wider-range assay by reducing the predilution factor, a method of improving the detection percentage in various diseases such as hepatitis A, and a method of diagnosing and detecting the diseases without fail. By diluting a specimen with at least IgM or an aqueous solution thereof, it becomes possible to conduct favorably an immunoassay of a specific IgM antibody against a target antigen present in the specimen by using an antihuman IgM antibody reagent. More particularly, a specific IgM antibody can be assayed by (1) diluting, if necessary, a specimen with a buffer, a diluent or an aqueous diluent solution and then with at least IgM or an aqueous solution thereof, then reacting a specific IgM antibody contained in a specimen with an antihuman IgM antibody-binding solid carrier to effect an immunological reaction between the IgM antibody in the specimen and the solid-phase antihuman IgM antibody, and (2) conducting either (a) an immunological reaction of the obtained reaction product with a specified antigen reagent and then with a labeled antibody against the antigen reagent, or (b) an immunological reaction of the obtained reaction product with a specified labeled antigen reagent.

Description

明 細 書 特異的 I g M抗体の測定法及びその試薬 産業上の利用分野  Description Specific IgM antibody assay and reagents
本発明は、 抗ヒ卜 I g M抗体試薬を使用して、 被検試料中の対象抗原 に対する特異的 I g M抗体を免疫学的に測定する方法において、 被検試 料を少なくとも I g Mまたは I g M含有水溶液により希釈することを特 徵とする特異的 I g M抗体測定試薬及びその試薬を用いた測定方法に関 する。 背景技術  The present invention provides a method for immunologically measuring a specific IgM antibody against a target antigen in a test sample using an anti-human IgM antibody reagent, wherein the test sample comprises at least IgM antibody. Alternatively, the present invention relates to a specific IgM antibody measuring reagent characterized by being diluted with an aqueous solution containing IgM, and a measuring method using the reagent. Background art
免疫学的測定法は、 人の臨床における検査や病気の診断に広く利用さ れる他、 動物についてもその臨床検査や病気の診断、 さらにはその他の 広い範囲の測定対象物の分析、 測定、 定量、 検出などの分野において応 用されている。 この免疫学的測定法は、 抗原とその抗原に対する抗体と の間の抗原抗体反応を利用するものであるが、 通常この抗原抗体反応の 生起していることの検出は可視的に判別したり、 あるいは検知すること は困難であるので、 その検知、 検出を容易にするため様々な手法が開発 されてきている。 そのうち特に急性期において生体内の免疫反応により に生じる特異的 I g M抗体を測定することは、 例えば、 ウィルス感染、 病原菌感染などの初期感染の診断に用いられて有用であることから注目 されている。 ところが特異的 I g M抗体はリウマチ因子などの妨害を受 けたり、 I g Gなどの干渉を受けるため、 その測定が難しいという問題 があった。 この I gM測定を利用する免疫学的測定法の代表的なものと しては、 I g M抗体捕捉測定法が挙げられ、 例えば、 A型肝炎ウィルス (Hepa t i t i s A v i ru s : HAV)感染の診断、 B型 肝炎ウィルスコア抗原 (H e p a t i t i s B v i ru s co r e an t i gen : HBc) 、 風疹、 麻疹、 ムンブスなどの診断など に利用されている。 特に、 A型肝炎ウィルス (HAV) は、 1973年 フヱインストン (Fe i ns t one)等により A型肝炎急性期患者の 便材料のうちに発見され、 1977年には実験感染チンパンジー肝組織 における増殖の報告がされてのち、 1979年には初代マーモセット肝 細胞及びァ力ゲザル胎児腎細胞での増殖が報告されて以来、 H A Vを培 養細胞系では初代及び株化ァフリカミ ドリザル腎細胞、 ヒトニ倍体細胞 などにおいて増殖せしめることが報告されている。 Immunoassays are widely used in human clinical tests and disease diagnosis, as well as in animal clinical tests and disease diagnosis, and in the analysis, measurement and quantification of a wide range of other analytes. It is applied in fields such as detection and detection. This immunoassay utilizes an antigen-antibody reaction between an antigen and an antibody against the antigen, but usually, the detection of the occurrence of this antigen-antibody reaction can be visually determined, Or, since it is difficult to detect, various methods have been developed to make the detection and detection easy. Of these, the measurement of specific IgM antibodies generated by in vivo immune reactions, especially in the acute phase, has been attracting attention because it is useful for diagnosis of early infections such as viral infections and pathogen infections. I have. However, the specific IgM antibody has a problem that its measurement is difficult because it is interfered by rheumatoid factor or the like or interfered by IgG or the like. A typical example of the immunoassay using the IgM measurement is an IgM antibody capture assay, such as hepatitis A virus. (Hepatitis A vi ru s: HAV) Infection diagnosis, Hepatitis B virus core antigen (HBc), rubella, measles, mumbus, etc. . In particular, hepatitis A virus (HAV) was discovered in the feces of patients with acute hepatitis A by Feinstone and others in 1973, and in 1977 the proliferation of experimentally infected chimpanzee liver tissue was observed. After the report, the growth of primary marmoset hepatocytes and fetal monkey fetal kidney cells was reported in 1979, and HAV-cultured cell lines have been used for primary and established africana monkey kidney cells and human diploid cells. It has been reported that it grows in such as.
ところで、 現在日本では、 A型肝炎ウィルス感染の発生は減少しては いるものの、 若年層を中心に抗 H A V抗体陰性者が増加するのに対して、 一方では高年齢者にはその陽性者が多く分布するという状況から、 成人 では H A Vに汚染された飲食物に接する機会が多くなることに加えて、 大人では一旦感染した場合、 肝炎の発症につながる恐れが高いことから、 その HAV感染を防ぐ意味でも、 正確かつ迅速な H A V感染の有無を検 出することが求められている。 また、 HAVは糞便などによる経口感染 をその主な伝播経路とするため、 環境衛生の不備な地域での感染の危険 は大きく、 最近では海外渡航の機会も増加し、 こうして HAV感染の検 査が、 近親者間、 従業員者間などでの感染を防ぐ意味でも重要視されて いる。 この急性期の HAV感染の検出のためには、 HAV感染に伴って 生体内の強い免疫反応により患者の血液中に出現する抗 H A V抗体、 特 に HAVに特異的な I gM抗体を検出して行われており、 この抗 HAV (I gM)抗体と免疫学的に反応性を有する HAV抗原を試薬として用 いる次のような I gM抗体捕捉測定法が開発されている。 代表的な I g By the way, in Japan, although the incidence of hepatitis A virus infection is decreasing, the number of anti-HAV antibody-negative people is increasing, mainly in young people, while the age of the elderly is positive. Preventing HAV infection because adults are more likely to come into contact with foods and drinks contaminated with HAV due to their high distribution, and adults are more likely to develop hepatitis once infected. In that sense, there is a need for accurate and rapid detection of HAV infection. In addition, since HAV is transmitted mainly by oral transmission via feces and the like, the risk of infection in areas with poor environmental hygiene is high, and the chances of overseas travel have recently increased, thus testing HAV infection. It is also considered important to prevent transmission between relatives and employees. To detect HAV infection in the acute phase, anti-HAV antibodies that appear in the patient's blood due to a strong immune response in vivo following HAV infection, particularly IgM antibodies specific to HAV, are detected. The following IgM antibody capture assay using the HAV antigen immunologically reactive with this anti-HAV (IgM) antibody as a reagent has been developed. Typical Ig
M抗体捕捉測定法にしたがう急性 A型肝炎の感染診断法は、 I gM抗体 の〃一鎖に特異性をもつ抗ヒト I gM抗体を使用し、 その抗ヒト I gM 抗体 (//一鎖特異抗体) で被覆した固相、 例えば下記に示すような固相 担体を、 測定試料と反応させ、 次に HAV抗原試薬と反応させ、 最後に 標識抗 H A V抗体と反応させるというように順次反応させることにより 行われている。 ところ力 このような急性期においては血液、 血清、 血 漿などの被検試料中の抗 H A V (I gM)抗体などの測定すべき特異的 な I gM及び総 I gMの濃度は様々である。 一般には、 血液中の総 I g M量は通常約 0. 4〜2mgZm 1存在していることが知られているが、 上記した第一反応での抗ヒト I gM抗体で被覆した固相の抗体量が充分 でない場合が起こるので、 被検試料を前希釈、 例えば、 高倍率の前希釈 を行うことが必要であるという問題がある。 従来は、 緩衝水溶液、 生理 食塩水溶液などで被検試料を前希釈していた。 こうすると総 I gM抗体 の量を減ずることになる力^ 総 I gM抗体量に対する特異的 I gM量の 比率を減ずることはできない。 そのため、 必要な測定範囲を得ることが 困難であるという問題がある。 また自動化された測定系においては、 希 釈液量が制限されるという問題があり、 測定範囲が限定されしまうとい う問題があつた。 Diagnosis of acute hepatitis A infection according to the M antibody capture assay Using an anti-human IgM antibody with specificity for one of the above chains, a solid phase coated with the anti-human IgM antibody (// single-chain specific antibody), for example, a solid phase carrier as shown below, was measured. The reaction is performed by reacting with a sample, then reacting with an HAV antigen reagent, and finally reacting with a labeled anti-HAV antibody. However, in such an acute phase, the concentration of specific IgM such as anti-HAV (IgM) antibody and total IgM to be measured in test samples such as blood, serum, and plasma vary. In general, it is known that the total amount of IgM in blood is usually about 0.4 to 2 mgZm1, but the solid phase coated with the anti-human IgM antibody in the first reaction described above Since the amount of antibody may be insufficient, there is a problem that it is necessary to perform a pre-dilution of the test sample, for example, a high-magnification pre-dilution. Conventionally, the test sample was pre-diluted with a buffered aqueous solution, physiological saline solution, or the like. This will reduce the amount of total IgM antibody ^ The ratio of specific IgM to total IgM antibody cannot be reduced. Therefore, there is a problem that it is difficult to obtain a necessary measurement range. In addition, in an automated measurement system, there was a problem that the amount of diluent was limited, and a problem that the measurement range was limited.
上記したようにより早い時期で特異的な I gM、 例えば、 HAV関連 抗体を検出したり、 前希釈の希釈倍率を低減せしめてより広範囲の測定 を可能にし、 例えば、 A型肝疾患などの高濃度領域における確実な測定 法が、 緊急的かつ強く求められている。 発明の開示  As mentioned above, specific IgM, such as HAV-related antibodies, can be detected earlier, or the pre-dilution dilution can be reduced to allow for a wider range of measurements. Reliable measurement methods in the area are urgently and strongly required. Disclosure of the invention
本発明者らは、 上記した問題のないそして被検試料の必要な測定範囲 を簡単に設定でき、 より早い時期で特異的な I gM、 例えば、 HAV関 連抗体を検出したり、 前希釈の希釈倍率を低減せしめてより広範囲の測 定を可能にする自動化された測定系に適した測定方法を見いだすべく、 鋭意研究を行った結果、 簡単な方法によりそれらの問題を解決しうるこ とを見出し、 本発明を完成した。 The present inventors can easily set the required measurement range of the test sample without the above-mentioned problems, detect specific IgM, for example, HAV-related antibody at an earlier stage, or perform pre-dilution. Reduce the dilution ratio to obtain a wider range of measurements. As a result of diligent research to find a measurement method suitable for an automated measurement system that enables measurement, it was found that these problems could be solved by a simple method, and the present invention was completed.
