WO1995032289A1 - Transformant line of candida utilis yeast and expression of heterogene therewith - Google Patents

Transformant line of candida utilis yeast and expression of heterogene therewith Download PDF

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WO1995032289A1
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Keiji Kondo
Susumu Kajiwara
Norihiko Misawa
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a reproducible transformation system for Candida utilis, and more specifically to a recombinant DN
  • A relates to the transformation of yeast Candida utilis by A and the expression of the heterologous gene in the resulting novel transformant.
  • the present invention provides a promoter, and a promoter for the expression of a heterologous gene having a novel DNA sequence which can be used as a selection force gene in transformation. It also relates to a novel DNA sequence that can be used as a minor.
  • the present invention also relates to a method for efficiently integrating a heterologous gene into a yeast chromosome.
  • the present invention relates to a DNA fragment, which has an autonomous replication function in a Candida utilis, and has a function to increase the transformation efficiency, and It also relates to a method for integrating a DNA fragment that does not contain a selection marker gene into a chromosome, and a method for obtaining a DNA sequence having promoter activity using the same.
  • yeast of the genus Saccharomyces belonging to the genus Saccharomyces has long been used for the production of fermentable foods such as alcoholic beverages. Since Tilis yeast is produced for feed, it is known that these yeasts are highly safe. In addition, yeast can generally be cultured at a higher cell density than bacteria, and continuous culture is also possible. Yeast also secretes proteins into the medium, and the secreted proteins are modified by sugar chains.
  • yeasts of the genus Saccharomyces that have been best studied and accumulated diagnosed knowledge to date are the yeasts belonging to the genus Saccharomyces. It is being studied as a host for the production of various substances.
  • yeasts other than Saccharomyces spp. Include yeasts of the genus Pichia, Hansenula, Cryveromyces, and Cande. Methods have been developed for transforming species such as yeast of the genus Ida, which have been studied as hosts for the production of useful substances.
  • the yeasts belonging to the genus Cyandaida have characteristics that are not practically the same as those of the yeast belonging to the genus Saccharus, such as a wide carbon assimilation zone, and are practically advantageous. Therefore, the use of yeast of the genus Candida is expected for the production of useful substances from recombinant DNA.
  • Candida utilis (C andidauti 1 is) is one of the most important yeasts against pentoses including xylose. Demonstrates excellent assimilation. Also, unlike Saccharomyces yeast, it does not produce ethanol when cultured under aerobic conditions and is not susceptible to growth inhibition due to it. Therefore, efficient cell production by continuous culture at high density is possible. Therefore, industrial production of cells using sugar sulphate pulp waste liquid, a saccharified liquor from broadleaf trees, which has received much attention as a protein source and contains a large amount of paint, has been implemented. There have been times. In addition, this yeast was prepared by the American FDA (Food dand Drug).
  • Candida dutilis is a fermented strain of pentoxylose, an ethyl acetate. It has been widely used in industry as a producer of acetate, glutamin, glutathione, invertase, etc.
  • Candida dutilis has a high ploidy and does not sporulate, so its transgene properties are still well defined. Absent. Therefore, the transformation conditions and the conditions to be satisfied by the vector system are unknown, and it is extremely difficult to establish the host / vector system. It is expected that .
  • the present inventors have recently succeeded in obtaining a transformant with good reproducibility from a Candida utilis yeast, and have obtained a heterologous transfection in the transformant.
  • Various findings were obtained on the expression of genes.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a method in which a gene and a plasmid, which can be used in a Candida utilis transformation system and serve as a selection marker, are integrated into a chromosome.
  • the purpose is to provide a novel DNA sequence, such as a target sequence, a promoter required for expression of a heterologous gene, a terminator, etc.
  • Another object of the present invention is to provide a vector system that enables expression of a heterologous gene in a Candida utilis.
  • Another object of the present invention is to provide a method for expressing a heterologous gene in Candida utilis.
  • the present invention provides a DNA fragment having an autonomous replication function in a candidate utility and having a function of increasing transformation efficiency, and a DNA fragment containing the same.
  • Lasmid Vector its A method for integrating a DNA fragment that does not contain a selection marker gene into a chromosome, and a method for obtaining a DNA sequence having a promoter activity, It is an object of the present invention to provide a novel DNA sequence having the obtained promoter activity.
  • the novel DNA sequences according to the present invention include genes encoding the ribosome-constituting protein L41 of Candida utilis, as well as genes and the like.
  • Promoter and terminator sequence of the plasma membrane protein ATPase (PMA) gene promoter and terminator sequence A URA3 gene, and its promoter and terminator sequences; two types of DNA fragments capable of autonomous replication; Sequence of a DNA fragment having a motor activity; and an rRNA gene encoding ribosome RNA of Candida utilis. is there .
  • the vector which can be used in the Candida utilis transformation system according to the present invention has a sequence homologous to the chromosomal DNA of the Candida utilis. And a selectable marker gene, whereby the heterologous gene can be integrated into the chromosomal DNA of the Candida utilis by homologous recombination. Or a DNA sequence with autonomous replication in a candidutilis, and a selectable marker gene, which is expensive. It is one that can transform candidurises with frequency.
  • vectors that can be used in the Candida utilis transformation system according to the present invention do not include a selection marker gene, and do not include a selection marker gene. It contains a sequence homologous to the chromosomal DNA of Dieda utilis, and allows homologous recombination to transfer the heterologous gene to the stranded DNA. It is one that can be integrated into chromosomal DNA. This plasmid is used for transformation simultaneously with the plasmid containing the autonomously replicating DNA sequence and the selection marker gene. be able to .
  • Drug-resistant markers preferably cycloheximide-resistant L41 genes, genes that confer G4 1..8 resistance, or It is a gene that confers igloomycin B resistance.
  • the method for expressing a heterologous gene in a Candida utilis comprises the steps of: And transforming the resulting transformant, culturing the resulting transformant, and isolating and purifying the expression product of the heterologous gene from the culture. Also It is
  • the transformation system of Candida utilis according to the present invention is a function such as a novel DNA group or a vector system according to the present invention. This is what is obtained by a combination.
  • FIG. 1 shows the restriction map of the plasmid containing the phosphoglycerate kinase (PGK) gene, the strategy for DNA sequencing and the strategy for DNA sequencing.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for obtaining fragments of a promoter and a terminator by PCR.
  • FIG. 2 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing the PKG gene terminator.
  • FIG. 3 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PKK gene promoter.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the construction of an expression vector plasmid using the PKK gene promoter and terminator overnight.
  • FIG. 5 is a restriction map of plasmid containing ribosomal DNA.
  • Figure 6 shows the structure of ribosome DNA, the strategy of DNA sequencing, and the structure of subcloned brassmids.
  • Figure 6 (a) shows the plasmids p CRE l, p CRE 2, p CRE 3, p CRX l, p CRX 2, p CRX 3, and p CRX 4
  • Fig. 6 (b) shows the restriction of the DNA fragment of about 13.5 kb including the ribosome DNA of Candida utilis. It is an enzyme map.
  • Figure 7 shows a restriction map of plasmids containing the URA3 gene and the Saccharomyces cerevisiae ura3 mutation of those plasmids. It is a diagram showing the complementarity.
  • FIG. 8 shows a strategy for determining the DNA base sequence of the URA3 gene and a restriction map.
  • FIG. 9 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a URA3 gene.
  • Figure 10 is a diagram showing the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the URA3 gene and the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence.
  • Figure 11 shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the URA3 gene, and the nucleotide sequence of the DNA encoding it. The sequence following Figure 10 is shown. This is shown in the figure.
  • FIG. 12 is a diagram showing a restriction map of a plasmid containing the L41 gene and a strategy for determining DNA sequencing ⁇ 3.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the L41 gene.
  • FIG. 14 is a diagram showing the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the L41 gene and the nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence.
  • FIG. 15 is an explanatory diagram of the construction of the plasmids pCLBS10 and pCLBS12.
  • FIG. 16 is a diagram showing the construction of the brassmids pCLRE2, pCLRE3, pCLRX1, and pCLRX2.
  • Figure 17 shows the results obtained by examining the viability of ATCC 9950 and the number of transformants under various electric pulse conditions.
  • Fig. 18 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA of ATCC 9950 strain transformed with the plasmid PCLRE2. is there .
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of blotting analysis.
  • Figure 20 shows the construction of the plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7.
  • FIG. 21 shows a sample of the DNA of the ATCC 9950 strain transformed with the plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the result of the rotation analysis.
  • Figure 22 shows the Southern blot of the DNA of ATCC 9950 strain transformed with the plasmid pCLURAl. It is an electrophoresis diagram showing the result of ring analysis.
  • FIG. 23 is an explanatory diagram of the construction of the plasmid pCLSTAl and pCLSRSTA1.
  • Figure 24 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the culture supernatant of the ATCC 9950 strain transformed with the plasmid pCLRSTAl.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results.
  • FIG. 25 is an illustration of the construction of the plasmid pCLLACl and pCLLRAC1.
  • FIG. 26 is an explanatory diagram of the construction of the plasmid pCLAPHI and pCLRAPH1.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA of the ATCC 9950 strain transformant using the midp CLRAPHl.
  • FIG. 28 is a diagram showing the structures of the plasmids pCRE8, pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5, and pCRAPH6.
  • FIG. 29 shows a map of the restriction enzyme of plasmid containing the glyceroazole dehydrogenase-13-phosphonate dehydrogenase (GAP) gene and DNA sequencing.
  • FIG. 4 is a diagram showing a strategy and a method for obtaining a fragment of a promoter and a terminator by PCR by PCR.
  • FIG. 30 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing the GAP gene promoter.
  • FIG. 31 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the GAP gene terminator.
  • FIG. 32 is an explanatory diagram of construction of an expression vector plasmid using a GAP gene promoter and a terminator.
  • FIG. 33 shows the restriction map of the plasmid containing the plasma membrane proton ATPase (PMA) gene, the strategy for determining the DNA base sequence, and the results of PCR.
  • FIG. 3 is a diagram showing a method for obtaining fragments of a promoter 1 and a terminator 1.
  • FIG. 34 is a diagram showing a nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PMA gene promoter.
  • FIG. 35 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PMA gene terminator.
  • FIG. 36 is a diagram for explaining the construction of an expression vector plasmid using a PMA gene promoter and a terminator.
  • FIG. 37 shows the structure of the cloning vector pGKAPH2 of the DNA fragment containing ARS.
  • FIG. 38 is a diagram showing a restriction map of the inserted DNA fragments of six plasmids containing ARS.
  • FIG. 39 shows the insertion of four types of plasmids, which are subcloned into the plasmid PCARS6 and the inserted DNA fragment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of a DNA fragment.
  • Figure 40 shows a restriction map of the plasmid p CARS 7 and the DNA fragments of the five plasmids into which the inserted DNA fragment was subcloned. It is a figure.
  • FIG. 41 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of plasmid pCARS6-2.
  • FIG. 42 is a diagram showing the base sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid pCARS6-2, which is a sequence following FIG. 41.
  • FIG. 43 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of plasmid pCARS7-6.
  • FIG. 44 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid pCARS7-6, and shows the sequence following FIG.
  • Figure 45 shows the DNA (1) or plasmid p of ATCC 9950 strain transformed with plasmid p CARS 6 or p CARS 7.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA (2) of ATCC 9950 strain transformed by CLAC1.
  • FIG. 46 shows the DNA of the ATCC 9950, ATCC 9226, ATCC 9256, KP-205P, and S288C DNA.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of Southern plotting analysis using 1 (1) and CUARS 2 ⁇ (2) and (3) ⁇ as probes.
  • FIG. 47 is an explanatory diagram of the construction of the promoter cloning vector pPCV2.
  • FIG. 48 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment showing the promoter activity of plasmid pPCRV19.
  • Figure 49 is an illustration of the construction of the plasmid pGKHPTl.
  • FIG. 50 is an electrophoretogram showing the results of PCR analysis of the ATCC 9950 strain DNA transformed by the co-transformation method.
  • Candida utilis Specific strains of Candida utilis to which the transformation system according to the present invention is applied include, for example, ATCC 9256 (IF0626), ATCC 9 2 2 6 (IF 0 1 0 8 6). ATCC 9 9 5 0 (IF 0 0 9 8 8) IF 0 3 9 6, IFO 0 6 1 9, IFO 0 6 3 9, KP — 2 0 59 P shares etc. are listed.
  • Candida utilis differs in its chromosomal pattern depending on the strain, and may show chromosomal length polymorphism. Reported (St Q 1 tenburge a 1.Cur r.
  • a selection marker gene for selecting a transformant and a method for selecting a transformant in order to develop a transformation system for an organism, (a) a selection marker gene for selecting a transformant and a method for selecting a transformant, and (b) a method for selecting a transformant.
  • Plasmid A DNA sequence that has the autonomous replication ability required for DNA to exist as an extranuclear gene in the host cell, or the plasmid can be efficiently used.
  • An appropriate chromosomal DNA homologous sequence required for specific integration into the chromosome ie, establishment of a target for integration of the plasmid DNA
  • C a processing method for bringing the host cell into a state in which extracellular DNA can be taken up, and the transformant is prepared by combining these three elements. Can be obtained. Therefore, in establishing a transformation system for Candida dutilis, for which little biographical information is available, It was essential to consider and develop all of these elements.
  • the selectable marker gene for selecting transformants became auxotrophic due to the mutation treatment. Used by host strain If possible, a gene that complements its auxotrophy can be used as a selective gene. In this case, it is possible to directly select a transformant on a minimal medium in which the nutrient has been removed from -III3. However, in the case of Candida utilis, it is particularly important to obtain mutants to which a selection code such as an appropriate trait has been added as described above. It was difficult, and it was not possible to develop a transformation system using auxotrophic it fc: offspring as a selection marker.
  • the inventors have found that dried dandritis is susceptible to antibiotics G418-Hygromycin B, cycloheximide, etc. Thus, it was found that the growth of bacteria can be suppressed by adding these agents to the medium. Therefore, we attempted to use genes that confer resistance to these drugs as transformant selection markers.
  • the G418 resistance gene Amino glycoside protein transfection gene
  • the high chromosome resistance gene Use genes from other organisms, such as genes from the chromosome (phosphotransferase gene).
  • Candida yeasts such as Candida albicans
  • some codons are translated in other ways. It has also been reported that it is different from organisms (Ohama et. A. Nucleic Acids Res. 21 039-4040519), and the heterologous gene is selected as the marker gene.
  • the heterologous gene is selected as the marker gene.
  • the present inventors obtained a gene for L41 protein of Candida utilis which is sensitive to cycloheximide, and obtained that gene.
  • this gene since this gene is derived from the host, the promoter and terminator sequence of the expression are based on the sequence of the gene itself. I decided to keep it. Therefore, this embodiment is extremely advantageous in that reliable expression of the gene can be expected.
  • a drug resistance gene marker as a selection marker used in the transformation system of a Candida utilis according to the present invention.
  • the nucleotide sequence of the L41 gene and the DNA fragment containing the promoter and terminator sequences are shown in FIG. 13 (SEQ ID NO: 5).
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence Is as shown in FIG. 14 SEQ ID NO: 6
  • the 164th nucleotide C in the sequence shown in Fig. 13 is converted to A.
  • Pr0 is replaced by G1n.
  • an 11 # agent for the antibiotic G418 is one of the preferred agents.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ Amino grease to be given, and phospho-ferrase (APT) gene can also be used.
  • the transposons Tn903 and the transposons Tn5 are derived from the gene transfer genes. The two types are known, and any of these genes can be used in the present invention.
  • a large source of neuroglomerin B phosphotransferase gene that confers resistance to the antibiotic hygromycin B. It can also be used in the transformation system according to the present invention. Is this G4 18 resistant?
  • heterologous gene such as a gene or a Higuchi-mouth Mycin B-resistant gene
  • it functions in the candidutilis for gene expression. It is preferred to incorporate the transcriptional motor and terminator sequences 5 'upstream and 3' downstream of the heterologous gene, respectively.
  • the promoter and terminator sequences for this transcript are derived from the gene of Cyanida utilis.
  • the candidacy described later A sequence of promoters and terminators of Tyrith's hos-ho-de-selenic acid kinase (PGK) gene; DO3—Promoter and terminator sequence of phosphate dehydrogenase (GAP) gene; and plasma membrane protein ATP
  • PGK Tyrith's hos-ho-de-selenic acid kinase
  • GAP phosphate dehydrogenase
  • PMA phosphate dehydrogenase
  • a DNA sequence having promoter activity obtained by a promoter cloning vector described later can also be used. .
  • promoters and terminator sequences examples include those known in Saccharomyces yeast. Promoters and terminator sequences for homologous genes in the candidutilis of genes such as ADH, ENO, GAL, and SUC What can I list?
  • the G418 resistance gene and high-level gene described above can be used.
  • the chloramphenicoretransferase gene Ro dfie 2col resistance
  • Blast Sine Dinmina Blast sine resistance
  • Resistance gene Woolz e TJ et. a 1. Antibiotic resistant genes such as Yeast, 8, 667-668 (1992)).
  • the dehydrofolate reductase gene (metrexate resistance) (Miyajima, A. et. A 1. Mo 1. Cell) B io l. 4, 407-414 (1984)), and the yeast dominant gene, Sulphonullomethinol iT, (i.e., Casey, GP et. A 1. J. Inst. Brew). 94, 93-97 (1988)), the CUPl gene (imprisonment tolerance) (Hende Mon on RCA et. A 1. Current Gene t. 9, 133-138 (1985)) CYH2 gene
  • Known drug-resistant genes such as heximide resistance (Del gado, M. eta 1.
  • the marker gene is derived from a heterologous organism such as a bacterium or a transposon gene
  • the above-mentioned candidacy * It is preferable to use a promoter and an array of terminators that function within the network.
  • the ribosome RNA is coded as an appropriate chromosomal DNA fragment required for integrating the plasmid into a chromosome.
  • Gene rRNA Gene rDNA It has been found that the URA3 gene, the L41 gene, and the PGK gene can be favorably used.
  • rRNA genes in Saccharomyces cerevisiae, rDNA is present on the chromosome in more than 100 copies in tandem, and the repetition is repeated. It has been reported that an autonomously replicating sequence (ARS) is present in the unit (SaHerk Miller, JR. Mole c. Cell. Biol. 6, 1148-1157, (1986)) o By using this rDNA region as a target for integration of plasmid, the frequency of transformation for integration can be increased. This has been reported (Lo pes, et. A 1. Gene 79, 199-206 (1989)) o
  • ARS autonomously replicating sequence
  • the present inventors have found that rDNA also exists repeatedly on a chromosome even in a candidate utility, and as a result, Like Karomaisses cerevisiae, the RDNA sequence of Candida utilis is a target sequence for high frequency integration. It is suggested that this can be used as a recombinant target in a Candida utilis transformation system. I was able to do it.
  • the presence of the DNA fragment integrated into the transformant was analyzed in detail, and as a result, the DNA fragment was transferred to the Candida utilis chromosome. It has been clarified that the integration of the gene occurs mainly by homologous recombination. If this is a DNA molecule that contains a DNA sequence that has a homology to the host chromosomal target sequence, it can be incorporated into any chromosomal target. Means that and are possible.
  • a DNA sequence having a homology to the target sequence is decomposed with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence to make it linear.
  • the ability to incorporate a DNA fragment into the target sequence of the Candida utilis chromosome You can.
  • the selected marker a cycloheximide-resistant L41 gene
  • multiple plasmid molecules can be simultaneously used as described later. The transformed transformant is efficiently selected.
  • chromosome target sequence there is a homology for the chromosome target sequence. It is also possible to use a linear DNA fragment containing a selection marker gene within the DNA sequence to be used.
  • the plasmid is inserted so as to replace a homologous gene on a chromosome.
  • no repetitive sequence of the target sequence is formed before and after the inserted DNA fragment, and thus higher stability of the integrated DNA is expected. .
  • the URA3 gene, the L41 gene, the PGK gene, etc. are genes with only two copies per cell.
  • the DNA fragment can be used as a target for incorporation of a DNA fragment.
  • the number of yeast rRNA genes is 100 haploids per repetitive DNA unit containing the 18S, 5.8S, 25S, and 5S rRNA genes. More than a copy exists (Schweizer, E. et. A. J. Mo. Biol. 40, 261-277 (1969)). Therefore, when this rDNA is used as a target sequence for recombination, (1) the frequency of transformation is increased as compared to the case where other gene sequences are used.
  • the change of the target sequence due to the integration can be ignored, and so on.
  • the present inventors also concluded that the rRNA gene in a candidate lysate tandemly repeats a DNA sequence of about 13.5 kb as a repeat unit.
  • the presence of the rDNA sequence and the target for recombination (described later in detail)
  • the transformation frequency is about 10 to 50 times higher than when the L41 gene, which is present in two copies per cell, is targeted. Clarified what will happen.
  • the stability of the DNA fragment integrated into the rDNA locus was high, revealing that the rDNA sequence was an excellent integration target.
  • the use of the rDNA sequence as the target sequence for DNA fragment integration has the effect of increasing the frequency of transformation as described above, and the yeast It played an important role in examining the treatment conditions for E. coli and finding suitable transformation conditions therefrom.
  • the frequency of transformation is significantly reduced when used as a target for transformation. It has been clarified, suggesting that any rDNA fragment may not be an efficient target for incorporation of Brasmid. It was done.
  • the use of cycloheximid or do-resistant L41 gene as a selection marker makes the plasmid more plasmid-free.
  • a transformant in which a plurality of cells have been incorporated can be efficiently obtained.
  • the reason is considered as follows. That is, only when multiple DNA fragments containing the cycloheximide resistant L41 gene are incorporated into multiple copies, is the endogenous cycloheximide sensitivity sensitive. Type L41 protein is replaced with a resistant type, and the function is inhibited by cycloheximide. The proportion of ribosome molecules that do not receive liposomes increases.
  • the target site for integration may be a DNA sequence derived from a chromosome of a Candida utililis such as the URA3 locus or the L41 gene locus. Basically, any array can be used. It is also interesting to note that the targeted loci are specifically targeted at the rRNA locus as its integrated target sequence. It was shown that the DNA fragment had a tendency to be incorporated in a larger amount as compared to the case of using the DNA sequence.
  • the transformation method that is, the treatment method for bringing the host cell into a state capable of taking up extracellular DNA includes a protoplast method, a lithium acetate method, and an electric pulse method. It is conceivable to use methods conventionally used for transformation of Saccharomyces cerevisiae, such as the Saccharomyces cerevisiae and their modifications. Although the protoplast method is a widely used transformation method, the operation is rather complicated, and it is difficult to select a transformant due to drug resistance. The emergence of the non-transformed back ground colony is often problematic.
  • the present inventors used the lithium drunkate method and the electric pulse method to obtain the cycloheximide resistance L41 gene and rDNA described above. Attempt to transform a candida * utilis using a plasmid that combines the fragments. We have found the conditions under which transformants can be obtained with good reproducibility.
  • Transformation of Candida utilis is preferably by the electropulse method. After the cells are grown to logarithmic growth phase, wash and resuspend in 1 M Sorbitol.
  • the condition of the electric pulse is that the time constant value (time until the voltage attenuates to about 37% of the maximum value) is about 10 to 20 milliseconds. It is only necessary that the conditions be such that the viable cell rate after pulse is about 10 to 40%.
  • the capacitance is 25 F and the resistance is 600 to
  • a YPD medium containing 1 M sodium sorbitol it is preferable to add to the bacterial solution after adding an electric pulse, and culturing with shaking at 30 ° C. It was found that colonies could not be obtained when bacteria were directly applied to a selection plate containing cycloheximide. The appropriate culture time is about 4 to 6 hours, after which the growth of the transformant becomes insignificant.
  • carrier DNA such as summon spam DNA may be added, and polyethylene glycol may be added. It is also possible to increase the frequency of transformation by adding It is also good to have a system.
  • an expression vector system used for transformation of Candida utilis.
  • One embodiment of the vector according to the present invention is a sequence homologous to a Candida utilis chromosomal DNA (hereinafter, sometimes referred to as a “homologous DNA sequence”). And homologous recombination in this part will allow the integration of plasmid DNA into the chromosome and the selection of transformants It is a plasmid DNA containing the selected marker gene.
  • the homologous DNA sequence preferably includes rRNA gene, URA3 gene, L41 gene, PGK gene, GAP gene, PMA gene and the like.
  • it is derived from the chromosomal DNA of the Candida utilis. It is possible to integrate a heterologous gene at any position on the chromosome depending on the sequence used. This plasmid is generated by digestion with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence within the plasmid molecule.
  • DNA is used as a linear chain.
  • the plasmid DNA fragment is integrated by homologous recombination into the Candida ducilis chromosome.
  • the plasmid DNA contains a marker gene and a heterologous gene.
  • the DNA sequence is flanked at both ends by the homologous DNA sequence.
  • the plasmid DNA is cleaved with a homologous DNA sequence by a restriction enzyme, and a marker gene and a marker gene having the homologous DNA sequence at both ends thereof.
  • the DNA fragment obtained in this way can also be incorporated by homologous recombination into Candida duculis chromosomal DNA by homologous recombination. It is.
  • a DNA fragment is integrated by homologous recombination into a Candida ducilis chromosome.
  • the mode of integration is not limited, but at least It is used for meanings that include these two forms. That is, (1) the DNA sequence of the Candida duduris chromosome and the homologous DNA sequence portions at both ends of the DNA fragment generate homologous recombination, and the cleaved portion is generated.
  • the DNA fragment is inserted into the chromosomal DNA by "insertion” into the chromosomal DNA, and (2) the DNA sequence of the Candida * duris chromosome, and the DNA sequence at both ends of the DNA fragment.
  • the plasmid DNA fragment is "replaced” with a portion of the Candida dudis chromosome into chromosomal DNA. Any of the incorporated aspects shall mean at least as little as possible.
  • the target DNA sequence was inserted before and after the inserted DNA fragment because no repetitive sequence of the target sequence was formed before and after the inserted DNA fragment.
  • a more preferred drug-resistant marker is a gene that confers cycloheximide resistance, for example, a cycloheximide-resistant L41 gene.
  • a gene that confers resistance to the antibiotic G418, for example, the APT gene from Bacteria transposon Tn903; an antibiotics, Hygromycin If the selected marker gene is of microbial origin, such as a B-resistant gene, the key is used to ensure their expression. It is preferable to link to a promoter that works with the standard.
  • the vector according to another embodiment of the present invention includes a sequence homologous to a Candida dystilis chromosomal DNA (a homologous DNA sequence).
  • a homologous DNA sequence By causing homologous recombination in the part, it is possible to integrate the plasmid DNA into the chromosome.
  • This is a plasmid DNA that does not have a marker gene.
  • This plasmid is used as a straight chain by digestion with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence in the plasmid molecule.
  • the plasmid DNA also includes a DNA sequence containing a heterologous gene sandwiched between the homologous DNA sequences at both ends. Configuration You may be happy. Then, this plasmid DNA is cleaved with a homologous DNA sequence by a restriction enzyme to obtain a DNA fragment having a homologous DNA sequence at both ends. The DNA fragment obtained in this way can also be integrated into the chromosomal DNA of the candidate durilis by homologous recombination. It is.
  • linearized DNA fragments can be used in the same manner as in the case of the plasmid DNA containing the above-mentioned selection gene, as described above. It is integrated by homologous recombination into the Diris chromosome. Even in the plasmid of the present embodiment, the integration according to the above-mentioned embodiment (2) ensures that the integrated DNA fragment is stably present on the chromosome. Be expected .
  • B and the homologous DNA sequence preferably include rRNA gene, URA3 gene, L41 gene, PGK gene, GAP gene, PMA gene and the like. They are preferably derived from the Candida utilis chromosome DNA. It is also possible to incorporate a foreign DNA fragment at any position on the chromosome, depending on the sequence used.
  • This vector is used for transformation simultaneously with a plasmid having a DNA sequence containing an autonomously replicating sequence described below and a selection marker gene. That is, the transformation selected by the introduction of a plasmid capable of autonomous replication. From the body, it is possible to secondarily select a strain in which a DNA fragment that does not have a selection marker gene has been integrated on the chromosome. The plasmid present in the isolated strain can then be eliminated by culturing the bacteria under non-selective conditions, and ⁇ ⁇ It is possible to obtain a strain that retains only the inserted DNA fragment on the chromosome. By using this technique, a strain can be bred that retains only the heterologous gene and does not contain extra sequences, such as a drug-resistant gene derived from a microorganism. This will be possible.
  • Brasmid itself which has a DNA sequence containing this autonomously replicating sequence and a selection marker gene, is also known as a Candidate utility. It can be used as a vector for yeast transformation. This plasmid has a characteristic that it is easily removed by culturing the bacteria under non-selective conditions, but a DNA fragment that enhances stability is obtained as described below. Then, it can be used as a vector in combination with this DNA fragment.
  • a heterologous gene refers to a gene or a portion of a gene that is not normally present on the chromosome of the host candidutilis. .
  • the heterologous gene is preferably combined with a regulatory region that independently regulates the expression of the heterologous gene, or the gene that has been disrupted during the transformation.
  • the heterologous gene is expressed under the influence of the regulatory region of the body.
  • Such an array must function in a Canadian utility, and a preferred example thereof is a PGK ⁇ according to the present invention, described below.
  • Promoter and terminator sequences for the gene, GAP gene, and PMA gene, as well as the promotor sharing described below A DNA sequence that has promotor activity and is obtained by a vector.
  • the present invention provides that the promoter sequence of the e.g. The darco-amylase gene, aminoglycosylphosphos-transferase gene, and yS—galactosidase gene were used for the whole sequence.
  • Heterologous genes such as the chromosome gene and the high chromosomal B-phosphotranslation luciferase gene, have been successfully expressed.
  • Promoter of the 3D-U-hydroxyphosphate dehydrogenase gene And the sequence of the terminator, and the sequence of the promoter and terminator of the plasma membrane protein ATPase gene.
  • glucoamylase is a secreted protein
  • aminoglycosidase phosphotransferase ⁇ ⁇ -Galactosidase is an intracellular enzyme.
  • Candida utilis strains that express the gene for glucose coamylases have more available carbon due to the conferment of source assimilation. It is said that the source space has been expanded.
  • the vector according to the present invention can be used for transformation of cells other than Candida utilis.
  • a cell other than the Candida utilis is used as a host, it is preferable to select an appropriate DNA fragment when performing the transformation.
  • DNA fragments include, for example, bacterial plasmid DNA such as pBLuesefipt or pUC19 in the case of E. coli.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces for example, YEp13,
  • Yeasts such as YC p50 (Methodsin Enzymo 1 ogy, 19, p195-230, Academic Press (1991)) and other Escherichia coli shuttle vectors are listed. It is. Cloning of DNA sequences capable of autonomous replication in Candida utilis yeast
  • a method for cloning a DNA sequence having autonomous replication ability in a Candida utilis yeast The DNA used may be from any species, but is preferably from Candida and Utilis.
  • a vector for this one containing a drug-resistant marker gene can be used, and preferably it functions in a Canadian drug library. It is possible to use a vector containing the APT gene, which is a G418 resistant gene expressed by both promoter and terminator. Wear .
  • a plasmid containing an APT gene expressed in the PGK gene promoter is used as a vector, and the candid * A yeast chromosomal DNA library is prepared, and the library DNA is used to transform a Candida utilis.
  • the transformed yeast Plasmid DNA that had been present as an extrachromosomal factor can be recovered. Isolate a functional sequence as an autonomously replicating sequence (ARS) from a chromosomal DNA fragment derived from Candida utilis inserted into this plasmid DNA. be able to .
  • ARS autonomously replicating sequence
  • cyclohexene is a drug-resistant marker.
  • a plasmid containing the shim-resistant L41 gene is used as a vector, it is not possible to clone a DNA sequence capable of autonomous replication. I did.
  • a candidobacterium yeast chromosomal DNA library was prepared, and this library DNA was used.
  • Candida utilis was transformed with E. coli, no cycloheximide-resistant transformant was obtained. This is a characteristic of the ARS of Candida utilis, which has low copy number per cell of the plasmid containing the ARS and can transform the transformant.
  • a DNA sequence having promoter activity for transcription in a candidutilis can be obtained.
  • a cloning method is provided.
  • the vector for this purpose is a drug-resistant marker that does not have a promoter sequence for transcription in addition to a DNA sequence capable of autonomous replication.
  • Any gene containing the APT gene can be used, preferably one containing the GPT18 resistance gene, the APT gene.
  • the DNA used may be from any species, but is preferably from Candida utilis.
  • DNA in order to make a library, DNA must be degraded by enzymatic treatment such as restriction enzymes or DNAases, or by mechanical shearing such as ultrasonic waves.
  • restriction enzymes A1uUHaeIIRsal which recognize four bases and generate blunt ends are used in combination for partial digestion of chromosomal DNA. This is because more chromosomal regions are cloned into the library.
  • a DNA fragment of about 0.8 to 1.8 kb which was partially digested with the above-mentioned restriction enzyme, was added to the 5 'side of the APT gene not containing the promoter sequence. And ligating them to produce a candida * utilis yeast chromosomal DNA library by a conventional method. And this library DNA Transform the candidate utility with.
  • a DNA sequence having promoter activity can be obtained. Separation can be performed efficiently.
  • the number of copies of a plasmid containing ARS in a candida or utility is per cell. Since it is only about 1 copy, it is said that it is convenient for separating a highly active promoter sequence.
  • the method for isolating a DNA having motor activity also provides a method for isolating a DNA sequence having a function of enhancing the stability of a plasmid containing ARS.
  • One of the features of the existence of the plasmid containing ARS in the Canadian utility is that its stability is low and that it can be used under nonselective conditions. By culturing for about 3 to 4 generations, the proportion of cells retaining plasmid is 20 to 30% of the total. descend .
  • the strain carrying the ARS plasmid having the drug resistance gene is the same as the strain having the drug resistance gene integrated on the chromosome.
  • a slightly smaller colony is formed on the present invention.
  • a strain that forms a relatively large colony was selected in order to isolate a highly active promoter sequence.
  • the stability of the plasmid was improved and the stability was improved. It was also possible to obtain a DNA sequence having the following functions:
  • those skilled in the art can use this transformation system to obtain DNAs having various functions such as centromeric sequences. It is easy to imagine that it is possible to obtain an array.
  • a method that does not include a gene is provided.
  • a transformant not containing the drug-resistant marker gene can be obtained by the following procedure. First, a plasmid DNA which does not have a selection marker gene for the above-mentioned transformant selection and which contains a sequence homologous to chromosomal DNA (homologous DNA sequence) is used as the homologous DNA. It is made linear by digestion with an appropriate restriction enzyme site in the sequence.
  • this linear Lasmid DNA is the one that can be integrated on the homologous DNA sequence of the Candida utilis chromosome.
  • This linear plasmid DNA is then used to transform the yeast simultaneously with the plasmid containing the ARS-containing DNA sequence and the selection marker gene. .
  • the DNA fragment used for the transformation is simultaneously integrated into the chromosome from among the transformants selected by the introduction of the plasmid containing ARS.
  • the expression of the heterologous gene contained in the DNA fragment or confirm the integration of the DNA fragment by PCR, Southern analysis, etc. And make a secondary choice.
  • the autonomously replicating plasmid present in the more selected strains can be easily eliminated by culturing the bacteria under non-selective conditions. is there . This makes it possible to obtain a strain that does not retain the selected marker gene and retains only the inserted DNA fragment on the chromosome.
  • Candida utilis chromosome site-specific mutagenesis According to another aspect of the present invention, a Candida utilis chromosome site-specific mutagenesis.
  • This method uses a gene-separated cassette, which has lost its function by inserting the selected marker gene into the target gene, as a replacement for the chromosomal target gene.
  • This cassette contains at both ends a DNA sequence homologously recombinable with the chromosomal target gene (homologous DNA sequence), and at least one fragment between them. Includes one selection marker gene In other words, they form a linear DNA structure. It is important that the insertable DNA fragment has the same orientation as that on the chromosome.
  • the selection marker gene is preferably a drug resistance gene, and transformants in which the gene has been destroyed can be selected by drug resistance.
  • the gene that is the target of the gene modification is preferably a gene derived from a Candida utililis chromosome. Specific examples include, but are not limited to, the URA3, ADE1, ADE2, and HIS4 genes.
  • the Candida utilis URA3 gene is divided into selectable marker genes such as the cycloimidide-resistant L41 gene to function as a chromosome. After transforming into a gene that does not have a gene, it is used for transformation. In the obtained cycloheximide resistant transformant, one out of two URA3 genes on the chromosome has been disrupted. Subsequently, the above strain in which one URA3 gene was disrupted was used by using a URA3 gene fragment separated by another selection marker gene such as a G418 resistance gene. By transformation, it is possible to obtain a strain in which two URA3 genes have been disrupted.
  • selectable marker genes such as the cycloimidide-resistant L41 gene to function as a chromosome.
  • ura 3 mutant is ⁇ It is known to be resistant to 5-toxic fluorotinic acid (5-FOA), a toxic analog of the lacyl biosynthetic pathway intermediate. Thus, one of the two URA3 genes lost function by replacing the disrupted strain with one of the two URA3 genes lost function. It is also possible to obtain the ura 3 mutant as a 5—FOA resistant strain. By using the ura3 mutant obtained as a host as a host, a drug-resistant gene marker using the URA3 gene as a selection marker gene was obtained. It is also possible to obtain transformants that do not depend on the target. The auxotrophic mutants obtained in this way are, like strains produced by chemical mutagenesis, secondary to the other gene loci. It has the advantage of being very unlikely to be affected by the mutation.
  • 5-FOA 5-toxic fluorotinic acid
  • the ribosome-constituting protein L41 of Candida utilis the gene encoding it, and the gene encoding it
  • An array of promoters and terminators is provided.
  • the protein L41 of Candida utilis according to the present invention specifically has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) shown in FIG. That's what it is. Therefore, the L41 gene according to the present invention encodes the amino acid sequence shown in FIG. In addition, a base comprising this gene, its promoter, and its terminator sequence A specific example of the sequence is the base sequence shown in FIG. 13 (SEQ ID NO: 5). .
  • the 56th amino acid residue was converted from proline to gnoretamin by the site-directed mutagenesis method.
  • a mutant L41 gene encoding a cycloheximide-resistant L41 protein is provided.
  • this translocated heximid-resistant L41 gene is a selected marker gene for the transformation of Candida utilis.
  • it can also be used as a transformation marker gene for other yeasts, for example, Saccharomyces yeasts.
  • the promoter of the gene and the Yuichiichi Minerta sequence can also be used for the expression of a heterologous gene.
  • a promoter sequence of a PKK gene and a sequence of a terminator.
  • FIG. 3 A preferred specific example of the promoter sequence is shown in FIG. 3 and at least 946 to 13346 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) described in FIG.
  • SEQ ID NO: 2 A sequence having the previous sequence and a partial sequence retaining promoter activity are also listed, and a preferred specific example of a terminal sequence is included. Examples include the nucleotide sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1) and its partial sequence that retains the terminator activity.
  • This promoter array and terminator array By connecting to a suitable plasmid vector, it is possible to obtain an expression vector that can be used in the Canadian * utility. As a push vector for this,
  • a selected marker gene such as E. coli plasmid or known E. coli plasmid such as PB1uescript or pUC19, or cycloheximide-resistant L41 gene, and further, If necessary, an enzyme comprising a DNA sequence homologous to a chromosome target gene and a recombination-recognizable gene can be used.
  • other host cells particularly yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear that what is possible will be clear to the person skilled in the art.
  • the PGK gene is a glycolytic enzyme gene, and is expressed in large quantities in Candida utilis together with other glycolytic enzyme genes. It is expected to be a powerful promoter.
  • the dalcoamylase gene which is a heterologous gene, and an aminoglycoside phosphophoton were used. It has been revealed that this promoter can be used to advantage in the expression of genes such as genes and ⁇ -galactosidase genes. ing
  • a promoter sequence and a terminator sequence of the GAP gene are provided.
  • promoter sequence examples include the nucleotide sequence shown in FIG. 30 (SEQ ID NO: 7) and the nucleotide sequence retaining one promoter activity. Subsequences are listed.
  • Preferred examples of the terminator sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 31 (SEQ ID NO: 8) and retention of the terminator activity. Subsequent subsequences are listed.
  • the plasmid vector for this purpose include known E. coli plasmids such as pB1uescript and pUC19, and cycloheximide-resistant types.
  • other host cells especially yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear that what is possible will be clear to the person skilled in the art.
  • the GAP gene is a glycolytic enzyme gene. Because it is expressed in large quantities, it is expected that it will have a strong promoter.
  • the expression vector thus prepared was used to express a heterologous gene, a aminoglycosidase phosphotransferase gene. O It has been clarified that this motor can be used to advantage o
  • the expression level of the gene linked to the promoter sequence and the terminator sequence of the GAP gene according to the present invention may be reduced. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size by deleting a part of the expression vector.
  • a promoter sequence and a terminator sequence of a PMA gene are provided.
  • promoter sequence examples include the nucleotide sequence shown in FIG. 34 (SEQ ID NO: 9) and the nucleotide sequence retaining one promoter activity. Subsequences are listed.
  • Preferred examples of the terminator sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 35 (SEQ ID NO: 10), and the activity of the terminator. Connect the promoter array and the terminator array to the appropriate plasma vector, where the partial sequence that holds the I Ri, a key catcher down de Lee da Interview te I of Me other n this that Ki the expression vector click Turn-available in the re-scan out and give Ru this flop La scan Mi Dobe click data over to Is
  • a known marker gene such as E. coli plasmid or cycloheximide-resistant L41 gene such as pB1uescript or pUC19 is used.
  • an enzyme comprising a homologous recombination DNA sequence with a chromosome target gene and an Escherichia coli shutozoleplasmid can be used.
  • other host cells especially yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear to a person skilled in the art that this is also possible.
  • the PMA gene is a gene for a plasma membrane enzyme, and in Saccharomyces yeast, it accounts for about 10% of plasma membrane proteins. It is known to be proteinaceous. Therefore, this PMA gene is expected to have a strong promoter.
  • the expression vector thus prepared was used to express a heterologous gene, an aminoglycoside phosphotransfer gene. It has been shown that this promoter can be used to advantage in expression.
  • the expression level of the gene linked to the PMA gene promoter sequence and the terminator sequence according to the present invention is not reduced, a part of the gene may be used. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size by deleting the expression vector.
  • a DNA sequence having promoter activity is provided.
  • a column is provided.
  • This DNA sequence should include a DNA sequence capable of autonomous replication and a drug-resistant marker gene that does not have a promoter sequence for transcription.
  • the DNA sequence having promoter activity include the base sequence (SEQ ID NO: 13) shown in FIG. 48 and the promoter. -The subsequences that retain activity are listed. Further, as will be described in detail in Examples described later, a promoter in which the nucleotide sequence shown in FIG. 48 was clarified using this vector. In addition to the active DNA sequences, eight types of DNA sequences were obtained.
  • a drug resistance gene that does not have a promoter sequence for this transcription can be replaced with another gene, such as a hygromycin B resistance gene.
  • a DNA sequence having promoter activity can be isolated.
  • selection conditions such as the type of sugar contained in the plate from which the transformants are selected and other medium compositions, certain specificities can be obtained. It is possible to obtain promoters whose transcriptional activity is induced under typical conditions.
  • E. coli plasmids such as pBluescript, pUC19, or selected marker genes such as cycloheximide-resistant L41 gene
  • a yeast-Escherichia coli shuttle plasmid containing a DNA sequence homologous to the chromosome target gene and capable of recombination can be used. It is also true that other host cells, particularly yeast of the genus Saccharomyces, can be used as a promoter. I think it is clear to the trader.
  • the expression vector was used to produce a heterologous gene, Amino Glycosid Phosphotransferase gene. It has been shown that this promoter can be used to advantage in the expression of offspring.
  • the expression level of the gene linked to the promoter sequence according to the present invention does not decrease, it is possible to delete a part of the gene. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size.
  • a DNA fragment of about 13.5 kb, which contains the rRNA gene of Candida utilis, and a fragment thereof are repetitively prepared.
  • the resulting DNA sequence is provided.
  • This approximately 13.5 kb fragment is represented by the restriction map shown in FIG. 6 (b). Location of the 18S, 5.8S and 25S rRNA genes in this DNA sequence was as shown in Fig. 6 (b).
  • this rRNA gene By using a part of this rRNA gene as a target sequence for the integration of chromosomes into DNA fragments, efficient and multicopy integration can be achieved. It is done. It is interesting to note that this approximately 13.5 kb DNA fragment was divided into four fragments to construct a plasmid, which was used for transformation, respectively. However, a difference was found in the frequency of transformation obtained depending on the region used as the integration target sequence. That is, in Fig. 20, 3.5 including the 3 'part of the 18S rRNA gene and 5.85 rRNA gene, and 3.5 parts including the 5' side of the 25S rRNA gene.
  • Plasmid p CLE7 which contains a 4.7 kb EcoRI fragment containing PCLRE 6 and the 5 'part of the 18S rRNA gene, can be used to transform frequently.
  • the transformation frequency obtained with the plasmid pCLRE5 containing the 2.4 kb EcoRI fragment containing the 18S rRNA gene was low.
  • a URA of Candida utilis which complements the ura3 mutation of Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • This gene is, as described above, a target for integration of DNA fragments. In addition to this, it can be used for the production of ur.a3 mutants by gene disruption of the chromosome URA3 gene.
  • a drug-resistance gene marker using the URA3 gene as a selection marker gene is used. It is also possible to obtain a transformant that does not depend on the target. It goes without saying that the promoter and the terminator sequence of this gene can also be used for the expression of a heterologous gene. Absent.
  • a specific URA3 gene encodes the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) shown in FIGS. 10 and 11.
  • Preferred URA3 genes are those having the nucleotide sequence shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 3), or those of Saccharomyces cerevisiae yeast. It has the partial sequence that retains the function of complementing the ura3 mutation.
  • ARS DNA sequence with autonomous replication ability
  • a vector containing a DNA sequence having an autonomous replication function and containing the DNA sequence in a candidacy * Provided is a DNA sequence which can be retained as a plasmid as an extrachromosomal element to increase the frequency of transformation of a host.
  • the DNA fragment can be from any organism, but is preferably from Candida utilis.
  • Preferred specific examples of ARS include the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) shown in FIG. 41 and FIG. 42, or the nucleotide sequence shown in FIG. 43 and FIG. Stated
  • the base sequence (SEQ ID NO: 12) and its partial sequence having an autonomous replication function are listed. As is evident from the examples described below, even though the frequency of the plasmid containing the shortened DNA fragment is reduced, the frequency of the plasmid is reduced. It is capable of transforming T. cerevisiae yeast.
  • this ARS and the appropriate selection marker gene it is present as a plasmid in the Canadian utility list. Possible vectors are provided. Furthermore, by using this vector, a DNA sequence having promoter activity or a DNA sequence having other functions can be separated. It is possible . In addition, a candidate marker gene containing a sequence homologous to the Candida utilis chromosomal DNA (homologous DNA sequence), and particularly for selecting a transformant. The use of a plasmid containing ARS and an appropriate selection marker gene together with a plasmid DNA lacking the same allows for the selection of the selection marker. It is possible to produce a transformed yeast that retains only a DNA fragment containing a heterologous gene on a chromosome without a gene.
  • the plasmid K10 ⁇ g was digested with an appropriate restriction enzyme, it was extracted with a phenolic ⁇ -mouthed hole, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. DNA was added to 100 ml of EX0m buffer (50mM Tris-HC1pH8.
  • the fluorescent primer cycle cycle of Avid Biosystems Co., Ltd. The sequencing reaction was performed using a kit, and the DNA sequence was determined using an automatic DNA sequencer.
  • the DNA was applied to a high-band N + filter (Amersham) using the force applied to the attached protocol.
  • a filter for southern hybridization as an azure recurrence facilitator.
  • the finalizer on which the DNA is fixed is a hybridizer.
  • ⁇ m (6 XSSC, 5 x Denhardt Solution, 0.2% s DS, 20 ⁇ gm IS almonserm
  • the composition of the YPD medium for culturing yeast is 1% yeast extract, 2% bactone, 2% glucose, and in the case of a plate, 2% agar. %.
  • the composition of the SD medium is 0.67% amino acid-free yeast nitrogen base, 2% dalcose, and is a nutrient for the yeast used. Amino acids were added as required. In the case of plates, the agar was forced to 2%.
  • Reactions with various enzymes may be performed using the reaction conditions recommended by the manufacturer.
  • Candida utilis ATCC 9950 strain was inoculated into 3 O ml of YPD medium, and cultured at 30 ° C. until the early stationary phase was reached. The cells were collected by centrifugation, washed with sterilized water, and collected again by centrifugation. The cells are suspended in a 3 ml zymoryze buffer (0.19 M sono-reitol, 0.1 MEDTA, 50 m MDTT, pH 7.5). After the addition, add 0.91 sonobitone containing 25 mg / m1 of Zymoryase 100 T, and add 37 to the mixture. Shake and heat at C.
  • centrifugation was performed to collect the protoplast-converted bacteria.
  • Add 3 ml of lysate 50 mM MT ris-HC 150 mM EDTA, pH 8.0
  • 0.3 ml of 10% SDS was mixed and incubated at 65 ° C overnight.
  • 1 ml of 5 M potassium acetate solution was added, and the mixture was left on ice for 1 hour. Thereafter, aggregates were removed by centrifugation, and 4 ml of cooled ethanol was added, followed by centrifugation to precipitate DNA and the like.
  • the precipitate was washed with 50% ethanol, dried, and then washed with 3 ml of RNase A buffer (10 mM MTris-1). It was dissolved in HC1, 1mMEDTA, 00g / m1 RNase A ⁇ pH7.5) and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Finally, add 3 ml 1-propanol and centrifuge to remove the supernatant. Wash the precipitate with 50% 2-propanol and dry. I let you. The precipitate dissolved in 0.5 ml of TE buffer was used as a Candida utilis chromosome DNA sample.
  • DNA fragments were layered on a 100-150% sucrose density gradient containing (pH 8.0) and centrifuged at 120,000 X g for 14 hours. .
  • Example 3 Nucleotide sequence determination of DNA fragment containing PGK gene and identification of structural gene and regulatory region
  • the isolated 2.6 kb EcoRI fragment was incorporated into the EcoRI site of the plasmid vector Bluescriptl ISK +, and the insert fragment to the vector was The plasmids p PGKEl and p PGKE 2 with opposite directions were prepared. Similarly, the 2.5 kb Sa1I fragment was similarly vectorized. The plasmids p PGKSl and PPGKS2 were incorporated into the Sa1I site of B1uescript II SK +, and the inserts were oriented in opposite directions to the vector. ( Figure 1 ) .
  • Plasmids pPGKEl and pPGKE2 Two types of plasmids, plasmids pPGKEl and pPGKE2, were treated with restriction enzyme sites such as HindlH, Kpnl, and Sa1I. Of deletion mutants of E. coli, and deletion mutants prepared by using Ex01I1 nuclease and Mangby nuclease. Then, plasmids having various deletion mutations were prepared, and the sequence of an Ec0RI fragment consisting of 2530 bp was determined.
  • this Ec0RI fragment contains 401 bp upstream of the start codon ATG and 880 bp downstream of the stop codon TAA in the gene control region.
  • the 88-Obp sequence from immediately after the termination codon TAA, presumed to contain the transcription terminator, to the Ec0RI site is shown in Fig. 2. It was as shown in the figure.
  • Smid p PGKS l and p PGKS 2 can also be used to create deletion mutants using Exo111 nuclease-: and magvine nuclease.
  • the 1346 bp sequence from the Hind III sitoka, presumed to include the transcriptional promoter, to immediately before the initiation codon ATG is shown in Figure 3. It was as expected.
  • a gene expression factor, transcription and transcription functioning in a Candida * / utilis are required.
  • a promoter and terminator are required. Therefore, a multi-cloning device is connected between the PGK gene transfer promoter of the CANADA DUTILIS and the terminator. An expression vector plus an expression vector was prepared.
  • the plasmid pPGKSl was used as a ⁇ type, and the site was located at 2.3 kb upstream of the start codon from the Sa1I site. Fragments up to just before the start code ATG were obtained.
  • the plasmid pPGKEl is a type I, and the Ec0RI site 880 bp downstream immediately after the termination codon is used. The fragments up to now have been obtained.
  • the plasmid pPGKEl is a type I, and the Ec0RI site 880 bp downstream immediately after the termination codon is used. The fragments up to now have been obtained.
  • the PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
  • the promoter and terminator fragments synthesized by PCR were designated Sa1I and XbaI, or Kpnl, respectively.
  • the plasmid pPGKPTl was constructed by sequentially incorporating the SalI-Xbal site and the Kpnl-EcoRI site (Fig. 4). Then, at the terminal one downstream end
  • the NotI linker (5'AGCGGCCGCT3 ': SEQ ID NO: 18) was ligated, and Approximately 0.9 kb by stl digestion A PstI-NotI fragment was cut out. This fragment was excised from the plasmid pPG.KS1 1.2 kb.
  • the plasmid PPGKPT2 was constructed by inserting it along with the HindI1I-PstI fragment between the HindIII site and the NotI site of pBlueserip tSK-. Was. In addition,
  • PPGKPT2 is digested with Bglll, treated with Klenow enzyme, and recyclized to remove Bglll sites in one terminator fragment, and The plasmid pPGKPT3 was constructed. Subsequently, Hind111 site of PPGKPT3 was blunted by Klenow enzyme treatment, and then NotI linker (5′AGCGGCCGCT3 ′: SEQ ID NO: 18) was ligated. And constructed the plasmid PPGKPT4. In addition, the plasmid PPGKPT4 was partially digested with Kpnl to delete the ⁇ I site upstream of the promoter to construct plasmid PPGKPT5. (Fig. 4).
  • the Sau3AI portion of the genomic DNA of Candida utilis ATCC 9950 obtained by sucrose density gradient centrifugation as described in Example 2.
  • a DNA fragment (40 ng) of a fraction of 5 to 10 kb and a vector plasmid which was digested with BamHI and dephosphorylated and then oxidized.
  • pBR322 and 200 ng were ligated together with T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli DH5 is transformed using this DNA solution, and the chromosome of the Candida dutilis lys is obtained. Completed the DNA library.
  • 10 ng of a DNA fragment of a fraction of 5 to 10 kb was combined with a vector plasmid, which was digested with BamHI and then dephosphorylated, YE pl 3 (et ho dsin E nzymo 1.194, 195-230, 1991) 10 ng was ligated with T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli DH5 was transformed to prepare a chromosomal DNA library. After extracting the mixture of the plasmids from the transformants, the obtained DNA was Saccharomyces * Cellevisie YPH 500
  • Ura ⁇ strain was obtained. From these transformants,
  • Plasmid DNA was prepared. Escherichia coli was transformed with this, and the plasmid DNA was recovered. Among these plasmids DNA, a plasmid PCURA3-3 containing a 6.lkb insert at the BamHI site of YEpl3;
  • the plasmid pURAEl was constructed by linking to the EcoRI site of (StratageneCloning Systems) (FIG. 7).
  • a transformant of URA + was frequently obtained.
  • the URA3 gene is present in this 5 kb EcoRI fragment and complements the Saccharomyces cerevisiae ura3 mutation in one copy. was revealed.
  • the plasmid pURAEl is digested with XhoI or PstI and recircularized by the T4 ligase reaction again to obtain a plasmid.
  • the plasmids p URAE l AX ho and p URAE l AP st were obtained.
  • Plasmids pURAEC1 and pURAHI were inserted at the HindIII site (FIG. 7).
  • the YPH500 strain was transformed by the lithium method using the five types of plasmids, and the complementation ability of the ura 3 — mutation was examined. These fragments encode the URA 3 gene I checked whether it included. The result was as shown in Figure 7. As a result, the URA3 gene could be limited to 2.3 kb between EcoRI and Hind111.
  • Example 8 Cloning of the L41 gene and sequencing of the DNA fragment containing the L41 gene
  • the region showing homology to the L41 gene is this 4 kb region.
  • the amino acid at position 56 of the L41 protein of cycloheximide-resistant yeast is glutamine, whereas cycloheximide-sensitive yeast is This is the position of L41 protein in The amino acid at the position is proline. It has been reported that this amino acid residue determines the sensitivity of yeast having the L4.l protein to cycloheximide. (KAWA 1 et. A 1. JB acterio 1.174 254-262 (1992)).
  • the 56th amino acid of the L41 protein of Candida utilis which is sensitive to cycloheximide is the cycloheximide. It was prolin, as was the Simid-sensitive Saccharomyces cerevisiae.
  • the codon that codes for the 56th proline of the L41 gene by site-directed mutagenesis was changed to a Glucomin codon.
  • the gene encoding L41 protein is converted into a cycloheximid-resistant type, and is used as a selection marker for transformation. I used it.
  • a 2.1 kb BamHI-SacI fragment obtained from the plasmid pCLEL was inserted between the BamHI-SacI sites of pUC18.
  • a plasmid pCLBS1 was prepared (FIG. 15).
  • the plasmid pCLEl was digested with Af111, smoothed by Klenow enzyme treatment, and further Xh0I digested.
  • pCLAX1 was prepared by inserting pB1uescript SK— between SmaI and XhoI.
  • this plasmid the ligation between the blunted Ail11 end of the 0.6 kb fragment and the SmaI end of the vector was performed.
  • the Af111 cut site is regenerated.
  • helper phage A single-stranded DNA was prepared from pCLXA1 and synthesized, and the resulting mutant nucleic acid was synthesized using the 5 'TTGTGG AAA ACT TG C TT G GTT TGA3'.
  • the candidate plasmids obtained from which the mutant plasmids were prepared were identified as 0.
  • the entire nucleotide sequence of the 6 kb insert was determined, and the codon CCA, which codes for the 56th proline, was mutated to codon CAA, which is Gluymin, and A 0.6 kb insert from PCLAX 20 from which a plasmid PCLAX 20 having no mutation in the other sequence was obtained was cut out as a Clal-Af111 fragment, which was then excised. And the plasmid pCLBSl is digested with Clal and Af111.
  • Plasmid PCLBS10 containing the mutant L41 gene was constructed by ligating with the 4.4 kb fragment.
  • the plasmid pCLBSIO is referred to as BamHI.
  • the NotI linker was digested.
  • the saccharomyces yeast YPH500 strain was transformed into Methodsin Yeast Genetics-A la bo ratory Course Manu al-Rose. M. Data 1. Transformation was carried out according to the lithium acetate method described in P122-123 Cold Spring Laboratories Press NY (1990). As a transformant, a strain which was not required for leucine was selected. The growth of these transformants on YPD plates containing cycloheximide was examined.
  • Example 10 Construction of plasmid for transformation and determination of Candida utilis transformation conditions
  • the G418 resistance gene (Amino), which has been previously shown to function in Saccharomyces cerevisiae Glycosid phototransferase (APT) gene expression, using a plasmid containing the set Transformation of Idutyris ATCC 9950 strain was attempted.
  • This expression cassette was described by Yamano et al.
  • XhoI is cut out as a PstI fragment
  • Example 5 the plasmid pCRE shown in Example 5 was added to the EcoRI site and Xbal site of the plasmid PCLBS 10 described in Example 9 (FIG. 15). 2, p CRE 3,
  • This false-resistant colony is used when selecting transformants on a plate to which antibiotics such as G418-cycloheximide are added at a low concentration. A frequently observed colony that spontaneously acquires resistance irrespective of the presence of the drug resistance gene of the selected marker.
  • the cycloheximide concentration of the YPD plate was set at 40 ⁇ g / m
  • the plate's incubation temperature was set at 28 ° C instead of 30 ° C. It has been found that the appearance of ⁇ can be suppressed.
  • the plasmids pCLRE2, pCLRX1, and pCLRX2 must have the r After digestion of the plasmid with Bg1II, Ec0RV, and Bg111, respectively, the restriction enzyme sites in the RNA gene region, the plasmids were used for shape-IS exchange experiments. Using. As a result, with regard to the Bg111-digested plasmid pCLRE2 and PCLRX2, the electric capacity is 25 F, the resistance value is 600 ohms, and the voltage is By setting it to 5 KVZ cm, it was possible to obtain a cycloheximide resistant strain. These resistant strains are clearly smaller in size than the small pseudoresistant strains previously obtained in control experiments without the addition of plasmid DNA. Big and big The Southern analysis shown in Example 12 revealed that it was a transformant.
  • the time it takes for the voltage to decay to about 37% of the maximum value is less than 10 milliseconds, 600, 800, or
  • the time u instance is about 10 seconds to about 20 seconds.
  • the viable cell rate after the pulse was about 10-40%, and the time was more than 10 seconds.
  • High form that gives a certain electric pulse to bacteria It is suggested that it is important to obtain the quality change frequency.
  • Collect cells by centrifugation at 1400 X g for 5 minutes. The cells were washed once with 100 ml of ice-cold sterile water, followed by 40 ml of ice-cold sterile water. After washing once with ice-cold sterile water, wash once with 40 ml of ice-cold 1 M sodium sorbitol. Suspend the cells in 10 ml of 1 M sorbitol, transfer to a sterile polypropylene tube, and centrifuge again at 11 X g for 5 minutes. Collect bacteria. After removing the supernatant, resuspend the cells in ice-cold 1 M sodium hydroxide so that the final volume of the bacterial cells is 2.5 ml.
  • Transformation experiments using electric pulses will be performed using Biorad's Gene Pulser. After mixing the bacterial solution of 50 // 1 and the DNA sample of 5 ⁇ 1, put it into a 0.2 cm disposable cubette and place it under an appropriate condition. Add After pulsing, add 1 ml of ice-cold YPD medium containing 1 M sorbitol, transfer to a sterile polypropylene tube, and place at 30 ° C. Incubate with C for about 6 hours. After culturing, apply the bacterial solution to YPD selective medium containing 40 jug / ml cycloheximide, and incubate the plate at 28 ° C for 3-4 days. Then, a transformant colony is obtained.
  • the fact that the number of copies of the L41 gene per Candida * utilis 1 cell is 2 is based on the Southern analysis in Example 15 As shown in the figure, the number of copies of the plasmid DNA incorporated from the results of the scanning by densitometry is approximately Else, it was strongly indicated that the copy ranged from 6 copies (lane 7) to 15 copies (lane 2).
  • Sa1I abolishes the plasmid pCLRE2 at one site, but when chromosomal DNA is ablated, Sa1I results from the endogenous L41 gene. Near the 7.5 kb band, an 8.5 kb band corresponding to the length of the plasmid PCLRE2 was detected. This is due to the fact that multiple plasmids have been integrated into chromosomes in multiple tandems, resulting in Sa1I deletion. It was thought to have originated from a potential plasmid due to the chemical transformation. .
  • Candida utilis has been reported to have different chromosome swimming patterns in different strains and to exhibit chromosomal length polymorphisms. (St 01 tenburget. A 1. Curr. Genet. 22 441-446 (1992)). Therefore, it is expected that the genetic characteristics of the strains and the frequency of transformation due to the strains are expected to differ, so that the ATCC 9250 strains as well as the ATCC 9250 strains Transformation of ATCC 9256 strain by the electropulse method shown in Example 11 was attempted.
  • the pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 ⁇ F, the resistance value was 100 ohms, and the voltage was 2.5-6.25 KV / cm.
  • the electric capacity was 25 ⁇ F
  • the resistance value was 100 ohms
  • the voltage was 2.5-6.25 KV / cm.
  • Bg1H-digested pCLRE2 was used as plasmid DNA.
  • the ATCC 9226 strain and the transformants derived from ATCC 9256 strain were cloned into plasmids. In addition to the 8.4 kb band of the same size as the DNA size, bands were also observed on the polymer side (lanes 2-4, and 7). This is because the rDNA sequence on the plasmid differs from the rDNA sequence on the chromosome that is the integration target, and the end of the plasmid DNA molecule integrated on the chromosome This indicates that the Bg111 site may be deleted.
  • Example 15 shows that the number of copies of the L41 gene per candida / utilis cell is two.
  • the 5.4 kb band force corresponds to the 2 copies of the L41 gene, and the built-in band force was compared based on the band strength comparison.
  • the density of the band from which the number of copies of the smid was calculated was determined by the imaging analyzer.
  • Plasmid PCLRE2 was 7 copies (lane 1) of the ATCC 925 56 strain, and 25 copies (lane 3).
  • the ATCC 922 26 strain ranged from 3 copies (lane 5) to 11 copies (lane 6).
  • Transformants can also be obtained using the cycloheximide resistance L41 gene for ATCC 9226 and ATCC 9256. , Indicating that a plurality of plasmids were simultaneously integrated into the chromosome.
  • Example 14 Transformation of Candida *.
  • the lithium acetate method (1 t. Eta 1. J. B acteri. 153, 163-168 (1983)) is widely used for the transformation of yeast of the genus Saccharomyces because of its convenience. There are. Thus, using the plasmid pCLRE2, which has been linearized by Bglll siding, the candida * utilis ATCC 9950 strain was expanded. Lithium acetate method, and a modified method of lithium acetate with addition of ethanol or DMSO (SG niet. A 1. Cu ⁇ rent Genet. 1993 24, 455-459) .In the modified acid-lithium method, ethanol concentration was reduced to a final concentration 10 minutes after the start of heat shock.
  • the solution was added to the bacterial solution so that the concentration became 10%, and the mixture was further incubated for 10 minutes.
  • DMS0 was added to the bacterial solution at the same time as the polyethylene glycol solution so that the final concentration became 10%.
  • the treated cells are suspended in a YPD solution, cultured at 30 ° C for 4 hours with shaking, and then applied to a selection plate containing cyclosimid. And incubated at 28 ° C for 6 days. ..
  • Example 15 Transformation using different rRNA gene regions as targets
  • PCLRE5 was constructed by inserting a 2.4 kb EcoRI fragment.
  • Plasmids pCLRE6 and PCLRE7 were constructed by inserting them into the EcoRI site.
  • the prepared plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7 were digested with restriction enzymes into linear DNA, and the DNA of each lug was used.
  • the ATCC 9950 strain was transformed by the electropulse method described in Example 11.
  • the pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 F, the voltage was 5 KVZcm, the resistance value was 800 ohms, and the culture time after the pulse was 18 hours.
  • the restriction enzyme used for the digestion of the plasmid was an enzyme having its cleavage site in the rRNA gene fragment.PCLRE4 was Bglll, pCLRE5 was BamHI or X bal, p CLRE 6 is
  • BamHI and pCLRE7 were digested with Apal or EcoRV, respectively.
  • Plasmid pCLRE4 is also digested at the C1aI site in the L41 gene, and is characterized by a difference in the integrated target gene. The difference in conversion frequency was compared. The experiment was performed twice. The results were as shown in Table 2.
  • pCLRE 7 (EcoRV) 577 640 Plasmid p CLRE 4, p CLRE 6, and digested in the rCL gene fragment of p CLRE 7 Yes; f also 1 g The DNA showed a high transformation frequency of several hundreds per DNA.
  • the plasmid pCLRE5 is
  • Transformation frequency was significantly lower when either BamHI or XbaI was used than when other plasmids were used. This result indicates that the transformation frequency of the rRNA gene region also varies greatly depending on the fragment used as the transformation target.
  • the plasmid pCLRE4 was digested with the C1aI. Site in the L41 gene, its transformation frequency was lower than the rRNA gene. Compared to digestion with Bg111 site, the ratio was about 1/10 to 1/50, and according to the Southern analysis described below, Plasmid molecules are at the L41 locus when digested at the C1aI site and at the rRNA locus when digested at the Bg111 site. , Respectively.
  • PCLRE4 digested with Bg111 or C1aI, pCLRE5 digested with XbaI, pCLRE6 digested with BamHI, and pCLRE7 digested with ApaI Chromosomal DNA was prepared for each of the four cycloheximide resistant strains obtained using the method.
  • the prepared DNA was digested with Pg111 or Bg111 and N0tI, and the 1.8 kBamHI- containing 32 P-labeled L41 gene was digested.
  • the Southern analysis was performed using the Hindlll fragment (Fig. 12) as a probe (Fig. 21).
  • the 5.4 kb band from the endogenous L41 gene was digested by Bg111 digestion.
  • the plasmid DNA molecule Of the Bg111 site a 8.4 kb band of the same size as that of the plasmid DNA was found by cleavage at the site (Fig. 21).
  • the plasmid ⁇ CLRE 4 contained three copies (lane 4) and five copies (lane 1 and 3), r at the L41 locus. It was shown that 2 copies (lane 8) to 8 copies (lane 5) were inserted into the R ⁇ gene locus.
  • Example 16 ⁇ Incorporating the plus into the RA3 locus Insert a 5 kb EcoRI fragment ( Figure 7) containing the UR A.3 gene into the EcoRI site of plasmid pCLBS12 ( Figure 15), De CLURA l was constructed. This plasmid was cut at the PstI site in the URA 3 locus, and the plasmid was used to apply the electric pulse method described in Example 11 to the plasmid. Transformation of ATCC 9950 strain was attempted. The pulse conditions were set as follows: the capacitance was 25 ⁇ F, the resistance was 800 ohms, and the voltage was 5 KVZ cm. As a result, ⁇ 40 clones resistant to cycloheximide per 1 ag DNA were obtained.
  • Chromosomal DNA was prepared for the four cycloheximide resistant strains obtained.
  • the prepared DNA was digested with Bg111 or Sa1I + N0tI and used for Southern analysis.
  • a 1.8 kb BamHI-HindlI fragment containing the L41 gene (Fig. 12) was used for the Sa1I + N0tI digested DNA.
  • a 2.3 kb Hindlll-EcoRI fragment containing the URA3 gene (Fig. 8) was labeled with 32 P and used as a probe.
  • Example 17 Expression of a heterologous gene (glucoamylase gene) in Candida * utilis
  • a plasmid for STAl gene expression was constructed as shown in Figure 23.
  • the STA1 gene was transferred to the Saccharomyces Deathstatistics 5 1 0 6 — 9 A (a 1 eu 2, arg 4, STA 1) (Yamashitaa nd Cloning from the chromosomal DNA library of Fukui Agric. Biol. Cliem. 1 2689-2692). This was done by the operation shown below.
  • a DNA fragment of about 20 to 30 kb was prepared by agarose gel electrophoresis, and this DNA fragment was digested with BamHI. And then dephosphorylated; I phage vector EMBL 3 (Stratagene Cloning System) was ligated by T4 ligase. Using Gigapack II Gold Packagin Extract (Stratagene Clonin Systems), it was subjected to invitrono and 0 packaging, and the gene DNA line of chromosomal DNA was obtained. Build a library did .
  • a 4 kb Bg11I-HpaI fragment containing the STA1 gene was ligated between BamHI and Hincl of PUC19.
  • the plasmid pUSTAl (Fig. 23) was constructed.
  • Synthetic adapter including (SEQ ID NO: 21):
  • the STA1 gene was obtained as a 2.7 kb Xbal-Sail fragment by further partial digestion with Sa1I.
  • PUC12 is digested with PstI and HindII1, treated with T4DN'A polymerase, and added with Bg111 phosphorylation. Contains the STA1 gene between XbaI and Sa1I of the resulting plasmid PUC12Bg11I
  • the Bg1II fragment was excised and this was used as an expression vector.
  • the 4.9 kb N0tI gene comprising the PGKS gene A1 to the PGK gene promoter, the s ⁇ A1 gene, and the PGK gene terminator Yuichi. Cut out the fragment, insert this fragment into the plasmid, insert it into the N0tI site of PCLBS12, and place the plasmid KpCLSTA1 in the plasmid.
  • PCLRSTA1 was constructed respectively.
  • Transformation of the ATcc 9256 strain was carried out by the electric pulse method described in Example 11.
  • the pulse conditions are as follows: the capacitance is 25 F, the resistance is 0.000 ohm, the voltage is Or 6.25 KV / cm.
  • the glucoamylase activity of these transformants was measured.
  • the cells were cultured once in a YPD liquid medium, and the supernatant was used as a crude enzyme solution.
  • the reaction was carried out using a crude enzyme solution of 401 and a reaction solution of 501 containing 0.5% of soluble starch and 100 mM sodium acetate (H5.0). At 50. C, 20 minutes. After the reaction, the enzyme was inactivated by heat treatment at 100 ° C for 5 minutes, and the concentration of released glucose was measured using a commercially available kit (Gnorecoose B-Test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). )).
  • the glucoamylase activity was expressed as 1 unit when the amount of glucose released under the reaction conditions was as high as 100 ⁇ g.
  • the activity values per ml of the culture supernatant were as shown in Table 3.
  • Table 3 Characterized by plasmids p CL STA 1 and p C LR STA 1
  • Glucoamylase activity of transformed Candida utilis yeast Dalcoamylase activity (units / ml)
  • ATCC 9256 strain the secretion of glycocoamylase, a heterologous protein derived from Saccharomyces' Diastaticus. The Gnal sequence was recognized, and it was revealed that Dalcoamylase was secreted into the medium.
  • ATCC 995 transformed with B111-digested plasmid, pCLSTA1 or Af1I1'-digested plasmid pCLSTA1 0 shares by their respective two strains 4 0 ⁇ g Z m 1 of shea click b to key sheet mi de, and then cultured for 3 0 0 C 4 days in YPD liquid medium containing 5% grayed Le courses Was.
  • Example 18 Expression of a heterologous gene (1 acZ gene) in Candida utilis
  • a bacmid for expression of the 1acZ gene was constructed as shown in Figure 25.
  • the 1acZ gene encoding 9 galactosidase was cut out as a 3.1 kb B'amHI fragment. This fragment was transformed with B1 II of plasmid YE pl3K (S0neet.a 1.App 1.Environ.Microbiol. 54, 38-42 (1988)). The plasmid was ligated to the site, and the plasmid pZ4 of HindIII site was selected on the 5 'side of the gene.
  • the 1acZ gene having the initiation codon ATG was cut out as a 3.lkb Hindlll—Xhol fragment. This fragment was ligated between Hindlll and Xhol site of pBluescriptSK- to construct a plasmid pLACZl.
  • This plasmid was digested with Hindlll + XbaI, treated with Klenow, and recircularized to construct a plasmid pLACZ2.
  • the lacZ gene was excised from this plasmid as a 3.1 kb Xbal-Kpnl fragment, and this was excised from the plasmid pPGKPT5 (Fig. 4). ),
  • the plasmid pGKLACl was constructed, the pGKLAC1 power, the PGK gene promoter, and the lacZ gene were constructed.
  • LRLAC 1 was constructed for each.
  • B gl H-digested plasmid pCLRLAC1 or Af11-modified plasmid pCLLAC1 was used for the electric pulse method described in Example 11.
  • the ATCC 9950 strain was further transformed. Two strains of the transformed ATCC 9950 strain were placed in 5 ml of YPD liquid medium for 6 hours in the logarithmic growth phase (0D
  • ⁇ a lactosidase activity is M eth 0 dsin Y east Genetics-A laboratory C ourse Manu al-Rose M. D eta 1.P 155-159 Cold Spring H rbor Laboratory Press It was measured according to the method described in NY (1990). That is, after suspending the collected cells in a 1-m1 Z-buffer, add 3 drops of the mouth opening solution and 2 drops of 0.1% SDS. And vortexed for 10 seconds. After incubating at 28 ° C for 5 minutes, 0.2 ml of ONPG solution was added, followed by incubation for another 10 minutes. Later, 0.
  • Example 19 Expression of heterologous gene (APT gene) in Candida dutilis
  • a plasmid for APT gene expression was constructed as shown in Figure 26.
  • a transposon Tn903 a plasmid containing the aminoglycoside phosphotransferase (APT gene) derived from A 1.1 kb Xh0I-Pstl fragment was excised from pUC4K (Pharmacia) and inserted between Sac1I and PstI of PUC19.
  • the plasmid pAPH1 was constructed.
  • pAPH1 is digested with PstI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and Bglll linker (5 'CAGATCTG3') is inserted. Lasmid p APH 2 was constructed.
  • APT gene was excised from pAPH2 as a 1.1 kb XbaI-Bg111 fragment, and this fragment was expressed in the X vector of pPGKPT4 (Fig. 4).
  • a plasmid pGKAPHl was constructed by inserting it between the bal and BamHI sites.
  • a 3.3 kb Not I fragment containing the PGK gene promoter, the APT gene and the PGK gene terminator was cut from pGKAPHl. And insert it into the NotI site of the plasmid pCLBS12 to insert the plasmid pCLAPHl and the NotI of the plasmid pCLRE4. Plasmids p CLRAPHI were constructed by inserting them into the site, respectively.
  • Transformation was performed by the electric pulse method described in Example 11.
  • the pulse conditions were as follows: electric capacity of 25 / F, resistance of 100 ohms, and voltage of 3.75 KV / cm or 6.25 KVZ cm. .
  • the plasmid pCLAPH1 digested with Af11I was Transformation of the ATCC 9950 strain was performed and the expression of the gene integrated into the L41 gene locus was also examined. Proliferation of the transformant was confirmed in the same manner as in the ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4, and expression of the APT gene integrated into the L41 gene locus was also confirmed.