. 本発明は、 抗ヒト I g M抗体試薬を使用して、 被検試料中の対象抗原 に対する特異的 I g M抗体を免疫学的に測定する方法において、 被検試 料を少なくとも I g Mまたは I g M含有水溶液により希釈することを特 徴とする特異的 I g M抗体測定試薬及びその試薬を用いた測定方法を提 供する。 より具体的な態様においては、 本発明は、 試料を一旦緩衝剤、 希釈液又は希釈剤などの水溶液で幾分か希釈し、 つぎに試料を少なくと も I g Mまたは I g M含有水溶液により希釈した後、 試料中の抗ウィル ス特異的 I g M抗体などの特定の抗原に特異性をもつ I g M抗体を、 抗 ヒト I g M抗体で被覆した固相担体などと反応させて試料中の I g M抗 体を固相抗ヒト I g M抗体と免疫学的に反応させ、 (a ) つぎにウィル スなどの特定の抗原試薬を免疫学的に反応させ、 得られた反応生成物に 化学発光標識抗ウィルス抗体などの標識抗体を免疫学的に反応させるか、 または (b ) ウィルスなどの特定の抗原試薬を標識剤で標識した標識抗 原を免疫学的に反応させることからなることを特徴とする特異的 I g M 抗体の測定法及びその測定法に用いる試薬が提供される。 ヒト I g Mの 添加処理により、 より広範囲の測定を達成することもできるし、 測定試 料調製の手間、 例えば試料濃度の調製などの測定範囲設定が簡易に行う ことができるようになり、 自動化免疫測定系における適用が容易になる。 図面の簡単な説明  The present invention provides a method for immunologically measuring a specific IgM antibody against a target antigen in a test sample using an anti-human IgM antibody reagent, the method comprising: Alternatively, the present invention provides a specific IgM antibody measurement reagent characterized by being diluted with an aqueous solution containing IgM, and a measurement method using the reagent. In a more specific embodiment, the invention provides that the sample is diluted once with an aqueous solution of a buffer, diluent or diluent, and then the sample is diluted with at least IgM or an aqueous solution containing IgM. After dilution, an IgM antibody having specificity for a specific antigen, such as an anti-virus-specific IgM antibody, in the sample is reacted with a solid support coated with anti-human IgM antibody, etc. The IgM antibody in the sample is immunologically reacted with the solid-phase anti-human IgM antibody, and (a) a specific antigen reagent such as virus is immunologically reacted. (B) reacting a labeled antigen, such as a virus, with a specific antigen reagent with a labeling agent, or reacting it immunologically with a labeled antibody such as a chemiluminescent-labeled antiviral antibody. Method for measuring specific IgM antibody and reagents used in the method It is provided. By adding human IgM, it is possible to achieve a wider range of measurement, and to simplify the preparation of the measurement sample, such as setting the measurement range such as adjusting the sample concentration. Facilitates application in immunoassay systems. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 試料濃度と発光量との関係を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、 抗ヒト I gM抗体試薬を使用して、 被検試料中の対象抗原 に対する特異的 I gM抗体を免疫学的に測定する方法において、 被検試 料を少なくとも I gMまたは I gM含有水溶液により希釈することを特 徴とする特異的 I gM抗体測定試薬及びその試薬を用いた測定方法を提 供する。 本発明で用いられる測定対象試料としては、 全血、 血清、 血漿、 唾液、 生体粘液、 などの生体由来材料をあげることができる。 特に測定 対象試料としては、 全血、 血清、 血漿が好ましく用いられる。 Figure 1 shows the relationship between sample concentration and luminescence. Detailed description of the invention The present invention relates to a method for immunologically measuring a specific IgM antibody against a target antigen in a test sample using an anti-human IgM antibody reagent, wherein the test sample contains at least IgM or IgM. Provide a specific IgM antibody measurement reagent characterized by being diluted with an aqueous solution, and a measurement method using the reagent. Examples of the measurement target sample used in the present invention include biological materials such as whole blood, serum, plasma, saliva, and biological mucus. In particular, whole blood, serum, and plasma are preferably used as a sample to be measured.
本発明においては、 また試料をヒト I gM含有フラクション、 精製ヒ ト I gMなどの水溶液を添加して、 試料中の I gM量に影響されること 無く、 目的の抗原に特異的な I gM抗体を測定できるようにする。 約 0. In the present invention, an IgM antibody specific to a target antigen is added to a sample by adding an aqueous solution of a human IgM-containing fraction or purified human IgM to the sample without being affected by the amount of IgM in the sample. To be measured. About 0.
005 %のヒト I gMを含有する水溶液の場合、 その水溶液で試料を約 10〜500倍に、 好ましくは約 50〜200倍に、 さらに好ましくは 約 70〜1 50倍に、 最も好ましくは約 80〜120倍に希釈してもよ い。 ヒト I gMの添加処理により、 より広範囲の測定を達成することも できるし、 測定試料調製の手間、 例えば試料濃度の調製などの測定範囲 設定が簡易に行うことができるようになり、 自動化免疫測定系における 適用が容易になる。 In the case of an aqueous solution containing 005% of human IgM, the aqueous solution will increase the sample by a factor of about 10-500, preferably about 50-200, more preferably about 70-150, most preferably about 80-150. It may be diluted up to 120 times. By adding human IgM, it is possible to achieve a wider range of measurement, and it is possible to easily set the measurement range, such as preparation of the measurement sample, for example, adjustment of the sample concentration, and automated immunoassay. It is easier to apply in systems.
測定対象試料は、 必要に応じ上記処理の前に、 緩衝剤、 希釈液、 キレ ート化剤、 保存剤などを添加して用いることができる。 試料は、 場合に よって 50〜500倍に希釈してもよい。 緩衝剤、 希釈液又は希釈剤と しては、 水、 リン酸又はリン酸塩緩衝液、 トリス (ヒドロキシメチル) ァミノメタン (T r i s ) 緩衝液、 例えば生理食塩水などの塩化ナトリ ゥム液、 N— (2—ヒ ドロキシェチル) ピぺラジン一 N, - (2—エタ ンスルホン酸) (HEPES)液、 ピぺラジン一N, N, 一ビス (2— エタンスルホン酸) (P I BES)液、 3— (シァノへキシルァミノ) 一 1—プロパンスルホン酸 (CAP S)液、 3— (モルホリノ) プロパ ンスルホン酸 (MOPS)液、 N, N' —ビス (2—ヒドロキシェチル ) —2—アミノエタンスルホン酸 (BES)液、 N—トリス (ヒドロキ シメチル) メチルー 2—アミノエタンスルホン酸 (TES)液、 N— ( 2—ァセトアミ ド) 一2—アミノエタンスルホン酸 (ACES)液、 ァ ミノ酸液などが挙げられる。 これらは単独でも、 任意に組合わせて配合 しても用いることができる。 キレート化剤としては、 エチレンジァミン テトラ酢酸 (EDTA) 、 エチレングリコール一ビス (yS—アミノエチ ルエーテル) — N, N, N' , N' —テトラ酢酸 (EGTA) などが挙 げられる。 これらキレート化剤は、 約 0. 01 mM〜約 20 mMの範囲 で用いることができる。 The sample to be measured can be used by adding a buffer, a diluent, a chelating agent, a preservative, and the like before the above treatment, if necessary. The sample may optionally be diluted 50- to 500-fold. Examples of the buffer, diluent or diluent include water, phosphate or phosphate buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer, sodium chloride such as physiological saline, N — (2-Hydroxitytyl) piperazine-N,-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES) solution, piperazine-N, N, monobis (2-ethanesulfonic acid) (PI BES) solution, 3 — (Cyanohexylamino) 1-propanesulfonic acid (CAPS) solution, 3- (morpholino) propa Sulfonic acid (MOPS) solution, N, N'-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES) solution, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) solution N- (2-acetoamide) -1-aminoethanesulfonic acid (ACES) solution, amino acid solution and the like. These can be used alone or in any combination. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethyleneglycol-bis (yS-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA). These chelating agents can be used in the range of about 0.01 mM to about 20 mM.
また、 試料は、 必要に応じ肝炎陰性のヒト血清、 血漿、 ヒト I gMを 含有する水溶液で希釈処理することもできる。 より具体的な態様におい ては、 本発明は、 試料を一旦緩衝剤、 希釈液又は希釈剤などの水溶液で 幾分か希釈し、 つぎに試料を少なくとも I gMまたは I gM含有水溶液 により希釈した後、 試料中の抗ウィルス特異的 I gM抗体などの特定の 抗原に特異性をもつ I gM抗体を、 抗ヒト I gM抗体で被覆した固相担 体などと反応させて試料中の I gM抗体を固相抗ヒト I gM抗体と免疫 学的に反応させ、 (a) つぎにウィルスなどの特定の抗原試薬を免疫学 的に反応させ、 得られた反応生成物に化学発光標識抗ウィルス抗体など の標識抗体を免疫学的に反応させるか、 または (b) ウィルスなどの特 定の抗原試薬を標識剤で標識した標識抗原を免疫学的に反応させること からなることを特徴とする特異的 I g M抗体の測定法及びその測定法に 用いる試薬が提供される。  The sample can be diluted with an aqueous solution containing hepatitis-negative human serum, plasma, and human IgM, if necessary. In a more specific embodiment, the present invention provides a method wherein the sample is once diluted with buffer, diluent or an aqueous solution of a diluent to some extent, and then diluted with at least IgM or an aqueous solution containing IgM. An IgM antibody having specificity for a specific antigen, such as an anti-virus-specific IgM antibody in the sample, is reacted with a solid phase carrier coated with an anti-human IgM antibody to react the IgM antibody in the sample. (A) Next, a specific antigen reagent such as a virus is immunologically reacted, and the obtained reaction product is reacted with a chemiluminescent-labeled anti-virus antibody or the like. A specific Ig comprising reacting a labeled antibody immunologically, or (b) immunologically reacting a labeled antigen obtained by labeling a specific antigen reagent such as a virus with a labeling agent. M antibody measurement method and reagents used for the measurement method are provided. It is.
特に好ましい測定系の例としては、 H A V感染の急性期に生ずる、 I gM型の抗 HAV抗体を患者の血液を測定することにより急性 A型肝炎 の感染を診断する方法が挙げられる。 この I gM型の抗 HAV抗体を特 異的に測定する系では、 //一鎖特異性の抗ヒト I gM抗体で被覆した固 相、 例えば下記に示すような固相担体を、 測定試料と反応させ、 次に H AV抗原試薬と反応させ、 最後に標識抗 HAV抗体と反応させるという ように順次反応させることにより行われる。 An example of a particularly preferable measurement system is a method for diagnosing acute hepatitis A infection by measuring the blood of a patient with an anti-HAV antibody of the IgM type, which occurs in the acute phase of HAV infection. This IgM type anti-HAV antibody is In a system for differential measurement, // a solid phase coated with a single-chain specific anti-human IgM antibody, for example, a solid support as shown below, is reacted with the sample to be measured, and then a HAV antigen reagent is used. The reaction is carried out, and finally the reaction is carried out sequentially with the labeled anti-HAV antibody.
本発明に従った I gM型の抗 HAV抗体を特異的に測定する系で用 いられる HAV抗原試薬は、 イン · ビトロの細胞培養法で得られたウイ ルス抗原を用いている。 それは感染細胞を溶菌化して得られた細胞ライ ゼー卜から分離された H A V抽出物あるいはそれから誘導されたものが 挙げられる。 その H A V抽出物は、 例えばアフリカミ ドリザル腎培養細 胞、 ヒト肝臓腫瘍セルライン PLCZPRF/5、 Hep. G2などの As the HAV antigen reagent used in the system for specifically measuring an IgM type anti-HAV antibody according to the present invention, a virus antigen obtained by an in vitro cell culture method is used. It includes an HAV extract isolated from a cell lysate obtained by lysing infected cells or a cell derived therefrom. The HAV extract was obtained from, for example, African green monkey kidney culture cells, human liver tumor cell line PLCZPRF / 5, Hep.