  • the retention rate of plasmid was determined for each of the YPD plate and the YPD plate containing kissmite in the 40 ⁇ g Zm1 After application, the cells were cultured at 30 ° C for 2 hours, and the number of colonies produced was examined.
  • Example 20 Obtaining Candida ducutilis transformant using G418 resistance as a selection marker
  • Plasmid p CLRAPHl is a mutant L41 gene that confers oximid resistance to cyclo as a transformant selection marker, and confers G418 resistance. Includes an APT message.
  • the experiment described in Example 19 confirmed that the APT gene was expressed by the PGK gene promoter. An attempt was made to make a direct selection based on tolerance.
  • the plasmid pCLRAPHl was eliminated with Bglll to make it linear.
  • the ATCC 9950 strain was transformed by the electric pulse method described in Example 11.
  • the pulse condition is that the capacitance is 25 ⁇ F and the resistance is 08-
  • the test was performed at 100 ohms or 800 ohms with a voltage of 5 KV / cm. After culturing the cells for 6 hours in a YPD medium containing 1 M sorbitol, a YPD plate containing kissimid is added to a 40 / g / m1 cycle mouth. Each of them was applied to a YPD plate containing G 418 of 150 i / g Z m 1, respectively.
  • a 1.8 kb BamHI-Hindill fragment (Fig. 12) containing the 321S-SB-modified L41 gene was used as a probe.
  • a southern analysis was performed (Fig. 27).
  • a 4.4 kb band derived from plasmid was observed.
  • the band intensity was measured, and the plasmid-derived band and endogenous L were measured. From the comparison of the bands of the 41 gene (23 cells // & TO cells), the number of copies of the incorporated plasmid was determined. In strains selected for their Nero and Shikiguchi kissmid resistance, the plasmid is from 4 (lane 2).
  • PGKAPH1 was digested with N0tI and divided into two fragments. That is, the PGK gene promoter,
  • the fragment containing the APT gene and the PGK gene terminator was divided into a fragment n and a vector fragment. After that, these It was used for transformation of ATCC 9950 strain.
  • the pulse condition is that the capacitance is 25 ⁇ F, the resistance is 100 ohms, and the voltage is
  • Example 17 The PGK gene promoter used in 7-20 was shortened, and the identification of the minimum functional region of the mouse was attempted.
  • Bam HI linker (5 ′ CCGGATCCGG 3 ′: SEQ ID NO: 22) was added, followed by digestion with Bam HI and Not I. As a result, one more fragment was obtained.
  • the plasmid p CRE 8 was constructed (Fig. 28).
  • the ATCC 9950 strain was transformed. Used for Transformation was performed by the electric pulse method described in Example 11. Pulse condition is electric capacity The amount was 25 / F, the resistance was 100 ohms, and the voltage was 5 KVZ cm.
  • Transformants were selected on a YPD plate containing G418 at 200 ⁇ g / ml.
  • the respective values are lg.
  • the fragment containing up to the Pstl site of 1669 bp 5 'upstream does not function as a promoter of transcription, while 40 Fragments containing up to and including the EcoRI site 1 bp upstream have been shown to function as transcriptional promoters.
  • the 94.6th EcoRI site from the ARI site It was clarified that the 401 bp sequence up to the 1st base of the previous base contains a sequence necessary for the function of the promoter. .
  • GAP Glyceraldehyde-3-Hydrogenate Dehydrogenase
  • Glycerol Anode Dehydrogenase of Candida utilis-Clonin of the gene for 3-hydroxyphosphate dehydrogenase (GAP)
  • Candida dutilis chromosome DNA library constructed in Example 2 as a gene library
  • the hybridization was performed using the gene as a probe.
  • a filter was prepared by adsorbing about 20,000 breakage of phage DNA.
  • a pUC plasmid containing a 2.1 kb Hindlll fragment containing the Saccharomyces cerevisiae GAP gene was prepared.
  • Yamano eta 1 -A flll fragment was cut out. This fragment was labeled with 32 P and used as a probe for a hybridisation reaction. As a result, three positive plaques could be separated. In addition, subcloning was performed on one of the phage DNAs of these plaques and was included in this phage DNA. A 5 kb EcoRI fragment was isolated and inserted into the EcoRI site of the plasmid vector pBluescriptll SK + to construct plasmids pGAPl and 2. ( Figure 29).
  • the isolated 6.5 kb Ec0RI fragment was digested with one or more of the restriction enzymes Hindlll, Clal, Smal, or Spel, and the resulting fragments were digested.
  • Plasmids pGAPH1 and pGAPH2 were prepared by incorporating pB1 uescrlpt IIKS + between the Hindlll site and the SpeI site, respectively. did .
  • generation of deletion mutants at restriction enzyme sites such as Hind11I, Clal, Smal, etc.
  • exonuclease By making continuous deletion mutants using 11I and Mung Bean nuclease, plasmids with various deletion mutations can be created. And generate 374 bp
  • Example 23 Construction of an expression vector using promoter and terminator of GAP gene
  • a DNA fragment containing a promoter and a terminator was obtained from the GAP gene regulatory region of Candida utilis by using the PCR method. (Fig. 29).
  • the plasmid pGAPl was used as a type, and the start code was obtained from the Hind111 site located 975 bp upstream of the start code. Fragments up to just before Don ATG were obtained. As a primer,.
  • Two of 5′-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3 ′ (SEQ ID NO: 24) were used, and were synthesized by designing with an XbaI site immediately before the 3 ′ downstream start codon.
  • the plasmid pGAPl was transformed into a type I, and the fragment from immediately after the termination codon to the SpeI site was obtained.
  • 5 "-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3" SEQ ID NO: 25
  • 5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3 '(SEQ ID NO: 26) was used, and the BamHI site was designed and synthesized immediately after the 5'-side termination codon.
  • the PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
  • the PCR-produced promoter fragment was digested with Hindlll and Xbal, and the pUC19 vector was digested.
  • the plasmid (5 'AGCGGCCGCT 3' : sequence number: 18) was linked to construct a plasmid pUGterN.
  • a 0.95 kb GAP promoter fragment from plasmid pUGpro was cut out with Hindlll and XbaI, and plasmid plasmid pUGterN was isolated. Inserted between the Hind I1I site and the XbaI site of A plasmid p GAPPT l was constructed.
  • the constructed plasmid pGAPAPHl was digested with NotI, and then used for transformation of ATCC 9950 strain. Transformation was carried out by the electric pulse method under the pulse conditions of an electric capacity of 25 / F, a resistance value of 100 ohms, and a voltage of 5 KVZcm. Transformants were selected on a YPD plate containing 200 ⁇ g Z m'l of G418 and about 40 transformants were used using 0.1 ⁇ g of DNA. I got my body. As a result, it was confirmed that the promoter and the terminal of the GAP gene functioned.
  • Example 24 Cloning of the plasma membrane protein ATPase (PMA) gene and sequencing of the DNA fragment containing the PMA gene Plasma membrane protons of Candida * utilis
  • the other three fragments (10 kb, 4 kb, and 10 kb) cut out from the same phage DNA fragment with XbaI were used.
  • 2.8 kb) were subcloned, and both ends were subjected to sequencing, and the PMA1 of Saccharomyces cerevisiae was sequenced.
  • the mouth mouth with the 3 'side region of the gene was examined. It was shown that, on one side of the 2.8 kb XbaI fragment, there was a region showing the 3 'end of the PMA1 gene and a high homologous region.
  • This XbaI fragment is incorporated into the XbaI site of the plasmid vector-pBluescript IISK +, and the insert direction is opposite to that of the plasmid.
  • pPMAL1 and PPMAL2 were generated (Fig. 33).
  • deletion mutants were prepared by digestion with KpnI, and Various deletion mutations can be created by creating 'deletion mutants using S. nuclease 111 and Mungbean nuclease'.
  • a plasmid was prepared, and the 1.9 kb nucleotide sequence from the XbaI site to the KpnI site was determined (FIG. 33).
  • This nucleotide sequence includes the Saccharomyces cerevisiae PMA1 gene from the + 2041st gene to the + 2757th gene (start code).
  • the A of the ATG is assumed to be +1) and an open reading frame of 717 bp showing about 82% homology and a termination codon TAA 1 188 bp of the 3 'downstream of the DNA.
  • the 11888 bp sequence from immediately after the termination codon TAA presumed to contain a transcription terminator to the KpnI site is shown in Figure 35. It was.
  • a DNA fragment containing a promoter or a terminator from the PMA gene control region of Candida * utilis was subjected to PCR.
  • a promoter the plasmid pPMAFl was used as a ⁇ type from the position 20 bp downstream of the XbaI site. The fragment up to just before the start code ATG was obtained.
  • a primer As a primer,
  • the plasmid pPMALl is type II, and the fragment from the stop codon TAA immediately to the stop codon 400 bp downstream is obtained. did.
  • 5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3 '' SEQ ID NO: 31
  • the PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
  • the promoter fragment synthesized by PCR was digested with NotI and Xbal, and the fragment was inserted between the NotI site and the XbaI site of pBluescriptll SK + vector.
  • the term overnight fragment was inserted between the KpnI site and the NotI site of pB1uescripiptlsk + to construct a plasmid pBMTer.
  • Plasmid p UM19N was inserted between Kpnl site and Notl site to construct a plasmid pUMter (Fig. 36).
  • Plasmid p MAPH1 was constructed by incorporating pPGKPT5 into a 2.9 kb fragment ⁇ obtained by digestion with N0tI (Fig. 36).
  • the constructed plasmid pMAAP ⁇ 1 was digested with N0tI and then used for transformation of ATCC9950 strain. Transformation was performed by the electric pulse method under the pulse conditions of XM. 25 ⁇ F, a resistance value of 1000 ohms, and a voltage of 5 KVZcm.
  • Transformants were selected on a YPD plate containing 200 g Zml of G418, using 0.1 lg DNA. About 40 transformants were obtained. This confirms that the PMA transmitter and terminator are functional.
  • Example 26 Cloning of a DNA fragment containing a sequence with autonomous duplication (ARS)
  • pB1uesC C1 PSK-(Stratagene) ONotI site to construct plasmid pGKAPH2 (Fig. 37) o Digestion after digestion with BamHI
  • the phosphorylated plasmid pGKAPH2, 200 ng, and the 3-7 kb of the candidate lysate ATCC 9950 obtained in Example 2 were compared.
  • 200 ng of the Sau3AI partial digestion fragment of the genomic DNA was ligated with T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli DH5 was transformed, and a plasmid DNA mixture was extracted from about 300,000 transformants obtained, and a chromosomal DNA mixture was extracted. I made a library.
  • the ATCC 9950 strain was tried to be transformed by the electropulse method described in Example 11.
  • the pulse condition is a capacitance of 25 // F, a resistance of 800 ohm or 100 ohm and a voltage of 3.75 KV cm or 5 KVZ cm. Then 25 one
  • these plasmids p CARS 5, p CARS 6 and p CARS 7 are Not I ligated and recircularized with T4 DNA ligase.
  • the insert length of the three newly obtained plasmids was determined by digestion with various restriction enzymes, the insert length was determined. However, since each of them was about 5-6 kb, we decided to further limit the region having autonomous replication function.
  • p CARS 50 and p CARS 60 and p CARS 70 were each partially digested with Sau3AI, and a fragment of 113.5 kb in size was recovered. After digestion with BamHI, ligation was performed with the dephosphorylated plasmid pGKAPH2 and T4 DNA ligase. Using these three types of DNA solutions, large Ma ⁇ DH5 was transformed, and 2,500--6,000 transformants obtained from each were used. A plasmid DNA mixture was extracted to prepare a DNA library./ Using 5 g of each of these DNAs, the DNA was re-used by the electric panoretic method described in Example 11 Transformation of ATCC 9950 strain yielded G418 resistant transformants
  • the resulting G418 resistant colonies were of various magnitudes and strengths, but were relatively large for the three libraries.
  • Five strains, each of which formed a colony, were cultured in a YPD medium containing 200 cells. Total DNA was prepared from the obtained cells, and E. coli DH5 was transformed. Escherichia coli transformants could not be obtained for some G418 resistant strains.
  • the electric pulse method described in Example 11 was repeated to re-use the electric pulse method. When the ATCC 9950 strain was transformed, some of these were compared to the original plasmid, do CARDS 5, PCARS 6 and p CARS 7. The transformation frequency was so low that it was excluded.
  • both p CARS 50 and p CARS 60 and p CARS 70 contain truncated DNA fragments and have a transformation frequency similar to that of the parent plasmid.
  • One type of plasmid was obtained, and the plasmid derived from PCARS 50 was designated as p CARS 52 and the plasmid derived from p CARS 60 was designated as p CARS 6-2.
  • the plasmid derived from PCARS70 was designated as pCAR7-2. Restriction enzyme maps of the chromosomal DNA fragments containing sequences with autonomous replication functions in the obtained six types of plasmids were as shown in Figure 38.
  • plasmids three types of plasmids, PCARS 5-2, p CARS 6-2, and p CAR 7-2, with shortened chromosomal DNA fragments, were used.
  • a plasmid in which the inserted DNA fragment was further shortened was constructed, and the frequency of transformation was examined (Example 28).
  • the Bg111 site of PCARS5 in Fig. 38 was determined.
  • Approximately 700 bp of the region on the left side showed 90% or more homology with approximately 70 Obp of the region on the left side of the Ec0RI site of p CARS 6-2.
  • Example 28 Shortening of pNARS6 and PCARS7-inserted DNA fragments, transformation frequency and plasmid stability
  • the 3 ⁇ 4au3AI partially digested DNA fragment cloned into plasmid pCARS6—2 is approximately 1.9 kb.
  • the 3.3 kb N0tI fragment containing the APT gene expression cassette was removed from PCARS 6-2 to construct p CARS 6-20.
  • the ends are blunted with Klenow enzyme, recircularized with T4 DNA ligase, and purified.
  • the construction of p CARS 6-210 was carried out. In this plus, The Ec0RI site in the open motor fragment of the plasmid pGKAPHl constructed in Example 19 was smoothed by Klenow enzyme treatment, and After Not I Linker
  • the obtained G418 resistant colony was inoculated into 4 ml of YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C for 8 hours. afterwards
  • the bacteria were applied to the YPD plate containing the YPD plate G418, respectively, and the number of colonies generated two days later was compared. The retention rate of the smid was calculated, and the results are shown in Table 8 below. During this time, the bacteria are 2.5-
  • p CARS 61-2 and p CARS 6-22 which are plasmids obtained by shortening the DNA fragment from the left and right sides respectively, are p Although comparable to CARS 612, both were shown to greatly reduce the frequency of transformation.o In addition, the inserted DNA fragment was shortened to 0.6 kbp. With reduced CARS 6-23, the frequency of transformation was further reduced to less than 50-fold less than PCARS6. These results indicate that CUARS 1 containing p CARS 6 is shorter than the approximately 1.9 kb long DNA fragment of p CARS 6-2. It was suggested that it was difficult to do so.
  • a plasmid pCARS720 from which a 3.3 kb N0tI fragment containing an APT gene expression cassette was removed was constructed from PCARS7-2. After digesting this PCARS 7 — 20 with XbaI, recircularization was performed with T4 DNA ligase, followed by a Not containing a 2.3 kb APT gene expression cassette. PCARS74 was constructed by ligating the I fragments.
  • Ec0RV-Hind1I1 fragment about 1.3 kb XbaI-I HindIII fragment, and about 1.8 kb Hind
  • the Bg111 fragments were cut out and Eco RV and Hindm, xbaI and Hind111, respectively. 34 one
  • Example 11 Using each of the constructed plasmids, a transformation experiment of the ATCC 9950 strain was performed by the electric pulse method described in Example 11. The pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 F, the resistance value was 100 ohms, the voltage was 5 KV / cm, and the DNA was used for l "g. The culture was performed for 4 hours, and the results are shown in Table 9.
  • Plasmid Colony Number (%) Plasmid% p CARS 7 1833 (100) p CARS 7 23.0 p CARS 7-2 1273 (69) p CARS 7-2 34.9 p CARS 7-4 0 (0) p CARS 7-6 18.6 p CARS 7-6 598 (33) p CARS 7-7 11.4 p CARS 7-7 * 280 (15) p CARS 7-8 7.0 p CARS 7-8 5 ( 0.2) Note) The number of generations is between 2.5 and 3.5 generations Note 1) The value is the average of two transformation experiments c
  • the frequency of transformation with p CARS 7-2 or p CARS 76 was approximately 70%, respectively, compared to that of p CARS 7 % And about 30%. However, it was shown that the stability was not so degraded. In addition, p CARS 177, whose DNA fragment was shortened, showed a transformation frequency of about one-half that of p CARS 7-6, but the resulting colony. ⁇ was very small and had poor stability (Table 9). On the other hand, the frequency of p CARS 7-8 was low, and that of PCARS 74-14 was that no 'transformant' was obtained. The transformation frequency of CUARS 2 contained in p CARS 7 is slightly reduced, but it can be shortened to 1.8 kb of p CARS 7-6. It was shown.
  • Saccharomyces yeast ARS functions at about 200 bp (New Ion, C. R and T Heis, J. Current 0 pinionin Geneticsand Deve 1 oient ⁇ ). 993 3, 752-758), which is an interesting feature.
  • Example 29 Base sequence determination and Southern analysis of a DNA fragment containing a sequence having an autonomous replication function of PCARS 6-2 and pCARS 7-6
  • plasmids having various deletion mutations were prepared and their nucleotide sequences were determined.
  • the determined nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of PCARS 6-2 is shown in Figs. 41 and 42, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of CARS 7-2 is shown in Figs. 43 and 44. It was.
  • the inserted DNA fragment of PCARS 6-2 had a size of 1921 bp and was capable of binding to all A + T bases. The rate at which it was added was 69.5%, and the insertion of p CARS 72
  • the DNA fragment had a power of 178 bP, and the ratio of all the bases in the A + to 70.8% was 70.8%.
  • the Southern analysis for calculating the number of PGK gene copies was performed using the plasmid described in Example 18 and PCLLAC 1 as the PGK program. After digestion with the SphI site in the mouth motor, the ATCC 9950 and 2 strains transformed with this plasmid were compared with the parental strain. Then, the DNA prepared in 13 ⁇ 4 was obtained. Sail + N0tI 0.4 kb Ec0RI-X containing PGK promoter cut out from PGKPT4 described in Example 4 for DNA digested with digestion A 3.2 kb band derived from the endogenous PGK gene was observed in the tj containing the baI fragment as a probe and in the parent strain ATCC 9950 (Fig.
  • This 3.2 kb band is used for the strain incorporating pCLLAC1 digested with 5 ph I site in the PGK promoter.
  • a 5.4 kb band generated by N0tI digestion from a plasmid integrated into multiple tandems and a PGK gene on the chromosome Two 6.4 kb and 2.1 kb bands, one of the offspring resulting from the insertion of the plasmid, were detected.
  • 2 and 3 are 6.4 kb and 2.1 kb, and the two bands are N 0 t I site in the plasmid molecule located at both ends of the inserted plasmid molecule and S a 1 I site in the PGK gene region This indicated that the plasmid molecule was integrated into the PGK locus by homologous recombination.
  • the DNA of ATCC 9950 strain transformed with PcARS6 and PCARS7 is digested with Ec0RV + N0tI and cut out from pGKPT4 described in Example 4. Southern analysis was carried out using a 0.9 kb XbaI-N0tI fragment containing PGK evening mineral as a probe. The result was as shown in Figure 45-1.
  • a band of about 7 kb derived from the endogenous PGK gene was observed (Fig. 45-3).
  • a band of about 7 kb was detected.
  • a 3.3 kb band derived from plasmid was observed.
  • ARSs are derived from chromosomal DNA.
  • a pulse field was used to determine whether these ARSs are derived from chromosomal DNA. Southern analysis was performed on Candida utililis chromosomal DNA separated by gel electrophoresis. Although the DNA of ATCC '9905 strain was divided into seven lines, CUARS 1 is located on the sixth chromosome, and CUARS 2 is located on the third chromosome. And that the cloned ARS is chromosome-derived.
  • pCARS5 The inserted DNA fragment of pCARS5 was shown to be located on the sixth chromosome as in CUARSI. As suggested by the sequence analysis described in Example 27, these ARS cloned into p CARS 5 and p CARS 6 were derived from homologous chromosomes. O support the possibility of
  • Example 30 Cloning of a DNA fragment having promoter activity using ARS
  • plasmid PCARS 6-20 constructed in Example 28 Based on the plasmid PCARS 6-20 constructed in Example 28, a DNA containing a sequence capable of autonomous replication was converted into a 1.9 kb SacI-SmaI fragment. Cut out. This fragment was smoothed by Ec0RI site treatment with Klenow enzyme. After that, the plasmid was ligated with SacI-digested plasmid pAPH1 (Example 19) ′ to construct plasmid pPCVl. Subsequently, pPCVl was digested with BamHI and blunted by Klenow enzyme treatment, followed by HpaI linker.
  • Chromosome DNA of Candida utilis ATCC 9950 is restricted to the restriction enzymes Rsal, Hae111 and
  • Partial digestion was performed simultaneously with A1uI. Thereafter, the DNA fragment was fractionated by electrophoresis on a 1% agarose gel, and a fragment having a length of 0.9 to 1.8 kb was recovered. This partially digested DNA fragment was ligated to a plasmid pPCV2 digested with HpaI and dephosphorylated by T4 DNA ligase. Using this DNA solution, Escherichia coli DH5 is transformed, and a plasmid DNA mixture is extracted from about 100,000 transformants obtained. A chromosomal DNA library was prepared. Using the DNA prepared from this library, transformation of the ATCC 9950 strain was attempted by the electric pulse method described in Example 11.
  • the pulse conditions are a capacitance of 25 iF, a resistance value of 100 ohms, a voltage of 5 KVZ cm, and a DNA pulse of 20-25 ⁇ g per pulse. It was done using.
  • Transformant selection Performed on a YPD plate containing 200 g / 1 G418, and repeated the transformation test, using a total of 280 // g DNA to achieve a total of 3 Of the 84 transformants from which 80 transformants were obtained, 1 mg / ml of G41 was used for 84 strains that formed relatively large colonies. Growth on YPD plates containing 8 was examined. One of the well-grown strains was cultured in YPD medium containing 1 mg / ml of G418, and the total DNA was prepared from the cells, and Escherichia coli DH5 was transformed. Was.
  • PPCV33 and pPCV78, and pPCV14, pPCV51, and pPCV55 each contain the same DNA fragment. This clearly showed that nine types of DNA fragments having promoter activities were finally cloned.
  • the D-cell was cultured once in 5 ml of YPD liquid medium, and then made into a single colony on the YPD plate.
  • Each of the 20 coons was made up of 10 co-alphas, including G4 18 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ The retention rate of the metal was checked. As a result, the retention rate of plasmid of PCARS 6-2 was 5%, while the retention rate of all other plasmides was higher than that of PCARS 6-2. In particular, the plasmid p PCV 1 p PCV 19 and p PCV 64 have a plasmid retention rate of 80-
  • DNA fragment containing the obtained sequence with promoter activity has a function to enhance the stability of plasmid.
  • the inserted 0 ⁇ -eight fragment of plasmid p? EX 0 1 1 1 Nucleus was prepared by a method of making deletion mutations using the enzyme and Mung Bean nuclease b. The nucleotide sequence was determined. The determined base sequence of the inserted DNA fragment of pPCV19 consisting of 104 bp was as shown in FIG.
  • Example 31 1 Construction of a Brasmid for Expression of High Glomycin B Resistance Gene and Selection of Co-transformant of Yeast Using It
  • the (HPT) gene is a plasmid pBIB-HYG
  • the plasmid PAHG1 was used to confirm whether the cassette was functional.
  • the ATCC 9950 strain was transformed by the electric pulse method described in Example 11. Transformants selected for G418 resistance were cultured in YPD liquid medium containing 200, 400, and 800 g / m1 of Higmouth Mycin B. It was shown that the wild strain that grew but was used as a control did not grow in any medium and showed high mouth mycin B properties.
  • the plasmid pGKHPT1 was digested with N0tI to obtain the PGK gene promoter, the H ⁇ gene, and the P'GK gene. After separating into a fragment containing ⁇ and a vector fragment, the fragment was used for transformation of ATCC 9950 strain. Transformation was performed by the electropulse method described in Example 11, and transformants were selected by using a YPD plate containing 800 g / m1 of high-opening meincin B. I went in. as a result,
  • the plasmid containing ARS obtained in Example 30 (0.1 ⁇ g of pPCV64), NotI-digested PGK gene promoter, HPT gene, and the like. Then, a mixture of a plasmid containing the PGK gene and a fragment containing the same and a vector fragment, p PGKHPT1; 1 g; The ATCC 9950 strain was used for transformation by the electric pulse method described in Example 11.
  • the pulse conditions were a capacitance of 25 F, a resistance of 600 000 or 100 ohms, and a voltage of 3.75 KV / cm or 5 KV cm. Then, two kinds of DNA mixtures were performed under six different conditions. Transformants were selected on a YPD plate containing 200 ⁇ g / m1 of G418, under conditions that were specific to 0.1 ⁇ g of pPCV64 DNA. Approximately 2,000 to 700,000 transformants were obtained. A YPD plate containing 8 g / m 1 of digging machine was used to obtain 200 000 G418 resistant cells obtained under the respective conditions.
  • the base sequence outside the 5 'end of the PGK gene promoter fragment used for HPT gene expression was synthesized based on the sequence.
  • Primer 1 5 'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' (SEQ ID NO: 35) and synthesized based on the sequence within the HPT gene.
  • Primer 2 5 'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' (SEQ ID NO: 36) and was synthesized based on the sequence in the terminal fragment of the PGK gene used.
  • Primer 3 5 'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' (SEQ ID NO: 37) Total of three types of primers were used.
  • Figure 50 is an electropherogram of the PCR reaction product using Primer 1 and Primer 13. From these results, it can be seen that all samples were used. Intrinsic
  • Sequence type nucleic acid
  • Genomi cDNA Name Candida utilis (Cand i da ut i li s)
  • CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAACAAATAA CGGGATTATA TGTCAATATC ATTATGATTA 60 TTTAGGAAAA CATGTAGACC TTACCCGATG CACCTCCACC AACAAGCCAA TTCTGGGTGG 120 GATGGAAGTT ACACACTGCT GGTACGTTGG TCACCAGTGG GTTTGACAAA TGTGCCAGCT 180 GATGACCATC TCGGTCGTAG ACGTCAAAGT ACTTGTTCAT ATTGGCAATG ACAAACTTTT 240 CTTTATCCGG GGTATATTGC TGCCACCTTG CCTTCAAAAT GGATACCCAT CTTCCCGTTT 300 GACAGTTGTGTGATACGA TGACTTGGGG TCAAATCACC TTCAATAGCG AAGTTCTTAG 360 GTTTAGTGCT GATGTCCTCA CCAAGATTGA AGATGTTAAC TGTGTCATCG TAACCGTTAC 420 AAACAAGGTC ACCAGATCTA TTCCAATCCA CGATGG
  • Sequence type nucleic acid
  • AAGCTTTTGT CTTTTAGGAG CCTTCTTTTC ACCCTGGCTT TCTTCAGACT CCACGCCTCT 60 CGCCCGTTTG TTGTTGATCT TCTTCTGTTG CTTCTTCGTG AGCTTACCAG TATCCAGATG 120 CGTTGTCAGG GCAAGAGGGT CATGTTCAAG CTCCTCTTTC ACTTTCAGTC CAATACGTTT 180 CCAGGCAGGG ATGTGTTCGC TCATCGTTCC AGACTCGAGT GGTGAAAACT.
  • Sequence type nucleic acid
  • GGT ATC GTC AAG GGG TTG AAG GAG GCT GCA CAG GAA ACC ACG GAT GAG 1690
  • Gly lie Yal Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gin Glu Thr Thr Asp Glu
  • Glu Asp Gly Phe Asp Trp lie He Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp
  • na is ⁇ ⁇ ID si ja ⁇ 3S ns njg B
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • AAATTTCATT ACTCAGAAAT GAATATACTT GAAACTTCCG AAATACTATG TTATGGGGAA 900 CAAATAAGAG GAGCCATTTC ATATTTATTT TGGAAAGATC GTTTTCTATG CGCAGTTGTT 960
  • TTGTCTATAC GATTGATAAG GTGAAACTTA GATAAACAAT GAAAAAGGAA GGTGCTTTGA 1260
  • AAACCGACCA GCTTCAAATA AATATGTAAC TATTTTTATG GATGTGAAAA TTAAATGTTG 1320
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

Abstract

A reproducible transformant line of a Candida utilis yeast; a method of expressing a heterogene in the above line; a vector utilizable in the above line and method of expression; and a novel DNA group. The method of expressing a heterogene in a Candida utilis yeast comprises transforming Candida utilis with a vector containing a drug-resistant marker, a sequence homologous with that of a chromosomal (DNA) of a Candida utilis yeast and a heterogene, culturing the resultant transformant, and isolating the product of expression of the heterogene.

Description

明 柳 書 キ ヤ ン デ ィ ダ ュ テ ィ リ ス酵母の形質転換系お よ び そ れ に よ る 異種遺伝子の発現  Akirayanagi, Transformation system of Candida dutilis yeast and expression of heterologous genes by the system
[発明 の背景 ] [Background of the Invention]
発明の分野  Field of the invention
本発明 は、 キ ヤ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス に 関す る 再現性 の あ る 形質転換系 に 関 し 、 よ り 具体的 に は、 組換え D N The present invention relates to a reproducible transformation system for Candida utilis, and more specifically to a recombinant DN
A に よ る 酵母キ ヤ ン デ イ ダ * ュテ ィ リ ス の形質転換、 お よ び そ の 結果得 ら れた新規な形質転換体 に お け る 異種遺 伝子の発現 に 関す る 。 ま た、 本発明 は、 形質転換 に お い て選択マ 一 力 一遣伝子 と し て利用可能な新規 D N A 配列 異種遺伝子の発現の た め の プ ロ モ ー タ ー 、 お よ び 夕 ー ミ ネ ー タ ー と し て利用可能な新規 D N A 配列 に も 関す る 。 さ ら に 、 本発明 は、 酵母染色体への異種遺伝子の 効率的 な組み込み法 に も 関す る 。 A relates to the transformation of yeast Candida utilis by A and the expression of the heterologous gene in the resulting novel transformant. Also, the present invention provides a promoter, and a promoter for the expression of a heterologous gene having a novel DNA sequence which can be used as a selection force gene in transformation. It also relates to a novel DNA sequence that can be used as a minor. Furthermore, the present invention also relates to a method for efficiently integrating a heterologous gene into a yeast chromosome.
.ま た、 さ ら に本発明 は キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お い て 自 律複製機能を有 し 、 形質転換効率を上 げ る 機能を 持つ D N A 断片、 お よ びそ れを利用 し た、 選択マ ー カ ー 遺伝子を含ま な い D N A 断片を染色体 に組み込む方法、 な ら び に プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配列の取得法 に も 関す る o 背景技術 In addition, the present invention relates to a DNA fragment, which has an autonomous replication function in a Candida utilis, and has a function to increase the transformation efficiency, and It also relates to a method for integrating a DNA fragment that does not contain a selection marker gene into a chromosome, and a method for obtaining a DNA sequence having promoter activity using the same.o Background art
遺伝子組換え技術の 発展 は、 微生物を利用 し て有用 な 蛋 白質を大量に製造す る こ と を可能 に し て き た。 こ の た め の 宿主 と し て大腸菌や枯草菌な ど の 原核生物の系 は簡 便で あ り 、 特 に大腸菌 は最 も 頻繁 に 利用 さ れ る 宿主であ る 。 し か し 、 大腸菌で生産 さ れ る 蛋 白 質 は不溶性 と な る こ と が多 く 、 ま た分泌 さ せ て も 糖鎖付加を受 け な い な ど の制約か ら 、 多様な ニ ー ズを十分 に 満足す る も の で は な い。 ま た、 生産 さ れた有用 蛋 白 質を 医薬品 と し て用 い る 場合 に は、 大腸菌の生産す る 発熱性毒性因子の 除去が問 題 と な る 。  Advances in genetic recombination technology have made it possible to produce useful proteins in large quantities using microorganisms. Prokaryotic systems, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, are convenient hosts for this purpose, and Escherichia coli is particularly the most frequently used host. However, proteins produced in Escherichia coli are often insoluble and, even when secreted, they do not receive glycosylation. It is not enough to satisfy the needs. In addition, when the produced useful protein is used as a pharmaceutical, removal of the pyrogenic toxic factor produced by Escherichia coli becomes a problem.
こ れ ら 原核生物の 系 に対 し て、 真核生物で あ る 酵母を 組換え D N A に よ る 有用 蛋 白 質生産 の 宿主 と し て使用す る こ と は以下の点で魅力的で あ る 。 ま ず、 酵母の う ち サ ッ カ ロ マ イ セ ス 属酵母 は古 く か ら 酒類な ど発酵性食品の 生産 に 利用 さ れて き て お り 、 ま た キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母 は食飼料用 に生産 さ れて い る こ と か ら 、 こ れ ら の酵母 につ い て は安全性が高 い こ と が知 ら れて い る 。 さ ら に 、 酵母 は一般 に細菌 よ り も 高 い細胞密度で培養す る こ と がで き 、 かつ連続培養 も 可能で あ る 。 ま た、 酵母 は 蛋 白 質を培地中 に 分泌 し 、 分泌 さ れた 蛋 白 質 は糖鎖 に よ る 修飾を受 け る 。 こ の た め、 酵母 に よ る 蛋 白 質の生産 は こ の よ う な 修飾が生物活性 に 重要で あ る 場合 に 価値があ る o 酵母の う ち 、 今 日 ま で最 も 良 く 研究 さ れて遣伝学的知 見が蓄積 し て い る 酵母 に は サ ッ カ ロ マ イ セ ス属酵母があ り 、 こ の酵母 は種々 の物質生産の宿主 と し て検討がな さ れて い る 。 ま た、 近年ゝ サ ッ カ ロ マ イ セ ス属酵母以外の 酵母 と し て ピキ ア 属酵母、 ハ ン セ ヌ ラ 属酵母、 ク ル イ べ ロ マ イ セ ス属酵母、 キ ヤ ン デ イ ダ属酵母な ど い く つ 力、の 種 につ い て、 そ れ ら を形質転換す る 手法が開発 さ れ、 有 用物質生産の 宿主 と し て検討 さ れて い る 0 こ の う ち 、 キ ヤ ン デ イ ダ属酵母 は、 特 に 、 炭素資化域が広い な ど、 サ ッ カ □ セ ス 属酵母 に な い特性を有 し 実用上有利で あ る こ の こ と か ら 、 キ ャ ン デ イ ダ属酵母 は組換え D N A に よ る 有用 物質の生産 に と つ て そ の利用 が期待 さ れ る The use of eukaryotic yeast as a host for production of useful proteins by recombinant DNA is attractive to these prokaryotic systems in the following points. . First, yeast of the genus Saccharomyces belonging to the genus Saccharomyces has long been used for the production of fermentable foods such as alcoholic beverages. Since Tilis yeast is produced for feed, it is known that these yeasts are highly safe. In addition, yeast can generally be cultured at a higher cell density than bacteria, and continuous culture is also possible. Yeast also secretes proteins into the medium, and the secreted proteins are modified by sugar chains. Therefore, production of proteins by yeast is valuable when such modifications are important for biological activity o Among the yeasts, yeasts of the genus Saccharomyces that have been best studied and accumulated diagnosed knowledge to date are the yeasts belonging to the genus Saccharomyces. It is being studied as a host for the production of various substances. In recent years, yeasts other than Saccharomyces spp. Include yeasts of the genus Pichia, Hansenula, Cryveromyces, and Cande. Methods have been developed for transforming species such as yeast of the genus Ida, which have been studied as hosts for the production of useful substances. Among them, the yeasts belonging to the genus Cyandaida have characteristics that are not practically the same as those of the yeast belonging to the genus Saccharus, such as a wide carbon assimilation zone, and are practically advantageous. Therefore, the use of yeast of the genus Candida is expected for the production of useful substances from recombinant DNA.
キ ャ ン デ ィ ダ属酵母の な かで も キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス （ C a n d i d a u t i 1 i s ) は、 キ シ ロ ー ス を始め と す る ペ ン ト ー ス に対す る 優れた資化性を示す。 ま たゝ サ ッ カ ロ マ イ セ ス酵母 と 異な り 、 好気的条件下で の培養でェ タ ノ 一 ルを生成せず、 そ れ に よ る 增殖阻害 も 受 け な い こ と か ら 高.密度での連続培養 に よ る 効率的 な 菌体製造が可能で あ る 。 従 っ て、 かっ て蛋 白質源 と し て注 目 さ れ、 ぺ ン ト 一 ス を多 く 含む広葉樹の 糖化液ャ亜硫酸パ ル プ廃液を糖源 と し た菌体の工業生産が実施 さ れた こ と があ る 。 ま た、 こ の酵母 は ア メ リ カ F D A ( F o o d a n d D r u g  Among the yeasts belonging to the genus Candida, Candida utilis (C andidauti 1 is) is one of the most important yeasts against pentoses including xylose. Demonstrates excellent assimilation. Also, unlike Saccharomyces yeast, it does not produce ethanol when cultured under aerobic conditions and is not susceptible to growth inhibition due to it. Therefore, efficient cell production by continuous culture at high density is possible. Therefore, industrial production of cells using sugar sulphate pulp waste liquid, a saccharified liquor from broadleaf trees, which has received much attention as a protein source and contains a large amount of paint, has been implemented. There have been times. In addition, this yeast was prepared by the American FDA (Food dand Drug).
A d m i n i s t r a t ί 0 n ) に よ り 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス • フ ラ ジ リ ス と と ち に、 食品添加 物 と し て安全 に使用 で き る 酵母 と し て認め ら れて い る 。 実際 に キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス は現在で も ド イ ツ を始 め と し て ア メ リ カ や 台湾、 ブ ラ ジ ルな ど世界各国で生産 さ れ、 食飼料 と し て使用 さ れて お り 、 安全性 につ い て は すで に確認 さ れて い る と い え る 。 A dministrat ί 0 n) according to Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, It is recognized as a yeast that can be used safely as a product. In fact, Canadian Dutilis is still produced in Germany and other parts of the world, such as the United States, Taiwan, Brazil, etc. It is said that its safety has already been confirmed.
以上の よ う な微生物蛋白 質 と し て の利用以外に も 、 キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス は 、 ペ ン ト ー ス ゃ キ シ ロ ー ス の 発酵株、 ェ チ ル ア セ テ ー ト 、 L 一 グル タ ミ ン 、 グル タ チ オ ン、 イ ン ベル タ ー ゼ等の生産株 と し て広 く 産業界で利 用 さ れて き た。  In addition to the use as a microbial protein as described above, Candida dutilis is a fermented strain of pentoxylose, an ethyl acetate. It has been widely used in industry as a producer of acetate, glutamin, glutathione, invertase, etc.
し か し な が ら 、 今 日 ま で こ の よ う に有用 な キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換 に成功 し 、 そ れを証明 し た報 告 は な い。 こ れ は、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス が 2 倍体 以上の 倍数体であ り 、 従来の ニ ト ロ ソ グ ァ 二 ジ ン ゃ ェ チ ル メ タ ン ス ル ホ ン 酸な どの変異源を用 い た突然変異誘起 処理 に よ つ て適当 な 栄養要求性な どの選択符号が付加 さ れた変異株の取得が著 し く 困難で あ っ た こ と に よ る 、 と 考え ら れ る 。 こ の こ と は、 過去 に お い て キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の A D E 1 や L E U 2 な ど、 他の 酵母で形質 転換の選択マ ー カ ー と し て頻繁 に 使用 さ れ る 遺伝子が取 得 さ れな 力く ら （西矢 ら 、 特開平 4 一 6 6 0 8 9 号公報、 小林 ら 、 特公平 1 一 4 2 6 7 3 号公報） 、 対応す る 遺伝 子 に変異を も つ キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 宿主株が得 ら れた と い う 報告が現在 ま で な か っ た こ と か ら も 推察す る こ と がで き る 。 すな わ ち 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に は、 栄養要求性株を宿主 と し てそ の栄養要求性を相補す る 遣伝子を導入 し形質転換体を直接選択す る と い う 、 従 来 よ り 各種酵母に お け る 形質転換系 の 開発 に用 い ら れて き た手法の適用 がで き な か っ た の で あ る 。 However, to date, no report has proven and successfully demonstrated the transformation of such a useful Candida utilis. This means that if the Candida dutilis is a diploid or more than two diploids, the conventional nitroso dimethyl methacrylate sulfone It was extremely difficult to obtain mutants to which a selection code such as appropriate auxotrophy was added by mutagenesis treatment using a mutagen such as an acid. it is conceivable that . This has been frequently used in the past as a selection marker for transformation in other yeasts, such as the ADE1 and LEU2 of Candida utilis. The gene from which the gene to be obtained cannot be obtained (Nishiya et al., Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-66089, Kobayashi et al., Japanese Patent Publication No. Hei 14-24673), the corresponding gene This is inferred from the fact that no report has been obtained on a Candida utilis host strain with a mutation in be able to . In other words, in a Candida utilis, an auxotrophic strain is used as a host, a gene that complements the auxotrophy is introduced, and a transformant is directly selected. In other words, the techniques conventionally used for the development of transformation systems for various yeasts could not be applied.
さ ら に、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス は、 そ の倍数性が 高 く 、 胞子形成 し な い た め遣伝学的特性が未だ十分 に 明 ら か に さ れて い な い。 そ の た め、 形質転換条件、 さ ら に はベ ク タ ー系が満たすべ き 条件 も 不明で あ り 、 そ の 宿主 /ベ ク タ ー系 の確立 も 極め て困難な も の であ る こ と が予 想 さ れ る 。  In addition, Candida dutilis has a high ploidy and does not sporulate, so its transgene properties are still well defined. Absent. Therefore, the transformation conditions and the conditions to be satisfied by the vector system are unknown, and it is extremely difficult to establish the host / vector system. It is expected that .
な お、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス に 関す る 薬剤耐性マ 一 力 一を用 い た予備的 な形質転換の検討例 は、 ホ ー ら に よ り 紹介 さ れて い る （HO, N. W. Y. e t . a 1. B i o t e chno l o y a n d B i o e n g i n e e r i n g S y m . No. 1 , 295 - 301, 1984 ) 0 し か し な が ら 、 こ の報告 に お い て は、 形質転換実験の条 件、 形質転換体で あ る と 主張す る 薬剤耐性株 に つ い てそ の.証明 に 不可欠な サザ ン 解析な どの デー タ が開示 さ れて お ら ず、 不十分な報告で あ る 。 Hoo et al. Have introduced examples of preliminary studies on the use of drug resistance techniques for Candida utilis in preliminary transformation. (HO, NWY et. A 1. Biotchno loyand Bioengineering Sym. No. 1, 295-301, 1984) 0 However, in this report, the condition of the transformation experiment was described. In the case of drug-resistant strains that are alleged to be transformants, no data such as Southern analysis essential for the proof were disclosed, which is an inadequate report.
こ の こ と か ら 、 依然 と し て、 キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス に 関す る 再現性 あ る 形質転換系、 さ ら に そ れを利用 し た有用 物質の生産技術の 確立が望 ま れて い る と い え る 。 [発明 の概要 ] For this reason, there is still a need for a reproducible transformation system for Candida utilis, and a technology for producing useful substances using it. It is said that establishment is desired. [Summary of Invention]
本発明者 ら は、 今般、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母 か ら 再現性 よ く 形質転換体を取得す る こ と に成功 し 、 形 質転換体 に お け る 異種遣伝子の発現 につ い て種 々 の知見 を得 た。 本発明 は こ れ ら の知見 に基づ く も の で あ る 。  The present inventors have recently succeeded in obtaining a transformant with good reproducibility from a Candida utilis yeast, and have obtained a heterologous transfection in the transformant. Various findings were obtained on the expression of genes. The present invention is based on these findings.
従 っ て、 本発明 は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の再現 性の あ る 形質転換系の 提供を そ の 目 的 と し て い る 。  Accordingly, it is an object of the present invention to provide a reproducible transformation system for Candida utilis.
ま た本発明 は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス形質転換系 で利用可能な 、 選択マ ー カ ー と な る 遣伝子、 プ ラ ス ミ ド が染色体への組み込 ま れ る 際の タ ー ゲ ッ ト 配列 と な る 遗 伝子、 異種遺伝子の発現 に必要な プ ロ モ ー タ ー、 タ ー ミ ネ ー タ ー な ど新規 D N A 配列の 提供を そ の 目 的 と し て い る o  In addition, the present invention relates to a method in which a gene and a plasmid, which can be used in a Candida utilis transformation system and serve as a selection marker, are integrated into a chromosome. The purpose is to provide a novel DNA sequence, such as a target sequence, a promoter required for expression of a heterologous gene, a terminator, etc. O
さ ら に本発明 は、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お け る 異種遺伝子の 発現を可能 に す る べ ク タ ー 系の提供を そ の 目 的 と し て い る 。  Further, another object of the present invention is to provide a vector system that enables expression of a heterologous gene in a Candida utilis.
ま た本発明 は、 異種遺伝子を染色体 に 複数 コ ピ ー でか つ安定 に組み込 ま せ る こ と の で き る 宿主 べ ク 夕 一系 の 提供を そ の 目 的 と し て い る 。  It is another object of the present invention to provide a host vector which is capable of stably integrating a heterologous gene into a chromosome in a plurality of copies.
さ ら に ま た本発明 は、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お け る 異種遺伝子の 発現法の 提供を そ の 目 的 と し て い る 。  Further, another object of the present invention is to provide a method for expressing a heterologous gene in Candida utilis.
ま た、 さ ら に本発明 は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で 自 律複製機能を有 し 、 形質転換効率を上 げ る 機能を持つ D N A 断片、 お よ びそ れを含む プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー 、 そ の 利用 に よ る 選択マ ー カ ー遣伝子を含 ま な い D N A断片を 染色体 に組み込む方法、 な ら び に プ ロ モ ー タ ー活性を有 す る D N A配列 の取得法、 そ れ に よ り 得 ら れた プ ロ モ ー タ ー活性を有す る 新規 D N A配列 の 提供を そ の 目 的 と し て い る 。 Further, the present invention provides a DNA fragment having an autonomous replication function in a candidate utility and having a function of increasing transformation efficiency, and a DNA fragment containing the same. Lasmid Vector, its A method for integrating a DNA fragment that does not contain a selection marker gene into a chromosome, and a method for obtaining a DNA sequence having a promoter activity, It is an object of the present invention to provide a novel DNA sequence having the obtained promoter activity.
本発明 に よ る 新規 D N A配列群 は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ ー ム構成蛋 白質 L 4 1 を コ ー ドす る 遺 伝子、 な ら び に そ の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一 配列 ； シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子 ； ホ ス ホ グ リ セ リ ン酸キ ナ ー ゼ （ P G K ) 遣伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 ； グ リ セ ロ ア ゾレデ ヒ ド ー 3 — リ ン酸 - デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ （ G A P ) 遺伝子の プ ロ モ ー タ 一 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 ； 原形質膜 プ ロ ト ン A T P a s e ( P M A ) 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ 一 タ ー配列 ； U R A 3 遣伝子、 な ら び に そ の プ ロ モ ー タ 一 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列 ； 二種類の 自 律複製能を有 す る D N A 断片 ； プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A断片 の..配列 ； そ し て、 キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ 一 ム R N A を コ ー ドす る r R N A遺伝子で あ る 。  The novel DNA sequences according to the present invention include genes encoding the ribosome-constituting protein L41 of Candida utilis, as well as genes and the like. Promoter and terminator sequences of the following: cycloheximide-resistant L41 gene; hosoglyserinate kinase ( PGK) gene promoter and terminator sequence; glyceroazolide 3-phosphoric acid-dehydrogenase (GAP) gene Promoter and terminator sequence of the plasma membrane protein ATPase (PMA) gene promoter and terminator sequence A URA3 gene, and its promoter and terminator sequences; two types of DNA fragments capable of autonomous replication; Sequence of a DNA fragment having a motor activity; and an rRNA gene encoding ribosome RNA of Candida utilis. is there .
本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換系 で利用可能な ベ ク タ ー は、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A と 相同 な 配列 と 、 選択マ ー カ ー遺伝子 と を 含ん で な り 、 相 同組換え に よ っ て異種遺伝子を キ ャ ン デ ィ ダ · ュテ ィ リ ス の 染色体 D N A に 組み込む こ と がで き る も の、 あ る い は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で 自 律複 製機能を有す る D N A配列 と 、 選択マ ー カ ー遺伝子 と を 含ん でな り 、 高 い頻度でキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形 質転換で き る も の、 で あ る 。 The vector which can be used in the Candida utilis transformation system according to the present invention has a sequence homologous to the chromosomal DNA of the Candida utilis. And a selectable marker gene, whereby the heterologous gene can be integrated into the chromosomal DNA of the Candida utilis by homologous recombination. Or a DNA sequence with autonomous replication in a candidutilis, and a selectable marker gene, which is expensive. It is one that can transform candidurises with frequency.
ま た、 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質 転換系で利用可能な ベ ク タ ー は、 選択マ ー カ ー遣伝子を 含 ま ず、 キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス.の 染色体 D N A と 相 同 な配列を含ん で な り 、 相 同組換え に よ っ て異種遣伝子 を キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A に組み込む こ と がで き る も の 、 で あ る 。 こ の プ ラ ス ミ ド は 、 こ の 自 律複製機能を有す る D N A配列 と 、 選択マ ー カ ー遣伝子 と を含ん で な る プ ラ ス ミ ド と 同時に形質転換 に 用 い る こ と がで き る 。  In addition, vectors that can be used in the Candida utilis transformation system according to the present invention do not include a selection marker gene, and do not include a selection marker gene. It contains a sequence homologous to the chromosomal DNA of Dieda utilis, and allows homologous recombination to transfer the heterologous gene to the stranded DNA. It is one that can be integrated into chromosomal DNA. This plasmid is used for transformation simultaneously with the plasmid containing the autonomously replicating DNA sequence and the selection marker gene. be able to .
さ ら に ま た、 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換系で利用可能な選択マ ー カ ー遺伝子 は、 キ ヤ ン デ イ ダ ， ュ テ ィ リ ス で機能 し 得 る 薬剤耐性マ ー カ ー、 好 ま し く は シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子、 G 4 1..8 耐性を付与す る 遺伝子、 ま た は ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を付与す る 遺伝子で あ る 。  Further, selection marker genes that can be used in the Candida utilis transformation system according to the present invention include Candida and utiliy. Drug-resistant markers, preferably cycloheximide-resistant L41 genes, genes that confer G4 1..8 resistance, or It is a gene that confers igloomycin B resistance.
さ ら に 、 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お け る 異種遺伝子の 発現法 は、 異種遺伝子を 含む前記本発 明 に よ る ベ ク タ ー でキ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス を形質転 換 し 、 得 ら れ た形質転換体を培養 し 、 該培養物か ら 異種 遣伝子の発現産物を単離、 精製す る こ と を含ん で な る も の であ る 。 Further, the method for expressing a heterologous gene in a Candida utilis according to the present invention comprises the steps of: And transforming the resulting transformant, culturing the resulting transformant, and isolating and purifying the expression product of the heterologous gene from the culture. Also It is
そ し て、 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の形 質転換系 と は、 こ れ ら の本発明 に よ る 新規 D N A群、 ベ ク タ 一系な どの機能的組み合わせ に よ っ て得 ら れ る も の で あ る 。  In addition, the transformation system of Candida utilis according to the present invention is a function such as a novel DNA group or a vector system according to the present invention. This is what is obtained by a combination.
[図面の簡単な説明 ]  [Brief description of drawings]
図 1 は、 ホ ス ホ グ リ セ リ ン酸キ ナ ー ゼ （ P G K ) 遺伝 子を含む プ ラ ス ミ ド の制限酵素地図 と D N A塩基配列決 定の ス ト ラ テ ジ ー、 お よ び P C R に よ る プ ロ モ ー タ ー 、 タ ー ミ ネ ー タ ー各断片の取得法を示す図であ る 。  Figure 1 shows the restriction map of the plasmid containing the phosphoglycerate kinase (PGK) gene, the strategy for DNA sequencing and the strategy for DNA sequencing. FIG. 2 is a diagram showing a method for obtaining fragments of a promoter and a terminator by PCR.
図 2 は、 P G K遣伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 を含む D N A断 片の塩基配列を表す図で あ る 。  FIG. 2 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing the PKG gene terminator.
図 3 は、 P G K遣伝子 プ ロ モ ー タ ー を含む D N A断片 の塩基配列を表す図で あ る 。  FIG. 3 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PKK gene promoter.
図 4 は、 P G K遺伝子プ ロ モ ー タ ー、 お よ び タ ー ミ ネ 一 夕 一を利用 し た発現ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ドの構築の説明 図で あ る 。  FIG. 4 is a diagram illustrating the construction of an expression vector plasmid using the PKK gene promoter and terminator overnight.
..図 5 は、 リ ボ ソ ー ム D N A を含む プ ラ ス ミ ドの制限酵 素地図で あ る 。  .. Figure 5 is a restriction map of plasmid containing ribosomal DNA.
図 6 は、 リ ボ ソ ー ム D N A の 構造 と 、 D N A塩基配列 決定の ス ト ラ テ ジ 一 お よ びサ ブ ク ロ ー ニ ン グ さ れた ブ ラ ス ミ ド の構造を表す図で あ っ て、 図 6 ( a ) は プ ラ ス ミ ド p C R E l 、 p C R E 2 、 p C R E 3 、 p C R X l 、 p C R X 2 、 p C R X 3 、 お よ び p C R X 4 プ ラ ス ミ ド の構造を表 し 、 図 6 ( b ) は キ ャ ン デ ィ ダ • ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ ー ム D N A を含ん だ約 1 3 . 5 k b の D N A フ ラ グ メ ン ト の 制限酵素地図で あ る 。 Figure 6 shows the structure of ribosome DNA, the strategy of DNA sequencing, and the structure of subcloned brassmids. Thus, Figure 6 (a) shows the plasmids p CRE l, p CRE 2, p CRE 3, p CRX l, p CRX 2, p CRX 3, and p CRX 4 Fig. 6 (b) shows the restriction of the DNA fragment of about 13.5 kb including the ribosome DNA of Candida utilis. It is an enzyme map.
図 7 は、 U R A 3 遣伝子を含む プ ラ ス ミ ド の制限酵素 地図 と 、 そ れ ら プ ラ ス ミ ドの サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ u r a 3 一変異の相補能を表す図で あ 0  Figure 7 shows a restriction map of plasmids containing the URA3 gene and the Saccharomyces cerevisiae ura3 mutation of those plasmids. It is a diagram showing the complementarity.
図 8 は、 U R A 3 遺伝子の D N A塩基配列決定の ス ト ラ テ ジ 一 と 、 制限酵素地図で あ る 。  FIG. 8 shows a strategy for determining the DNA base sequence of the URA3 gene and a restriction map.
図 9 は、 U R A 3 遣伝子を含む D N A断片の塩基配列 を表す図であ る 。  FIG. 9 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a URA3 gene.
図 1 0 は、 U R A 3 遣伝子の塩基配列か ら 推定 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 お よ び そ れを コ ー ドす る D N A の塩基配列 を表す図で あ る o  Figure 10 is a diagram showing the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the URA3 gene and the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence.
図 1 1 は、 U R A 3 遺伝子の塩基配列か ら 推定 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 お よ びそ れを コ ー ドす る D N A の塩基配列 で あ っ て、 図 1 0 の 続 き の配列 を表す図でめ る 。  Figure 11 shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the URA3 gene, and the nucleotide sequence of the DNA encoding it. The sequence following Figure 10 is shown. This is shown in the figure.
図 1 2 は、 L 4 1 遣伝子を含む プ ラ ス ミ ド の制限酵素 地図 と 、 D N A塩基配列決定の ス ト ラ テ ジ一を示す図で あ <3 。  FIG. 12 is a diagram showing a restriction map of a plasmid containing the L41 gene and a strategy for determining DNA sequencing <3.
図 1 3 は、 L 4 1 遺伝子を含む D N A 断片の塩基配列 を表す図で あ o  FIG. 13 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the L41 gene.
図 1 4 は、 L 4 1 遺伝子の塩基配列 か ら 推定 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 お よ びそ れを コ ー ドす る D N A の塩基配列を 表す図で あ る 図 1 5 は、 ブラ ス ミ ド p C L B S 1 0 、 お よ び p C L B S 1 2 の構築の説明図であ る 。 FIG. 14 is a diagram showing the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the L41 gene and the nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence. FIG. 15 is an explanatory diagram of the construction of the plasmids pCLBS10 and pCLBS12.
図 1 6 は、 ブ ラ ス ミ ド p C L R E 2 、 p C L R E 3 、 p C L R X 1 、 お よ び p C L R X 2 の構築を表す図であ o  FIG. 16 is a diagram showing the construction of the brassmids pCLRE2, pCLRE3, pCLRX1, and pCLRX2.
図 1 7 は、 さ ま ざ ま な電気パ ル ス 条件での A T C C 9 9 5 0 生菌率、 お よ び形質転換体数を調べた結果を表す 図であ る 0  Figure 17 shows the results obtained by examining the viability of ATCC 9950 and the number of transformants under various electric pulse conditions.
図 1 8 は、 ブ ラ ス ミ ド P C L R E 2 に よ っ て形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株の D N A の サ ザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ解折の結果を表す電気泳動図で あ る 。  Fig. 18 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA of ATCC 9950 strain transformed with the plasmid PCLRE2. is there .
図 1 9 は、 ブ ラ ス ミ ド p C L R E 2 に よ っ て形質転換 さ れた A T C C 9 2 2 6 株、 A T C C 9 2 5 6 株、 お よ び A T C C 9 9 5 0 株 の D N A の サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 解析の結果を表す電気泳動図で あ る 。  Figure 19 shows the DNA of strains ATCC 922, ATCC 925, and ATCC 950 transformed with the plasmid pCLRE2. FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of blotting analysis.
図 2 0 は、 ブ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 p C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 の構築を表す図で あ る .。  Figure 20 shows the construction of the plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7.
図 2 1 は 、 ブ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 p C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 に よ っ て形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株 の D N A の サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ解析の 結果を表す電気泳動図で あ る 。  FIG. 21 shows a sample of the DNA of the ATCC 9950 strain transformed with the plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7. FIG. 4 is an electrophoretogram showing the result of the rotation analysis.
図 2 2 は 、 ブ ラ ス ミ ド p C L U R A l に よ っ て形質転 換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株の D N A の サザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ解析の 結果を表す電気泳動図で あ る 。 Figure 22 shows the Southern blot of the DNA of ATCC 9950 strain transformed with the plasmid pCLURAl. It is an electrophoresis diagram showing the result of ring analysis.
図 2 3 は、 プ ラ ス ミ ド p C L S T A l 、 お よ び p C L R S T A 1 の 構築の 説明 図で あ る 。  FIG. 23 is an explanatory diagram of the construction of the plasmid pCLSTAl and pCLSRSTA1.
図 2 4 は 、 プ ラ ス ミ ド p C L R S T A l に よ り 形質転 換 さ れ た A T C C 9 9 5 0 株の培養上清を S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル電気泳動で分析 し た結果を表わす電気 泳動図であ る 。  Figure 24 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the culture supernatant of the ATCC 9950 strain transformed with the plasmid pCLRSTAl. FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results.
図 2 5 は、 プ ラ ス ミ ド p C L L A C l 、 お よ び p C L R L A C 1 の構築の 説明 図で あ る 。  FIG. 25 is an illustration of the construction of the plasmid pCLLACl and pCLLRAC1.
図 2 6 は 、 プ ラ ス ミ ド p C L A P H l 、 お よ び p C L R A P H 1 の 構築の 説明図で あ る 。  FIG. 26 is an explanatory diagram of the construction of the plasmid pCLAPHI and pCLRAPH1.
図 2 7 は、 異な る 薬剤耐性 マ ー カ ー （ C Y H r ： シ ク 口 へキ シ ミ ド耐性、 G 4 1 8 1" ： G 4 1 8 耐性） に よ り 選択 さ れた プ ラ ス ミ ド p C L R A P H l に よ る A T C C 9 9 5 0 株形質転換体の D N A の サザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ 解析の 結果を表す電気泳動図で あ る 。 Figure 2 7, different that drug-resistant M a mosquito over (CYH r: yellowish Shi Mi-de-resistance to click opening, G 4 1 8 1 ": G 4 1 8 resistance) by the Ri selected flop La scan FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA of the ATCC 9950 strain transformant using the midp CLRAPHl.
図 2 8 は 、 プ ラ ス ミ ド p C R E 8 、 p C R A P H 2 、 p C R A P H 3 、 p C R A P H 4 、 p C R A P H 5 、 お よ び p C R A P H 6 の 構造を 示 し た 図で あ る 。  FIG. 28 is a diagram showing the structures of the plasmids pCRE8, pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5, and pCRAPH6.
図 2 9 は 、 グ リ セ ロ ア ゾレ デ ヒ ド 一 3 - リ ン 酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ （ G A P ) 遺伝子を含む プ ラ ス ミ ド の 制 限酵素 地図 と D N A塩基配列決定の ス ト ラ テ ジ ー 、 お よ び P C R に よ る プ ロ モ ー タ ー 、 タ ー ミ ネ ー タ 一各断片 の 取得法 を示す図で あ る 。 図 3 0 は、 G A P 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー を含む D N A断 片の塩基配列を表す図で あ る 。 Figure 29 shows a map of the restriction enzyme of plasmid containing the glyceroazole dehydrogenase-13-phosphonate dehydrogenase (GAP) gene and DNA sequencing. FIG. 4 is a diagram showing a strategy and a method for obtaining a fragment of a promoter and a terminator by PCR by PCR. FIG. 30 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing the GAP gene promoter.
図 3 1 は、 G A P 遣伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一を含む D N A 断片の塩基配列を表す図で あ る 。  FIG. 31 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the GAP gene terminator.
図 3 2 は、 G A P 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー を利用 し た発現ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ドの構築の説 明図であ る 。  FIG. 32 is an explanatory diagram of construction of an expression vector plasmid using a GAP gene promoter and a terminator.
図 3 3 は、 原形質膜プ ロ ト ン A T P a s e ( P M A ) 遺伝子を含む プ ラ ス ミ ドの制限酵素地図 と D N A塩基配 列決定の ス ト ラ テ ジ ー 、 お よ び P C R に よ る プ ロ モ ー タ 一、 タ ー ミ ネ ー タ 一各断片の取得法を示す図で あ る 。  Fig. 33 shows the restriction map of the plasmid containing the plasma membrane proton ATPase (PMA) gene, the strategy for determining the DNA base sequence, and the results of PCR. FIG. 3 is a diagram showing a method for obtaining fragments of a promoter 1 and a terminator 1.
図 3 4 は、 P M A遺伝子 プ ロ モ ー タ ー を含む D N A断 片の塩基配列 を表す図であ る 。  FIG. 34 is a diagram showing a nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PMA gene promoter.
図 3 5 は、 P M A遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一を含む D N A 断片の塩基配列を表す図であ る 。  FIG. 35 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment containing a PMA gene terminator.
図 3 6 は、 P M A遺伝子 プ ロ モ ー タ ー 、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー を利用 し た発現ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ドの構築の説 明.図で あ る 。  FIG. 36 is a diagram for explaining the construction of an expression vector plasmid using a PMA gene promoter and a terminator.
図 3 7 は、 A R S を含む D N A 断片の ク ロ ー ニ ン グべ ク タ 一 p G K A P H 2 の構造を 示す図で あ る 。  FIG. 37 shows the structure of the cloning vector pGKAPH2 of the DNA fragment containing ARS.
図 3 8 は、 A R S を含む プ ラ ス ミ ド 6 種類の挿入 D N A 断片の 制限酵素地図を示 し た 図で あ る 。  FIG. 38 is a diagram showing a restriction map of the inserted DNA fragments of six plasmids containing ARS.
図 3 9 は、 プ ラ ス ミ ド P C A R S 6 と そ の 挿入 D N A 断片がサ ブ ク ロ ー ン 化 さ れた 4 種類の プ ラ ス ミ ド の挿入 D N A断片の制限酵素地図を示 し た図であ る 。 Figure 39 shows the insertion of four types of plasmids, which are subcloned into the plasmid PCARS6 and the inserted DNA fragment. FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of a DNA fragment.
図 4 0 は、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 7 と そ の 挿入 D N A 断片がサ ブ ク ロ ー ン 化 さ れ た 5 種類の プ ラ ス ミ ド の 揷入 D N A断片の制限酵素地図を示 し た 図で あ る 。  Figure 40 shows a restriction map of the plasmid p CARS 7 and the DNA fragments of the five plasmids into which the inserted DNA fragment was subcloned. It is a figure.
図 4 1 は 、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 6 — 2 の挿入 D N A 断片の塩基配列を表す図で あ る 。  FIG. 41 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of plasmid pCARS6-2.
図 4 2 は、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 6 — 2 の挿入 D N A 断片の塩基配列 を表す図で あ っ て、 図 4 1 の 続 き の配列 を表す図で あ る 。  FIG. 42 is a diagram showing the base sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid pCARS6-2, which is a sequence following FIG. 41.
図 4 3 は 、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 7 — 6 の挿入 D N A 断片の塩基配列 を表す図で あ る 。  FIG. 43 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of plasmid pCARS7-6.
図 4 4 は 、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 7 — 6 の 挿入 D N A 断片の塩基配列 を表す図であ っ て、 図 4 3 の続 き の配列 を表す図で あ る 。  FIG. 44 shows the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid pCARS7-6, and shows the sequence following FIG.
図 4 5 は、 プ ラ ス ミ ド p C A R S 6 あ る い は p C A R S 7 に よ っ て形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株の D N A ( 1 ) あ る い は プ ラ ス ミ ド p C L A C l に よ っ て形質 転.換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株の D N A ( 2 ) の サザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ解析の 結果を表す電気泳動図で あ る 。  Figure 45 shows the DNA (1) or plasmid p of ATCC 9950 strain transformed with plasmid p CARS 6 or p CARS 7. FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of Southern blotting analysis of the DNA (2) of ATCC 9950 strain transformed by CLAC1.
図 4 6 は、 A T C C 9 9 5 0 株、 A T C C 9 2 2 6 株 A T C C 9 2 5 6 株、 K P — 2 0 5 9 P 株、 そ し て S 2 8 8 C 株の D N A に つ い て C U A R S 1 ( 1 ) 、 C U A R S 2 { ( 2 ) お よ び （ 3 ) } を プ ロ ー ブ と し た サザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ解析の 結果を表す電気泳動図であ る 。 図 4 7 は、 プ ロ モ ー タ ー ク ロ ーニ ン グベ ク タ ー p P C V 2 の構築の説明図で あ る 。 Figure 46 shows the DNA of the ATCC 9950, ATCC 9226, ATCC 9256, KP-205P, and S288C DNA. FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of Southern plotting analysis using 1 (1) and CUARS 2 {(2) and (3)} as probes. FIG. 47 is an explanatory diagram of the construction of the promoter cloning vector pPCV2.
図 4 8 は、 プ ラ ス ミ ド p P C R V 1 9 の プ ロ モ ー タ ー 活性を示す D N A 断片の塩基配列 を表す図で あ る 。  FIG. 48 is a view showing the nucleotide sequence of a DNA fragment showing the promoter activity of plasmid pPCRV19.
図 4 9 は、 プ ラ ス ミ ド p G K H P T l の構築の説明図 乙" あ O o  Figure 49 is an illustration of the construction of the plasmid pGKHPTl.
図 5 0 は、 共形質転換法 に よ り 形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株 D N A の P C R 解析の 結果を表す電気泳動 図で あ る 。  FIG. 50 is an electrophoretogram showing the results of PCR analysis of the ATCC 9950 strain DNA transformed by the co-transformation method.
[発明 の具体的説明 ]  [Specific description of the invention]
キ ャ ン デ ィ ダ 》 ュ テ ィ リ ス酵母  Candida》 utilis yeast
本発明 に よ る 形質転換系が適用 さ れ る キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の具体的菌株 と し て は、 例え ば A T C C 9 2 5 6 ( I F 0 0 6 2 6 ) 、 A T C C 9 2 2 6 ( I F 0 1 0 8 6 ) . A T C C 9 9 5 0 ( I F 0 0 9 8 8 ) I F 0 0 3 9 6 、 I F O 0 6 1 9 、 I F O 0 6 3 9 、 K P — 2 0 5 9 P 株な どが挙 げ ら れ る 。  Specific strains of Candida utilis to which the transformation system according to the present invention is applied include, for example, ATCC 9256 (IF0626), ATCC 9 2 2 6 (IF 0 1 0 8 6). ATCC 9 9 5 0 (IF 0 0 9 8 8) IF 0 3 9 6, IFO 0 6 1 9, IFO 0 6 3 9, KP — 2 0 59 P shares etc. are listed.
.な お、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス は株 に よ っ てそ の 染 色体泳動パ タ ー ン が異な り 、 染色体 の長 さ の 多型性を 示 す こ と が報告 さ れて い る （ S t Q 1 t e n b u r g eし a 1. C u r r. It should be noted that Candida utilis differs in its chromosomal pattern depending on the strain, and may show chromosomal length polymorphism. Reported (St Q 1 tenburge a 1.Cur r.
Ge n e t. 22 441 - 446 ( 1992 ) ) 。 従 っ て、 本発明 に よ る 形 質転換系 は そ の 多型性 に起因 し て適用 が制限 さ れ る こ と が予想 さ れた。 し か し 、 後記す る 実施例 に お い て使用 し た 3 株につ い て は そ れぞれ染色体多型が認め ら れた も の の、 い ずれに つ い て も 形質転換体が得 ら れ、 ま た異種遗 伝子の発現 も 確認で き た。 こ の こ と か ら 、 本発明 に よ る 形質転換系がキ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 全般 につ い て適 用可能で あ る こ と は、 当業者 に と っ て容易 に推測で き る も の と 考え る 。 Genet. 22 441-446 (1992)). Therefore, it was expected that the transformation system according to the present invention would be limited in its application due to its polymorphism. However, chromosomal polymorphism was observed in each of the three strains used in the examples described below. In each case, a transformant was obtained, and the expression of a heterologous gene was confirmed. From this, it is easy for those skilled in the art that the transformation system according to the present invention can be applied to candida utilis in general. It can be guessed.
形質転換系  Transformation system
一般 に生物の形質転換系 を 開発す る た め に は、 （ a ) 形質転換体を選別す る た め の 選択マ ー カ ー遣伝子お よ び 形質転換体の選択方法、 （ b ) プ ラ ス ミ ド D N A が宿主 細胞内 で核外遺伝子 と し て存在す る た め に必要な 自 律複 製能を有す る D N A配列 （ A R S ) 、 ま た は プ ラ ス ミ ド を効率的 に染色体 に組み込 ま せ る た め に必要な適当 な 染 色体 D N A相同配列 （す な わ ち 、 プ ラ ス ミ ド D N A の組 み込み タ ー ゲ ッ ト の確立） 、 さ ら に、 （ c ) 宿主細胞を 細胞外 D N A を取 り 込み可能な 状態 に す る 処理方法、 の 3 つ の 要素が必要 と な り 、 こ れ ら 3 つ の要素がそ ろ っ て 形質転換体を取得す る こ と が可能 と な る 。 し たが っ て、 遺.伝学的 な情報が ほ と ん ど得 ら れて い な い キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換系 の 確立 に あ た っ て は、 こ れ ら すべての要素 に つ い て検討 し 、 開発す る こ と が必要不可 欠で あ っ た。  In general, in order to develop a transformation system for an organism, (a) a selection marker gene for selecting a transformant and a method for selecting a transformant, and (b) a method for selecting a transformant. Plasmid A DNA sequence (ARS) that has the autonomous replication ability required for DNA to exist as an extranuclear gene in the host cell, or the plasmid can be efficiently used. An appropriate chromosomal DNA homologous sequence required for specific integration into the chromosome (ie, establishment of a target for integration of the plasmid DNA), and , (C) a processing method for bringing the host cell into a state in which extracellular DNA can be taken up, and the transformant is prepared by combining these three elements. Can be obtained. Therefore, in establishing a transformation system for Candida dutilis, for which little biographical information is available, It was essential to consider and develop all of these elements.
( a ) 選択マ ー カ ー 遺伝子お よ び形質転換体の 選択 形質転換体を選別す る た め の選択マ ー カ ー遺伝子 と し て は、 変異処理 に よ り 栄養要求性 と な っ た宿主株が利用 7 一 で き る 場合、 そ の栄養要求性を相補す る 遗伝子を選択マ 一力 一遣伝子 と し て用 い る こ と がで き る 。 こ の場 口 、 -Τ3 地か ら 当該栄養素を 除 い た最少培地で形質転換体を直接 選択す る こ と が可能で あ る 。 し か し 、 キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 場合 に は、 前記 し た よ ラ に、 適当 な 栄 ^ ^ 性な どの選択符号が付加 さ れた変異株の取得が著 し く 困 難で あ り 、 栄養要求性の相 ¾ it fc:子を選択マ ー カ 一 と し た形質転換 シ ス テ ム の 開発が不可能で あ つ た。 (a) Selection of selectable marker gene and transformant The selectable marker gene for selecting transformants became auxotrophic due to the mutation treatment. Used by host strain If possible, a gene that complements its auxotrophy can be used as a selective gene. In this case, it is possible to directly select a transformant on a minimal medium in which the nutrient has been removed from -III3. However, in the case of Candida utilis, it is particularly important to obtain mutants to which a selection code such as an appropriate trait has been added as described above. It was difficult, and it was not possible to develop a transformation system using auxotrophic it fc: offspring as a selection marker.
発明者 ら は 、 干 ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス が、 抗生物質 G 4 1 8 ゃハ ィ グ ロ マ イ シ ン B 、 シ ク ロ へキ シ ミ ド な ど に感受性であ り 、 培地中 に そ れ ら の薬剤を添加す る こ と に よ つ て菌の生育を抑え る こ と が可能であ る こ と を見出 し た。 そ こ で、 形質転換体選択マ 一 力 ー遗伝子 と し て、 そ れ ら の 薬剤 に耐性を与え る 遺伝子を利用 す る こ と を試 み る こ と と し た。  The inventors have found that dried dandritis is susceptible to antibiotics G418-Hygromycin B, cycloheximide, etc. Thus, it was found that the growth of bacteria can be suppressed by adding these agents to the medium. Therefore, we attempted to use genes that confer resistance to these drugs as transformant selection markers.
こ で G 4 1 8 耐性遺伝子 （ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ 才 卜 ラ ン ス フ ェ ゼ遗伝子） やハ イ グ ロ マ イ シ ン Β 耐 性. 伝子 （ハ ィ グ ロ マ イ シ ン Β ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ 一ゼ遺伝子） な どの 、 他の生物 由来の 遺伝子を利用 す る Here, the G418 resistance gene (Amino glycoside protein transfection gene) and the high chromosome resistance gene are used. Use genes from other organisms, such as genes from the chromosome (phosphotransferase gene).
1^ 口 、 遺伝子の発現を確実 に す る た め に キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス で機能す る 転写の プ ロ モ ー タ ー お よ び 夕 一 ミ ネ一 タ ー配列 を利用 す る の が好 ま し い。 1 ^ mouth, a transcriptional promoter and evening-monitor sequence that functions in the candidatories to ensure gene expression It is preferable to use.
キ ヤ ン デ ィ ダ · ァ ル ビ 力 ン ス な どの一部の キ ヤ ン デ ィ ダ属酵母 に お い て は 、 一部 コ ド ン の 翻訳の さ れ方が他の 生物 と は異な っ て い る こ と も 報告 さ れて お り （Ohama e t. a 1. Nuc l e i c Ac i ds Res. 21 039 - 4045 19 )、 異種 遺伝子を選択マ ー カ ー遺伝子 と す る 場合に は、 そ れが宿 主内 で機能を持つ 蛋白 質 に 翻訳 さ れ る と い う 保証 は な い —方で、 シ ク ロ へキ シ ミ ド に対す る 感受性 は リ ボ ソ ー ム 蛋 白質で あ る L 4 1 蛋 白質の 5 6 番 目 残基 に よ り 決定 さ れ る と い う 興味深 い事実が報告 さ れて い る （ K a w a i e t. a 1. J Ba c t e r i o 1. 174 254 - 262 ( 1992 ) ) 。 In some Candida yeasts, such as Candida albicans, some codons are translated in other ways. It has also been reported that it is different from organisms (Ohama et. A. Nucleic Acids Res. 21 039-4040519), and the heterologous gene is selected as the marker gene In some cases, there is no guarantee that it will be translated into a functional protein within the host—but the sensitivity to cycloheximide will be less than An interesting fact has been reported that it is determined by the 56th residue of the L41 protein, which is a protein (Kawaie t. A 1. J Bacterio) 1. 174 254-262 (1992)).