H A V感染細胞であつて培養しうるもので、 さらに好ましくは大量に H AVを産生しうるセルライン細胞を、 公知の生育培地、 例えばイーグル 最小必須培地 (Eag l e' s MEM) . ダルべッコ最小必須培地 ( Du l be c co' s MEM) 、 PRM 1 - 1640 (G i b c o社 ) . E a g 1 e' s MEM) 、 N— ( 2—ヒ ドロキシェチル) ピペラ ジン一 N, 一 (2—エタンスルホン酸) (HE PES)緩衝液添加ィー グル MEM、 リン酸緩衝化 L一 15— a培地、 ハンクス液 (Hank s' ba l anc ed s a l t s o l u t i on) などの生育培地で、 必要に応じゥシ胎児血清 (FCS) 、 ペンシリン、 トレブトマイシンな どの抗生物質、 酵母抽出液、 パクトペプトン、 ラクトアルブミン加水分 解物、 その他細胞成長因子などを添加したものの中で培養し、 次にこう して得られた細胞培養物から次のようにして得られる。 A HAV-infected cell that can be cultured, and more preferably a cell line cell capable of producing HAV in large quantities, is transformed into a known growth medium, such as Eagle's minimum essential medium (Eagle's MEM). Minimum essential medium (Dulbecco's MEM), PRM 1-1640 (Gibco). Eag1e's MEM), N- (2-hydroxyxethyl) piperazine-N, 1- (2- Ethanesulfonic acid) (HE PES) Buffered Eagle MEM, Phosphate buffered L-15-a medium, Hanks 'solution (Hanks' banced saltsolution), etc., as needed. Culture in fetal serum (FCS), antibiotics such as pencilin, trebutomycin, yeast extract, pactopeptone, lactalbumin hydrolyzate, and other cell growth factors, and then It is obtained as follows from the obtained cell culture.
つまり、 上記のようにして得られた細胞培養物から栄養培地を除去し、 ついで細胞を生理的食塩水、 燐酸塩などで緩衝化された溶液などで、 必 要に応じ EDTAなどのキレート化剤を添加したもので洗浄する。 こう して単離.収穫された細胞を、 代表的には EDTAなどのキレ一ト化剤 及びポリオキシエチレンエーテル (代表的なものは、 0. 5%の Tr i t on X - 1 00などの商品名で入手しうる) などの非ィォン界面活 性剤を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液、 例えば ImMの EDTA及 び 0. 5%の Tr i t o n X— 1 00を含む燐酸塩緩衝化溶液、 ある いはデォキシコ一ル酸塩を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液でもって 溶菌処理し、 こうして得られた細胞ライゼートを、 必要に応じ、 例えば 約 1 0〜 1 5分間ィンキュベーション処理し、 つぎに遠心処理、 例えば 約 1, 0 0 0〜 20, O O O x g、 好ましくは約 2, 0 00〜 1 0, 0 00 X gで、 約 5〜 60分間、 好ましくは約 1 0〜 30分間遠心処理し、 HAV抽出物を得ることができる。 このように、 細胞ライゼ一卜からそ の核由来物質、 細胞オルガネラ、 破碎物などを遠心分離処理して除き、 A型肝炎ウィルスが得られている。 HAV抽出物は、 例えば米国特許明 細書第 4, 7 2 1, 67 5号に記載のようにしても得られる。 HAV抽 出物は、 必要に応じ、 例えばクロ口ホルム抽出法、 酵素処理法、 蔗糖濃 度勾配遠心分離法などでさらに精製することもできる。 That is, the nutrient medium is removed from the cell culture obtained as described above, and the cells are then buffered with physiological saline, phosphate, or the like, and if necessary, a chelating agent such as EDTA is used. Wash with the addition of The harvested cells are typically isolated by a chelating agent such as EDTA. And polyoxyethylene ether (typically available under a trade name such as 0.5% Triton X-100) and buffered with phosphate containing non-ionic surfactants. Lysate in a buffered solution, such as a phosphate buffered solution containing ImM EDTA and 0.5% Triton X-100, or a phosphate buffer containing dexcholate The cell lysate thus obtained is incubated, if necessary, for example, for about 10 to 15 minutes, and then centrifuged, for example, for about 1,000 to 20, OOO xg, preferably Centrifugation at about 2,000 to 10,000 Xg for about 5 to 60 minutes, preferably about 10 to 30 minutes can obtain an HAV extract. Thus, hepatitis A virus is obtained by removing the nucleus-derived substances, cell organelles, and crushed substances from the cell lysate by centrifugation. HAV extracts can also be obtained, for example, as described in US Pat. No. 4,721,675. The HAV extract can be further purified, if necessary, by, for example, a black form extraction method, an enzyme treatment method, or a sucrose gradient centrifugation method.
こうして得られた H A V抽出物は、 つぎに公知の方法又はそれを修飾 した方法によりその感染性を不活性化するための処理がなされる。 不活 性化処理は、 例えばホルマリン液で処理する、 例えば約 37°Cで約 25 〜 45 %ホルマリン溶液の約 1 : 3000〜 1 : 7000希釈下、 例え ば、 1 : 4000希釈下にインキュベーション処理することにより行う ことができるが、 その他適切な方法を公知のものの中から選んで適用す ることが出来る。 この処理は、 例えば、 2週間行うこともでき、 さらに それより短い時間あるいは長い時間でもよい。 この処理の際の処理液に おいては、 必要に応じ、 緩衝剤、 希釈液又は希釈剤、 キレート化剤、 保 存剤などを添加して用いることもできる。 緩衝剤、 希釈液又は希釈剤と しては、 水、 リン酸緩衝液、 トリス (ヒドロキシメチル) ァミノメタン (T r i s)緩衝液、 生理食塩水などの塩化ナトリウム液、 N— (2— ヒドロキシェチル) ピぺラジン一N' - (2—エタンスルホン酸) (H EPES)液、 ピぺラジン一N, N' —ビス (2—エタンスルホン酸) (P I BES)液、 3— (シァノへキシルァミノ) 一 1一プロパンスル ホン酸 (CAP S)液、 3— (モルホリノ) プロパンスルホン酸 (MOThe HAV extract thus obtained is then subjected to a treatment for inactivating its infectivity by a known method or a modified method thereof. The inactivation treatment is performed, for example, by treatment with a formalin solution, for example, incubation at about 37 ° C under a dilution of about 1: 3000 to 1: 7000 in a about 25-45% formalin solution, for example, under a dilution of 1: 4000. However, other appropriate methods can be selected from known methods and applied. This process may be performed, for example, for two weeks, and may be shorter or longer. In the treatment liquid for this treatment, a buffer, a diluent or a diluent, a chelating agent, a preservative, and the like can be added as necessary. Buffers, diluents or diluents include water, phosphate buffer, tris (hydroxymethyl) aminoaminomethane (Tris) buffer solution, sodium chloride solution such as physiological saline, N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '-(2-ethanesulfonic acid) (H EPES) solution, piperazine-N , N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PI BES) solution, 3- (cyanohexylamino) 1-propanesulfonic acid (CAPS) solution, 3- (morpholino) propanesulfonic acid (MO
PS)液、 アミノ酸液などが挙げられる。 これらは単独でも、 任意に組 合わせて配合しても用いることができる。 キレート化剤としては、 ェチ レンジアミンテトラ酢酸 (EDTA) 、 エチレングリコール一ビス β 一アミノエチルエーテル) 一 Ν, Ν, Ν' , N' —テトラ酢酸 (EGT Α) などが挙げられる。 PS) solution, amino acid solution and the like. These may be used alone or in any combination. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol-bis-β-aminoethyl ether) Ν, Ν, Ν ′, N′-tetraacetic acid (EGTΑ).
本発明によれば、 こうして得られた感染性が不活性化された HAV抽 出物は、 それをそのまま HAV抗原として用いることもできるし、 さら にそれをつぎに界面活性剤で処理し得られたものも用いることができ、 こうした界面活性剤処理 H A V抽出物は好ましいものとして使用できる c 界面活性剤としては、 適切なものを公知又は市販のもののうちから選ん で用いることができ、 特にァニォン性界面活性剤が適している。  According to the present invention, the thus obtained HAV extract in which the infectivity has been inactivated can be used as it is as a HAV antigen, or can be further treated with a surfactant. These surfactant-treated HAV extracts can be used as preferred.c As the surfactant, an appropriate surfactant can be selected from known or commercially available ones. Surfactants are suitable.
ァニオン性界面活性剤としては、 ステアリン酸カリウムなどの炭素数 12〜 18の高級脂肪酸のアル力リ金属塩又はアル力リ土類金属塩、 胆 汁酸のアル力リ金属塩、 炭素数 12〜 18の高級脂肪酸のトリエタノー ルァミンなどの有機塩基塩、 ドデシル硫酸リチウム (LDS) 、 ドデシ ル硫酸ナトリウム ( S D S ) などの炭素数 12〜 18の高級脂肪酸又は 高級アルコールの硫酸エステル、 アルキルスルホン酸塩、 アルキルベン ゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルァリ一ルスルホン酸塩などが 挙げられ、 特に LDS、 SDSは著効を示す。 アルカリ金属としては、 ナトリウム、 カリウム、 リチウムなど、 アルカリ土類金属としては、 力 ルシゥム、 マグネシウムなどが挙げられる。 これら界面活性剤は、 共存 する蛋白質の量に応じて、 その使用量を選ぶことが好ましく、 例えば約Examples of the anionic surfactant include an alkali metal salt or an earth metal salt of a higher fatty acid having 12 to 18 carbon atoms such as potassium stearate; an alkali metal salt of bile acid; Organic fatty acid salts of higher fatty acids, such as triethanolamine, fatty acids of 18 to 18 carbon atoms, such as lithium dodecyl sulfate (LDS) and sodium dodecyl sulfate (SDS), sulfuric acid esters of higher fatty acids or higher alcohols, alkyl sulfonates, and alkyls Examples thereof include alkyl aryl sulfonates such as sodium benzene sulfonate, and LDS and SDS are particularly effective. Alkali metals include sodium, potassium, lithium and the like, and alkaline earth metals include potassium, magnesium and the like. These surfactants coexist It is preferable to select the amount to be used according to the amount of protein to be used.
0. 0 0 1 %νΖν〜約 1 0%v/vの範囲で用いることができる。 特 に好ましくは SDSを用い、 約 0. 0 5 %v/v〜約 5 %v/v、 より 好ましくは共存する他の蛋白質が存在しない場合には約 0. 5%v/v 〜約 1. 0%v/vの範囲で用いることができる。 界面活性剤で HAV 抽出物を処理するにあたっては、 必要に応じ HAV抽出物を緩衝剤、 希 釈液又は希釈剤などで希釈し、 所要濃度を与える界面活性剤溶液と混合 するか、 懸濁する。 こうして得られた混合物は、 必要に応じ攪拌処理さ れることができる。 また場合によっては、 混合物中にガラスビーズなど を加えて攪拌処理してもよい。 攪拌処理は、 測定感度を改善しうるもの であれば、 例えば穏やかな混合のみで済ますこともできるし、 激しい攪 拌混合であることもできる。 処理温度は、 室温で行うこともできるし、 冷却下行うこともできるし、 37 °Cあるいはそれ以上の温度とすること も測定感度を改善しうるものであれば、 採用できる。 界面活性剤で処理 された HAV抽出物は、 そのまま次の処理に使用できるし、 あるいは一 旦保存したのち次の処理に使用できるし、 また必要に応じ遠心分離など の分離処理をし、 さらに必要に応じ洗浄などの処理をして後次の処理に 使用できる。 これらの処理は、 測定時の非特異吸着を抑制し、 感度を改 善しうるように選ぶことができる。 It can be used in the range of 0.01% vΖv to about 10% v / v. Particularly preferably, using SDS, about 0.05% v / v to about 5% v / v, and more preferably about 0.5% v / v to about 1% in the absence of other coexisting proteins. It can be used in the range of 0% v / v. When treating the HAV extract with a surfactant, dilute the HAV extract with a buffer, diluent or diluent as necessary, and mix or suspend with a surfactant solution that provides the required concentration. . The mixture thus obtained can be agitated if necessary. In some cases, glass beads or the like may be added to the mixture, followed by stirring. As long as the stirring process can improve the measurement sensitivity, for example, only gentle mixing can be performed, or vigorous stirring mixing can be performed. The treatment can be performed at room temperature, under cooling, or at a temperature of 37 ° C. or higher as long as the measurement sensitivity can be improved. The HAV extract treated with the surfactant can be used as it is for the next processing, or it can be used once for storage and then used for the next processing. It can be used for the next process after washing and other treatments according to the requirements. These treatments can be selected so as to suppress non-specific adsorption during measurement and improve sensitivity.