そ こ で本発明者 ら は、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド に 感受性で あ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の L 4 1 蛋 白質の遣伝子を 取得 し 、 そ れを部位特異的変異法 に よ り シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 に変換 し て選択マ ー カ ー 遺伝子 と し 、 そ れを利 用 し た。 こ こ で、 こ の遺伝子 は宿主由 来で あ る た め、 発 現の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列 は そ の遗伝 子 自 身の配列 を そ の ま ま 用 い る こ と と し た。 よ っ て本態 様 は、 遺伝子の確実な 発現が期待で き る 点で極め て有利 め る 。  Therefore, the present inventors obtained a gene for L41 protein of Candida utilis which is sensitive to cycloheximide, and obtained that gene. Was converted into a cycloheximide resistant form by site-directed mutagenesis to obtain a selected marker gene, which was used. Here, since this gene is derived from the host, the promoter and terminator sequence of the expression are based on the sequence of the gene itself. I decided to keep it. Therefore, this embodiment is extremely advantageous in that reliable expression of the gene can be expected.
従 っ て、 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形 質転換系 に お い て用 い ら れ る 選択マ ー カ ー と し て の薬剤 耐性遺伝子マ ー カ ー は、 好 ま し く は シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐 性型 L 4 1 遺伝子で あ る 。 L 4 1 遺伝子、 な ら び に プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー 配列を含ん だ D N A断片 の 塩基配列 は 図 1 3 (配列番号 ： 5 ) に 示 さ れ る 通 り で あ り 、 さ ら に そ の塩基配列 か ら 推定 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 は図 1 4 (配列番号 ： 6 ) に示 さ れ る 通 り であ る 。 ま た シ ク 口 へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子 は、 図 1 3 に示 さ れ る 配列の 1 6 4 4 番 目 の ヌ ク レ オ チ ド C が A に変換 さ れた も の で あ り 、 そ の結果、 図 1 4 に 示 さ れ る 配列の 5 6 番 目 の ァ ミ ノ 酸 は P r 0 が G 1 n に 置換 さ れ る 。 Accordingly, a drug resistance gene marker as a selection marker used in the transformation system of a Candida utilis according to the present invention. Is a cycloheximide resistant L41 gene, preferably a cycloheximide-resistant gene. The nucleotide sequence of the L41 gene and the DNA fragment containing the promoter and terminator sequences are shown in FIG. 13 (SEQ ID NO: 5). And the amino acid sequence deduced from the base sequence Is as shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 6). In the mouth-opening heximid-resistant L41 gene, the 164th nucleotide C in the sequence shown in Fig. 13 is converted to A. As a result, in the amino acid at the 56th position of the sequence shown in FIG. 14, Pr0 is replaced by G1n.
ま た、 本発明 に よ る 形質転換系 に お け る 他の好 ま し い 桌剤 ο#性遠伝子マ 一 力 一 と し て、 抗生物質 G 4 1 8 に対 す な 11#性 ¾·付与す る ァ ミ ノ グ リ シ ド、 ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ ( A P T ) 遗伝子 も ま た使用 で き る 。 ァ ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ 卜 ラ ン ス フ エ フ 一ゼ遣伝子に は ト ラ ン ス ポ ゾ ン T n 9 0 3 と 卜 ラ ン ス ポ ゾ ン T n 5 由来の 2 種類が知 ら れて お り 、 いずれの遣伝子 も 本発明 に お い て 使用可能で め 。 ま た、 抗生物質ハ イ グ ロ マ イ シ ン B に 対す る 耐性を付与す る 大 由来の ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン B ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遗伝子 も ま た本発明 に よ る 形質転換系 に お い て使用 で き る 。 こ の G 4 1 8 耐性？ έ 子やハ イ グ 口 マ イ シ ン B 耐性遣伝子な ど異種遣伝子の場 合.は、 遺伝子発現の た め に キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス で 機能す る 転写の プ 口 モ ー タ ー お よ び タ 一 ミ ネ 一 タ ー配列 を そ れぞれ異種遺伝子の 5 ' 上流 と 3 ' 下流 と に 組み込 むの が好 ま し い。  Also, as another preferred agent in the transformation system according to the present invention, an 11 # agent for the antibiotic G418 is one of the preferred agents. ¾ · Amino grease to be given, and phospho-ferrase (APT) gene can also be used. The transposons Tn903 and the transposons Tn5 are derived from the gene transfer genes. The two types are known, and any of these genes can be used in the present invention. In addition, a large source of neuroglomerin B phosphotransferase gene that confers resistance to the antibiotic hygromycin B. It can also be used in the transformation system according to the present invention. Is this G4 18 resistant? In the case of a heterologous gene, such as a gene or a Higuchi-mouth Mycin B-resistant gene, it functions in the candidutilis for gene expression. It is preferred to incorporate the transcriptional motor and terminator sequences 5 'upstream and 3' downstream of the heterologous gene, respectively.
こ の転写の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー 配列 と し て は、 キ ヤ ン ァ イ ダ · ュ テ ィ リ ス の 遺伝子 由来で あ る の が よ り 好ま し く 、 例え ば、 後記す る キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の ホ ス ホ ダ リ セ リ ン酸キ ナ ー ゼ （ P G K ) 遣伝 子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 ； グ リ セ 口 ア ルデ ヒ ド ー 3 — リ ン酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ （ G A P ) 遣 伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 ； お よ び 原形質膜 プ ロ ト ン A T P a s e ( P M A ) 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列 な どが利用 出来 る 。 ま た、 後述す る プ ロ モ ー タ ー ク ロ ー ニ ン グ用 ベ ク タ ー に よ り 取得 さ れ る プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配列 な ど も 利用 で き る 。 More preferably, the promoter and terminator sequences for this transcript are derived from the gene of Cyanida utilis. For example, for example, the candidacy described later A sequence of promoters and terminators of Tyrith's hos-ho-de-selenic acid kinase (PGK) gene; DO3—Promoter and terminator sequence of phosphate dehydrogenase (GAP) gene; and plasma membrane protein ATP The promoter and terminator sequence of the ase (PMA) gene can be used. Further, a DNA sequence having promoter activity obtained by a promoter cloning vector described later can also be used. .
ま た、 上記系 に お い て利用可能な他の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列の例 と し て は、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス 酵母で公知の A D H、 E N O、 G A L、 S U C な どの 遣伝子の キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お け る 相同遺伝子 の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列 な どを挙げ る こ と がで き る 。  Examples of other promoters and terminator sequences that can be used in the above system include those known in Saccharomyces yeast. Promoters and terminator sequences for homologous genes in the candidutilis of genes such as ADH, ENO, GAL, and SUC What can I list?
さ ら に、 形質転換体の 選択 マ ー カ ー と し て利用可能な 細菌 由来の 薬剤耐性遣伝子 と し て は、 前記 し た G 4 1 8 耐.性遺伝子お よ びハ イ グ ロ マ イ シ ン B ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ遺伝子の ほ か に 、 ク ロ ラ ム フ エ ニ コ ー ノレ ァ セ チ ノレ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子 （ ク ロ ラ ム フ エ 二 コ ー ル 耐性） （Ha d f i e 1 d, C. e t. a 1. G e n e, 5, 149-158 (1986) ) 、 ブ ラ ス ト サ イ ジ ン デ ァ ミ ナ ー ゼ （ ブ ラ ス ト サ イ ジ ン耐性） ( I z um i , M. e t . a 1. Ex . C e l l Re s. , 197, 229 - 233 ( 1991) ) 、 フ レ オ マ イ シ ン耐性遺伝子 （ We nz eし T. J. e t. a 1. Yeas t, 8, 667 - 668 ( 1992 ) ) な ど の抗生物質 耐性遣伝子が挙げ ら れ る 。 こ の他 に、 デ ィ ハ イ ド ロ フ ォ レ ー ト レ ダ ク タ ー ゼ遺伝子 （ メ ト ト レ キセ ー ト 耐性） ( M i y a j i m a , A. e t . a 1. M o 1. Ce l l B i o l. 4, 407 - 414 ( 1984 ) ) や、 酵母由来の 優性遺伝子 ス ル ホ ヌ ッ ロ ン メ チ ノレ iT性遺伝十 ( Cas ey, G. P. e t . a 1. J. Ins t. Brew. 94, 93 - 97 ( 1988 ) ) 、 CUPl遺伝子 （錮耐性） （Hend e M on R. C. A. e t. a 1. Cur rent Gene t. 9, 133 - 138 ( 1985 ) ) CYH2遣伝子 （ シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性） （ De l gado, M. e t a 1. EBC congress, 23, 281 - 288 ( 1991 ) ) な ど、 公知の 薬剤耐性遣伝子 も 利用 で き る 。 こ の う ち マ ー カ ー 遺伝子 が細菌や ト ラ ン ス ポ ゾ ン の遺伝子な ど異種生物由来であ る 場合 に は、 上記 し た よ う な キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内 で機能す る プ ロ モ ー タ ー、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 を利用 す る の が好 ま し い。 Further, as the drug-resistant gene derived from bacteria that can be used as a selection marker for transformants, the G418 resistance gene and high-level gene described above can be used. In addition to the Meissin B phosphotransferase gene, the chloramphenicoretransferase gene (Ro dfie 2col resistance) (Ha dfie 1d, C.e.t.a 1.Gene, 5, 149-158 (1986)), Blast Sine Dinmina (Blast sine resistance) (Izumi, M. et. A. Ex. Cell Res., 197, 229-233 (1991)), Resistance gene (Wenz e TJ et. a 1. Antibiotic resistant genes such as Yeast, 8, 667-668 (1992)). In addition, the dehydrofolate reductase gene (metrexate resistance) (Miyajima, A. et. A 1. Mo 1. Cell) B io l. 4, 407-414 (1984)), and the yeast dominant gene, Sulphonullomethinol iT, (i.e., Casey, GP et. A 1. J. Inst. Brew). 94, 93-97 (1988)), the CUPl gene (imprisonment tolerance) (Hende Mon on RCA et. A 1. Current Gene t. 9, 133-138 (1985)) CYH2 gene Known drug-resistant genes such as heximide resistance (Del gado, M. eta 1. EBC congress, 23, 281-288 (1991)) can also be used. When the marker gene is derived from a heterologous organism such as a bacterium or a transposon gene, the above-mentioned candidacy * It is preferable to use a promoter and an array of terminators that function within the network.
( b ) プ ラ ス ミ ド D N A の組み込み タ ー ゲ ッ ト の確立 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子を は じ め と す る 利.用可能な選択マ ー カ ー が前記の よ う に本発明 に よ っ て 確立 さ れた こ と か ら 、 こ れ ら の配列 に 限 ら ずキ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス染色体 由来の 種々 の配列が タ ー ゲ ッ ト 配 列 と し ての利用可能で あ る こ と が期待 さ れ る 。  (b) Establishment of a target for integration of plasmid DNA Useful for selection including the cyclimid-resistant L41 gene, which can be used as a selection marker. As described above, various sequences derived from a Candida utilis chromosome are not limited to these sequences, but have been established according to the present invention. It is expected that it can be used as a get array.
本発明 の好 ま し い態様 に よ れば、 プ ラ ス ミ ド を 染色体 に組み込 ま せ る た め に必要な 適当 な 染色体 D N A 断片 と し て、 リ ボ ソ ー ム R N A を コ ー ドす る 遺伝子で あ る r R N A 遣伝子 （ r D N A ) U R A 3 遣伝子、 L 4 1 遺伝子、 お よ び P G K 遗伝子を好 ま し く 使用 す る こ と が で き る こ と が見出 さ れた。 According to a preferred embodiment of the present invention, the ribosome RNA is coded as an appropriate chromosomal DNA fragment required for integrating the plasmid into a chromosome. Gene rRNA Gene (rDNA) It has been found that the URA3 gene, the L41 gene, and the PGK gene can be favorably used.
r R N A 遺伝子 に つ い て は、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ に お い て r D N A が染色体上 に タ ン デム に 1 0 0 コ ピ ー 以上存在 し 、 そ の反復単位の な か に 自 律複製配列 ( A R S ) が存在す る こ と が報告 さ れて い る （ S a H e r k M i l l e r, J R. Mo l e c. C e l l. B i o l. 6, 1148-1157, (1986 ) ) o ま た、 こ の r D N A 領域を ブ ラ ス ミ ド組み込み の タ ー ゲ ッ ト と す る こ と に よ り 、 組み込み の形質転換頻度 を高 く で き る こ と が報告 さ れて い る （ Lo p e s, e t . a 1. Ge n e 79, 199-206 (1989) ) o  For rRNA genes, in Saccharomyces cerevisiae, rDNA is present on the chromosome in more than 100 copies in tandem, and the repetition is repeated. It has been reported that an autonomously replicating sequence (ARS) is present in the unit (SaHerk Miller, JR. Mole c. Cell. Biol. 6, 1148-1157, (1986)) o By using this rDNA region as a target for integration of plasmid, the frequency of transformation for integration can be increased. This has been reported (Lo pes, et. A 1. Gene 79, 199-206 (1989)) o
本発明者 ら は 、 キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス に お い て も r D N A が染色体上 に反復 し て存在す る こ と を見出 し た こ れ に よ り 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ 同様、 キ ヤ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス の r D N A 配列 は、 高頻度組み込 み の た め の タ ー ゲ ッ ト 配列 と し ての 利用 が可能で あ る こ と .が示唆 さ れ、 事実、 キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の形質 転換系 に お い て組換え タ ー ゲ ッ ト と し て有利 に利用 す る こ と 力 で き た。  The present inventors have found that rDNA also exists repeatedly on a chromosome even in a candidate utility, and as a result, Like Karomaisses cerevisiae, the RDNA sequence of Candida utilis is a target sequence for high frequency integration. It is suggested that this can be used as a recombinant target in a Candida utilis transformation system. I was able to do it.
興味あ る こ と に、 r R N A 遺伝子、 U R A 3 遺伝子、 L 4 1 遺伝子、 お よ び P G K遺伝子 な どの キ ヤ ン デ ィ ダ « ュ テ ィ リ ス 染色体を タ ー ゲ ッ ト と し 、 後記す る 本発明 に よ る ベ ク タ ー 系を用 い て、 キ ャ ン デ イ ダ · ュデ ィ リ ス 酵母を形質転換す る と 、 D N A断片が染色体上に組み込 ま れ、 酵母 に安定 に保持 さ れ る こ と が観察 さ れた。 従 つ て、 こ の タ ー ゲ ッ ト と ベ ク タ ー系 と の組み合わせ に よ り 異種遣伝子が 自 律複製を続 け る 染色体外プ ラ ス ミ ド と し て保持 さ れ る 場合の 外来遣伝子の 不安定性の 問題を排除 す る こ と がで き る 。 Interestingly, we target candidate chromosomes such as the rRNA gene, URA3 gene, L41 gene, and PGK gene, as described below. Using the vector system according to the present invention, the Canadian When the yeast was transformed, it was observed that the DNA fragment was integrated on the chromosome and was stably retained in the yeast. Therefore, when the heterologous gene is retained as an extrachromosomal plasmid that continues autonomous replication by this combination of the target and the vector system. This eliminates the problem of instability of the foreign gene.
本発明 に お い て、 形質転換体 に よ り 組み込 ま れた D N A断片の存在様態を詳 し く 解析 し た結果、 D N A断 片の キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体への組み込み は主 に相同組換え に よ っ て起 き る こ と が明 ら か と な っ た。 こ れ は、 宿主染色体 タ ー ゲ ッ ト 配列 に対す る ホ モ ロ ジ一を 有す る D N A配列を含む D N A分子で あ れば、 そ れを任 意の染色体 タ ー ゲ ッ ト に組み込む こ と が可能で あ る こ と を意味す る 。  In the present invention, the presence of the DNA fragment integrated into the transformant was analyzed in detail, and as a result, the DNA fragment was transferred to the Candida utilis chromosome. It has been clarified that the integration of the gene occurs mainly by homologous recombination. If this is a DNA molecule that contains a DNA sequence that has a homology to the host chromosomal target sequence, it can be incorporated into any chromosomal target. Means that and are possible.
具体的 に は、 タ ー ゲ ッ ト 配列 に対す る ホ モ ロ ジ一を有 す る D N A配列 を、 そ の相同 D N A配列内 の適当 な制限 酵素サ イ ト で分解 し て 直鎖状 と し た プ ラ ス ミ ド D N A を ベ.ク タ 一 と し て使用 し 、 あ る D N A 断片を キ ャ ン デ ィ ダ • ュ テ ィ リ ス 染色体の タ ー ゲ ッ ト 配列上 に組み込む こ と 力くで き る 。 こ の 場合、 選択 マ ー カ ー を シ ク ロ へキ シ ミ ド 耐性型 L 4 1 遺伝子 に す る こ と に よ り 、 後述す る よ う に 複数の プ ラ ス ミ ド分子が同時 に組み込 ま れた形質転換体 が効率的 に選択 さ れ る 。  Specifically, a DNA sequence having a homology to the target sequence is decomposed with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence to make it linear. Using the plasmid DNA as a vector, the ability to incorporate a DNA fragment into the target sequence of the Candida utilis chromosome You can. In this case, by making the selected marker a cycloheximide-resistant L41 gene, multiple plasmid molecules can be simultaneously used as described later. The transformed transformant is efficiently selected.
ま た、 染色体 タ ー ゲ ッ ト 配列 に対す る ホ モ ロ ジ一を有 す る D N A 配列の 内部 に選択マ ー カ ー遣伝子を含ん だ形 態の線状 D N A 断片を用 い る こ と も 可能で あ る 。 In addition, there is a homology for the chromosome target sequence. It is also possible to use a linear DNA fragment containing a selection marker gene within the DNA sequence to be used.
本発明 に よ る 本態様の形質転換 に お い て、 プ ラ ス ミ ド は、 染色体上の相同 な 遺伝子 と 置 き 換わ る 形で挿入 さ れ る 。 こ の た め、 挿入 さ れた D N A 断片の前後 に は、 タ ー ゲ ッ ト 配列 の反復配列が形成 さ れず、 よ っ て、 組み込ま れた D N A の よ り 高 い安定性が期待 さ れ る 。  In the transformation of the present embodiment according to the present invention, the plasmid is inserted so as to replace a homologous gene on a chromosome. As a result, no repetitive sequence of the target sequence is formed before and after the inserted DNA fragment, and thus higher stability of the integrated DNA is expected. .
こ こ で、 U R A 3 遺伝子、 L 4 1 遺伝子、 P G K遗伝 子な ど は、 他の多 く の遺伝子 と 同様 に 1 細胞あ た り 2 コ ピ ー し か存在 し な い遣伝子で あ る が、 D N A 断片組み込 み の タ ー ゲ ッ ト と し て用 い る こ と が可能で あ る こ と が本 発明 に よ っ て示 さ れた。 ま た、 一般 に酵母の r R N A 遣 伝子 は 1 8 S 、 5 . 8 S 、 2 5 S 、 5 S の各 r R N A 遣 伝子を含む反復 D N A 単位が 1 倍体あ た り 1 0 0 コ ピ ー 以上存在す る ( S c hwe i z e r, E. e t . a 1. J. Moし B i o l. 40, 261 - 277 ( 1969 ) ) 。 そ こ で、 こ の r D N A を組換え の タ ー ゲ ッ ト 配列 と し て の利用 に は、 他の遺伝子配列 を 利,用 し た場合 と 比較 し て、 （ 1 ) 形質転換頻度が上昇す る こ と が期待 さ れ る 、 （ 2 ) 組み込み に よ る タ ー ゲ ッ ト 配列 の 変化 は無視で き る 、 な ど の利点があ る 。 発明者 ら は、 キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス に お い て も r R N A 遣伝子 が、 約 1 3 . 5 k b の D N A 配列 を反復単位 と し て タ ン デム に反復 し て存在 し て い る こ と 、 を 明 ら か に す る と と も に （詳細後記） 、 r D N A 配列 を組換え の タ ー ゲ ッ ト 配列 と す る こ と で、 細胞あ た り 2 コ ピ ー存在す る L 4 1 遺伝子を タ ー ゲ ッ ト と す る よ り も 形質転換頻度が 1 0 倍 か ら 5 0 倍程度高 く な る こ と を 明 ら か に し た。 ま た、 r D N A座 に組み込 ま れた D N A断片の安定性 も 高 く 、 r D N A配列 は優れた組み込み タ ー ゲ ッ ト で あ る こ と が 明 ら か と な っ た。 Here, the URA3 gene, the L41 gene, the PGK gene, etc., like many other genes, are genes with only two copies per cell. However, according to the present invention, it has been shown that the DNA fragment can be used as a target for incorporation of a DNA fragment. In general, the number of yeast rRNA genes is 100 haploids per repetitive DNA unit containing the 18S, 5.8S, 25S, and 5S rRNA genes. More than a copy exists (Schweizer, E. et. A. J. Mo. Biol. 40, 261-277 (1969)). Therefore, when this rDNA is used as a target sequence for recombination, (1) the frequency of transformation is increased as compared to the case where other gene sequences are used. (2) The change of the target sequence due to the integration can be ignored, and so on. The present inventors also concluded that the rRNA gene in a candidate lysate tandemly repeats a DNA sequence of about 13.5 kb as a repeat unit. The presence of the rDNA sequence and the target for recombination (described later in detail) As a sequence, the transformation frequency is about 10 to 50 times higher than when the L41 gene, which is present in two copies per cell, is targeted. Clarified what will happen. In addition, the stability of the DNA fragment integrated into the rDNA locus was high, revealing that the rDNA sequence was an excellent integration target.
本発明 に お い て D N A断片組み込み の タ ー ゲ ッ ト 配列 と し て r D N A配列 を用 い た こ と は、 こ の よ う に形質転 換頻度を高め る 効果を も た ら し 、 酵母の処理条件を検討 し てそ の な かか ら 適切な形質転換条件を発見す る う えで 重要な役割を果た し た。 し か し 、 興味あ る こ と に、 r D N A の 領域 に よ っ て は形質転換の タ ー ゲ ッ ト と し て 用 い た場合 に形質転換頻度が著 し く 低 く な る こ と が明 ら か に さ れ、 r D N A 断片であ れば ど こ で も 効率的な ブ ラ ス ミ ドの組み込み タ ー ゲ ッ ト と し て利用 で き る も の で は な い こ と が示唆 さ れた。  In the present invention, the use of the rDNA sequence as the target sequence for DNA fragment integration has the effect of increasing the frequency of transformation as described above, and the yeast It played an important role in examining the treatment conditions for E. coli and finding suitable transformation conditions therefrom. However, it is interesting to note that, depending on the region of the rDNA, the frequency of transformation is significantly reduced when used as a target for transformation. It has been clarified, suggesting that any rDNA fragment may not be an efficient target for incorporation of Brasmid. It was done.
さ ら に本発明の好 ま し い態様 に よ れば、 シ ク ロ へキ シ ミ，ド耐性型 L 4 1 遺伝子を選択マ ー カ ー と す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ドが複数個組み込 ま れ た形質転換体を効率 的 に取得で き る 。 こ の 理由 は次の よ う に 考え ら れ る 。 す な わ ち 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子を含む D N A 断片が複数 コ ピ ー組み込 ま れ た場合 に の み、 内在 性の シ ク ロ へ キ シ ミ ド感受性型 L 4 1 蛋白 質が耐性型の も の に 置 き 換え ら れ、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド に よ る 機能阻害 を受 け な い リ ボ ソ ー ム 分子の 割合が増 え る 。 こ れ に よ つ て、 形質転換体が シ ク ロ へキ シ ミ ド を含む培地で生育で き る こ と と な る と 考え ら れ る 。 こ の 場合の組み込み の タ 一ゲ ッ ト 部位 と し て は U R A 3 遺伝子座、 L 4 1 遣伝子 座な どの キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体由来の D N A 配列で あ れば基本的 に い ずれの配列 も 利用 で き る 。 ま た 興味深 い こ と に、 こ の う ち 特 に r R N A遺伝子座を そ の 組み込み の タ ー ゲ ッ ト 配列 と す る こ と に よ っ て、 他遣伝 子座を タ ー ゲ ッ ト 配列 と し た場合に比較 し て D N A 断片 が よ り 多 く 組み込ま れ る 傾向があ る こ と が示 さ れた。 Further, according to a preferred embodiment of the present invention, the use of cycloheximid or do-resistant L41 gene as a selection marker makes the plasmid more plasmid-free. Thus, a transformant in which a plurality of cells have been incorporated can be efficiently obtained. The reason is considered as follows. That is, only when multiple DNA fragments containing the cycloheximide resistant L41 gene are incorporated into multiple copies, is the endogenous cycloheximide sensitivity sensitive. Type L41 protein is replaced with a resistant type, and the function is inhibited by cycloheximide. The proportion of ribosome molecules that do not receive liposomes increases. It is thought that this will allow the transformant to grow on a medium containing cycloheximide. In this case, the target site for integration may be a DNA sequence derived from a chromosome of a Candida utililis such as the URA3 locus or the L41 gene locus. Basically, any array can be used. It is also interesting to note that the targeted loci are specifically targeted at the rRNA locus as its integrated target sequence. It was shown that the DNA fragment had a tendency to be incorporated in a larger amount as compared to the case of using the DNA sequence.
( c ) 形質転換方法  (c) Transformation method
形質転換方法、 す な わ ち 宿主細胞を細胞外 D N A を取 り 込み可能な状態 に す る 処理方法 と し て は、 プ ロ ト プ ラ ス ト 法、 酢酸 リ チ ウ ム 法、 電気パ ル ス 法、 お よ びそ れ ら の 改変法な ど の 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ の形質 転換 に 従来用 い ら れて い る 方法の利用 が考え ら れ る 。 こ の う ち プ ロ ト プ ラ ス ト 法 は広 く 使用 さ れて い る 形質転換 法で あ る が、 操作がや や煩雑で あ り 、 薬剤耐性で形質転 換体を選択す る 際 に は、 非形質転換体で あ る バ ッ ク グ ラ ン ド コ ロ ニ ー の 出現力く し ば し ば問題 と な る 。  The transformation method, that is, the treatment method for bringing the host cell into a state capable of taking up extracellular DNA includes a protoplast method, a lithium acetate method, and an electric pulse method. It is conceivable to use methods conventionally used for transformation of Saccharomyces cerevisiae, such as the Saccharomyces cerevisiae and their modifications. Although the protoplast method is a widely used transformation method, the operation is rather complicated, and it is difficult to select a transformant due to drug resistance. The emergence of the non-transformed back ground colony is often problematic.
そ こ で本発明者 ら は、 醉酸 リ チ ウ ム 法な ら び に電気パ ル ス 法を用 い て、 先 に述べ た シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 L 4 1 遺伝子 と r D N A 断片を組み 合わせ た プ ラ ス ミ ド に よ っ て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換を試み 再現性良 く 形質転換体を得 る こ と の で き る 条件を見出 し た。 Thus, the present inventors used the lithium drunkate method and the electric pulse method to obtain the cycloheximide resistance L41 gene and rDNA described above. Attempt to transform a candida * utilis using a plasmid that combines the fragments. We have found the conditions under which transformants can be obtained with good reproducibility.
キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス の形質転換 は、 電気パ ル ス 法に よ る の が好ま し い。 菌体を対数増殖期 に ま で増殖 さ せ た後、 洗浄 し て 1 M ソ ル ビ ト ー ル に 懸濁す る 。 電気パ ル ス の 条件は、 タ イ ム コ ン ス タ ン ト 値 （電圧が最大値の 約 3 7 % に ま で減衰す る ま での 時間） が約 1 0 か ら 2 0 ミ リ 秒であ り 、 パ ル ス 後の生菌率が約 1 0 — 4 0 % と な る 条件であ れば良 い。 例え ば、 本発明 の好ま し い態様 に よ れば、 電気容量が 2 5 F 、 抵抗値が 6 0 0 〜  Transformation of Candida utilis is preferably by the electropulse method. After the cells are grown to logarithmic growth phase, wash and resuspend in 1 M Sorbitol. The condition of the electric pulse is that the time constant value (time until the voltage attenuates to about 37% of the maximum value) is about 10 to 20 milliseconds. It is only necessary that the conditions be such that the viable cell rate after pulse is about 10 to 40%. For example, according to a preferred embodiment of the present invention, the capacitance is 25 F and the resistance is 600 to
1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧が 3 . 7 5 〜 5 K V Z c mの 条件 で、 上記の タ イ ム コ ン ス タ ン ト 値 と 生菌率が得 ら れ、 1 g D N A あ た り 約 5 0 0 〜 1 4 0 0 個の形質転換体 が得 ら れ る こ と 力 示 さ れた。  Under the conditions of 100 ohms and a voltage of 3.75 to 5 KVZ cm, the above time constant value and viable cell rate are obtained, and about 1 g DNA It was shown that 500-1400 transformants could be obtained.
ま た、 電気パ ル ス を加え た後、 菌液 に 1 M ソ ル ビ ト ー ルを含む Y P D培地を加え 3 0 °Cで振盪培養す る こ と が 好 ま し く 、 培養せず に菌を 直接 シ ク ロ へキ シ ミ ドを含む 選.択プ レ ー 卜 に塗布す る と コ ロ ニ ー が得 ら れな い場合が あ る こ と が見出 だ さ れた。 ま た、 培養時間 は 4 〜 6 時間 程度が適当 で あ り 、 そ の後 は形質転換体の増殖が無視で き な く な る 。 こ の ほ か、 D N A と 菌体を接触す る 際 に サ 一モ ン ス パ ー ム D N A な ど の キ ヤ リ ア D N A を 添加 す る こ と や ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルを添加す る こ と な ど に よ つ て形質転換頻度を高め る こ と も 本発明 に よ る 形質転換 系 に あ っ て も 好ま し い。 In addition, it is preferable to add a YPD medium containing 1 M sodium sorbitol to the bacterial solution after adding an electric pulse, and culturing with shaking at 30 ° C. It was found that colonies could not be obtained when bacteria were directly applied to a selection plate containing cycloheximide. The appropriate culture time is about 4 to 6 hours, after which the growth of the transformant becomes insignificant. In addition, when contacting the DNA with the bacterial cells, carrier DNA such as summon spam DNA may be added, and polyethylene glycol may be added. It is also possible to increase the frequency of transformation by adding It is also good to have a system.
ま た、 酢酸 リ チ ウ ム 法 U t G e t a 1. J. Ba c t e r i d. 153， 163 - 168 1983) は そ の簡便 さ か ら 広 く サ ッ カ ロ ミ セ ス 属酵母の形質転換 に 用 い ら れて お り 、 さ ま ざ ま な 改良 法が報告 さ れて い る 。 こ れ ら の方法を用 い て も キ ャ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換が可能で あ る こ と が確認 さ れた。 特 に、 エ タ ノ ー ルを添加す る リ チ ウ ム 法変法  In addition, the lithium acetate method UtGeta 1. J. Bacteri d. 153, 163-168 1983) has been widely used for the transformation of Saccharomyces yeasts because of its convenience. Various improvements have been reported. It was confirmed that transformation of Candida utilis was possible even by using these methods. In particular, a modified lithium method with the addition of ethanol
(S 0 n i e t . a 1. Cu r r en t Ge n e t. 1993 24, 455 - 459 ) に よ つ て キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス の形質転換が好ま し く 可 能であ る 。 ま た、 集菌時の菌体密度、 リ チ ウ ム の 濃度、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル の 種類 と 濃度、 キ ャ リ ア D N A の 種類、 形態、 量な ど異な る 条件を試み る こ と に よ り 、 醉酸 リ チ ウ ム 法 に よ る キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス の形質転 換の至適条件を決定 し て、 形質転換頻度を高め る こ と が 可能で あ る 。 上記 し た本発明 に よ る （ a ) 選択マ ー カ ー 遺伝子お よ び （ b ) 組み込み タ ー ゲ ッ 卜 が確定 さ れた こ と か ら 、 こ れ ら は 当業者 に と り 容易であ る と 考え る 。  (S 0 niet. A. Current Genet. 1993 24, 455-459), it is possible to favor the transformation of Candida utilis. . Also, different conditions such as the cell density, the concentration of lithium, the type and concentration of polyethylene glycol, and the type, form and amount of carrier DNA at the time of collection. In order to increase the frequency of transformation, the optimal conditions for the transformation of Candida utilis by the lithium sulphate method are determined. And are possible. Since the (a) selection marker gene and (b) integration target according to the present invention described above have been determined, they can be easily prepared by those skilled in the art. I think there is.
.な お、 形質転換条件を見出 す過程で、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ で機能す る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由 来 A R S 配列 8 種類 と 、 同 じ く サ ッ カ ロ マ イ セ ス * セ レ ピ シ ェ で機能す る G 4 1 8 耐性遺伝子発現ュニ ッ ト と を 組み合わせ た プ ラ ス ミ ド を用 い て形質転換を試み た が、 形質転換体 は取得で き な か っ た。 こ の結果 は ホ ー ら に よ る キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス の 形質転換の報告 （H0， N. W. Y e t . a 1. 刖掲） の再 性を疑わせ る も の で あ る と い え る 発現ベ ク タ 系お よ び異種遣伝子の発現 Eight types of ARS sequences derived from Candida dutilis that function in Saccharomyces cerevisiae during the process of finding transformation conditions And a G418 resistance gene expression unit, which also functions in Saccharomyces * cerevisiae. Attempted, but no transformants could be obtained. This result is based on the report of the transformation of Candida utilis by Ho (H0, NWY). a.1) The expression vector system and the expression of the heterologous gene which are said to be
本発明 に よ れば、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転 換に使用 さ れ る 発現べ ク タ ー 系が提供 さ れ る 。  According to the present invention, there is provided an expression vector system used for transformation of Candida utilis.
本発明 に よ る ベ ク タ ー の一つ の態様 は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス染色体 D N A と 相 同 な配列 （以下、 「相同 D N A配列」 と い う こ と があ る ） を含み、 こ の部分 に お い て相同組換え を起 こ す こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド D N A を染色体 に組み込む こ と を可能 に し 、 かつ形質転換体の 選別を可能 と す る 選択マ ー カ ー遺伝子を含ん でな る 、 プ ラ ス ミ ド D N Aで あ る 。  One embodiment of the vector according to the present invention is a sequence homologous to a Candida utilis chromosomal DNA (hereinafter, sometimes referred to as a “homologous DNA sequence”). And homologous recombination in this part will allow the integration of plasmid DNA into the chromosome and the selection of transformants It is a plasmid DNA containing the selected marker gene.
こ こ で、 相同 D N A配列 と は好 ま し く は r R N A遣伝 子、 U R A 3 遺伝子、 L 4 1 遣伝子、 P G K遺伝子、 G A P 遺伝子、 P M A遺伝子な どが挙げ ら れ、 そ れ ら は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス染色体 D N A 由 来の も の で あ る こ と が好ま し い。 用 い る 配列 に依存 し て染色体上の任 意の位置 に異種遣伝子を組み込む こ と が可能であ る 。 こ の .プ ラ ス ミ ド は、 プ ラ ス ミ ド分子内 の相同 D N A配列 内 の適当 な 制限酵素サ イ ト での分解 に よ り プ ラ ス ミ ド  Here, the homologous DNA sequence preferably includes rRNA gene, URA3 gene, L41 gene, PGK gene, GAP gene, PMA gene and the like. Preferably, it is derived from the chromosomal DNA of the Candida utilis. It is possible to integrate a heterologous gene at any position on the chromosome depending on the sequence used. This plasmid is generated by digestion with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence within the plasmid molecule.
D N A を 直鎖状 と し て使用 さ れ る 。 そ の結果、 プ ラ ス ミ ド D N A 断片 は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 染色体 に相 同 組換え に よ り 組み込 ま れ る 。 DNA is used as a linear chain. As a result, the plasmid DNA fragment is integrated by homologous recombination into the Candida ducilis chromosome.
さ ら に本発明 の好 ま し い態様 に よ れば、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A 中で、 マ ー カ ー遺伝子お よ び異種遺伝子を含む D N A配列 は、 そ の両端 に お い て前記相同 D N A配列 に 挟 ま れて な る 。 . こ の態様で は、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を 相 同 D N A配列 に お い て制限酵素切断 し 、 相 同 D N A配 列 を そ の両端 に有す る マ ー カ ー遺伝子お よ び異種遺伝子 を含む D N A 断片を得 る 。 こ う し て得た D N A断片 も 、 ま た、 相 同組換え に よ り キ ャ ン デ ィ ダ * ュデ ィ リ ス 染色 体 D N A に相 同組換え に よ り 組み込 ま れ得 る も の で あ る 。 Further, according to a preferred embodiment of the present invention, the plasmid DNA contains a marker gene and a heterologous gene. The DNA sequence is flanked at both ends by the homologous DNA sequence. In this embodiment, the plasmid DNA is cleaved with a homologous DNA sequence by a restriction enzyme, and a marker gene and a marker gene having the homologous DNA sequence at both ends thereof. Obtain a DNA fragment containing the heterologous gene. The DNA fragment obtained in this way can also be incorporated by homologous recombination into Candida duculis chromosomal DNA by homologous recombination. It is.
な お、 本明細書 に お い て、 「 D N A 断片 （ ま た は配列） が、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 染色体 に相 同組換え に よ り 組み込 ま れ る 」 と は、 D N A断片がキ ャ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 染色体 に組み込 ま れ る 限 り に お い て、 そ の組み 込み の態様 は 限定 さ れな い が、 少な く と も 次の二つ の態 様を含む意味 に用 い る こ と と す る 。 す な わ ち 、 （ 1 ) キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 染色体の D N A配列 と 、 D N A 断片の 両端 に あ る 相 同 D N A配列部分 と が相 同組換え を 生 じ 、 開裂部分 に D N A 断片が " 挿入 " さ れて染色体 D N A に組み込 ま れ る 態様、 お よ び （ 2 ) キ ャ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 染色体の D N A配列 と 、 D N A 断片の両端 に あ る 相 同 D N A配列 と の相 同組換え に よ っ て、 プ ラ ス ミ ド D N A 断片がキ ャ ン デ ィ ダ · ュ デ ィ リ ス 染色体の 一 部 と " 置換 " さ れて染色体 D N A に組み込 ま れ る 態様の い ずれ も 少な く と も 意味す る も の と す る 。 （ 2 ) の態様 に お い て は、 挿入 さ れ た D N A 断片の 前後 に 、 タ ー ゲ ッ ト 配列 の反復配列が形成 さ れな い た め、 組み込 ま れた D N A断片が安定 に染色体 に存在す る こ と が期待 さ れ る ま た、 選択マ.一 力 一遺伝子 と し て は前記 し た薬剤耐性 マ ー カ ー を利用 す る の が好 ま し く 、 よ り 好ま し い薬剤耐 性マ ー カ ー と し て は、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性を付与す る 遺伝子、 例 え ば シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子 ； 抗生物質 G 4 1 8 耐性を付与す る 遣伝子、 例え ばバ ク テ リ ア ト ラ ン ス ポ ゾ ン T n 9 0 3 由来の A P T遺伝子 ； 抗 生物質ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性遣伝子な どが挙げ ら れ る こ れ ら 選択マ ー カ ー遣伝子が微生物 由来で あ る 場合 は、 そ れ ら の発現を確かな も の と す る た め に キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス で機能す る プ ロ モ ー タ ー に連結す る こ と が好 ま し い。 It should be noted that, in the present specification, "a DNA fragment (or sequence) is integrated by homologous recombination into a Candida ducilis chromosome". As long as the DNA fragment is integrated into the Candida dyschromis chromosome, the mode of integration is not limited, but at least It is used for meanings that include these two forms. That is, (1) the DNA sequence of the Candida duduris chromosome and the homologous DNA sequence portions at both ends of the DNA fragment generate homologous recombination, and the cleaved portion is generated. The DNA fragment is inserted into the chromosomal DNA by "insertion" into the chromosomal DNA, and (2) the DNA sequence of the Candida * duris chromosome, and the DNA sequence at both ends of the DNA fragment. By homologous recombination with a homologous DNA sequence, the plasmid DNA fragment is "replaced" with a portion of the Candida dudis chromosome into chromosomal DNA. Any of the incorporated aspects shall mean at least as little as possible. In the embodiment of (2), the target DNA sequence was inserted before and after the inserted DNA fragment because no repetitive sequence of the target sequence was formed before and after the inserted DNA fragment. It is expected that the DNA fragment is stably present on the chromosome, and it is preferable to use the drug-resistant marker described above as a selection marker. A more preferred drug-resistant marker is a gene that confers cycloheximide resistance, for example, a cycloheximide-resistant L41 gene. A gene that confers resistance to the antibiotic G418, for example, the APT gene from Bacteria transposon Tn903; an antibiotics, Hygromycin If the selected marker gene is of microbial origin, such as a B-resistant gene, the key is used to ensure their expression. It is preferable to link to a promoter that works with the standard.
ま た、 本発明 の も う 一つ の態様 に よ る ベ ク タ ー は、 キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A と 相同な 配列 （相 同 D N A配列） を含み、 こ の 部分 に お い て相同組換え を 起 こ す こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド D N A を染色体 に組み込 む こ と を可能 と す る も の で あ り 、 一方で形質転換体選択 の め の選択 マ ー カ ー遺伝子を持た な い プ ラ ス ミ ド D N A で あ る 。 こ の プ ラ ス ミ ド は 、 プ ラ ス ミ ド分子中 の相同 D N A配列 内 の 適当 な 制 限酵素サ イ 卜 で の 分解 に よ り 直 鎖状 と し 使用 さ れ る 。  In addition, the vector according to another embodiment of the present invention includes a sequence homologous to a Candida dystilis chromosomal DNA (a homologous DNA sequence). By causing homologous recombination in the part, it is possible to integrate the plasmid DNA into the chromosome. This is a plasmid DNA that does not have a marker gene. This plasmid is used as a straight chain by digestion with an appropriate restriction enzyme site within the homologous DNA sequence in the plasmid molecule.
ま た 、 こ の 態様 の プ ラ ス ミ ド に お い て も 、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A は、 異種遺伝子を含む D N A配列が、 そ の両 端 に お い て前記相同 D N A配列 に挟 ま れて な る よ う 構成 さ れて よ い。 そ し て、 こ の プ ラ ス ミ ド D N A を相同 D N A配列 に お い て制限酵素切断す る こ と に よ っ て、 相 同 D N A配列 を そ の両端 に有す る D N A断片が得 ら れ る こ う し て得 ら れた D N A 断片 も 相 同組換え に よ り キ ャ ン デ ィ グ · ュ デ ィ リ ス 染色体 D N A に相 同組換え に よ り 組 み込 ま れ う る も の で あ る 。 In addition, in the plasmid of this embodiment, the plasmid DNA also includes a DNA sequence containing a heterologous gene sandwiched between the homologous DNA sequences at both ends. Configuration You may be happy. Then, this plasmid DNA is cleaved with a homologous DNA sequence by a restriction enzyme to obtain a DNA fragment having a homologous DNA sequence at both ends. The DNA fragment obtained in this way can also be integrated into the chromosomal DNA of the candidate durilis by homologous recombination. It is.
こ れ ら 直鎖状 と さ れ た D N A 断片 は 、 上記 し た選択マ 一 力 一遺伝子を含ん で な る プ ラ ス ミ ド D N A の場 合 と 同 様 に 、 キ ヤ ン デ ィ ダ 《 ュデ ィ リ ス 染色体 に相同組換え に よ り 組み込 ま れ る 。 本態様の プ ラ ス ミ ド に お い て も 、 上 記 （ 2 ) の 態様 に よ る 組み込み に す る こ と で、 組み込 ま れた D N A断片が安定 に 染色体 に存在す る こ と が期待 さ れ る 。  These linearized DNA fragments can be used in the same manner as in the case of the plasmid DNA containing the above-mentioned selection gene, as described above. It is integrated by homologous recombination into the Diris chromosome. Even in the plasmid of the present embodiment, the integration according to the above-mentioned embodiment (2) ensures that the integrated DNA fragment is stably present on the chromosome. Be expected .
乙 、 相 同 D N A配列 と は好 ま し く は r R N A遗伝 子、 U R A 3 遺伝子、 L 4 1 遺伝子、 P G K遣伝子、 G A P 遗伝子、 P M A遺伝子な どが挙 げ ら れ る 。 そ れ ら は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A 由 来の も の で あ こ と が好 ま し い。 ま た、 用 い る 配列 に 依存 し て染色 体上の 任意の 位置 に 外来 D N A 断片を 組み込む こ と が可 能で あ る  B and the homologous DNA sequence preferably include rRNA gene, URA3 gene, L41 gene, PGK gene, GAP gene, PMA gene and the like. They are preferably derived from the Candida utilis chromosome DNA. It is also possible to incorporate a foreign DNA fragment at any position on the chromosome, depending on the sequence used.
こ の ぺ ク タ 一 は、 後述す る 自 律複製配列 を含む D N A 配列 と 選択 マ ー カ ー遺伝子 と を持つ プ ラ ス ミ ド と 同時 に 形質転換 に 用 い ら れ る 。 す な わ ち 、 自 律複製能を 有す る プ ラ ス ミ ドが導入 さ れ た こ と に よ り 選択 さ れ る 形質転換 体の な かか ら 、 さ ら に選択マ ー カ ー遺伝子を持た な い D N A 断片が染色体上 に組み込 ま れた株を二次的 に選択 す る こ と が可能であ る 0 選択 さ れた株に存在す る プ ラ ス ミ ド は、 そ の 後非選択条件下で菌を培養す る こ と に よ つ て脱落 さ せ る こ と が可能で あ り 、 τ¾ と し て、 挿入 D N A 断片だ け を染色体上 に保持す る 株を取得す る こ と がで き る 。 こ の手法を用 い る こ と に よ り 、 例 え ば異種遺伝子 の み を保持 し 、 微生物由 来の 薬剤耐性遣伝子の よ う に 余 分な配列を含 ま な い株 育種す る こ と が可能 に な る 。 This vector is used for transformation simultaneously with a plasmid having a DNA sequence containing an autonomously replicating sequence described below and a selection marker gene. That is, the transformation selected by the introduction of a plasmid capable of autonomous replication. From the body, it is possible to secondarily select a strain in which a DNA fragment that does not have a selection marker gene has been integrated on the chromosome. The plasmid present in the isolated strain can then be eliminated by culturing the bacteria under non-selective conditions, and τ 、 It is possible to obtain a strain that retains only the inserted DNA fragment on the chromosome. By using this technique, a strain can be bred that retains only the heterologous gene and does not contain extra sequences, such as a drug-resistant gene derived from a microorganism. This will be possible.
ま た さ ら に 、 こ の 自 律複製配列 を含む D N A 配列 と 選 択マ ー カ ー遣伝子 と を持つ ブ ラ ス ミ ド 自 体 も 、 キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ イ リ ス酵母形質転換用 の ベ ク タ 一 と し て利用 可能で あ る 。 こ の プ ラ ス ミ ド は非選択条件下で菌を培養 す る こ と に よ っ て脱落 し やす い特徴を も つ が、 安定性を 高 め る D N A 断片が後述す る よ う に取得で き 、 こ の D N A 断片 と 組み 合わせ てベ ク タ 一 と し て利用す る こ と が可 能で あ る 。  Furthermore, Brasmid itself, which has a DNA sequence containing this autonomously replicating sequence and a selection marker gene, is also known as a Candidate utility. It can be used as a vector for yeast transformation. This plasmid has a characteristic that it is easily removed by culturing the bacteria under non-selective conditions, but a DNA fragment that enhances stability is obtained as described below. Then, it can be used as a vector in combination with this DNA fragment.
. し り 牛発明 に よ る べ ク タ ー に異種遺伝子を連結 し て 異種遺伝子を保持 し た ベ ク タ ー と す る こ と がで き る 。 こ の べ ク 夕 ー に よ っ て キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転 換す る と 、 そ れ ら の異種遺伝子を キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体 に 安定 に組み込む こ と が可能で あ る 。 こ う し て得 ら れ た形質転換体を適当 な培地中で培養 し 、 該培養 物か ら 異種遺伝子の 発現産物を、 そ の 発現産物 に 適 し た 方法で単離、 精製す る こ と に よ っ て、 異種遣伝子を キ ヤ ン デ イ ダ • ュ テ ィ リ ス で発現 さ せ る こ と がで き る 。 すな わ ち 、 キ ヤ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス に お け る 異種遺伝子の 発現法が提供 さ れ る 。 こ こ で、 異種遺伝子 と は通常 は宿 主の キ ヤ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス 染色体上 に本来存在 し な い 遺伝子ま た は そ の一部の D N A を意味す る も の と す る 。 It is possible to link a heterologous gene to a vector according to the invention of a cattle and obtain a vector retaining the heterologous gene. Transformation of a candida utilis with this vector can result in the transfer of these heterologous genes to the chromosome of the candida utilis. It can be stably incorporated into the system. The transformant thus obtained was cultured in an appropriate medium, and the expression product of the heterologous gene from the culture was adapted to the expression product. By isolating and purifying by a method, a heterologous gene can be expressed in a candidate utilis. That is, the present invention provides a method for expressing a heterologous gene in Candida * utilis. As used herein, a heterologous gene refers to a gene or a portion of a gene that is not normally present on the chromosome of the host candidutilis. .
異種遗伝子 は、 好 ま し く は、 そ の異種遣伝子の 発現を 独立 し て制御す る 調節領域 と 組み 合わせ る か、 ま た は、 形質転換の過程で破壊 さ れ た遺伝子 自 身の 調節領域の影 響下に そ の異種遺伝子を発現 さ せ る 。 そ の よ う な配列 は キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス で機能す る 必要があ り 、 そ の 好 ま し い具体例 と し て は後記す る 本発明 に よ る P G K遗 伝子、 G A P 遺伝子、 お よ び P M A 遺伝子の プ ロ モ ー タ 一配列 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列、 さ ら に は後述す る プ 口 モ ー タ 一 ク ロ ー 二 ン グ用 ベ ク タ ー に よ り 取得 さ れ る プ 口 モ ー タ 一活性を有す る D N A 配列が挙げ ら れ る 。  The heterologous gene is preferably combined with a regulatory region that independently regulates the expression of the heterologous gene, or the gene that has been disrupted during the transformation. The heterologous gene is expressed under the influence of the regulatory region of the body. Such an array must function in a Canadian utility, and a preferred example thereof is a PGK 遗 according to the present invention, described below. Promoter and terminator sequences for the gene, GAP gene, and PMA gene, as well as the promotor sharing described below A DNA sequence that has promotor activity and is obtained by a vector.
後記す る 実施例か ら 明 ら かな よ う に 、 本発明 に よ り 、 ホ..ス ホ グ リ セ リ ン 酸キ ナ ー ゼ遺伝子の プ ロ モ ー タ ー配列 お よ び 夕 一 ミ ネ 一 夕 一配列 を用 い て、 ダル コ ア ミ ラ ー ゼ 遺伝子、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 遺伝子、 yS — ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ遺伝子、 ハ イ グ ロ マ イ シ ン B ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ユ ラ ー ゼ遺伝子な どの異種遺伝 子の 発現 に成功 し た ま た、 さ ら に グ リ セ 口 ア ルデ ヒ ド 一 3 - U ン 酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ遺伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列、 な ら び に原形質膜 プ ロ ト ン A T P a s e 遣伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列を用 い て、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ エ ラ ー ゼ遣伝子の発現 に も 成功 し た。 こ れ ら の異種 タ ン パ ク 質の う ち 、 グル コ ア ミ ラ ー ゼ は分泌蛋 白質で あ り 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼゃ ^ ー ガ ラ ク ト シ ダー ゼは菌体内酵素で あ る 。 こ の こ と は、 本発 明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で の異種蛋白質の生 産 は、 そ れが菌体内 あ る い は分泌蛋白質 いずれで あ っ て も 可能であ る こ と を意味す る 。 さ ら に、 グル コ ア ミ ラ ー ゼ につ い て は そ の高 レ ベルの分泌発現が認め ら れ、 キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス が異種蛋白 質の 高生産の た め の 優 れた宿主 と な り う る こ と が明 ら か に さ れた と い え る 。 As will be apparent from the examples described later, the present invention provides that the promoter sequence of the e.g. The darco-amylase gene, aminoglycosylphosphos-transferase gene, and yS—galactosidase gene were used for the whole sequence. Heterologous genes, such as the chromosome gene and the high chromosomal B-phosphotranslation luciferase gene, have been successfully expressed. Promoter of the 3D-U-hydroxyphosphate dehydrogenase gene And the sequence of the terminator, and the sequence of the promoter and terminator of the plasma membrane protein ATPase gene. We have also succeeded in expressing the gene for Aminoglycosylphosphotransferase. Among these heterologous proteins, glucoamylase is a secreted protein, and aminoglycosidase phosphotransferaseゃ ^ -Galactosidase is an intracellular enzyme. This suggests that the production of heterologous proteins in Candida utilis according to the present invention, whether they are intracellular or secretory proteins. It means that it is possible. In addition, a high level of secretory expression of glucoamylase was observed, and Candida utilis showed high production of heterologous proteins. It has been clarified that it can be an excellent host.
さ ら に キ ャ ン デ ィ ダ · マ ル ト ー サ、 ア ル ビ カ ン ス な ど —部の キ ヤ ン デ ィ ダ属酵母 に お い て は、 一部 コ ド ン の 翻 訳の さ れ方が他の生物 と は異な っ て い る こ と も 報告 さ れ て い る （Ohama e t . a 1. Nu c l e i c Ac i d s Re s. 21 039 - 40.45 (1993) ) 。 キ ャ ン デ ィ ダ ' マ ル ト ー サ を宿主 と し て 得 ら れた大腸菌由来の ^ 一 ガ ラ ク ト シ ダー ゼ遺伝子の発 現産物が活性を示 さ な い こ と は、 そ の た め で あ る と さ れ て い る 。 後記実施例か ら 明 ら かな よ う に、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で産生 さ れた、 大腸菌 由来の ^ 一 ガ ラ ク ト シ ダー ゼ遺伝子産物 は そ の 活性を保持 し て い た。 こ の こ と は、 キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス が正常な コ ド ン認識を す る こ と を示 し て お り 、 こ れ は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス が異種 ポ リ ペ プチ ド生産 に お い て好 ま し い宿主で あ る こ と を示 し て い る 。 In addition, Candida maltosa, Albicans, etc.-In some Candida yeasts, translation of some codons It has also been reported that this is different from other organisms (Ohama et. A 1. Nucleic Acids Res. 21 039-40.45 (1993)). The fact that the expression product of the ^ -galactosidase gene derived from Escherichia coli obtained using Candida maltosa as a host does not show any activity indicates that It is said that it is because of. As is evident from the examples described below, the ^ -galactosidase gene product derived from Escherichia coli produced by Candida utilis retains its activity. Was. This means that the candidutilis recognizes the correct codon recognition. This indicates that Candida utilis is a preferred host for heterologous polypeptide production. are doing .
ま た、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で異種遺伝子を発現 す る こ と に よ っ て キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の性質を改 変す る こ と がで き る 。 従 っ て、 本発明 に よ れば、 新た な キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス株の 作 出法が提供 さ れ る 。 例 え ばそ の 発酵特性を改良 し 、 工業的有用性を増大す る こ と が可能で あ る 。 特 に グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ遣伝子を発現す る キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス株 は、 源粉資化性が付与 さ れ る こ と に よ り 利用可能な炭素源ス ぺ ク ト ルが拡大 さ れた と い え る 。  In addition, the expression of a heterologous gene in a Candida utilis can alter the properties of the Candida utilis. it can . Therefore, according to the present invention, a method for producing a new Candida utilis strain is provided. For example, it is possible to improve its fermentation properties and increase its industrial utility. In particular, Candida utilis strains that express the gene for glucose coamylases have more available carbon due to the conferment of source assimilation. It is said that the source space has been expanded.
さ ら に 、 本発明 に よ る ベ ク タ ー は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 以外の細胞の形質転換 に利用す る こ と も 可能で あ る 。 キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス 以外の細胞を宿主 と す る 場合、 形質転換の 実施 に 際 し て適当 な D N A 断片を選 択す る の が好 ま し い。 そ の よ う な D N A 断片 と し て は、 大.腸菌の 場合、 例え ば p B l u e s e f i p t や p U C 1 9 の よ う な 細菌の プ ラ ス ミ ド D N A が挙 げ ら れ る 。 ま た、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス 属酵母の 場合、 例 え ば Y E p 1 3 、  Furthermore, the vector according to the present invention can be used for transformation of cells other than Candida utilis. When a cell other than the Candida utilis is used as a host, it is preferable to select an appropriate DNA fragment when performing the transformation. Such DNA fragments include, for example, bacterial plasmid DNA such as pBLuesefipt or pUC19 in the case of E. coli. In the case of yeast belonging to the genus Saccharomyces, for example, YEp13,
Y C p 5 0 ( M e t h o d s i n E n z y m o 1 o g y, 1 9 , p 1 95 - 23 0 , A c a d e m i c P r e s s ( 1 99 1 ) ) な ど の 酵母一大腸菌 シ ャ ト ルべ ク タ 一 が挙 げ ら れ る 。 キ ヤ ン デ ィ ダ · ュテ ィ リ ス酵母内 で 自 律複製能を有す る D N A配列 の ク ロ ー ニ ン グ法 Yeasts such as YC p50 (Methodsin Enzymo 1 ogy, 19, p195-230, Academic Press (1991)) and other Escherichia coli shuttle vectors are listed. It is. Cloning of DNA sequences capable of autonomous replication in Candida utilis yeast
さ ら に本発明 に よ れば、 キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス酵 母内で 自 律複製能を持つ D N A配列 を ク ロ ー ン化す る 手 法が提供 さ れ る 。 使用 す る D N A は い かな る 生物種由来 の も の で あ っ て も よ い が、 キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス 由 来で あ る の が好 ま し い。 ま た、 こ の た め の ベ ク タ ー と し て は、 薬剤耐性マ ー カ ー遺伝子を含む も の が利用 で き 、 好ま し く は キ ヤ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス で機能す る プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ ー タ 一 と に よ り 発現す る G 4 1 8 耐性遗 伝子で あ る A P T遺伝子を含むベ ク タ ー を用 い る こ と が で き る 。 具体的 に は、 P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー で発現 す る A P T遣伝子を有す る プ ラ ス ミ ド をベ ク タ ー と し て 用 い て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し 、 こ の ラ イ ブ ラ リ ー D N A で キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換す る 。 そ し て、 例 え ば G 4 1 8 耐性で選択 さ れ る 形質転換体酵母か ら 全 D N A を 抽.出 し て、 大腸菌を形質転換す る こ と に よ り 、 形質転換 酵母体で、 染色体外因子 と し て存在 し て い た プ ラ ス ミ ド D N A を回収す る こ と が で き る 。 こ の プ ラ ス ミ ド D N A に挿入 さ れた キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由来の染色体 D N A断片か ら 、 自 律複製配列 （ A R S ) と し て の機能 配列 を分離す る こ と がで き る 。  Further, according to the present invention, there is provided a method for cloning a DNA sequence having autonomous replication ability in a Candida utilis yeast. The DNA used may be from any species, but is preferably from Candida and Utilis. As a vector for this, one containing a drug-resistant marker gene can be used, and preferably it functions in a Canadian drug library. It is possible to use a vector containing the APT gene, which is a G418 resistant gene expressed by both promoter and terminator. Wear . Specifically, a plasmid containing an APT gene expressed in the PGK gene promoter is used as a vector, and the candid * A yeast chromosomal DNA library is prepared, and the library DNA is used to transform a Candida utilis. Then, for example, by extracting total DNA from a transformant yeast selected with G418 resistance, and transforming Escherichia coli, the transformed yeast Plasmid DNA that had been present as an extrachromosomal factor can be recovered. Isolate a functional sequence as an autonomously replicating sequence (ARS) from a chromosomal DNA fragment derived from Candida utilis inserted into this plasmid DNA. be able to .
驚 く べ き こ と に、 薬剤耐性マ ー カ ー と し て シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子を含む プ ラ ス ミ ド をベ ク タ ー と し た場合 は、. 自 律複製能を持つ D N A配列 を ク ロ ー ン 化す る こ と は で き な か っ た。 す な わ ち 、 こ の プ ラ ス ミ ド を用 い てキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し 、 こ の ラ イ ブ ラ リ ー D N A で キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換 し て も 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性の形質転換体 は得 ら れな か っ た。 こ れ は、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の A R S の 特徴 と し て、 そ れを含む プラ ス ミ ド の 細胞あ た り の コ ピ ー数が低 く 、 形質転換体 を選択す る た め に数 コ ピ ー必要な シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性 型 L 4 1 遺伝子 と 組み合わせて も 形質転換体を選択で き な い こ と を示唆 し て い る 。 こ れ は後 に、 取得 し た A R S と シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子 と を含む プ ラ ス ミ ド に よ っ て キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の形質転換を行 つ て も 、 形質転換体が得 ら れな か っ た こ と か ら も 確認 さ れた。 後記す る 実施例 に 示 さ れ る よ う に、 分離 し た A R S を含む D N A配列 の性質を詳 し く 解析す る こ と に よ..り 、 A R S を有す る プ ラ ス ミ ド は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母内 で 1 細胞 あ た り 約 1 コ ピ ー し か存在 し な い こ と 力く明 ら か に さ れ た。 こ の他 に、 分離 し た A R S の特 徴 と し て、 そ れを含む プ ラ ス ミ ドが不安定で あ る こ と が あ げ ら れ る 。 非選択条件下で約 2 . 5 〜 3 . 5 世代培養 す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ドを保持す る 菌の 割合 は全体 の 2 0 〜 3 0 % に ま で低下 し て い た。 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母内で プ ロ モ ー タ ー活性を 有す る D N A配列の分離法 Surprisingly, cyclohexene is a drug-resistant marker. When a plasmid containing the shim-resistant L41 gene is used as a vector, it is not possible to clone a DNA sequence capable of autonomous replication. I did. In other words, using this plasmid, a candidobacterium yeast chromosomal DNA library was prepared, and this library DNA was used. However, even if Candida utilis was transformed with E. coli, no cycloheximide-resistant transformant was obtained. This is a characteristic of the ARS of Candida utilis, which has low copy number per cell of the plasmid containing the ARS and can transform the transformant. This suggests that transformants cannot be selected even in combination with the cycloheximide-resistant L41 gene, which requires several copies for selection. This was followed by a plasmid containing the obtained ARS and the cycloheximide-resistant L41 gene, which was used to prepare the candidate utility. It was also confirmed that no transformant was obtained even after the transformation. As shown in the examples below, the properties of the isolated DNA sequence containing ARS were analyzed in detail. Candida utilis It was clearly demonstrated that there was only about one copy per cell in yeast. Another characteristic of isolated ARS is that the plasmid containing it is unstable. By culturing for about 2.5 to 3.5 generations under non-selective conditions, the proportion of bacteria that retain the plasmid is reduced to 20 to 30% of the total. Was. Isolation of DNA sequences with promoter activity in Candida utilis yeast
前記の 自 律複製能を有す る D N A配列の利用 に よ り 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス に お い て転写の プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A配列の ク ロ ー ン 化法が提供 さ れ る 。 こ の た め の ベ ク タ ー と し て は、 自 律複製能を有す る D N A配列 の 他 に、 転写の た め の プ ロ モ ー タ ー配列を持 た な い薬剤耐性マ ー カ ー遺伝子を含む も の で あ れば用 い る こ と がで き 、 好ま し く は G 4 1 8 耐性遺伝子であ る A P T遣伝子を含む も の を用 い る こ と がで き る 。 ま た、 使用す る D N A は い か な る 生物種由来で あ っ て も よ いが キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由来であ る の が好 ま し い。 ま た、 ラ イ ブ ラ リ ー作成の た め に D N A は制限酵素や D N A ァ ー ゼな どの酵素処理あ る い は超音波な どの機械 的剪断 に よ り 低分子化す る 必要があ る が、 好 ま し く は、 4 塩基認識でかつ平滑末端を生 じ る 3 種類の制限酵素 A 1 u U Ha e I I Rsa lを組み 合わせて染色体 D N A の 部分 分.解 に 使用 す る 。 こ れ に よ り 、 よ り 多 く の染色体領域が ラ イ ブ ラ リ ー に ク ロ ー ンィ匕 さ れ る か ら であ る 。  By utilizing the DNA sequence capable of autonomous replication as described above, a DNA sequence having promoter activity for transcription in a candidutilis can be obtained. A cloning method is provided. The vector for this purpose is a drug-resistant marker that does not have a promoter sequence for transcription in addition to a DNA sequence capable of autonomous replication. Any gene containing the APT gene can be used, preferably one containing the GPT18 resistance gene, the APT gene. . Also, the DNA used may be from any species, but is preferably from Candida utilis. In addition, in order to make a library, DNA must be degraded by enzymatic treatment such as restriction enzymes or DNAases, or by mechanical shearing such as ultrasonic waves. Preferably, three kinds of restriction enzymes A1uUHaeIIRsal which recognize four bases and generate blunt ends are used in combination for partial digestion of chromosomal DNA. This is because more chromosomal regions are cloned into the library.
よ り 具体的 に は、 プ ロ モ ー タ ー配列 を含 ま な い A P T 遺伝子の 5 ' 側 に、 前記の 制限酵素 に よ り 部分分解 し た 約 0 . 8 〜 1 . 8 k b の D N A 断片を連結 し て キ ャ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母染色体 D N A ラ イ プ ラ リ ー を通常 法 に よ っ て作製す る 。 そ し て、 こ の ラ イ ブ ラ リ ー D N A でキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換す る 。 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A配列が A P T遺伝子の 直前 に ク ロ ー ン化 さ れた プ ラ ス ミ ド に よ り 形質転換 さ れた酵母 は G 4 1 8 耐性 と な る 。 よ っ て、 G 4 1 8 耐性を示す形質 転換体か ら 全 D N A を抽 出 し て、 大腸菌を形質転換す る こ と に よ り 、 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A配列 を効 率的 に 分離す る こ と がで き る 。 こ の 際、 プ レ ー ト に 含 ま れ る G 4 1 8 濃度を高 く す る 、 ま た は プ レ ー ト 上で比較 的大 き な コ ロ ニ ー を形成す る 株を選択す る こ と に よ っ て よ り 転写活性の 高 い プ ロ モ ー タ ー配列 を分離す る こ と が 可能で あ る 。 本発明 に よ る こ の方法 は、 前述 し た よ う に キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス に お け る A R S を含む プ ラ ス ミ ドの コ ピ ー数 は細胞 あ た り 1 コ ピ ー 程度であ る た め、 活性の 高 い プ ロ モ ー タ ー配列 を分離す る の に好都合で あ る と い え る 。 More specifically, a DNA fragment of about 0.8 to 1.8 kb, which was partially digested with the above-mentioned restriction enzyme, was added to the 5 'side of the APT gene not containing the promoter sequence. And ligating them to produce a candida * utilis yeast chromosomal DNA library by a conventional method. And this library DNA Transform the candidate utility with. A yeast transformed with a plasmid in which the promoter-active DNA sequence has been cloned immediately before the APT gene becomes G418 resistant. . Thus, by extracting total DNA from a G418-resistant transformant and transforming Escherichia coli, a DNA sequence having promoter activity can be obtained. Separation can be performed efficiently. At this time, select a strain that increases the concentration of G418 contained in the plate or forms a relatively large colony on the plate. Thus, it is possible to isolate a promoter sequence having a higher transcriptional activity. According to the method of the present invention, as described above, the number of copies of a plasmid containing ARS in a candida or utility is per cell. Since it is only about 1 copy, it is said that it is convenient for separating a highly active promoter sequence.
キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の そ の他機能遣伝子の 分離法 ま た、 前述の 本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ ' ュテ ィ リ ス 酵母内 で プ ロ モ ー タ ー 活性をす る D N A を分離す る 方法 は、 同時 に 、 A R S を 含ん だ プ ラ ス ミ ド の安定性を高め る 機能を有す る D N A配列の 分離法を 提供す る 。 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス に お け る A R S を 含む プ ラ ス ミ ド の 存在様式の ひ と つ の 特徴 と し て、 そ の 安定性が低 く 、 非 選択条件下で約 3 〜 4 世代培養す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ドを 保持す る 菌体の 割合が全体の 2 0 〜 3 0 % に ま で 低下す る 。 こ の た め、 選択薬剤を含む プ レ ー ト 上に お い て は、 薬剤耐性遺伝子を持つ A R S プ ラ ス ミ ドを保持す る 株 は、 薬剤耐性遺伝子が染色体上 に組み込ま れた株 と 比較 し て、 細胞あ た り の コ ピ ー数が同 じ で あ っ て も やや 小 さ い コ ロ ニ ー を形成す る 。 本発明 に お い て は、 活性の 高 い プ ロ モ ー タ ー配列 を分離す る た め に比較的大 き な コ ロ ニ ー を形成す る 株を選択 し た た め に、 後記す る 実施例 で示す よ う に分離 さ れた プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配列 の な か に は、 同時 に、 プ ラ ス ミ ドの安定性を改善 し 、 よ り 安定 にす る 機能を持つ D N A 配列 も 取得す る こ と がで き た。 ま た さ ら に、 当業者に と り 、 こ の形質転換 系 を利用 す る こ と に よ っ て、 こ の ほ か セ ン ト ロ メ ァ配列 な ど種 々 の機能を有す る D N A 配列 の取得が可能であ る こ と は容易 に想到可能 と 考え る 。 A method for isolating other functional genes of a Candida utilis, and a method for prototyping in a Candida utilis yeast according to the above-described present invention. The method for isolating a DNA having motor activity also provides a method for isolating a DNA sequence having a function of enhancing the stability of a plasmid containing ARS. One of the features of the existence of the plasmid containing ARS in the Canadian utility is that its stability is low and that it can be used under nonselective conditions. By culturing for about 3 to 4 generations, the proportion of cells retaining plasmid is 20 to 30% of the total. descend . For this reason, on the plate containing the selection drug, the strain carrying the ARS plasmid having the drug resistance gene is the same as the strain having the drug resistance gene integrated on the chromosome. In comparison, even though the number of copies per cell is the same, a slightly smaller colony is formed. In the present invention, a strain that forms a relatively large colony was selected in order to isolate a highly active promoter sequence. In some of the isolated DNA sequences having promoter activity, as shown in the Examples, the stability of the plasmid was improved and the stability was improved. It was also possible to obtain a DNA sequence having the following functions: In addition, those skilled in the art can use this transformation system to obtain DNAs having various functions such as centromeric sequences. It is easy to imagine that it is possible to obtain an array.
薬剤耐性マ ー カ 一遺伝子を含ま な い形質転換体の作出法 前述の本発明 に よ る 自 律複製能を有す る D N A 配列の 利用 に よ り 、 更 に、 薬剤耐性マ ー カ ー遣伝子を含 ま な い 形.質転換体の作出法が提供 さ れ る 。 具体的 に は、 薬剤耐 性マ ー カ ー遺伝子を含 ま な い形質転換体 は、 以下の手順 に よ り 取得可能で あ る 。 始め に前記の 形質転換体選択の た め の選択マ ー カ ー遺伝子を持 たず、 染色体 D N A と 相 同 な 配列 （相 同 D N A 配列） を含む プ ラ ス ミ ド D N A を こ の相 同 D N A 配列内 の適当 な制限酵素サ イ ト で分解す る こ と に よ り 直鎖状 と す る 。 こ れ に よ り 、 こ の 直鎖状 プ ラ ス ミ ド D N A は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体の相 同 D N A配列上 に組み込 ま れ る 得 る も の と な る 。 そ の後 こ の 直鎖状プ ラ ス ミ ド D N A を、 A R S を含む D N A配 列 と 選択マ ー カ ー遣伝子 と を持つ プ ラ ス ミ ド と 同時 に酵 母の形質転換 に 用 い る 。 次 に A R S を含む プ ラ ス ミ ドが 導入 さ れた こ と に よ り 選択 さ れ る 形質転換体の な かか ら 同時 に形質転換 に用 い た D N A断片が染色体上に組み込 ま れ た株を、 D N A 断片 に含 ま れ る 異種遣伝子な ど の発 現を み る か、 ま た は P C R、 サザ ン 解析な どで D N A 断 片の組み込み を確認す る こ と な ど し て、 二次的 に選択す る 。 さ ら に選択 さ れた株 に存在す る 自 律複製能プ ラ ス ミ ド は、 非選択条件下で菌を培養す る こ と に よ っ て容易 に 脱落 さ せ る こ と が可能で あ る 。 こ れ に よ り 、 選択マ ー カ 一遺伝子を保持せず、 挿入 D N A 断片だ け を染色体上 に 保持す る 株を取得す る こ と が可能で あ る 。 Method for Creating a Transformant Containing No Drug-Resistant Marker Gene By utilizing the autonomously replicating DNA sequence according to the present invention described above, it is possible to further enhance drug-resistant marker transfer. A method that does not include a gene is provided. Specifically, a transformant not containing the drug-resistant marker gene can be obtained by the following procedure. First, a plasmid DNA which does not have a selection marker gene for the above-mentioned transformant selection and which contains a sequence homologous to chromosomal DNA (homologous DNA sequence) is used as the homologous DNA. It is made linear by digestion with an appropriate restriction enzyme site in the sequence. As a result, this linear Lasmid DNA is the one that can be integrated on the homologous DNA sequence of the Candida utilis chromosome. This linear plasmid DNA is then used to transform the yeast simultaneously with the plasmid containing the ARS-containing DNA sequence and the selection marker gene. . Next, the DNA fragment used for the transformation is simultaneously integrated into the chromosome from among the transformants selected by the introduction of the plasmid containing ARS. The expression of the heterologous gene contained in the DNA fragment, or confirm the integration of the DNA fragment by PCR, Southern analysis, etc. And make a secondary choice. The autonomously replicating plasmid present in the more selected strains can be easily eliminated by culturing the bacteria under non-selective conditions. is there . This makes it possible to obtain a strain that does not retain the selected marker gene and retains only the inserted DNA fragment on the chromosome.
キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体の 部位特異的変異法 本発明 の 別の態様 に よ れば、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス..染色体の 部位特異的変異法が提供 さ れ る 。 こ の方法 は 選択マ ー カ ー 遺伝子を タ ー ゲ ッ ト 遺伝子 に挿入 し て機能 を失わ せ た遺伝子分断 カ セ ッ ト を、 染色体の タ ー ゲ ッ ト 遺伝子の 置換体 と し て使用 す る こ と に基づ く 。 こ の カ セ ッ ト は、 そ の両端 に 染色体 タ ー ゲ ッ ト 遺伝子 に相 同で組 換え可能な D N A配列 （相 同 D N A配列） を含み、 かつ そ れ ら の 間 に 少な く と も 1 つ の選択 マ ー カ ー遺伝子を含 ん でな る 、 線状 D N A構造を な す も の で あ る 。 こ の う ち 挿入可能な D N A断片 は、 そ れが染色体上 に存在す る と き と 同 じ 方向であ る こ と が重要で あ る 。 こ の カ セ ッ ト を 用 い て酵母を形質転換す る こ と に よ り 、 こ の マ ー カ ー遣 伝子 と そ の両側 に存在す る 挿入可能な D N A配列 と が宿 主 に取 り 込 ま れ る 。 こ の形質転換の結果 と し て、 組み込 み部位の タ ー ゲ ッ ト 遺伝子が破壊 さ .れ、 新規な 形質を有 す る 酵母株が得 ら れ る 。 選択マ ー カ ー 遺伝子 は好 ま し く は薬剤耐性遺伝子で あ り 、 遺伝子が破壌 さ れた形質転換 体 は薬剤耐性 に よ り 選択で き る 。 遣伝子修飾の タ ー ゲ ッ ト に な り う る 遣伝子 は 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色 体由来の遣伝子であ る の が好 ま し い。 具体的 に は U R A 3 、 A D E l 、 A D E 2 、 H I S 4 遺伝子な どが挙 げ ら れ る が、 こ れ ら に 限定 さ れ る も の で は な い。 Candida utilis chromosome site-specific mutagenesis According to another aspect of the present invention, a Candida utilis chromosome site-specific mutagenesis. A law is provided. This method uses a gene-separated cassette, which has lost its function by inserting the selected marker gene into the target gene, as a replacement for the chromosomal target gene. On the basis of This cassette contains at both ends a DNA sequence homologously recombinable with the chromosomal target gene (homologous DNA sequence), and at least one fragment between them. Includes one selection marker gene In other words, they form a linear DNA structure. It is important that the insertable DNA fragment has the same orientation as that on the chromosome. By transforming yeast using this cassette, the host gene will be able to transfer the marker gene and the insertable DNA sequences present on both sides of the marker gene. Will be inserted. As a result of this transformation, the target gene at the integration site is disrupted, and a yeast strain having a new trait is obtained. The selection marker gene is preferably a drug resistance gene, and transformants in which the gene has been destroyed can be selected by drug resistance. The gene that is the target of the gene modification is preferably a gene derived from a Candida utililis chromosome. Specific examples include, but are not limited to, the URA3, ADE1, ADE2, and HIS4 genes.