本発明の界面活性剤処理の際の処理液においては、 緩衝剤、 希釈液 又は希釈剤、 キレート化剤、 保存剤などを添加して用いることができる。 緩衝剤、 希釈液又は希釈剤としては、 水、 リン酸又はリン酸塩緩衝液、 T r i s緩衝液、 例えば生理食塩水などの塩化ナトリゥム液、 H E P E S液、 P I BES液、 CAPS液、 MOPS液、 N, N' 一ビス (2— ヒ ドロキシェチル) 一 2—アミノエタンスルホン酸 (BES) 液、 N— トリス (ヒ ドロキシメチル) メチル一2—アミノエタンスルホン酸 (T E S)液、 N— (2—ァセトアミ ド) _ 2—アミノエタンスルホン酸 ( ACES)液、 アミノ酸液などが挙げられる。 これらは単独でも、 任意 に組合わせて配合して用いることもできる。 キレート化剤としては、 E DTA、 EGTAなどが挙げられる。 本発明によれば、 HAV抽出物は、 必要に応じて、 その感染性を不活性化する前に上記界面活性剤で処理し、In the treatment solution for the surfactant treatment of the present invention, a buffer, a diluent, a diluent, a chelating agent, a preservative, and the like can be added and used. Buffers, diluents or diluents include water, phosphate or phosphate buffer, Tris buffer, for example, sodium chloride solution such as saline, HEPES solution, PI BES solution, CAPS solution, MOPS solution, N, N 'Monobis (2-hydroxyxethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES) solution, N-Tris (hydroxymethyl) methyl-1-aminoethanesulfonic acid (T ES) solution, N- (2-acetoamide) _2-aminoethanesulfonic acid (ACES) solution, amino acid solution and the like. These can be used alone or in any combination. Examples of the chelating agent include EDTA, EGTA and the like. According to the present invention, the HAV extract is optionally treated with the above surfactant before inactivating its infectivity,
' つぎに得られた界面活性剤で処理された HAVを、 公知の方法又はそれ を修飾した方法により不活性化処理してもよい。 不活性化処理は、 上記 と同様にしてよく、 例えば約 37 °Cで約 37 %ホルマリン溶液の 1 : 4'Next, the obtained HAV treated with the surfactant may be inactivated by a known method or a modified method thereof. The inactivation treatment may be performed in the same manner as described above.
000希釈下にィンキュベ一ション処理することにより行うことができ る。 より具体的な態様において、 本発明で用いられる H A V抗原試薬は、 イン · ビトロの細胞培養法で得られた細胞ライゼ一卜から得られた H A V抽出物を約 0. 5% /¥〜約1. 0%v/vの範囲の濃度のドデシ ル硫酸ナトリウム (SDS)液と混合し、 つぎに必要に応じ、 例えば室 温で 3時間ィンキュベ一シヨン処理し、 303処理^1八¥抽出物を得る ことによって提供されるものであることもできる。 本発明では、 少なく とも I gMまたは I gM含有水溶液処理工程と組合せ、 その該得られた SDS処理 H A V抽出物を用いた試料中の H A V抗体の免疫測定試薬及 びそれを用いた試料中の抗体の測定法も提供される。 It can be performed by incubation treatment at a dilution of 000. In a more specific embodiment, the HAV antigen reagent used in the present invention comprises an HAV extract obtained from a cell lysate obtained by an in vitro cell culture method of about 0.5% / ¥ to about 1%. Mix with sodium dodecyl sulfate (SDS) solution at a concentration in the range of 0% v / v and then, if necessary, incubate at room temperature for 3 hours, for example, and treat 303 extract It can also be provided by gaining. In the present invention, a reagent for immunoassay of HAV antibody in a sample using the obtained SDS-treated HAV extract and an antibody in a sample using the same in combination with at least a step of treating an IgM or an aqueous solution containing IgM. Are also provided.
本発明における特異的 I gM抗体を測定するにあたっては、 ラジオィ ムノアツセィ、 酵素免疫測定法、 螢光免疫測定法、 及び化学発光免疫測 定法などの方法によることができる。 特に化学発光免疫測定法、 例えば In measuring the specific IgM antibody in the present invention, methods such as radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, and chemiluminescence immunoassay can be used. In particular, chemiluminescence immunoassays, for example
1 gM捕捉固相化学発光免疫測定法は自動化された測定ができ好ましい 方法である。 本発明において試料中の特異的 I gM抗体を測定するにあ たっては、 抗原抗体反応にあずかる抗原や抗体は、 必要に応じて、 例え ば、 寒天、 ァガロース、 セルロース、 紙、 ニトロセルロース、 デキスト ラン、 ゼラチン、 キチン、 コラーゲン、 綿などの生体由来高分子あるい は天然物由来高分子、 ポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリビニルアルコ —ル、 ポリアクリルァミ ドなどのァクリル樹脂、 ィォン交換樹脂、 光架 橋樹脂、 テフロン、 ポリアセタールなどの合成高分子、 ガラスビーズ、 シリカゲル、 アルミナ、 セラミック、 カーボン、 硫酸マグネシウムなど の無機質材料などからなる、 微粒子、 ビーズ、 マイクロプレート、 マイ クロタイタ一ゥエル、 マイクロチューブ、 トリップ、 メンブレン、 トレ ィ、 ゲルなど、 さらには赤血球、 ラテックス粒子、 乳剤などの固体担体 に固定しておき、 この固定担体を、 分析対象としての抗体等を含有する 試料と接触させ、 こうして固定担体に固定された抗原と、 分析試料中の 抗体等とを特異的に結合反応せしめ、 この特異的に結合した分析対象物 を検知することによりおこなうことができる。 The 1 gM capture solid phase chemiluminescence immunoassay is the preferred method because it allows for automated measurements. In the present invention, in measuring a specific IgM antibody in a sample, antigens and antibodies participating in an antigen-antibody reaction may be used, if necessary, for example, agar, agarose, cellulose, paper, nitrocellulose, dextran. , Gelatin, chitin, collagen, cotton, etc. Are polymers derived from natural products, acrylyl resins such as polystyrene, polyethylene, polyvinyl alcohol, and polyacrylamide, ion exchange resins, optical bridge resins, synthetic polymers such as Teflon and polyacetal, glass beads, silica gel, alumina, ceramic, Fine particles, beads, microplates, microtiter wells, microtubes, trips, membranes, trays, gels, etc., made of inorganic materials such as carbon and magnesium sulfate, as well as solid carriers such as red blood cells, latex particles, and emulsions The immobilized carrier is brought into contact with a sample containing an antibody or the like to be analyzed, and the antigen immobilized on the immobilized carrier and the antibody or the like in the analysis sample are specifically bound and reacted. Analyte specifically bound Can be detected.
好ましい態様において、 本発明では試料と反応せしめられる抗ヒト I g M抗体結合固体担体ある t、は粒子状担体などとしては、 ポリスチレン 製のビーズ、 ポリスチレン製の微小粒子などを用いることができる。 また、 抗体としては、 ヒト I gMに対する抗体であれば特に限定され ることなく用いることができる。 抗体は常法により得ることができ、 例 えば村松繁、 他編、 実験生物学講座 1 4、 免疫生物学、 丸善株式会社、 昭和 6 0年、 日本生化学会編、 続生化学実験講座 5、 免疫生化学研究法、 東京化学同人、 1 9 8 6年、 日本生化学会編、 新生化学実験講座 1 2、 分子免疫学 I I I、 抗原 '抗体 '捕体、 東京化学同人、 1 9 9 2年など に記載の方法に準じて、 例えばゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 ゥサギ、 ャギ、 ラ ッ ト、 マウスなどを免疫するなどして得たり、 モノクローナル抗体であ ることもでき、 これらは単独でもあるいはこれらを組合せて用いること は任意にできる。 これら抗体は、 必要なら、 ペプシン、 パパインなどの 酵素で消化して、 F ( a b ' ) 2 、 F a bとして使用してもよい。 抗ヒ ト I g M抗体としては、 好ましくは/ z鎖に対して特異的に反応する抗体、 抗〃鎖—ヒト I g M抗体が挙げられ、 これらはマウスミエローマ細胞を 用いて細胞融合技術を利用して得られたモノク口一ナル抗体であつても よいことはいうまでもない。 また、 抗 H A V抗体は、 高力価を有するヒ ト H A V陽性血清又は血漿から得られたものが利用できるカ^ 上記した ようにモノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもない。 抗 HIn a preferred embodiment, in the present invention, the anti-human IgM antibody-bound solid carrier capable of reacting with a sample, such as polystyrene beads or polystyrene microparticles, can be used as the particulate carrier. In addition, any antibody can be used without particular limitation as long as it is an antibody against human IgM. Antibodies can be obtained by conventional methods.For example, Shigeru Muramatsu, et al., Experimental Biology Lecture 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., Showa 60, Japan Biochemical Society Ed. Immunochemical Chemistry Research Method, Tokyo Chemistry Dojin, 1996, ed., Biochemical Society of Japan, New Chemistry Experiment Course 12, Molecular Immunology III, Antigen 'Antibody' Capture, Tokyo Chemical Dojin, 1992, etc. For example, they can be obtained by immunizing a horse, a horse, a horse, a sheep, a goat, a goat, a rat, a mouse, or the like, or can be a monoclonal antibody. Alternatively, these can be arbitrarily used in combination. These antibodies may be digested with enzymes such as pepsin and papain, if necessary, and used as F (ab ') 2 and Fab. As the anti-human IgM antibody, preferably, an antibody that specifically reacts with the / z chain, It is needless to say that an anti-chain-human IgM antibody may be used, and these may be a monoclonal antibody obtained by using cell fusion technology using mouse myeloma cells. In addition, the anti-HAV antibody may be one obtained from human HAV-positive serum or plasma having a high titer. Needless to say, a monoclonal antibody may be used as described above. Anti-H
B e抗体は、 ウィルス培養物から得ることもできるが、 遺伝子組換えの 手法を用い、 大腸菌、 酵母などで発現させた組換え抗原であることもで さ <ε> ο B e antibody can be obtained from a virus culture, but can also be a recombinant antigen expressed in E. coli, yeast, etc. using genetic recombination <ε> ο
ラジオィムノアツセィ、 酵素免疫測定法、 螢光免疫測定法、 化学発光 免疫測定法などでは、 1 2 5 I、 3 Ηなどの放射性物質、 西洋わさびペル ォキシダ一ゼ、 β—ϋ 一ガラク トシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ などの酵素、 フルォレツセインなどの螢光色素、 ァクリジニゥムエステ ル類などの化学発光色素、 金コロイド、 セレンコロイドあるいは有色ラ テックス粒子などの有色物質などで標識された抗原あるレ、は二次抗体が 試薬として用いられ、 分析試料中の抗体、 複合体等と特異的に結合反応 せしめられ、 その放射活性、 酵素活性、 化学発光あるいは色の有無など を測定して、 試料中の抗体等が存在していたか否かを判別することがで きる。 本発明においては、 特に化学発光標識法、 例えばアタリジニゥム エステル類あるいは螢光標識法、 例えば発光ランタニドなどで標識され た二次抗体試薬を用いる螢光あるいは化学発光免疫測定法は自動化され た測定ができ好ましい方法である。 特にァクリジニゥムエステル類で標 識された二次抗体試薬を用 、る化学発光免疫測定法は自動化された測定 ができ好ましい。 ァクリジニゥムエステル類としては、 例えば特開昭 6 2 - 3 9 5 9 8号公報、 特開昭 6 2— 6 1 9 6 9号公報、 特開昭 6 3― 5 7 5 7 2号公報、 特開昭 6 3— 1 0 1 3 6 8号公報、 特開昭 6 3— 1Radio I Takeno Atsu Si, enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, in chemiluminescent immunoassay, radioactive materials, such as 1 2 5 I, 3 Η, horseradish peroxide Okishida Ichize, β-ϋ one-galactosidase Antigens such as alkaline phosphatase, fluorescent dyes such as fluorescein, chemiluminescent dyes such as acridinium esters, and colored substances such as colloidal gold, colloidal selenium, or colored latex particles In some cases, a secondary antibody is used as a reagent, and specifically reacts with the antibody, complex, etc. in the analysis sample, and its radioactivity, enzyme activity, chemiluminescence, or the presence or absence of color is measured. It is possible to determine whether or not an antibody or the like was present in the sample. In the present invention, in particular, a chemiluminescent labeling method, for example, an ataridinium ester or a fluorescent labeling method, for example, a fluorescent or chemiluminescent immunoassay using a secondary antibody reagent labeled with luminescent lanthanide, etc., can perform automated measurement. This is the preferred method. In particular, a chemiluminescence immunoassay using a secondary antibody reagent labeled with an acridinium ester is preferable because it can perform automated measurement. Examples of the acridinium esters include, for example, JP-A-62-39598, JP-A-62-196969, and JP-A-63-575772. JP, JP-A-63-101-368, JP-A-633-1
1 2 5 6 4号公報、 特開平 1— 1 9 9 9 4 9号公報、 特開平 1一 2 6 1 4 6 1号公報、 特開平 2— 9 6 5 6 7号公報、 特開平 2— 1 3 3 4 6 9 号公報、 特開平 2— 5 0 3 2 6 8号公報、 特開平 2 _ 5 0 1 7 7 2号公 報、 欧州特許公開出願第 0 0 8 2 6 3 6号、 英国特許明細書第 1, 4 6 1, 8 7 7号、 米国特許明細書第 3, 5 3 9 , 5 7 4号などに記載の N —アルキル又はァリールァクリジニゥムー 9一力ルボン酸エステルなど が挙げられる。 特に、 特開昭 6 3 - 1 1 2 5 6 4号公報、 米国特許明細 書第 3, 5 3 9 , 5 7 4号などに記載の 1 0—アルキル · N—アルキル 又はァリ一ルースルホニルー N—アルキル又はァリ一ルスルホニルァク リジニゥムー 9—カルボキサミ ド、 N—メチルァクリジニゥム一 9一力 ルボン酸エステルなどは代表的な化学発光標識として挙げられる。 ァクリジニゥム標識の場合、 測定前にトリガ一試薬処理、 例えば過酸 化水素、 例えば約 0 . 0 1 %〜約0 . 1 %の過酸化水素水溶液、 及び水 酸化ナトリウム、 例えば約 0 . ひ 5 N〜約 0 . 5 Nの水酸化ナトリウム 水溶液で処理してから、 ルミノメ一ターなどを用レ、て測定を行うことが できる。 発光ランタニドとしては、 例えば欧州特許公開出願第 0 0 6 81 2 564, JP-A-1-1999949, JP-A-11-261 No. 461, JP-A-2-966567, JP-A-2-133334, JP-A2-50332, JP2_50 No. 1 772, European Patent Application No. 0 82 636, UK Patent Specification 1, 461, 877, U.S. Patent Specification 3, 539, 5 N-alkyl or aryl acrylidinum 9 described in No. 74, etc. In particular, 10-alkyl-N-alkyl or arylsulfonyl-N described in JP-A-63-112564, U.S. Pat. No. 3,539,574, etc. —Alkyl or arylsulfonycrydinidium 9-carboxamide, N-methylacridinium-1-hydroxyrubonate and the like are mentioned as typical chemiluminescent labels. In the case of acridinium labeling, trigger one reagent treatment before measurement, for example, hydrogen peroxide, for example, an aqueous solution of about 0.01% to about 0.1% hydrogen peroxide, and sodium hydroxide, for example, about 0.1 N After treatment with an aqueous solution of about 0.5 N sodium hydroxide, the measurement can be performed using a luminometer or the like. Examples of the luminescent lanthanide include, for example, European Patent Application No. 0 6 8
8 7 5号、 米国特許明細書第 4, 3 7 4, 1 2 0号、 米国特許明細書第 4, 2 8 3 , 3 8 2号、 米国特許明細書第 4, 2 5 9 , 3 1 3号、 米国 特許明細書第 4, 3 5 2, 7 5 1号、 米国特許明細書第 4 , 4 3 2, 9 0 7号、 欧州特許公開出願第 0 1 0 3 5 5 8号などに記載のァミノカル ボン酸基を持つ発光ランタニドをキレート化できるものなどが挙げられ る。 また測定前にレーザ一光などによる励起処理をして測定を容易にす ることもできる。 勿論、 標識剤は上記のものに限定されること無く、 測 定に使用される機器、 場所などを考慮し、 適宜当該分野で使用すること が知られているものの中から目的に応じ選択して用いることができる。 固体担体、 粒子状担体あるいは標識などと抗原あるいは抗体などとを 結合あるいは吸着させるには、 当該分野で汎用されている方法を用レ、る ことができ、 例えばイオン相互作用、 疎水相互作用、 共有結合などの物 理的吸着や化学的結合により行うことができる。 例えば、 架橋剤として は、 グルタルアルデヒ ド、 1 一ェチル一 3— ( 3—ジメチルァミノプロ ピル) カルボジイミ ド、 N, N' — 0—フエ二レンジマレイ ミ ド、 N— スクシンィミジル 3— ( 2—ピリジルジチォ) プロピオネート、 N— スクシンィ ミ ジル S—ァセチルメルカプトアセテート、 N—スクシン ィ ミ ジル 4一 (N—マレイ ミ ドメチル) シクロへキサン一 1 一カルボ キシレート、 N—スクシンィミジル 6 _マレイミ ドへキサノエート、 N—スクシンィミジル 4ーョードアセチルァミノべンゾエート、 N— スクシンィミジル 3— ( p—ヒ ドロキシフヱニル) プロピオンネート、875, U.S. Pat. No. 4,374,120, U.S. Pat. No. 4,283,382, U.S. Pat. No. 4,259,31 No. 3, U.S. Patent Specification No. 4,352,751, U.S. Patent Specification No. 4,432,907, European Patent Application No. 0 2013355, etc. Those which can chelate the luminescent lanthanide having the described aminocarbonic acid group can be mentioned. Also, the measurement can be facilitated by performing an excitation process using a laser beam or the like before the measurement. Of course, the labeling agent is not limited to the above, but may be appropriately selected from those known to be used in the relevant field, taking into account the equipment and location used for the measurement. Can be used. In order to bind or adsorb a solid carrier, a particulate carrier, a label, etc. to an antigen, an antibody, etc., a method generally used in the relevant field is used. For example, it can be performed by physical adsorption or chemical bonding such as ionic interaction, hydrophobic interaction, and covalent bond. For example, crosslinking agents include glutaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, N, N'-0-phenylenediimide, N-succinimidyl 3- (2- Pyridyldithio) propionate, N-succinimidyl S-acetylmercaptoacetate, N-succinimidyl 4-1 (N-maleidomethyl) cyclohexane-11-carboxylate, N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate, N-succinimidyl 4-acetylacetylaminobenzoate, N-succinimidyl 3- (p-hydroxyphenyl) propionate,
N—スクシンィミジル m—マレイミ ドベンゾエー卜、 N—スクシンィ ミ ジル 4—マレイミ ドブチレート、 N—スクシンィミジル (P—マ レイミ ドフエ二ル) ァセテ一ト、 N—スクシンィ ミジル 4— ( ρ—マ レイミ ドフエニル) プチレー卜などが挙げられる。 N-succinimidyl m-maleimidobenzoate, N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate, N-succinimidyl (P-maleimidophenyl) acetate, N-succinimidyl 4 -— (ρ-maleimidphenyl) petitate And the like.
固体担体、 粒子状担体などの例としては、 上記したようなものが挙げ られ、 例えば寒天、 ァガロース、 架橋ァガロース、 架橋アルギン酸、 架 橋グァガム、 二トロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル口 ースエステルあるいは混合セルロースエステル、 ゼラチン、 架橋ゼラチ ン、 ラテックス、 ゴム、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリスチレン、 スチレン—ブタジエン共重合体、 ポリ塩化ビニル、 ポリ酢酸ビニル、 ポ リアクリルアミ ド、 ポリメタクリ レート、 スチレン一メタクリ レ一ト共 重合体、 ポリグリシジルメタクリレート、 ァクロレイン一エチレングリ コールジメタクリ レート共重合体などのポリエステル、 ポリアミ ド、 ポ リウレタン、 ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あるいは 非修飾の重合炭水化物、 重合炭化水素など、 それらの架橋誘導体など、 ガラス、 例えば活性化ガラス、 シリカゲル、 カオリン、 タルク、 シリカ —アルミナ、 アルミナ、 硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群か ら選ばれたものを、 多孔性のゲル、 微粒子などにしたものが挙げられる 本発明においては、 測定は競合アツセィ、 サンドイッチアツセィ、 中 和アツセィ、 固相アツセィ、 クロマトグラムアツセィなどに適したよう にしておこなうこともできる。 本発明においては、 標識用試薬として、Examples of solid carriers and particulate carriers include those described above, for example, agar, agarose, cross-linked agarose, cross-linked alginic acid, cross-linked guar gum, cellulosic esters such as ditrocellulose and carboxycellulose, or mixed cellulose. Ester, gelatin, crosslinked gelatin, latex, rubber, polyethylene, polypropylene, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyacrylamide, polymethacrylate, styrene-methacrylate copolymer, Modification of natural or synthetic materials such as polyesters such as polyglycidyl methacrylate and acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, polyamides, polyurethanes, and polyepoxy resins; Glass, such as activated glass, silica gel, kaolin, talc, silica, etc., such as unmodified polymerized carbohydrates, polymerized hydrocarbons, and their crosslinked derivatives —A material selected from the group consisting of inorganic materials such as alumina, alumina, barium sulfate and the like is used in the form of porous gels, fine particles, etc. In the present invention, the measurement is performed by competitive atssays, sandwich atsieties, It can also be carried out in a manner suitable for neutral attraction, solid-phase at- sity, chromatogram atssay, and the like. In the present invention, as a labeling reagent,
4ーヒドロキシフエニル酢酸、 1, 2—フエ二レンジァミン、 テトラメ チルベンジジンなどと西洋ヮサビ ·ペルォキシダ一ゼ、 ゥンベリフェリ ルガラク トシド、 ニトロフェニルガラク トシ 'ドなどと β -D ーガラク ト シダーゼ、 ゥンベリフェリルホスフェート、 ニトロフエニルホスフエ一 ト、 N A D Ρなどとアルカリフォスファターゼ、 グルコース一 6—リン 酸 ·デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬、 放射性物質試薬、 フルォレツセ インイソチオシァネ一ト、 テトラメチルローダミンイソチオシァネ一ト、 ァクリジニゥムエステル類、 発光ランタニドなどを用いている螢光試薬、 発光試薬、 化学発光試薬、 金コロイ ド、 銀コロイ ド、 セレンコロイ ドな どのコロイ ド標識試薬、 磁性体試薬、 ピオチン標識抗ビォチン抗体など のハプテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いることができる。 上記したように本発明においては、 特に化学発光標識試薬、 例えばァク リジニゥムエステル類あるいは螢光標識試薬、 例えば発光ランタニドな どで標識された二次抗体試薬を用いると、 測定は自動化され好ましい。 本発明の測定系においては、 前記以外の界面活性剤、 緩衝剤、 希釈液又 は希釈剤、 ブロッキング剤、 キレート化剤、 保存剤などを含有させるよ うにして用いることができる。 好ましいこの界面活性剤としては、 ポリ ォキシエチレンソルビタン (代表的なものは、 Tw e e n 2 0などの 商品名で入手しうる) 、 ポリオキシエチレンエーテル (代表的なものは、 T r i t o n X - 1 0 0などの商品名で入手しうる) 、 ォクチルフエ ノ一ル ·ェチレンォキサイ ド縮合物 (代表的なものは、 N 0 n i d e t P— 40などの商品名で入手しうる) などが挙げられる。 4-hydroxyphenylacetic acid, 1,2-phenylenediamine, tetramethylbenzidine, etc. and horseradish peroxidase, umbelliferyl galactoside, nitrophenylgalactoside, etc. and β-D-galactosidase, umbelliferyl Phosphate, nitrophenyl phosphate, NADΡ and other enzyme reagents such as alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate and dehydrogenase, radioactive material reagents, fluorescein isothiocyanate, tetramethyl rhodamine isothiosine Fluorescent reagent, luminescent reagent, chemiluminescent reagent, colloid labeling reagent such as gold colloid, silver colloid, selenium colloid, magnetic reagent, etc. using acridinium ester, luminescent lanthanide, etc. Hap of biotin-labeled anti-biotin antibody Or the like can be used down-labeled anti-hapten antibody detection system reagent. As described above, in the present invention, the use of a chemiluminescent labeling reagent, for example, an acridinium ester or a fluorescent labeling reagent, for example, a secondary antibody reagent labeled with a luminescent lanthanide, can automate the measurement. preferable. In the measurement system of the present invention, a surfactant, a buffer, a diluent or a diluent, a blocking agent, a chelating agent, a preservative and the like other than those described above can be used. Preferred surfactants include polyoxyethylene sorbitan (typical is available under trade names such as Tween 20), polyoxyethylene ether (typical is Triton X-1 (Available under trade names such as 0 0), octylphenol-ethylenoxide condensate (typically N 0 nidet P-40, etc.).