例え ば、 キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス U R A 3 遺伝子を シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 L 4 1 遺伝子な どの選択マ ー カ ー 遣伝子 に よ り 分断 し て、 機能を持た な い遺伝子 と し た後 形.質転換 に用 い る 。 得 ら れた シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性の 形 質転換体 は、 染色体上の U R A 3 遺伝子 2 個 の う ち 1 個 が破壊 さ れて い る 。 続 い て G 4 1 8 耐性遺伝子な ど他の 選択マ ー カ ー遺伝子 に よ り 分断 さ れた U R A 3 遺伝子断 片を用 い て、 1 個 の U R A 3 遺伝子が破壊 さ れた前記株 を形質転換す る こ と に よ り 、 U R A 3 遺伝子力 2 個 と も 破壊 さ れた株を得 る こ と がで き る 。 u r a 3 変異株 は ゥ ラ シ ル生合成経路中間体の毒性類似体であ る 5 — フ ルォ 口 才 ロ チ ン酸 （ 5 — F O A ) に耐性 と な る こ と が知 ら れ て い る 。 よ っ て、 2 個 の う ち 1 個 の U R A 3 遣伝子が破 壊 さ れた株を遣伝子置換す る こ と で得 ら れた、 U R A 3 遺伝子が 2 個 と も 機能を失 っ た u r a 3 変異株を、 5 — F O A耐性株 と し て取得す る こ と も 可能であ る 。 こ れ に よ っ て得 ら れ る u r a 3 変異株を宿主 と し て用 い る こ と に よ り 、 U R A 3 遺伝子を選択マ ー カ ー遺伝子 と し た、 薬剤耐性遣伝子マ ー カ ー に よ ら な い形質転換体取得 も 可 能 に な る 。 さ ら に こ う し て得 ら れ る 栄養要求性変異株 は 化学的突然変異法 に よ り 作製 さ れた株の よ う に、 そ の他 の遗伝子座 に生 じ う る 二次突然変異の影響を受 け る 可能 性が き わ め て低 い と い う 利点を有す る 。 For example, the Candida utilis URA3 gene is divided into selectable marker genes such as the cycloimidide-resistant L41 gene to function as a chromosome. After transforming into a gene that does not have a gene, it is used for transformation. In the obtained cycloheximide resistant transformant, one out of two URA3 genes on the chromosome has been disrupted. Subsequently, the above strain in which one URA3 gene was disrupted was used by using a URA3 gene fragment separated by another selection marker gene such as a G418 resistance gene. By transformation, it is possible to obtain a strain in which two URA3 genes have been disrupted. ura 3 mutant is ゥ It is known to be resistant to 5-toxic fluorotinic acid (5-FOA), a toxic analog of the lacyl biosynthetic pathway intermediate. Thus, one of the two URA3 genes lost function by replacing the disrupted strain with one of the two URA3 genes lost function. It is also possible to obtain the ura 3 mutant as a 5—FOA resistant strain. By using the ura3 mutant obtained as a host as a host, a drug-resistant gene marker using the URA3 gene as a selection marker gene was obtained. It is also possible to obtain transformants that do not depend on the target. The auxotrophic mutants obtained in this way are, like strains produced by chemical mutagenesis, secondary to the other gene loci. It has the advantage of being very unlikely to be affected by the mutation.
L 4 1 遺伝子  L 4 1 gene
本発明 に よ れば、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ ー ム 構成蛋白質 L 4 1 、 な ら び に、 そ れを コ ー ドす る 遺 伝子、 そ の プ ロ モ ー タ ー 、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列が 提供 さ れ る 。  According to the present invention, the ribosome-constituting protein L41 of Candida utilis, the gene encoding it, and the gene encoding it An array of promoters and terminators is provided.
本発明 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス の 蛋 白 質 L 4 1 は、 具体的 に は 図 1 4 に記載の ア ミ ノ 酸配列 （配 列番号 ： 6 ) を有す る も の で あ る 。 従 っ て、 本発明 に よ る L 4 1 遺伝子 は、 図 1 4 に記載の ア ミ ノ 酸配列 を コ ー ドす る も の で あ る 。 さ ら に、 こ の 遣伝子 と 、 そ の プ ロ モ 一 夕 一、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 と を含ん で な る 塩基 配列の具体例 は、 図 1 3 (配列番号 ： 5 ) に示 さ れ る 塩 基配列で あ る 。. The protein L41 of Candida utilis according to the present invention specifically has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) shown in FIG. That's what it is. Therefore, the L41 gene according to the present invention encodes the amino acid sequence shown in FIG. In addition, a base comprising this gene, its promoter, and its terminator sequence A specific example of the sequence is the base sequence shown in FIG. 13 (SEQ ID NO: 5). .
ま た、 さ ら に本発明 に よ れば、 部位特異的変異作製法 に よ り 、 5 6番 目 の ア ミ ノ 酸残基が プ ロ リ ン か ら グノレ タ ミ ン に変換 さ れた シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 蛋 白 質を コ ー ドす る 変異型 L 4 1 遣伝子が提供 さ れ る 。 こ の シ ク 口 へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子 は、 前記 し た よ う に、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 形質転換の選択マ ー カ ー遺 伝子 と し て有用 で あ る ほ か、 他の酵母、 た と え ばサ ッ カ ロ マ イ セ ス 属酵母の形質転換マ ー カ ー遺伝子 と し て も 使 用 で き る 。 ま た、 さ ら に こ の遺伝子の プ ロ モ ー タ ー、 夕 一 ミ ネ ー タ ー配列 は異種遺伝子の 発現 に も 使用可能で あ る の は言 う ま で も な い。  Furthermore, according to the present invention, the 56th amino acid residue was converted from proline to gnoretamin by the site-directed mutagenesis method. A mutant L41 gene encoding a cycloheximide-resistant L41 protein is provided. As described above, this translocated heximid-resistant L41 gene is a selected marker gene for the transformation of Candida utilis. In addition to being useful as offspring, it can also be used as a transformation marker gene for other yeasts, for example, Saccharomyces yeasts. Moreover, it goes without saying that the promoter of the gene and the Yuichiichi Minerta sequence can also be used for the expression of a heterologous gene.
P G K遺伝子  P G K gene
本発明 に よ れば、 ま た、 P G K遺伝子の プ ロ モ ー タ ー 配列、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列が提供 さ れ る 。  According to the present invention, there are also provided a promoter sequence of a PKK gene and a sequence of a terminator.
プ ロ モ ー タ ー配列の 好ま し い具体例 と し て は、 図 3 に 記.載の塩基配列 （配列番号 ： 2 ) の 内 、 少な く と も 9 4 6 番〜 1 3 4 6 番 ま で の 配列 を有す る 配列、 お よ び プ ロ モ ー タ ー 活性を保持す る そ の 部分配列が挙げ ら れ る ま た、 タ ー ミ ネ ー タ 一配列 の 好 ま し い具体例 と し て は 図 2 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 1 ) 、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー活性を保持す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る 。  A preferred specific example of the promoter sequence is shown in FIG. 3 and at least 946 to 13346 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) described in FIG. A sequence having the previous sequence and a partial sequence retaining promoter activity are also listed, and a preferred specific example of a terminal sequence is included. Examples include the nucleotide sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1) and its partial sequence that retains the terminator activity.
こ の プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と を適当 な プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に接続す る こ と に よ り 、 キ ャ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス で利用可能な 発現ベ ク タ ー を得 る こ と がで き る 。 こ の た め の プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー と し て は This promoter array and terminator array By connecting to a suitable plasmid vector, it is possible to obtain an expression vector that can be used in the Canadian * utility. As a push vector for this,
P B 1 u e s c r i p t 、 p U C 1 9 な ど公知の 大腸菌 プ ラ ス ミ ド ま た は、 シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子な どの選 択マ ー カ ー遺伝子 と 、 さ ら に必要 に応 じ て染色体 タ ー ゲ ッ ト 遣伝子 に相同で組換え可能な D N A 配列 と を含む酵 母一大腸菌 シ ャ ト ノレ プ ラ ス ミ ドが利用 で き る 。 ま た、 他 の 宿主細胞、 特 に サ ッ カ ロ マ イ セ ス 属酵母、 に お い て も プ ロ モ ー タ ー、 ま た は タ ー ミ ネ ー タ 一 と し て利用す る こ と も 可能で あ る こ と は 当業者 に 明 ら かで あ る と 考え る 。  A selected marker gene such as E. coli plasmid or known E. coli plasmid such as PB1uescript or pUC19, or cycloheximide-resistant L41 gene, and further, If necessary, an enzyme comprising a DNA sequence homologous to a chromosome target gene and a recombination-recognizable gene can be used. In addition, other host cells, particularly yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear that what is possible will be clear to the person skilled in the art.
P G K遺伝子 は解糖系酵素の 遺伝子で あ り 、 そ の他の 解糖系酵素の遺伝子 と 共に キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で 大量 に発現 し て い る こ と か ら 、 強力 な プ ロ モ ー タ ー であ る こ と が期待 さ れ る 。 後記す る 実施例で は、 作製 し た発 現べ ク タ ー を用 い て異種遺伝子で あ る ダル コ ア ミ ラ ー ゼ 遺伝子、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 遣.伝子、 β ガ ラ ウ ト シ ダー ゼ遺伝子な ど の 発現 に、 こ の プ ロ モ ー タ ー が有利 に利用 で き る こ と が明 ら か に さ れて い る  The PGK gene is a glycolytic enzyme gene, and is expressed in large quantities in Candida utilis together with other glycolytic enzyme genes. It is expected to be a powerful promoter. In the examples described later, using the produced expression vector, the dalcoamylase gene, which is a heterologous gene, and an aminoglycoside phosphophoton were used. It has been revealed that this promoter can be used to advantage in the expression of genes such as genes and β-galactosidase genes. ing
ま た、 本発明 に よ る P G K 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と に連結 し た遺伝子の 発現量が減少 し な け れば、 そ れ ら の 一部を欠損 さ せ る こ と に よ っ て、 発現べ ク タ 一を小型化す る こ と も 可能で あ る こ と は 当業 者に 自 明の事項であ ろ う 。 In addition, if the expression level of the gene linked to the PGK gene promoter sequence and the terminator sequence according to the present invention is not reduced, a part of the gene is linked to the promoter sequence. The fact that it is possible to reduce the size of the expression vector by deleting It would be a matter obvious to the person.
G A P 遺伝子 . GAP gene.
本発明 に よ れば、 G A P 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー配列お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列が提供 さ れ る 。  According to the present invention, a promoter sequence and a terminator sequence of the GAP gene are provided.
プ ロ モ ー タ ー配列の好 ま し い具体例 と し て は、 図 3 0 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 7 ) 、 お よ び プ ロ モ ー タ 一活性を保持す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る 。  Preferable specific examples of the promoter sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 30 (SEQ ID NO: 7) and the nucleotide sequence retaining one promoter activity. Subsequences are listed.
ま た、 タ ー ミ ネ ー タ 一配列 の好 ま し い具体例 と し て は 図 3 1 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 8 ) 、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー活性を保持す る そ の部分配列が挙げ ら れ る 。  Preferred examples of the terminator sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 31 (SEQ ID NO: 8) and retention of the terminator activity. Subsequent subsequences are listed.
こ の プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と を適当 な プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に接続す る こ と に よ り 、 キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス で利用可能な発現ベ ク タ ー を得 る こ と がで き る 。 こ の た め の プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー と し て は p B 1 u e s c r i p t 、 p U C 1 9 な ど公知の大腸菌 プ ラ ス ミ ド ま た は、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子な どの選 択マ ー カ ー遺伝子 と 、 さ ら に必要 に応 じ て染色体 タ ー ゲ ッ..ト 遺伝子に相同で組換え可能な D N A 配列 と を含む酵 母一大腸菌 シ ャ ト ル プ ラ ス ミ ドが利用 で き る 。 ま た、 他 の 宿主細胞、 特 に サ ッ カ ロ マ イ セ ス 属酵母、 に お い て も プ ロ モ ー タ ー 、 ま た は タ ー ミ ネ ー タ 一 と し て利用 す る こ と も 可能で あ る こ と は 当業者 に 明 ら かで あ る と 考え る 。  By connecting this promoter array and the terminator array to an appropriate plasma vector, candidacy is achieved. You can get an expression vector that can be used in the list. Examples of the plasmid vector for this purpose include known E. coli plasmids such as pB1uescript and pUC19, and cycloheximide-resistant types. An Escherichia coli containing a selected marker gene such as the L41 gene and, if necessary, a chromosome target. A DNA sequence homologous to the gene and capable of recombination. Shuttle plusm is available. In addition, other host cells, especially yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear that what is possible will be clear to the person skilled in the art.
G A P 遺伝子 は解糖系酵素の遺伝子で あ り 、 そ の他の 解糖系酵素の遺伝子 と 共 に キ ャ ン デ ィ ダ ' ュ テ ィ リ ス で 大量 に発現 し て い る こ と か ら 、 強力 な プ ロ モ ー タ ー を有 す る こ と が期待 さ れ る 。 後記す る 実施例で は、 作製 し た 発現べ ク タ ー を用 い て異種遺伝子で あ る ァ ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遺伝子の 発現 に、 こ の プ 口 モ ー タ ー が有利 に利用 で き る こ と が明 ら か に さ れて い る o The GAP gene is a glycolytic enzyme gene. Because it is expressed in large quantities, it is expected that it will have a strong promoter. In the examples described below, the expression vector thus prepared was used to express a heterologous gene, a aminoglycosidase phosphotransferase gene. O It has been clarified that this motor can be used to advantage o
ま た、 本発明 に よ る G A P 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と に連結 し た遣伝子の 発現量が減少 し な け れば、 そ れ ら の一部を欠損 さ せ る こ と に よ っ て、 発現べ ク タ 一を小型化す る こ と も 可能であ る こ と は 当業 者 に 自 明の事項で あ ろ う 。  In addition, if the expression level of the gene linked to the promoter sequence and the terminator sequence of the GAP gene according to the present invention does not decrease, they may be reduced. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size by deleting a part of the expression vector.
P M A 遺伝子  P M A gene
本発明 に よ れば、 P M A 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー配列、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー配列が提供 さ れ る 。  According to the present invention, a promoter sequence and a terminator sequence of a PMA gene are provided.
プ ロ モ ー タ ー配列の好 ま し い具体例 と し て は、 図 3 4 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 9 ) 、 お よ び プ ロ モ ー タ 一活性を保持す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る 。  Preferable specific examples of the promoter sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 34 (SEQ ID NO: 9) and the nucleotide sequence retaining one promoter activity. Subsequences are listed.
，ま た、 タ ー ミ ネ ー タ 一配列の好 ま し い具体例 と し て は 図 3 5 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 1 0 ) 、 お よ び 夕 一 ミ ネ ー タ ー 活性を保持す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る こ の プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と を適当 な プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に 接続す る こ と に よ り 、 キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス で利用可能な 発現ベ ク タ ー を得 る こ と がで き る n こ の た め の プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー と し て は p B 1 u e s c r i p t 、 p U C 1 9 な ど公知の 大腸菌 プラ ス ミ ド ま た は、 シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子な どの選 択マ ー カ ー遣伝子 と 、 さ ら に必要 に 応 じ て染色体 タ ー ゲ ッ ト 遺伝子 に相同で組換え可能な D N A 配列 と を含む酵 母一大腸菌 シ ャ ト ゾレ プ ラ ス ミ ドが利用 で き る 。 ま た、 他 の宿主細胞、 特 に サ ッ カ ロ マ イ セ ス属酵母、 に お い て も プ ロ モ ー タ ー 、 ま た は タ ー ミ ネ ー タ と し て利用す る こ と も 可能であ る こ と は 当業者 に 明 ら かで あ る と 考え る 。 Preferred examples of the terminator sequence include the nucleotide sequence shown in FIG. 35 (SEQ ID NO: 10), and the activity of the terminator. Connect the promoter array and the terminator array to the appropriate plasma vector, where the partial sequence that holds the I Ri, a key catcher down de Lee da Interview te I of Me other n this that Ki the expression vector click Turn-available in the re-scan out and give Ru this flop La scan Mi Dobe click data over to Is A known marker gene such as E. coli plasmid or cycloheximide-resistant L41 gene such as pB1uescript or pUC19 is used. Further, if necessary, an enzyme comprising a homologous recombination DNA sequence with a chromosome target gene and an Escherichia coli shutozoleplasmid can be used. In addition, other host cells, especially yeasts belonging to the genus Saccharomyces, may be used as promoters or terminators. It is clear to a person skilled in the art that this is also possible.
P M A 遣伝子 は原形質膜酵素の遺伝子で あ り 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス酵母 に お い て は原形質膜 タ ン パ ク 質の約 1 0 % を 占 め て い る 主要 夕 ン パ ク 質で あ る こ と が知 ら れて い る 。 従 っ て、 こ の P M A 遺伝子 は、 強力 な プ ロ モ ー タ ー を有 し て い る こ と が期待 さ れ る 。 後記す る 実施例で は、 作製 し た発現べ ク タ ー を用 い て異種遺伝子で あ る ァ ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遣伝子の発現 に こ の プ ロ モ ー タ ー が有利 に利用 で き る こ と が明 ら か に さ れて い る 。  The PMA gene is a gene for a plasma membrane enzyme, and in Saccharomyces yeast, it accounts for about 10% of plasma membrane proteins. It is known to be proteinaceous. Therefore, this PMA gene is expected to have a strong promoter. In the examples described below, the expression vector thus prepared was used to express a heterologous gene, an aminoglycoside phosphotransfer gene. It has been shown that this promoter can be used to advantage in expression.
. ま た、 本発明 に よ る P M A 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー配列 と タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と に連結 し た遺伝子の 発現量が減少 し な け れば、 そ れ ら の 一部を欠損 さ せ る こ と に よ っ て、 発現ベ ク タ ー を小型化す る こ と も 可能で あ る こ と は 当業 者 に 自 明 の事項で あ ろ う 。  Further, if the expression level of the gene linked to the PMA gene promoter sequence and the terminator sequence according to the present invention is not reduced, a part of the gene may be used. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size by deleting the expression vector.
プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配列 DNA sequence with promoter activity
本発明 に よ れば、 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配 列が提供 さ れ る 。 こ の D N A 配列 は、 自 律複製能を有す る D N A 配列 と、 転写の た め の プ ロ モ ー タ ー配列を持た な い薬剤耐性マ ー カ ー 遺伝子 と を含ん で な る べ ク タ ー を 利用 し て分離 さ れ る 。 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 配列 の 好 ま し い具体例 と し て は、 図 4 8 に記載の塩基配 列 （配列番号 ： 1 3 ) 、 お よ び プ ロ モ ー タ ー活性を保持 す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る 。 ま た、 後記す る 実施例 で詳述す る よ う に 、 こ の ベ ク タ ー を利用 し て、 図 4 8 に 記載の塩基配列が明 ら か に さ れ た プ ロ モ ー タ ー 活性を有 す る D N A 配列以外 に、 8 種類の D N A 配列が取得 さ れ た。 こ の転写の た め の プ ロ モ ー タ ー 配列 を持た な い薬剤 耐性遺伝子を例え ばハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性遺伝子な ど 他の遺伝子 に 置 き 換え る こ と に よ つ て も 同様 に、 プ ロ モ 一 タ ー 活性を有す る D N A 配列 を分離で き る 。 ま た、 さ ら に形質転換体を選択す る プ レ ー ト に 含 ま れ る 糖の 種類 や、 そ の 他の 培地組成 な ど選択条件を変更す る こ と に よ り 、 あ る 特異的な 条件下で転写活性が誘導 さ れ る プ ロ モ 一 .タ ー を取得す る こ と が可能で あ る 。 こ れ ら の こ と は、 本明細書の 開示を参照すれば、 当業者 に 容易 に理解 さ れ る 事項で あ ろ う 。 According to the present invention, a DNA sequence having promoter activity is provided. A column is provided. This DNA sequence should include a DNA sequence capable of autonomous replication and a drug-resistant marker gene that does not have a promoter sequence for transcription. Are separated by using Preferred specific examples of the DNA sequence having promoter activity include the base sequence (SEQ ID NO: 13) shown in FIG. 48 and the promoter. -The subsequences that retain activity are listed. Further, as will be described in detail in Examples described later, a promoter in which the nucleotide sequence shown in FIG. 48 was clarified using this vector. In addition to the active DNA sequences, eight types of DNA sequences were obtained. For example, a drug resistance gene that does not have a promoter sequence for this transcription can be replaced with another gene, such as a hygromycin B resistance gene. Similarly, a DNA sequence having promoter activity can be isolated. Furthermore, by changing the selection conditions such as the type of sugar contained in the plate from which the transformants are selected and other medium compositions, certain specificities can be obtained. It is possible to obtain promoters whose transcriptional activity is induced under typical conditions. These will be readily understood by those skilled in the art in light of the disclosure herein.
こ の プ ロ モ ー タ ー配列 を適当 な タ ー ミ ネ ー タ ー配列 と と も に適当 な プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に 接続す る こ と に よ り キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で利用可能 な 発現ベ ク タ ー を 得 る こ と がで き る 。 こ の た め の プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー と し て は pB lues cr ip t 、 p U C 1 9 な ど公知の大腸菌 プ ラ ス ミ ド、 ま た は、. シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遺伝子な どの選択マ ー カ ー遺伝子 と 、 さ ら に必要 に応 じ て染色体 タ ー ゲ ッ ト 遺伝子 に相同で組換え可能な D N A配列 と を 含む酵母一大腸菌 シ ャ ト ル プ ラ ス ミ ドが利用 で き る 。 ま た、 他の宿主細胞、 特 に サ ッ カ ロ マ イ セ ス属酵母、 に お い て も 、 プ ロ モ ー タ ー と し て利用 す る こ と も 可能で あ る こ と は 当業者 に 明 ら かで あ る と 考え る 。 By connecting this promoter array with an appropriate terminator array and an appropriate plasma vector, you can use You can obtain an expression vector that can be used in the utility. A premium vector for this purpose E. coli plasmids such as pBluescript, pUC19, or selected marker genes such as cycloheximide-resistant L41 gene And, if necessary, a yeast-Escherichia coli shuttle plasmid containing a DNA sequence homologous to the chromosome target gene and capable of recombination can be used. It is also true that other host cells, particularly yeast of the genus Saccharomyces, can be used as a promoter. I think it is clear to the trader.
後記す る 実施例で は、 作製 し た発現ベ ク タ ー を用 い て 異種遣伝子で あ る ア ミ ノ グ リ コ シ ド ホ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ遗伝子の発現 に、 こ の プ ロ モ ー タ ー が有利 に利 用 で き る こ と が明 ら か に さ れて い る 。  In the examples described below, the expression vector was used to produce a heterologous gene, Amino Glycosid Phosphotransferase gene. It has been shown that this promoter can be used to advantage in the expression of offspring.
ま た、 本発明 に よ る プ ロ モ ー タ ー 配列 に連結 し た遺伝 子の 発現量が減少 し な け れば、 そ れ ら の一部を欠損 さ せ る こ と に よ っ て、 発現ベ ク タ ー を小型化す る こ と も 可能 で あ る こ と は 当業者 に 自 明の事項で あ ろ う 。  Further, if the expression level of the gene linked to the promoter sequence according to the present invention does not decrease, it is possible to delete a part of the gene. It will be obvious to those skilled in the art that the expression vector can be reduced in size.
r R N A遣伝子  r R N A
，本発明 に よ れば、 さ ら に、 キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス の r R N A遺伝子を 含ん で な る 、 約 1 3 . 5 k b の D N A 断片、 お よ びそ の 断片が反復 さ れて な る D N A配列が提 供 さ れ る 。  According to the present invention, furthermore, a DNA fragment of about 13.5 kb, which contains the rRNA gene of Candida utilis, and a fragment thereof are repetitively prepared. The resulting DNA sequence is provided.
こ の 約 1 3 . 5 k b の 断片 は、 図 6 ( b ) に 示 さ れ る 制限酵素地図で表 さ れ る も の で あ る 。 こ の D N A配列の う ち 1 8 S 、 5 . 8 S 、 2 5 S r R N A遺伝子の 位置 は図 6 ( b ) に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 This approximately 13.5 kb fragment is represented by the restriction map shown in FIG. 6 (b). Location of the 18S, 5.8S and 25S rRNA genes in this DNA sequence Was as shown in Fig. 6 (b).
こ の r R N A遺伝子の一部の領域を D N A断片の染色 体組み込み の た め の タ ー ゲ ッ ト 配列 と し て用 い る こ と に よ り 、 効率的で多 コ ピ ー の組み込みが達成 さ れ る 。 こ の 約 1 3 . 5 k b の D N A 断片を 4 個 の 断片 に分 け て ブ ラ ス ミ ドを構築 し 、 そ れぞれ、 形質転換に用 い た と こ ろ 、 興味あ る こ と に、 組み込み タ ー ゲ ッ ト 配列 と し て使用 す る 領域 に よ っ て、 得 ら れ る 形質転換頻度 に差が認め ら れ た。 すな わ ち 、 図 2 0 の 1 8 S r R N A遺伝子の 3 ' 側一部 と 5 . 8 5 r R N A遺伝子、 さ ら に 2 5 S r R N A遺伝子の 5 ' 側一部を含む 3 . 5 k b の E c o R I 断片を含むプ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 ま た は 2 5 S r R N A遣伝子の 3 ' 側一部を含む 3 k b の E c o R I 断片を含む プ ラ ス ミ ド P C L R E 6 と 1 8 S r R N A遺伝子の 5 ' 側一部を含む 4 . 7 k b の E c o R I 断 片を含む プ ラ ス ミ ド p C L E 7 で は、 高頻度で形質転換 体が得 ら れた が、 一方、 1 8 S r R N A遺伝子を含む 2.. 4 k b E c o R I 断片を含む プ ラ ス ミ ド p C L R E 5 で は得 ら れ る 形質転換頻度が低か つ た。  By using a part of this rRNA gene as a target sequence for the integration of chromosomes into DNA fragments, efficient and multicopy integration can be achieved. It is done. It is interesting to note that this approximately 13.5 kb DNA fragment was divided into four fragments to construct a plasmid, which was used for transformation, respectively. However, a difference was found in the frequency of transformation obtained depending on the region used as the integration target sequence. That is, in Fig. 20, 3.5 including the 3 'part of the 18S rRNA gene and 5.85 rRNA gene, and 3.5 parts including the 5' side of the 25S rRNA gene. A plasmid containing a kb EcoRI fragment, pCLRE4, or a plasmid containing a 3 kb EcoRI fragment containing the 3 'part of the 25S rRNA gene. Plasmid p CLE7, which contains a 4.7 kb EcoRI fragment containing PCLRE 6 and the 5 'part of the 18S rRNA gene, can be used to transform frequently. On the other hand, the transformation frequency obtained with the plasmid pCLRE5 containing the 2.4 kb EcoRI fragment containing the 18S rRNA gene was low.
U R A 3 遺伝子  URA3 gene
本発明 に よ れば、 さ ら に ま た、 サ ッ カ ロ ミ セ ス · セ レ ピ シ ェ酵母の u r a 3 変異を相補す る 、 キ ヤ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス の U R A 3 遺伝子が提供 さ れ る 。 こ の遺伝子 は、 前記 し た よ う に 、 D N A 断片の組み込み タ ー ゲ ッ ト と し て用 い ら れ る ほか、 染色体 U R A 3 遣伝子の遣伝子 破壊 に よ る u r. a 3 変異株の 作出 に使用 で き る 。 こ れ に よ っ て得 ら れ る u r a 3 変異株を宿主 と し て用 い る こ と に よ り 、 U R A 3 遺伝子を選択マ ー カ ー遣伝子 と し た薬 剤耐性遺伝子マ ー カ ー に よ ら な い形質転換体の取得 も 可 能に な る 。 ま た、 さ ら に こ の遺伝子の プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 は、 異種遣伝子の 発現 に も 使用可 能で あ る の は言 う ま で も な い。 According to the present invention, furthermore, a URA of Candida utilis, which complements the ura3 mutation of Saccharomyces cerevisiae yeast. Three genes are provided. This gene is, as described above, a target for integration of DNA fragments. In addition to this, it can be used for the production of ur.a3 mutants by gene disruption of the chromosome URA3 gene. By using the ura3 mutant obtained as a host as a host, a drug-resistance gene marker using the URA3 gene as a selection marker gene is used. It is also possible to obtain a transformant that does not depend on the target. It goes without saying that the promoter and the terminator sequence of this gene can also be used for the expression of a heterologous gene. Absent.
具体的 な U R A 3 遺伝子 は、 図 1 0 お よ び図 1 1 に示 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 4 ) を コ ー ドす る も の で あ る 。 好 ま し い U R A 3 遣伝子 は図 9 に 示 さ れ る 塩基 配列 （配列番号 ： 3 ) を有す る も の 、 ま た は サ ッ カ ロ ミ セ ス · セ レ ビ シ ェ酵母の u r a 3 変異を相補す る 機能を 保持す る そ の部分配列を有す る も の で あ る 。  A specific URA3 gene encodes the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) shown in FIGS. 10 and 11. Preferred URA3 genes are those having the nucleotide sequence shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 3), or those of Saccharomyces cerevisiae yeast. It has the partial sequence that retains the function of complementing the ura3 mutation.
自 律複製能を有す る D N A配列 （ A R S ) DNA sequence with autonomous replication ability (ARS)
本発明 に よ れば、 自 律複製機能を有す る D N A配列で あ っ て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内で、 当該 D N A配 列 .を含むベ ク タ ー を 、 染色体外要素 と し て の プ ラ ス ミ ド と し て保持 さ せ、 宿主の形質転換頻度を上昇 さ せ る こ と がで き る D N A配列が提供 さ れ る 。 こ の D N A断片 と し て は どの よ う な生物 由来で も 良 い が、 好 ま し く は キ ヤ ン デ ィ ダ . ュ テ ィ リ ス 由来で あ る 。 A R S の好 ま し い具体 例 と し て は、 図 4 1 お よ び図 4 2 に記載の 塩基配列 （配 列番号 ： 1 1 ) 、 あ る い は図 4 3 お よ び図 4 4 に記載の 塩基配列 （配列番号 1 2 ) 、 お よ び 自 律複製機能を有す る そ の 部分配列が挙 げ ら れ る 。 後記す る 実施例か ら 明 ら かな よ う に、 短縮化 し た D N A断片を含む プ ラ ス ミ ド に よ っ て も 、 頻度 は低下す る も の の 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母を形質転換す る こ と が で き る 。 According to the present invention, a vector containing a DNA sequence having an autonomous replication function and containing the DNA sequence in a candidacy * Provided is a DNA sequence which can be retained as a plasmid as an extrachromosomal element to increase the frequency of transformation of a host. The DNA fragment can be from any organism, but is preferably from Candida utilis. Preferred specific examples of ARS include the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) shown in FIG. 41 and FIG. 42, or the nucleotide sequence shown in FIG. 43 and FIG. Stated The base sequence (SEQ ID NO: 12) and its partial sequence having an autonomous replication function are listed. As is evident from the examples described below, even though the frequency of the plasmid containing the shortened DNA fragment is reduced, the frequency of the plasmid is reduced. It is capable of transforming T. cerevisiae yeast.
こ の A R S と 、 適当 な選択マ ー カ ー遺伝子 と を使用 す る こ と に よ り 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内 に お い て プ ラ ス ミ ド と し て存在 し 得 る ベ ク タ ー が提供 さ れ る 。 さ ら に 、 こ の ベ ク タ ー を利用 す る こ と に よ り 、 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A配列や、 そ の他の機能を有す る D N A配列 を分離す る こ と が可能で あ る 。 ま た、 キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A と 相 同 な 配列 （相同 D N A 配列） を含み、 かつ特 に形質転換体を選択す る た め の選 択マ ー カ ー遺伝子を持た な い プ ラ ス ミ ド D N A と と も に A R S と 適当 な選択 マ ー カ ー遺伝子 と を含む プ ラ ス ミ ド を形質転換 に用 い る こ と に よ り 、 選択マ ー カ ー遺伝子を 含 ま ず、 異種遺伝子を 含む D N A 断片の み を染色体上 に 保.持す る 形質転換酵母の作 出が可能で あ る 。 By using this ARS and the appropriate selection marker gene, it is present as a plasmid in the Canadian utility list. Possible vectors are provided. Furthermore, by using this vector, a DNA sequence having promoter activity or a DNA sequence having other functions can be separated. It is possible . In addition, a candidate marker gene containing a sequence homologous to the Candida utilis chromosomal DNA (homologous DNA sequence), and particularly for selecting a transformant. The use of a plasmid containing ARS and an appropriate selection marker gene together with a plasmid DNA lacking the same allows for the selection of the selection marker. It is possible to produce a transformed yeast that retains only a DNA fragment containing a heterologous gene on a chromosome without a gene.
[実 施 例 ] [Example ]
本発明 を以下の実施例 に よ り さ ら に 具体的 に説明す る が、 本発明 は こ れ ら 実施例 に の み 限定 さ れ る も の で は な い o  The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to only these examples.
な お、 各種遣伝子の制限酵素地図 に お け る 制限酵素サ イ ト につ い て は以下の 略号で示 し て あ る 。  Restriction enzyme sites in the restriction map of various genes are indicated by the following abbreviations.
A a ； A a t I U A f ; A f ! I I 、 A 1 ； A f 1 m 、 A a; A at I U Af; A f! I I, A 1; A f 1 m,
A p ； A P a I 、 B ； B a m H I 、 B g ； B g 1 11、Ap; APaI, B; BamHI, Bg; Bg111,
C C 1 a I 、 E ； E c o R I 、 R V ; E c o R V、 H H i n d I I I 、 H p ; H p a I 、 K ; K p n I 、 P P s I 、 P v ； P v u 1 U S ; S a 1 I 、 S e ; S p e I S m ； S m a I 、 S c ； S a c I 、 S c 11 ; CC1aI, E; EcoRI, RV; EcoRV, HHindIII, Hp; HpaI, K; KpnI, PPsI, Pv; Pvu1US; Sa1I Spe; Spe ISm; SmaI, Sc; SacI, Sc11;
S a c 、 S P ； S p h I 、 X ； X b a I 、 お よ び X h ； X h o I で あ る  Sac, SP; SphI, X; XbaI, and Xh; XhoI
ま た、 以下 に記載す る 実施例 に お い て共通 に使用 さ れ る 方法 は以下の と お り で あ る 。  In addition, the method commonly used in the embodiments described below is as follows.
1 ) E x o I I 1 ヌ ク レ ア ー ゼ及び マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ァ 一 ゼを用 い た欠失変異処理 と D N A 配列 の 決定  1) Deletion mutation treatment using ExoI I1 nuclease and Mungbean nuclease and determination of DNA sequence
プ ラ ス K 1 0 β g を適当 な 制限酵素消化 し た後、 フ ェ ノ ー ル ク α 口 ホ ル ム で抽 出 し 、 エ タ ノ ー ル沈殿 に よ り D N A を 回収 し た。 D N A を 1 0 0 1 の E X 0 m 緩衝液 （ 5 0 m M T r i s - H C 1 p H 8 .  After the plasmid K10βg was digested with an appropriate restriction enzyme, it was extracted with a phenolic α-mouthed hole, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. DNA was added to 100 ml of EX0m buffer (50mM Tris-HC1pH8.
0 ， 1 0 0 m M N a C 1 ， 5 m M M g C 1 2 , 1 0 m M 2 メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル ) に 溶解 し 、 1 8 0 ュ ニ ッ ト の E x o l l l ヌ ク レ ア ー ゼを加え、 3 7 °C で保温 し た。 1 分 ご と.に 1 0 1 を サ ン プ リ ン グ し 、 2 サ ン プ ル分ずつ ま と め て、 2 0 1 の M B バ ッ フ ァ ー 0, 1 0 0 m MN a C 1, 5 m MM g C 1 2, 1 0 m M 2 dissolved in main Le mosquito flops example data Roh Lumpur), 1 8 0 Interview Nit Exolll nuclease was added and incubated at 37 ° C. Sampling 10 1 every 1 minute, grouping 2 samples each, and 2 0 1 MB buffer
( 4 0 m M N a - Ac e t a t e, 1 0 0 m M N a C 1 , 2 m M Z n C 1 2 , 1 0 % グ リ セ ロ ー ノレ p H 4 . 5 ) の 入 っ た氷冷 し た チ ュ ー ブ に移 し た。 得 ら れ た 5 本の チ ユ ー ブを 6 5 °C 1 0 分間保温 し て酵考を失活 さ せ た後、 5 ユニ ッ ト の マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを加 え て、 3 7 °C で 3 0 分間反応 し た 。 反応後、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳 動 に よ り 欠失の 程度が異 な る 5 種類の D N A 断片を 回収 し た。 回収 し た D N A は ク レ ノ ウ 酵素で末端を平滑化 し 、 1 6 °C で一晚 ラ イ ゲ ー シ ョ ン 反応 し た後、 大腸菌 を形質 転換 し た。 (4 0 m MN a -. Ac etate, 1 0 0 m MN a C 1, 2 m MZ n C 1 2, 1 0% grayed Li cell B over Honoré p H 4 5) and ice was entering Tsu of Moved to a tube. After incubating the obtained five tubes for 10 minutes at 65 ° C to inactivate the enzyme, 5 units of Mung Bean Nuclease were added. In addition, the reaction was carried out at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, five types of DNA fragments having different degrees of deletion were recovered by agarose gel electrophoresis. The recovered DNA was blunt-ended with Klenow enzyme, subjected to a ligation reaction at 16 ° C, and then transformed into Escherichia coli.
得 ら れ た種 々 の プ ラ ス ミ ドの挿入断片 につ い て、 ア ブ ラ イ ドバ イ ォ シ ス テ ム ズ （株） の 蛍光 プ ラ イ マ ー サ イ ク ル シ ー ク ェ ン ス キ ッ ト を 用 い て シ ー ク ェ ン ス 反応を行 い、 自 動 D N A シ ー ク ェ ン サ一を用 い て D N A 配列 を決定 し た .α  About the obtained inserts of the various plasmids, the fluorescent primer cycle cycle of Avid Biosystems Co., Ltd. The sequencing reaction was performed using a kit, and the DNA sequence was determined using an automatic DNA sequencer.
2 ) ハ イ プ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン  2) High predication
D Ν Α は ァ ガ ロ ー ス ゲ ル電気泳動後、 ハ イ ボ ン ド N + フ ィ ル タ ー （ Ame r s h am) に 、 添 付 の プ ロ ト コ 一ノレ に し た 力く つ て ァ ゾレ カ リ ト ラ ン ス フ ァ ー し て 、 サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン 用 の フ ィ ル タ ー を 作 製 し た 。  After the agarose gel electrophoresis, the DNA was applied to a high-band N + filter (Amersham) using the force applied to the attached protocol. We have created a filter for southern hybridization as an azure recurrence facilitator.
D N A が固定ィ匕 さ れ た フ ィ ノレ タ ー は、 ハ イ プ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ン m ( 6 X S S C , 5 x D e n h a r d t S o l u t i o n, 0 . 2 % s D S , 2 0 β g m I S a l m o n s e r mThe finalizer on which the DNA is fixed is a hybridizer. ー m (6 XSSC, 5 x Denhardt Solution, 0.2% s DS, 20 β gm IS almonserm
D N A ) 中で 6 5 °C 、 2 時間 プ レ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 つ た。 次 に M e g a p r i 1 e D N A l a b e l l i n The pre-hybridization was performed at 65 ° C. for 2 hours in DNA). Next, M e g a p r i 1 e D N A l a b e l l i n
s y s t em s ( A m e r s h am) と [ a - 3 2 P ] d C T P ( 1 1 0 T B q / m m o 1 ) と を用 い て標識化 し た プ ロ ー ブ D N A を、 ノヽ ィ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン 溶液 .に加え、 6 5 °C で 1 6 時間ハ ィ ブ リ ダィ ゼ ー シ ヨ ン を行 っ た。 ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン 後、 フ ィ ル タ ー は I x S S C , 0 . 1 % S D S 中で、 6 5 。C 、 2 時間洗浄 し た後、 オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ 一 に供 し て シ グナ ル を検出 し た。 syst em s and (A mersh am) - a [a 3 2 P] d CTP (1 1 0 TB q / mmo 1) and have use of a labeled the profile over blanking DNA, Nono I Bed Li da I In addition to the solution, a hybridization test was performed at 65 ° C for 16 hours. After hybridisation, the filters were 65 in IxSSC, 0.1% SDS. C. After washing for 2 hours, the sample was subjected to autoradiography to detect a signal.
3 ) 培地組成  3) Medium composition
酵母を培養す る た め の Y P D 培地の組成 は 1 %酵母ェ キ ス 、 2 % バ ク ト ぺ ブ ト ン 、 2 % グル コ ー ス であ り 、 プ レ ー ト の場合 は寒天を 2 % に な る よ う に加え た。 S D 培 地の組成 は、 0 . 6 7 % ア ミ ノ 酸不含 イ ー ス ト ニ ト ロ ジ ェ ン ベ ー ス、 2 % ダル コ ー ス で あ り 、 使用 し た酵母の 栄 養.要求性 に 応 じ て、 ア ミ ノ 酸を添加 し た。 プ レ ー ト の 場 合 は寒天を 2 % に な る よ う に力 Dえ た。  The composition of the YPD medium for culturing yeast is 1% yeast extract, 2% bactone, 2% glucose, and in the case of a plate, 2% agar. %. The composition of the SD medium is 0.67% amino acid-free yeast nitrogen base, 2% dalcose, and is a nutrient for the yeast used. Amino acids were added as required. In the case of plates, the agar was forced to 2%.
4 ) 酵素処理  4) Enzyme treatment
制限酵素反応 、 ク レ ノ ゥ 酵素処理、 T 4 D N A リ ガ一 ゼ反応な ど、 種 々 の酵素 に よ る 反応 は、 メ ー カ ー の 推奨 す る 反応条件、 あ る い は Mo l e c u l a r C l o n i n 2 n d e d i t i o n S a mb r o o k e t a . C o l d S r i n g H a r b o r Labo ra tory Pres s ( 1989 ) に 記載の 方法 に 従 っ て行 っ た 実施例 1 ： キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス 染色体 D N A の調 製 Reactions with various enzymes, such as restriction enzyme reactions, Kleno enzyme treatment, and T4 DNA ligase reactions, may be performed using the reaction conditions recommended by the manufacturer. lonin 2 ndedition S a mb rooketa .Cold S ring H arbor Example 1 Performed according to the method described in Labo tory Press (1989): Preparation of chromosomal DNA of Candida utilis
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス （Candi da u t i l i s)の 染色体 D N A抽 出 は、 以下 に 示す方法で行 っ た。 3 O m l の Y P D 培地 に、 キ ャ ン デ ィ ダ . ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株を植菌 し 、 3 0 °Cで定常期初期 に な る ま で培養 し た。 遠心分離 に よ り 菌体を集め て滅菌水で洗浄 し た後、 再度遠心分離に よ り 集菌 し た。 菌体 は 3 m 1 の ザ ィ モ リ ァ ー ゼ バ ッ フ ァ ー （ り . 9 M ソ ノレ ビ ト ー ノレ 、 0 . 1 M E D T A、 5 0 m M D T T 、 p H 7 . 5 ) に懸濁 し た 後、 2 5 m g / m 1 の ザ ィ モ リ ア ー ゼ 1 0 0 T を含む 0 . 9 Μ ソ ノレ ビ ト ー ノレ を 2 0 0 1 を加え、 3 7 。Cで振 と う 保温 し た。 顕微鏡下で プ ロ ト プ ラ ス ト 化を確認 し た 後、 遠心分離 し て プ ロ ト プ ラ ス ト 化 し た菌を回収 し た。 3 m l の 溶 菌 ノ < ッ フ ァ ー （ 5 0 m M T r i s — H C 1 5 0 m M E D T A、 p H 8 . 0 ) を加え 、 穏や か に、 か..つ十分 に 懸濁 し て か ら 0 . 3 m l の 1 0 % S D S を混 合 し 、 6 5 °Cで一夜保温 し た。 続 い て l m l の 5 M酢酸 カ リ ウ ム 液を加え、 氷上で 1 時間放置 し た。 そ の 後遠心 分離 に よ り 凝集物を 除 き 、 4 m l の 冷却 し た エ タ ノ ー ル を加え 、 遠心分離 し て D N A 等を沈殿 さ せ た。 沈殿 は 5 0 %の エ タ ノ ー ル で洗浄 し 、 乾燥 し た後、 3 m l の R N a s e A ノく ッ フ ァ ー （ 1 0 m M T r i s 一 H C 1 、 1 m M E D T A、 0 0 g / m 1 R N a s e A ^ p H 7 . 5 ) に 溶解 し て、 3 7 °C で 3 0 分保温 し た 。 最後 に 3 m 1 の 2 — プ ロ パ ノ ー ノレ を 加 え 、 遠心分離 し て上清 を 除 い た 後、 沈殿 を 5 0 % の 2 — プ ロ パ ノ ー ル で 洗浄 し 、 乾燥 さ せ た 。 こ の 沈殿 を 0 . 5 m 1 の T E ノく ッ フ ァ ー に 溶解 し た も の を キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A 試料 と し た 。 Chromosomal DNA extraction of Candi da utilis was performed by the method described below. Candida utilis ATCC 9950 strain was inoculated into 3 O ml of YPD medium, and cultured at 30 ° C. until the early stationary phase was reached. The cells were collected by centrifugation, washed with sterilized water, and collected again by centrifugation. The cells are suspended in a 3 ml zymoryze buffer (0.19 M sono-reitol, 0.1 MEDTA, 50 m MDTT, pH 7.5). After the addition, add 0.91 sonobitone containing 25 mg / m1 of Zymoryase 100 T, and add 37 to the mixture. Shake and heat at C. After confirming protoplast formation under a microscope, centrifugation was performed to collect the protoplast-converted bacteria. Add 3 ml of lysate (50 mM MT ris-HC 150 mM EDTA, pH 8.0) and gently or thoroughly suspend. Then, 0.3 ml of 10% SDS was mixed and incubated at 65 ° C overnight. Subsequently, 1 ml of 5 M potassium acetate solution was added, and the mixture was left on ice for 1 hour. Thereafter, aggregates were removed by centrifugation, and 4 ml of cooled ethanol was added, followed by centrifugation to precipitate DNA and the like. The precipitate was washed with 50% ethanol, dried, and then washed with 3 ml of RNase A buffer (10 mM MTris-1). It was dissolved in HC1, 1mMEDTA, 00g / m1 RNase A ^ pH7.5) and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Finally, add 3 ml 1-propanol and centrifuge to remove the supernatant. Wash the precipitate with 50% 2-propanol and dry. I let you. The precipitate dissolved in 0.5 ml of TE buffer was used as a Candida utilis chromosome DNA sample.
実施 例 2 ： ホ ス ホ グ リ セ リ ン 酸 キ ナ ー ゼ （ P G K ) 遺 伝子 の ク ロ ー ニ ン グ  Example 2 Cloning of the Hosoglycerate Acid Kinase (PGK) Gene
キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A を制 限酵素 S a u 3 A I で 部分消 化 し た 後、 0 . 8 M N a C l 、 2 0 m M T r i s - H C 1 、 1 0 m M E D T A  After partially digesting Candida utilis chromosomal DNA with the restriction enzyme Sau3AI, 0.8 MNaCl, 20 m MTris-HC1, 10 m MEDTA
( p H 8 . 0 ) を 含 む 1 0 一 5 0 % シ ョ 糖密度勾配 に 重 層 し て、 120, 000 X g 、 1 4 時 間 の 遠心分離 に よ り D N A 断片 を 分画 し た 。 こ の う ち 1 0 〜 2 0 k b の 染色体 D N A 断片 と 、 B a m H I 消 化 し た 後脱 リ ン 酸化 し た λ フ ァ ー ジ ベ ク タ ー DASHTMI 1 ( a t r a t a g e n e C l o n i ng  DNA fragments were layered on a 100-150% sucrose density gradient containing (pH 8.0) and centrifuged at 120,000 X g for 14 hours. . The chromosomal DNA fragment of 10 to 20 kb and the λ phage vector DASHTMI 1 (atratagenegClonigng) that had been digested with BamHI and then dephosphorylated.
S y.s t e m s ) と を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 一晚連結 し た 続 い て G i g a p a c k I 1 Go l d Pa c k a g i n g Ex t r a c t (S t r a t a g e n e C l o n i ng S y s t ems) を 用 い て イ ン ビ ト ロ パ ッ ケ ー ジ ン グ し 、 キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を 構築 し た 。 (Systems) and T4 DNA ligase, followed by Gigapack I 1 Gold Packing Extract (Stratagene Cloning System). By carrying out biopackaging, a Candida utilis chromosome DNA library was constructed.
キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の P G K 遺伝子 の ク ロ ー 二 ン グ は 、 他生物 の 既知 の P G K 遺伝子 を プ ロ ー ブ と し た ハ イ ブ リ ダ ィ ゼー シ ョ ン 法を用 い て行 っ た。 す な わ ち 、 Mo l e c u l a r C l o n i n 2 n d e d i t i o n S a m b r o o k e t . a 1. p 2. 108-121, C o l d S r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ( 1989 ) に 記載 さ れた方法 に 従 い 、 上記の D N A ラ イ ブ ラ リ ー の約 20, 000プ ラ ー ク の フ ァ ー ジ D N A を 吸着 さ せ た フ ィ ノレ 夕 一を作製 し た。 次 に、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス * セ レ ピ シ ェ の P G K 遺伝子を保持す る プ ラ ス ミ ド p S T 2 ( Yama no e t . a 1. J o u r n a l o f B i o t e c h no l o g y. 32, 165 - Π 1 ( 1994 ) ) か ら P G K 遺伝子を含む D N A 断片を、 2 k b の Cloning of Candida utilis PGK gene probed a known PGK gene of another organism. This was done using the hybridization method. That is, according to the method described in Molecular Clonin 2ndedition Sambrooket.a 1.p 2.108-121, Old Sring Harbor Laboratory (1989), the DNA line described above was used. A finola was prepared by adsorbing about 20,000 plaques of phage DNA from the library. Next, a plasmid pST2 (Yama no et. 165-Π1 (1994)), a 2 kb DNA fragment containing the PGK gene was
C 1 a I 断片 と し て切 り 出 し た。 こ の 断片を 32 P 標識 し て、 こ れを プ ロ ー ブ と し てハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン を行 つ た。 そ の結果 4 つ の 陽性 プ ラ ー ク が分離で き た。 更 に こ れ ら プ ラ ー ク か ら 調製 し た フ ァ ー ジ D N A につ い て さ ま ざ ま な 制限酵素で消化後、 同 じ プ ロ ー ブを用 い てサザ ン 解析を行 っ た。 そ の結果、 プ ロ ー ブ に ハ イ ブ リ ダィ ズ し た 2 . 6 k b E c o R I 断片 と 2 . 5 k b S a l I 断片を単離 し た。 It was cut out as a C1aI fragment. This fragment was labeled with 32 P, and a hybridization was carried out using this as a probe. As a result, four positive plaques could be separated. Furthermore, the phage DNA prepared from these plaques was digested with various restriction enzymes, and then subjected to Southern analysis using the same probe. Was. As a result, a 2.6 kb EcoRI fragment and a 2.5 kb SalI fragment hybridized to the probe were isolated.
実施例 3 ： P G K遺伝子を 含む D N A 断片の塩基配列 決定 と 、 構造遺伝子及 び制御領域 の 特定  Example 3: Nucleotide sequence determination of DNA fragment containing PGK gene and identification of structural gene and regulatory region
単離 し た 2 . 6 k b E c o R I 断片を、 プ ラ ス ミ ド べ ク タ ー B l u e s c r i p t l I SK+ の E c o R I サ イ ト に 組み込 み、 ベ ク タ ー に 対す る 挿入断片の方 向性が互 い に 逆向 き の プ ラ ス ミ ド p P G K E l 、 p P G K E 2 を作製 し た。 ま た、 2 . 5 k b S a 1 I 断片を 同様 に ベ ク タ ー B 1 u e s c r i p t I I SK+ の S a 1 I サ イ ト に 組み込み、 ベ ク タ 一 に対す る 挿入断片の方向性が互 い に 逆向 き の プ ラ ス ミ ド p P G K S l 、 P P G K S 2 を作製 し た （図 1 ) 。 The isolated 2.6 kb EcoRI fragment was incorporated into the EcoRI site of the plasmid vector Bluescriptl ISK +, and the insert fragment to the vector was The plasmids p PGKEl and p PGKE 2 with opposite directions were prepared. Similarly, the 2.5 kb Sa1I fragment was similarly vectorized. The plasmids p PGKSl and PPGKS2 were incorporated into the Sa1I site of B1uescript II SK +, and the inserts were oriented in opposite directions to the vector. (Figure 1 ) .
こ の う ち 、 プ ラ ス ミ ド p P G K E l 、 p P G K E 2 の 2 種の プ ラ ス ミ ド に つ い て、 H i n d l H 、 K p n l 、 S a 1 I な どの制限酵素サ イ 卜 で の 欠失変異体の作製や E x 0 1 I 1 ヌ ク レ ア ー ゼ及び マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼ を用 い て欠失変異体を作製す る こ と に よ り 、 種 々 の欠失 変異を も つ プ ラ ス ミ ド を作製 し 、 2 5 3 0 b p か ら な る E c 0 R I 断片の配列 を決定 し た。  Two types of plasmids, plasmids pPGKEl and pPGKE2, were treated with restriction enzyme sites such as HindlH, Kpnl, and Sa1I. Of deletion mutants of E. coli, and deletion mutants prepared by using Ex01I1 nuclease and Mangby nuclease. Then, plasmids having various deletion mutations were prepared, and the sequence of an Ec0RI fragment consisting of 2530 bp was determined.
予想 さ れ る 構造遣伝子領域の 解析を行 っ た と こ ろ 、 1 2 4 8 b p か ら な る オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム が 存在 し 、 そ こ か ら 推定 さ れ る 遺伝子産物の ア ミ ノ 酸配列 に つ い て サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ の P G K 遺伝子 に対す る ホ モ ロ ジ一を調べ た。 両配列 は互 い に 8 6 . 8 % の ホ モ ロ ジ一を 示 し た こ と か ら 、 単離 し た遺伝子がキ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の P G K 遺伝子で あ る と 断定 し た,  Analysis of the predicted structural gene region revealed that there was an open reading frame of 12848 bp. The amino acid sequence of the putative gene product was examined for homologues against the PGK gene of Saccharomyces cerevisiae. Since both sequences showed 86.8% homology to each other, the isolated gene was a PGK gene of Candida dutilis. I decided,
ま た こ の E c 0 R I 断片 に は、 遺伝子制御領域 に つ い て は 、 開始 コ ド ン A T G の上流 4 0 1 b p 、 終止 コ ド ン T A A の下流 8 8 0 b p が含 ま れて い た。 こ の う ち 、 転 写の タ ー ミ ネ ー タ 一を 含む と 推測 さ れ る 終止 コ ド ン T A A の 直後か ら E c 0 R I サ イ 卜 ま で の 8 8 O b p の 配列 は 図 2 に示 さ れ る 通 り で あ っ た。 ま た さ ら に、 ブ ラ ス ミ ド p P G K S l 、 p P G K S 2 に つ い て も 、 E x o 111 ヌ ク レ ア -: ゼ及 び マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼ を 用 い た 欠失変異体作製 に よ り 種 々 の 欠失変異 を も つ プ ラ ス ミ ド を 作製 し 、 H i n d l l l サ イ ト カヽ ら E c o R I サ イ ト ま で の 塩基配列 を 決定 し た （ 図 1 ) 。 転写の プ ロ モ ー 夕 一を 含 む と 推測 さ れ る H i n d I I I サ イ ト カ、 ら 開始 コ ド ン A T G の 直前 ま で の 1 3 4 6 b p の 配列 は 図 3 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 。 In addition, this Ec0RI fragment contains 401 bp upstream of the start codon ATG and 880 bp downstream of the stop codon TAA in the gene control region. Was. The 88-Obp sequence from immediately after the termination codon TAA, presumed to contain the transcription terminator, to the Ec0RI site is shown in Fig. 2. It was as shown in the figure. In addition, Smid p PGKS l and p PGKS 2 can also be used to create deletion mutants using Exo111 nuclease-: and magvine nuclease. We generated plasmids with more deletion mutations and determined the nucleotide sequence from the Hindlll site to the EcoRI site (Figure 1). The 1346 bp sequence from the Hind III sitoka, presumed to include the transcriptional promoter, to immediately before the initiation codon ATG is shown in Figure 3. It was as expected.
実施例 4 ： P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ ー タ 一 と を 使 っ た 発現 ベ ク タ ー の 構築  Example 4: Construction of expression vector using PGK gene promoter and terminator
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内 で異種遺伝子 を 発現 さ せ る た め に は 、 キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス 内 で機能す る 遗 伝子発現 因子、 転写 プ ロ モ ー タ ー 及 び タ ー ミ ネ ー タ 一 が 必要 と な る 。 そ こ で 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の P G K遣伝子 プ ロ モ ー タ ー と 、 タ ー ミ ネ ー タ 一 と の 間 に マ ル チ ク ロ ー ニ ン グ サ イ ト を 持つ 発現べ ク タ ー プ ラ ス ミ ド を 作製 し た 。  In order to express a heterologous gene in a Candida * utilis, a gene expression factor, transcription and transcription functioning in a Candida * / utilis are required. A promoter and terminator are required. Therefore, a multi-cloning device is connected between the PGK gene transfer promoter of the CANADA DUTILIS and the terminator. An expression vector plus an expression vector was prepared.
.ま ず、 Po l yme ra s e Cha in Reac t i on ( P C R ) に よ リ プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ ー タ ー と を 含 む 断片 を そ れ ぞ れ 取得 し た （ 図 1 ) 。  First, fragments containing a repro- moter and a terminator were obtained by the Polymerase Cha- in Reaction (PCR) (Fig. 1). ).
プ ロ モ ー タ ー と し て は 、 プ ラ ス ミ ド p P G K S l を 铸 型 と し て 、 開始 コ ド ン の 2 . 3 k b 上流 に 位 置す る S a 1 I サ イ ト か ら 開始 コ ド ン A T G 直前 ま で の 断片 を 取得 し た 。 プ ラ イ マ ー と し て 、 5' -GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' (配列番号： 14)As a promoter, the plasmid pPGKSl was used as a 铸 type, and the site was located at 2.3 kb upstream of the start codon from the Sa1I site. Fragments up to just before the start code ATG were obtained. As a primer, 5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3 '(SEQ ID NO: 14)
5' -TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' (配列番号： 15) を用 い、 3 ' 下流側開始 コ ド ン 直前 に X b a I 部位を も つ 様 に デザ ィ ン し て 合成 し た。 Using 5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3 '(SEQ ID NO: 15), it was synthesized by designing with an XbaI site immediately before the 3' downstream initiation codon.
次 に、 タ ー ミ ネ ー タ 一 と し て は、 プ ラ ス ミ ド p P G K E l を铸型 と し て、 終止 コ ド ン 直後か ら 8 8 0 b p 下流 の E c 0 R I サ イ ト ま での 断片 を取得 し た。 プ ラ イ マ ー と し て、  Next, as a terminator, the plasmid pPGKEl is a type I, and the Ec0RI site 880 bp downstream immediately after the termination codon is used. The fragments up to now have been obtained. As a primer,
5* -GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' (配列番号： 16) 5 * -GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3 '(SEQ ID NO: 16)
5' -GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' (配列番号： 17) を用 い 、 5 ' 上流側終止 コ ド ン 直後 に K p n l サ イ ト を も つ様 に デザィ ン し 合成 し た。 Using 5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 17), it was designed and synthesized with a Kpnl site immediately after the 5' upstream termination codon.
P C R プ ロ セ ス は、 P f u D N A ポ リ メ ラ ー ゼ  The PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
( S t r a t a g e n e C l oni n Sys t ems) ¾r feい 、 添付の ノく ッ フ ァ ー を使用 し て、 3 0 サ イ ク ノレ行 っ た。  (StratagneCleon Systems) Using the attached buffer, 30 cycles were performed.
P C R 合成 し た プ ロ モ ー タ ー 及び タ ー ミ ネ ー タ ー 断片 は、 そ れぞれ S a 1 I と X b a I 、 ま た は K p n l と  The promoter and terminator fragments synthesized by PCR were designated Sa1I and XbaI, or Kpnl, respectively.
E .c 0 R I で消ィ匕 し た。 そ の 断片を 、 p U C 1 9 の E.c 0 R I defeated. The fragment was converted to pUC19.
S a l I - X b a l サ イ ト と K p n l — E c o R I サ イ ト と に 順 に組み込み、 プ ラ ス ミ ド p P G K P T l を構築 し た （図 4 ) 。 続 い て、 タ ー ミ ネ ー タ 一下流末端の The plasmid pPGKPTl was constructed by sequentially incorporating the SalI-Xbal site and the Kpnl-EcoRI site (Fig. 4). Then, at the terminal one downstream end
E c 0 R I サ イ ト を ク レ ノ ゥ 酵素処理 に よ り 平滑化 し た 後、 N o t I リ ン カ ー （5' AGCGGCCGCT3' :配列番号 ： 1 8 ) を連結 し て か ら 、 P s t l 消化 に よ り 約 0 . 9 k b の P s t I 一 N o t I 断片を切 り 出 し た。 こ の 断片を、 プ ラ ス ミ ド p P G. K S 1 か ら 切 り 出 し た 1 . 2 k b After the Ec0RI site was blunted by Klenow enzyme treatment, the NotI linker (5'AGCGGCCGCT3 ': SEQ ID NO: 18) was ligated, and Approximately 0.9 kb by stl digestion A PstI-NotI fragment was cut out. This fragment was excised from the plasmid pPG.KS1 1.2 kb.
H i n d I 1 I 一 P s t I 断片 と 共 に 、 pB lues e r i p tSK -の H i n d I I I サ イ ト と N o t I サ イ ト と の 間 に挿入 し て プ ラ ス ミ ド P P G K P T 2 を構築 し た。 さ ら に、 The plasmid PPGKPT2 was constructed by inserting it along with the HindI1I-PstI fragment between the HindIII site and the NotI site of pBlueserip tSK-. Was. In addition,
P P G K P T 2 を B g l l l消化 し て、 ク レ ノ ウ 酵素処理 そ し て再環状化す る こ と に よ り 、 タ ー ミ ネ ー タ 一断片中 の B g l l lサ イ ト を 除去 し て、 プ ラ ス ミ ド p P G K P T 3 を構築 し た。 続 い て P P G K P T 3 の H i n d 111 サ ィ ト を ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平滑化 し た後、 N o t I リ ン カ 一 （ 5' AGCGGCCGCT3' ： 配列番号 ： 1 8 ) を連結 し て、 プ ラ ス ミ ド P P G K P T 4 を構築 し た。 ま た、 ブ ラ ス ミ ド P P G K P T 4 を K p n l で部分消化 し て、 プ ロ モ ー タ ー上流の Κ ρ η I サ イ ト を欠失 さ せ て、 プ ラ ス ミ ド P P G K P T 5 を構築 し た （図 4 ) 。 PPGKPT2 is digested with Bglll, treated with Klenow enzyme, and recyclized to remove Bglll sites in one terminator fragment, and The plasmid pPGKPT3 was constructed. Subsequently, Hind111 site of PPGKPT3 was blunted by Klenow enzyme treatment, and then NotI linker (5′AGCGGCCGCT3 ′: SEQ ID NO: 18) was ligated. And constructed the plasmid PPGKPT4. In addition, the plasmid PPGKPT4 was partially digested with Kpnl to delete the ΚρηI site upstream of the promoter to construct plasmid PPGKPT5. (Fig. 4).
実施例 5 ： r R N A遺伝子の単離  Example 5: Isolation of rRNA gene
実施例 2 に記載の庶糖密度勾配遠心分離 に よ っ て得 ら れ..た、 キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 の ゲ ノ ム D N A の S a u 3 A I 部分消化断片の う ち 、 5 〜 1 O k b の 分画の D N A断片 4 0 O n g と 、 B a m H I 消化 し た後脱 リ ン 酸化 し た ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド  The Sau3AI portion of the genomic DNA of Candida utilis ATCC 9950, obtained by sucrose density gradient centrifugation as described in Example 2. Among the digested fragments, a DNA fragment (40 ng) of a fraction of 5 to 10 kb and a vector plasmid which was digested with BamHI and dephosphorylated and then oxidized.
p B R 3 2 2 、 2 0 0 n g と を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 一晚連結 し た。 こ の D N A 溶液を用 い て大腸菌 D H 5 を形質転換 し て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ 一を完成 し た。 pBR322 and 200 ng were ligated together with T4 DNA ligase. Escherichia coli DH5 is transformed using this DNA solution, and the chromosome of the Candida dutilis lys is obtained. Completed the DNA library.
こ の う ち約 1.0, 0 00コ ロ ニ ー に つ い て 、 Mo l e c u l a r C l on i n 2 " e d i t i o n S a m b r o o k e t . a 1. p 12. 21-23, Co l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ( 1989 ) に 従 っ て フ ィ ノレ タ ー を作製 し 、 サ ッ カ ロ ミ セ ス · セ レ ピ シ ェ の 1 8 S r R N A 遺伝ナを 含む 1 . 8 k b の H i n d l l l — E c o R I 断片を 32 P 標識 し 、 こ れを プ ロ ー ブ と し て ス ク リ 一二 ン グを行 つ た。 こ の プ ロ ー ブ と し て用 い た r D N A 断片 は、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ About 1.0, 000 colonies, see Molecular Clon in 2 "edition S ambrooket.a 1.p 12.21-23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989 ) To prepare a 1.8 kb Hindlll-EcoRI fragment containing the 18 S rRNA gene of Saccharomyces cerevisiae. The probe was labeled with 32 P, and this was used as a probe for screening, and the rDNA fragment used for this probe was obtained from Saccharomyx CeS Celle
S 2 8 8 C [ α , s u c 2 , m a 1 , a 1 2 , C U P 1 ] よ り 作製 し た染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー か ら 、 5 . 8 S r R Ν A 遣伝子の 5 ' 末端の 4 〜 3 2 番 目 の 塩基 に対応す る ォ リ ゴマ ー を 32 P 標識 し た も の を プ ロ 一 ブ と し て取得 し た も の で あ る （曽根 ら 、 特公平 6 — 1 4 8 6 5 号公報） 。 From the chromosomal DNA library prepared from S2888C [α, suc2, ma1, a12, CUP1], 5.8 SrR gene A gene 5 'It was obtained as a probe with a 32 P-labeled oligo glycer corresponding to the 4th to 32nd base at the terminal (Sone et al., Tokuhei 6 — 1 4 8 6 5).
そ の 結果、 2 0 0 個以上の ポ ジ テ ィ ブ ク ロ ー ン が得 ら れ た。 の う ち 7 個 の ク ロ ー ン p C R l 、 p C R 4 、 As a result, more than 200 positive clones were obtained. Of the seven clones, pCR1, pCR4,
P..C R 5 、 P C R 6 、 p C R 7 、 p C R 8 、 お よ び p C R 9 に つ い て プ ラ ス ミ ド の制限酵素地図を作製 し 、 整列 さ せ比較 し た と こ ろ 、 両端の 制限酵素地図が一致 し た （図 5 ) 。 こ の こ と か ら 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の r R N Α 遺伝子を 含む領域が、 約 1 3 k b か ら な る 繰 り 返 し 構造を と つ て い る こ と 力く明 ら 力、 と な っ た。 When a restriction map of plasmids was prepared for P..CR5, PCR6, pCR7, pCR8, and pCR9, they were aligned and compared. The restriction enzyme maps at both ends matched (Fig. 5). From this, the region containing the rRN 遺 伝 子 gene of Candida dutilis has a repetitive structure of about 13 kb. It was clear and powerful.
こ れ ら の プ ラ ス ミ ド よ り 、 E c o R I ま た は X b a l 消化 に よ り 切 り 出 さ れ る 断片を p B 1 u e s i p t S K -に サ ブ ク ロ ー ン 化 し て、 .プ ラ ス ミ ド p C R E l 、 p C R E 2 、 p C R E 3 、 p C R X l 、 p C R X 2 、 p C R X 3 、 お よ び P C R X 4 を構築 し た （図 6 ( a ) ) 。 さ ら に 、 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド を さ ま ざ ま な 制限酵素 に よ り 消化 し た 後、 再環状化す る こ と に よ り 、 各種の 欠失 プ ラ ス ミ ド を 構築 し た。 こ れ ら プ ラ ス ミ ドの 挿入 片 に つ い て図 6 に 矢印 で示 し た領域 に つ い て塩基配列 を決定 し た と こ ろ 、 1 8 S 、 5 . 8 S 、 お よ び 2 5 S r R N A 遺伝子 に高 ぃ ホ モ ロ ジ一を 示す領域が認め ら れ、 こ れ に よ つ て 3 つ の r R N A 遺伝子の 存在位置、 転写方向 な どが明 ら か と な っ た （図 6 ( b ) ) 。 From these plasmids, EcoRI or Xbal The fragment excised by digestion is subcloned into pB1uesiptSK-, and plasmids pCRE1, pCRE2, pCRE3, pCRXl , PCRX2, pCRX3, and PCRX4 were constructed (FIG. 6 (a)). Furthermore, these plasmids are digested with various restriction enzymes and then recyclized to construct various deletion plasmids. did. When the nucleotide sequences of these plasmid inserts were determined in the regions indicated by the arrows in FIG. 6, 18S, 5.8S, and 18S were determined. A region showing high homology was found in the 25 S rRNA gene, which revealed the location of three rRNA genes and the transcription direction. (Figure 6 (b)).
実施例 6 ： オ ルチ ジ ン 一 5 ' 一 フ ォ ス フ ェ ー ト デ カ ル ボキ シ ラ ー ゼ遺伝子 （ U R A 3 遣伝子） の単離  Example 6: Isolation of the gene for 5'-1 phosphate decarboxylase (URA3 gene)
実施例 2 に記載の庶糖密度勾配遠心分離 に よ っ て得 ら れ た 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 の ゲ ノ ム D N A の S a u 3 A I 部分消化断片 の 内 、 5 〜 1 0 k b の 分画 の D N A 断片 1 0 O n g と 、 B a m H I 消化 し た後脱 リ ン 酸化 し た ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド Y E p l 3 ( e t ho d s i n E n z y m o 1. 194, 195 - 230, 1991) 1 0 O n g と を、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り ー晚連結 し た。 こ の D N A 溶液を 用 い て大腸菌 D H 5 を形質転換 し て、 染色 体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し た。 形質転換体 よ り ブ ラ ス ミ ド混合物を 抽 出後、 得 ら れ た D N A で u r a 3 — 株 で あ る サ ッ カ ロ マ イ セ ス * セ レ ビシ ェ Y P H 5 0 0 ( a h i s 3 ,. t r p l , 1 e u 2 , a d e 2 , Sau3AI partial digestion fragment of the genomic DNA of Candida utilis ATCC 9950 obtained by sucrose gradient centrifugation described in Example 2. Among them, 10 ng of a DNA fragment of a fraction of 5 to 10 kb was combined with a vector plasmid, which was digested with BamHI and then dephosphorylated, YE pl 3 (et ho dsin E nzymo 1.194, 195-230, 1991) 10 ng was ligated with T4 DNA ligase. Using this DNA solution, Escherichia coli DH5 was transformed to prepare a chromosomal DNA library. After extracting the mixture of the plasmids from the transformants, the obtained DNA was Saccharomyces * Cellevisie YPH 500
1 y s 2 ， u r a 3 ) ( S t r a t a g e n e C l on i n Sy s t ems) を 形質転換 し 、 最少培地で生育す る ゥ ラ シ ル非要求性の形 質転換株を選択 し た。 サ ッ カ ロ マ イ セ ス * セ レ ビ シ ェ株 の形質転換 は Me t h o d s i n Y e a s t G e e t i c s - A  1 ys 2, ura 3) (StratageneCloninSystems) were transformed, and a non-laser-requiring transformant that grew on a minimal medium was selected. The transformation of the Saccharomyces * cellevissia strain was performed by
l a b o r a t o ry Co u r s e Ma nu a l - Ro s e M. D e t a 1. P 122 - 123 Co l d S r i n g Ha r b o r L ab o r a t o r y P r e s s NY ( 1990 ) 記載 の リ チ ウ ム 法 に 従 っ た。 l a b o r a t o ry Co r s e Ma n u a l-Rose M. De t a 1. P 122-123 Co l d S r i n g Ha r b o r L a b o r a rt o r y P rys s NY (1990) The lithium method was followed.
こ の方法 に よ り 1 0 / g の D N A か ら 、 5 株の  According to this method, 10 strains of DNA were obtained from 10 / g of DNA.
U r a τ 株が得 ら れた。 こ れ ら 形質転換株よ り 、 Ura τ strain was obtained. From these transformants,
Me t ho d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a b o r a t o ry Cou r s e Ma nu a l - Ro s e M. D e t a 1. P 130 Co l d Sp r i ng Ha r b o r L a b o r a t o ry P r e s s Y ( 1990 )記載の 方法 に従 い プ ラ ス ミ ド D N A を調製 し た。 こ れで大腸菌 を形質転換 し て ブ ラ ス ミ ド D N A を回収 し た。 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド D N A の う ち 、 Y E p l 3 の B a m H I 部位 に 6 . l k b の イ ン サ ー ト を含む プ ラ ス ミ ド P C U R A 3 — 3 と 、 Me tho dsin Y east Genetics-A laborato ry Cou rse Ma nual-Rose M. D eta 1.P 130 Cold Sp rig Harbor La borato ry Press Y (1990) Plasmid DNA was prepared. Escherichia coli was transformed with this, and the plasmid DNA was recovered. Among these plasmids DNA, a plasmid PCURA3-3 containing a 6.lkb insert at the BamHI site of YEpl3;
8 . l k b の イ ン サ ー ト を 含む P C U R A 3 — 5 と に つ い て、 制限酵素地図を作製 し た。 そ の 地図 は 図 7 に 示 さ れ る 通 り で あ る 。 8. A restriction map of PCURA 3-5 containing an insert of lkb was made. The map is as shown in Figure 7.
実施例 7 ： U R A 3 遺伝子領域の 特定化 と 塩基配列 の 決定  Example 7: Specification of URA3 gene region and determination of nucleotide sequence
U R A 3 遺伝子領域を特定化す る た め に、 プ ラ ス ミ ド P C U R A 3 — 3 と P C U R A 3 — 5 に共通す る 領域を 含む 5 k b の E. c o R I 断片を 、 プ ラ ス ミ ド p C U R A 3 — 5 よ り 切 り 出 し 、 プ ラ ス ミ ド P R S 3 1 4 In order to identify the URA3 gene region, A 5 kb E.coRI fragment containing a region common to PCURA 3 — 3 and PCURA 3 — 5 was cut out from plasmid p CURA 3 — 5, and plasmid PRS 3 14
( S t r a t a g e n e C loni ng Sys t ems) の E c o R I 部位 に連 結 し て、 プ ラ ス ミ ド p U R A E l を 作製 し た （図 7 ) 。 こ の プ ラ ス ミ ドで Y P H 5 0 0 株を リ チ ウ ム 法 に よ り 形 質転換 し た と こ ろ 、 高頻度で U R A + の形質転換体が得 ら れた。 こ れ よ り 、 こ の 5 k b の E c o R I 断片 中 に U R A 3 遺伝子が存在 し 、 1 コ ピ ー でサ ッ カ ロ マ イ セ ス • セ レ ピ シ ェ の u r a 3 — 変異を相補す る こ と が明 ら か に さ れた。  The plasmid pURAEl was constructed by linking to the EcoRI site of (StratageneCloning Systems) (FIG. 7). When the YPH500 strain was transformed by the lithium method using this plasmid, a transformant of URA + was frequently obtained. Thus, the URA3 gene is present in this 5 kb EcoRI fragment and complements the Saccharomyces cerevisiae ura3 mutation in one copy. Was revealed.
次 に 、 プラ ス ミ ド p U R A E l を X h o I 、 ま た は P s t I 消化 し て、 再び T 4 リ ガ ー ゼ反応に よ り 再環状 ィ匕す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド p U R A E l A X h o 、 お よ び p U R A E l A P s t を 得 た。  Next, the plasmid pURAEl is digested with XhoI or PstI and recircularized by the T4 ligase reaction again to obtain a plasmid. The plasmids p URAE l AX ho and p URAE l AP st were obtained.
さ ら に プ ラ ス ミ ド p U R A E l よ り 切 り 出 さ れ た 3 . 5 k b の E c o R I — C I a l 断片、 お よ び  In addition, the 3.5 kb EcoRI—CIal fragment, which was cut out of the plasmid pURAEl, and
2 , 3 k b の H i n d l l l 断片 を 、 そ れぞれ プ ラ ス ミ ド P R S 3 1 4 の E c o R I — C 1 a I 間、 お よ び The 2,3 kb Hind lll l fragments were converted into the EcRI-C1aI of the plasmid PRS314 and C1aI, respectively.
H i n d l l l 部位 に 挿入 し て 、 プ ラ ス ミ ド p U R A E C 1 、 お よ び p U R A H l を作製 し た （図 7 ) 。 Plasmids pURAEC1 and pURAHI were inserted at the HindIII site (FIG. 7).
以上、 5 種類の プ ラ ス ミ ド を 用 い て Y P H 5 0 0 株を リ チ ウ ム 法 に よ り 形質転換 し 、 u r a 3 — 変異の相補能 を調べ る こ と に よ り 、 こ れ ら の 断片が U R A 3 遺伝子を 含むか ど う かを調べた。 そ の 結果 は、 図 7 に示 さ れ る 通 り で あ っ た。 こ れ よ り 、 U R A 3 遣伝子を E c o R I — H i n d 111 間 の 2 . 3 k b に 限定す る こ と が で き た 。 As described above, the YPH500 strain was transformed by the lithium method using the five types of plasmids, and the complementation ability of the ura 3 — mutation was examined. These fragments encode the URA 3 gene I checked whether it included. The result was as shown in Figure 7. As a result, the URA3 gene could be limited to 2.3 kb between EcoRI and Hind111.
さ ら に U R A 3 遺伝子を含む 2 . 3 k b の  In addition, a 2.3 kb fragment containing the URA3 gene
H i n d I I I 断片を、 プ ラ ス ミ ド p B l u e s c r i p t SK" の H i n d l l l 部位 に連結 し て、 プ ラ ス ミ ド p U R A H 2 を作製 し た。 つ ぎに 挿入断片の 両側 か ら E X 0 111 ヌ ク レ ア ー ゼお よ びマ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを用 い た欠失 変異作製法 に よ り 、 種 々 の 欠失変異を も つ プ ラ ス ミ ド を 作製 し 、 塩基配列 を決定 し た。 そ の シ ー ク ェ ン ス ス ト ラ テ ジ 一 と 塩基配列 の解析か ら 明 ら か に さ れた制限酵素地 図 は、 図 8 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 ま た、 得 ら れた 2 3 3 0 b p か ら な る D N A 配列 は 図 9 に、 ま た推定 さ れ る 2 6 7 ァ ミ ノ 酸残基か ら な る ポ リ ベ プチ ドの ァ ミ ノ 酸配列 は 図 1 0 お よ び図 1 1 に示 さ れ る 通 り であ る 。 The HindIII fragment was ligated to the Hindlll site of the plasmid pBluescript SK "to generate the plasmid pURAH2. EX 0111 was obtained from both sides of the inserted fragment. Generation of plasmids with various deletion mutations by the method of deletion mutation generation using nuclease and mangabean nuclease Figure 8 shows the sequence of the restriction enzyme identified from the sequence of the sequence and the analysis of the nucleotide sequence. The obtained DNA sequence consisting of 233 bp is shown in Fig. 9, and the deduced DNA sequence consisting of 2667 amino acid residues is also shown in Fig. 9. The amino acid sequence of the rebide is as shown in FIGS. 10 and 11.
推定 さ れ た ポ リ べ プチ ドの ァ ミ ノ 酸配列 を他の酵母の U R A 3 蛋 白 質 と 比較 し た と こ ろ 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ と で は 7 3 . 4 % ^ ク ノレ イ べ ロ マ イ セ ス ， ラ ク テ イ ス と で は 7 6 . 3 % 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ァ ノレ ビ カ ン ス で は 7 5 . 1 % と 、 高 い相 同性を示 し た。  When the deduced amino acid sequence of the polypeptide was compared with the URA3 protein of other yeasts, it was found that Saccharomyces cerevisiae did not. 73.4% ^ 76.3% for Knorre-Velomyces and Ractice, and 75.1% for Candida Van Norevices Showed high homology.
実施例 8 ： L 4 1 遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ と L 4 1 遺伝 子を含む D N A 断片 の塩基配列決定  Example 8: Cloning of the L41 gene and sequencing of the DNA fragment containing the L41 gene
実施例 5 で作製 し た ラ イ ブ ラ リ ー の約 30, O コ ロ ニ ー ίこつ 、 て 、 Mo l e cu l a r C l on i n g 2n d e d i t i o n p 12. 21-23, C o 1 d Sp r ing Ha rbor Labora tory ( 1989 ) ίこ従 っ て フ ィ ル タ ー を作製 し、 32 Ρ 標識 し た キ ャ ン デ ィ ダ ' マ ル ト ー サ の L 4 1 遺伝子 R I M — C を 含む、 1 . l k b の Approximately 30, O colony of the library prepared in Example 5 was obtained using the Molecular Cloning 2n deditionp 12. 21-23, C o 1 d Spring Harbor Labora tory (1989) 32 32 32- labeled L41 gene of Candida's maltosa, which was prepared using a filter 1. lkb of RIM — including C
X b a l — S a u 3 A I 断片 （ KAWAl eし a I . J X b a l — S a u 3 A I fragment (KAWAl e
Ba c t e r i o 1. Π 4, 254 - 262 ( 1992 ) ) を プ ロ ー ブ と し て ス ク リ ー ニ ン グを行 っ た。 Screening was performed using Bacterio 1. 1. 4, 254-262 (1992)) as a probe.
そ の 結果、 5 個 の ポ ジ テ ィ ブ ク ロ ー ン が得 ら れ、 こ の う ち 3 個 の ク ロ ー ン p C L 4 1 — 1 、 p C L 4 1 — 2 、 お よ び p C L 4 1 — 5 に つ い て制限酵素地図を作製 し 、 そ れを比較 し た と こ ろ 、 こ れ ら の ク ロ ー ン が 4 k b の E c o R I 断片を 共有す る こ と が示 さ れた （図 1 2 ) 。 さ ら に こ れ ら プ ラ ス ミ ド D N A の サザ ン ハ イ プ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ン 解析 に よ り 、 キ ャ ン デ ィ ダ * マ ル ト ー サ の  As a result, five positive clones are obtained, of which three clones, p CL 41-1, p CL 41-2, and p A restriction map was constructed for CL4 1-5 and a comparison of these maps showed that these clones shared a 4 kb EcoRI fragment. (Figure 12). In addition, the southern pre-digestion analysis of these plasmids DNA revealed that the Canadida * Maltosa
L 4 1 遺伝子 に相同性を示す領域が、 こ の 4 k b の The region showing homology to the L41 gene is this 4 kb region.
E c o R I 断片内 の 1 . 4 k b C l a I - P s t I 断片 内 に あ る こ と が示 さ れた。 It was shown to be within the 1.4 kb ClaI-PstI fragment within the EcoRI fragment.
そ こ で 4 k b の E c o R I 断片を、 pB l ue s c r i p t S K " の E c 0 R I サ イ ト に 挿入 し 、 挿入断片が互 い に逆向 き の プ ラ ス ミ ド p C L E l 、 お よ び p C L E 2 を作製 し た こ の 2 種の プ ラ ス ミ ド に つ い て E c o R I 断片内 に サ イ ト を も つ H i n d 11 ί 、 X h ο I 、 C 1 a I な ど に よ る 欠失変異体の 作製や 、 E x o l l l ヌ ク レ ア ー ゼお よ びマ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを用 い た欠失変異体の作製 に よ り 、 種 々 の 欠失変異を も つ プ ラ ス ミ ド を作製 し 、 B a m H I サ イ ト か ら S a c I サ イ ト ま での 2 0 8 6 b p か ら な る D N A 配列 を決定 し た （図 1 3 ) 。 Then, a 4 kb EcoRI fragment was inserted into the Ec0RI site of pBluescript SK ", and the inserted fragments were inverted with the plasmid pCLEl, and so on. And the two plasmids from which pCLE2 was prepared, which had sites in the EcoRI fragment, such as Hind11 、, XhοI, C1aI, etc. , And deletion mutants using Exolll nuclease and Mangby nuclease. A plasmid with the deletion mutation of The DNA sequence consisting of 286 bp from the BamHI site to the SacI site was determined (Fig. 13).
こ の配列 を解析す る と 、 サ ザ ン 解析 に よ り L 4 1 造遺 伝子が存在す る と 推定 さ れた 領域 に 3 6 7 b p の ィ ン ト ロ ン で分断 さ れた 3 1 8 b p 力、 ら な る オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム が存在 し た （図 1 2 お よ び図 1 4 ) 。 イ ン ト ロ ン と 推定 さ れた領域の 5 ' と 3 ' 端お よ び 3 ' 端近 傍 に は ィ ン ト 口 ン に 共通す る 配列 G T A T G T - - T A C T A A C _ - A G が認め ら れ た。 ま た 、 そ の位置 も 報告 さ れて い る 他の 酵 母 由来の 6 種類の L 4 1 遺伝子 （ KAWA 1 e t. a 1. J B a c t e r i o 1. Π 4, 254 - 262 ( 1992 )、 POZO e t. a 1. E u r. J. B i o c h em. 213， 849 - 85 ? ( 1993 ) ) と 同様、 開始 コ ド ン の 直後 に存在 し て い た。 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス し 4 1 ポ リ べ プチ ドの推定 さ れ る ァ ミ ノ 酸配列 を他の い く つ かの L 4 1 蛋 白 質 と 比較 し た と こ ろ 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ L 4 1 a と の 間で は 9 3 . 4 %、 キ ャ ン デ ィ ダ · ト ロ ピ カ リ ス L 4 1 と の 間で は 8 9 . 6 %、 キ ヤ ン デ ィ ダ · マ ノレ ト ー ザ の L 4 1 と の 間で は 8 5 . 8 % と 、 高 い相 同性を示 し た。  When this sequence was analyzed, it was determined by Southern analysis that the region where the L41 gene was estimated to be present was cleaved by a 367 bp intron 3 There were 18 open-ended frames with 18 bp power (Figures 12 and 14). The sequence GTATGT--TACTAAC _-AG common to the int mouth was observed at the 5 ', 3' and near the 3 'end of the putative intron region. . In addition, its location has been reported for six L41 genes derived from other yeasts (KAWA 1 et.a 1.JB acterio 1.Π4, 254-262 (1992), POZO e t. a 1. Like Eur. J. Biom. 213, 849-85? (1993)), it was present immediately after the start codon. A comparison of the putative amino acid sequence of the 41-polypeptide with several other L41 proteins was found in a Canadian * utility. 93.4% between Saccharomyces cerevisiae L41a and Candidate tropicaris L41a. Showed high homology with 89.6%, and 85.8% with L41 of Candida manoretoza.
実施例 9 部位特異的変異法 に よ る シ ク ロ へキ シ ミ ド 耐性型 L 4 1 遺伝子の 作製  Example 9 Construction of cycloheximide-resistant L41 gene by site-directed mutagenesis
シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性を示す酵母の L 4 1 蛋 白 質の 5 6 番 目 の ア ミ ノ 酸 は グル タ ミ ン で あ り 、 一方、 シ ク ロ へキ シ ミ ド感受性酵母の L 4 1 蛋 白 質 に お い て は こ の 位 置 の ア ミ ノ 酸 は プ ロ リ ン で あ る 。 そ し て こ の ア ミ ノ 酸残 基が そ の L 4 1. 蛋 白 質 を も つ 酵母 の シ ク ロ へ キ シ ミ ド に 対す る 感受性 を 決定 し て い る と 報告 さ れ て い る （ KAWA 1 e t . a 1. J B a c t e r i o 1. 174 254 - 262 ( 1992 ) ) 。 こ こ で シ ク ロ へ キ シ ミ ド感受性で あ る キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の L 4 1 蛋 白 質 の 5 6 番 目 の ア ミ ノ 酸 は シ ク ロ へ キ シ ミ ド感受性 の サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ピ シ ェ と 同様 に プ ロ リ ン で あ っ た 。 そ こ で、 部位特異 的 突然変異導入 に よ り L 4 1 遺伝子 の 5 6 番 目 の プ ロ リ ン を コ 一 ド す る コ ド ン を グ ル 夕 ミ ン コ ド ン に 変更す る こ と に よ っ て 、 こ の 遣伝 子力く コ ー ド す る L 4 1 蛋 白 質 を シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 へ と 変換 し 、 形質転換 の 選択 マ ー カ ー と し て 利用 し た 。 The amino acid at position 56 of the L41 protein of cycloheximide-resistant yeast is glutamine, whereas cycloheximide-sensitive yeast is This is the position of L41 protein in The amino acid at the position is proline. It has been reported that this amino acid residue determines the sensitivity of yeast having the L4.l protein to cycloheximide. (KAWA 1 et. A 1. JB acterio 1.174 254-262 (1992)). Here, the 56th amino acid of the L41 protein of Candida utilis which is sensitive to cycloheximide is the cycloheximide. It was prolin, as was the Simid-sensitive Saccharomyces cerevisiae. Therefore, the codon that codes for the 56th proline of the L41 gene by site-directed mutagenesis was changed to a Glucomin codon. Thus, the gene encoding L41 protein is converted into a cycloheximid-resistant type, and is used as a selection marker for transformation. I used it.
ま ず、 プ ラ ス ミ ド p C L E l か ら 得 ら れ る 2 . l k b の B a m H I — S a c I 断片 を p U C 1 8 の B a m H I 一 S a c I サ イ ト 間 に 挿入 し て 、 プ ラ ス ミ ド p C L B S 1 を 作製 し た （図 1 5 ) 。  First, a 2.1 kb BamHI-SacI fragment obtained from the plasmid pCLEL was inserted between the BamHI-SacI sites of pUC18. A plasmid pCLBS1 was prepared (FIG. 15).
ま た 、 プ ラ ス ミ ド p C L E l を A f 1 11消 化 し 、 ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平滑化 し た 後、 さ ら に X h 0 I 消 化 す る こ と に よ っ て 得 ら れ る 0 . 6 k b の 断片 を 、  In addition, the plasmid pCLEl was digested with Af111, smoothed by Klenow enzyme treatment, and further Xh0I digested. The 0.6 kb fragment obtained from
p B 1 u e s c r i p t SK— の S m a I と X h o I 間 に 挿入 し て 、 p C L A X 1 を 作製 し た 。 こ の プ ラ ス ミ ド に お い て は 、 0 . 6 k b 断片 の 平滑化 さ れ た A i l 11末端 と ベ ク タ ー の S m a I 末端 と の ラ イ ゲ ー シ ヨ ン に よ り 、 A f 1 11切 断部位 が再生 さ れ る 。 ヘ ルパ ー フ ァ ー ジ を 用 い て p C L X A l か ら 一本鎖 D N A を 調製 し 、 合成 し た 変異 用 才 リ ゴ ヌ ク レ.才 チ ド 5 ' T T G T G G AAA ACT TG C TT G GTT TGA3' を 用 い て、 S c u 1 p t o rイ ン ビ ト ロ ミ ュ ー タ ジ エ ネ シ ス キ ッ ト （Ame r s h am) に よ り 、 変異 プ ラ ス ミ ド を 作製 し た 得 ら れ た 候補 プ ラ ス ミ ド に つ い て 0 . 6 k b 挿入断片 の 全塩基配列 を 決定 し 、 5 6 番 目 の プ ロ リ ン を コ ー ド す る コ ド ン C C A が グ ル 夕 ミ ン の コ ド ン C A A に 変異 さ れ、 そ の 他 の 配列 に 変異 の な い プ ラ ス ミ ド P C L A X 2 0 を 得 た P C L A X 2 0 か ら 0 . 6 k b の 挿入断片 を C l a l - A f 1 11断片 と し て切 り 出 し 、 こ れ と 、 プ ラ ス ミ ド p C L B S l を C l a l と A f 1 11 と 消化 し て 得 ら れ るpCLAX1 was prepared by inserting pB1uescript SK— between SmaI and XhoI. In this plasmid, the ligation between the blunted Ail11 end of the 0.6 kb fragment and the SmaI end of the vector was performed. The Af111 cut site is regenerated. Using the helper phage A single-stranded DNA was prepared from pCLXA1 and synthesized, and the resulting mutant nucleic acid was synthesized using the 5 'TTGTGG AAA ACT TG C TT G GTT TGA3'. According to the Ambi-Romometer Genetics Kit (Amersham), the candidate plasmids obtained from which the mutant plasmids were prepared were identified as 0. The entire nucleotide sequence of the 6 kb insert was determined, and the codon CCA, which codes for the 56th proline, was mutated to codon CAA, which is Gluymin, and A 0.6 kb insert from PCLAX 20 from which a plasmid PCLAX 20 having no mutation in the other sequence was obtained was cut out as a Clal-Af111 fragment, which was then excised. And the plasmid pCLBSl is digested with Clal and Af111.
4 . 4 k b の 断片 と ラ イ ゲ ー シ ヨ ン し て 、 変異型 L 4 1 遺伝子 を 含 む プ ラ ス ミ ド P C L B S 1 0 を構築 し た 。 Plasmid PCLBS10 containing the mutant L41 gene was constructed by ligating with the 4.4 kb fragment.
ま た 、 プ ラ ス ミ ド p C L B S l O を B a m H I と In addition, the plasmid pCLBSIO is referred to as BamHI.
5 p h I と で消化 し て 、 T 4 D N A ポ リ メ ラ ー ゼ処理 に よ り 平滑末端 と し た 後、 N o t I リ ン カ 一 After digestion with 5 phI and blunt-ended by T4DNA polymerase treatment, the NotI linker was digested.
(5' AGCGGCCGCT3' ) を 挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド P C L B S 1 2 構築 し た （図 1 5 ) 。  (5'AGCGGCCGCT3 ') was inserted to construct a plasmid PCCLBS12 (Fig. 15).
次 に 、 作成 し た 変異型 L 4 1 遺伝子が酵母 に シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 を 付与す る か ど う か を 調 べ た 。 Y E p 型 べ ク タ 一 で あ る Y E p l 3 K ( S o n e e t . a 1. A p 1.  Next, it was examined whether or not the constructed mutant L41 gene confers cyclimid resistance to yeast in yeast. YEp type vector, YEpl3K (Soneet.a 1.Ap 1.
En v i r o n. M i c r o b i o l . 54, 38 - 42 (1988) ) の B a m H I 一 S a c I サ イ ト 間 に 、 プ ラ ス ミ ド p C L B S l O カヽ ら 得 ら れ る 2 . l k b の 変異型 L 4 1 遺伝子 を 含 む B a m H I - S a c I 断片 を挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド P Y E C L 1 0.を作製 し た。 一方、 コ ン ト ロ ー ル と し て p C L B S l か ら 得 ら れ る 2 . l k b の 野生型 L 4 1 遣 伝子を含む B a m H I — S a c I 断片 を Y E p l 3 K に ク ロ ー ン 化 し た プ ラ ス ミ ド p Y E C L l を作製 し た。 54, 38-42 (1988)), a 2.lkb mutation obtained from the plasmid pCLBS10O between the BamHI and SacI sites. Including the type L41 gene The BamHI-SacI fragment was inserted to create the plasmid PYECL10. On the other hand, the BamHI-SacI fragment containing the 2.1 kb wild-type L41 gene obtained from pCLBSl as a control was cloned into YEpl3K. The purified plasmid pYECLl was prepared.
こ れ ら の プ ラ ス ミ ド を用 い て サ ッ カ ロ ミ セ ス酵母 Y P H 5 0 0 株を Me t ho d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a bo r a t o ry C ou r s e Ma nu a l - Ro s e M. D e t a 1. P 122 - 123 Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s NY (1990) 記載の 酢酸 リ チ ウ ム 法 に 従 っ て形質転換 し た。 形質転換 体 と し て、 ロ イ シ ン非要求性 に な っ た株を選択 し た。 こ れ ら の 形質転換体 につ い て シ ク ロ へ キ シ ミ ド を含む Y P D プ レ ー ト での生育を調べ た と こ ろ 、  Using these plasmids, the saccharomyces yeast YPH500 strain was transformed into Methodsin Yeast Genetics-A la bo ratory Course Manu al-Rose. M. Data 1. Transformation was carried out according to the lithium acetate method described in P122-123 Cold Spring Laboratories Press NY (1990). As a transformant, a strain which was not required for leucine was selected. The growth of these transformants on YPD plates containing cycloheximide was examined.
P Y E C L 1 0 を保持す る 株 は、 5 0 お よ び 1 0 0 ;u g Z m l の シ ク ロ へキ シ ミ ド を含む Y P D プ レ ー ト で増殖 す る こ と が示 さ れた。 一方、 p Y E C L l を保持す る 株 は 同濃度の シ ク ロ へキ シ ミ ド を 含む プ レ ー ト 上で は ま つ た く 増殖 し な か っ た。 こ れ に よ つ て、 作成 し た変異型 L 4 1 遺伝子が シ ク ロ へ キ シ ミ ド感受性酵母 に耐性を付与 す る こ と が示 さ れた。 Strains harboring PYECL10 were shown to grow on YPD plates containing cycloheximide at 50 and 100; ugZml. On the other hand, the strain carrying pYECL1 did not grow on the plate containing cycloheximide at the same concentration. Thus, it was shown that the constructed mutant L41 gene confers resistance to cycloheximide-sensitive yeast.
実施例 1 0 ： 形質転換用 プ ラ ス ミ ド の 構築 と キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス 形質転換条件の 決定  Example 10: Construction of plasmid for transformation and determination of Candida utilis transformation conditions
始め に サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ で機能す る こ と が既 に 明 ら か に さ れて い る G 4 1 8 耐性遺伝子 （ ァ ミ ノ グ リ コ シ ド フ ォ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ A P T ) 遗 伝子） の 発現 力 .セ ッ ト を 含 む プ ラ ス ミ ド を 用 い て 、 キ ヤ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株の形質転換を 試み た。 こ の 発現 カ セ ッ ト は 、 Yama no ら の 記載 し た The G418 resistance gene (Amino), which has been previously shown to function in Saccharomyces cerevisiae Glycosid phototransferase (APT) gene expression, using a plasmid containing the set Transformation of Idutyris ATCC 9950 strain was attempted. This expression cassette was described by Yamano et al.
1 . 0 k b の ダ リ セ ル ア ル デ ヒ ド 一 3 — リ ン 酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ遺伝子の プ ロ モ ー タ ー 領域、 0 . 4 k b の ホ ス ホ グ リ セ レ ー ト キ ナ ー ゼ遺伝子 の タ ー ミ 'ネ ー タ ー 領域Promoter region of 1.0 kb dalysyl aldehyde-1 3 -phosphonate dehydrogenase gene, 0.4 kb phoshoglycerol -Terminator region of the kinase gene
( Y a m a n 0 e t a 1. J. B i o t e chnoし 32, 165-171 ( 1994 ) ) の 間 に 、 プ ラ ス ミ ド p U C 4 K ( P h a r m a c i a ) か ら (Yamanan0eta1.J.Biotechno, 32, 165-171 (1994)), from the plasmid pUC4K (Pharmacia).
X h o I 一 P s t I 断片 と し て切 り 出 さ れ る 、 XhoI is cut out as a PstI fragment,
1 . l k b G 4 1 8 耐性遺伝子 を 平滑末端化 し て連結 し て作製 し た も の で あ る 。 こ の プ ラ ス ミ ド と し て は 、 1. This was prepared by blunt-ending and linking lkb G4 18 resistance gene. The plasmid is,
(1) 上記発現 カ セ ッ ト を Y E p 型 ベ ク タ ー Y E p l 3 K (1) Use the above expression cassette as a YE p-type vector YEpl3K
( Sone e t . a 1. A p p 1. E n v . M i c r o b i o l. , 54, 38 - 42 ( 1998 ) ) 連結 し た プ ラ ス ミ ド、 お よ び （ 2 ) 上記発現 力 セ ッ ト を プ ラ ス ミ ド pB l u e s c r i p t SK— に 連結 し た プ ラ ス ミ ド p G P D A P H l の B a m H I サ イ ト に 実施例 2 に 記載 の キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株 の S a n 3 A I 部分消化染色体 D N A 断片 （ 5 — 1 0 k b ) を 挿入 し た D N A ラ イ ブ ラ リ ー 、 さ ら に （3) サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ で機能す る A R S 配列 を 含む (Sone et. A. 1. App 1. Env. Microbiol., 54, 38-42 (1998)) Connected plasmids and (2) the above expression set At the Bam HI site of the plasmid p GPDAPHl linked to the plasmid pBluescript SK—, the candid * described in Example 2 * ATAT 99 9 DNA library of the 50 strains into which the San 3 AI partially digested chromosomal DNA fragment (5-10 kb) was inserted, and (3) Saccharomyces cerevisiae Includes ARS sequences that function in the shea
p G P D A P H l プ ラ ス ミ ド の 8 種類 を 用 い た 。 （3) の プ ラ ス ミ ド は 、 （2) の ラ イ ブ ラ リ ー で サ ッ カ ロ マ イ セ スEight kinds of pGPDAPH1 plasmids were used. The smidology of (3) can be found in the library of (2).
* セ レ ビ シ ェ Y P H 5 0 0 を 形質転換 し て 得 ら れ た 酵母 コ ロ ニ ー か ら 単離 し た プ ラ ス ミ ド で あ る 。 こ れ ら の ブ ラ ス ミ ド あ る い は .ラ イ ブ ラ リ ー D N A を 用 い て抵抗値、 電 圧 を さ ま ざ ま に 組 み 合わ せ た 電気パ ル ス 法、 あ る い は 酢 酸 リ チ ウ ム 法 に よ り キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株 の 形質転換 を 試 み た 。 し か し な か ら 、 * Yeast obtained by transforming cellophysia YPH500 It is a plasmid isolated from the colony. The electric pulse method using various combinations of resistance values and voltages using library DNA or library DNA Tested the transformation of Candida utilis ATCC 9950 strain by the lithium acetate method. However,
G 4 1 8 耐性 を 示す コ ロ ニ ー は 得 ら れ な か っ た 。 No colonies showing G418 resistance were obtained.
次 に 、 実施例 9 記載 の プ ラ ス ミ ド P C L B S 1 0 (図 1 5 ) の E c o R I サ イ ト と X b a l サ イ ト に 、 実施例 5 で 示 し た プ ラ ス ミ ド p C R E 2 、 p C R E 3 、  Next, the plasmid pCRE shown in Example 5 was added to the EcoRI site and Xbal site of the plasmid PCLBS 10 described in Example 9 (FIG. 15). 2, p CRE 3,
p C R X l 、 お よ び p C R X 2 ( 図 6 ) か ら そ れ ぞ れ E c o R I ま た は X b a I に よ り 切 り 出 さ れ る 4 種類 の r D N A断片 を 挿入 し て 、 プ ラ ス ミ ド p C L R E 2 、 p C L R E 3 、 p C L R X l 、 お よ び p C L R X 2 を 構 築 し た （図 1 6 ) 。 Insert the four rDNA fragments cut out from pCRXl and pCRX2 (Figure 6) with EcoRI or XbaI, respectively, and The plasmids pCLRE2, pCLRE3, pCLRXl, and pCLRX2 were constructed (Figure 16).
こ れ ら シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性遺伝子 を選択 マ ー カ ー と す る プ ラ ス ミ ド 4 種類、 お よ び プ ラ ス ミ ド  Four types of plasmids that select these cycloheximide resistance genes as markers, and plasmids
p C L B S l O の B a m H I 部位 に 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ. リ ス A T C C 9 9 5 0 株 の 染色体 D N A の S a u 3 A I 部分消 化 D N A 断片 （ 5 — 1 0 k b ) を 挿入 し て 作 製 し た ラ イ ブ ラ リ ー D N A を 用 い て 、 抵抗値、 電圧 を さ ま ざ ま に 組 み 合 わ せ た 電気パ ル ス 法、 あ る い は 酢酸 リ チ ゥ ム 法 に よ り 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株 の 形質転換 を 試 み た 。 し 力、 し な 力く ら 、 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド を 閉環状 の ま ま 用 い た 場 合 は 形質転換体 は 得 ら れな か っ た。 こ の形質転換実験 に お い て、 弱 い シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性、 .ま た は G 4 1 8 耐性を 示す偽耐性 コ ロ ニ 一 の 出現が観察 さ れ た。 こ の 偽耐性 コ ロ ニ ー と は、 低濃 度の G 4 1 8 ゃ シ ク ロ へ キ シ ミ ド な ど抗生物質を添加 し た プ レ ー 卜 で形質転換体を選択す る 場合 に し ば し ば観察 さ れ る 、 選択マ ー カ ー の 薬剤耐性遺伝子の存在に よ ら ず 自 発的 に耐性を獲得す る コ ロ ニ ー で あ.る 。 In the BamHI site of pCLBS10, a partially digested DNA fragment (5-10 kb) of the Sau3AI partially chromosomal DNA of the Candida lithi ATCC 9950 strain chromosomal DNA was inserted. Using the library DNA inserted and inserted, the resistance pulse and the voltage are combined in various ways by the electric pulse method or the lithium acetate method. Transformation of Candida utilis ATCC 9950 strain was attempted by the yeast method. If these plasmids are used in a closed loop, the transformant will not be obtained. It was not. In this transformation experiment, the appearance of a pseudo-resistant colony showing weak cycloheximide resistance, or G4 18 resistance was observed. This false-resistant colony is used when selecting transformants on a plate to which antibiotics such as G418-cycloheximide are added at a low concentration. A frequently observed colony that spontaneously acquires resistance irrespective of the presence of the drug resistance gene of the selected marker.
こ の実験の な かで、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド を形質転換体の 選択 に 用 い る 場合、 Y P D プ レ ー ト の シ ク ロ へ キ シ ミ ド 濃度を 4 0 μ g / m 1 と す る こ と 、 そ し て プ レ ー ト の ィ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 温度を 3 0 °C で は な く 2 8 °C と す る こ と で 、 偽耐性 コ ロ ニ ー の 出現を抑 え ら れ る こ と がわ か つ た。 そ こ で、 プ ラ ス ミ ド D N A の 染色体への組み込み を 促進す る た め に、 プ ラ ス ミ ド p C L R E 2 、 p C L R X 1 、 お よ び p C L R X 2 に つ い て、 D N A の r R N A 遣 伝子領域内 の制限酵素サ イ ト の そ れぞれ B g 1 I I、 E c 0 R V、 B g 1 11で プ ラ ス ミ ド を 消化 し てか ら 、 形 質 IS換実験 に 用 い た。 そ の 結果、 B g 1 11消化 し た ブ ラ ス ミ ド p C L R E 2 お よ び P C L R X 2 に つ い て、 電気 容量を 2 5 F と し 、 抵抗値を 6 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V Z c m と す る こ と に よ り 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 株を 得 る こ と が で き た 。 こ れ ら の 耐性株 は、 プ ラ ス ミ ド D N A を添加 し な い コ ン ト ロ ー ノレ実験で ま れ に 得 ら れ る 微小な 偽耐性株 に比べて 明 ら か に サ イ ズが大 き く 、 ま た 施例 1 2 に 示すサ ザ ン解析 に よ り 形質転換体で あ る こ と が明 ら か に さ.れた。 In this experiment, when cycloheximide was used for the selection of transformants, the cycloheximide concentration of the YPD plate was set at 40 μg / m By setting the plate to 1 and the plate's incubation temperature to 28 ° C instead of 30 ° C, a false-tolerant colony can be achieved. It has been found that the appearance of ー can be suppressed. Therefore, in order to promote integration of the plasmid DNA into the chromosome, the plasmids pCLRE2, pCLRX1, and pCLRX2 must have the r After digestion of the plasmid with Bg1II, Ec0RV, and Bg111, respectively, the restriction enzyme sites in the RNA gene region, the plasmids were used for shape-IS exchange experiments. Using. As a result, with regard to the Bg111-digested plasmid pCLRE2 and PCLRX2, the electric capacity is 25 F, the resistance value is 600 ohms, and the voltage is By setting it to 5 KVZ cm, it was possible to obtain a cycloheximide resistant strain. These resistant strains are clearly smaller in size than the small pseudoresistant strains previously obtained in control experiments without the addition of plasmid DNA. Big and big The Southern analysis shown in Example 12 revealed that it was a transformant.
次 に形質転換の最適条件を 見 い だす た め に 、 B g 1 I I 消化 し た プ ラ ス ミ ド、 P C L R E 2 を 用 い て、 電気容量を 2 5 / F に 固定 し 、 抵抗値、 電圧 を さ ま ざ ま に組み 合わ せて電気パル ス の最適条件を検討 し た o や α ¾ は図 1 7 に さ れ る 通 り で あ つ た 0 図 に は、 パ ル ス後の生菌率 と 、 ら れた シ ク ロ へキ シ ミ r 性株数 と が示 さ れて い る 。 こ の 結果カヽ り 、 電気容量が 2 5 F で抵抗値力く 6 0 0 Next, in order to find the optimal conditions for transformation, fix the electric capacity to 25 / F using Bg1II-digested plasmid, PCLRE2, and set the resistance and voltage. The optimal conditions of the electrical pulse were examined by combining various types of o. Α and α ¾ were as shown in Fig. 17. The percentage and the number of isolated cyclohexene strains are shown. As a result, the electric capacity is 25 F and the resistance value is high.
8 0 0 、 ま た は 1 0 0 0 ォ一 ム 、 S.が 3 . 7 5 、 ま た は 5 K V / c m の 条件で ^ g D N Α あ た り 約 5 0 0 1 4 0 0 個 と い う 高 い頻度で形質転換体が得 ら れ る こ が分か つ れ ら の 条件下で の パ ル ス後の生菌率 は 約 1 0 - 4 0 % で あ っ た。 ま た、 抵抗値が 2 0 0 、 ま た は 4 0 0 ォ ー ム で も生菌率が 4 0 %以下 に な る 条件 は あ る が、 高 い形質転換頻度 は得 ら れな か つ た。 抵抗値が 2 0 0 、 ま た は 4 0 0 ォ一ム で は タ イ ム コ ン ス タ ン トApproximately 50,000 pieces per ^ g DN Α under the condition of 800, 100,000, S. of 3.75, or 5 KV / cm Under these conditions, it was found that the transformants could be obtained at such a high frequency, and the viable cell ratio after pulse was about 10 to 40%. In addition, even if the resistance value is 200 or 400 ohms, there is a condition that the viability rate is 40% or less, but high transformation frequency cannot be obtained. Was. Time constant when the resistance is 200 or 400 ohms
(電圧が最大値の約 3 7 % に ま で減衰す る ま で の 時間） が 1 0 ミ リ 秒以下で あ り 、 6 0 0 、 8 0 0 、 ま た は (The time it takes for the voltage to decay to about 37% of the maximum value) is less than 10 milliseconds, 600, 800, or
0 0 0 ォ ー ム で 、 パ ル ス 後の 生菌率が約 1 0 - 4 0 % と な る 条件で は、 タ イ ム u ン ス タ ン ト が約 1 0 カヽ ら 2 0 リ 秒で あ つ た o 以上の こ と 力ヽ ら ヽ パ ル ス 後の 生菌率が 約 1 0 - 4 0 % と な り 、 かつ タ イ ム コ ン ス 夕 ン ト カ 1 0 リ 秒以上で あ る 電気パ ル ス を菌 に 与ん と が高 い形 質転換頻度を得 る た め に 重要であ る こ と が示唆 さ れ た。 ま た、 電気パ.ル ス を加え た後、 菌液 に 1 M ソ ル ビ ト ー ルを含む Y P D培地を加え、 3 0 °Cで振盪培養す る こ と が好 ま し く 、 培養せず に菌を 直接 シ ク ロ へ キ シ ミ ド を含 む選択 プ レ ー 卜 に塗布す る と コ ロ ニ ー が得 ら れな か っ た ま た、 生蘭数 と 形質転換体数の 変化を経時的 に調べて そ れ ら の増加率を比較す る こ と に よ り 、 最適培養時間を 決定 し た。 Under the condition that the viable cell rate after pulse is about 10% to 40% at 0.00 mm, the time u instance is about 10 seconds to about 20 seconds. The viable cell rate after the pulse was about 10-40%, and the time was more than 10 seconds. High form that gives a certain electric pulse to bacteria It is suggested that it is important to obtain the quality change frequency. Also, after adding an electric pulse, it is preferable to add a YPD medium containing 1 M sodium sorbitol to the bacterial solution, and culture at 30 ° C with shaking, preferably. When the bacteria were applied directly to the selection plate containing cycloheximide without the colonies, colonies were not obtained, and the number of viable orchids and the number of transformants were reduced. The optimal culture time was determined by examining the changes over time and comparing the rates of increase.
そ の結果、 培養時間が 6 時間 ま で は形質転換体の 增加 が生菌数の増加率を上回 る が、 そ れ以後 は生菌数 と 形質 転換体数が同 じ 割 合で増加す る こ と が明 ら か に さ れ、 培 養時間 は 6 時間が最適で あ る こ と が示 さ れ た。  As a result, the addition of the transformants exceeded the rate of increase in the number of viable cells up to a culture time of 6 hours, but thereafter the number of viable cells and the number of transformants increased at the same rate It was clarified that the optimal cultivation time was 6 hours.
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株の電気 パ ル ス に よ る 標準的 な 形質転換法 は実施例 1 1 に 示 さ れ る 通 り で あ る 。  The standard transformation method using the electric pulse of the Candida utilis ATCC 9950 strain is as described in Example 11.
実施例 1 1 ： 電気パ ル ス に よ る キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 株の 形質転換法  Example 11 1: Transformation of Candida utilis strain by electric pulse
Y P D プ レ ー ト 上の コ ロ ニ ー を、 5 m l の Y P D 液体 培地で、 3 0 °C、 約 8 時間振邀培養 し た後、 2 0 0 m l の Y P D 液体培地 に 0 D 6 Q () - に な る よ う 植菌 し て 3 0 °C振盪培養す る 。 約 1 6 時間後、 対数増殖期 ( 0 D 600 = 2 . 5 ) に ま で菌体が増殖 し た後、 After culturing the colonies on the YPD plate in 5 ml of YPD liquid medium at 30 ° C for about 8 hours, 0 D 6 Q ( 200 ml) was added to 200 ml of YPD liquid medium. ) -And incubate at 30 ° C with shaking. Approximately 16 hours later, after the cells had grown to the logarithmic growth phase (0 D 600 = 2.5),
1400 X gで 5 分間 の 遠心分離 に よ り 集菌す る 。 菌体 は 1 0 0 m l の 氷冷 し た 滅菌水で 1 回、 続 い て 4 0 m l の 氷冷 し た滅菌水で 1 回洗浄 し た後、 氷冷 し た 1 M ソ ル ビ ト ー ル 4 0 m l .で 1 回洗浄す る 。 菌体 を 1 0 m l の 1 M ソ ル ビ ト ー ル に 懸濁 し た 後、 滅菌 ポ リ プ ロ ピ レ ン チ ュ ー ブ に移 し 、 再度 11 X gで 5 分間の遠心分離 に よ り 集菌 す る 。 上清 を 除 い た後、 最終菌体液量が 2 . 5 m l に な る よ う 氷冷 し た 1 M ソ ル ビ ト ー ル に 懸濁す る 。 Collect cells by centrifugation at 1400 X g for 5 minutes. The cells were washed once with 100 ml of ice-cold sterile water, followed by 40 ml of ice-cold sterile water. After washing once with ice-cold sterile water, wash once with 40 ml of ice-cold 1 M sodium sorbitol. Suspend the cells in 10 ml of 1 M sorbitol, transfer to a sterile polypropylene tube, and centrifuge again at 11 X g for 5 minutes. Collect bacteria. After removing the supernatant, resuspend the cells in ice-cold 1 M sodium hydroxide so that the final volume of the bacterial cells is 2.5 ml.
電気パル ス に よ る 形質転換実験 は バ イ オ ラ ッ ド社の ジ ー ン パ ルサ ー を用 い て行な う 。 5 0 // 1 の 菌液 と 5 ^ 1 の D N A 試料 と を混合 し た 後、 0 . 2 c m の デ イ ス ポ ー ザ ブ ル キ ュ べ ッ ト に入れ、 適当 な 条件の電気パ ル ス を加 え る 。 パ ル ス後、 1 m 1 の 氷冷 し た 1 M ソ ル ビ ト ー ルを 含む Y P D 培地を加 え、 滅菌 ポ リ プ ロ ピ レ ン チ ュ ー ブ に 移 し た後、 3 0 °C で約 6 時間振盪培養す る 。 培養後、 菌 液を 4 0 ju g / m l の シ ク ロ へ キ シ ミ ド を含む Y P D 選 択培地 に塗布 し た後、 プ レ ー ト を 2 8 °C で 3 — 4 日 保温 し て、 形質転換体 コ ロ ニ ー を 得 る 。  Transformation experiments using electric pulses will be performed using Biorad's Gene Pulser. After mixing the bacterial solution of 50 // 1 and the DNA sample of 5 ^ 1, put it into a 0.2 cm disposable cubette and place it under an appropriate condition. Add After pulsing, add 1 ml of ice-cold YPD medium containing 1 M sorbitol, transfer to a sterile polypropylene tube, and place at 30 ° C. Incubate with C for about 6 hours. After culturing, apply the bacterial solution to YPD selective medium containing 40 jug / ml cycloheximide, and incubate the plate at 28 ° C for 3-4 days. Then, a transformant colony is obtained.
実施例 1 2 ： サザ ン 解析 に よ る 形質転換体 に お け る プ ラ ス ミ ド の検出  Example 12: Detection of Plasmid in Transformants by Southern Analysis
実施例 1 0 で得 ら れ た シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性株の う ち 7 個 に つ い て サザ ン 解析を行 い 、 こ れ ら の ク ロ ー ン 力く プ ラ ス ミ ド D N A を保持す る か ど う か を調べ た。 染色体 D N A の調製 は、 Me t ho d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a b o r a t o ry C o u r s e Ma nu a l - Ro s e . D e t a 1. P 131 - 132 Co l d S r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s N Yに 記載 の 方法 に 従 っ た 。 調製 し た D N A は E c 0 R V あ る い は S a 1 I に よ り 消ィ匕 し 、 32 P 標識 し た L 4 1 遺伝子 を 含 む 1 . 8 k b の B a m H I — H i n d l l l 断片 （図 1 2 ) を プ ロ ー ブ と し て ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た （図 1 8 ) 0 Southern analysis was performed on seven of the cycloheximide-resistant strains obtained in Example 10 and these clone-powered plasmids were analyzed. We examined whether to retain the DNA. Preparation of chromosomal DNA is described in Methodsin Yeast Genetics-A laborato ry Course Manu al-Rose .Deta 1.P 131-132 Cold S ring Harbor La boratory Press NY Followed the method. Prepared had DNA is Ru Ah E c 0 RV is Shoi匕Ri by the S a 1 I, 32 P-labeled L 4 1 gene including 1 8 kb of B am HI -. H indlll fragment ( The hybridization was performed with the probe of Fig. 12) (Fig. 18).
こ の 結果、 E c o R V消 化 に よ り 、 内 在性 の L 4 1 遺 伝子 に 由 来す る 5 k b の バ ン ド の ほ か に 、 2 0 k b 以上 の バ ン ド が検 出 さ れ た 。 E c 0 R V は r R N A遺伝子座 を 切断す る が、 プ ラ ス ミ ド P C L R E 2 は E c o R Vで 切断 さ れ な い こ と か ら 、 プ ラ ス ミ ド が染色体 に 組 み 込 ま れ た こ と に よ り 、 こ の 2 0 k b 以上 の バ ン ド が検 出 さ れ た も の と 考 え ら れ た 。 ま た 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 1 細胞 あ た り の L 4 1 遺伝子 の コ ピ ー 数が 2 で あ る こ と は 実施例 1 5 の サ ザ ン 解析 に よ り 示 さ れて い る の で 、 デ ン シ ト メ 一 夕 一 に よ る ス キ ャ ニ ン グ の 結果か ら 組 み込 ま れ た プ ラ ス ミ ド D N A の コ ピ ー 数 は 、 お よ そ 、 6 コ ピ ー ( レ ー ン 7 ) か ら 1 5 コ ピ ー （ レ ー ン 2 ) で あ る こ と 力く 示 さ れ た 。  As a result, by Eco RV digestion, a band of 20 kb or more was detected in addition to the 5 kb band derived from the endogenous L41 gene. Was. Ec0 RV cleaves the rRNA locus, but plasmid PCLRE 2 is not cleaved by EcoRV, so the plasmid is integrated into the chromosome. Thus, it was considered that a band of 20 kb or more was detected. Further, the fact that the number of copies of the L41 gene per Candida * utilis 1 cell is 2 is based on the Southern analysis in Example 15 As shown in the figure, the number of copies of the plasmid DNA incorporated from the results of the scanning by densitometry is approximately Else, it was strongly indicated that the copy ranged from 6 copies (lane 7) to 15 copies (lane 2).
—方、 S a 1 I は プ ラ ス ミ ド p C L R E 2 を 1 箇所消 化す る が、 染色体 D N A を S a 1 I 消 化 し た 場 合、 内 在 性 の L 4 1 遺伝子 に 由 来す る 7 . 5 k b の バ ン ド の ほ カヽ に プ ラ ス ミ ド P C L R E 2 の 長 さ に 相 当 す る 8 . 5 k b の バ ン ド が検 出 さ れ た 。 こ れ は 、 プ ラ ス ミ ド が染色体 に 複数個 タ ン デ ム に 組み 込 ま れ た こ と に よ り 、 S a 1 I 消 化 に よ っ て と な り あ う プ ラ ス ミ ド か ら 生 じ た も の であ る と 考え ら れた。 . On the other hand, Sa1I abolishes the plasmid pCLRE2 at one site, but when chromosomal DNA is ablated, Sa1I results from the endogenous L41 gene. Near the 7.5 kb band, an 8.5 kb band corresponding to the length of the plasmid PCLRE2 was detected. This is due to the fact that multiple plasmids have been integrated into chromosomes in multiple tandems, resulting in Sa1I deletion. It was thought to have originated from a potential plasmid due to the chemical transformation. .
こ の ほ か 1 0 個以上の シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性株 につ い て サザ ン 解析を行な っ た と こ ろ 、 すべ て の ク ロ ー ン で プ ラ ス ミ ド D N A の存在が確認 さ れ、 実施例 1 0 の形質転 換実験で得 ら れた シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性株が形質転換体 で あ る こ と が証明 さ れた。  In addition, when Southern analysis was performed on 10 or more cycloheximide-resistant strains, it was confirmed that all clones had plasmid DNA. The presence was confirmed, and it was proved that the cycloheximide-resistant strain obtained in the transformation experiment of Example 10 was a transformant.
実施例 1 3 ： そ の 他の キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス株の 形質転換  Example 13: Transformation of other Candida and utility strains
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス は株 に よ っ て そ の染色体泳 動パ タ ー ン が異な り 、 染色体の長 さ の 多型性を示す こ と 力《報告 さ れて い る （ S t 01 t e n b u r g e t . a 1. C u r r . G e n e t. 22 441 - 446 ( 1992 ) ) 。 よ っ て、 株 に よ る 遺伝的性質や、 そ れ に よ る 形質転換頻度の違 い も 予想 さ れ る こ と か ら 、 A T C C 9 9 5 0 株以外 に も 、 A T C C 9 2 2 6 株、 A T C C 9 2 5 6 株 に つ い て実施例 1 1 に 示 し た電気パ ル ス 法 に よ る 形質転換を試み た。  Candida utilis has been reported to have different chromosome swimming patterns in different strains and to exhibit chromosomal length polymorphisms. (St 01 tenburget. A 1. Curr. Genet. 22 441-446 (1992)). Therefore, it is expected that the genetic characteristics of the strains and the frequency of transformation due to the strains are expected to differ, so that the ATCC 9250 strains as well as the ATCC 9250 strains Transformation of ATCC 9256 strain by the electropulse method shown in Example 11 was attempted.
パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 β F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム と し 、 電圧 を 2 . 5 - 6 . 2 5 K V / c m と し て 行 っ た。 プ ラ ス ミ ド D N A は B g 1 H消化 し た p C L R E 2 を 用 い た。  The pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 βF, the resistance value was 100 ohms, and the voltage was 2.5-6.25 KV / cm. As plasmid DNA, Bg1H-digested pCLRE2 was used.
そ の結果 は表 1 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 株 に よ っ て 頻度の 差 は認め ら れ た も の の い ずれの 株で も シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 コ ロ ニ ー が得 ら れ た。 表 1 ：プラスミ ド PCLRE2による形 換 電圧条件
Figure imgf000085_0001
The results were as shown in Table 1. Cycloheximid-resistant colonies were obtained in all strains, although the frequency was different depending on the strain. Table 1: Voltage conditions for conversion by plasmid PCLRE2
Figure imgf000085_0001
(KV/cm) ATCC 9226 ATCC 9256  (KV / cm) ATCC 9226 ATCC 9256
2. 50 22 0  2.50 22 0
3. 75 145 8  3.75 145 8
5. 00 128 8  5.00 128 8
6. 25 94 7 そ こ で、 得 ら れた A T C C 9 2 2 6 株、 な ら び に A T C C 9 2 5 6 株由来の シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性株そ れ ぞれ 4 株づっ計 8 株、 お よ び対照 と し て A T C C 9 9 5 0 株由来の シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性株 2 株 に つ い て、 染色 体 D N A を調製 し て B g 1 H消化 し た後、 32 P 標識 し た L 4 1 遺伝子を含む 1 . 8 k b の B a m H I — H i n d 111 断片 （図 1 2 ) を プ ロ ー ブ と し て、 サザ ン 解析を行 つ た o 6.25 94 7 The obtained ATCC 9226 strain and the cycloheximide-resistant strain derived from ATCC 9256 strain were each counted for 4 strains in total. After preparing chromosomal DNA and digesting it with Bg1H, eight strains and two cycloheximide-resistant strains derived from ATCC 9950 as a control were used. , 32 1 includes a P-labeled L 4 1 gene 8 kb of B am HI -. H ind 111 fragment (Fig. 1 2) to the profiles over blanking and one row of Sutherland emissions analysis o
結果 は図 1 9 に示 さ れ る 通 り で あ っ た。 い ずれの株 に お い て も 染色体上の L 4 1 遺伝子 に 由 来す る 5 . 4 k b の バ ン ドの 他 に、 プ ラ ス ミ ド D N A 由来の バ ン ドが認め ら れた。 こ れ よ り 、 こ れ ら 耐性株が プ ラ ス ミ ド D N A を 保持す る 形質転換体で あ る こ と が示 さ れた。  The results were as shown in FIG. In all strains, in addition to the 5.4 kb band derived from the L41 gene on the chromosome, a band derived from plasmid DNA was observed. This indicated that these resistant strains were transformants carrying plasmid DNA.
ま た 、 A T C C 9 2 2 6 株 と A T C C 9 2 5 6 株由来 の形質転換体 に つ い て は、 ク ロ ー ン に よ っ て プ ラ ス ミ ド D N A サ イ ズ と 同 じ 8 . 4 k b の バ ン ド以外 に高分子側 に バ ン ドが認め.ら れた （ レ ー ン 2 — 4 、 お よ び 7 ) 。 こ れ は、 プ ラ ス ミ ド上の r D N A配列が組み込み タ ー ゲ ッ ト で あ る 染色体上の r D N A配列 と 異な る 場合、 染色体 に組み込 ま れ た プ ラ ス ミ ド D N A分子末端の B g 1 11部 位が欠失す る こ と があ る こ と を 示 し て い る 。 The ATCC 9226 strain and the transformants derived from ATCC 9256 strain were cloned into plasmids. In addition to the 8.4 kb band of the same size as the DNA size, bands were also observed on the polymer side (lanes 2-4, and 7). This is because the rDNA sequence on the plasmid differs from the rDNA sequence on the chromosome that is the integration target, and the end of the plasmid DNA molecule integrated on the chromosome This indicates that the Bg111 site may be deleted.
キ ャ ン デ ィ ダ ， ュ テ ィ リ ス 1 細胞 あ た り の L 4 1 遣伝 子の コ ピ ー 数が 2 で あ る こ と は 実施例 1 5 の サザ ン 解析 に よ り 示 さ れて い る の で、 5 . 4 k b の バ ン ド力 2 コ ピ 一 の L 4 1 遺伝子 に対応す る も の と し て 、 バ ン ド の 強 さ の比較か ら 組み込ま れた プ ラ ス ミ ド の コ ピ ー数を求め た バ ン ドの 濃 さ は イ メ ー ジ ン グ ア ナ ラ イ ザ ー  The Southern analysis in Example 15 shows that the number of copies of the L41 gene per candida / utilis cell is two. The 5.4 kb band force corresponds to the 2 copies of the L41 gene, and the built-in band force was compared based on the band strength comparison. The density of the band from which the number of copies of the smid was calculated was determined by the imaging analyzer.
B A S 2 0 0 0 ( FU】 1 F UM ) を用 い て測定 し た。 The measurement was performed using BAS200 (FU) 1 FUM.
そ の 結果、 プ ラ ス ミ ド P C L R E 2 の コ ピ ー数 は、 A T C C 9 2 5 6 株で は 7 コ ピ ー （ レ ー ン 1 ) 力、 ら 2 5 コ ピ ー （ レ ー ン 3 ) で あ り 、 A T C C 9 2 2 6 株で は 3 コ ピ ー （ レ ー ン 5 ) か ら 1 1 コ ピ ー （ レ ー ン 6 ) で あ つ た.。 一方、 A T C C 9 9 5 0 株で は そ れぞれ 1 1 コ ピ ー ( レ ー ン 9 、 お よ び 1 0 ) と 計算 さ れ た。  As a result, the number of copies of Plasmid PCLRE2 was 7 copies (lane 1) of the ATCC 925 56 strain, and 25 copies (lane 3). Thus, the ATCC 922 26 strain ranged from 3 copies (lane 5) to 11 copies (lane 6). On the other hand, it was calculated to be 11 copies (lane 9 and 10) for the ATCC 9950 strain, respectively.
以上の 結果 は、 A T C C 9 9 5 0 株以外の  The above results indicate that except for the ATC C950 strain
A T C C 9 2 2 6 株、 お よ び A T C C 9 2 5 6 株 に つ い て も 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 L 4 1 遺伝子を用 い て形質 転換体が取得可能で あ る こ と を 示 し 、 プ ラ ス ミ ド は 複数 個 同時 に染色体 に組み込 ま れ た こ と が示 さ れた。 実施例 1 4 ： 酢酸 リ チ ウ ム 法、 お よ び そ の 変法 に よ る キ ャ ン デ ィ ダ * .ュ テ ィ リ ス の 形質転換 Transformants can also be obtained using the cycloheximide resistance L41 gene for ATCC 9226 and ATCC 9256. , Indicating that a plurality of plasmids were simultaneously integrated into the chromosome. Example 14: Transformation of Candida *. Utilis by the lithium acetate method and its modifications
酢酸 リ チ ウ ム 法 （ 1 t。 e t a 1. J . B a c t e r i . 153, 163 - 168 ( 1983 ) ) は そ の 簡便 さ か ら 広 く サ ッ カ ロ ミ セ ス 属酵母 の 形質転換 に 用 い ら れ て い る 。 そ こ で、 B g l l l 消ィ匕 に よ り 直鎖状 に し た プ ラ ス ミ ド p C L R E 2 を 用 い て 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株 を 酢 酸 リ チ ウ ム 法、 お よ び エ タ ノ ー ル ま た は D M S O を 添加 す る 酢酸 リ チ ウ ム 法変法 （ S G n i e t . a 1. C u τ r e n t G e n e t. 1993 24, 455 - 459 ) に 従 っ て形質転換す る こ と を 試み た ^酸 リ チ ウ ム 法変法で は エ タ ノ ー ソレ は ヒ ー ト シ ョ ッ ク 開 始 1 0 分後 に 終濃度 1 0 % に な る よ う に 菌 液 に 添加 し 、 さ ら に 1 0 分 間保温 し た 。 ま た 、 D M S 0 は ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル液 と 同 時 に 終濃度 1 0 % に な る よ う に 菌液 に 添加 し た 。 処理 し た 菌体 は Y P D 溶液 に 懸濁 し て、 3 0 °C 4 時間 の 振盪培 養 を 行 な っ て か ら シ ク ロ へ キ シ ミ ド を 含 む選択 プ レ ー ト に 塗布 し 、 2 8 °C で 6 日 間保温 し た 。..  The lithium acetate method (1 t. Eta 1. J. B acteri. 153, 163-168 (1983)) is widely used for the transformation of yeast of the genus Saccharomyces because of its convenience. There are. Thus, using the plasmid pCLRE2, which has been linearized by Bglll siding, the candida * utilis ATCC 9950 strain was expanded. Lithium acetate method, and a modified method of lithium acetate with addition of ethanol or DMSO (SG niet. A 1. Cu τ rent Genet. 1993 24, 455-459) .In the modified acid-lithium method, ethanol concentration was reduced to a final concentration 10 minutes after the start of heat shock. The solution was added to the bacterial solution so that the concentration became 10%, and the mixture was further incubated for 10 minutes. In addition, DMS0 was added to the bacterial solution at the same time as the polyethylene glycol solution so that the final concentration became 10%. The treated cells are suspended in a YPD solution, cultured at 30 ° C for 4 hours with shaking, and then applied to a selection plate containing cyclosimid. And incubated at 28 ° C for 6 days. ..
そ の 結果、 エ タ ノ ー ル D N A を 添加す る リ チ ウ ム 法変 法 に よ り プ ラ ス ミ ド D N A 2 ;z g D N A に つ い て シ ク 口 へ キ シ ミ ド耐性株が 5 個 得 ら れ た 。 こ の う ち 2 つ の ク ロ ー ン に つ い て 染色体 D N A を 調製 し て実施例 1 3 記載 の 方法 で サ ザ ン 解析 を 行 っ た と こ ろ 、 プ ラ ス ミ ド 由 来 の バ ン ド が検 出 さ れ、 こ れ ら が形質転換体 で あ る こ と が示 さ れ た。 こ の結果か ら 、 形質転換頻度 は電気パ ル ス 法に 比較 し てかな り .低い が、 酢酸 リ チ ウ ム に よ っ て処理 さ れ た キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス も D N A を取 り 込む こ と が可 能で あ る こ と が示 さ れた。 As a result, a modified lithium method in which ethanol DNA was added resulted in 5 strains of kissmid resistant strains of plasmid DNA 2; One was obtained. From these two clones, chromosomal DNA was prepared and subjected to Southern analysis according to the method described in Example 13; End-points are detected, indicating that they are transformants. It was done. These results indicate that the transformation frequency is much lower than that of the electropulse method, but that the candidate strain treated with lithium acetate is also low. It has been shown that it is possible to incorporate DNA.
本実験で は S G n i ら の 報告 に し た 力く つ て実験を行な っ た が、 さ ら に 処理条件を検討す る こ と に よ り 形質転換頻度 を高 め る こ と も 可能であ る 。  In this experiment, we performed the experiment using the power reported by SGni et al., But it is also possible to increase the frequency of transformation by further studying the treatment conditions. is there .
実施例 1 5 ： 異な る r R N A 遺伝子領域を タ ー ゲ ッ ト と し た形質転換  Example 15: Transformation using different rRNA gene regions as targets
1 ) プ ラ ス ミ ド の構築  1) Construction of plush
実施例 9 に記載の プ ラ ス ミ ド p C L B S 1 2 (図 1 5 ) の E c o R I サ イ 卜 に 、 p C R E 2 (図 6 ) か ら 得 ら れ る 3 . 5 k b の E c o R I 断片を挿入す る こ と に よ り P C L R E 4 を、 p C R E 3 (図 6 ) カヽ ら 得 ら れ る  The 3.5 kb EcoRI obtained from pCRE2 (Figure 6) was added to the EcoRI site of the plasmid pCLBS12 (Figure 15) described in Example 9. PCLRE 4 can be obtained from pCRE 3 (Figure 6) by inserting the fragment
2 . 4 k b の E c o R I 断片を挿入す る こ と に よ り p C L R E 5 を そ れぞれ構築 し た。 PCLRE5 was constructed by inserting a 2.4 kb EcoRI fragment.
ま た、 7 . 5 k b の r D N A を含む E c o R I 断片力く ク ロ ー ン 化 さ れ た p C R E l (図 6 ) 力、 ら 切 り 出 さ れ る 3 k b の E c o R I — X b a l 断片 と 、 4 . 5 k b の E c 0 R I - X b a I 断片 と を、 p B l u e s c r i p t S K - の E c 0 R I と X b a I 間 に連結 し た後、 そ れ ぞれの ブ ラ ス ミ ド の X b a I サ イ ト を E c o R I リ ン カ 一  Also, the EcoRI fragment containing the 7.5 kb rDNA fragment (Fig. 6), and the 3 kb EcoRI—X that was cut out. The bal fragment and the 4.5 kb Ec0RI-XbaI fragment were ligated between the Ec0RI and XbaI of pBluescript SK-, and the respective plasmids were ligated. Insert the XbaI site of Mido into Eco RI Linker
(5' C CAAGCTTGG 3' ) の 挿入 に よ り E c o R I サ イ 卜 に 変換 し て、 プ ラ ス ミ ド p C R E 6 と P C R E 7 と を構築 し た。 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド p C R E 6 と P C R E 7 と か ら そ れ そ れ切 り 出 し た.3 k b と 4 . 5 k b の E c o R I 断片を プ ラ ス ミ ド P C L B S 1 2 の E c o R I サ イ ト に 挿入す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド p C L R E 6 と P C L R E 7 を構築 し た。 (5 'C CAAGCTTGG 3') was inserted to convert it to EcoRI site to construct plasmid pCRE6 and PCRE7. These plasmids, pCRE6 and PCRE7, were respectively cut out.The 3 kb and 4.5 kb EcoRI fragments were isolated from the plasmids PCLBS12 and PCLBS12. Plasmids pCLRE6 and PCLRE7 were constructed by inserting them into the EcoRI site.
構築 し た プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 p C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 の構造 は 図 2 0 に 示 さ れ る 通 り で あ る 。  The structures of the constructed plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7 are as shown in FIG.
2 ) 形質転換  2) Transformation
作製 し た プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 p C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 は制限酵素で消化 し て直鎖状 D N A と し た後、 各 l u g の D N A を 用 い て実 施例 1 1 に示 し た電気パ ル ス 法 に よ り A T C C 9 9 5 0 株を形質転換 し た。 パ ル ス 条件 は、 電気容量を 2 5 F 電圧を 5 K V Z c m、 抵抗値を 8 0 0 オ ー ム と し 、 パ ル ス 後の培養時間 は 1 8 時間 と し た。 プ ラ ス ミ ドの 消化 に 用 い た制限酵素 は r R N A遣伝子断片内 に そ の切断サ イ ト があ る 酵素で、 P C L R E 4 は B g l l l、 p C L R E 5 は B a m H I ま た は X b a l 、 p C L R E 6 は  The prepared plasmids pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7 were digested with restriction enzymes into linear DNA, and the DNA of each lug was used. The ATCC 9950 strain was transformed by the electropulse method described in Example 11. The pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 F, the voltage was 5 KVZcm, the resistance value was 800 ohms, and the culture time after the pulse was 18 hours. The restriction enzyme used for the digestion of the plasmid was an enzyme having its cleavage site in the rRNA gene fragment.PCLRE4 was Bglll, pCLRE5 was BamHI or X bal, p CLRE 6 is
B a m H I 、 そ し て p C L R E 7 は A p a l 、 ま た は E c o R V で そ れぞれ消化 し た。 プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 に つ い て は L 4 1 遺伝子内 の C 1 a I サ イ ト に お い て も 消化 し て、 組み込み の タ ー ゲ ッ ト 遺伝子の 違 い に よ る 形質転換頻度 の 差を比較 し た。 実験 は 2 回行 っ た。 そ の 結果 は、 表 2 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 BamHI and pCLRE7 were digested with Apal or EcoRV, respectively. Plasmid pCLRE4 is also digested at the C1aI site in the L41 gene, and is characterized by a difference in the integrated target gene. The difference in conversion frequency was compared. The experiment was performed twice. The results were as shown in Table 2.
表 2 ： プラスミ ド p CLRE 4、 p CLRE 5、 p CLRE 6、  Table 2: Plasmids p CLRE 4, p CLRE 5, p CLRE 6,
および p CLRE 7による形質転換 プラスミ ド DNA1 gあたりの形 換 ί«  And pCLRE7 Transformation per g of plasmid DNA ί «
1回目 2回目  1st time 2nd time
p CLRE4 (B g 1 II) 786 593  p CLRE4 (B g 1 II) 786 593
p CLRE4 (C 1 a I) 87  p CLRE4 (C 1 a I) 87
p CLRE 5 (B amH I) 0 0  p CLRE 5 (B amH I) 0 0
p CLRE 5 (Xb a I) 1 18  p CLRE 5 (Xb a I) 1 18
p CLRE 6 (B amH I) 301 775  p CLRE 6 (B amH I) 301 775
p CLRE 7 (A pa l) 409 754  p CLRE 7 (A pa l) 409 754
p CLRE 7 (E c oRV) 577 640 プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 の r R N A遣伝子断片内 で消化 し た場合 は い； f れ も 1 g D N A あ た り 数百個 と 、 高 い形質転換頻 度 を示 し た。 一方、 プ ラ ス ミ ド p C L R E 5 は、  pCLRE 7 (EcoRV) 577 640 Plasmid p CLRE 4, p CLRE 6, and digested in the rCL gene fragment of p CLRE 7 Yes; f also 1 g The DNA showed a high transformation frequency of several hundreds per DNA. On the other hand, the plasmid pCLRE5 is
B a m H I 、 ま た は X b a I ど ち ら で消ィ匕 し た 場 合 も 、 他の プ ラ ス ミ ド を用 い た場合 に比較 し て形質転換頻度 は 非常 に 低か っ た。 こ の 結果 は、 r R N A遺伝子領域で も 形質転換の タ ー ゲ ッ ト と し て用 い る 断片 に よ り 、 形質転 換頻度が大 き く 異な る こ と を 示 し て い る 。 ま た、 プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 に つ い て、 L 4 1 遗伝 子内 の C 1 a I.サ イ ト で消化 し た場合、 そ の形質転換頻 度 は r R N A遺伝子内 の B g 1 11サ イ ト で消化 し た場合 に比較 し て、 約 1 0 分の 1 か ら 5 0 分の 1 程度で あ っ た ま た、 以下 に記載 し た サザ ン 解析 に よ り 、 プ ラ ス ミ ド分 子 は C 1 a I サ イ ト で消化 し た場合 に は L 4 1 遺伝子座 に、 B g 1 11サ イ ト で消化 し た場合 に は r R N A遣伝子 座 に 、 そ れぞれ組み込 ま れた こ と が示 さ れた。 Transformation frequency was significantly lower when either BamHI or XbaI was used than when other plasmids were used. This result indicates that the transformation frequency of the rRNA gene region also varies greatly depending on the fragment used as the transformation target. In addition, when the plasmid pCLRE4 was digested with the C1aI. Site in the L41 gene, its transformation frequency was lower than the rRNA gene. Compared to digestion with Bg111 site, the ratio was about 1/10 to 1/50, and according to the Southern analysis described below, Plasmid molecules are at the L41 locus when digested at the C1aI site and at the rRNA locus when digested at the Bg111 site. , Respectively.
以上 よ り 、 染色体で の コ ピ ー 数が多 い r R N A遺伝子 を タ ー ゲ ッ ト 配列 と し て用 い る こ と に よ っ て、 高 い形質 転換頻度が得 ら れ る こ と が明 ら 力、 と な っ た。  As described above, by using the rRNA gene having a large number of copies on the chromosome as a target sequence, a high transformation frequency can be obtained. It became clear power.
3 ) サ ザ ン解析  3) Southern analysis
B g 1 11ま た は C 1 a I 消化 し た p C L R E 4 、 X b a I 消化 し た p C L R E 5 、 B a m H I 消化 し た p C L R E 6 、 そ し て A p a I 消化 し た p C L R E 7 を 用 い て得 ら れた シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性株そ れぞれ 4 株ず つ に つ い て、 染色体 D N A を調製 し た。 調製 し た D N A は P g 1 11、 ま た は B g 1 11お よ び N 0 t I に よ り 消化 し 、 32 P 標識 し た L 4 1 遺伝子を 含む 1 . 8 k の B a m H I - H i n d l l l 断片 （図 1 2 ) を プ ロ ー ブ と し て、 サザ ン 解析を行 っ た （図 2 1 ) 。 PCLRE4 digested with Bg111 or C1aI, pCLRE5 digested with XbaI, pCLRE6 digested with BamHI, and pCLRE7 digested with ApaI Chromosomal DNA was prepared for each of the four cycloheximide resistant strains obtained using the method. The prepared DNA was digested with Pg111 or Bg111 and N0tI, and the 1.8 kBamHI- containing 32 P-labeled L41 gene was digested. The Southern analysis was performed using the Hindlll fragment (Fig. 12) as a probe (Fig. 21).
プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 が組み込 ま れ た株で は 、 B g 1 11消化 に よ っ て、 内在性の L 4 1 遺伝子 に 由来す る 5 . 4 k b の バ ン ド の ほ か に 、 プ ラ ス ミ ド D N A分子 内 B g 1 1 1サ イ ト で の切断 に よ り プ ラ ス ミ ド D N A と 同 じ サ イ ズ の 8 . . 4 k b の バ ン ドが認め ら れた (図 2 1In strains incorporating the plasmid pCLRE4, the 5.4 kb band from the endogenous L41 gene was digested by Bg111 digestion. In addition, the plasmid DNA molecule Of the Bg111 site, a 8.4 kb band of the same size as that of the plasmid DNA was found by cleavage at the site (Fig. 21).
( 1 ) 、 レ ー ン 1 一 8 ) 。 ま た、 C 1 a I 消化 し た ブ ラ ス ミ ドが組み込 ま れ た株の 場合 は、 こ れ ら 2 つ の ノく ン ド の他 に . 7 . 4 k b と 6 . 4 k b の バ ン ドが認め ら れた(1), lanes 118). In addition, in the case of a strain into which C1aI-digested brassmid has been integrated, in addition to these two compounds, a .7.4 kb fragment and a 6.4 kb fragment are used. Band approved
( レ一 ン 1 一 4 ) o ら 2 つ の バ ン ド は、 染色体上の L 4 1 遺伝子の う ち 1 個が プ ラ ス ミ ド の 挿入 に よ り 分断 さ れた こ と に よ り 、 組み込 ま れた プ ラ ス ミ ド分子の両末 端 に位置す る ブ ラ ス ミ ド分子内 の B g 1 1 1サ ィ 卜 と L 4 1 遺伝子領域内 の， B g 1 I 1サ イ 卜 と カヽ ら 生ず る も の で あ る こ と ヽ 、 プ ラ ス ミ ド分子が相同組換え に よ り L 4 1 遺伝子座 に 組み込 ま れた こ と が示 さ れた 。 こ の こ と カヽ 、 プ ラ ス ミ ド分子 は、 C 1 a I サ イ ト で切断 さ れ ¾S 口 に は L 4 1 遺伝子座 に、 B g 1 1 1サ イ 卜 で切断 さ れ た場合 に は r R N A 遣伝子座 に、 そ れぞれ組み込 ま れ た こ と が示 さ れた o れ に よ り 、 切断サ イ ト を 変更す る こ と で プ ラ ス ミ ド の組み込み場所を 3 ン 卜 □ 一ノレす る こ と が可能で あ る こ と が示 さ れた。 ま た、 レ ー ン 1 一 4 で は 5 . 4 k b 、 7 . 4 k b 、 お よ び 6 . 4 k b の バ ン ド の 濃 さ が ほ ぼ同 じ で あ つ た こ と か ら 、 染色体 に は L 4 1 遺伝子が 2 コ ピ ー 存在す る こ と が明 ら か に さ れ た。 (Lane 114) o The two bands are due to the fact that one of the L41 genes on the chromosome was disrupted by insertion of a plasmid. Bg111 site in the plasmid molecule located at both ends of the integrated plasmid molecule and Bg1I1 in the L41 gene region. It was shown that it was produced from the site and the carp, indicating that the plasmid molecule was integrated into the L41 locus by homologous recombination. In this case, the plasmid molecule is cleaved at the C1aI site, and when cut at the L41 locus in the S mouth and at the Bg111 site. Are shown to have been incorporated into the rRNA gene locus, respectively, and the cleavage site was changed by changing the cleavage site. 3 in. □ It was shown that it is possible to go one place. In addition, in lane 114, the bands of 5.4 kb, 7.4 kb and 6.4 kb were almost the same in density, indicating that the chromosome Revealed that there were two copies of the L41 gene.
プ ラ ス ミ ド p C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 力 組み込 ま れ た株で は 、 B g 1 I i +  Plasmids pCLRE5, pCLRE6, and pCLRE7 in the integrated strain, Bg1Ii +
N 0 t I 消化 に よ り 、 内在性の L 4 1 遺伝子 に 由 来す る 5 . 4 k b の バ ン ド の ほ か に 、 染色体 に 組み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド 由 来 の.い く つ か の バ ン ド が認 め ら れ た （図 2 1 ( 2 ) ) 。 こ の う ち サ イ ズが各 プ ラ ス ミ ド と 同一で あ る バ ン ド 、 す な わ ち P C L R E 5 で は 7 . 3 k b ( レ ー ン 1 一 4 ) 、 p C L R E 6 で は 8 . O k b ( レ ー ン 5 — 8 ) 、 そ し て P C L R E 7 で は 9 . 4 k b の ノ、 ン ド （ レ ー ン 9 - 1 2 ) は 、 プ ラ ス ミ ド が染色体 に タ ン デ ム に 組み込 ま れ る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド 内 に 1 箇所サ イ ト が あ る N o t I 消 化 に よ っ て 隣 り 合 う プ ラ ス ミ ド か ら 生 じ た バ ン ド で あ る 。 ま た 、 そ れ以外 に も P C L R E 5 で は N 0 t I digestion results in endogenous L41 gene In addition to the 5.4 kb band, several bands derived from the plasmid integrated into the chromosome were observed (Fig. 21 (2) ). In this case, the band whose size is the same as each of the plasmids, that is, 7.3 kb (lane 14) for PCLRE 5, and 8 for pCLRE 6 O kb (lanes 5-8) and 9.4 kb in PCLRE 7 and lanes (lanes 9-12) indicate that the plasmid has a strand on the chromosome. Due to being incorporated into the system, there is one site in the Plusmid, generated from the adjacent Plusmid by the NotI digestion. It is a band. Other than that, with PCLRE 5,
7 k b ( レ ー ン 1 一 4 ) 、 P C L R E 6 で は 6 . 9 k b ( レ ー ン 5 — 8 ) 、 そ し て P C L R E 7 で は l l k b ( レ ー ン 9 一 1 2 ) の バ ン ド が認 め ら れ た 。 こ れ ら の サ ィ ズ は プ ラ ス ミ ド D N A 力く r R N A遺伝子座 に 相 同組換 え に よ り 組 み 込 ま れ た 場 合 に B g 1 I I + N 0 t I 消化 に よ り r R N A遺伝子座 内 の B g 1 11サ イ 卜 と プ ラ ス ミ ド D N A 内 の N o t I サ イ ト と か ら 得 ら れ る 断片 の 長 さ に — ¾す る 。 こ れ よ り 、 プ ラ ス ミ ド D N Aが切 断 さ れ た 部 位で相 同組換 え に よ り 染色体 に 組 み 込 ま れ た こ と が示 さ れ た 。 7 kb (lanes 114), 6.9 kb (lanes 5-8) for PCLRE 6, and llkb (lanes 911) for PCLRE 7. Admitted . These sizes are due to Bg1II + N0tI digestion when homologously recombined into the plasmid DNA locus and the rRNA locus. The length of the fragment obtained from the Bg111 site in the rRNA locus and the NotI site in the plasmid DNA is given below. This indicated that the plasmid DNA was integrated into the chromosome by homologous recombination at the cut site.
図 2 1 ( 1 ) の レ ー ン 1 — 4 の 5 . 4 k b の バ ン ド 力く 1 コ ピ ー の L 4 1 遺伝子、 レ ー ン 5 — 8 お よ び 図 2 1 ( 2 ) の レ ー ン 1 — 1 2 の 5 . 4 k b バ ン ド 力く 2 コ ピ ー の L 4 1 遺伝子 に 対応す る も の と し て 、 各バ ン ド の 濃 さ の 比較か ら 組 み込 ま れ た プ ラ ス ミ ド の コ ピ ー 数 を 求 め た。 ノく ン ド の 濃 さ は .ィ メ ー ジ ン グ ア ナ ラ イ ザ ー B A S 2 0 0 0 ( FUJ I F ILM ) を用 い て 測定 し た 。 One copy of the L41 gene, lane 5-8, and lane 5-8 of lane 1-4 in Fig. 21 (1), and 5.4 kb band in Fig. 21 (2) Lanes 1-1 2 5.4 kb band The intensity of each band corresponds to 2 copies of the L41 gene. From the comparison, the number of copies of the included plusm was obtained. The darkness of the knob was measured using an imaging analyzer BAS 2000 (FUJ IF ILM).