緩衝剤、 希釈液又は希釈剤としては、 上記したような水、 リン酸緩衝 液、 Tr i s緩衝液、 生理食塩水など、 HE PES液、 PBES液、 C APS液、 MOPS液、 アミノ酸液などが挙げられる。 これらは単独で も、 任意に配合しても用いることができる。 キレート化剤としては、 E Examples of the buffer, diluent or diluent include water, phosphate buffer, Tris buffer, physiological saline, and the like, such as HE PES solution, PBES solution, CAPS solution, MOPS solution, and amino acid solution. No. These can be used alone or in any combination. E as a chelating agent
DTA、 EGTAなどが挙げられる。 保存剤としては、 例えばナトリウ ムアジド、 ェチルパラベンなどが挙げられる。 その他、 本発明の測定系 には、 各種動物の血清、 例えばゥシ血清、 ゥシ血清アルブンミン (BS A) 、 ゥシ胎児血清 (FCS) 、 ャギ血清、 卵白アルブンミン、 ゼラチ ン、 各種乳蛋白質、 例えばスキムミルク、 カゼイン、 カゼイン分解物、 ホエー蛋白質など、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピ口リ ドンなど 力、らなる群から選ばれたものを添加することができる。 DTA, EGTA and the like. Examples of the preservative include sodium azide, ethylparaben and the like. In addition, the measurement system of the present invention includes various animal sera, for example, sera serum, sera serum albumin (BSA), sera fetal serum (FCS), goat serum, egg white albumin, gelatin, and various milk proteins. For example, skim milk, casein, casein hydrolyzate, whey protein, and the like, and polyvinyl alcohol, polyvinylpyridone, and other substances selected from the group consisting of strength and the like can be added.
本発明においては、 試薬は単一の容器あるいは複数の容器に入れてあ り、 使用にあたり配合されて用いるようになつていてもよい。  In the present invention, the reagent may be contained in a single container or a plurality of containers, and may be used after being mixed for use.
I gM抗体測定の代表的な H A V感染診断のための測定系のより具体 的な態様においては、 本発明は、 試料を適当な濃度に生理食塩水などで 希釈し、 例えば約 80〜120倍、 好ましくは約 100倍に希釈し、 つ いで適当な量のヒト I gM溶液及び抗ヒト I gM抗体結合固体担体ある いは粒子状担体などを反応させ、 次に (1) H A V感染培養細胞から収 穫された HAV抽出物又は (2) この HAV抽出物を少なくとも界面活 性剤、 例えば SDSで処理して得られた H A V抗原と免疫学的に反応さ せ、 得られた反応生成物に化学発光標識抗 H A V抗体、 例えばァクリジ 二ゥム標識抗 H A V抗体を免疫学的に反応させ、 過酸化水素溶液及び水 酸化ナトリウム溶液からなるトリガー試薬と反応させた後検知を行うこ とを特徴とする HAV抗体の測定法が提供されうる。  In a more specific embodiment of a typical measurement system for HAV infection diagnosis of IgM antibody measurement, the present invention provides a method of diluting a sample to an appropriate concentration with a physiological saline or the like, for example, about 80 to 120 times, It is preferably diluted about 100-fold, and then reacted with an appropriate amount of a human IgM solution and an anti-human IgM antibody-bound solid carrier or particulate carrier, and then (1) collected from HAV-infected cultured cells. The harvested HAV extract or (2) the HAV extract is immunologically reacted with at least a HAV antigen obtained by treating with a surfactant, for example, SDS, and the obtained reaction product is subjected to chemiluminescence. HAV characterized by immunologically reacting a labeled anti-HAV antibody, for example, an anti-HAV antibody labeled acridium, and reacting with a trigger reagent comprising a hydrogen peroxide solution and a sodium hydroxide solution, followed by detection. Methods for measuring antibodies may be provided.
ィン · ビトロの細胞培養法で得られたウィルス抗原を用いて、 試料中 の該抗原と免疫学的に反応性の抗体を測定する場合、 感染細胞を溶菌化 して得られた細胞ライゼ一卜から一旦分離された H A V抽出物を、 さら に界面活性剤で処理したものを、 H A V抗原試薬として用いると、 予想 外にも抗原活性に悪影響を与えること無く、 測定感度を大幅に上昇させ ることができる。 Using viral antigens obtained by the in vitro cell culture method, When measuring an antibody that is immunologically reactive with the antigen, the HAV extract once isolated from a cell lysate obtained by lysing infected cells is further treated with a detergent. When used as an HAV antigen reagent, the measurement sensitivity can be significantly increased without unexpectedly adversely affecting antigen activity.
本発明においては、 特異的 I g M抗体を測定する公知の免疫学的測定 法にそれを利用可能であり、 例えば、 ウィルス感染、 病原性微生物感染 などにより生ずる特異抗体測定系に応用できると考えられる。 ウィルス としては、 単純ヘルぺス、 帯状ヘルぺス、 水痘ウィルス、 ムンブス、 麻 疹、 風疹、 A I D Sウィルス (H I V) 、 B型肝炎ウィルス (H B V) 、 In the present invention, it can be used for a known immunological assay for measuring a specific IgM antibody, and is considered to be applicable to, for example, a specific antibody assay system caused by a virus infection, a pathogenic microorganism infection, or the like. Can be Viruses include herpes simplex, herpes zoster, varicella virus, mumbus, measles, rubella, AIDS virus (HIV), hepatitis B virus (HBV),
C型肝炎ウィルス (H C V) などが挙げられ、 病原性微生物などとして は、 ジフテリア菌 (Corynebacteium diphtheriae) 、 破傷風菌 (Clostr idium tetani) 、 コレラ菌 (Vibrio cholerae )、 ボツリヌス菌 (Clos iridium botul inum リ 、 ウエノレシュ菌 (Clostridium perfringens リ 、 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus ) 、 例えば、 MRSA、 赤痢菌 (Hepatitis C virus (HCV) and the like, and pathogenic microorganisms include diphtheria bacteria (Corynebacteium diphtheriae), tetanus bacteria (Clostr idium tetani), cholera bacteria (Vibrio cholerae), botulinum bacteria (Clos iridium botul inum, Uenoles bacteria (Clostridium perfringens li, Staphylococcus aureus), for example, MRSA, Shigella (
Shigel la dysenteriae) 、 百日咳菌 (Bordetel la perussis ジ ヽ チフス 菌 (Salmonel la typhi) 、 パラチフス A菌 (Salmonel la paratyphi) 、 腸炎菌 (Salmonel la enteri tidis) ヽ 結核菌 (Mycobacterium tubercul os is) などが挙げられる。 実施例 Shigel la dysenteriae), B. pertussis (Salmonel la typhi), Paratyphi A (Salmonel la paratyphi), S. enteritidis (Salmonel la enteri tidis), Mycobacterium tuberculos, etc. Example
次に実施例を示して、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はこ の具体例により限定されるものでなく、 その思想に従うかぎり各種の形 態で実施できることは理解されるべきである。  Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, it should be understood that the present invention is not limited to these specific examples and can be implemented in various forms as long as the idea is followed. It is.
実施例 1 I gMの調製 Example 1 Preparation of IgM
市販のヒト I g M溶液 (米国ケミコン 'ィンタ一ナショナル社製 〔C hemi con I n t e rna t i ona l, USA. 〕 ) を使用の 前に 0. 1 %アジ化ナトリウムを含有する 0. 021\のトリス (丁!" 1 s)緩衝液 (pH8. 5) 中に希釈し、 I gM試薬とした。 Commercially available human IgM solution (Chemicon, USA) prior to use in a 0.021 \ Tris buffer (pH 8.5) containing 0.1% sodium azide prior to use. Dilute to give IgM reagent.
抗ヒ ト ー I gM抗体被覆微粒子の調製  Preparation of anti-human IgM antibody coated microparticles
ャギから得られたヒト I gMの 鎖に対して特異性をもポリクローナ ル抗体( 米国ジャクソン 'ィムノ · リサーチ ·ラボ社製 〔J a c k s 0 n I mm u no Re s e a r ch Labo. , USA. 」 ) を力 ルポキシル化ポリスチレンラテックス微粒子( 米国セラダイン社製 〔S e r adyn, USA. ; 0. 2 urn) に以下に記載の方法で結合し た。 まず、 0. 015MのMES (2 - 〔N—モルホリノ〕 エタンスル ホン酸) 緩衝液 (PH 4. 7) 中の 1ーェチルー 3 - (3—ジメチルァ ミノプロピル) カルポジイミ ド (EDAC; 16mg/m 1 ) を用いて ポリクロ一ナル抗体抗ヒト I gM抗体 (16 Omg/ml) を室温で 1. 5時間かけて結合した。 次に 1%ツイ一ン (Twe en) 20及び 0. 9%NaC 1を含有する 0. 05 Mのリン酸緩衝液 (p H 7. 2 ) を用 いて洗浄した。 最終的には、 0. 05%ゼラチン、 0. 1%ツイ一ン 2 0、 0. 9%NaC l及び0. 1 %アジ化ナトリウムを含有する 0. 0 1Mのトリス (Tr i s)緩衝液 (pH7. 4) 中に貯蔵した。 被覆微 粒子の固形分の%が、 0. 0625 %になるように貯蔵バッファーで希 釈し、 抗ヒト 一 I gM抗体被覆微粒子試薬とした。  A polyclonal antibody (Jackson Immon Research Laboratories, USA), which has specificity for the human IgM chain obtained from goats (Jacks Immon Research Laboratories, USA.) ) Was bound to lipoxylated polystyrene latex fine particles (Ceradyne, USA; Seradyn, USA; 0.2 urn) by the method described below. First, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC; 16 mg / m 1) in 0.015 M MES (2- [N-morpholino] ethanesulfonate) buffer (PH4.7) was added. A polyclonal antibody anti-human IgM antibody (16 Omg / ml) was bound for 1.5 hours at room temperature. Next, washing was carried out using a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 1% Tween 20 and 0.9% NaCl. Ultimately, a 0.05 M Tris buffer containing 0.05% gelatin, 0.1% Tween 20, 0.9% NaCl and 0.1% sodium azide. (PH 7.4). The coated microparticles were diluted with a storage buffer such that the solid content% became 0.0625%, and used as an anti-human IgM antibody-coated microparticle reagent.