そ の 結果、 ブ ラ ス ミ ド Ρ C L R E 4 は 、 L 4 1 遺伝子 座 に は 3 コ ピ ー （ レ ー ン 4 ) カヽ ら 5 コ ピ ー （ レ ー ン 1 、 お よ び 3 ) 、 r R Ν Α遺伝子座 に は 2 コ ピ ー （ レ ー ン 8 ) か ら 8 コ ピ ー （ レ ー ン 5 ) 挿入 さ れ た こ と が示 さ れ た 。 こ の 結果 か ら 、 プ ラ ス ミ ド D N A 力く r R N A遺伝子座 に 組 み込 ま れ た 場合、 組 み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド分子 の コ ピ 一数が高 い 株が選択 さ れ る 傾 向 が認 め ら れ た 。 こ れ は 、 実施例 1 2 に お い て プ ラ ス ミ ド p C L R E 2 力' r R N A 遺伝子座 に 組 み 込 ま れ た 株 で は プ ラ ス ミ ド D N A の コ ピ 一数が お よ そ 6 コ ピ ー カヽ ら 1 5 コ ピ ー で あ る が、 実施例 1 6 の U R A 3 遣伝子座へ組 み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド  As a result, the plasmid Ρ CLRE 4 contained three copies (lane 4) and five copies (lane 1 and 3), r at the L41 locus. It was shown that 2 copies (lane 8) to 8 copies (lane 5) were inserted into the RΝ gene locus. These results indicate that when the plasmid DNA was integrated into the rRNA locus, a strain with a high copy number of the integrated plasmid molecule was selected. This tendency has been recognized. This indicates that in the strain integrated into the plasmid pCLRE2 rRNA locus in Example 12, only one copy of the plasmid DNA is required. The six copies are fifteen copies, but the plasmid that is incorporated into the URA3 gene locus of Example 16
D N A の 場合 は コ ピ ー 数 が お よ そ 3 コ ピ ー か ら 4 コ ピ ー で あ っ た こ と カヽ ら も 示唆 さ れ る 。 In the case of DNA, it is suggested that the number of copies was about 3 to 4 copies.
ま た 、 プ ラ ス ミ ド、 P C L R E 5 、 p C L R E 6 、 お よ び p C L R E 7 に つ い て は そ れ ぞ れ 3 コ ピ ー （図 2 1 ( 2 ) 、 レ ー ン 4 ) 力、 ら 5 コ ピ ー （ レ ー ン 2 ) 、 3 コ ピ 一 （ レ ー ン 8 ) か ら 6 3 ピ一 （ レ ー ン 5 、 お よ び 6 ) 、 3 コ ピ ー ( レ ー ン 1 2 ) か ら 5 コ ピ ー （ レ ー ン 9 ) 組 み 込 ま れ た こ と が示 さ れ た 。  In addition, three copies (Fig. 21 (2), lane 4) of Plasmid, PCLRE 5, p CLRE 6, and p CLRE 7, respectively, were used. 5 copies (lane 2), 3 copies (lane 8) to 6 3 copies (lane 5 and 6), 3 copies (lane 1 2) ) Showed that 5 copies (lane 9) were incorporated.
実施例 1 6 ： ϋ R A 3 遺伝子座 へ の プ ラ ス ド の 組 み 込 み プ ラ ス ミ ド p C L B S 1 2 (図 1 5 ) の E c o R I サ イ ト に、 U R A.3 遺伝子を含む 5 k b の E c o R I 断片 (図 7 ) を挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド p C L U R A l を構築 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド を U R A 3 遺伝子座内 の P s t I サ イ ト で切断 し 、 こ の プ ラ ス ミ ド を用 い て実施例 1 1 記 載の 電気パ ル ス 法 に よ り A T C C 9 9 5 0 株の形質転換 を試み た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 μ F 抵抗値を 8 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V Z c m と し て行 っ た。 こ れ に よ り 1 a g D N A あ た り シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 コ ロ ニ 一 力《 4 0 個得 ら れた。 Example 16: プ Incorporating the plus into the RA3 locus Insert a 5 kb EcoRI fragment (Figure 7) containing the UR A.3 gene into the EcoRI site of plasmid pCLBS12 (Figure 15), De CLURA l was constructed. This plasmid was cut at the PstI site in the URA 3 locus, and the plasmid was used to apply the electric pulse method described in Example 11 to the plasmid. Transformation of ATCC 9950 strain was attempted. The pulse conditions were set as follows: the capacitance was 25 μF, the resistance was 800 ohms, and the voltage was 5 KVZ cm. As a result, <40 clones resistant to cycloheximide per 1 ag DNA were obtained.
得 ら れ た シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性株 4 株 に つ い て染色体 D N A を調製 し た。 調製 し た D N A は B g 1 11、 ま た は S a 1 I + N 0 t I に よ り 消化 し 、 サザ ン 解析 に供 し た B g 1 1！消化 し た D N A に つ い て は L 4 1 遺伝子を含む 1 . 8 k b の B a m H I — H i n d l l l 断片 （図 1 2 ) を、 S a 1 I + N 0 t I 消化 し た D N A に つ い て は U R A 3 遺伝子を含む 2 . 3 k b の H i n d l l l — E c o R I 断片 （図 8 ) を、 そ れぞれ 32 P 標識 し て プ ロ ー ブ と し た。 Chromosomal DNA was prepared for the four cycloheximide resistant strains obtained. The prepared DNA was digested with Bg111 or Sa1I + N0tI and used for Southern analysis. For the digested DNA, a 1.8 kb BamHI-HindlI fragment containing the L41 gene (Fig. 12) was used for the Sa1I + N0tI digested DNA. Then, a 2.3 kb Hindlll-EcoRI fragment containing the URA3 gene (Fig. 8) was labeled with 32 P and used as a probe.
そ の 結果 は、 図 2 2 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。  The result was as shown in Figure 22.
S a 1 I + N 0 t I 消化 し た D N A に つ い て U R A 3 遺 伝子を プ ロ ー ブ と し た場合、 親株の A T C C 9 9 5 0 株 で は 内在性 U R A 3 遺伝子由 来の 1 3 K b の バ ン ドが認 め ら れた （図 2 2 ( 1 ) 、 レ ー ン 1 ) 。 一方、 耐性株で は こ の 1 3 k b の ノ< ン ド の ほ か に 、 タ ン デ ム に複数個組 み込 ま れ た プ ラス ミ ド カ、 ら N 0 t I 消 化 に よ り 生 じ る 1 O k b の バ ン ド と 、 染色体上 の U R A 3 遺伝子 の う ち 1 個 が プ ラ ス ミ ド の 挿入 に よ り 分 断 さ れ て生 じ る 8 . 4 k b と 1 4 k b の 2 本 の バ ン ド 力く検 出 さ れ た （ レ ー ン 2 一 5 ) 。 こ れ ら 2 本 の バ ン ド は 、 組 み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド分子 の 両末端 に 位 置す る プ ラ ス ミ ド.分子内 の N o t I サ イ 卜 と U R A 3 遣伝子領域 内 の S a 1 I サ イ ト と か ら 生ず る も の で あ る こ と 力、 ら 、 プ ラ ス ミ ド分子が相 同組換 え に よ り U R A 3 遣伝子座 に 組 み 込 ま れ た こ と が示 さ れ た 。 When the URA3 gene was probed for the DNA digested with Sa1I + N0tI, the parent ATCC9905 strain derived from the endogenous URA3 gene A 13 Kb band was observed (Fig. 22 (1), lane 1). On the other hand, In addition to this 13 kb node, plus more than one tandem-built plasmid, 1 O generated by N0tI digestion kb and one of the URA3 genes on the chromosome, 8.4 kb and 14 kb, which are generated by fragmentation of the plasmid by insertion of a plasmid. It was detected strongly (Lane 215). These two bands are the plasmids located at both ends of the integrated plasmid molecule, the Not I site and the URA 3 domain in the molecule. The force generated from the S a1I site in the gene region and the homologous recombination of the plasmid molecule leads to the URA3 gene locus. It was shown that it was incorporated into
ま た 、 形質転換体 で は 内 在性 U R A 3 遣伝子 由 来 の 1 3 k b の バ ン ド と 染色体 に 組み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド分 子 の 両末端 の プ ラ ス ミ ド 由 来 の 8 . 4 k b と 1 4 k b の バ ン ド の 濃 さ 力く ほ ぼ一致す る こ と か ら 、 U R A 3 遺伝子 も L 4 1 遺伝子 同 様 、 細胞 あ た り 2 コ ピ ー 存在 し 、 形質 転換体 で は そ の う ち 1 コ ピ ー が プ ラ ス ミ ド D N A の 挿入 に よ り 分断 さ れ た こ と が示 さ れ た 。 ま た 、 こ れ ら の 4 本 の バ ン ド （ 1 4 k b 、 1 3 k b 、 1 0 k b 、 お よ び 8 . 4 k b ) の 濃 さ の 比較 か ら 、 組 み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド の コ ピ ー 数 は 3 コ ピ ー （ レ ー ン 3 、 お よ び 5 ) か ら 4 コ ピ ー （ レ ー ン 2 、 お よ び 4 ) で あ る こ と 力く示 さ れ た 。  In the transformants, a 13 kb band derived from the endogenous URA3 gene and plasmids at both ends of the plasmid integrated into the chromosome were used. Since the original 8.4 kb and 14 kb bands have almost the same concentration, the URA3 gene has 2 copies per cell, as does the L41 gene. However, in the transformant, it was shown that one copy was broken by insertion of the plasmid DNA. From the comparison of the density of these four bands (14 kb, 13 kb, 10 kb, and 8.4 kb), the built-in It is clearly shown that the number of copies of the Smid ranges from 3 copies (lanes 3 and 5) to 4 copies (lanes 2 and 4). Was
ま た 、 B g 1 1 I消 ィ匕 し た D N A に つ い て L 4 1 遺伝子 を プ ロ ー ブ と し た 場 合、 親株 の A T C C 9 9 5 0 株 で は 内在性の L 4 1 遣伝子 に 由来す る 5 . 4 k b の ノ ン ドが 認め ら れた 力く （'図 2 2 ( 2 ) 、 レ ー ン 1 ) 、 耐性株で は こ の ノく' ン ド の ほ か に プ ラ ス ミ ド D N A と 同 じ サ イ ズの 1 0 k b の バ ン ドが認め ら れた （ レ ー ン 2 — 5 ) 。 In addition, when the L41 gene was used as a probe for the Bg11I-inhibited DNA, the parent strain ATCC 9950 could not be used. A 5.4 kb node derived from the endogenous L41 gene was observed ('Fig. 22 (2), lane 1). A 10-kb band of the same size as the plasmid DNA was observed in the other region (lane 2-5).
実施例 1 7 : キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で の異種遣伝 子 （ グル コ ア ミ ラ ー ゼ遺伝子） の 発現  Example 17: Expression of a heterologous gene (glucoamylase gene) in Candida * utilis
( 1 ) ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼ遣伝子 ( S' T A 1 遺伝子） 発 現用 プ ラ ス ミ ド の構築  (1) Construction of plasmid for gene expression of Dalcoamylase (S'TA1 gene)
S T A 1 遺伝子発現用 プ ラ ス ミ ド を 図 2 3 に 示 さ れ る よ う に構築 し た。  A plasmid for STAl gene expression was constructed as shown in Figure 23.
ま ず、 S T A 1 遣伝子を サ ッ カ ロ マ イ セ ス · デ ィ ァ ス タ テ ィ カ ス 5 1 0 6 — 9 A ( a 1 e u 2 , a r g 4 , S T A 1 ) (Y a m a s h i t a a nd Fuk u i A g r i c . B i o l. C li e m. 1 2689- 2692) の染色体 D N A ラ ィ ブ ラ リ ー よ り ク ロ ー ニ ン グ し た。 こ れ は、 以下 に 示 し た操作 に よ り 行 っ た。  First, the STA1 gene was transferred to the Saccharomyces Deathstatistics 5 1 0 6 — 9 A (a 1 eu 2, arg 4, STA 1) (Yamashitaa nd Cloning from the chromosomal DNA library of Fukui Agric. Biol. Cliem. 1 2689-2692). This was done by the operation shown below.
5 1 0 6 — 9 A 菌体か ら 染色体 D N A を調製 し て Preparation of chromosomal DNA from 5 10 6 — 9 A cells
S a u 3 A I に よ り 部分消化 し た後、 ァ ガ ロ ー ス ゲル電 気'泳動 に よ り 約 2 0 — 3 0 k b の D N A 断片を調製 し た こ の D N A 断片 と 、 B a m H I 消化 し た後脱 リ ン 酸化 し た ； I フ ァ ー ジ ベ ク タ ー E M B L 3 ( S t r a t a g e n e C l o n i ng S y s t ems) と を、 T 4 リ ガ ー ゼ に よ り 連結 し た。 そ れを G i g a p a c k I I Go l d P a c k a g i n E∑ t r a c t ( S t r a t a g e n e C l o n i n Sy s t ems ) を 用 い て、 ィ ン ビ ト ロ ノ、0 ッ ケ ー ジ ン グ し 、 染色体 D N A の 遺伝子 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を構築 し た 。 After partial digestion with Sau3AI, a DNA fragment of about 20 to 30 kb was prepared by agarose gel electrophoresis, and this DNA fragment was digested with BamHI. And then dephosphorylated; I phage vector EMBL 3 (Stratagene Cloning System) was ligated by T4 ligase. Using Gigapack II Gold Packagin Extract (Stratagene Clonin Systems), it was subjected to invitrono and 0 packaging, and the gene DNA line of chromosomal DNA was obtained. Build a library did .
発表済み の S'T A 1 遺伝子の塩基配列 （Yamashi e t. a 1. J B a c t e r i o 1. 161, 567 - 5 Π 1985)に基づ い て合成 し た 2 種類 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド  Two types of oligonucleotides synthesized based on the published nucleotide sequence of the S'T A1 gene (Yamashiet. A 1. JB acterio 1. 161, 567-5 5 1985) Chid
5' ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3' (配列番号 ： 1 9 お よ び 5 ' GACACATCTCTGAGCAGC ATGACTTGGTTG3' (配列番号 2 0 ) を T 4 キ ナ ー ゼ に よ り 3 2 P 末端標識 し た も の を プ ロ ー ブ と し て用 い て、 こ の 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー 約 20， 000プ ラ ー ク を ス ク リ ー ニ ン グ し た。 こ の 結果、 2 種 の プ ロ ー ブ ど ち ら に も ポ ジ テ ィ ブ シ グ ナ ルを与え る ク 口 ー ン 1 個 を得 た。 5 'ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3' (SEQ ID NO: 1 9 is also your good beauty 5 'GACACATCTCTGAGCAGC ATGACTTGGTTG3' (SEQ ID NO: 2 0) was 3 2 P end-labeled Ri by the T 4 key Na over zero of the the profile over Breakfast Approximately 20,000 chromosomal DNA libraries were screened using this method, and as a result, both types of probes could be screened. Obtained a token to give a positive signal.
こ の S T A 1 遣伝子を含む フ ァ ー ジ ク ロ ー ン よ り 、 S T A 1 遺伝子を 含む 4 k b の B g 1 1 I - H p a I 断片 を P U C 1 9 の B a m H I と H i n c l l間 に ク ロ ー ン 化 し て、 プ ラ ス ミ ド p U S T A l (図 2 3 ) を構築 し た。  From the phage clone containing the STA1 gene, a 4 kb Bg11I-HpaI fragment containing the STA1 gene was ligated between BamHI and Hincl of PUC19. The plasmid pUSTAl (Fig. 23) was constructed.
続 い て、 p U S T A l を S T A 1 遺伝子の 開始 コ ド ン ATG の 5 bp下流 に 存在す る S t u I サ イ ト で切断 し た後 X b a I サ イ ト お よ び開始 コ ド ン を 含む合成 ア ダ プ タ ー (配列番号 ： 2 1 ) ：  Subsequently, pUSTAl was digested with the StuI site, which is 5 bp downstream of the start code ATG of the STA1 gene, and then the XbaI site and the start code were deleted. Synthetic adapter including (SEQ ID NO: 21):
5' - C T A G A T G G T A G G - 3 ' 5 '-C T A G A T G G T A G G-3'
3' -TACCATCC-5'  3 '-TACCATCC-5'
を付加 し た。 そ の 後、 さ ら に S a 1 I で部分消化す る こ と に よ り 、 S T A 1 遺伝子を 2 . 7 k b の X b a l — S a i l 断片 と し て得 た。 次に、 P U C 1 2 を P s t I と H i n d I I 1 で消化 し た後、 T 4 D N ' A ポ リ メ ラ ー ゼで処理 し 、 B g 1 1 1 リ ン 力 一を付加 し て構築 し た ブ ラ ス ミ ド P U C 1 2 B g 1 1 I の 、 X b a I と S a 1 I と 間 に S T A 1 遺伝子を 含むWas added. Then, the STA1 gene was obtained as a 2.7 kb Xbal-Sail fragment by further partial digestion with Sa1I. Next, PUC12 is digested with PstI and HindII1, treated with T4DN'A polymerase, and added with Bg111 phosphorylation. Contains the STA1 gene between XbaI and Sa1I of the resulting plasmid PUC12Bg11I
.2 . 7 k b の X b a I - S a 1 I 断片 を挿入 し て、 ブ ラ ス ミ ρ U S T A 2 を構築 し 5 *- o .2.7 Insert a 7 kb XbaI-Sa1I fragment to construct a brassic ρUSTA2 5 * -o
の ρ U S T A 2 か ら 2 . 7 k b の X b a I - Ρ U ST A 2 to 2.7 kb X b a I-
B g 1 I I断片を切 り 出 し 、 こ れを 、 発現ベ ク タ ー The Bg1II fragment was excised and this was used as an expression vector.
P P G K P T 4 の X b a I と B a m H I サ イ ト 間 に挿入 し て、 プ ス ミ ド ρ G K S T A 1 を構築 し た。  Insertion of PPGKPT4 between XbaI and BamHI sites to construct the push ρGKSTA1.
さ ら に P G K S Τ A 1 か ら P G K 遺伝子プ ロ モ ー タ ー と 、 s τ A 1 遺伝子 と 、 さ ら に P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ ー 夕 一 と を む 4 . 9 k b の N 0 t I 断片を切 り 出 し 、 こ の 断片を プ ラ ス ミ ド、 P C L B S 1 2 の N 0 t I サ イ ト に 挿入 し て プ ラ ス ミ K p C L S T A 1 を 、 プ ラ ス ミ ド In addition, the 4.9 kb N0tI gene comprising the PGKS gene A1 to the PGK gene promoter, the sτA1 gene, and the PGK gene terminator Yuichi. Cut out the fragment, insert this fragment into the plasmid, insert it into the N0tI site of PCLBS12, and place the plasmid KpCLSTA1 in the plasmid.
P c L R E 4 の Ν 0 t I サ イ ト に 揷入 し て プ ラ ス ミ ドEnter the Pc LRE 4 Ν 0 t I site and
P C L R S T A 1 を、 そ れぞれ構築 し た。 PCLRSTA1 was constructed respectively.
2 ) キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 形質転換 と ダ ル コ ァ ミ ゼ発現  2) Transformation of Candida utilis and expression of darkomidase
B 1 消化 し た プ ラ ス ミ ド p C L R S T A 1 を 用 い て、 A T C C 9 9 5 0 株、 A T C C 9 2 2 6 株、 お よ び Using the B1 digested plasmid pCLRSTA1, ATC C950 strain, ATCCC922 strain, and
A T c c 9 2 5 6 株の 形質転換を 、 実施例 1 1 記載の電 気パ ル ス 法で行 っ た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 F 抵抗値 を 0 0 0 ォ ー ム 、 電圧 を 3 . 7 5 K V / c m、 ま た は 6 . 2 5 K V / c m と し て仃 っ た。 Transformation of the ATcc 9256 strain was carried out by the electric pulse method described in Example 11. The pulse conditions are as follows: the capacitance is 25 F, the resistance is 0.000 ohm, the voltage is Or 6.25 KV / cm.
株 に よ っ て頻度の 差 は認 め ら れた も の の い ずれの 株で も シ ク ロ へ キ シ ミ ト 耐性 コ ロ ニ ー が得 ら れた。  Cycloheximito-resistant colonies were obtained in all strains, although differences in frequency were observed among the strains.
の う ち そ れぞれ 2 株ずつ に つ い て基質で あ る ス タ ー チ が入 っ た プ レ ー ト （ 3 % S o l u b l e s t a r c h ( K a t a y a m a ) 2 % p 01 y p e p t 0 n e 、 1 % Y e a s t e x t r a c t、 3 . 3 x 1 0 ~ 3 % B r 0 m 0 c r e s 0 1 p u r p 1 eヽ 2 % B a c t o a g a r ) 上 で グル コ ア ミ ラ ー ゼ活性を調べ た。 そ の結果、 3 種 の 株 由来の 形質転換体すべて に つ い て分泌 さ れた ダル コ ア ミ ゼに よ る ハ ロ ー が観察 さ れ、 遗伝子の発現が確認 さ れた 。 ま た、 A f 1 1 1消化 し た プ ラ ス ミ ド p C L S T A 1 を用 い て A T C C 9 9 5 0 株を形質転換 し た。 こ の形 質転換体 に つ い て、 L 4 1 遺伝子座 に組み込 ま れ た グル コ ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子の 発現 も 調べた と こ ろ 、 同様 に ハ ロ 一 の形成が確認 さ れ た。 For each of the two strains, a plate containing the substrate start (3% Solublestarch (Katayama)) 2% p 01 ypept 0 ne, 1% Y eastextract, 3. it was examined 3 x 1 0 ~ 3% B r 0 m 0 cres 0 1 purp 1 eヽ2% B actoagar) on at guru core Mi la chromatography peptidase activity. As a result, in all transformants derived from the three strains, halo due to secreted darco amidase was observed, and the expression of the gene was confirmed. The ATCC 9950 strain was transformed using the plasmid pCLSTA1 digested with Af111. When the expression of the glucoamylase gene integrated into the L41 locus was examined for this transformant, the formation of halo was also confirmed. Was.
さ ら に こ れ ら 形質転換体 の グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ活性を測 定 し た。 こ の た め 、 菌体を Y P D 液体培地で一晚培養 し て .、 そ の 上清を 粗酵素液 と し た。 反応 は、 4 0 0 1 の 粗酵素液 と 、 0 . 5 % の 可溶性 で ん ぷ ん 、 l O O m M酢 酸ナ ト リ ウ ム ( H 5 . 0 ) を 含む 5 0 0 1 の 反応液 で、 5 0 。C 、 2 0 分間行 つ た 。 反応後 1 0 0 °C 、 5 分間 の 熱処理で酵素を失活 し た 後、 遊離 し た グ ル コ ー ス 濃度 を市販の キ ッ ト （ グ ノレ コ ー ス B -テ ス ト （和光純薬） ） を 用 い て測定 し た。 グル コ ア ミ ラ ー ゼ活性 は 当反応条件下で遊離す る グ ル コ ー ス の量力く 1 0 0 μ g で あ る 時、 そ の 活性を 1 ュニ ッ ト と し 表 し た。 培養上清 l m l あ た り の 活性値 は表 3 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 表 3：プラスミ ド p CL STA 1および p C LR STA 1によって形質 In addition, the glucoamylase activity of these transformants was measured. For this purpose, the cells were cultured once in a YPD liquid medium, and the supernatant was used as a crude enzyme solution. The reaction was carried out using a crude enzyme solution of 401 and a reaction solution of 501 containing 0.5% of soluble starch and 100 mM sodium acetate (H5.0). At 50. C, 20 minutes. After the reaction, the enzyme was inactivated by heat treatment at 100 ° C for 5 minutes, and the concentration of released glucose was measured using a commercially available kit (Gnorecoose B-Test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). )). The glucoamylase activity was expressed as 1 unit when the amount of glucose released under the reaction conditions was as high as 100 μg. The activity values per ml of the culture supernatant were as shown in Table 3. Table 3: Characterized by plasmids p CL STA 1 and p C LR STA 1
転換されたキヤンディダ ·ュティリス酵母のグルコアミラーゼ活性 ダルコアミラーゼ活性 (units/ml)  Glucoamylase activity of transformed Candida utilis yeast Dalcoamylase activity (units / ml)
プラスミ ド ATCC9256 ATCC9266 ATCC9950 p CLRSTA1 (B g 1 II) 1. 3 7. 9 8. 3 p CLRSTA1 (B 1 II) 0. 5 6. 6 8. 5 p CL STA1 (A f 1 II) 7. 6 p CL STA1 (A f I II) 8. 8  Plasmid ATCC9256 ATCC9266 ATCC9950 p CLRSTA1 (B g 1 II) 1.3 7.97 8.3 p CLRSTA1 (B 1 II) 0.5 6.6.6 8.5 p CL STA1 (A f 1 II) 7.6 p CL STA1 (A f I II) 8.8
-DNA 0. 0 0. 0 0. 0 活性はそれぞれ した形難換体 2株につ Lヽて測定した c -DNA 0. 0 0. 0 0. 0 activity was determined in the form flame recombinants 2 strains respectively One Te Lヽc
―：測定せず こ の 結果か ら 、 調べ た キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 株、 A T C C 9 2 2 6 株、 お よ び  ―: Not measured. Based on the results, the examined Canadian dusty strains ATC C950, ATC C922, and ATC C922.
A T C C 9 2 5 6 株 に お い て、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス ' デ ィ ァ ス タ テ ィ カ ス 由 来の 異種蛋 白 質で あ る グ ル コ ア ミ ラ ー ゼの 分泌 シ グナ ル配列 が認識 さ れ、 ダ ル コ ア ミ ラ ー ゼが 培地 中 に 分泌 さ れ る こ と が明 ら か に さ れ た。 さ ら に 、 B 1 1 1消化 し た プ ラ ス ミ ド、 p C L S T A 1 ま た は A f 1 I 1'消化 し た ブ ラ ス ミ ド p C L S T A 1 で形 質転換 し た A T C C 9 9 5 0 株を そ れぞれ 2 株ずつ 4 0 β g Z m 1 の シ ク ロ へキ シ ミ ド、 と 5 % グ ル コ ー ス を含む Y P D 液体培地で 3 0 0C 4 日 間培養 し た。 そ の後、 そ れ ら の 菌体培養液 1 0 1 を 4 - 2 0 % S D S ポ リ ァ ク リ ル ァ ミ ド ゲ ル電気泳動 に 供 し 、 培養液中の 蛋 白 質を分析 し た （図 2 4 ) 。 ゲル は ク マ シ一 ブ リ リ ァ ン ト ブル一に よ り 染色 し た o ^ i 、 対照 と し て B g i l l消化 し た ブ ラ ス ミ ド p C L R E 2 で形質転換 し た 株の培養液を分析 し た （ レ ー ン 1 ：) 。 そ の π ¾、 い ずれの 培養液 に お い て も グ ル コ ァ ミ ラ 一ゼ に相 当 す る 約 1 0 0 k D a の 蛋 白 質が 認め ら れ、 蛋 白 量 は、 染色 さ れ た バ ン ド の 濃 さ か ら 約 2 〜 5 g に相 当 す る と 判断 さ れた。 こ の こ と か ら 、 グル コ ァ ミ ラ ー ゼ遺伝子が高 い レ ベ ル で発現 し 、 培養液中 に 分泌 さ れた こ と が示 さ れた。 以上の ネロ ヽ ら 、 分泌蛋 白 質生産用 の 好適 な宿主 べ ク 夕 一 系 と し てキ ャ ン デ ィ ダ • i テ ィ リ ス が使用 で さ る こ と が明 ら か と な つ た ο In the ATCC 9256 strain, the secretion of glycocoamylase, a heterologous protein derived from Saccharomyces' Diastaticus. The Gnal sequence was recognized, and it was revealed that Dalcoamylase was secreted into the medium. In addition, ATCC 995 transformed with B111-digested plasmid, pCLSTA1 or Af1I1'-digested plasmid pCLSTA1 0 shares by their respective two strains 4 0 β g Z m 1 of shea click b to key sheet mi de, and then cultured for 3 0 0 C 4 days in YPD liquid medium containing 5% grayed Le courses Was. Thereafter, the cell culture solution 101 was subjected to 4-20% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the protein in the culture solution was analyzed. (Figure 24). The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue o ^ i, and as a control, a culture of a strain transformed with B gill-digested plasmid pCLRE2. Was analyzed (lane 1 :). In each of the cultures at π¾, a protein of about 100 kDa, which is equivalent to glycosamylase, was observed, and the amount of protein was determined by staining. It was determined to be equivalent to about 2 to 5 g based on the density of the band. This indicated that the glucoamylase gene was expressed at a high level and was secreted into the culture broth. From the above, it has been clarified that Candida iris can be used as a suitable host system for secretory protein production. Was ο
実施例 1 8 ： キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス で の 異種遺伝子 ( 1 a c Z 遺伝子） の 発現  Example 18: Expression of a heterologous gene (1 acZ gene) in Candida utilis
( 1 ) 1 a c Z 遺伝子発現用 ブ ラ ス ミ ド の 構築  (1) Construction of a bacmid for expression of 1acZ gene
1 a c Z 遺伝子発現用 ブ ラ ス ミ ド を 図 2 5 に 示 さ れ る よ う に構築 し た。  A bacmid for expression of the 1acZ gene was constructed as shown in Figure 25.
ま ず、 プ ラ ス ミ ド P M C 1 8 7 1 ( P h a r m a c i a ) よ り 9 ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ を コ ー ド す る 1 a c Z 遺伝子を 3 . l k b の B' a m H I 断片 と し て切 り 出 し た 。 こ の 断 片 を 、 プ ラ ス ミ ド Y E p l 3 K ( S 0 n e e t. a 1. Ap p 1. Envi ron. Mi c robi o l. 54, 38 - 42 ( 1988 ) ) の B 1 I Iサ ィ ト に 連結 し 、 遺伝子 の 5' 側 に H i n d I I I サ イ ト の ぁ る プ ラ ス ミ ド p Z 4 を 選択 し た 。 First, from the PMID PMC 1871 (Pharmacia) The 1acZ gene encoding 9 galactosidase was cut out as a 3.1 kb B'amHI fragment. This fragment was transformed with B1 II of plasmid YE pl3K (S0neet.a 1.App 1.Environ.Microbiol. 54, 38-42 (1988)). The plasmid was ligated to the site, and the plasmid pZ4 of HindIII site was selected on the 5 'side of the gene.
こ の プ ラ ス ミ ド カ、 ら 開始 コ ド ン ATG を 有す る 1 a c Z 遺伝子 を 、 3 . l k b の H i n d l l l — X h o l 断片 と し て切 り 出 し た 。 こ の 断片 を 、 pB lues cr i p t SK- の H i n d l l l と X h o l サ イ ト 間 に 連結 し て、 プ ラ ス ミ ド p L A C Z l を構築 し た 。  From this plasmid, the 1acZ gene having the initiation codon ATG was cut out as a 3.lkb Hindlll—Xhol fragment. This fragment was ligated between Hindlll and Xhol site of pBluescriptSK- to construct a plasmid pLACZl.
こ の プ ラ ス ミ ド を H i n d l l l + X b a I 消 化 し 、 ク レ ノ ウ 処理 し た 後、 再環状化 し て プ ラ ス ミ ド p L A C Z 2 を構築 し た 。  This plasmid was digested with Hindlll + XbaI, treated with Klenow, and recircularized to construct a plasmid pLACZ2.
さ ら に 、 こ の プ ラ ス ミ ド か ら l a c Z 遺伝子 を 3 . 1 k b の X b a l — K p n l 断片 と し て切 り 出 し 、 こ れ を プ ラ ス ミ ド p P G K P T 5 ( 図 4 ) の X b a I と K p n I '間 に 連結 し て 、 プ ラ ス ミ ド p G K L A C l を 構築 し た さ ら に p G K L A C 1 力、 ら P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー と 、 l a c Z 遺伝子 と 、 さ ら に P G K遺伝子 タ ー ミ ネ 一 タ ー と を 含む 5 . 4 k b の N o t I 断片 を 切 り 出 し 、 こ れ を プ ラ ス ミ ド P C L B S 1 2 の N o t I サ イ ト に 挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド p C L L A C l を 、 ま た プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 の N o t I サ イ ト に 挿入 し て プ ラ ス ミ ド p C L R L A C 1 を、 そ れぞれ構築 し た。 Furthermore, the lacZ gene was excised from this plasmid as a 3.1 kb Xbal-Kpnl fragment, and this was excised from the plasmid pPGKPT5 (Fig. 4). ), The plasmid pGKLACl was constructed, the pGKLAC1 power, the PGK gene promoter, and the lacZ gene were constructed. And a 5.4 kb NotI fragment containing the PGK gene terminator and the NotI site of the plasmid PCLBS12. And insert the plasmid pCLLACl into the NotI site of the plasmid pCLRE4 and insert the plasmid pCLLACl. LRLAC 1 was constructed for each.
( 2 ) キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 形質転換 と ^ ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ活性確認  (2) Transformation of Candida utilis and confirmation of ^ galactosidase activity
B g l H消化 し た プ ラ ス ミ ド p C L R L A C l 、 ま た は A f 1 1 肖化 し た プ ラ ス ミ ド p C L L A C 1 を用 い て 実施例 1 1 記載の電気パ ル ス 法 に よ り A T C C 9 9 5 0 株を形質転換 し た。 形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株 そ れぞれ 2 株を、 5 m l の Y P D 液体培地で 6 時間、 対 数増殖期 （ 0 D  B gl H-digested plasmid pCLRLAC1 or Af11-modified plasmid pCLLAC1 was used for the electric pulse method described in Example 11. The ATCC 9950 strain was further transformed. Two strains of the transformed ATCC 9950 strain were placed in 5 ml of YPD liquid medium for 6 hours in the logarithmic growth phase (0D
600 が約 2 力、 ら 3 ) ま で培養 し た。 β a ラ ク ト シ ダ ー ゼ活性 は M e t h 0 d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a b o r a t o r y C o u r s e Ma nu a l - Ro s e M. D e t a 1. P 155 - 159 Co l d Sp r i n g H r b o r L a b o r a t o r y P r e s s NY (1990) に記載の方法 に従 っ て測定 し た。 す な わ ち 、 集菌 し た菌 体を 1 m 1 の Z バ ッ フ ァ ー に 懸濁 し た後、 ク ロ 口 ホ ル ム 液を 3 滴、 0 . 1 % S D S を 2 滴加 え て、 1 0 秒 ボルテ ッ ク ス し た。 2 8 °C で 5 分間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た後、 0 . 2 m l の O N P G 液を加 え、 さ ら に 1 0 分間 イ ン キ ュ 'ベ ー ト し た。 そ の 後、 0 . 5 m l の N a 2 C 〇 3 液を 添加 し て反応を停止 し た。 O D 420 を 測定 し た後、 計算 式 に 従 っ て yS ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ活性を求め た。 ^ ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ活性 は 2 8 °C で 1 分あ た り 1 n m 0 1 の オ ル ト ニ ト ロ フ エ ノ ー ル を生成す る 活性 を 1 ュニ ッ ト と し た 得 ら れ た 菌体 1 0 D 6 Q () 当 た り の 活性値 は表 4 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 表 4 :プラスミ ド p C L LA C lおよび p CLRLAC lによって 形 換さ lた ATCC9950株の^一ガラクトシダーゼ活性 β— ϋラクトシダーゼ活性 600 were cultured to about 2 strengths and 3). β a lactosidase activity is M eth 0 dsin Y east Genetics-A laboratory C ourse Manu al-Rose M. D eta 1.P 155-159 Cold Spring H rbor Laboratory Press It was measured according to the method described in NY (1990). That is, after suspending the collected cells in a 1-m1 Z-buffer, add 3 drops of the mouth opening solution and 2 drops of 0.1% SDS. And vortexed for 10 seconds. After incubating at 28 ° C for 5 minutes, 0.2 ml of ONPG solution was added, followed by incubation for another 10 minutes. Later, 0. The 5 ml of N a 2 C 〇 3 solution was stopped and the reaction added. After measuring OD420, the yS galactosidase activity was determined according to a calculation formula. ^ Galactosidase activity at 28 ° C per minute is defined as the activity to produce 1 nm 01 of ortho-nitrile phenol per minute. The activity value per 10 D6Q () of the obtained bacterial cells was as shown in Table 4. Table 4: ^ -Galactosidase activity of ATCC9950 strain transformed with plasmids pCLLACl and pCLRLACl β-ϋlactosidase activity
プラスミ ド (units /OD 600 )  Plasmid (units / OD 600)
p CLLAC l (A f 1 II) 6. 4  p CLLAC l (A f 1 II) 6.4
p CLLAC l (A f I II) 6. 7  p CLLAC l (A f I II) 6.7
p CLRLAC l (B g 1 II) 6. 8  p CLRLAC l (B g 1 II) 6.8
pCLRLAC l (B g 111) 7. 0  pCLRLAC l (B g 111) 7.0
-DNA 0. 1 そ の結果、 プ ラ ス ミ ド p C L R L A C 1 お よ び プ ラ ス ミ ド、 p C L L A C 1 の い ずれで形質転換 さ れた A T C C 9 9 5 0 株 も そ れぞれ活性を示 し 、 大腸菌 由 来の  -DNA 0.1 As a result, the plasmid pCLRLAC1 and the ATCC 9950 strain transformed with both plasmid and pCLLAC1 were also active. Indicates that E. coli originated
1 a c Z 遺伝子が キ ャ ン デ ィ ダュ テ ィ リ ス で発現 し て、 活性の あ る ） S ガ ラ ク 卜 シ ダ一ゼが生産 さ れ る こ と が示 さ れ た。 キ ャ ン デ イ ダ · マ ル ト ー サゃ ァ ゾレ ビ カ ン ス な ど― 部め キ ヤ ン デ ィ ダ属酵母で は 、 ロ イ シ ン コ ド ン の C U G が セ リ ン に 翻訳 さ れ る た め ( 0 h a m a e t . a 1. Nu c l e i c A c i d s It was shown that the 1 ac Z gene was expressed in Candida utilis and that active (active) S-galactosidase was produced. Candida maltozoa zorevicens, etc.- In yeasts belonging to the genus Candida, the CUG of roysin codon is added to serine. To be translated (0 hamaet. A 1. Nucleic A cids
R e s. 21 039 - 045 1993 ) 、 大腸菌 由来 1 a c Z 遺伝 子が、 活性を も つ ガ ラ ク ト シ ダ一ゼ に 翻訳 さ れな い こ と が知 ら れて い る ( S u g i y a m a e t . a 1. Y e a s t 11, 3 -52 ( 1995 ) ) 。 本実施例で は 、 キ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス で 活性の あ る 入 菌 S ガ ラ ク ト シ ダ一ゼが生産 さ れ る こ と が明 ら か に さ れ、 ま た実施例 1 7 で示 し た よ う に ダ ル コ ァ ミ ラ ー ゼが 生産 さ れ る こ と か ら も 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス が異種遣伝子発現用 の 宿主 と し て使用 で き る こ と が示 さ れた と % O o Res. 21 039-045 1993), it is known that the 1 acZ gene from E. coli is not translated into an active galactosidase (Sugiyamaet). a 1. Yeast 11, 3 -52 (1995)). In this example, it is assumed that an active inoculum S-galactosidase is produced in a candidate utility. Candidacy and production of dalcolamellar as shown in Example 17 also indicates the need for candidacy. % O o has been shown to be useful as a host for heterologous gene expression.
実施例 1 9 ： キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で の異種遺伝 子 （ A P T遺伝子 ) の 発現  Example 19: Expression of heterologous gene (APT gene) in Candida dutilis
( 1 ) A P T遗伝子発現用 プ ラ ス ミ ド の構築  (1) Construction of APT P gene expression plasmid
A P T遺伝子発現用 プ ラ ス ミ ド を 図 2 6 に 示 さ れ る よ う に構築 し た。  A plasmid for APT gene expression was constructed as shown in Figure 26.
ま ず、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン T n 9 0 3 由 来の ア ミ ノ グ リ コ シ ド フ ォ ス フ ォ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ （ A P T遺伝子） を 含む プ ラ ス ミ ド p U C 4 K ( Pharma c i a ) か ら 1 . 1 k b の X h 0 I - P s t l 断片を切 り 出 し 、 こ れを P U C 1 9 の S a 1 I と P s t I 間 に挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド p A P H 1 を構築 し た。  First, a transposon Tn903, a plasmid containing the aminoglycoside phosphotransferase (APT gene) derived from A 1.1 kb Xh0I-Pstl fragment was excised from pUC4K (Pharmacia) and inserted between Sac1I and PstI of PUC19. The plasmid pAPH1 was constructed.
続 い て p A P H 1 を P s t I 消化 し た後、 T 4 D N A ポ リ メ ラ ー ゼ に よ り 平滑末端 と し 、 B g l l l リ ン カ 一 (5' CAGATCTG3' ) を挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド p A P H 2 を構 築 し た。  Subsequently, pAPH1 is digested with PstI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and Bglll linker (5 'CAGATCTG3') is inserted. Lasmid p APH 2 was constructed.
さ ら に 、 p A P H 2 よ り A P T遺伝子を 1 . l k b の X b a I - B g 1 11断片 と し て切 り 出 し 、 こ れを 発現べ ク タ 一 p P G K P T 4 (図 4 ) の X b a l と B a m H I サ イ ト 間 に 挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド p G K A P H l を構築 し た。 05 — Furthermore, the APT gene was excised from pAPH2 as a 1.1 kb XbaI-Bg111 fragment, and this fragment was expressed in the X vector of pPGKPT4 (Fig. 4). A plasmid pGKAPHl was constructed by inserting it between the bal and BamHI sites. 05 —
さ ら に p G K A P H l か ら P G K 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー と 、 A P T 遺伝'子、 そ し て P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 と を含む 3 . 3 k b の N o t I 断片 を切 り 出 し 、 こ れを プ ラ ス ミ ド p C L B S 1 2 の N o t I サ イ ト に 挿入 し て プ ラ ス ミ ド p C L A P H l を 、 ま た プ ラ ス ミ ド p C L R E 4 の N o t I サ イ ト に挿入 し て プ ラ ス ミ ド p C L R A P H I を、 そ れぞれ構築 し た。 Furthermore, a 3.3 kb Not I fragment containing the PGK gene promoter, the APT gene and the PGK gene terminator was cut from pGKAPHl. And insert it into the NotI site of the plasmid pCLBS12 to insert the plasmid pCLAPHl and the NotI of the plasmid pCLRE4. Plasmids p CLRAPHI were constructed by inserting them into the site, respectively.
( 2 ) キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 形質転換 と G 4 1 8 耐性の 確認  (2) Transformation of Candida utilis and confirmation of G418 resistance
B 1 11消化 し た プ ラ ス ミ ド p C L R A P H l を用 い て、 A T C C 9 9 5 0 株、 A T C C 9 2 2 6 株、 お よ び A T C C 9 2 5 6 株の 形質転換を試み た。 形質転換 は実 施例 1 1 記載の電気パ ル ス 法で行 っ た。 パ ル ス 条件 は電 気容量を 2 5 / F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧を 3 . 7 5 K V ノ c m、 ま た は 6 . 2 5 K V Z c m と し て 行 っ た。  Using the B111-digested plasmid pCLRAPHl, transformation of the ATCC 950, ATCC 922, and ATCC 926 strains was attempted. Transformation was performed by the electric pulse method described in Example 11. The pulse conditions were as follows: electric capacity of 25 / F, resistance of 100 ohms, and voltage of 3.75 KV / cm or 6.25 KVZ cm. .
そ の結果、 株 に よ っ て頻度の 差 は認め ら れ た も の の い ずれの株で も シ ク 口 へ キ シ ミ ド耐性 コ ロ ニ ー が得 ら れた こ の う ち そ れぞれ 2 株ずつ に つ い て、 異な る 濃度の G 4 1 8 を含む Y P D プ レ ー ト 上で菌 の 増殖を調べ た。 そ の 結果、 3 種の キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 株すべて に つ い て形質転換体の 増殖が確認 さ れ、 こ れ ら の 形質転換体 に お い て A P T 遺伝子が発現 し た こ と が確認 さ れた。  As a result, although the frequency difference was observed depending on the strains, it was found that all the strains obtained kissimid-resistant colonies in the mouth. The growth of each two strains was examined on YPD plates containing different concentrations of G418. As a result, the growth of the transformants was confirmed in all three types of Candida utilis strains, and the APT gene was expressed in these transformants. This was confirmed.
ま た、 A f 1 1 I消化 し た プ ラ ス ミ ド p C L A P H 1 を 用 い て A T C C 9 9 5 0 株を形質転換 し 、 L 4 1 遣伝子 座 に組み込 ま れた遺伝子の 発現 に つ い て も 調べた。 そ の 糸 α ι¾ 、 同様 に 形質転換体の増殖が確認 さ れ、 L 4 1 遺伝 子座 に 組み込 ま れた A P T 遺伝子 に つ い て も そ の 発現が 確認 さ れた。 Furthermore, the plasmid pCLAPH1 digested with Af11I was Transformation of the ATCC 9950 strain was performed and the expression of the gene integrated into the L41 gene locus was also examined. Proliferation of the transformant was confirmed in the same manner as in the α αι¾, and expression of the APT gene integrated into the L41 gene locus was also confirmed.
( 3 ) 組み込 ま れた ブ ラ ス ミ ド の 安疋性  (3) Easiness of embedded brassmid
B g 1 1 1消化 さ れた ブ ラ ス ミ ド P C L R A P 、 ま た は A f 1 i 1消化 さ れた プ ラ ス ミ ド p C L A P H 1 で形 質転換 さ れ た A T C C 9 9 5 0 株、 そ れぞれ 2 株ずつ に つ い て、 組み込 ま れた ブ ラ ス ミ ド D N A の安定性を次の よ う に調べ た。 ま ず、 形質転換体 4 0 β g / m 1 の シ ク ロ へ キ シ ミ ド を含む 5 m 1 の Y P D 液体培地で定常期 ま で培養 し 、 こ の と き の世代数を 0 と し た。 次 に 、 こ の う ち 5 1 ¾: 5 m 1 の Y P D 液体培地 に 植菌 し て定常期 ま で培養 し 、 こ の と き の世代数を 1 0 と 計算 し た。 こ の 操作を繰 り 返 し て 2 0 世代 ま で菌 を培養 し た。 プ ラ ス ミ ド保持率 は、 菌液を希釈後、 Y P D プ レ ー ト と 4 0 μ g Z m 1の シ ク 口 へ キ シ ミ ト を 含む Y P D プ レ ー ト と に そ れ ぞれ塗布 し て、 3 0 °C で 2 曰 培養後、 生 じ た コ ロ ニ ー数 調べ た。  Bg111 digested plasmid PCLRAP, or Af11i1 digested plasmid pCLAPH1, transformed ATCC 9950 strain, The stability of the integrated plasmid DNA was examined as follows for each of the two strains. First, the transformant was cultured in a 5 ml YPD liquid medium containing 40 β g / m 1 cycloheximide until stationary phase, and the number of generations was set to 0 at this time. Was. Then, the cells were inoculated into a liquid culture medium of YPD of 5% to 5%, and cultured until the stationary phase, and the number of generations at this time was calculated to be 10. This operation was repeated to culture the bacteria up to the 20th generation. After the bacterial solution was diluted, the retention rate of plasmid was determined for each of the YPD plate and the YPD plate containing kissmite in the 40 μg Zm1 After application, the cells were cultured at 30 ° C for 2 hours, and the number of colonies produced was examined.
口 ：¾c は 表 5 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 07 — Mouth: ¾c was as shown in Table 5 07 —
表 5 : ATC C 9950染色体に組み込まれたプラスミ ド Table 5: Plasmid integrated into ATC C 9950 chromosome
DN Aの安定性 プラスミ ド 保持率 （％) p CLRAPHl (B g 1 II) 91. 3 p CLRAPH l (B g l ll) 87. 8 p C L A P H 1 (A f 111) 99. 5 p CLAPH l (A f I II) 98. 6 こ の 結果か ら 、 r R N A遺伝子座、 L 4 1 遣伝子座 に 挿入 さ れ た D N A 断片 は安定で あ る こ と が確認 さ れた。  Stability of DNA Plasmid Retention (%) p CLRAPHl (B g 1 II) 91.3 p CLRAPH l (B gl ll) 87.8 p CLAPH 1 (A f 111) 99.5 p CLAPH l (A f I II) 98.6 From these results, it was confirmed that the DNA fragment inserted into the rRNA locus and the L41 gene locus was stable.
実施例 2 0 ： G 4 1 8 耐性を選択マ ー カ ー と し た キ ヤ ン デ イ ダ * ュ テ ィ リ ス形質転換体の取得  Example 20: Obtaining Candida ducutilis transformant using G418 resistance as a selection marker
プ ラ ス ミ ド p C L R A P H l は、 形質転換体選択マ ー カ ー と し て シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性を付与す る 変異型 L 4 1 遺伝子 と 、 G 4 1 8 耐性を付与す る A P T遣伝子 を含ん で い る 。 実施例 1 9 に記載 し た実験 に よ り A P T 遺'伝子が P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー に よ り 発現す る こ と が確認 さ れ た の で、 形質転換体の G 4 1 8 耐性 に よ る 直 接選択を試み た。  Plasmid p CLRAPHl is a mutant L41 gene that confers oximid resistance to cyclo as a transformant selection marker, and confers G418 resistance. Includes an APT message. The experiment described in Example 19 confirmed that the APT gene was expressed by the PGK gene promoter. An attempt was made to make a direct selection based on tolerance.
ま ず、 プ ラ ス ミ ド p C L R A P H l を B g l l lに よ り 消ィヒ し 、 直鎖状 に し た。 こ れ を用 い て、 実施例 1 1 記載 の電気パ ル ス 法 に よ っ て、 A T C C 9 9 5 0 株を形質転 換 し た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 ^ F 、 抵抗値を 08 - First, the plasmid pCLRAPHl was eliminated with Bglll to make it linear. Using this, the ATCC 9950 strain was transformed by the electric pulse method described in Example 11. The pulse condition is that the capacitance is 25 ^ F and the resistance is 08-
1 0 0 0 オ ー ム 、 ま た は 8 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V / c m と し て行 つ.た 。 菌体 は 1 M ソ ル ビ ト ー ル を 含 む Y P D 培地で 6 時 間培養 し た 後、 4 0 / g / m 1 の シ ク 口 へ キ シ ミ ド を 含む Y P D プ レ ー ト と 、 1 5 0 i/ g Z m 1 の G 4 1 8 を 含む Y P D プ レ ー ト と に そ れ ぞ れ塗布 し た 。 The test was performed at 100 ohms or 800 ohms with a voltage of 5 KV / cm. After culturing the cells for 6 hours in a YPD medium containing 1 M sorbitol, a YPD plate containing kissimid is added to a 40 / g / m1 cycle mouth. Each of them was applied to a YPD plate containing G 418 of 150 i / g Z m 1, respectively.
結果 は 表 6 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た 。  The results were as shown in Table 6.
表 6 ：プラスミ ド pCLRAPHlによる ATCC 9950形 «¾換体の  Table 6: Transformation of ATCC 9950 with plasmid pCLRAPHl
異なる薬剤耐性マ一力一による選択  Selection by different drug resistance
G418 シクロへキシミ ド プラスミ ド 1000 Ω 800 Ω 1000 Ω 800 Ω p CLRAPH1 (B g 111) 100 111 7 18 G418 Cycloheximid Plasmid 1000 Ω 800 Ω 1000 Ω 800 Ω p CLRAPH1 (B g111) 100 111 7 18
-DNA 0 一 0 一  -DNA 0 1 0 1
*DNA0. 1 g当たりの形 «¾換^： * DNA0. Form per 1 g «¾Exchange ^:
* G 418およびシク口へキシミ ドの濃度はそれぞれ 150 g/m 1 および 40 β g/m 1とした  * Concentrations of G 418 and silk heximide were 150 g / m1 and 40 βg / m1, respectively.
一：測定せず こ の 結果 よ り 、 G 4 1 8 耐性 で選択 さ れ る コ ロ ニ ー の 数 力《 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性 コ ロ ニ ー 数 に 比較 し て 1 0 倍 程度多 い こ と が分 か る 。  1: No measurement. Based on this result, the number of colonies selected for G4 18 resistance is 10 times that of the number of colonies resistant to cycloheximide. You can see that there are many.
G 4 1 8 耐性 で選択 し た 4 個 の コ ロ ニ ー と 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性で選択 し た 4 個 の コ ロ ニ ー と に つ い て、 染 色体 D N A を ^製 し た。 調製 し た D N A は B g 1 11 + N p G 4 18 4 clones selected for resistance and Chromosomal DNA was produced from four colonies selected for xymid resistance. The prepared DNA was Bg111 + Np
0 t I に よ り 消化 し た後、 32 1S¾ SB¾ し た L 4 1 遣伝子 を含む 1 . 8 k b の B a m H I 一 H i n d i l l 断片 （図 1 2 ) を プ ロ 一 ブ と し て、 サ ザ ン 解析を行 っ た (図 2 7 ) 。 そ の結果、 内在性 L 4 1 遺伝子 に 由来す る 5 . 4 k b の バ ン ド の ほ か に 、 プ ラ ス ミ ド に 由来す る 4 . 4 k b の バ ン ドが認め ら れ た。 ィ メ ー ジ ン グ ア ナ ラ イ ザ - B A S 2 0 0 0 ( FU J I F I LM ) を用 い て バ ン ドの 強度を測定 し 、 プ ラ ス ミ ド 由来の パ' ン ド と 内在性 L 4 1 遣伝子 ( 2 3 ピ 一 / / & TO胞） の バ ン ド の 比較か ら 、 組み込 ま れた プ ラ ス ミ ド の コ ピ ー数を求め た。 そ の ネロ 、 シ ク 口 へ キ シ ミ ド耐 性で選択 さ れた株で は プ ラ ス ミ ド、が 4 ( レ ー ン 2 ) か ら After digestion with 0 tI, a 1.8 kb BamHI-Hindill fragment (Fig. 12) containing the 321S-SB-modified L41 gene was used as a probe. A southern analysis was performed (Fig. 27). As a result, in addition to the 5.4 kb band derived from the endogenous L41 gene, a 4.4 kb band derived from plasmid was observed. Using a imaging analyzer-BAS 2000 (FU JIFI LM), the band intensity was measured, and the plasmid-derived band and endogenous L were measured. From the comparison of the bands of the 41 gene (23 cells // & TO cells), the number of copies of the incorporated plasmid was determined. In strains selected for their Nero and Shikiguchi kissmid resistance, the plasmid is from 4 (lane 2).
7 3 ピ一 （ レ ー ン 5 ) 存在す る こ と が示 さ れた。 —方、 G 4 1 8 耐性で選択 し た株で は 4 株 と も コ ピ ー数が 1 ( レ一 ン 6 - 9 ) で あ る と 計算 さ れた。 こ の 結果 よ り 、 変異型 L 4 1 遺伝子を選択マ一 力 一 と し て形質 κ換体 ¾: m す る こ と に よ っ て形質転換の頻度 は低 く な る も の の 、 プ ラ ス ミ ドが複数個組み込 ま れ た株を容易 に取得で き る こ と が示 さ れ た 7 3 peak (lane 5) was shown to be present. On the other hand, it was calculated that the number of copies of all the four strains selected for G418 resistance was 1 (lane 6-9). The results show that although the frequency of transformation is reduced by using the mutant L41 gene as a selection tool, the frequency of transformation is reduced, It was shown that strains with multiple integrated smids could be easily obtained
ま た、 P G K A P H 1 を N 0 t I 消化 し て、 二つ の 断 片 に 分 け た。 す な わ ち 、 P G K 遺伝子 プ ロ モ - タ 一、  In addition, PGKAPH1 was digested with N0tI and divided into two fragments. That is, the PGK gene promoter,
A P T 遺伝子、 お よ び P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ 一 タ ー を 含 、断 n と 、 べ ク タ ー 断片 と に 分 け た。 そ の 後、 こ れ ら を A T C C 9 9 5 0 株の形質転換 に 用 い た。 パ ル ス 条件 は 電気容量を 2 5 β F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧 をThe fragment containing the APT gene and the PGK gene terminator was divided into a fragment n and a vector fragment. After that, these It was used for transformation of ATCC 9950 strain. The pulse condition is that the capacitance is 25 βF, the resistance is 100 ohms, and the voltage is
5 K V / c m と し て行 つ た。 2 0 0 g Z m l の 5 KV / cm. 2 0 0 g Z m l
G 4 1 8 を含む Y P D プ レ ー 卜 で形質転換体を選択 し た と こ ろ 、 1 β g D N A あ た り 1 5 6 個 の形質転換体が得 ら れた の結果 は、 キ ヤ ン デ イ ダ . ュ テ ィ リ ス酵母 に お い て は、 B g 1 1 1消化 に よ り 直鎖状 に し た プ ラ ス ミ ド When the transformants were selected on the YPD plate containing G418, 156 transformants per 1βg DNA were obtained. In Dietirius yeast, a plasmid that has been linearized by digestion with Bg111
P c L R A P H I に よ る 遺伝子挿入型 の形質転換 に加え 遺伝子置換型の形質転換 も 起 き る こ と を 示す。 ま た、 そ の形質転換頻度 も 比較的高 く 、 遺伝子置換型の形質転換 も 効率良 く 起 き る こ と が明 ら か に さ れた。 This shows that, in addition to the gene insertion type transformation by PcLRAPHI, the gene replacement type transformation may also occur. In addition, the transformation frequency was relatively high, and it was revealed that gene-replacement-type transformation can be performed efficiently.
実施例 2 1 ： P G K 遣伝子プ ロ モ ー タ ー の短縮化 と 最小 義 領域の 同定 Example 21: Shortening of PGK gene promoter and identification of minimum meaning region
実施例 1 7 - 2 0 で使用 し た P G K 遺伝子プ ロ モ ー タ 一を短縮化 し 、 プ 口 モ ー 夕 一 の 最小機能領域の 同定を試 み た  Example 17 The PGK gene promoter used in 7-20 was shortened, and the identification of the minimum functional region of the mouse was attempted.
実施例 1 9 記載の ブ ラ ス ミ ド p G K A P H l の P G K 遗' 子 プ ロ モ ー タ ー 断片内 部 に 存在す る 制限酵素サ イ ト を利用 し て、 長 さ の 異な る P G K 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー と Using the restriction enzyme site present in the PGK 遗 'promoter promoter fragment of the plasmid pGKAPHl described in Example 19, PGK gene templates having different lengths were used. With the motor
A P T 遺伝子、 さ ら に P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 と を 含む 断片を 5 種類取得 し た。 す な わ ち p G K A P H l をFive types of fragments containing the APT gene and the PGK gene terminator were obtained. That is, p G K A P H l
N 0 t I 、 S a c I 、 E c o R I + S a c I 、 ま た はN0tI, SacI, EcoRI + SacI, or
P s t I + S a c I 消化 し て 4 種類の 断片を得た。 ま たPstI + SacI digestion yielded four types of fragments. Also
P G K A P H 1 を S p h I 消ィ匕 し て 力、 ら T 4 D N A p o l y m e r a s e 処理 に よ っ て平滑末端 と し 、 さ ら に B a m H I リ' ン カ ー （ 5 ' C C G G A T C C G G 3 ' ： 配列番号 ： 2 2 ) を付加 し た後、 B a m H I と N o t I 消化す る こ と に よ り 、 さ ら に 1 種類の 断片を得 た。 PGKAPH 1 by Sph I After blunt-ended by polymerase treatment, Bam HI linker (5 ′ CCGGATCCGG 3 ′: SEQ ID NO: 22) was added, followed by digestion with Bam HI and Not I. As a result, one more fragment was obtained.
ま た、 実施例 5 記載の プ ラ ス ミ ド p C R E 2 を  In addition, the plasmid pCRE2 described in Example 5 was used.
H i n d 111 消化 し て得 ら れ る 0 . 7 k b と 5 . 8 k b の 断片の う ち 、 5 . 8 k b の 断片を ラ イ ゲ ー シ ョ ン に よ り 再環状化 し て、 プ ラ ス ミ ド p C R E 8 を構築 し た （図 2 8 ) o こ の プ ラ ス ミ ド p C R E 8 を N 0 t I 、 Of the 0.7 kb and 5.8 kb fragments obtained by Hind 111 digestion, the 5.8 kb fragment was recircularized by ligation and purified. The plasmid p CRE 8 was constructed (Fig. 28).
B a m H I + N o t I 、 S a c I 、 E c 0 R I + S a cBamHI + NotI, SacI, Ec0RI + Sac
1 、 ま た は P s t I + S a c I 消化 し た の ち 、 そ れぞれ と 上記の 各種断片を ラ イ ゲー シ ヨ ン し て、 プ ラ ス ミ ド p C R A P H 2 、 p C R A P H 3 、 p C R A P H 4 、 p C R A P H 5 、 お よ び p C R A P H 6 を構築 し た （図1, or after digestion with PstI + SacI, ligating each of the various fragments with the above fragments to form plasmids pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5, and pCRAPH6 were constructed (Fig.
2 8 ) o そ れぞれの プ ラ ス ミ ド に 含 ま れ る P G K 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー 断片の長 さ は、 p C R A P H 2 で は 1 .2 8) o The length of the PGK gene promoter fragment contained in each plasmid is 1 in pCRAPH2.
3 5 k b 、 p C R A P H 3 で は 0 . 8 3 k b 、 35 kb, 0.83 kb for pCRAPH3,
p C R A P H 4 で は 0 . 4 6 k b 、 p C R A P H 5 で は 0 . 4 0 k b 、 そ し て p C R A P H 6 で は 0 . 1 6 k b で あ っ た It was 0.46 kb for pCRAPH4, 0.40 kb for pCRAPH5, and 0.16 kb for pCRAPH6.
構築 し た プ ラ ス ミ ド p C R A P H 2 、 3 、 4 、 5 、 お よ び 6 を B g 1 11消ィヒ に よ り 直鎖状 に し た後、 A T C C 9 9 5 0 株の形質転換 に 使用 し た。 形質転換 は実施例 1 1 記載の電気パ ル ス 法で行 つ た。 パ ル ス 条件 は電気容 量を 2 5 / F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧を 5 K V Z c m と し て行 っ た。 After the constructed plasmids pCRAPH2, 3, 4, 5, and 6 were linearized with Bg111, the ATCC 9950 strain was transformed. Used for Transformation was performed by the electric pulse method described in Example 11. Pulse condition is electric capacity The amount was 25 / F, the resistance was 100 ohms, and the voltage was 5 KVZ cm.
形質転換体の選択 は 2 0 0 β g / m 1 の G 4 1 8 を含 む Y P D プ レ ー ト で行 っ た。 そ の 結果、 プ ラ ス ミ ド p C R A P H 2 p C R A P H 3 、 p C R A P H 4 、 お よ び P C R A P H 5 を 用 い た場合、 そ れぞれ l g  Transformants were selected on a YPD plate containing G418 at 200 βg / ml. As a result, when the plasmids pCRAPH2pCRPAPH3, pCRAPH4, and PCRAPH5 are used, the respective values are lg.
D N A あ た り 3 0 0 個程度の 形質転換'体が得 ら れた が、 —方 プ ラ ス ミ ド P C R A P H 6 で は形質転換体が得 ら れ な か っ た。 こ の 結果 は、 P G K 遣伝子の 開始 コ ド ン Approximately 300 transformants were obtained per DNA, but no transformants were obtained with the plasmid PCRAPH6. This result is the start code of the P GK gene.
A T G の 直前か ら 、 5 ' 上流 1 6 9 b p の P s t l サ イ ト ま でを 含む断片 は転写の プ ロ モ ー タ ー と し て の機能を 有 し て お ら ず、 一方、 4 0 1 b p 上流の E c o R I サ イ 卜 ま で を含む断片、 お よ び さ ら に 長 い 領域を含む断片 は 転写の プ ロ モ ー タ ー と し て機能す る こ と を示 し て い る 。 こ れ よ り 、 図 3 に 示 さ れ る P G K 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー を 含む 1 3 4 6 b p の配列 の う ち 、 9 4 6 番 目 の . E c o R I サ イ 卜 か ら A T G 直前の 1 3 4 6 番 目 塩基 ま で め 4 0 1 b p の配列 に プ ロ モ ー タ ー の機能を示す た め に 必要 な配列 が含 ま れ る こ と が明 ら か に さ れ た。 Immediately before ATG, the fragment containing up to the Pstl site of 1669 bp 5 'upstream does not function as a promoter of transcription, while 40 Fragments containing up to and including the EcoRI site 1 bp upstream have been shown to function as transcriptional promoters. . Thus, of the 1346 bp sequence containing the PGK gene promoter shown in Fig. 3, the 94.6th EcoRI site from the ARI site It was clarified that the 401 bp sequence up to the 1st base of the previous base contains a sequence necessary for the function of the promoter. .
実施例 2 2 ： グ リ セ ロ ア ルデ ヒ ド - 3 - リ ン 酸デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ （ G A P ) 遺伝子 の ク ロ ー ニ ン グ と G A P 遺伝子 を 含む D N A 断片の 塩基配列決定 Example 22 Cloning of Glyceraldehyde-3-Hydrogenate Dehydrogenase (GAP) Gene and Nucleotide Sequencing of DNA Fragment Containing GAP Gene
キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の グ リ セ ロ ア ノレ デ ヒ ド - 3 - リ ン 酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ （ G A P ) 遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ は、 遺伝子 ラ イ プ ラ リ ー と し て実施例 2 で構築 し た キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を用 い 、 他生物の既知の G A P 遺伝子を プ ロ ー ブ と し たハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン 法を用 い て行 っ た。 Mo l e cu l a r C l on i n g 2nd e d i t i o n p 2. 95-121, Co l d S r i n Ha r b o r L a b o r a t o ry ( 1989 ) に記載 さ れ た方法 に 従 い、 上記の遺 伝子 ラ イ ブ ラ リ ー の約 20, 000ブ ラ ー 'ク の フ ァ ー ジ D N A を吸着 さ せ た フ ィ ル タ ー を作製 し た。 次 に 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ の G A P 遺伝子を含む 2. 1 k b の H i n d l l l 断片を保持す る p U C プ ラ ス ミ ド Glycerol Anode Dehydrogenase of Candida utilis-Clonin of the gene for 3-hydroxyphosphate dehydrogenase (GAP) Using the Candida dutilis chromosome DNA library constructed in Example 2 as a gene library, a known GAP of other organisms was used. The hybridization was performed using the gene as a probe. Mole cu lar C l oning 2nd editionp 2.95-121, Cold Srin Harbor Laboratory (1989) A filter was prepared by adsorbing about 20,000 breakage of phage DNA. Next, a pUC plasmid containing a 2.1 kb Hindlll fragment containing the Saccharomyces cerevisiae GAP gene.
Yamano e t a 1. J o u r na l 0 ί B i o t e chno l o gy 32, 165 - 171 ( 1994 ) ) か ら 、 G A P 遺伝子の 大部分を 占 め る 0 ' 八 断片 と し て約 1 k b の A s u H - A f l l l断片を 切 り 出 し た。 こ の 断片を 32 P 標識 し て、 こ れを プ ロ ー ブ と し てハ イ プ リ ダィ ゼー シ ヨ ン を行 っ た。 そ の結果 3 つ の 陽性 プ ラ ー ク が分離で き た。 更 に こ れ ら プ ラ ー ク の 1 つ の フ ァ ー ジ D N A に つ い てサ ブ ク ロ ー ニ ン グを行 い、 こ の フ ァ ー ジ D N A に 含 ま れて い た 6. 5 k b E c o R I 断片 を単離 し 、 プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー p B l u e s c r i p t l l S K + の E c o R I サ イ 卜 に 組込み、 プ ラ ス ミ ド p G A P l お よ び 2 を構築 し た （図 2 9 ) 。 Yamano eta 1. -A flll fragment was cut out. This fragment was labeled with 32 P and used as a probe for a hybridisation reaction. As a result, three positive plaques could be separated. In addition, subcloning was performed on one of the phage DNAs of these plaques and was included in this phage DNA. A 5 kb EcoRI fragment was isolated and inserted into the EcoRI site of the plasmid vector pBluescriptll SK + to construct plasmids pGAPl and 2. (Figure 29).
制限酵素 H i n d l l l 、 C l a l 、 S m a l 、 あ る い は S p e l を単独 も し く は複数使用 し て、 単離 し た 6. 5 k b E c 0 R I 断片 を 消化 し 、 生 じ た 断片 に対 し て サ ッ カ ロ マ イ セ ス • セ レ ビ シ ェ の G A P 遺伝子を プ ロ ー ブ と し た サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン を 行 っ た 。 そ の 結果 3 . 8 k b H i n d I I I 一 S p e I 断片 に 強 く ハ イ ブ リ ダ ィ ズ し た o 乙 、 3 . 8 k b H i n d I I I - S p e I 断 片 を プ ラ ス ミ ド ベ ク 夕 ー The isolated 6.5 kb Ec0RI fragment was digested with one or more of the restriction enzymes Hindlll, Clal, Smal, or Spel, and the resulting fragments were digested. On the other hand, Karo Mysses • A southern hybridization was performed using the GAP gene of Serrevisier as a probe. As a result, the 3.8 kb HindIII-SpeI fragment was strongly hybridized to the 3.8 kb HindIII-SpeI fragment. Evening
p B 1 u e s c i p t s κ + 及 び  p B 1 u e s c i p t s κ + and
p B 1 u e s c r l p t I I K S + の H i n d l l l サ イ ト と S p e I サ ィ 卜 と の 間 に そ れ ぞ れ組 み 込 み 、 プ ラ ス ミ ド p G AP H 1 、 p G AP H 2 を 作製 し た 。 こ れ ら プ ラ ス ミ ド に つ い て 、 H i n d 11 I 、 C l a l 、 S m a l 等 の 制 限酵素 サ イ ト で の 欠失変異体 の 作製 や 、 ェ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 11 I 及 び マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼ を 用 い た 連続 し た 欠失変異体 を 作製す る こ と に よ り 、 種 々 の 欠失変異 を も つ プ ラ ス ミ ド を 作製 し 、 3 7 4 9 b p か ら な る  Plasmids pGAPH1 and pGAPH2 were prepared by incorporating pB1 uescrlpt IIKS + between the Hindlll site and the SpeI site, respectively. did . For these plasmids, generation of deletion mutants at restriction enzyme sites such as Hind11I, Clal, Smal, etc., and exonuclease By making continuous deletion mutants using 11I and Mung Bean nuclease, plasmids with various deletion mutations can be created. And generate 374 bp
H i n d m - S p e I 断 片 の 配 列 を 決 定 し た （ 図 2 9 ) 0 The arrangement of the Hindm-SpeI fragments was determined (Fig. 29).
予想 さ れ る 構造遺伝子領域 の 解析 を 行 つ た と こ ろ 、 1 0 0 5 b p か ら な る オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム が 存在 し 、 そ こ か ら 推定 さ れ る 遺伝子産 物 の ァ ミ ノ 酸配列 に つ い て サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェ の G A P 遺伝子 産物 に 対す る ホ モ ロ ジ一を 調 べ た 。 両配列 は 互 い に Analysis of the predicted structural gene region revealed that there was an open reading frame of 105 bp, which was estimated from this. The aminoic acid sequence of the gene product was compared with that of the Saccharomyces cerevisiae GAP gene product. Both arrays are mutually
7 9 . 6 % ホ モ ロ ジ一を 示 し た こ と か ら 、 単離 し た 遺伝 子が キ ヤ ン ァ イ ダ * ュ テ ィ リ ス の G A P 遺伝子 で あ る と 断疋 し た 制御領域 に つ い て は 、 開始 コ ド ン の 上流 9 7 5 b p 、 終止 コ ド ン の下流 1 7 6 9 b p が含 ま れて い た。 こ の う ち 、 転写の プ ロ モ ー タ ー を含む と 推測 さ れ る H i n d I I I サ イ ト か ら 開始 コ ド ン A T G の 直前 ま で の 9 7 5 b p の配列 は 図 3 0 に 、 転写の タ ー ミ ネ ー タ 一 を含む と 推測 さ れ る 終止 コ ド ン T A A の 直後か ら A f 1 I I I サ イ ト ま で の 8 0 2 b p の 配列 は 図 3 1 に示 さ れ る 通 り で あ っ た。 79.6% control, indicating that the isolated gene was the GAP gene of Cyanida * utilis. For regions, upstream of the start codon It contained 975 bp and 176 bp downstream of the termination codon. Of these, the 9975 bp sequence from the HindIII site, which is presumed to contain the transcriptional promoter, to just before the start codon, ATG, is shown in Figure 30. The 802-bp sequence from immediately after the termination codon TAA, presumed to contain a transcription terminator, to the Af1III site is shown in Figure 31. It was as expected.
実施例 2 3 ： G A P 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ一 タ ー と を使 っ た発現べ ク タ ー の構築 Example 23: Construction of an expression vector using promoter and terminator of GAP gene
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の G A P 遺伝子制御領域か ら プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ ー タ ー を 含む D N A断片を そ れぞれ PCR 法を用 い て取得 し た （図 2 9 ) 。  A DNA fragment containing a promoter and a terminator was obtained from the GAP gene regulatory region of Candida utilis by using the PCR method. (Fig. 29).
プ ロ モ ー タ ー と し て は、 プ ラ ス ミ ド p G A P l を铸型 と し て、 開始 コ ド ン の上流 9 7 5 b p に 位置す る H i n d 111 サ イ ト か ら 開始 コ ド ン A T G 直前 ま で の 断片を取得 し た。 プ ラ イ マ ー と し て、 . As a promoter, the plasmid pGAPl was used as a type, and the start code was obtained from the Hind111 site located 975 bp upstream of the start code. Fragments up to just before Don ATG were obtained. As a primer,.
5' -CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' (配列番号： 23) 5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3 '(SEQ ID NO: 23)
5' -CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' (配列番号： 24) の 2 つ を用 い 、 3 ' 下流側 開始 コ ド ン 直前 に X b a I 部 位を も つ 様 に デサ イ ン し て 合成 し た。 Two of 5′-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3 ′ (SEQ ID NO: 24) were used, and were synthesized by designing with an XbaI site immediately before the 3 ′ downstream start codon.
次 に 、 タ ー ミ ネ 一 夕 一 と し て、 プ ラ ス ミ ド p G A P l を铸型 と し て、 終止 コ ド ン 直後か ら S p e I サ イ 卜 ま で の 断片を取得 し た。 プ ラ イ マ ー と し て は、 5" -GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3" (配列番号： 25)Next, as a terminator, the plasmid pGAPl was transformed into a type I, and the fragment from immediately after the termination codon to the SpeI site was obtained. . As a primer, 5 "-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3" (SEQ ID NO: 25)
5' -GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' (配列番号： 26) を用 い、 5 ' 側終止 コ ド ン 直後 に は B a m H I サ イ ト を も つ 様 に デザ イ ン し 合成 し た。 5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3 '(SEQ ID NO: 26) was used, and the BamHI site was designed and synthesized immediately after the 5'-side termination codon.
P C R プ ロ セ ス は、 P f u D N A ポ リ メ ラ ー ゼ  The PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
( S T R A T A G E N E ) を使 っ て 3 0 サ イ ク ルで行 つ た。 P C R 合成 し た プ ロ モ ー タ ー 断片 を H i n d l l l と X b a l と で消化 し 、 p U C 1 9 ベ ク タ ー の  (STRATAGENE) in 30 cycles. The PCR-produced promoter fragment was digested with Hindlll and Xbal, and the pUC19 vector was digested.
H i n d I I I サ イ ト と X b a I サ イ ト と の 間 に組み込み プ ラ ス ミ ド p U G p r o を構築 し た （図 3 2 ) 。 一方、 タ ー ミ ネ ー タ 一断片 は、 終止 コ ド ン の 約 0 . 8 k b 下流 の A f 1 111 サ イ ト で消ィヒ し 、 ク レ ノ ウ 酵素で D N A末 端の 平滑化を行 っ た後、 B a m H I で消化 し た。 得 ら れ た 0 . 8 k b の D N A 断片を p U C 1 9 ベ ク タ ー の B a m H I サ イ ト と S m a I サ イ 卜 の 間 に組み込み、 プ ラ ス ミ ド p U G t e r を構築 し た （図 3 2 ) 。 An embedded plasmid pUGpro was constructed between the HindIII site and the XbaI site (Fig. 32). On the other hand, a fragment of the terminator disappears at the Af111 site, about 0.8 kb downstream of the termination codon, and blunts the DNA end with Klenow enzyme. After that, it was digested with BamHI. The obtained 0.8 kb DNA fragment was inserted between the BamHI site and the SmaI site of pUC19 vector to construct a plasmid pUGter. (Fig. 32).
プ ラ ス ミ ド p U G t e r の G A P タ ー ミ ネ ー タ 一 の下 流' 端の E c o R I サ イ ト を ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平 滑化 し た後、 N o t I リ ン カ 一 （ 5 ' A G C G G C C G C T 3 ' :配列番 号 ： 1 8 ) を連結 し て、 プ ラ ス ミ ド p U G t e r N を構 築 し た。 次 に 、 プ ラ ス ミ ド p U G p r o カヽ ら 0 . 9 5 k b の G A P プ ロ モ ー タ ー 断片を H i n d l l l と X b a I と で切 り 出 し 、 プ ラ ス ミ ド p U G t e r N の H i n d I 1 I サ イ ト と X b a I サ イ ト と の 間 に 挿入 し て、 発現 プ ラ ス ミ ド p G A P P T l を構築 し た。 さ ら に、 プ ロ モ ー タ ー の 上流末端の H i n d I I I サ イ ト を ク レ ノ ウ 酵素処 理 に よ り 平滑化 し 、 N o t I リ ン カ 一 （5' AGCGGCCGCT3' : 配列番号 ： 1 8 ) を連結 し て、 プ ラ ス ミ ド p G A P P T 2 を構築 し た （図 3 2 ) 。 After smoothing the EcoRI site at the downstream end of the GAP terminator of the plasmid pUGter by Klenow enzyme treatment, the NotI The plasmid (5 'AGCGGCCGCT 3' : sequence number: 18) was linked to construct a plasmid pUGterN. Next, a 0.95 kb GAP promoter fragment from plasmid pUGpro was cut out with Hindlll and XbaI, and plasmid plasmid pUGterN was isolated. Inserted between the Hind I1I site and the XbaI site of A plasmid p GAPPT l was constructed. Furthermore, the HindIII site at the upstream end of the promoter was smoothed by Klenow enzyme treatment, and the NotI linker (5'AGCGGCCGCT3 ': SEQ ID NO: : 18) to construct the plasmid pGAPPT2 (Fig. 32).
さ ら に構築 し た発現 プ ラ ス ミ ド P G A P P T 2 が実際 に キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 内 で機能す る か否かを確認 す る た め に、 プ ラ ス ミ ド p G A P P T 2 の X b a I サ イ ト と B a m H I サ イ ト の 間 に実施例 1 9 記載の プ ラ ス ミ ド P A P H 2 か ら X b a I と B g 1 11に よ っ て切 り 出 さ れ る 1 . l k b の A P T遺伝子断片を組み込み、 プ ラ ス ミ ド p G A P A P H l を構築 し た （図 3 2 ) 。  To confirm whether the constructed expression plasmid PGAPPT2 actually functions in the Candida utilis, Cut out from the plasmid PAPH2 described in Example 19 between XbaI and BamHI sites of pGAPPT2 by XbaI and Bg111. The resulting 1.1 kb APT gene fragment was incorporated to construct a plasmid pGAPAPHl (FIG. 32).
構築 し た プ ラ ス ミ ド p G A P A P H l を N o t I で消 化 し た後、 A T C C 9 9 5 0 株の形質転換 に使用 し た。 形質転換 は電気パ ル ス 法で、 パ ル ス 条件を電気容量を 2 5 / F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧を 5 K V Z c m と し て行 っ た。 形質転換体の選択 は 2 0 0 ^ g Z m' l の G 4 1 8 を含む Y P D プ レ ー ト で行 い、 0 . 1 μ g の D N A を使用 し て約 4 0 個程度 の 形質転換体が得 ら れた。 こ れ に よ り 、 G A P 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー 、 タ 一 ミ ネ ー タ ー が機能す る こ と が確認 さ れた。  The constructed plasmid pGAPAPHl was digested with NotI, and then used for transformation of ATCC 9950 strain. Transformation was carried out by the electric pulse method under the pulse conditions of an electric capacity of 25 / F, a resistance value of 100 ohms, and a voltage of 5 KVZcm. Transformants were selected on a YPD plate containing 200 ^ g Z m'l of G418 and about 40 transformants were used using 0.1 μg of DNA. I got my body. As a result, it was confirmed that the promoter and the terminal of the GAP gene functioned.
実施例 2 4 : 原形質膜 プ ロ ト ン A T P a s e ( P M A ) 遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ と P M A遺伝子を 含む D N A 断片 の塩基配列決定 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の原形質膜 プ ロ ト ン Example 24: Cloning of the plasma membrane protein ATPase (PMA) gene and sequencing of the DNA fragment containing the PMA gene Plasma membrane protons of Candida * utilis
A T P a s e ( P M A ) 遺伝子の ク ロ ー ニ ン グ は、 P G K 遺伝子や P M A 遺伝子の 場合 と 同様 に、 実施例 2 で構 築 し た キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を用 い、 他生物の 既知の P M A 遺伝子の一部分を プ ロ ー ブ と し た ハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン 法を用 い て行 っ た Mo l e cu l a r C l on i n 2 n d e d i t i o n p 2. 95- 121, Co l d Cloning of the ATPase (PMA) gene was performed in the same manner as in the case of the PGK gene and the PMA gene, as in the case of the candida * utilis chromosomal DNA line constructed in Example 2. Mole cu lar C l in in using a hybridization and a hybridization method in which a part of a known PMA gene of another organism was probed. 2 ndeditionp 2. 95- 121, Cold
Sp r i n Ha r bo r La b o r a t o r y ( 1989 ) に言己載 さ れた方法 に 従 い、 上記 し た遣伝子 ラ イ ブ ラ リ ー の約 2 0 . 0 0 0 プ ラ ー ク の フ ァ ー ジ D N A を吸着 さ せ た フ ィ ル タ ー を作 製 し た。 次 に 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ピ シ ェの P M A 1 遺伝子の 塩基配列 （ S e t r ano e t a 1. Na t u r e 319, 689 - 693 ( 1986 ) ) を も と に 合成 し た 2 つ の プ ラ イ マ ー ： 5' -ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' (配列番号： 27)According to the method described in Sp. Rin Harbor Laboratory (1989), about 200.000 plaques of the above-mentioned generative library were obtained. -A filter to which DNA was adsorbed was made. Next, we synthesized the nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae PMA1 gene (Setrananoeta 1. Nature 319, 689-693 (1986)). One primer: 5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3 '(SEQ ID NO: 27)
5' -TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' (配列番号： 28) を用 い、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス * セ レ ビ シ ェ A H 2 2 株 Using 5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3 '(SEQ ID NO: 28), Saccharomyces * Celleviche AH22 strain
( A T C C 3 8 6 2 6 ) の染色体 D N A を铸型 と し て P C R 法で P M A 1 構造遺伝子の 5 ' 末端 + 1 か ら + 1 0 2 7 (開始 コ ド ン A T G の A を + 1 と す る ） に対応 す る 約 l k b の 領域 を 増幅 し た。 染色体 D N A は  Using the chromosomal DNA of (ATCC 388626) as the 铸 type, the 5 'end of the PMA1 structural gene + 1 to +27 (the A of the start codon ATG is +1) A region of about lkb corresponding to (a) was amplified. Chromosome D N A
Me t h o d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a b o r a t o r y Co u r s e a nu a l - Ro s e . D e t a 1. P 126 - 127 Co l d S r i n g Me t ho d s i n Y e a s t G en e t i cs-A l a b o r a t o r y Co u r s e a nu a l-Ro s e. De t a 1.P 126-127 Co l d S r i n g
Ha r bo r L a b o r a t o r y P r e s s NY ( 1990 ) 記載の方法 に 従 つ て調製 し た。 取得 し た 断片 は 32 P 標識 し て、 プ ロ ー ブ と し て ハ ィ ブ リ ダ ィ ゼ ー シ ヨ ン を 行 っ た 。 そ の 結果、 得 ら れ た 4 つ の 陽性 プ ラ ー ク の う ち 1 つ の フ ァ ー ジ D N A に つ い て ィ ン サ ー ト D N A を X b a l 消 化 し て 、 1 0 k b 4 k b 、 2 . 8 k b 、 2 . 6 k b の 4 つ の X b a l 断片 を 単離 し た It was prepared according to the method described in Harbor Laboratory Press NY (1990). The obtained fragment was labeled with 32 P and probed. And did a hybridisation. As a result, for one phage DNA of the four positive plaques obtained, the insert DNA was subjected to Xbal digestion to obtain 10 kb and 4 kb. , 2.8 kb and 2.6 kb Xbal fragments were isolated
単離 し た 4 つ の 断 n に 対 し 、 ス ク 一 リ ー ニ ン グ に 用 い た サ ッ 力 口 マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ の P M A 1 遺伝子 の 約 1 k b 断片を プ ロ 一 ブ と し て サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ ィ ゼ一 シ ヨ ン を ί つ た と こ ろ 、 2 . 6 k b の X b a I 断片 に ノヽ ィ ブ リ ダ ィ ズ し / そ こ で、 こ の 断片を ブ ラ ス ミ ド ベ ク タ 一 p B 1 u e s c P t 1 I S K + の X b a I サ イ ト に 組み 込 み 、 イ ン サ一 ト の 方 向性が互 い に 逆 の ブ ラ ス ミ ド p P M A F 1 、 P P M A F 2 を 作製 し た （ 図 3 3 ) o こ れ ら プ ラ ス ミ ド に つ い て、 B a m H I 、 C 1 a I 、 E c 0 R I 等 の 制 限酵素 サ イ ト で の 欠失変異体 の 作製 や ェ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 1 I I 及 び マ ン グ ビ一 ン ヌ ク レ ァ ー ゼ を 用 い た 欠失変異体 を作製 す る こ と に よ り 、 種 々 の 欠失 変異 を も つ プ ラ ス ミ ド、 を 作製 し ヽ 両 末端 力、 ら 約 1 k b ず つ の 塩基配列 を 決定 し た （ 図 3 3 ) 。 予想 さ れ る 構造遺 伝子領域 の 解析 を 行 つ た と こ ろ 、 図 3 3 中左側 の X b a I サ ィ ト か ら E c 0 R V サ イ ト を 含 む 約 1 k b 内 に 、 サ ッ カ ロ マ ィ セ ス · セ レ ビ シ ェ の P M A 1 構造遺伝子 の 5 末端領域 と 約 5 0 % の ホ モ 口 シ ー ¾r示 す 3 5 2 b P の ォ ー プ ン リ 一デ ィ ン グ フ レ ー ム が存在 し た。 も う一方側 の X b a I サ イ ト か り β a m H I サ イ ト を含む約 0 . 8 k b 内 に は、 サ ッ 力 ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ の P M A 1 遣 伝子の + 1 2 9 2 番 目 か ら + 2 0 4 6 番 目 ま で の 範囲 (開始 コ ド ン A T G の A を + 1 と す る ） と 約 7 0 % の ホ モ ロ ジ一を示す 7 5 4 b p の ォ ー プ ン リ 一デ ィ ン グ フ レ 一ム が存在す る こ と が分か つ た。 こ の 結果か ら 、 単離 し た遺伝子がキ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ の P M A 遺伝子で あ る と 判断 し た o ま た 、 こ の 2 . 6 k b の X b a I 断片 に は 、 開始 コ ド ン A T G の上流 。 9 9 b P が含 ま れて い た。 転写の プ ロ モ一 タ ー を含む と 推測 さ れ る こ の 5 9 9 b p の配列 は 図 3 4 に 示 さ れ る 通 り で あ つ た。 For each of the four isolated fragments, an approximately 1 kb fragment of the PMA1 gene from Saccharomyces cerevisiae used for screening was purified. When the Southern Hybridization was added as a part, the 2.6 kb XbaI fragment was digested and digested. This fragment was incorporated into the XbaI site of the plasmid vector pB1uescPt1ISK +, and the orientation of the insert was reversed. The plasmids p PMAF 1 and PPMAF 2 were prepared (Fig. 33). O These plasmids were controlled by BamHI, C1aI, Ec0RI, etc. Generation of deletion mutants at restriction enzyme sites and generation of deletion mutants using exonuclease 1II and mangbin nuclease As a result, various deletion mutations Flops la scan Mi-de, to prepare a ヽ both ends force even One was determined al approximately 1 kb not a One nucleotide sequence (Figure 3 3). Analysis of the predicted structural gene region revealed that the site within about 1 kb, including the Ec0RV site, from the XbaI site on the left side in Fig. 33. An open readout of 352 bP, which shows the 5 terminal region of the PMA1 structural gene and about 50% of the homologous region of the PMA1 structural gene of Gaccharomyces cerevisiae. There was a frame. On the other side Within about 0.8 kb, including the β am HI site and the X ba I site, +1 2 9 of the PMA1 gene of Saccharomyces cerevisiae The range from the second to the +2 046 (assuming that the A of the starting codon ATG is +1) and a homology of about 70%, with a 754 bp It turns out that there is a pruning frame. Based on these results, the isolated gene was determined to be a Candida utilitarian PMA gene.o In addition, the 2.6 kb XbaI fragment was not identified in this 2.6 kb XbaI fragment. , The start code upstream of the ATG. It contained 99 bP. The 5999 bp sequence, which is presumed to contain the transcriptional promoter, was as shown in Figure 34.
転写の タ ー ミ ネ 一 夕 一 につ い て は 、 同 じ フ ァ ー ジ D N A カヽ ら X b a I で切 り 出 さ れ る 他の 3 つ の 断片 （ 1 0 k b 、 4 k b 、 お よ び 2 . 8 k b ) を サ ブ ク ロ ー 二 ン グ し そ れぞれ両末端側 力、 り ： 配列決定を行い、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェ の P M A 1 遗伝子の 3 ' 側領域 と の ホ モ 口 ジ一 ¾r 調 べ た。 そ の ロ 、 2 . 8 k b の X b a I 断片の 片側 に上記 の P M A 1 遺伝子の 3 ' 末端側 と 高 い ホ モ 口 ジ一を 示す領域が存在す る こ と が示 さ れ た。 こ の X b a I 断片を プ ラ ス ミ ドベ ク タ - p B l u e s c r i p t I I S K + の X b a I サ イ ト に 組み込み、 イ ン サ一 ト の方 向性が互 い に逆の プ ラ ス ミ ド p P M A L 1 お よ び P P M A L 2 を 作製 し た （図 3 3 ) o れ ら プ ラ ス ミ ド に つ い て、 K p n I 消化 に よ る 欠失変異体の作製や、 ェ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 111 及 び マ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼ を 用 い た 欠失変異体'を作製す る こ と に よ り 、 種 々 の 欠失変異 を も つ プ ラ ス ミ ド を作製 し 、 X b a I サ イ 卜 か ら K p n I サ イ ト ま で の 1 . 9 k b の塩基配列 を決定 し た （図 3 3 ) 。 こ の塩基配列 に は、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス · セ レ ビ シ ェの P M A 1 遺伝子の + 2 0 4 1 番 目 カヽ ら + 2 7 5 7 番 目 ま で の範囲 （開始 コ ド ン A T G の A を + 1 と す る ） と 約 8 2 % の ホ モ ロ ジ一を 示す 7 1 7 b p の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム と 、 終止 コ ド ン T A A の 3 ' 下流 1 1 8 8 b p が含 ま れて い た。 転写の タ ー ミ ネ ー タ 一を含む と 推測 さ れ る 終止 コ ド ン T A A 直後か ら K p n I サ イ ト ま での 1 1 8 8 b p の配列 は 図 3 5 に 示 さ れ る 通 り で あ つ た。 For the transcriptional terminology, the other three fragments (10 kb, 4 kb, and 10 kb) cut out from the same phage DNA fragment with XbaI were used. And 2.8 kb) were subcloned, and both ends were subjected to sequencing, and the PMA1 of Saccharomyces cerevisiae was sequenced. The mouth mouth with the 3 'side region of the gene was examined. It was shown that, on one side of the 2.8 kb XbaI fragment, there was a region showing the 3 'end of the PMA1 gene and a high homologous region. This XbaI fragment is incorporated into the XbaI site of the plasmid vector-pBluescript IISK +, and the insert direction is opposite to that of the plasmid. pPMAL1 and PPMAL2 were generated (Fig. 33). o For these plasmids, deletion mutants were prepared by digestion with KpnI, and Various deletion mutations can be created by creating 'deletion mutants using S. nuclease 111 and Mungbean nuclease'. A plasmid was prepared, and the 1.9 kb nucleotide sequence from the XbaI site to the KpnI site was determined (FIG. 33). This nucleotide sequence includes the Saccharomyces cerevisiae PMA1 gene from the + 2041st gene to the + 2757th gene (start code). The A of the ATG is assumed to be +1) and an open reading frame of 717 bp showing about 82% homology and a termination codon TAA 1 188 bp of the 3 'downstream of the DNA. The 11888 bp sequence from immediately after the termination codon TAA presumed to contain a transcription terminator to the KpnI site is shown in Figure 35. It was.
実施例 2 5 ： P M A 遺伝子の プ ロ モ ー タ ー と タ ー ミ ネ 一 タ ー と を使 っ た発現べ ク タ ー の ¾築 Example 25: Construction of expression vector using promoter and terminator of PMA gene
先ず、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の P M A 遺伝子制御 領域か ら プ ロ モ ー タ ー ま た は タ ー ミ ネ ー タ ー を含む D N A ίί片を そ れぞれ P C R 法を用 い て取得 し た （図 3 3 ) プ ロ モ ー タ ー と し て、 プ ラ ス ミ ド p P M A F l を铸型 と し て、 X b a I サ イ ト 下流 2 0 b p の 位置か ら 開始 コ ド ン A T G 直前 ま での 断片を取得 し た 。 プ ラ イ マ ー と し て、  First, a DNA fragment containing a promoter or a terminator from the PMA gene control region of Candida * utilis was subjected to PCR. (Fig. 33) As a promoter, the plasmid pPMAFl was used as a 铸 type from the position 20 bp downstream of the XbaI site. The fragment up to just before the start code ATG was obtained. As a primer,
o' -GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' (配列番号： 2 9)o'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3 '(SEQ ID NO: 29)
5' -TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3' (配列番号： 3 0) の 2 つを用 い、 5 ' 上流側末端 に は N 0 t I サ イ ト 、 3 下流側開始 コ ド ン 直前 に X b a I サ イ ト を も つ 様 に デザ イ ン し て合成 し た。 5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3 '(SEQ ID NO: 30) These were synthesized by designing with the N0tI site at the 5 'upstream end and the XbaI site just before the start codon at the downstream 3'. .
タ ー ミ ネ ー タ 一 と し て、 プ ラ ス ミ ド p P M A L l を铸 型 と し て、 終止 コ ド ン T A A 直後力、 ら 終止 コ ド ン 4 0 3 b p 下流 ま で の 断片 を取得 し た。 プ ラ イ マ ー と し て、 5' -CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' ' (配列番号： 31 ) As a terminator, the plasmid pPMALl is type II, and the fragment from the stop codon TAA immediately to the stop codon 400 bp downstream is obtained. did. As a primer, 5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3 '' (SEQ ID NO: 31)
5' -GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' (配列番号： 32) を用 い 、 5 ' 上流側終止 コ ド ン 直後 に は K p n I サ イ ト 3 ' 下流側末端 に は N o t I サ イ ト を も つ 様 に デザイ ン し 合成 し た。 5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3 '(SEQ ID NO: 32) is used. Immediately after 5' upstream termination codon, KpnI site 3 'Downstream terminal has NotI site It was designed and synthesized in the same way.
P C R プ ロ セ ス は、 P f u D N A ポ リ メ ラ ー ゼ  The PCR process is based on the Pfu DNA polymerase.
( S T R A T A G E N E ) を使 っ て 3 0 サ イ ク ルで行 つ た。 P C R 合成 し た プ ロ モ ー タ ー 断片 を N o t I と X b a l と で消化 し 、 p B l u e s c r i p t l l S K + ベ ク タ ー の N o t I サ イ 卜 と X b a I サ イ 卜 の 間 に組み 込み、 プ ラ ス ミ ド p B M p r o を構築 し た。 一方、 タ ー ミ 一 夕 一断片を、 p B 1 u e s c r i p t l l S K + の K p n I サ イ 卜 と N o t I サ イ 卜 と の 間 に組み込み、 プ ラ ス ミ ド p B M t e r を構築 し た。 プ ラ ス ミ ド  (STRATAGENE) in 30 cycles. The promoter fragment synthesized by PCR was digested with NotI and Xbal, and the fragment was inserted between the NotI site and the XbaI site of pBluescriptll SK + vector. To construct the plasmid pBM pro. On the other hand, the term overnight fragment was inserted between the KpnI site and the NotI site of pB1uescripiptlsk + to construct a plasmid pBMTer. Plus
p B M t e r か ら 得 ら れ る 0 . 4 k b の Κ ρ η I — N o t I 断片 を、 p U C 1 9 の E c o R I サ イ ト を ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平滑化 し 、 N o t I リ ン カ 一 The 0.4 kb ΚρηI—NotI fragment obtained from pBMter was blunted by digestion of the EcoRI site of pUC19 with Klenow enzyme, N ot I Linker
(5' AGCGGCCGCT3' :配列番号 ： 1 8 ) を連結 し て構築 し た プ ラ ス ミ ド、 p U C 1 9 N の K p n l サ イ ト と N o t l サ ィ 卜 と の 間 に組み込み、 プ ラ ス ミ ド p U M t e r を構築 し た （図 3 6 ) o (5 'AGCGGCCGCT3': SEQ ID NO: 18) Plasmid p UM19N was inserted between Kpnl site and Notl site to construct a plasmid pUMter (Fig. 36).
次 に、 プ ラ ス ミ ド p U Μ t e r τ)ヽ X b a I と Ν ο t I と の 消化で得 ら れ る 0 . 4 k b の 夕 一 ミ ネ 一 タ ー 断片 と 、 プ ラ ス ミ p B M p r o 力、 ら N 0 t I と X b a I の 消化で得 ら れ る 0 . 6 5 k b の プ π ΐ一 タ ー 断片 と を、 実施例 4 で構築 し た プ ラ ス ミ ド' p P G K P T 5 を N 0 t I 消化 し て得 ら れ る 2 . 9 k b の 断 η に組み込み、 ブ ラ ス ミ ド p M A P H 1 を構築 し た （図 3 6 ) o  Next, a 0.4 kb evening mineral fragment obtained by digesting the plasmid pU Μter τ) ヽ XbaI and ΝοtI, and plasmid p BM pro and the 0.65 kb π-pitter fragment obtained by digestion of N0tI and XbaI were combined with the plasmid 'constructed in Example 4'. Plasmid p MAPH1 was constructed by incorporating pPGKPT5 into a 2.9 kb fragment η obtained by digestion with N0tI (Fig. 36).
さ ら に構築 し た発現 ブ ラ ス ミ ド ρ Μ A P H 1 が実際 に キ ャ ン デ イ ダ • ュ テ ィ リ ス 内 で機能す る か否かを確認す る た め に、 プ ラ ス ミ p M A P H 1 の X b a I サ ィ 卜 と B a m H I サ ィ 卜 と の 間 に実施例 1 9 記載の プ ラ ス ミ ド p A P H 2 か ら X b a I と B 1 11に よ っ て切 り 出 さ れ る 1 . 1 k b の A P T遺伝子断片を組み込み、 プ ラ ス ミ ド p M A A P H 1 を構築 し た （図 3 6 ) o  To confirm whether the constructed expression plasmid ρ ρ APH1 actually functions in the Candidate utility, Cut between the plasmid pAPH2 described in Example 19 between XbaI site and BamHI site of mi pMAPH1 by XbaI and B111. The plasmid pMAAPH1 was constructed by incorporating the 1.1 kb APT gene fragment (Fig. 36).
'構築 し た プ ラ ス ミ ド p M A A P Η 1 を N 0 t I 消化 し た後、 A T C C 9 9 5 0 株の 形質転換 に 使用 し た。 形質 転換 は電気パ ル ス 法で、 パ ル ス 条件を X M.を 2 5 ^ F 、 抵抗値を 1 0 0 0 ォ ー ム、 電圧 を 5 K V Z c m と し て行 つ た。  'The constructed plasmid pMAAPΗ1 was digested with N0tI and then used for transformation of ATCC9950 strain. Transformation was performed by the electric pulse method under the pulse conditions of XM. 25 ^ F, a resistance value of 1000 ohms, and a voltage of 5 KVZcm.
形質転換体の選択 は 2 0 0 g Z m l の G 4 1 8 を含 む Y P D プ レ一 卜 で行 い 、 0 . l g の D N A を 用 い て 約 4 0 個程度の形質 換体が得 ら れた。 こ れ に よ り 、 P M A遣伝子の プ ロ モ一 夕 一 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一 が機 能す る も の で あ る こ と が確 Transformants were selected on a YPD plate containing 200 g Zml of G418, using 0.1 lg DNA. About 40 transformants were obtained. This confirms that the PMA transmitter and terminator are functional.
実施例 2 6 ： 自 律複 を 有す る 配列 （ A R S ) を含 む D N A断片の ク 口 ン 化 Example 26: Cloning of a DNA fragment containing a sequence with autonomous duplication (ARS)
実施例 1 9 で構築 し た プ ラ ス ミ ド p G K A P H l か ら P G K遺伝子 プ ロ モ 夕 一 と 、 A P T 遺伝子 と 、 そ し て P G K遺伝子 タ ー ミ ネ 一 夕 一 と を 含む 3 . 3 k b の N 0 t I 断片を切 り 出 し 、 こ れを プ ラ ス ミ ド  3.3 kb containing the PGK gene promoter, the APT gene and the PGK gene terminator from the plasmid pGKAPHl constructed in Example 19 Cut out the N 0 tI fragment of
p B 1 u e s C Γ 1 P S K - (S t rat agene) O N o t I サ ィ ト に挿入 し て プ ラ ス ミ ド p G K A P H 2 を構築 し た （図 3 7 ) o B a m H I 消化 し て脱 リ ン 酸化 し た プ ラ ス ミ ド p G K A P H 2 、 2 0 0 n g と 、 実施例 2 で得 ら れた キ ャ ン デ ィ グ ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 の 3 - 7 k b の ゲ ノ ム D N A の S a u 3 A I 部分消化断片 2 0 0 n g と を、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 連結 し た。 こ の D N A溶液を用 い て大腸菌 D H 5 を形質転換 し て、 得 ら れ た約 3 0 0 0 0 個 の形質転換体 よ り プ ラ ス ミ ド D N A混合物を抽 出 し て染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作 製 し た。 こ の ラ イ ブ リ 一か ら 調製 し た D N A を用 い 、 実施例 1 1 記載 の 電 パ ル ス 法 に よ り 、 A T C C 9 9 5 0 株 の 形質転換を試み た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 // F と し 、 抵抗値 は 8 0 0 オ ー ム ま た は 1 0 0 0 オ ー ム 電圧 は 3 . 7 5 K V c m ま た は 5 K V Z c m と し て計 25 一 pB1uesC C1 PSK-(Stratagene) ONotI site to construct plasmid pGKAPH2 (Fig. 37) o Digestion after digestion with BamHI The phosphorylated plasmid pGKAPH2, 200 ng, and the 3-7 kb of the candidate lysate ATCC 9950 obtained in Example 2 were compared. 200 ng of the Sau3AI partial digestion fragment of the genomic DNA was ligated with T4 DNA ligase. Using this DNA solution, Escherichia coli DH5 was transformed, and a plasmid DNA mixture was extracted from about 300,000 transformants obtained, and a chromosomal DNA mixture was extracted. I made a library. Using the DNA prepared from this library, the ATCC 9950 strain was tried to be transformed by the electropulse method described in Example 11. The pulse condition is a capacitance of 25 // F, a resistance of 800 ohm or 100 ohm and a voltage of 3.75 KV cm or 5 KVZ cm. Then 25 one
4 通 り と し 、 そ れ ぞれ D N A を 3 g 使用 し て行 っ た 。 こ れ に よ り G 4 1 8 耐性 を 示す コ ロ ニ ー が計 7 株得 ら れ た 。 こ れ ら 耐性株 を 4 0 0 g / m l の G 4 1 8 を 含む Y P D 培地で培養 し 、 菌体 よ り 全 D N A を 調製 し 、 大腸 菌 D H 5 を形質転換 し た 。 酵母染色体 D N A の 調製 は 、 Me t h o d s i n Y e a s t G e n e t i c s - A l a b o r a t o r y C o u r s e Ma nu a l - Ro s e M. D e t a 1. P 131 - 132 C o l d S p r i n Four replicates were carried out, each using 3 g of DNA. As a result, a total of seven clones exhibiting G418 resistance were obtained. These resistant strains were cultured in a YPD medium containing 400 g / ml of G418, all DNA was prepared from the cells, and Escherichia coli DH5 was transformed. The yeast chromosome DNA was prepared according to the following method: MethodsinYeastGenetics -AlaboratoryCours e Manual -RosE M.Deta 1.P 131-132 ColdSprin
Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s NYに 記載 の 方法 に 従 っ た 。 大 腸菌 か ら 回収 さ れ た 7 種類 の ブ ラ ス ミ ド D N A ( p C A R S 1 、 p C A R S 4 、 p C A R S 5 、 p C A R S 6 p C A R S 7 、 p C A R S 8 、 お よ び p C A R S l O ) は い ず れ も 5 - 7 k b の ィ ン サ ー ト を 含む こ と が各種制 限酵素消化 に よ り 明 ら か に さ れ、 ま た 、 こ れ ら プ ラ ス ミ ド D N A を 用 い て A T C C 9 9 5 0 株 の 形質転換 を 電気 パ ル ス 法 に よ り 試 み た と こ ろ 、 い ずれ の プ ラ ス ミ ド The method described in Harbor LarabortoryPryss NY was followed. Seven types of plasmid DNA recovered from E. coli (p CARS 1, p CARS 4, p CARS 5, p CARS 6 p CARS 7, p CARS 8, and p CARS 10) All of them contain various inserts of 5-7 kb, which have been clarified by various restriction enzyme digestions and use of these plasmid DNAs. When the transformation of the ATCC 9950 strain was attempted by the electric pulse method, it was confirmed that any of the plasmids
D N A に つ い て も G 4 1 8 耐性 の 形質転換体が得 ら れ た こ の こ と か ら 、 こ れ ら プ ラ ス ミ ド 中 に 自 律複製機能 を 有 す る D N A 配列 力く ク ロ ー ン 化 さ れ て い る こ と 力く確認 さ れ た 。 各種制 限酵素 消化 に よ る 解析 に よ り 、 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド の う ち p C A R S 7 と p C A R S 8 と が 同一の ィ ン サ ー ト を 含 む プ ラ ス ミ ド で あ る こ と が 明 ら か に さ れ た こ れ ら の 結果 よ り 、 キ ヤ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母 内 で 自 律複製機能 を 有す る D N A 断片 が 6 種類 ク ロ ー ニ ン グ さ れ た こ と 力く 明 ら 力、 に さ れ た 。 ま た、 実施例 9 記載の プ ラ ス ミ ド p C L B S l O (図 1 5 ) を ベ ク タ ー と し て キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス酵母 染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し 、 プ ラ ス ミ ド p G K A P H 2 ラ イ オ プ ラ リ ー と 同時 に 形質転換を行 っ た。 し か し な が ら 、 シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性の形質転換体 は全 く 得 ら れな か っ た。 こ の 結果か ら 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の A R S の特徴 と し て、 そ れを含む プ ラ ス ミ ドの細 胞 あ た り の コ ピ ー数が低 く 、 形質転換体を選択す る た め に数 コ ピ ー必要な シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子 と 組み合わせ た場合形質転換体を選択で き な い こ と が示 唆 さ れた。 From the fact that transformants resistant to G418 were obtained, the DNA sequence having an autonomous replication function in these plasmids was confirmed. It was strongly confirmed that it had been cloned. According to the analysis by various restriction enzyme digestions, p CARS 7 and p CARS 8 of these plasmids were found to be plasmids containing the same insert. These results clearly show that there are six types of autonomously replicating DNA fragments in Candida yeast strain yeast. -What was learned and the power of the light was increased. In addition, the plasmid pCLBS10 (FIG. 15) described in Example 9 was used as a vector to render the yeast chromosome DNA library. Was prepared and transformed simultaneously with the plasmid pGKAPH2 biopharmaceutical. However, no cycloheximide-resistant transformants could be obtained. From this result, it is clear that the number of copies per cell of the plasmid containing the ARS of the Canadian * utility is low, Cyclohexamide requires several copies to select for transformants. It suggests that transformants cannot be selected when combined with the transgenic L41 gene. It was done.
実施例 2 7 ： 自 律複製機能を有す る 配列 （ A R S ) を含 む D N A断片の短縮化 Example 27: Shortening of DNA fragment containing sequence (ARS) having autonomous replication function
実施例 2 6 で ク ロ ー ニ ン グ さ れた 自 律複製機能を有す る D N A 断片を含む プ ラ ス ミ ド 7 種類の う ち 、 高頻度で キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母を形質転換す る こ と がで き た プ ラ ス ミ ド 3 種類 （ p C A R S 5 、 p C A R S 6 、 お よ び p C A R S 7 ) に つ い て 、 さ ら に詳 し い解析を行 ま ず、 こ れ ら 3 種の プ ラ ス ミ ド に よ る 酵母形質転換頻 度を実施例 1 9 で作成 し た染色体組み込み型 プ ラ ス ミ ド p C L R A P H l を B g 1 H消化 し た D N A を コ ン ト 口 ー ル と し て調べた。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 β F 、 抵抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V / c m と し 、 D N A を 0 . l 〃 g 用 い て A T C C 9 9 5 0 株の形質転 換を行 っ た。 電気パ ル ス後の 培養 は 4 時間行 っ た。 そ の 結果 は表 7 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 Of the seven types of plasmids containing the DNA fragment having an autonomous replication function cloned in Example 26, candidacy was frequently performed. A more detailed analysis of the three plasmids (p CARS 5, p CARS 6, and p CARS 7) that could transform saccharomyces cerevisiae yeast was performed. Instead, the frequency of yeast transformation with these three plasmids was determined by digestion of the chromosomal integration plasmid pCLRAPHl prepared in Example 19 with Bg1H. The DNA was examined as a control. The pulse conditions are as follows: the electric capacity is 25 βF, the resistance value is 100 ohm, the voltage is 5 KV / cm, The ATCC 9950 strain was transformed using 0.1 μg of DNA. The culture after the electric pulse was performed for 4 hours. The results were as shown in Table 7.
表 7 各種 AR Sプラス ミ ドの形質転換頻度 プラス ミ ド コロニー数  Table 7 Transformation frequency of various ARS plasmids plus plasmid colonies
p C A R S 5 6 4 5 0  p C A R S 5 6 4 5 0
p C A R S 6 9 5 0 0  p C A R S 6 9 5 0 0
p C A R S 7 4 7 0 0  p C A R S 7 4 7 0 0
p C L R A P H 4 0 0 注 1 ) l // gプラス ミ ド D N Aあたりの形質転換体数 注 2) p C L RA P H lは B g lll で分解して用いた こ の結果 よ り 、 A R S を含ん だ プ ラ ス ミ ド を用 い る こ と に よ り 、 r D N A を タ ー ゲ ッ ト と し た D N A の 組込み よ り さ ら に 1 0 倍か ら 4 0 倍程度高 い形質転換頻度が得 ら れ る こ と が示 さ れた。  p CLRAPH 400 Note 1) l // Number of transformants per g plasmid DNA Note 2) p CLRA PHl was digested with Bglll and used, and ARS was included. By using plasmid, the transformation frequency can be 10 to 40 times higher than the integration of DNA using rDNA as a target. It was shown that it could be done.
ま た、 こ れ ら プ ラ ス ミ ド p C A R S 5 、 p C A R S 6 お よ び p C A R S 7 を N o t I 消ィ匕 し 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 再 び環状化す る こ と に よ り 、 P G K遺伝子 プ 口 モ ー タ ー 、 A P T遺伝子、 お よ び P G K遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー を含む 3 . 3 k b の N o t I 断片を 除去 し た プ ラ ス ミ ド p C A R S 5 0 、 p C A R S 6 0 、 お よ び P C A R S 7 0 を構築 し た。 新た に 得 ら れた 3 種類の プ ラ ス ミ ド に つ い て種 々 の 制限酵素消化 に よ り イ ン サ一 ト の長 さ を調べた と こ ろ 、 イ ン サ ー ト の長 さ が いずれ も 約 5 — 6 k b で あ っ た た め、 自 律複製機能を有す る 領域を さ ら に 限定す る こ と と し た。 そ の た め に p C A R S 5 0 p C A R S 6 0 、 お よ び p C A R S 7 0 そ れぞれを S a u 3 A I で部分消化 し 、 1 一 3 . 5 k b の サ ィ ズ の 断片を 回収 し て、 B a m H I 消化後、 脱 リ ン 酸化 し た プ ラ ス ミ ド p G K A P H 2 と T 4 D N A リ ガ一ゼ に よ り 連 結 し た。 こ れ ら の 3 種類の D N A 溶液を用 い て大 Ma ^ D H 5 を形質転換 し て、 そ れぞれ得 ら れ た 2 , 5 0 0 - 6 ， 0 0 0 個 の形質転換体 よ り プ ラ ス ミ ド D N A 混合物 を抽 出 し て、 D N A ラ イ ブ ラ リ 一を作製 し / o れ ら D N A 5 g ずつ を用 い て実施例 1 1 記載の 電気パノレ ス 法に よ り 再 び A T C C 9 9 5 0 株の形質転換を行い、 G 4 1 8 耐性形質転換体を得 た In addition, these plasmids p CARS 5, p CARS 6 and p CARS 7 are Not I ligated and recircularized with T4 DNA ligase. The plasmid p CARS from which the 3.3 kb Not I fragment containing the PGK gene mouth motor, the APT gene and the PGK gene terminator has been removed. 50, p CARS 60, and PCARS 70 was constructed. When the insert length of the three newly obtained plasmids was determined by digestion with various restriction enzymes, the insert length was determined. However, since each of them was about 5-6 kb, we decided to further limit the region having autonomous replication function. For this purpose, p CARS 50 and p CARS 60 and p CARS 70 were each partially digested with Sau3AI, and a fragment of 113.5 kb in size was recovered. After digestion with BamHI, ligation was performed with the dephosphorylated plasmid pGKAPH2 and T4 DNA ligase. Using these three types of DNA solutions, large Ma ^ DH5 was transformed, and 2,500--6,000 transformants obtained from each were used. A plasmid DNA mixture was extracted to prepare a DNA library./ Using 5 g of each of these DNAs, the DNA was re-used by the electric panoretic method described in Example 11 Transformation of ATCC 9950 strain yielded G418 resistant transformants
得 ら れた G 4 1 8 耐性の コ ロ ニ ー は さ ま ざ ま な 大 き さ 力、'ら な っ て い たが、 3 種類の ラ イ ブ ラ リ ー に つ い て比較 的大 き な コ ロ ニ ー を形成 し た株そ れぞれ 5 株を 2 0 0 を 含む Y P D培地 で培養 し た。 得 ら れ た菌体 よ り 全 D N A を調製 し 、 大腸菌 D H 5 を形質転 換 し た。 一部の G 4 1 8 耐性株 に つ い て は大腸菌形質転 換体が得 ら れな か つ た。 ま た、 こ れ ら 回収 さ れた プ ラ ス ミ ド を用 い て実施例 1 1 記載の 電気パ ル ス 法 に よ り 再 び A T C C 9 9 5 0 株の形質転換を ίτ つ た と こ ろ 、 そ れ ら の う ち 部 は、 元の プ ラ ス ミ ド、 ド ' Ρ C A R S 5 、 P C A R S 6 お よ び p C A R S 7 と 比較 し て形質転換頻度が 大幅 に 低か っ た た め 除外 し た。 最終的 に p C A R S 5 0 p C A R S 6 0 、 p C A R S 7 0 い ずれ に つ い て も 短縮 化 さ れた D N A 断片を含み、 かつ形質転換頻度が親ブ ラ ス ミ ド 同程度で あ る ブ ラ ス ミ ドが 1 種類ずつ 得 ら れた そ し て P C A R S 5 0 由来の プ ラ ス ミ ド を p C A R S 5 一 2 と p C A R S 6 0 由来の ブ ラ ス ミ ドを p C A R S 6 - 2 、 そ し て P C A R S 7 0 由来の プ ラ ス ミ ド を p C A R 7 - 2 と 、 そ れぞれ命名 し た。 得 ら れた 6 種類 の ブ ラ ス ミ ド 中 の 、 自 律複製機能を有す る 配列を含む染 色体 D N A 断片の制限酵素地図 は図 3 8 に示 さ れ る 通 り で あ つ た The resulting G418 resistant colonies were of various magnitudes and strengths, but were relatively large for the three libraries. Five strains, each of which formed a colony, were cultured in a YPD medium containing 200 cells. Total DNA was prepared from the obtained cells, and E. coli DH5 was transformed. Escherichia coli transformants could not be obtained for some G418 resistant strains. Also, using the recovered plasma, the electric pulse method described in Example 11 was repeated to re-use the electric pulse method. When the ATCC 9950 strain was transformed, some of these were compared to the original plasmid, do CARDS 5, PCARS 6 and p CARS 7. The transformation frequency was so low that it was excluded. Finally, both p CARS 50 and p CARS 60 and p CARS 70 contain truncated DNA fragments and have a transformation frequency similar to that of the parent plasmid. One type of plasmid was obtained, and the plasmid derived from PCARS 50 was designated as p CARS 52 and the plasmid derived from p CARS 60 was designated as p CARS 6-2. The plasmid derived from PCARS70 was designated as pCAR7-2. Restriction enzyme maps of the chromosomal DNA fragments containing sequences with autonomous replication functions in the obtained six types of plasmids were as shown in Figure 38.
こ れ ら の プ ラ ス ミ ドの う ち 染色体 D N A 断片の短縮化 さ れた 3 種類の プ ラ ス ミ ド P C A R S 5 — 2 、 p C A R S 6 - 2 、 お よ び p C A R 7 — 2 に つ い て、 さ ら に 挿入 D N A 断片を短縮化 し た プ ラ ス ミ ド を構築 し 、 形質転換 頻度を調ベ た （実施例 2 8 ) 。 し か し 、 こ の 過程で構築 し た一部の プ ラ ス ミ ド に つ い て部分塩基配列 を決定 し た と こ ろ 図 3 8 に お い て P C A R S 5 の B g 1 11サ イ ト よ り 左側 の 領域約 7 0 0 b p が、 p C A R S 6 — 2 の E c 0 R I サ イ ト よ り 左側 の 領域約 7 0 O b p と 9 0 % 以上の相同性を示 し た。 こ の 結果か ら 、 P C A R S 5 と p C A R S 6 の挿入 D N A断片 は互 い に制限酵素地図 は 一致 し な い も の の、 そ れ ぞれ相同染色体 ま た は反復配列 か ら 由来す る こ と が推察 さ れ た た め 、 以後の解析 は p C A R S 6 と p C A R S 7 挿入 D N A 断片 と に つ い て 行 う こ と と し た。 ま た、 P C A R S 6 に 含 ま れ る A R S 活性を持つ配列 を C U A R S 1 と 、 p C A R S 7 に含 ま れ る A R S 活性を持つ 配列 を C U A R S 2 と 、 そ れぞれ 命名 し た。 Of these plasmids, three types of plasmids, PCARS 5-2, p CARS 6-2, and p CAR 7-2, with shortened chromosomal DNA fragments, were used. In addition, a plasmid in which the inserted DNA fragment was further shortened was constructed, and the frequency of transformation was examined (Example 28). However, when the partial base sequence of some of the plasmids constructed in this process was determined, the Bg111 site of PCARS5 in Fig. 38 was determined. Approximately 700 bp of the region on the left side showed 90% or more homology with approximately 70 Obp of the region on the left side of the Ec0RI site of p CARS 6-2. From these results, PCARS 5 and Although the inserted DNA fragments of p CARS 6 did not correspond to each other in their restriction enzyme maps, it was inferred that they were derived from homologous chromosomes or repetitive sequences, respectively. The analysis was performed on p CARS 6 and the inserted DNA fragment of p CARS 7. Also, the sequence having ARS activity contained in PCARS 6 was named CUARS 1, and the sequence containing ARS activity contained in p CARS 7 was named CUARS 2, respectively.
実施例 2 8 ： p C A R S 6 、 P C A R S 7 挿入 D N A断 片 の 短縮化 と 形質転換頻度 と プ ラ ス ミ ド安定性 Example 28: Shortening of pNARS6 and PCARS7-inserted DNA fragments, transformation frequency and plasmid stability
( 1 ) p C A R S 6 挿入 D N A 断片の 短縮化 と 形質転換 頻度  (1) Shortening of pCARS6 inserted DNA fragment and transformation frequency
プ ラ ス ミ ド p C A R S 6 — 2 に ク ロ ー ン 化 さ れた ¾ a u 3 A I 部分消化 D N A 断片 は約 1 . 9 k b で あ つ The ¾au3AI partially digested DNA fragment cloned into plasmid pCARS6—2 is approximately 1.9 kb.
/ o よ つ て 、 自 律複製能を有す る 領域 を さ ら に 限定す る た め に、 C A R S 6 — 2 の イ ン サ ー ト 断片の一部を含 む 3 種類 の プ ラ ス ミ ド を構築 し た。 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド は '以下の よ う に構築 し た。 Thus, to further restrict the autonomous replication-capable region, three types of plasmids, including some of the insert fragments of CARS 6-2, were used. Was built. These plasmids were constructed as follows.
P C A R S 6 - 2 か ら A P T遺伝子発現 カ セ ッ ト を 含 む 3 . 3 k b の N 0 t I 断片を 除去 し て、 p C A R S 6 - 2 0 を構築 し た。 P C A R S 6 — 2 0 を A f l l lと X b a I と で消化 し た後、 ク レ ノ ゥ 酵素で末端を平滑化 し て T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 再環状化 し て プ ラ ス ミ ド p C A R S 6 - 2 1 0 を構築 し た。 こ の プ ラ ス ミ ド に 、 実施例 1 9 で構築 し た プ ラ ス ミ ド p G K A P H l の プ 口 モ ー タ ー 断片内'の E c 0 R I サ イ ト を ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平滑化 し 、 そ の 後 N o t I リ ン カ 一 The 3.3 kb N0tI fragment containing the APT gene expression cassette was removed from PCARS 6-2 to construct p CARS 6-20. After digesting PCARS 6 — 20 with Aflll and XbaI, the ends are blunted with Klenow enzyme, recircularized with T4 DNA ligase, and purified. The construction of p CARS 6-210 was carried out. In this plus, The Ec0RI site in the open motor fragment of the plasmid pGKAPHl constructed in Example 19 was smoothed by Klenow enzyme treatment, and After Not I Linker
( 5' AGCGGCCGCT3' ： 配列番号 ： 1 8 ) を連結 し て構築 し た プ ラ ス ミ ド P G K A P H 3 か ら 切 り 出 さ れ る 短縮化 さ れた P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー に よ る A P T遺伝子発現 カ セ ッ ト を含む 2 . 3 k b の N o t l 断片を連結す る こ と に よ っ て、 p C A R S 6 — 2 1 を構築 し た。 ま た P C A R S 6 — 2 0 と P C A R S 6 — 2 1 を そ れぞれ H i n d I 1 I 消ィヒ し て T 4 D N A リ ガ ー ゼに よ り 再環状 化 し た後、 同様 に P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー に よ る A P T遺伝子発現 カ セ ッ ト を 含む 2 . 3 k b の N o t I 断片を連結す る こ と に よ っ て、 P C A R S 6 — 2 2 お よ び P C A R S 6 — 2 3 を構築 し た。 こ れ ら 5 種類の プ ラ ス ミ ド に 含 ま れ る 挿 入 D N A 断 片 の 制 限酵素地図 は 図 3 9 に示 さ れ る 通 り で あ っ た。  (5'AGCGGCCGCT3 ': SEQ ID NO: 18) by the shortened PGK gene promoter cut out from the plasmid PGKAPH3 constructed by linking P CARS 6—21 was constructed by ligating a 2.3 kb Notl fragment containing the APT gene expression cassette. PCARS 6-20 and PCARS 6-21 were re-circularized with T4 DNA ligase after Hind I 1 I deletion, respectively. By ligating a 2.3 kb NotI fragment containing the APT gene expression cassette from the rotor, PCARS 6—22 and PCARS 6—2 3 Was built. The restriction enzyme maps of the inserted DNA fragments contained in these five plasmids were as shown in Figure 39.
次に構築 し た各プ ラ ス ミ ド を用 い て、 実施例 1 1 記載 の' ¾気パ ル ス 法 に よ り 、 A T C C 9 9 5 0 株の形質転換 実験を行な っ た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 F 、 抵 抗値を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V Z c m と し 、 D N A は l // g 用 い て行 っ た。 電気パ ル ス後の 培養 は 4 時間行 っ た。 そ の 結果 は表 8 に 示 さ れ る 通 り で あ つ た。 表 8 PCARS6由来各種プラスミ ドの形 «^換 と安定性 Next, using the constructed plasmids, an ATCC 9950 strain transformation experiment was carried out by the aerial pulse method described in Example 11. The pulse conditions were a capacitance of 25 F, a resistance of 100 ohms, a voltage of 5 KVZ cm, and DNA for l / g. The culture after the electric pulse was performed for 4 hours. The results were as shown in Table 8. Table 8 Shapes and stability of various plasmids derived from PCARS6
1 β gプラスミ ド DN Aあたりの形質転換体数 プラス ミ ドの安定性 Transformants per 1 βg plasmid DNA Plus plasmid stability
プラスミ ド uロニー数 (%) プラスミ ド % p CARS 6 1093 (100) p CARS 6 21. 4 p CARS 6- 2 710 (65) p CARS 6-2 31. 9 p CARS 6- 21 137 (13) p CARS 6-21 29. 0 p CARS 6- 22 253 (23) p CARS 6-22 11. 0 p CARS 6— 23 25 (2) p CARS 6-23 3. 9 注 1)値は 2回の形質転換実験の平均値を示す。 注） 世 f ^Cは 2. 5〜3. 5世代の間 ま た 、 各 ブ ラ ス ミ ド の 酵母内安定性を次の よ つ に調べ Plasmid u Ronnie (%) Plasmid% p CARS 6 1093 (100) p CARS 6 21.4 p CARS 6- 2 710 (65) p CARS 6-2 31.9 p CARS 6- 21 137 (13) p CARS 6-21 29.0 p CARS 6-22 253 (23) p CARS 6-22 11.0 p CARS 6—23 25 (2) p CARS 6-23 3.9 Note 1) The average value of the transformation experiment is shown. Note: During the 2.5-3.5 generation, f ^ C was used to examine the stability of each plasmid in yeast as follows.
ら れた G 4 1 8 耐性の コ ロ ニ ー ¾· 4 m 1 の Y P D 培地 に 植菌 し 、 3 0 °C で 8 時間振 と う 培養 し た。 そ の後 The obtained G418 resistant colony was inoculated into 4 ml of YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C for 8 hours. afterwards
Y P D プ レ ー ト G 4 1 8 を 含む Y P D プ レ ー ト と に 菌を そ れぞれ塗布 し て、 2 日 後生 じ た コ ロ ニ一数を比較 す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド の 保持率を求め O ^FZ. ，よ 表 8 に 示 さ れ る 通 り で あ つ た。 こ の 間、 菌 は 2 . 5 -The bacteria were applied to the YPD plate containing the YPD plate G418, respectively, and the number of colonies generated two days later was compared. The retention rate of the smid was calculated, and the results are shown in Table 8 below. During this time, the bacteria are 2.5-
3 . 5 回分裂 し た こ と が培養液の 吸光度 ¾ 調ベ る こ と に よ 'り 示 さ れた。 こ の結果か ら 、 P C A R S 6 — 2 の挿入The fact that the culture was split 3.5 times was shown by the change in the absorbance of the culture solution. From this result, the insertion of PCARS 6-2
D N A 断片 を左右 側 よ り そ れぞれ短縮化 し た プ ラ ス ミ ド' p C A R S 6 一 2 1 お よ び p C A R S 6 - 2 2 の う ち p C A R S 6 - 2 1 の 安定性 は p C A R S 6 一 2 と 同程 度で あ つ た が、 ど ち ら も 形質転換頻度が大 き く 低下す る こ と が示 さ れ た o « た、 挿入 D N A 断片を 0 . 6 k b p ま で短 く し た C A R S 6 - 2 3 で は形質転換頻度 は さ ら に 低下 し 、 P C A R S 6 の 5 0 分の 1 以下 に 低下す る こ と が示 さ れた こ れ ら の結果か ら 、 p C A R S 6 〖こ 含 ま れ る C U A R S 1 は、 p C A R S 6 — 2 の 約 1 . 9 k b 長 さ の D N A 断片 よ り 短縮化す る こ と が困難であ る こ と が示唆 さ れた。 The stability of p CARS 61-2 and p CARS 6-22, which are plasmids obtained by shortening the DNA fragment from the left and right sides respectively, is p Although comparable to CARS 612, both were shown to greatly reduce the frequency of transformation.o In addition, the inserted DNA fragment was shortened to 0.6 kbp. With reduced CARS 6-23, the frequency of transformation was further reduced to less than 50-fold less than PCARS6. These results indicate that CUARS 1 containing p CARS 6 is shorter than the approximately 1.9 kb long DNA fragment of p CARS 6-2. It was suggested that it was difficult to do so.
( 2 ) P C A R S 7 挿入 D N A 断片の 短縮化 と 形質転換 頻度  (2) Shortening of PCARS7 inserted DNA fragment and transformation frequency
プ ラ ス ミ ド、 P C A R S 7 一 2 に ク ロ ー ン化 さ れた S a u 3 A I 部分消化 D N A 断片 は約 3 . 5 k b で あ っ た。 よ つ て、 自 律複製能を有す る 領域を さ ら に 限定す る た め に p C A R S 7 一 2 の イ ン サ ー ト 断片の一部を含む 5 種類 の ブ ラ ス ミ ド を構築 し た。 こ れ ら の プ ラ ス ミ ド は以下の よ う に構築 し た。 The Sau3AI partially digested DNA fragment cloned into plasmid, PCARS72, was approximately 3.5 kb. Therefore, in order to further restrict the region capable of autonomous replication, five types of plasmids containing a part of the insert fragment of p CARS712 were constructed. did. These plasmids were constructed as follows.
P C A R S 7 — 2 か ら 、 A P T遺伝子発現 カ セ ッ ト を 含む 3 . 3 k b の N 0 t I 断片 を 除去 し た プ ラ ス ミ ド p C A R S 7 一 2 0 を構築 し た。 こ の P C A R S 7 — 2 0 を X b a I 消化後、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 再環 状化 し 、 そ の後 2 . 3 k b の A P T遺伝子発現 カ セ ッ ト を '含む N o t I 断片を連結す る こ と に よ り P C A R S 7 一 4 を構築 し た。  A plasmid pCARS720 from which a 3.3 kb N0tI fragment containing an APT gene expression cassette was removed was constructed from PCARS7-2. After digesting this PCARS 7 — 20 with XbaI, recircularization was performed with T4 DNA ligase, followed by a Not containing a 2.3 kb APT gene expression cassette. PCARS74 was constructed by ligating the I fragments.
ま た 、 C A R S 7 - 2 0 よ り 、 約 1 . 8 k b の  Also, according to CARS 7-20, about 1.8 kb
E c 0 R V - H i n d 1 I 1 断片、 約 1 . 3 k b の X b a I 一 H i n d I I I 断片、 お よ び約 1 . 8 k b の H i n d Ec0RV-Hind1I1 fragment, about 1.3 kb XbaI-I HindIII fragment, and about 1.8 kb Hind
B g 1 11断片を切 り 出 し 、 そ れぞれ、 E c o R V お よ び H i n d m 、 x b a I お よ び H i n d 111 、 な 34 一 The Bg111 fragments were cut out and Eco RV and Hindm, xbaI and Hind111, respectively. 34 one
ら び に H i n d 111 お よ び B a m H I で消化 し た And digested with Hind111 and BamHI.
p B l u e s c r i p t I I ¾ K 一 (S t r a t a gen ej に連結 し た。 そ の後、 短縮化 さ れた P G K 遺伝子 プ ロ モ一 タ ー に よ る A P T 遺伝子発現 力 セ ッ ト を 含む 2 . 3 k b の  pBluescript II ¾K-I (ligated to Strata gen ej. 2.3 kb containing the APT gene expression set by the shortened PGK gene promoter. of
N o t I 断片を連結す る こ と に よ り p C A R S 7 - 6 、  By linking the NotI fragments, pCARS7-6,
P C A R S 7 - 7 、 お よ び P C A R S 7 — 8 を構築 し た こ れ ら 6 種類の プ ラ ス ミ ド に 含 ま れ る 挿入 D N A 断片の 制限酵素地図 は図 4 0 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た  Restriction enzyme maps of the inserted DNA fragments contained in these six types of plasmids that constructed PCARS 7-7 and PCARS 7-8 were as shown in Figure 40. Met
構築 し た各 プ ラ ス ミ ド を用 い て、 実施例 1 1 記載の電 気パ ル ス 法 に よ り 、 A T C C 9 9 5 0 株の形質転換実験 を行な っ た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 F 、 抵抗値 を 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧 を 5 K V / c m と し 、 D N A を l " g 用 い て行 っ た。 電気パ ル ス 後の 培養 は 4 時間行 つ た。 そ の結果を表 9 に 示 し た。  Using each of the constructed plasmids, a transformation experiment of the ATCC 9950 strain was performed by the electric pulse method described in Example 11. The pulse conditions were as follows: the electric capacity was 25 F, the resistance value was 100 ohms, the voltage was 5 KV / cm, and the DNA was used for l "g. The culture was performed for 4 hours, and the results are shown in Table 9.
表 9 p CARS 7由来各種プラスミ ドの形 換^と安定性 Table 9 Transformation and stability of various plasmids derived from p CARS 7
1 β gプラスミ ド DNAあたりの形 «¾換^« プラス ミ ドの安定性 1 β g plasmid per DNA «¾ 化 ^« Plasmid stability
プラスミ ド コロニ—数 (%) プラスミ ド % p CARS 7 1833 (100) p CARS 7 23. 0 p CARS 7- 2 1273 (69) p CARS 7-2 34. 9 p CARS 7 - 4 0 (0) p CARS 7-6 18. 6 p CARS 7- 6 598 (33) p CARS 7-7 11. 4 p CARS 7- 7 * 280 (15) p CARS 7-8 7. 0 p CARS 7 - 8 5 (0. 2) 注） 世代数は 2. 5〜3. 5世代の間 注 1)値は 2回の形質転換実験の平均値を示す c Plasmid Colony Number (%) Plasmid% p CARS 7 1833 (100) p CARS 7 23.0 p CARS 7-2 1273 (69) p CARS 7-2 34.9 p CARS 7-4 0 (0) p CARS 7-6 18.6 p CARS 7-6 598 (33) p CARS 7-7 11.4 p CARS 7-7 * 280 (15) p CARS 7-8 7.0 p CARS 7-8 5 ( 0.2) Note) The number of generations is between 2.5 and 3.5 generations Note 1) The value is the average of two transformation experiments c
注 2) *はコロニーの大きさ力非常に小さい。 ま た、 各 プ ラ ス ミ ド の酵母内安定性を次の よ う に調べ た。 得 ら れ た 0 4 1 8 耐性の u ロ ニ ー を 4 m 1 の Y P D 培地 に 植菌 し 、 3 0 °C で 8 時間振 と う 培養 し た。 そ の後 Y P D プ レ 、 G 4 1 8 を 含む Y P D プ レ ー ト と に 菌 を そ れぞれ塗布 し て、 2 日 後生 じ た コ ロ ニ一数を比較 す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド の 保持率を求め た （表 9 ) こ の 間、 菌 は 2 . 5 - 3 . 5 回分裂 し た こ と が培養液の 吸光度変化を調べ る こ と に よ り 示 さ れた o こ れ ら の 結果 カヽ り 、 p C A R S 7 — 2 ま た は p C A R S 7 一 6 に よ る 形質転換頻度 は、 p C A R S 7 の そ れ と 比較 し て 、 そ れ ぞれ約 7 0 %、 お よ び約 3 0 %程度 に 低下 し た。 し か し 安定性 は そ れ ほ ど悪化 し て い な い こ と が示 さ れた。 さ ら に D N A 断片を短 く し た p C A R S 7 一 7 に つ い て は、 p C A R S 7 - 6 の 2 分 の 1 程度の 形質転換頻度を示 し た も の の 、 生 じ た コ ロ ニ ー は微小で あ り 、 ま た、 安定性 も 悪か つ た (表 9 ) 。 一方、 p C A R S 7 - 8 に つ い て は頻度が悪 く 、 P C A R S 7 一 4 に つ い て は全 く 形質転 換'体が得 ら れな か つ た o れ ら の 結果力、 ら 、 p C A R S 7 に 含 ま れ る C U A R S 2 に つ い て は、 形質転換頻度 は や や低下す る も の の 、 p C A R S 7 - 6 の 1 . 8 k b に ま で短縮化で き る こ と が示 さ れ た 。 Note 2) * indicates very small colony size. In addition, the stability of each plasmid in yeast was examined as follows. The obtained 0418 resistant u-lone was inoculated into 4 ml of YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C for 8 hours. Then, the bacteria were applied to the YPD plate and the YPD plate containing G418, respectively, and the number of colonies generated two days later was compared. The retention rate of the plasmid was determined (Table 9). During this time, the bacteria split 2.5-3.5 times, which was shown by examining the change in the absorbance of the culture solution. Based on these results, the frequency of transformation with p CARS 7-2 or p CARS 76 was approximately 70%, respectively, compared to that of p CARS 7 % And about 30%. However, it was shown that the stability was not so degraded. In addition, p CARS 177, whose DNA fragment was shortened, showed a transformation frequency of about one-half that of p CARS 7-6, but the resulting colony.ー was very small and had poor stability (Table 9). On the other hand, the frequency of p CARS 7-8 was low, and that of PCARS 74-14 was that no 'transformant' was obtained. The transformation frequency of CUARS 2 contained in p CARS 7 is slightly reduced, but it can be shortened to 1.8 kb of p CARS 7-6. It was shown.
こ れ ら 2 つ の A R S の 短縮化 に 関す る 結果 は 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス酵母の A R S が 自 律複製能を示す に は約 2 k b 程度の かな り 長 い領域が必要で あ る こ と を意 36 一 The result of the shortening of these two ARSs is that the ARS of Candida utilis yeast has a long region of about 2 kb for autonomous replication. That you need 36 I
味 し て い る 。 こ れ は サ ッ カ ロ マ イ セ ス 酵母の A R S が約 2 0 0 b p で機能す る 事実 （ New I o n, C. R a n d T h e i s， J . C u r r e n t 0 p i n i o n i n G e n e t i c s a n d D e v e 1 o i e n t Ϊ 993 3, 752- 758 ) と 異な っ て お り 、 興味深 い特徴で あ る と い え る 。 I taste it. This is due to the fact that the Saccharomyces yeast ARS functions at about 200 bp (New Ion, C. R and T Heis, J. Current 0 pinionin Geneticsand Deve 1 oient Ϊ). 993 3, 752-758), which is an interesting feature.
実施例 2 9 ： P C A R S 6 - 2 お よ び p C A R S 7 - 6 の 自 律複製機能を有す る 配列 を含む D N A 断片の塩基配 列決定 と サザ ン解析 Example 29: Base sequence determination and Southern analysis of a DNA fragment containing a sequence having an autonomous replication function of PCARS 6-2 and pCARS 7-6
( 1 ) 自 律複製機能を有す る 配列 を 含む D N A 断片の 塩 基配列決定  (1) Base sequencing of DNA fragments containing sequences with autonomous replication functions
p C A R S 6 お よ び p C A R S 7 中 の 、 A R S 、 C U A R S 1 、 お よ び C U A R S 2 を 含む D N A 断片 に つ い て、 そ れ ぞれの 塩基配列 を決定 し た。 C U A R S 1 を 含む D N A と し て は p C A R S 6 - 2 の挿入 D N A 断 片 に つ い て、 C U A R S 2 を含む D N A と し て は  The nucleotide sequence of each of the DNA fragments containing ARS, CUARS1, and CUARS2 in pCARS6 and pCARS7 was determined. For DNA containing CUARS1, insert DNA fragment of pCARS6-2, and for DNA containing CUARS2, do not
p C A R S 7 一 6 の 挿入 D N A 断片 に つ い て 、 そ れぞれ 挿入 D N A 断片の 両側 か ら E X 0 I I I ヌ ク レ ァ ー ゼお よ び'マ ン グ ビ一 ン ヌ ク レ ア ー ゼを用 い た欠失変異作製法 に よ り 、 種 々 の 欠失変異 を も つ プ ラ ス ミ ドを作製 し て塩基 配列 を決定 し た。 決定 し た P C A R S 6 - 2 の 挿入 D N A 断片の塩基配列 は 図 4 1 と 4 2 と に、 C A R S 7 - 2 の 挿入 D N A 断片の 塩基配列 は 図 4 3 と 4 4 と に 示 さ れ る 通 り で あ つ た。 こ の う ち P C A R S 6 - 2 の挿入 D N A 断片 は 1 9 2 1 b p カヽ ら な り A + T の 全塩基 に対 す る 割合 は 6 9 . 5 % で あ り 、 p C A R S 7 一 2 の挿入p For the inserted DNA fragment of CARS 716, the EX0III nuclease and the 'Ming bin nuclease' from both sides of the inserted DNA fragment, respectively. By using the method for constructing deletion mutations, plasmids having various deletion mutations were prepared and their nucleotide sequences were determined. The determined nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of PCARS 6-2 is shown in Figs. 41 and 42, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of CARS 7-2 is shown in Figs. 43 and 44. It was. Of these, the inserted DNA fragment of PCARS 6-2 had a size of 1921 bp and was capable of binding to all A + T bases. The rate at which it was added was 69.5%, and the insertion of p CARS 72
D N A断片 は 1 7 8 8 b P 力、 ら な り A + 丁 の 全塩基 に対 す る 割合 は 7 0 . 8 % で あ り 、 い ずれの D N A も 非常 にThe DNA fragment had a power of 178 bP, and the ratio of all the bases in the A + to 70.8% was 70.8%.
A + T の割合が高 い こ と が示 さ れ た。 It was shown that the proportion of A + T was high.
=3 ン ピ ュ 一 夕 一 に よ る 解析 に よ り 、 A R S に認め ら れ る 1 1 b p の共通配列 （ T / A ) T T T A ( C / T ) ( A / G ) T T T ( T / A ) ( N e w I o n , C. R and T h e i s , J . Cu r r e n t 0 p i n i 0 n i n G e n e t i c s a nd D e v e 1 o p m e n t 1993 3, 152-758 ) と 比ベ る と、 一塩 ずつ異な る 配列 が、 p C A R S 6 一 2 で は 9 個分散 し て存在 し て い る こ と 、 ま た、 p C A R S 7 一 6 で は 1 3 個存在 し 、 そ の う ち 5 個が互 い に 重な り 合 い な が ら 存在 し て い る こ と が示 さ れた （図 4 1 〜図 4 4 ) o  = 3 Analysis of the whole sample overnight revealed that a 11 bp consensus sequence (T / A) TTTA (C / T) (A / G) TTT (T / A) found in ARS (New Ion, C.R. and Theis, J. Cu rrent 0 pini 0 nin Genetic nd D eve 1 opment 1993 3, 152-758), the sequence that differs for each salt is p In CARS 6-1 2, there are 9 scattered ones, and in p CARS 716, there are 13, and 5 of them overlap each other However, it was shown that it was present (Figs. 41 to 44) o
( 2 ) サザ ン 解析 に よ る コ ピ ー 数算定  (2) Calculation of the number of copies by Southern analysis
キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス酵母細胞内 に お い て、 A R S を含む ブ ラ ス ミ ドが何 コ ピ ー 存在す る かを調べ る た め に、 p C A R S 6 お よ び P C A R S 7 で形質転換 し た'キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 酵母か ら 調製 し た D N A に つ い てサザ ン解析を行 つ た （図 4 5 - 1 ) o ま た、 コ ピ 一数算定の た め の 内部標準 と し て P G K遺伝子を 用 い る こ と と し た の で、 P G K遺伝子 コ ピ ー数算定の た め の サ サ ン 解析 も 行 っ た (図 4 5 - 2 ) o  P CARS 6 and p CARS 6 to determine how many copies of the plasmid containing ARS are present in Candida utilis yeast cells Southern analysis was performed on DNA prepared from 'Candida dutilus yeast transformed with PCARS 7 (Fig. 45-1). Since the PGK gene was used as the internal standard for calculating the number of copies of the PGK gene, a sanitary analysis was also performed to calculate the number of copies of the PGK gene (Fig. 45). -2) o
P G K遺伝子 コ ピ ー 数算定の た め の サザ ン 解析 は、 実 施例 1 8 記載の プ ラ ス ミ ド、、 P C L L A C 1 を P G K プ 口 モ ー タ ー 内 の S p h I サ イ ト で消化 し た後、 こ の ブ ラ ス ミ ドで形質 ΙΪ換 し た A T C C 9 9 5 0 株、 2 株 と 、 対 照 と し て親株 と か ら そ レ し 1¾製 し た D N A に つ い て行 つ た。 S a i l + N 0 t I 消化 し た D N A に つ い て実施 例 4 記載の P G K P T 4 か ら 切 り 出 さ れ る P G K プ ロ モ 一 タ ー を含む 0 . 4 k b の E c 0 R I - X b a I 断片を プ ロ 一 ブ と し た tj 、 親株の A T C C 9 9 5 0 株で は 内 在性 P G K 遺伝子由 来の 3 . 2 k b の バ ン ドが認 め ら れ た （図 4 5 - 2 、 レ 一 ン 1 ) o ―方、 P G K プ ロ モ ー タ 一内 の 5 p h I サ ィ ト で消化 し た p C L L A C 1 を組み 込ん だ株で は こ の 3 . 2 k b の バ ン ド の ほか に、 タ ン デ ム に 複数個組み込 ま れ た プ ラ ス ミ ド か ら N 0 t I 消化 に よ り 生 じ る 5 . 4 k b の バ ン ド と 、 染色体上の P G K遣 伝子の う ち 1 個がプ ラ ス ミ ド の 挿入 に よ り 分断 さ れて生 じ る 6 . 4 k b お よ び 2 . 1 k b の 2 本の バ ン ドが検出 さ れ た ( レ ー ン 2 、 3 れ ら 6 . 4 k b お よ び 2 . 1 k b の 2 本の バ ン ド は、 組み込 ま れ た プ ラ ス ミ ド 分子の両末端 に 位置す る プ ラ ス ミ ド分子内 の N 0 t I サ ィ 卜 と P G K 遺伝子領域内 の S a 1 I サ イ ト と カヽ ら 生ず る も の で あ る こ と か ら 、 プ ラ ス ミ ド分子が相 同組換え に よ り P G K 遺伝子座 に 組み込 ま れ た こ と が示 さ れ た。 The Southern analysis for calculating the number of PGK gene copies was performed using the plasmid described in Example 18 and PCLLAC 1 as the PGK program. After digestion with the SphI site in the mouth motor, the ATCC 9950 and 2 strains transformed with this plasmid were compared with the parental strain. Then, the DNA prepared in 1¾ was obtained. Sail + N0tI 0.4 kb Ec0RI-X containing PGK promoter cut out from PGKPT4 described in Example 4 for DNA digested with digestion A 3.2 kb band derived from the endogenous PGK gene was observed in the tj containing the baI fragment as a probe and in the parent strain ATCC 9950 (Fig. 45- 2, lane 1) This 3.2 kb band is used for the strain incorporating pCLLAC1 digested with 5 ph I site in the PGK promoter. In addition to the above, a 5.4 kb band generated by N0tI digestion from a plasmid integrated into multiple tandems and a PGK gene on the chromosome Two 6.4 kb and 2.1 kb bands, one of the offspring resulting from the insertion of the plasmid, were detected. 2 and 3 are 6.4 kb and 2.1 kb, and the two bands are N 0 t I site in the plasmid molecule located at both ends of the inserted plasmid molecule and S a 1 I site in the PGK gene region This indicated that the plasmid molecule was integrated into the PGK locus by homologous recombination.
ィ メ 一 ジ ン グ ア ナ ラ ィ ザ一 B A S 2 0 0 0 ( F U J I F I L M ) を用 い て各バ ン ド の 強度 を 測定 し た と こ ろ 、 形質 転換体で は 内在性 P G K 遺伝子 由 来の 3 . 2 k b の バ ン ド、 と 、 染色体 に組み込 ま れた プ ラ ス ミ ド分子の両末端の プ ラ ス ミ ド、 由来の 6 . 4 k b お よ び 2 . 1 k b の バ ン ド の 濃 さ が ほ ぼ一致す る こ と か ら 、 P G K遣伝子 は細胞あ た り 2 コ ピ 一 存在 し 、 形質転換体で は そ の う ち 1 コ ピ ー が プ ラ ス ミ ド D N A の挿入 に よ り 分断 さ れた こ と が示 さ れた。 ま た 、 プ ラ ス ミ ド の タ ン デ ム 組み込み に よ る 5 . 4 k b の ン ド と 6 . 4 k b と 2 . 1 k b の バ ン ド の 濃 さ の 比較カ、 ら 、 組み込 ま れた プ ラ ス ミ ドの コ ピ ー数 は約 4 コ ピ 一 で あ る こ と が示 さ れた When the strength of each band was measured using BAS2000 (FUJIFILM), it was found that in the transformants, the endogenous PGK gene was derived from the endogenous PGK gene. 3.2 kb band And the 6.4 kb and 2.1 kb bands from the plasmids at both ends of the plasmid molecule integrated into the chromosome. Because of the agreement, there are two copies of the PGK gene per cell, one of which in the transformants was disrupted by insertion of the plasmid DNA. What was done was shown. In addition, the 5.4 kb band and the 6.4 kb and 2.1 kb band density comparisons due to the tandem incorporation of the plasmid are compared. It was shown that the number of copies of the plush plasmid was about 4 copies.
P c A R S 6 お よ び P C A R S 7 で形質転換 し た A T C C 9 9 5 0 株 D N A を E c 0 R V + N 0 t I 消化 し 、 実施例 4 記載の p G K P T 4 か ら 切 り 出 さ れ る P G K 夕 一 ミ ネ 一 タ ー を含む 0 . 9 k b X b a I - N 0 t I 断片を プ ロ ー ブ と し て サザ ン 解析を行 つ た。 そ の結果 は 図 4 5 - 1 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 親株の A T C C 9 9 5 0 株で は 内在性 P G K 遺伝子由来の約 7 k b の バ ン ドが認め ら れた （図 4 5 ン 3 ) 形 質転換体 に お い て は約 7 k b の バ ン ド の他 に プ ラ ス ミ ド 由来の 3 . 3 k b の バ ン ドが認め ら れ た 。 7 k b と 3 . 3 k b の ン ド の 濃 さ の比較か ら 、 P G K 遺伝子 由 来の バ ン ド を 2 コ ピ ー と す る と 、 P C A R S 6 の コ ピ ー 数 は 1 ( レ ー ン 1 ) 、 P C A R S 7 の コ ピ ー数 は 0 . 4 ( レ一 ン 2 ) と 計算 さ れた。 p C A R S 7 の コ ピ ー数が 1 以下 と な た の は、 菌培養時の プ ラ ス ミ ド分子の 脱落 に よ る も の と 考え ら れ る 。 こ の結果か ら 、 C U A R S を 含む ブ ラ ス ミ 、 は細胞 あ た り 、 1 コ ピ ー 程度存在す る と 考え ら れた。 The DNA of ATCC 9950 strain transformed with PcARS6 and PCARS7 is digested with Ec0RV + N0tI and cut out from pGKPT4 described in Example 4. Southern analysis was carried out using a 0.9 kb XbaI-N0tI fragment containing PGK evening mineral as a probe. The result was as shown in Figure 45-1. In the parent strain ATCC 9950, a band of about 7 kb derived from the endogenous PGK gene was observed (Fig. 45-3). In the transformant, a band of about 7 kb was detected. In addition to the plasmid, a 3.3 kb band derived from plasmid was observed. From a comparison of the 7 kb and 3.3 kb band densities, if the band derived from the PGK gene is 2 copies, the number of PCARS 6 copies is 1 (lane 1 ), The number of copies of PCARS 7 was calculated to be 0.4 (lane 2). The reason why the number of copies of p CARS 7 was 1 or less was that the plasmid molecules were lost during culture of the bacteria. It is thought to be due to From these results, it was considered that about 1 copy of the brain containing CUARS was present per cell.