ァクリジニゥム標識抗 HAV抗体の調製 Preparation of acridinium-labeled anti-HAV antibody
3—ァラニンァクリジニゥム (lmg) を無水ジメチルホルムアミ ド (DMF) (100 z 1) 中に溶解し、 N—ヒドロキシスクシンィミ ド (NHS) (5. 75mg/m K 50〃 1)及び ED AC (9. 6 mg/mK 50 1 ) を連続して添加し、 暗所、 25 °Cで 48時間攪 拌することにより活性化した。 プロティン A精製モノクローナル抗 H A V抗体 (l mgZml) を含有している、 0. 9%NaC l及び 0. 5 %CHAP Sを含む 0. 1 Mのリン酸緩衝液 ( p H 8. 0) に活性化ァ クリジ二ゥムを加え (抗体の 4倍のモル数) 、 反応混合物を室温中で 1 0分間攪拌した。 緩衝液を 0. 1 %CHAPS、 0. 1 %アジ化ナトリ ゥム及び 0. 9 %Na C 1を含有する 0. 0 1 Mのリン酸緩衝液 (p H3-alanine acridinium (lmg) was dissolved in anhydrous dimethylformamide (DMF) (100 z 1) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (5.75 mg / m K 50 〃1) and EDAC (9.6 mg / mK501) were added successively, and the mixture was activated by stirring at 25 ° C for 48 hours in the dark. Protein A purified monoclonal anti-HA Activated vaccine in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.9% NaCl and 0.5% CHAPS containing V antibody (1 mgZml) Then, the reaction mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. Buffer solution was 0.1 M phosphate buffer containing 0.1% CHAPS, 0.1% sodium azide and 0.9% NaCl (pH
6. 3) に置き換えた後、 調整物を遠心分離にかけ、 上清を置換後のも のと同じ緩衝液で平衡化したバイオシル SEC 25 0 (米国バイオ ラド社製 〔B i o 1 a d, USA. 〕 の HP L Cカラム上のクロマトグ ラフィ一にかけた。 それぞれのフラクション (1 m l) を 3 6 9 nm及 び 280 nmでの紫外分光分析により分析し、 ァクリジニゥムの結合量 を^定した。 結合体を濃縮フラクション (約 1 00 / g/m l) 中、 約 4 °Cで貯蔵し、 使用前に 1 %カゼインナトリウム、 0. 1 %ツイーン 2 0、 0. 1 %アジ化ナトリウム、 5mM EDTA及び 0. 9%Na C 1を含有する 0. 05Mのリン酸緩衝液 (pH6. 3) で希釈し、 ァク リジニゥム標識抗 HAV抗体試薬とした。 6.3), the preparation was centrifuged, and the supernatant was equilibrated with the same buffer solution as the one after the replacement. Biosil SEC 250 (Bio-Rad, USA [Bio 1ad, USA. The fractions (1 ml) were analyzed by UV spectroscopy at 369 nm and 280 nm to determine the amount of acridinium bound. Store at about 4 ° C in concentrated fractions (about 100 / g / ml) and use 1% sodium caseinate, 0.1% tween 20, 0.1% sodium azide, 5 mM EDTA and 0.1% prior to use. The mixture was diluted with a 0.05 M phosphate buffer (pH 6.3) containing 9% NaCl to obtain an acridinium-labeled anti-HAV antibody reagent.
H A V抗原の調製  Preparation of HAV antigen
H A Vは栄養培地中のバース一ァレキサンダー細胞 (B a r t h— A l e x and e r C e 1 1 s ) を用いて培養した。 培養細胞に、 0. 5%トライ トン (Tr i t on) X— 1 00を含有しかつ 5mM ED TA及び 0. 9%Na C lを含む 0. 02 Mリン酸緩衝液 (p H 7. 2 HAV was cultured using Bars Alexander cells (Barth—Alex and erCe11s) in a nutrient medium. Cultured cells were treated with a 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.5% Triton X-100 and containing 5 mM EDTA and 0.9% NaCl.
) を混合し、 3 6°Cで 1 6〜68時間攪拌した後、 遠心分離にかけ、 上 清を捨てることにより、 HAV抽出物をホルムアルデヒド希釈倍率で 1 : 4000となるように添加した後、 36 °Cで 3日間攪拌して、 HAV の感染性を不活性化した。 不活性化した HAV抽出物は、 1 %牛血清ァ ルブミン、 0. 05%ツイ一ン 20、 0. 1 %アジ化ナトリウム、 5 m), Stirred at 36 ° C for 16-68 hours, centrifuged, discarded the supernatant, and added the HAV extract to a formaldehyde dilution ratio of 1: 4000. Stirring at 3 ° C for 3 days inactivated the infectivity of HAV. The inactivated HAV extract was 1% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20, 0.1% sodium azide, 5m
M EDTA及び 0. 9 %Na C 1を含有する 0. 0 1 Mのリン酸緩衝 液 (pH7. 2) で希釈し、 HAV抗原試薬とした。 HAV抗原試薬は 使用時まで 4てで貯蔵した。 0.1 M phosphate buffer containing M EDTA and 0.9% NaC1 The resulting solution was diluted with a solution (pH 7.2) to obtain an HAV antigen reagent. HAV antigen reagents were stored at 4 till use.
ッセつ  Secret
HAVAB- M陽性 °ネル試料を生理食塩水で希釈した。 希釈試料を I gM試薬 (3 0 1) を用いてさらに 5倍に希釈した。  The HAVAB-M positive channel sample was diluted with physiological saline. The diluted sample was further diluted 5-fold with IgM reagent (301).
比較として H A V A B— M陰性パネル試料を生理食塩水で希釈した後 に、 I gMを希釈する際に用いた緩衝液を用いてさらに 5倍に希釈した c 希釈した試料 (1 2 5 // 1) を容器に入れ、 これに抗ヒ卜//— I gM抗 体被覆微粒子試薬 (30 1) を添加し、 37でで 20分間反応させた c 反応した微粒子をガラス繊維フィルターで捕捉し、 0. 1Mのホウ酸緩 衝液 (pH 8. 5 ) ( 3 00 / 1) で 2回洗浄した。 次に HAV抗原試 薬 (3 0〃 1) をフィルタ一表面に添加し、 37°Cで 20分間フィルタ 一表面に捕捉されている微粒子と反応させた。 フィルターを 0. 1Mの ホウ酸緩衝液 (pH 8. 5) (1 00 1) で 1回、 そして同緩衝液 ( 30 0 ^ 1) で 1回洗浄した。 次にアタリジニゥム標識抗 HAV抗体試 薬 (3 0〃 1 ) をフィルタ一表面に添加し、 37°Cで 1 0分間フィルタ —表面に捕捉されている微粒子と反応させた。 フィルタ一を 0. 1Mの ホウ酸緩衝液 (pH 8. 5) (1 00 1) で 1回、 そして同緩衝液 ( 30 0 z 1 ) で 1回洗浄した。  For comparison, HAVAB-M negative panel sample was diluted with physiological saline, and then diluted 5-fold with the buffer used for diluting IgM. C Diluted sample (1 25 // 1) Was added to the container, and anti-human //-IgM antibody-coated fine particle reagent (301) was added thereto, and reacted at 37 for 20 minutes.c.The reacted fine particles were captured by a glass fiber filter. The plate was washed twice with a 1 M boric acid buffer solution (pH 8.5) (300/1). Next, an HAV antigen reagent (30〃1) was added to the surface of the filter, and allowed to react with the fine particles captured on the surface of the filter at 37 ° C for 20 minutes. The filters were washed once with 0.1 M borate buffer (pH 8.5) (1001) and once with the same buffer (300 ^ 1). Next, an ataridium-labeled anti-HAV antibody reagent (30 に 1) was added to one surface of the filter, and allowed to react with the fine particles trapped on the surface of the filter for 10 minutes at 37 ° C. The filter was washed once with 0.1 M borate buffer (pH 8.5) (1001) and once with the same buffer (300 z1).
このフィルタ一を化学発光読取り機に移し、 この中で 0. 25Nの N Transfer this filter to a chemiluminescence reader where 0.25N N
&011中の0. 4 %過酸化水素を含むトリガー溶液 (5 0 // 1) をフィ ルターに送り込んだ。 微粒子に結合したアタリジニゥムが発光し、 生じ た光の量を測定した。 低い HAVAB— M陽性 、°ネル試料の濃度では、 I gM試薬による希釈処理では 2 1 36の発光量 (光子カウント) で、 I gM試薬添加無しでは 1 3299の発光量 (光子カウント) であり、 中程度の HAVAB— M陽性パネル試料の濃度では、 I gM試薬による 希釈処理では 5010の発光量 (光子カウント) で、 I gM試薬添加無 しでは 16788の発光量 (光子カウント) であり、 高い HAVAB— M陽性パネル試料の濃度では、 I gM試薬による希釈処理では 1253 1の発光量 (光子カウント) で、 I gM試薬添加無しでは 18029の 発光量 (光子カウント) であった。 因みに下記実施例 2のように SDS 処理 H A V抗原を用いた場合 (I gM試薬添加) では、 低値パネルでは 4381、 中値パネルでは 1 1007、 及び高値パネルでは 1 1007 の発光量 (光子カウント) であった。 実施例 2 308処理11八¥抗原の調製 The trigger solution (50 // 1) containing 0.4% hydrogen peroxide in & 011 was sent to the filter. Ataridium bonded to the fine particles emitted light, and the amount of generated light was measured. At low HAVAB—M positive, ° N sample concentrations, the dilution with the IgM reagent gives an emission of 2136 (photon count) and 13299 without the addition of the IgM reagent (photon count), Moderate HAVAB—at concentrations of M-positive panel samples, The dilution yields 5010 luminescence (photon count) and 16788 luminescence (photon count) without the addition of IgM reagent. High HAVAB-M positive panel sample concentration is 1253 for dilution with IgM reagent. The luminescence of 1 (photon count) was 18029 without the addition of IgM reagent (photon count). By the way, when the SDS-treated HAV antigen was used as in Example 2 below (IgM reagent added), the luminescence (photon count) was 4381 for the low panel, 1107 for the medium panel, and 1007 for the high panel. Met. Example 2 Preparation of 308 treatment
H A Vは栄養培地中のバース—ァレキサンダー細胞 (Ba r t h— A l exande r Ce l l s) を用いて培養した。 培養細胞に、 0. 5%トライトン (Tr i t on) X— 100を含有しかつ 5 mM ED 丁 及び0. 9%NaC lを含む0. 02Mリン酸緩衝液 (pH7. 2 ) を混合し、 36°Cで 16〜68時間攪拌した後、 遠心分離にかけ、 上 清を捨てることにより、 H A V抽出物をホルムアルデヒド希釈倍率で 1 HAV was cultured using bar Alexander cells (Barth-AlexandeCells) in a nutrient medium. The cultured cells were mixed with a 0.02M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.5% Triton X-100 and containing 5 mM ED and 0.9% NaCl, After stirring at 36 ° C for 16-68 hours, centrifuge and discard the supernatant.
4000となるように添加した後、 36°Cで 3日間攪拌して、 HAVの 感染性を不活性化した。 不活性化した H A V抽出物に S D Sを添加し、 室温で 24時間攪拌して、 303処理11八¥抽出物を得た。 SDSは 1. 2 wt%までの各種濃度となるようにして添加した。 303処理1"1 抽出物は、 0. 1%のアジ化ナトリウム、 5mM £0丁八及び0. 9After adding to 4000, the mixture was stirred at 36 ° C for 3 days to inactivate HAV infectivity. SDS was added to the inactivated HAV extract, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to obtain a 303-treated extract. SDS was added at various concentrations up to 1.2 wt%. 303 treatment 1 "1 extract contains 0.1% sodium azide, 5mM £ 0 and 0.9
%NaC lを含む0. 01Mリン酸緩衝液 (pH7. 2) で希釈して、 SDS処理 H A V抗原試薬とした。 S D S処理 H A V抗原試薬は使用時 まで 4 °Cで貯蔵した。 アツセィ It was diluted with 0.01M phosphate buffer (pH 7.2) containing% NaCl to obtain an SDS-treated HAV antigen reagent. SDS-treated HAV antigen reagents were stored at 4 ° C until use. Atsushi
実施例 1と同様にして、 HAVAB— M陽性パネル試料を生理食塩水 で希釈した。 希釈試料を I gM試薬 (30〃 1) を用いてさらに 5倍に 希釈した。 比較として HAVAB— M陰性パネル試料を生理食塩水で希 釈した後に、 I gMを希釈する際に用いた緩衝液を用いてさらに 5倍に 希釈した。 希釈した試料 (1 25 / 1) を容器に入れ、 これに抗ヒト - I gM抗体被覆微粒子試薬 ( 30 / 1 ) を添加し、 37 °Cで 20分間 反応させた。 反応した微粒子をガラス繊維フィルタ一で捕捉し、 0. 1 Mのホウ酸緩衝液 (pH 8. 5 ) ( 300〃 1 ) で 2回洗浄した。 次に SDS処理 HAV抗原試薬 (30 /z 1 ) をフィルター表面に添加し、 3 In the same manner as in Example 1, the HAVAB-M positive panel sample was diluted with physiological saline. The diluted sample was further diluted 5-fold with IgM reagent (30〃1). As a comparison, the HAVAB-M negative panel sample was diluted with physiological saline, and further diluted 5-fold with the buffer used for diluting IgM. The diluted sample (125/1) was placed in a container, and an anti-human-IgM antibody-coated fine particle reagent (30/1) was added thereto, followed by reaction at 37 ° C for 20 minutes. The reacted microparticles were captured by a glass fiber filter and washed twice with 0.1 M borate buffer (pH 8.5) (300〃1). Next, SDS-treated HAV antigen reagent (30 / z 1) was added to the filter surface.
7 °Cで 20分間フィルタ一表面に捕捉されている微粒子と反応させた。 フィルターを 0. 1 Mのホウ酸緩衝液 (pH 8. 5) (100/z l) で 1回、 そして同緩衝液 (300 z 1)で 1回洗浄した。 次にァクリジニ ゥム標識抗 HAV抗体試薬 (30// 1) をフィルタ一表面に添加し、 3 7°Cで 10分間フィルタ一表面に捕捉されている微粒子と反応させた。 フィルターを 0. 1Mのホウ酸緩衝液 (pH8. 5) (100〃 1) で 1回、 そして同緩衝液 (300 /z 1) で 1回洗浄した。 このフィルター を化学発光読取り機に移し、 この中で 0. 25Nの NaOH中の 0. 4 %過酸化水素を含むトリガー溶液 (5 Ο z l) をフィルタ一に送り込ん だ。 微粒子に結合したアタリジニゥムが発光し、 生じた光の量を測定し た。 得られた結果を図 1に示す。 図 1中横軸は試料を生理食塩水で希釈 したとき (一回目の希釈) の試料の濃度で、 全く希釈していないものを 1とした。 図 1よりヒト I gM含有液で希釈することにより、 すぐれた 希釈直線性が得られることが判明した。 こうして、 血清中に I gMが多 量に存在し、 試料血清を多量の希釈液で希釈したとしても、 使用担体結 合抗体の量が I gM量に対して十分な量無い (例えば、 HAV感染者な どでは、 感染時には血中 I gM量が数倍から十数倍程度も増加してしま う) と、 該担体結合抗体は全 I gMのうち一部の血中 I gMとしか結合 できなくなり、 こうして担体結合抗体と結合できる抗 HAV— I gM抗 体 (以下、 単に 「HAV— M」 という。 ) の量は、 結局 HAV— M量 Z 血中総 I gM量に比例したものとなってしまうことがわかった。 つまり いくら試料を希釈してもあるいはいくら試料を濃縮しても担体に結合す る H A V— M量は常に一定となってしまい、 通常の希釈液による試料の 希釈では担体に結合する H A V— M量は少なくなるばかりであることが わかった。 一方、 試料をヒト I gM含有液で希釈すると担体結合抗体と 結合できる HAV— M量は、 11八 ー1\量/ (血中総 I gM量 +添加 I gM量) に比例したものとなり、 血中総 I gM量に関係なく添加 I gM 量に応じて担体結合抗体と結合できる H A V— M量を調節できる。 こう して試料中の I gM量に関係なく、 測定 HAV— M量を希釈直線性のあ るようにした測定系を組み立てることができる。 こうして定性的測定で よいなら、 I gMを添加しないで測定するとか、 定量化したい場合にはThe reaction was carried out at 7 ° C for 20 minutes with the fine particles captured on one surface of the filter. The filters were washed once with 0.1 M borate buffer (pH 8.5) (100 / zl) and once with the same buffer (300 z1). Next, an acridinium-labeled anti-HAV antibody reagent (30 // 1) was added to the surface of the filter, and allowed to react at 37 ° C for 10 minutes with the fine particles captured on the surface of the filter. The filters were washed once with 0.1 M borate buffer (pH 8.5) (100〃1) and once with the same buffer (300 / z 1). The filter was transferred to a chemiluminescence reader, in which a trigger solution (5 μl) containing 0.4% hydrogen peroxide in 0.25N NaOH was fed to the filter. Ataridium bonded to the microparticles emitted light, and the amount of generated light was measured. The results obtained are shown in FIG. The horizontal axis in Fig. 1 is the concentration of the sample when the sample was diluted with physiological saline (first dilution). From FIG. 1, it was found that excellent dilution linearity was obtained by dilution with a solution containing human IgM. In this way, IgM is present in large amounts in serum, and even if the sample serum is diluted with a large amount of diluent, the amount of carrier-conjugated antibody used is not sufficient relative to the amount of IgM (for example, HAV infection). Person In the case of infection, the amount of IgM in blood increases several times to about ten-fold during infection), and the carrier-bound antibody can only bind to a part of blood IgM of total IgM. Thus, the amount of anti-HAV-IgM antibody (hereinafter simply referred to as “HAV-M”) that can bind to the carrier-bound antibody is eventually proportional to the amount of HAV-M and the amount of total IgM in blood. I understand. In other words, no matter how much the sample is diluted or concentrated, the amount of HAV-M bound to the carrier is always constant, and the amount of HAV-M bound to the carrier when the sample is diluted with a normal diluent. Turned out to be less. On the other hand, when the sample is diluted with a solution containing human IgM, the amount of HAV-M that can bind to the carrier-bound antibody is proportional to 118.1 \ amount / (total blood IgM amount + added IgM amount). The amount of HAV-M that can bind to the carrier-bound antibody can be adjusted according to the amount of added IgM regardless of the amount of total IgM in blood. In this way, it is possible to assemble a measurement system in which the measured HAV-M amount has dilution linearity regardless of the IgM amount in the sample. If qualitative measurement is sufficient, do not add IgM, or if you want to quantify,
I gMを添加することにより測定 HAV— M量の希釈直線性、 及び HA V - M濃度による検出量の直線性を図り容易に達成できる。 発明の効果 By adding IgM, the linearity of the measured HAV-M amount and the linearity of the detected amount depending on the HAV-M concentration can be easily achieved. The invention's effect
被検試料を少なくとも I gMまたは I gM含有水溶液により希釈する ことで、 試料中の I gM抗体の測定において、 必要な測定範囲を得るこ とができ、 より優れた測定ができる。 さらに希釈液量の制限を回避し、 自動化された広範囲の測定系を組み立てることが可能となった。 より早 い時期 (急性期) で特異的な I gM、 例えば、 H A V関連抗体を検出し たり、 前希釈の希釈倍率を低減せしめてより広範囲の測定を可能にし、 例えば、 A型肝疾患などの診断 ·検出を確実に行なうことが可能になる。  By diluting the test sample with at least IgM or an aqueous solution containing IgM, a necessary measurement range can be obtained in the measurement of IgM antibodies in the sample, and more excellent measurement can be performed. Furthermore, it has become possible to assemble a wide range of automated measurement systems, avoiding restrictions on the amount of diluent. Detects specific IgM earlier in the phase (acute phase), such as HAV-related antibodies, or reduces the pre-dilution dilution to allow for a wider range of measurements, such as in cases of liver disease such as type A liver disease Diagnosis · Detection can be performed reliably.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1. 抗ヒト I gM抗体試薬を使用して、 被検試料中の対象抗原に対す る特異的 I gM抗体を免疫学的に測定する方法において、 被検試料を少 なくとも I gMまたは I gM含有水溶液により希釈することを特徴とす る特異的 I gM抗体の測定方法。 1. In a method of immunologically measuring a specific IgM antibody to a target antigen in a test sample using an anti-human IgM antibody reagent, the test sample is analyzed using at least IgM or IgM. A method for measuring a specific IgM antibody, characterized by dilution with an aqueous solution containing the antibody.
2. 特異的 I gM抗体が感染初期の I gM抗体である請求項 1記載の 特異的 I gM抗体の測定法。  2. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 1, wherein the specific IgM antibody is an IgM antibody at an early stage of infection.
3. 特異的 I gM抗体が感染初期の H A Vに対する I gM抗体又は H B eに対する I gM抗体である請求項 1又は 2記載の特異的 I gM抗体 の測定法。  3. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 1, wherein the specific IgM antibody is an IgM antibody against HAV or an IgM antibody against HBe in the early stage of infection.
4. 測定対象試料が、 全血、 血清、 または血漿である請求項 1〜3の 、ずれか一記載の特異的 I g M抗体の測定法。  4. The method for measuring a specific IgM antibody according to any one of claims 1 to 3, wherein the sample to be measured is whole blood, serum, or plasma.
5. ( 1 ) 測定対象試料を必要に応じ緩衝剤、 希釈液又は希釈剤の水 溶液で希釈し、 つぎに試料を少なくとも I gMまたは I gM含有水溶液 により希釈した後、 試料中の測定対象特異性 I gM抗体を、 抗ヒト I g 5. (1) Dilute the sample to be measured with a buffer, diluent, or an aqueous solution of the diluent as necessary, and then dilute the sample with at least IgM or an aqueous solution containing IgM. Anti-human IgM
M抗体結合固体担体と反応させて試料中の I gM抗体を固相抗ヒト I g M抗体と免疫学的に反応させ、 (2) (a)得られた反応生成物に特定 の抗原試薬を免疫学的に反応させ、 さらに抗原試薬に対する抗体を標識 剤で標識した標識抗体を免疫学的に反応させるか、 又は (b)得られた 反応生成物に特定の抗原試薬を標識剤で標識した標識抗原を免疫学的に 反応させることからなることを特徴とする請求項 1 ~ 4の 、ずれか一記 載の特異的 I gM抗体の測定法。 The IgM antibody in the sample is reacted immunologically with the solid-phase anti-human IgM antibody by reacting with the M antibody-bound solid carrier. (2) (a) A specific antigen reagent is added to the obtained reaction product. An immunological reaction is performed, and an antibody against the antigen reagent is labeled with a labeling agent.The labeled antibody is immunologically reacted, or (b) a specific antigen reagent is labeled with a labeling agent on the obtained reaction product. The method for measuring a specific IgM antibody according to any one of claims 1 to 4, wherein the method comprises immunologically reacting a labeled antigen.
6. 標識抗体が、 ァクリジニゥム標識抗 HAV抗体又はァクリジニゥ ム標識抗 H B c抗体である請求項 5記載の特異的 I g M抗体の測定法。 6. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 5, wherein the labeled antibody is an acridinium-labeled anti-HAV antibody or an acridinium-labeled anti-HBc antibody.
7. 対象抗原が、 HAV抗原又は HB c抗原である請求項 1〜6のい ずれか一記載の特異的 I gM抗体の測定法。 7. The method for measuring a specific IgM antibody according to any one of claims 1 to 6, wherein the target antigen is a HAV antigen or an HBc antigen.
8. H A V抗原試薬が、 イン · ビトロの細胞培養法で得られた H A V 抗原を界面活性剤で処理したものである請求項 1〜 7のいずれか一記載 の特異的 I gM抗体の測定法。  8. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 1, wherein the HAV antigen reagent is obtained by treating a HAV antigen obtained by an in vitro cell culture method with a surfactant.
9. 界面活性剤が、 ァニオン性界面活性剤である請求項 8記載の特異 的 I gM抗体の測定法。  9. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 8, wherein the surfactant is an anionic surfactant.
10. ァニオン性界面活性剤が、 ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 又はドデシル硫酸リチウム (LDS) である請求項 9記載の特異的 I g M抗体の測定法。  10. The method for measuring a specific IgM antibody according to claim 9, wherein the anionic surfactant is sodium dodecyl sulfate (SDS) or lithium dodecyl sulfate (LDS).
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