( 3 ) 染色体上での A R S の 存在様式  (3) Existence of ARS on chromosome
H i n d i l l 消化 し た A T C C 9 9 5 0 株、 9 2 2 6 、 9 2 5 6 株、 K P - 2 0 5 9 P 株、 お よ びサ ッ カ ロ マ イ セ ス • セ レ ビ シ ェ S 2 8 8 C 株め 各種染色体 D N A 対 し て 、 サザ ン 解析を行 つ た。 プ ロ ー ブ と し て、 Hindill digested ATCC 9950, 922, 926, KP-209P, and Saccharomyces • Celleviche S Southern analysis was performed on various chromosomal DNAs of the 288C strain. As a probe,
C U A R S 1 と し て P C A R S 6 - 2 2 の 1 . 3 k b 挿 入 D N A断片を X b a I と H i n d I I 1 に よ り 切 り 出 し 断片 （図 3 9 ) を 、 C U A R S 2 と し て P C A R S 7 6 の 1 . 8 k b E c o R V - H i n d 111 断片 The 1.3 kb inserted DNA fragment of PCARS 6-22 as CUARS 1 was cut out with Xba I and Hind II 1 and the fragment (FIG. 39) was converted as CUARS 2 into PCARS 7 6 1.8 kb Eco RV-Hind 111 fragment
(図 4 0 ) を 、 そ れぞれ用 い て ノヽ イ ブ リ ダィ ゼ ー シ ヨ ン を行 っ た (図 4 6 ) o C U A R S 1 に つ い て は、  (Fig. 40) was subjected to noise reduction (Fig. 46) .o For CUARS1,
P C A R S 6 の制限酵素地図か ら 予想 さ れ る 2 k b の主 要 な バ ン ド以外 に p C A R S 5 の制限酵素地図か ら 予想 さ れ る H i n d m 断片の 長 さ に一致す る 1 . 6 k b の パ、 ン ドが認め ら れた （図 4 6 一 1 ) 。 一方、 C U A R S 2 に つ い て は p C A R S 7 の 制限酵素地図か ら 予想 さ れ る 2 . 5 k b の主要な バ ン ド以外 に ホ モ 口 ジ 一 の 高 い D N A配列がキ ヤ ン ァ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 酵母染色体上 に 1 0 3 ピ一程度存在す る と 共 に 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス 酵母 に も 多数存在す る こ と が示 さ れた （図 4 6 — 2 ) 。 こ の 果カヽ ら 、 C U A R S 2 は 広 く 保存 さ れ た配列で あ る 可 一一' 1 4 1 "― ' In addition to the 2 kb major band predicted from the PCARS 6 restriction map, 1.6 kb corresponds to the Hind fragment length predicted from the p CARS 5 restriction map. Of the target was confirmed (Fig. 46-11). On the other hand, in the case of CUARS2, a DNA sequence having a high homologous mouth in addition to the major 2.5 kb band predicted from the restriction enzyme map of pCARS7 is used as a carrier. It was shown that there are about 103 pieces on the chromosome of D. utilis yeast and a large number of Saccharomyces yeasts (Fig. 46). — 2) This suggests that CUARS 2 may be a widely conserved sequence. 11 "1 4 1"-"
能性が示唆 さ れ ま た、 洗浄条件を厳 し く す る こ と に よ り （ 0 . 1 X S S C 6 5 °C ) 主要な バ ン ド 以外の シ グ ナ ル は ほ と ん ど認め ら れな く な つ た （図 4 6 - 2 ) 0 . ま た、 こ れ ら の A R S が染色体 D N A 由 来で あ る か ど う かを ベ る た め に 、 パ ル ス フ ィ ー ル ド ゲ ル電気泳動法 で分離 し た キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 染色体 D N A に対 し てサザ ン 解析を行 つ た。 A T C C ' 9 9 5 0 株の D N A は 7 本 に分れた が、 C U A R S 1 は大 き い ほ う か り 6 番 目 の 染色体 に、 C U A R S 2 は 3 番 目 の染色体 に そ れぞ れ位置す る こ と が明 ら か に さ れ、 ク ロ ー ン化 し た A R S は染色体由 来で あ る こ と が明 ら か に さ れた The use of strict cleaning conditions (0.1 XSSC 65 ° C) indicated that most signals other than the main band were almost recognized. (Fig. 46-2) 0 In addition, to determine whether these ARSs are derived from chromosomal DNA, a pulse field was used. Southern analysis was performed on Candida utililis chromosomal DNA separated by gel electrophoresis. Although the DNA of ATCC '9905 strain was divided into seven lines, CUARS 1 is located on the sixth chromosome, and CUARS 2 is located on the third chromosome. And that the cloned ARS is chromosome-derived.
p C A R S 5 の挿入 D N A 断片 に つ い て は C U A R S I と 同様 に 6 番 目 の 染色体 に 位置す る こ と が示 さ れた。 実 施例 2 7 記載の シ一 ク ェ ン ス 解析か り 示唆 さ れた よ う に 、 こ れ ら p C A R S 5 と p C A R S 6 に ク ロ ー ン 化 さ れた A R S は相同染色体由来で あ る 可能性を支持す る 結 果 と な つ た o The inserted DNA fragment of pCARS5 was shown to be located on the sixth chromosome as in CUARSI. As suggested by the sequence analysis described in Example 27, these ARS cloned into p CARS 5 and p CARS 6 were derived from homologous chromosomes. O support the possibility of
実施例 3 0 ： A R S を利用 し た プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 断片の ク ロ ー ニ ン グ Example 30: Cloning of a DNA fragment having promoter activity using ARS
( 1 ) プ ロ モ ー タ ー検索ベ ク タ ー の構築  (1) Construction of a promoter search vector
実施例 2 8 で構築 し た プ ラ ス ミ ド P C A R S 6 — 2 0 よ り 、 自 律複製能を有す る 配列 を 含む D N A を 1 . 9 k b の S a c I — S m a I 断片 と し て切 り 出 し た。 こ の 断 片 を E c 0 R I サ イ ト を ク レ ノ ゥ 酵素処理 に よ り 平滑化 し た後、 さ ら に S a c I 消化 し た プ ラ ス ミ ド p A P H 1 (実施例 1 9 )' と 連結 し て プ ラ ス ミ ド p P C V l を構築 し た。 続い て p P C V l を B a m H I 消化 し て ク レ ノ ウ 酵素処理 に よ り 平滑化 し た後、 H p a I リ ン カ ー Based on the plasmid PCARS 6-20 constructed in Example 28, a DNA containing a sequence capable of autonomous replication was converted into a 1.9 kb SacI-SmaI fragment. Cut out. This fragment was smoothed by Ec0RI site treatment with Klenow enzyme. After that, the plasmid was ligated with SacI-digested plasmid pAPH1 (Example 19) ′ to construct plasmid pPCVl. Subsequently, pPCVl was digested with BamHI and blunted by Klenow enzyme treatment, followed by HpaI linker.
(5' GTTAAC3' )を挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド P P C V 2 を構築 し た （図 4 7 ) 。  (5 'GTTAAC3') was inserted to construct a plasmid PPCV2 (Fig. 47).
( 2 ) ラ イ ブ ラ リ ー の構築 と プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 断片の ク ロ ー ニ ン グ  (2) Library construction and cloning of DNA fragments having promoter activity
キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス A T C C 9 9 5 0 の 染色体 D N A を制限酵素 R s a l 、 H a e 111 、 お よ び  Chromosome DNA of Candida utilis ATCC 9950 is restricted to the restriction enzymes Rsal, Hae111 and
A 1 u I に よ り 、 同時 に部分消化 し た。 そ の後、 D N A 断片を 1 %の ァ ガ ロ ー ス ゲルで電気泳動す る こ と に よ り 分画 し 、 0 . 9 — 1 . 8 k b の長 さ の 断片を回収 し た。 こ の 部分消化 D N A断片 と 、 H p a I 消化 し て脱 リ ン酸 化 し た プ ラ ス ミ ド p P C V 2 と を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ に よ り 連結 し た。 こ の D N A 溶液を 用 い て大腸菌 D H 5 を形質転換 し て、 得 ら れた約 1 0 0 , 0 0 0 個の 形質転 換'体 よ り プ ラ ス ミ ド D N A混合物を抽 出 し て染色体 D N A ラ イ ブ ラ リ ー を作製 し た。 こ の ラ イ ブ ラ リ ー か ら 調製 し た D N A を 用 い て実施例 1 1 記載の電気パ ル ス 法 に よ り A T C C 9 9 5 0 株の 形質転換 を試み た。 パ ル ス 条件 は電気容量を 2 5 i F 、 抵抗値 は 1 0 0 0 オ ー ム 、 電圧 は 5 K V Z c m と し 、 D N A は 1 回 の パ ル ス あ た り 2 0 - 2 5 β g を 使用 し て行 っ た。 形質転換体の選択 は 2 0 0 g / 1 の G 4 1 8 を含む Y P D プ レ ー ト で行 い、 形質転換卖験 を繰 り 返す こ と に よ り 、 2 8 0 // g の D N A を使用 し て 合計 3 8 0 個 の形質転換体を取得 し た こ れ ら の形質転換体の う ち 比較的大 き な コ ロ ニ ー を形成 し た 8 4 株 に つ い て、 1 m g / m l の G 4 1 8 を含む Y P D プ レ ー ト で の 増殖を調べ た。 こ の う ち 、 増殖の良 か つ た株 1 株を 1 m g / m 1 の G 4 1 8 を含む Y P D 培地で培養 し 、 菌体 よ り 全 D N A を調製 し 、 大腸菌 D H 5 を形質転換 し た。 Partial digestion was performed simultaneously with A1uI. Thereafter, the DNA fragment was fractionated by electrophoresis on a 1% agarose gel, and a fragment having a length of 0.9 to 1.8 kb was recovered. This partially digested DNA fragment was ligated to a plasmid pPCV2 digested with HpaI and dephosphorylated by T4 DNA ligase. Using this DNA solution, Escherichia coli DH5 is transformed, and a plasmid DNA mixture is extracted from about 100,000 transformants obtained. A chromosomal DNA library was prepared. Using the DNA prepared from this library, transformation of the ATCC 9950 strain was attempted by the electric pulse method described in Example 11. The pulse conditions are a capacitance of 25 iF, a resistance value of 100 ohms, a voltage of 5 KVZ cm, and a DNA pulse of 20-25 βg per pulse. It was done using. Transformant selection Performed on a YPD plate containing 200 g / 1 G418, and repeated the transformation test, using a total of 280 // g DNA to achieve a total of 3 Of the 84 transformants from which 80 transformants were obtained, 1 mg / ml of G41 was used for 84 strains that formed relatively large colonies. Growth on YPD plates containing 8 was examined. One of the well-grown strains was cultured in YPD medium containing 1 mg / ml of G418, and the total DNA was prepared from the cells, and Escherichia coli DH5 was transformed. Was.
大腸 ¾力ヽ ら 回収 さ れた 1 2 種類の プ ラ ス ミ ド D N A、 す な わ ち P P C V 1 、 3 、 9 、 1 4 、 1 9 、 3 3 . 5 1 5 5 、 5 7 . 6 2 . 6 4 、 お よ び Ί 8 は、 いずれ も 0 . 9 - 1 . 8 k b の 挿入 D N A 断片を含む こ と が制限酵素 消化 に よ り 明 ら か に さ れた。 次 に、 プ ロ モ ー タ ー 活性を 有す る 配列 を含む D N A 断片を X b a I 消化 に よ り 切 り 出 し 、 p B 1 u e s c r i P t I I S K 一 (S t r a t a g e n e ) に 連結 し て得 ら れた プ ラ ス ミ ド に つ い て、 そ れ ら の 挿入 D'N A 断片の両側か ら 一部塩基配列 を決定 し た。 そ の結 果、 P P C V 3 3 お よ び p P C V 7 8 、 な ら び に p P C V 1 4 、 p P C V 5 1 、 お よ び p P C V 5 5 が、 そ れぞれ同一の D N A 断片を含む こ と が明 ら か と な つ た よ っ て、 最終的 に 9 種類の プ ロ モ一 タ ー 活性を有す る D N A 断片が ク ロ ー ン 化 さ れ た こ と が示 さ れた。  12 types of plasmid DNA recovered from colon intestines, ie, PPCV 1, 3, 9, 14, 14, 19, 33.5, 53.5, 57.6, 2 It was clarified by restriction enzyme digestion that both .64 and Ί8 contained an inserted DNA fragment of 0.9-1.8 kb. Next, a DNA fragment containing a sequence having promoter activity was excised by digestion with XbaI and ligated to pB1uescriPtIIISK (Stratagene). The nucleotide sequence of each of the inserted plasmids was determined partially from both sides of the inserted DNA fragment. As a result, PPCV33 and pPCV78, and pPCV14, pPCV51, and pPCV55 each contain the same DNA fragment. This clearly showed that nine types of DNA fragments having promoter activities were finally cloned.
ま た、 こ れ ら 9 種類の プ ラ ス ミ ド、 p P C V 1 、 3 、 9 1 4 9 3 3 5 7 6 2 、 お よ び 6 4 を用 い て AIn addition, these nine types of plasmids, pPCV1, 3, 9 1 4 9 3 3 5 7 6 2 and A using 6 4
T C C 9 9 5 0 株の形質転換を電気パ ゾレ ス法 に よ り 試み た と こ ろ 、 い ずれの プ ラ ス ミ ド D N Α に つ い て も 1 ^ gWhen the transformation of the TCC 9950 strain was attempted by the electroplasmic method, 1 ^ g was obtained for any of the plasmids DN N.
D N A あ た り 6 , 0 0 0 か ら 1 0 , 0 0 0 個 の G 4 1 8 H 性 U D 二一が得 ら れ た。 さ ら に 、 こ れ ら 9 種類の ブ ラ ス ミ K と 、 対照 と し て用 い た p C A R S 6 一 2 と に よ り 得 ら れた 1 0 種類の G 4 1 8 耐性株 2 株ずつ の計 2 0 クFrom 6,000 per DNA, 100,000 G418H UD-21s were obtained. In addition, each of the nine types of G418 resistant strains obtained from these nine types of Brassimi K and p CARS612 used as a control Total 20 k
D 一 ン に つ い て 5 m 1 の Y P D 液体培地で一晚培養 し た後 Y P D プ レ ー ト 上で単一 コ ロ ニ ー に し た。 こ れ りThe D-cell was cultured once in 5 ml of YPD liquid medium, and then made into a single colony on the YPD plate. This
2 0 ク α ー ン の お の お の 1 0 コ α 二 一 ずつ を G 4 1 8 を 含む Υ Ρ D プ レ ー ト 上で の生育を調ベ る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド、の 保持率を調べ た。 そ の結果、 P C A R S 6 - 2 の プ ラ ス ミ ド保持率 は 5 % で あ つ た の に対 し 、 そ の 他 すベて の プ ラ ス ミ ド に つ い て保持率が高 ま つ て い た の う ち 特 に ブ ラ ス ミ ド p P C V 1 p P C V 1 9 、 お よ び p P C V 6 4 に つ い て は 、 プ ラ ス ミ ド保持率が 8 0 -Each of the 20 coons was made up of 10 co-alphas, including G4 18 Υ プ ク 調 ラ 調 プ 調 ラ プ ラThe retention rate of the metal was checked. As a result, the retention rate of plasmid of PCARS 6-2 was 5%, while the retention rate of all other plasmides was higher than that of PCARS 6-2. In particular, the plasmid p PCV 1 p PCV 19 and p PCV 64 have a plasmid retention rate of 80-
8 5 % と ι¾ ヽ 、 取得 さ れ た プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る 配 列'を 含む D N A 断片が、 プ ラ ス ミ ド の 安定性を高 め る 機 能を有 し て い る こ と が示唆 さ れ た。 85%, and DNA fragment containing the obtained sequence with promoter activity has a function to enhance the stability of plasmid. Was suggested.
( 3 ) プ ラ ス ミ ド p P C V プ ロ モ ー 夕 一活性を有す る (3) Plasmid p P C V Promote
D N Α 断片 の 塩基配列決定 Nucleotide sequencing of the DNA fragment
取得 さ れ た 9 種類の プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 断片の う ち 、 プ ラ ス ミ ド p ? 〇 ¥ 1 9 の 挿入 0 ^- 八 断片 に つ い て、 挿入 D N A 断片の両側力、 ら E X 0 1 1 1 ヌ ク レ ァ ー ゼお よ びマ ン グ ビ ー ン ヌ ク レ ア ー ゼを用 い た欠失変 異作製法 に よ b 、 種 々 の 欠失変異を も つ プ ラ ス ミ ド を作 製 し て塩基配列を決定 し た。 決定 し た 1 0 5 4 b p か ら な る p P C V 1 9 の 挿入 D N A 断片の塩基配列 は 図 4 8 に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 Of the nine types of obtained DNA fragments having promoter activity, the inserted 0 ^ -eight fragment of plasmid p? EX 0 1 1 1 Nucleus A plasmid with various deletion mutations was prepared by a method of making deletion mutations using the enzyme and Mung Bean nuclease b. The nucleotide sequence was determined. The determined base sequence of the inserted DNA fragment of pPCV19 consisting of 104 bp was as shown in FIG.
実施例 3 1 ： ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性遺伝子発現用 ブ ラ ス ミ ド の 構築 と そ れを利用 し た酵母の 共形質転換体の選 択 Example 31 1: Construction of a Brasmid for Expression of High Glomycin B Resistance Gene and Selection of Co-transformant of Yeast Using It
( 1 ) ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性遺伝子発現用 プ ラ ス ミ ド の構築 と そ の機能確認  (1) Construction of a plasmid for the expression of the hygromycin B resistance gene and confirmation of its function
ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン B ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ  NoiGromy Machine B Host Phototransferase
( H P T ) 遺伝子 は 、 プ ラ ス ミ ド p B I B — H Y G The (HPT) gene is a plasmid pBIB-HYG
( B e c k e r D. Nu c I . A s i d s R e s. 18, 203 ( 1990 ) ) を铸型 と し て、 すで に 明 ら か に さ れて い る H P T 遺伝子の塩基 配列情報 （ G r i L. a n d D a v i s J . G e n e 25, Π 9 - Π 8(Becker D. Nucl I. A sids Res. 18, 203 (1990)), and the base sequence information (Gri) of the HPT gene that has already been revealed. L. and D avis J. Gene 25, Π 9-Π 8
( 1983 ) ) に基づ き 作成 し た 2 種類の プ ラ イ マ ー を用 い て P C R に よ り 取得 し た。 プ ラ イ マ ー と し て、 (1983)) and obtained by PCR using two types of primers. As a primer,
5 GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' (配列番号： 3 3)5 GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 33)
5' -GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' (配列番号： 34) を用 い て、 5 ' 側末端開始 コ ド ン 直前 に X b a I サ イ ト 3 ' 側末端終止 コ ド ン 直後 に B g 1 I Iサ イ ト を も つ 様 に デザ イ ン し て 合成 し た。 合成 し た H P T 遺伝子断片 は X b a I と B g 1 1 1 と で消化後、 実施例 4 記載の 発現べ ク タ 一 P P G K P T 4 (図 4 ) の X b a l サ イ ト と B a m Η I サ ィ 卜 と 間 に挿入 し て、 プ ス Using 5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3 '(SEQ ID NO: 34), XbaI site immediately before the 5' terminal termination codon and Bg1II site immediately after the 3 'terminal termination codon They were designed and synthesized in the same manner. The synthesized HPT gene fragment was digested with XbaI and Bg111, and then expressed with the Xbal site of the expression vector PPGKPT4 (FIG. 4) described in Example 4. B am ΗI Insert between the site and press
p G K H P T 1 を構築 し た （図 4 9 ) pGKHPT1 was constructed (Fig. 49)
さ ら に p G K H P T 1 か ら P G K 遺伝子 プ 口 モ ー タ ー と 、 H P T 遺伝子 と 、 そ し て P G K 遗伝子 タ 一 ミ ネ 一 夕 一 と を含む 3 . 3 k b の N 0 t I 断片 を切 り 山 し 、 ^ * \ を実施例 3 0 記載の ブ ラ ス ミ ド P P C V 1 4 の N 0 t I サ イ ト に 挿入 し て、 プ ラ ス ミ ド P A H G 1 を構築 し た。  Furthermore, a 3.3 kb N0tI fragment containing the pGKHPT1 to PGK gene promoter, the HPT gene, and the PGK gene and one minute to one minute. Then, ^ * \ was inserted into the N0tI site of the plasmid PPCV14 described in Example 30 to construct a plasmid PAHG1.
構築 し た H P T 遺伝子発現 カ セ ッ 卜 が機能す る か ど う か確認す る た め に、 プ ラ ス ミ ド P A H G 1 に よ り  In order to confirm whether the constructed HPT gene expression cassette functions, the plasmid PAHG1 was used to confirm whether the cassette was functional.
A T C C 9 9 5 0 株を実施例 1 1 記載の電気パ ル ス 法 に よ り 形質転換 し た。 G 4 1 8 耐性で選択 し た形質転換体 は、 2 0 0 、 4 0 0 、 お よ び 8 0 0 g / m 1 の 濃度の ハ ィ グ 口 マ イ シ ン B を含む Y P D 液体培地で増殖 し た が 対照 と し て用 い た野生株 は い ずれの 培地で も 増殖せず、 ハ ィ グ 口 マ イ シ ン B 性を示す こ と が明 ら か に さ れ た。 The ATCC 9950 strain was transformed by the electric pulse method described in Example 11. Transformants selected for G418 resistance were cultured in YPD liquid medium containing 200, 400, and 800 g / m1 of Higmouth Mycin B. It was shown that the wild strain that grew but was used as a control did not grow in any medium and showed high mouth mycin B properties.
ま た 、 プ ラ ス ミ ド p G K H P T 1 を N 0 t I 消化 し て P G K 遺伝子 プ 口 モ ー タ 一 と 、 H Ρ Τ 遺伝子 と 、 そ し て P' G K 遣伝子 夕 一 ミ ネ 一 タ ー と を 含む断片 と 、 ベ ク タ ー 断片 と に 分 け た後、 A T C C 9 9 5 0 株の 形質転換 に 用 い た。 形質転換 は実施例 1 1 記載の 電気パ ル ス 法 に よ り 行 い 、 形質転換体の 選択 は 8 0 0 g / m 1 の ハ イ グ 口 マ イ シ ン B を 含む Y P D プ レ ー ト で行 つ た。 そ の 結果、 In addition, the plasmid pGKHPT1 was digested with N0tI to obtain the PGK gene promoter, the HΡΤ gene, and the P'GK gene. After separating into a fragment containing ー and a vector fragment, the fragment was used for transformation of ATCC 9950 strain. Transformation was performed by the electropulse method described in Example 11, and transformants were selected by using a YPD plate containing 800 g / m1 of high-opening meincin B. I went in. as a result,
1 g D N A あ た り 1 6 8 個 の ハ ィ グ 口 マ イ シ ン B 耐性 n α 二一が得 ら れ れ は対照 と し て用 い た N 0 t I 消化 プ ラ ス ミ ド、 P G K A P H 1 に よ る 形質転換頻度、 1 g Ό N A あ †z り 1 5 6 個 と ほ ぼ同 じ で あ り 、 ヽ ィ グ ロ マ イ シ ン B 耐 te遺伝子 は G 4 1 8 耐性遺伝子同様、 キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス形質転換体の 直接選択 に 用 い る こ と がで き る こ と が示 さ れ 1668 per gram of DNA High-mouth mycin B-resistant nα21 was obtained and used as a control N0tI The frequency of transformation with the digestion plasmid, PGKAPH1, was about the same as that of 156 cells per gram of NA, and the chromogene B resistance te gene was It has been shown that, like the G418 resistance gene, it can be used for direct selection of Candida ducilis transformants.
( 2 ) 酵母の共形質転換の 実施  (2) Perform yeast co-transformation
実施例 3 0 で取得 し た A R S を含む プ ラ ス ミ ド、 p P C V 6 4 の 0 . 1 β g と 、 N o t I 消化 し て P G K 遺伝子 プ ロ モ一 夕 一 と 、 H P T 遺伝子 と 、 そ し て P G K 遺伝子 夕 一 ミ ネ 一 タ ー と を含む断片 と ベ ク タ 一断片 と に 分 け た プ ラ ス ミ ド、 p P G K H P T 1 の 1 ；" g ま た は 1 0 g と を混合 し て A T C C 9 9 5 0 株の 実施例 1 1 記 載の電気パ ル ス 法 に よ り 形質転換 に 用 い た。  The plasmid containing ARS obtained in Example 30 (0.1 βg of pPCV64), NotI-digested PGK gene promoter, HPT gene, and the like. Then, a mixture of a plasmid containing the PGK gene and a fragment containing the same and a vector fragment, p PGKHPT1; 1 g; The ATCC 9950 strain was used for transformation by the electric pulse method described in Example 11.
パ ル ス 条件 は電 ^容量を 2 5 F 、 抵抗値 は 6 0 0 8 0 0 、 ま た は 1 0 0 0 オ ー ム、 電圧 は 3 . 7 5 K V / c m ま た は 5 K V c m と し て D N A 混合物 2 種類 に 対 し て そ れぞれ 6 通 り の パ ノレ ス 条件で行 つ た。 形質転換 体の 選択 は 2 0 0 β g / m 1 の G 4 1 8 を 含む Y P D プ レ一 ト で行 い 0 . 1 β g の p P C V 6 4 D N A 当 た り そ れぞれの 条件で約 2 , 0 0 0 か ら 7 0 0 0 個 の 形質 換体を取得 し た 。 そ れぞれ の 条件で得 ら れた G 4 1 8 耐性 コ o 5 0 0 カヽ ら 2 0 0 0 個 を 8 g / m 1 の ヽ ィ グ Π マ ィ シ ン Β を含む Y P D プ レ ー ト に レ プ リ カ し た。 そ の 結果、 得 ら れた G 4 1 8 耐性 3 ロ ニ 一 の う ち ノ、 ィ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を示す コ ロ ニ ー の割合 は そ れぞ れのパ ル ス 条件で大 き な 差 は な く 、 約 1 一 2 %で あ る こ と が示 さ れ た。 つ ぎ に、 こ の G 4 1 8 耐性でかつ ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を 示 し た株 に つ い て Y P D 液体培地で —晚培養す る こ と に よ っ て、 プ ラ ス ミ ド と し て存在す る P P C V 6 4 が脱落 し て G 4 1 8 感受性 と な っ た株の取 得を試み た。 4 0 株 に つ い て調べ た と こ ろ 、 こ の う ち 1 0 株 に つ い て G 4 1 8 感受性でかつ ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を示す株が得 ら れた。 こ れ ら の株 に お い て は P G K 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー と 、 H P T 遺伝子 と 、 そ し て P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー と を含む断片が染色体上 に 保持 さ れて い る こ と が期待 さ れ た 。 そ こ で こ の 1 0 株 よ り 染色体 D N A を調製 し た後、 H P T 遺伝子発現 カ セ ッ ト が染色体上 に相同組換え に よ り 組み込 ま れた か ど う か を P C R に よ り 調べ た。 The pulse conditions were a capacitance of 25 F, a resistance of 600 000 or 100 ohms, and a voltage of 3.75 KV / cm or 5 KV cm. Then, two kinds of DNA mixtures were performed under six different conditions. Transformants were selected on a YPD plate containing 200 βg / m1 of G418, under conditions that were specific to 0.1 βg of pPCV64 DNA. Approximately 2,000 to 700,000 transformants were obtained. A YPD plate containing 8 g / m 1 of digging machine was used to obtain 200 000 G418 resistant cells obtained under the respective conditions. Was replicated to As a result, among the obtained G4 18 resistant 3 The ratio of colonies that show igloomycin B resistance does not show a large difference under each pulse condition, and is about 12%. Was done. Next, the strain that has been shown to be resistant to G418 and high resistance to hygromycin B was cultured in YPD liquid medium. An attempt was made to obtain a strain in which PPCV64, which exists as a smid, was dropped and became G418-sensitive. When the 40 strains were examined, 10 strains were found to be G41.8-sensitive and highly resistant to hygromycin B. In these strains, a fragment containing the PGK gene promoter, the HPT gene, and the PGK gene terminator is retained on the chromosome. This was expected. After preparing chromosomal DNA from the 10 strains, PCR was used to determine whether the HPT gene expression cassette had been integrated into the chromosome by homologous recombination. Was.
こ の た め の プ ラ イ マ ー と し て、 H P T 遺伝子発現 に 用 い た P G K 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー 断片 の 5 ' 端外側 の塩基 配.列 を も と に 合成 し た、  As a primer for this, the base sequence outside the 5 'end of the PGK gene promoter fragment used for HPT gene expression was synthesized based on the sequence.
プライマー 1 ; 5' CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' (配列番号： 35) 及 び、 H P T 遺伝子内 部の 配列 を も と に 合成 し た、 プライマー 2 ； 5' GAAACTTCTCGACAGACGTC3' (配列番号： 36) 及 び、 H P T 遺伝子発現 に 用 い た P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ 一 タ ー 断片 内 の配列 を も と に 合成 し た Primer 1; 5 'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' (SEQ ID NO: 35) and synthesized based on the sequence within the HPT gene. Primer 2; 5 'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' (SEQ ID NO: 36) and Was synthesized based on the sequence in the terminal fragment of the PGK gene used.
プライマー 3 ； 5' CATCGGGTAAGGTCTACATG3' (配列番号： 37) の 合計 3 種類の プ ラ イ マ一を使用 し た Primer 3; 5 'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' (SEQ ID NO: 37) Total of three types of primers were used.
P C R の 条 ^は 、 9 5 °C 1 分、 5 5 °C 1 分、 7 2 °C 5 分 と し 、 3 0 サ イ ク ル行 た そ の 結果 は 図 5 0 に示 さ れ る 通 り で あ つ た。 図 5 0 ( 1 ) は プ ラ イ マ ー 1 と ブ ラ イ マ一 3 と を用 い た P C R 反応産物の電気泳動図であ る こ の結果 よ り 、 すべて の サ ン プル に つ い て 内在性の The PCR conditions were 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 5 minutes, and the results of 30 cycles were as shown in Figure 50. It was. Figure 50 (1) is an electropherogram of the PCR reaction product using Primer 1 and Primer 13. From these results, it can be seen that all samples were used. Intrinsic
P G K 遺伝子 に よ る 2 . 7 k b の 増 '幅断片が認め ら れ た ほ か、 N o . 3 、 5 、 7 9 、 お よ び 1 0 の 5 つ の サ ン プル に つ い て は 2 . 6 k b の 断片が認 め ら れた。 こ れ は 形質転換 に 用 い た P G K遺伝子 プ ロ モ 一 夕 一 と 、 H P T 遺伝子 と 、 そ し て P G K遺伝子 タ 一 ミ ネ ー タ ー と を含む 断片 に よ っ て、 内在性の 2 個 の P G K 遺伝子の う ち 1 個 が置 き 換え ら れ よ り 生 じ た と 考 ら れた。 さ ら に、 同 じ D N A サ ン プル に つ い て ブ ラ イ マ一 1 と プ ラ イ マ ー 2 と を用 い て P C R を行 つ ナ 木 は図 5 0 ( 2 ) に 示 さ れ る 通 り で あ っ た。 そ の結果 よ り 、 2 . 6 k b の 断 片が認め ら れた 5 個 の サ ン プル に つ い て 1 . 4 k b の增 幅断片が認め ら れ、 こ れ ら 5 ク ロ ー ン に 関 し て は相同組 換え に よ っ て、 内 在性 P G K 遺伝子が H P T 遺伝子 に 置 き 換え ら れ た こ と が示 さ れ た。 配 列 表 In addition to a 2.7 kb increase in fragment size due to the PGK gene, two of the five samples, Nos. 3, 5, 79, and 10 A 6 kb fragment was identified. This is due to the fragment containing the PGK gene promoter used for the transformation, the HPT gene, and the PGK gene terminator, resulting in two endogenous fragments. It was considered that one of the PGK genes had been replaced and was generated. Furthermore, the same DNA sample is subjected to PCR using primers 1 and 2 and a na-tree is shown in FIG. 50 (2). It was as expected. The results show that for the five samples in which 2.6 kb fragments were found, a 1.4 kb long fragment was observed, and in these five clones, It was shown that the endogenous PGK gene was replaced by the HPT gene by homologous recombination. Arrangement table
配列番号： 1 . SEQ ID NO: 1.
配列の長さ ： 8 8 0 Array length: 8 8 0
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジー： 状  Topology: State
配列の ： Genomi c DNA 物名：キャンディダ*ュティ リス （Cand i da u t i l i s) Sequence: Genomi cDNA Name: Candida utilis (Cand i da ut i li s)
株名： AT C C 9 9 5 0  Stock name: AT C C 995 0
配列 Array
CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAACAAATAA CGGGATTATA TGTCAATATC ATTATGATTA 60 TTTAGGAAAA CATGTAGACC TTACCCGATG CACCTCCACC AACAAGCCAA TTCTGGGTGG 120 GATGGAAGTT ACACACTGCT GGTACGTTGG TCACCAGTGG GTTTGACAAA TGTGCCAGCT 180 GATGACCATC TCGGTCGTAG ACGTCAAAGT ACTTGTTCAT ATTGGCAATG ACAAACTTTT 240 CTTTATCCGG GGTATATTGC TGCCACCTTG CCTTCAAAAT GGATACCCAT CTTCCCGTTT 300 GACAGTTGTG TTTGATACGA TGACTTGGGG TCAAATCACC TTCAATAGCG AAGTTCTTAG 360 GTTTAGTGCT GATGTCCTCA CCAAGATTGA AGATGTTAAC TGTGTCATCG TAACCGTTAC 420 AAACAAGGTC ACCAGATCTA TTCCAATCCA CGATGGAAAC TGACAATCTT GAATCATAGA 480 CGCCAACAGT GTGAAGAGTC TCCAGGTTAT CATCCCATTC ATCCCAATCA CACGTAGTTA 540 CTGTTCTTAG ATCCCAAACC TTCAAAGTTC GATCCAATGA GGCAGTAGCA ATCTGGTTCT 600 TATTCATCGG ATTGGTAGTG AATCCACCAA TCTTTTTATT CGACAATCTC AAAACTTGTC 660 TTCTTGAGTG ATCGCCTGCT CTTAGGTCAA TTCTGCTGAA TTGTCCTTGC ATTGTTGTGT 720 AGTACATTTC ATTGTCGTTG TTGTAATTTA TGTCAGTGAT ACCGACGTCA AAGTCGTTGA ?80 TGAATAACTG TGAGGACTTC ATGGAGCGTA GATCAATTGA GCGAATGGAC CCATCATACG 840 ATGCACTGTA GACCTTCGTC GTGTCATTCA TGTTGAATTC 配列番号： 2 CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAACAAATAA CGGGATTATA TGTCAATATC ATTATGATTA 60 TTTAGGAAAA CATGTAGACC TTACCCGATG CACCTCCACC AACAAGCCAA TTCTGGGTGG 120 GATGGAAGTT ACACACTGCT GGTACGTTGG TCACCAGTGG GTTTGACAAA TGTGCCAGCT 180 GATGACCATC TCGGTCGTAG ACGTCAAAGT ACTTGTTCAT ATTGGCAATG ACAAACTTTT 240 CTTTATCCGG GGTATATTGC TGCCACCTTG CCTTCAAAAT GGATACCCAT CTTCCCGTTT 300 GACAGTTGTG TTTGATACGA TGACTTGGGG TCAAATCACC TTCAATAGCG AAGTTCTTAG 360 GTTTAGTGCT GATGTCCTCA CCAAGATTGA AGATGTTAAC TGTGTCATCG TAACCGTTAC 420 AAACAAGGTC ACCAGATCTA TTCCAATCCA CGATGGAAAC TGACAATCTT GAATCATAGA 480 CGCCAACAGT GTGAAGAGTC TCCAGGTTAT CATCCCATTC ATCCCAATCA CACGTAGTTA 540 CTGTTCTTAG ATCCCAAACC TTCAAAGTTC GATCCAATGA GGCAGTAGCA ATCTGGTTCT 600 TATTCATCGG ATTGGTAGTG AATCCACCAA TCTTTTTATT CGACAATCTC AAAACTTGTC 660 TTCTTGAGTG ATCGCCTGCT CTTAGGTCAA TTCTGCTGAA TTGTCCTTGC ATTGTTGTGT 720 AGTACATTTC ATTGTCGTTG TTGTAATTTA TGTCAGTGAT ACCGACGTCA AAGTCGTTGA? 80 TGAATAACTG TGAGGACTTC ATGGAGCGTA GATCAATTGA GCGAATGGAC CCATCATACG 840 ATGCACTGTA GACCTTCGTC GTGTCATTCA TGTTGAATTC SEQ ID NO: 2
配列の長さ： 1346 Array Length: 1346
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジー：直鎖状  Topology: linear
配歹1』の ： Genomic DNA Hai歹1 ": Genomic DNA
婦徵  Woman
特徴を表す記号： TATA signal  Characteristic symbol: TATA signal
現在位置： 1184..1190  Current location: 1184..1190
特徴を^した方法： S  How to add features: S
起源 Origin
物名：キャンディダ*ュティ リス （Candida utilis)  Product name: Candida utilis
株名： ATCC9950  Stock Name: ATCC9950
配列 Array
AAGCTTTTGT CTTTTAGGAG CCTTCTTTTC ACCCTGGCTT TCTTCAGACT CCACGCCTCT 60 CGCCCGTTTG TTGTTGATCT TCTTCTGTTG CTTCTTCGTG AGCTTACCAG TATCCAGATG 120 CGTTGTCAGG GCAAGAGGGT CATGTTCAAG CTCCTCTTTC ACTTTCAGTC CAATACGTTT 180 CCAGGCAGGG ATGTGTTCGC TCATCGTTCC AGACTCGAGT GGTGAAAACT. ATGGCAACCT 240 CTACTTCCTT TCCAAACACA CAGCGTGCTT TGTAGTGTGT GCCTAAGAGC TGAATTTTTT 300 TTCCTTCCAT GCTGCGCTGC GATGAGCTCT GCCCGCCCGC AGCCTCGGAG GCTAGCGACG 360 TATAAAAAAG GCCTGTGAAA ATTTTATCCT CCTCCTTAAC GACCCTTCTT TCTCTTCTTC 420 9113房 1Τ VΤΓ AAGCTTTTGT CTTTTAGGAG CCTTCTTTTC ACCCTGGCTT TCTTCAGACT CCACGCCTCT 60 CGCCCGTTTG TTGTTGATCT TCTTCTGTTG CTTCTTCGTG AGCTTACCAG TATCCAGATG 120 CGTTGTCAGG GCAAGAGGGT CATGTTCAAG CTCCTCTTTC ACTTTCAGTC CAATACGTTT 180 CCAGGCAGGG ATGTGTTCGC TCATCGTTCC AGACTCGAGT GGTGAAAACT. ATGGCAACCT 240 CTACTTCCTT TCCAAACACA CAGCGTGCTT TGTAGTGTGT GCCTAAGAGC TGAATTTTTT 300 TTCCTTCCAT GCTGCGCTGC GATGAGCTCT GCCCGCCCGC AGCCTCGGAG GCTAGCGACG 360 TATAAAAAAG GCCTGTGAAA ATTTTATCCT CCTCCTTAAC GACCCTTCTT TCTCTTCTTC 420 9113 bunch 1Τ VΤΓ
t— 111し1 t—111 then 1
6— ID 9D 3VV0 3D999VV V 6—ID 9D 3VV0 3D999VV V
-
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-
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Figure imgf000154_0002
5 3 一 配列番号： 3 5 3 1 SEQ ID NO: 3
配列の長さ： 2 3 3 0塩基 Sequence length: 2330 bases
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖核酸 Number of strands: double-stranded nucleic acid
配列の ： Genomi c DNA Sequence of: Genomi c DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号： CDS  Characteristic symbol: CDS
現在位置： 1259. . 2059 物名：キヤンディダ*ュティ リス （Cand i da u t i l i s)  Current Location: 1259.. 2059 Name: Cyandi da * ti Lis
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
配列 Array
AAGCTTATGG AGGAGATTGG GAAGATTGAA CGAGGTGAGA TGGACACGTT GCTGATTGAC 60 AAGCTTATGG AGGAGATTGG GAAGATTGAA CGAGGTGAGA TGGACACGTT GCTGATTGAC 60
GAGATCGGCA AGAAGGAGGC ACCTGTGGTG AAACCACTTA CACCCGACGT GGATAGTAAT 120GAGATCGGCA AGAAGGAGGC ACCTGTGGTG AAACCACTTA CACCCGACGT GGATAGTAAT 120
GTAACAGGGG AACCGACTGG ACATAGTTCT ACGACACCAC CACCGGTGGA ACAGGACTCG 180GTAACAGGGG AACCGACTGG ACATAGTTCT ACGACACCAC CACCGGTGGA ACAGGACTCG 180
AGCACAACCA CGAGGAAGAG AGCACAAGAC GATGGTGAGG AAAACACAAG GAAGAAGCCC 240AGCACAACCA CGAGGAAGAG AGCACAAGAC GATGGTGAGG AAAACACAAG GAAGAAGCCC 240
AAGGTTGAGG CAGAGAAAAA GGCAGAGCAA GAGGCAGAGA AAGAGGCAGA GAAAGAGGCA 300 GAGAAAGAGG CAGAGCAAGA GGCAGAGAAA GAGGCTCCGC GTGCAGTGCC GAACAAGAGA 360AAGGTTGAGG CAGAGAAAAA GGCAGAGCAA GAGGCAGAGA AAGAGGCAGA GAAAGAGGCA 300 GAGAAAGAGG CAGAGCAAGA GGCAGAGAAAGAGGCTCCGC GTGCAGTGCC GAACAAGAGA 360
CTACAACACA TTGCTACTCC TCTCATCGAG AGCATCTCGT CATACAAGTA CGCCTCAGCG 420CTACAACACA TTGCTACTCC TCTCATCGAG AGCATCTCGT CATACAAGTA CGCCTCAGCG 420
TTTCTACACC CTGTTAACGA GTCCAGTGCA CCCAACTATT ACTCTCTGAT CAAGAAACCA 480TTTCTACACC CTGTTAACGA GTCCAGTGCA CCCAACTATT ACTCTCTGAT CAAGAAACCA 480
AGGGATCTGA AGACCATCAA ACAGATGGTC AAGGACGGAC GTATACAGAC CAATCTTGAG 540AGGGATCTGA AGACCATCAA ACAGATGGTC AAGGACGGAC GTATACAGAC CAATCTTGAG 540
CTGGAGAGGG AGATCTTGCT GATGTTTGCC AATGCCATCA TGTACAACAA GACCGGGACG 600CTGGAGAGGG AGATCTTGCT GATGTTTGCC AATGCCATCA TGTACAACAA GACCGGGACG 600
GATATCTACG AGTGGACCAA GGAGATGCAG CCGGAAGTTG ACAAGCTCAT CGAGCTGTTT 660GATATCTACG AGTGGACCAA GGAGATGCAG CCGGAAGTTG ACAAGCTCAT CGAGCTGTTT 660
AACGAGAGTA AATAGGATAC AGGCTAGAGA TCAAAAGAAG AATAGAAACA GCTCGATAAA 720
Figure imgf000156_0001
AACGAGAGTA AATAGGATAC AGGCTAGAGA TCAAAAGAAG AATAGAAACA GCTCGATAAA 720
Figure imgf000156_0001
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»— ^ »— ^
CTT TCA AAG AAG CAC AAT TTC CTC ATC TTT GAG GAC CGT AAG TTT GCT 1548CTT TCA AAG AAG CAC AAT TTC CTC ATC TTT GAG GAC CGT AAG TTT GCT 1548
Leu Ser Lys Lys. His Asn Phe Leu lie Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Leu Ser Lys Lys. His Asn Phe Leu lie Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala
85 90 95  85 90 95
GAT ATC GGC AAC ACC GTC AAG GCA CAG TAC GCC GGT GGT GCG TTC AAG 1594 GAT ATC GGC AAC ACC GTC AAG GCA CAG TAC GCC GGT GGT GCG TTC AAG 1594
Asp He Gly Asn Thr Val Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys Asp He Gly Asn Thr Val Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys
100 105 110  100 105 110
ATT GCG CAA TGG GCA GAT ATC ACC AAC GCC CAC GGT GTC ACC GGT GCA 1642 lie Ala Gin Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala  ATT GCG CAA TGG GCA GAT ATC ACC AAC GCC CAC GGT GTC ACC GGT GCA 1642 lie Ala Gin Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala
115 120 125  115 120 125
GGT ATC GTC AAG GGG TTG AAG GAG GCT GCA CAG GAA ACC ACG GAT GAG 1690 GGT ATC GTC AAG GGG TTG AAG GAG GCT GCA CAG GAA ACC ACG GAT GAG 1690
Gly lie Yal Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gin Glu Thr Thr Asp GluGly lie Yal Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gin Glu Thr Thr Asp Glu
130 135 140 145130 135 140 145
CCA AGA GGG CTG TTG ATG CTT GCG GAG CTG AGC TCC AAG GGC TCC TTG 1738CCA AGA GGG CTG TTG ATG CTT GCG GAG CTG AGC TCC AAG GGC TCC TTG 1738
Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu
150 155 160  150 155 160
GCC CAC GGG ACA TAT ACC GAG GAG ACC GTG GAG ATT GCC AAA ACT GAT 1786 GCC CAC GGG ACA TAT ACC GAG GAG ACC GTG GAG ATT GCC AAA ACT GAT 1786
Ala His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu He Ala Lys Thr Asp Ala His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu He Ala Lys Thr Asp
165 170 175  165 170 175
AAG GAC TTT TGT ATT GGA TTC ATC GCA CAG AGA GAC ATG GGT GGC AGA 1834 AAG GAC TTT TGT ATT GGA TTC ATC GCA CAG AGA GAC ATG GGT GGC AGA 1834
Lys Asp Phe Cys He Gly Phe He Ala Gin Arg Asp Met Gly Gly Arg Lys Asp Phe Cys He Gly Phe He Ala Gin Arg Asp Met Gly Gly Arg
180 185 190  180 185 190
GAA GAT GGG TTC GAC TGG ATC ATC ATG ACA CCA GGC GTG GGA CTC GAC 1882 GAA GAT GGG TTC GAC TGG ATC ATC ATG ACA CCA GGC GTG GGA CTC GAC 1882
Glu Asp Gly Phe Asp Trp lie He Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Glu Asp Gly Phe Asp Trp lie He Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp
195 200 205 195 200 205
1I09VVD1V1 V931IVV9VV VVV1310139 V9V0V9VDVV 3V3V1391V9 13119VV313 V9 V919D1 991VV3IV91 DV99VVV9VD 0IYV3D1VV0 D1VD3VVVVV Ull 3910VVDV1V IIOIVDUDV 111VVVVDD9 391UIU19 V319IVVVDD 909U1UU mi 319V3393V9 I1VVVD039I XiilVODOXi Y9VI9113VV 99311X1913 VllVOiiOIV 00Π VVVIV1911D VD1X99VIV1 91ID991013 9V0I1939VV 1 1I09VVD1V1 V931IVV9VV VVV1310139 V9V0V9VDVV 3V3V1391V9 13119VV313 V9 V919D1 991VV3IV91 DV99VVV9VD 0IYV3D1VV0 D1VD3VVVVV Ull 3910VVDV1V IIOIVDUDV 111VVVVDD9 391UIU19 V319IVVVDD 909U1UU mi 319V3393V9 I1VVVD039I XiilVODOXi Y9VI9113VV 99311X1913 VllVOiiOIV 00Π VVVIV1911D VD1X99VIV1 91ID991013 9V0I1939VV 1
m m  m m
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V9D 111 911 399 VDV 1D9 110 31V 31V OIV DV9 1DI D99 199 19V D19V9D 111 911 399 VDV 1D9 110 31V 31V OIV DV9 1DI D99 199 19V D19
SZZ 022 S 0ΠSZZ 022 S 0Π
\H nig dsy A 】U 3jy 】 D1D 3 n3l "S v 3 s dsy\ H nig dsy A] U 3jy] D 1D 3 n3 l "S v 3 s dsy
0261 119 9V9 1V9 DIO 10V VOV OVI OVD WO D90 913 DDI DV3 D99 9VV 1V9 0261 119 9V9 1V9 DIO 10V VOV OVI OVD WO D90 913 DDI DV3 D99 9VV 1V9
- 9 g τ --9 g τ-
S00I0/S6dT/XDd 6SZZ£JS6 OAS. 配列番号： 4 S00I0 / S6dT / XDd 6SZZ £ JS6 OAS. SEQ ID NO: 4
配列の長さ ： 258アミノ酸 Sequence length: 258 amino acids
配列の型：アミノ酸 Sequence type: amino acid
配列の種類：ぺプチド Sequence type: peptide
¾ ^物名：キャンディダ-ュティ リス （Candida utilis) ¾ ^ Name: Candida utilis
株名： ATCC9950  Stock Name: ATCC9950
配列 Array
Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gin His Pro Ser Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gin His Pro Ser
1 5 10 151 5 10 15
Pro Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn Pro Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn
20 25 30  20 25 30
Leu Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu  Leu Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu
35 40 45  35 40 45
Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr lie Cys Leu Leu Lys Thr His lie Asp Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr lie Cys Leu Leu Lys Thr His lie Asp
50 55 60 50 55 60
lie He Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 80lie He Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 80
Leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu 11 e Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu 11 e Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala
85 90 95 85 90 95
Asp He Gly Asn Thr Val Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys Asp He Gly Asn Thr Val Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys
100 105 110 lie Ala Gin Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala 115 120 125 100 105 110 lie Ala Gin Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala 115 120 125
S9Z 092 S9Z 092
HID E]v J3S s 3jy s n ιίχ BJV dsy 丄  HID E] v J3S s 3jy s n ιίχ BJV dsy 丄
SSZ OSZ S SSZ OSZ S
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ilD m na i| 3iV D A "1 an 8|I dsy "S ^19 "s A m ui o ド A "19 v A JU V "1 DID n|g ijg naq "s v i|9 s dsy m m S6i dsy nsq i|3 JBA 3 OJJ 』U 13W 311 311 iiL dsV ！) v njQ ilD m na i | 3iV DA "1 an 8 | I dsy" S ^ 19 "s A m ui o do A" 19 v A JU V "1 DID n | g ijg naq" svi | 9 s dsy mm S6i dsy nsq i | 3 JBA 3 OJJ 』U1 3 W 3 11 311 ii L ds V! ) v njQ
061 S8I 081 061 S8I 081
3 V i[9 i|9 dsy 3jy MO E|y 9|j i[g 3[[ aqj dsy si]  3 V i [9 i | 9 dsy 3jy MO E | y 9 | j i [g 3 [[aqj dsy si]
SU Oil S9I  SU Oil S9I
dsv jqx siq I 八 "19 】U "1 】U 3 s!H MV dsv jqx siq I eight "19] U" 1] U 3 s! H MV
09Ϊ SSI OSl 09Ϊ SSI OSl
na is§ ί ID si ja§ 〗3S ns njg B|y na y} na n3q ί |g 3jy OJJ  na is§ ί ID si ja§〗 3S ns njg B | y na y} na n3q ί | g 3jy OJJ
SH OH SSI ΠΙ SH OH SSI ΠΙ
"19 dsv m Mo η|) ην MV "13 s naq ijg siq A ^II ^19  "19 dsv m Mo η |) ην MV" 13 s naq ijg siq A ^ II ^ 19
- 8 S T --8 S T-
SOOlO/SMT/XDd 68ir£7S6 O/A 配列番号： 5 SOOlO / SMT / XDd 68ir £ 7S6 O / A SEQ ID NO: 5
配列の長さ： 2 0.8 6 Sequence length: 2 0.8 6
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の鷗： Genomi c DNA Sequence 鷗: Genomi c DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号： i nt ron  Characteristic symbol: int ron
存在位置： 1115. . 1481  Location: 1115.. 1481
特徴を決定した方法： S  How the features were determined: S
特徴を表す記号： CDS  Characteristic symbol: CDS
存在位置： 1114  Location: 1114
1482. . 1795  1482.. 1795
起源 Origin
^^物名：キャンディダ*ュティ リス （Cand i da u t i l i s)  ^^ Name of product: Candida utilis (Cand i da ut i li s)
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
GGATCCAATC GTTGAAAGTG ATCAAGCTGA TTACAAAAGT AAGTATGAAA AGAGCCAATG 60TTGAGAGTCT CAGGAACCAC ATCGACTTCT TCGTGCCATC CTCCCACATT CTGAAGCCCA 120GGATCCAATC GTTGAAAGTG ATCAAGCTGA TTACAAAAGT AAGTATGAAA AGAGCCAATG 60TTGAGAGTCT CAGGAACCAC ATCGACTTCT TCGTGCCATC CTCCCACATT CTGAAGCCCA 120
AGAACCCACA AATCATCAAA CACCAACACG ATGCGGACGC CAACCCGAGT TGTAACGCCA 180AGAACCCACA AATCATCAAA CACCAACACG ATGCGGACGC CAACCCGAGT TGTAACGCCA 180
CAAAGTACGG GTACGACCCT GTTCCAGGAG GGCTCACGCC GCAATCAACA ACCAAAGTCG 240CAAAGTACGG GTACGACCCT GTTCCAGGAG GGCTCACGCC GCAATCAACA ACCAAAGTCG 240
CCACGATCAA CGCCAGTATC AAGTAAAAGA AGAATAGCAT CTCCAGTCTT CCGATAGCTG 300CCACGATCAA CGCCAGTATC AAGTAAAAGA AGAATAGCAT CTCCAGTCTT CCGATAGCTG 300
TGTACTTCGA TCTGACGTTG TAGATGATGA TGATCATGAT CACGAGGGCA CCAATGTTGA 360TGTACTTCGA TCTGACGTTG TAGATGATGA TGATCATGAT CACGAGGGCA CCAATGTTGA 360
CAAAGGCGTT ACCAATCTGG AATATCACGG TATTGGCAAC GTCTATCGGA CGGGCGTAGC 420CAAAGGCGTT ACCAATCTGG AATATCACGG TATTGGCAAC GTCTATCGGA CGGGCGTAGC 420
ACTCAGGGAT GATCCCTTCG TTCAGGTGCG TGAACTGCTC GTTCGTCGTT GCCTTCACAA 480 091： ACTCAGGGAT GATCCCTTCG TTCAGGTGCG TGAACTGCTC GTTCGTCGTT GCCTTCACAA 480 091:
一
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one
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SOI 001.' m n3l V ¾!9 1)9 si 0281 VUVllViii 房 V! 1VVDV9VVX10DVVX 311 WO 911 XD9 WD 199 9VV SOI 001.'m n3 l V ¾! 9 1) 9 si 0281 VUVllViii Tuft V! 1VVDV9VVX10DVVX 311 WO 911 XD9 WD 199 9VV
S6 06 S8 u]9 siq si dsy ί |g ί ]g na iqj) sijj s!n siq sij 3jy siq na  S6 06 S8 u] 9 siq si dsy ί | g ί] g na iqj) sijj s! N siq sij 3jy siq na
Ul\ WO 9VV DVV DV9 199 199 911 DVO Dll DVO 9VV 191193 DVV 9111D9  Ul \ WO 9VV DVV DV9 199 199 911 DVO Dll DVO 9VV 191 193 DVV 9111D9
08 Si U  08 Si U
H31 niD BIV siq J si si3 JBA sio n13 n3l S^V nai !UH31 niD BIV siq J si si3 JBA sio n 13 n3 l S ^ V nai! U
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S9 09 SS  S9 09 SS
sil siq jqi jqi siq γ siq siq SIH m n o siq iqi n]g i]g sil siq jqi jqi siq γ siq siq SIH mno siq iqi n] g i] g
8L9I 9VV 9VV 33V DOV VVV 103 9VV VVV DVO Oil 119 VDO 9VV DOV WO 199 8L9I 9VV 9VV 33V DOV VVV 103 9VV VVV DVO Oil 119 VDO 9VV DOV WO 199
OS St- 13 "丄 9 "S ΰΙ9 siq 3jy dsy J 3jy 3JV siq ijg u]g BIV aqjOS St- 13 "丄 9" S Ι Ι9 siq 3jy dsy J 3jy 3JV siq ijg u] g BIV aqj
0S9I 199 OVl 199 DDI WD DVV 193 DV9 IVl 190 190 OVV 199 9V3 DD9 1110S9I 199 OVl 199 DDI WD DVV 193 DV9 IVl 190 190 OVV 199 9V3 DD9 111
S8 OS U naq I3S MV O MV siq Jil nio】u IU s 'S!H DJO jqi S!H S8 OS U naq I3S MV O MV siq Jil nio】 u IUs' S ! H DJO jqi S! H
313 DDI 139 9VV 1D9 103 DVV OVl 9Y0 30V 119 9VV DVO WO 10V DVO 313 DDI 139 9VV 1D9 103 DVV OVl 9Y0 30V 119 9VV DVO WO 10V DVO
- T 9 T --T 9 T-
S00I0/S6dT/XD<I 68な £7S6 ΟΛλ 配列番号： 6 S00I0 / S6dT / XD <I 68 £ 7S6 ΟΛλ SEQ ID NO: 6
配歹 ϋの長さ ： 106アミノ酸 System length: 106 amino acids
配列の型：アミノ酸 Sequence type: amino acid
配列の ：ぺプチド Sequence of: peptide
^物名：キャンディダ*ュティ リス （Candida utilis) ^ Object name: Candida utilis
株名： ATCC9950  Stock Name: ATCC9950
配列 Array
Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu  Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu
5 10 15 5 10 15
Cys Arg Lys His Thr Gin His Lys Val Thr Gin Tyr Lys Ala Gly Lys Cys Arg Lys His Thr Gin His Lys Val Thr Gin Tyr Lys Ala Gly Lys
20 25 30  20 25 30
Ala Ser Leu Phe Ala Gin Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gin Ser  Ala Ser Leu Phe Ala Gin Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gin Ser
35 40 45  35 40 45
Gly Tyr Gly Gly Gin Thr Lys Pro Val Phe His Lys Lys Ala Lys Thr Gly Tyr Gly Gly Gin Thr Lys Pro Val Phe His Lys Lys Ala Lys Thr
50 55 60 50 55 60
Thr Lys Lys Val Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Val Cys Lys Thr Lys 65 70 75 80 Thr Lys Lys Val Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Val Cys Lys Thr Lys 65 70 75 80
Ala Gin Leu Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp Ala Gin Leu Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp
85 90 95 85 90 95
Lys Lys Gin Lys Gly Gin Ala Leu Gin Phe Lys Lys Gin Lys Gly Gin Ala Leu Gin Phe
100 105
Figure imgf000165_0001
： 7 100 105
Figure imgf000165_0001
: 7
E^IJの長さ： 9 7 5 m  Length of E ^ IJ: 9 7 5 m
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 鎖 Number of chains: chains
配列の觀： Genomi c DNA Sequence view: Genomi c DNA
^^物名：キャンディダ*ュティリス （Cand i d? u t i l i s) ^^ Product name: Candida dutilis (Cand i d? U t i l i s)
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
AAGCTTACAG CGAGCACTCA AATCTGCCCT CCGAGCCCTC CGGCCCTCTC TTCAACAAAC 60 TCGCGCTGCA CTTCGTCGTC AGTGGTGCCA ATCACCCAAC GTGGAGGTAT CAAGAGGTGC 120 TCCAGCCCAC AAAGCGACAT CAAAGACAAC AACCCTGCCG GCCTACGTCC TACACACCCT 180AAGCTTACAG CGAGCACTCA AATCTGCCCT CCGAGCCCTC CGGCCCTCTC TTCAACAAAC 60 TCGCGCTGCA CTTCGTCGTC AGTGGTGCCA ATCACCCAAC GTGGAGGTAT CAAGAGGTGC 120 TCCAGCCCAC AAAGCGACAT CAAAGACAAC AACCCTGCCG GCCTACGTCC TACACACCCT 180
GGTGATCGCA GACATTGTAC AAGGTGCCAC GCAATAACCT ACAGGCACCG CACATGACGA 240GGTGATCGCA GACATTGTAC AAGGTGCCAC GCAATAACCT ACAGGCACCG CACATGACGA 240
TGGCCTTGGT TGTGCAACCA GTGACTTCCA CGGTCCACGC AGCAACATGA ACCACACCAC 300TGGCCTTGGT TGTGCAACCA GTGACTTCCA CGGTCCACGC AGCAACATGA ACCACACCAC 300
CCAGAATCGA TGCGCGCAAC AACAGTTGTT CCGGTTCACT CAGCCCCACA GCGAGTCGCT 360CCAGAATCGA TGCGCGCAAC AACAGTTGTT CCGGTTCACT CAGCCCCACA GCGAGTCGCT 360
GGCAGAACAC GAGCCTGAGG GCGGAAAGAG GGTAGAGGAA AGCGCAAGGA CAGGGGACAA 420GGCAGAACAC GAGCCTGAGG GCGGAAAGAG GGTAGAGGAA AGCGCAAGGA CAGGGGACAA 420
CCTGGCCCAA TTGATGTCAT ATAAACCCTC TCGATCAATT GAGCACACTC ATCCGCCAAT 480CCTGGCCCAA TTGATGTCAT ATAAACCCTC TCGATCAATT GAGCACACTC ATCCGCCAAT 480
TGACCCCTGT TCGCAGCTCC ACGCCCCATG TTCCTCGTCC CTGGTGTAGC TTCTCCCCTA 540TGACCCCTGT TCGCAGCTCC ACGCCCCATG TTCCTCGTCC CTGGTGTAGC TTCTCCCCTA 540
AATTCCAGCG CTTGGTTCCG CCCTCCCTGT CTCCCGGGTT TAACGAACGT GTGTACCATC 600AATTCCAGCG CTTGGTTCCG CCCTCCCTGT CTCCCGGGTT TAACGAACGT GTGTACCATC 600
TGATGGTAAT CCGCTCCCGT CCGCGCAACA CAACTCACAA GCAGATCACA CCTGTACACG 660TGATGGTAAT CCGCTCCCGT CCGCGCAACA CAACTCACAA GCAGATCACA CCTGTACACG 660
CCGCTGCTGA TGCGCCCAAT TTAATTTTTT TTCTCTCAAT GTAGGGGAGA AGCCTTGGGA 720CCGCTGCTGA TGCGCCCAAT TTAATTTTTT TTCTCTCAAT GTAGGGGAGA AGCCTTGGGA 720
GCTCCCGACT CCCAGTTGGG CACAGCTGCC ACCTCATGAC TTTTCCTGTG TGTGCCTGTC 780GCTCCCGACT CCCAGTTGGG CACAGCTGCC ACCTCATGAC TTTTCCTGTG TGTGCCTGTC 780
TGACGTTACG TGTGATGTAG TGGCCCCCGT TCGGTGTGTT TTCGCCTGTT GCGCTGTGCC 840TGACGTTACG TGTGATGTAG TGGCCCCCGT TCGGTGTGTT TTCGCCTGTT GCGCTGTGCC 840
CCCCTTAAAA GTATAAAAGG AAGTGCAATT GCTGTTTGTG TTGATTGTTG ATCCTTGTTT 900CCCCTTAAAA GTATAAAAGG AAGTGCAATT GCTGTTTGTG TTGATTGTTG ATCCTTGTTT 900
CCTCTGTTTC CTCCTCATCA CACAAGAAAG GTTTCTTCTT TCCAACAGAT ACAAAACACA 960 CTTACAAACA ACATA 配列番号： 8 CCTCTGTTTC CTCCTCATCA CACAAGAAAG GTTTCTTCTT TCCAACAGAT ACAAAACACA 960 CTTACAAACA ACATA SEQ ID NO: 8
配歹 |Jの長さ ： 8 .0 2 Distribution system | Length of J: 8.02
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の驄： Genomi c DNA Sequence 驄: Genomi c DNA
起源 Origin
¾ ^物名：キャンディダ*ュティ リス （Candi da ut i l i s)  ¾ ^ Name: Candi da utiris
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
ATTGTATGAC TTTTATTTAT GGGATTACGT TATAAATTAT GATCCTCATG GATTATCTTA 60 TTAAGTCTCC ATCTTGTAGC TTGTAATATG ATGAACACTC GTGAGTTTTC CAGGTAATTC 120 ACCGTGCCTC GTCCATGCAC TTTTATCAGC CTCGACGTCA TACATTGCAT GGTGAGTAAC 180 TGGAAAACGG CTTTTTACGT TCTGTTGTAT ATGGCTAAAC GCTTCTATGG CACGGCGCTA 240 TTAACCTGTC TGACATTTCA ACCTGGTGTT GATGGCTTAA ACGATAATAC GGTGAGATAT 300 ATAGCTAACA GAATGGGGGT GACGCACTGA TTCCACTGTA TATATAGGCG ATATGTGTTG 360 TTGGATGGAC GTTTCTTTGT CTCCTGATCC ACAATAGTAG CTCAGCTCCG TGCCAACTGG 420 TTCGCTGGTA CGATAGTGAG GGATGAATGA AACCTTTTCG TTTTCTTCTG CGCTTCCACG 480 GAACTGTGTA GATTTCTCTC GTGAATAGCG AGTTAAGCCA CGAGTGGGGT CTGCAATTGA 540 AGGTGTGATA CCAGAGTCAA AAGTTTGGAT GTGATGGAAA CTTCAAAGGC TTCTCGGTGG 600 TATATCAAAC GATTCACAGA GGTAGAAGCG GATCTTGAAG GCCAGAATAT GCATTAAAAC 660 CAGCGTATAT CAGTTTTGCT TTCCCAGAGA GGACTTTTGC ATTATTCTTC AGCTTTATCC 720 CTGGATTTTG GGAGATGAAA CATTGACAAA GCTGGTTCGT GATCCTAAAT ACTTGCCTAC 780 TGACTCCTGA GGTATTACAC GT 配列番号： 9 ATTGTATGAC TTTTATTTAT GGGATTACGT TATAAATTAT GATCCTCATG GATTATCTTA 60 TTAAGTCTCC ATCTTGTAGC TTGTAATATG ATGAACACTC GTGAGTTTTC CAGGTAATTC 120 ACCGTGCCTC GTCCATGCAC TTTTATCAGC CTCGACGTCA TACATTGCAT GGTGAGTAAC 180 TGGAAAACGG CTTTTTACGT TCTGTTGTAT ATGGCTAAAC GCTTCTATGG CACGGCGCTA 240 TTAACCTGTC TGACATTTCA ACCTGGTGTT GATGGCTTAA ACGATAATAC GGTGAGATAT 300 ATAGCTAACA GAATGGGGGT GACGCACTGA TTCCACTGTA TATATAGGCG ATATGTGTTG 360 TTGGATGGAC GTTTCTTTGT CTCCTGATCC ACAATAGTAG CTCAGCTCCG TGCCAACTGG 420 TTCGCTGGTA CGATAGTGAG GGATGAATGA AACCTTTTCG TTTTCTTCTG CGCTTCCACG 480 GAACTGTGTA GATTTCTCTC GTGAATAGCG AGTTAAGCCA CGAGTGGGGT CTGCAATTGA 540 AGGTGTGATA CCAGAGTCAA AAGTTTGGAT GTGATGGAAA CTTCAAAGGC TTCTCGGTGG 600 TATATCAAAC GATTCACAGA GGTAGAAGCG GATCTTGAAG GCCAGAATAT GCATTAAAAC 660 CAGCGTATAT CAGTTTTGCT TTCCCAGAGA GGACTTTTGC ATTATTCTTC AGCTTTATCC 720 CTGGATTTTG GGAGATGAAA CATTGACAAA GCTGGTTCGT GATCCTAAAT ACTTGCCTAC 780 TGACTCCTGA GGTATTACAC GT SEQ ID NO: 9
配歹 ϋの長さ： 5 9 9 Distribution system Length: 5 9 9
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の觀： Genomi c DNA Sequence view: Genomi c DNA
起源 Origin
¾ ^物名：キャンディダ'ュティ リス （Cand i da ut i l i s)  ¾ ^ Name: Candida utilis (Candi da ut i li s)
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
配列 Array
TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCG 60 GTGTTTTGGG CAGTGGGACC AAATCGATGC CCATGTTGTT TTTTTGTATT TTCGCAACTT 120 TTTCCCCATT CGGTCATACC GAAGGCGGTT CAAGCCTGCA AGAGACAACA ACTATGGCTG 180 CTGTTCTTGG AATGAAAATA AACGCATTTG GAAGTTTTGC AGCCAAAACA GGATGCGTTT 240 TCGCCATTTC GGTGCGGCAT TTCCGGTTTC AGATTTTCGC GAAATTTGTT TTTCCCATCA 300 AATCTGCAAA TTTCGGAAAC GGGCCGCGCT GATTGGCTGC GTCCTGAAGC GGCAATTTTT 360 CTCCCTCTCG TTTGTTGATA CAACCAAGAA TTTCTTTTCG TGCTCTGCGC CAGCGCTATC 420 CAAATGTTTA TAAATCTTGA TGTGATTTCC CGTTTTCTGT CCTTGCTCAT TCTGTCTCTC 480 TGTTGAACCA TTGTTGTTTT ACGAACTCAA GGTCCAATTG GAACAGTATG TGCACTGCCA 540 ATGGAGCATT GAAAGGGTTA TTCGATGTCG TCACCACGTG ATACTAACCA TTGATATAG 配列番号： 1 0 TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCG 60 GTGTTTTGGG CAGTGGGACC AAATCGATGC CCATGTTGTT TTTTTGTATT TTCGCAACTT 120 TTTCCCCATT CGGTCATACC GAAGGCGGTT CAAGCCTGCA AGAGACAACA ACTATGGCTG 180 CTGTTCTTGG AATGAAAATA AACGCATTTG GAAGTTTTGC AGCCAAAACA GGATGCGTTT 240 TCGCCATTTC GGTGCGGCAT TTCCGGTTTC AGATTTTCGC GAAATTTGTT TTTCCCATCA 300 AATCTGCAAA TTTCGGAAAC GGGCCGCGCT GATTGGCTGC GTCCTGAAGC GGCAATTTTT 360 CTCCCTCTCG TTTGTTGATA CAACCAAGAA TTTCTTTTCG TGCTCTGCGC CAGCGCTATC 420 CAAATGTTTA TAAATCTTGA TGTGATTTCC CGTTTTCTGT CCTTGCTCAT TCTGTCTCTC 480 TGTTGAACCA TTGTTGTTTT ACGAACTCAA GGTCCAATTG GAACAGTATG TGCACTGCCA 540 ATGGAGCATT GAAAGGGTTA TTCGATGTCG TCACCACGTG ATACTAACCA TTGATATAG SEQ ID NO: 10
配列の長さ： 1 1.8 Array length: 1 1.8
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の觀： Genomi c DNA Sequence view: Genomi c DNA
起源 Origin
物名：キヤンディダ*ュティリス （Candi da ut i l i s)  Product name: Cany da utilis (Candi da ut i lis)
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
配列 Array
GCCGCTAATA CCCCTTAGGT TTTCGTTTCA TACATAGAGT GGTTGTTGTT TAACATTTTA 60 TCGTGATTAA TTTTTAATCG AGTAATATAT TATTGGAAAA GTTTTTAGAC TTTGAAGCGT 120 AGTATCGGTG GCTTTGCGGA GCTTAGCGCT GTGTCCTTTC TCCGTTGTTT ATGGAGTGTT 180 GATGTTTTGT GATTTACAGC GATGTCCGGG TTTTTGTGTA CACGCTGCCC TTGAACCAAA 240 AAAAAAGCTG CTGGGAATCG ATCGAGGGAA AAAACATCAC CAAAAAAAAA ACAAACAGCA 300 GAAAGTAAAC AAACAACATT ACAAACAACA ACATCACACA GCGGCACGCT TTAAACCAGG 360 GCGGTAGTGA CGTGACTTGC TTGTTTTCGA TCAGCGAGTG CGGTGTTATC GATATCTTCG 420 AATCTGCTTA TAGTTCAAGA ACGCCTGGAT CCCAAGCGTA GTGAAGTGTT CTCTTTTGTT 480TACTTTCTGT TTTGTATATT AGTTCGGAAC CCATTAGAAA AGGTTCATCT CTGAGATAAA 540 GAGCAAAGAC GCACGAGACA ATCAATCATT TGAGATGGGA TCAGTATCAG CGGAGAGTGC 600 TGATAAGATT GAGGAGAACA GAGCAACTGG GGCTTGTTTG GACATTCTCT CACCACCAAA 660 GCCTTCGTCA ACGTCCACAC CACCTACAGC GACTGCTGGT GCCATTGGCG GGTCTGGTAA 720 TGAAACCAGT GACAGCTTCA ATCCTTTTGA GAAGGACTCA CTGGATGAAT CTGCTTCGGT 780 GTTATCCACA AAGCAACTGC TTGCTGAGGG ACAGGGATCA AATGCCCTGC CATCTGAACT 840 CGTTGATATC AACTTGGCGA TTAGCGCTCT TAACTTGGAC TTTGACGGTC AAAAACGTGG 900 ACAAACTACA GCCACTACAG AGCCAGTAGG TGTTTTGAAA GATGGTGCCG AACCTAGTGC 960GCCGCTAATA CCCCTTAGGT TTTCGTTTCA TACATAGAGT GGTTGTTGTT TAACATTTTA 60 TCGTGATTAA TTTTTAATCG AGTAATATAT TATTGGAAAA GTTTTTAGAC TTTGAAGCGT 120 AGTATCGGTG GCTTTGCGGA GCTTAGCGCT GTGTCCTTTC TCCGTTGTTT ATGGAGTGTT 180 GATGTTTTGT GATTTACAGC GATGTCCGGG TTTTTGTGTA CACGCTGCCC TTGAACCAAA 240 AAAAAAGCTG CTGGGAATCG ATCGAGGGAA AAAACATCAC CAAAAAAAAA ACAAACAGCA 300 GAAAGTAAAC AAACAACATT ACAAACAACA ACATCACACA GCGGCACGCT TTAAACCAGG 360 GCGGTAGTGA CGTGACTTGC TTGTTTTCGA TCAGCGAGTG CGGTGTTATC GATATCTTCG 420 AATCTGCTTA TAGTTCAAGA ACGCCTGGAT CCCAAGCGTA GTGAAGTGTT CTCTTTTGTT 480TACTTTCTGT TTTGTATATT AGTTCGGAAC CCATTAGAAA AGGTTCATCT CTGAGATAAA 540 GAGCAAAGAC GCACGAGACA ATCAATCATT TGAGATGGGA TCAGTATCAG CGGAGAGTGC 600 TGATAAGATT GAGGAGAACA GAGCAACTGG GGCTTGTTTG GACATTCTCT CACCACCAAA 660 GCCTTCGTCA ACGTCCACAC CACCTACAGC GACTGCTGGT GCCATTGGCG GGTCTGGTAA 720 TGAAACCAGT GACAGCTTCA ATCCTTTTGA GAAGGACTCA CTGGATGAAT CTGCTTCGGT 780 GTTATCCACA AAGCAACTGC TTGCTGAGGG ACAGGGATCA AATGCCCTGC CATCTGAACT 840 CGTTGATATC AACTTGGCGA TTAGCGCTCT TAACTTGGAC TTTGACGGTC AAAAACGTGG 900 ACAAACTACA GCCACTACAG AGCCAGTAGG TGTTTTGAAA GATGGTGCCG AACCTAGTGC 960
TACAGGATCA GACGACCACC CGCCACCAGC TCTGTATCCA CCAGGTATGA TCCCACAGCA 1020TACAGGATCA GACGACCACC CGCCACCAGC TCTGTATCCA CCAGGTATGA TCCCACAGCA 1020
CATGCCATTT TTCCCGCTAA ACGAATTTGG ACAGCCAATG CATGCACCAT TCCCTGGAGA 1080CATGCCATTT TTCCCGCTAA ACGAATTTGG ACAGCCAATG CATGCACCAT TCCCTGGAGA 1080
CCATCCACAT AGTCCAATCC CGTGGGATTC CAAACCTGGA CAGACTCCTT TTGGTTTAAT 1140 GGGATCTCAT GGCCCAAATA TGGATGGGTT ACGCTCACAA ATGGTACC 番号： 1 1 CCATCCACAT AGTCCAATCC CGTGGGATTC CAAACCTGGA CAGACTCCTT TTGGTTTAAT 1140 GGGATCTCAT GGCCCAAATA TGGATGGGTT ACGCTCACAA ATGGTACC Number: 1 1
配列の長さ： 1 9 2 1塩基 Sequence length: 1921 bases
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の ： Genomi c DNA Sequence of: Genomi c DNA
起源 Origin
¾ ^物名：キャンディダ*ュティ リス （Candi da u t i l i s)  ¾ ^ Product name: Candi da utiris
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
配列 Array
GATCATGTTT CGTACAAAAC ACCGCCACTC CGTTATGAGA AAGTCATAGT TATATTTCGG 60 GGAAACTTAT GTTGCTTGCA AGGAATAATA GACAGACAAA TGTTTTACGA AACTGAAGGA 120 TTAATACAAT TGATGCAAAA AAACAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAACA 180 AAAACACAAA AACACAAAGA AAAAAAACAC AAAGAAAAAA AACACAGAAC ATCCAAAACA 240 AAACAACAAT ATATATATAT TTGCTAATAC CATCACCCTC CCTCATACAA AAAAAAAAAG 300 AAAATGGAAG GAGCACGTAT ATCTTTTCTA TGATCTTTGG ATATGGAATA GATAAGCAAC 360 CCCTCTAGTG AAGTACACAT CAAGATACTT GGGGAGCAAA CTGAGAGCAC ATGATATACA 420 CGAAAGCCAC CATATATCAT ATATAAAAAT ATGAAACATG AAAAGTTATT CATCTGTTGG 480 ATTCACTTTT ATATGTTTTC ATGCATTGTC TACTCTATGC CTCTGTCTTT TCTCTGTTCC 540
Figure imgf000170_0001
GATCATGTTT CGTACAAAAC ACCGCCACTC CGTTATGAGA AAGTCATAGT TATATTTCGG 60 GGAAACTTAT GTTGCTTGCA AGGAATAATA GACAGACAAA TGTTTTACGA AACTGAAGGA 120 TTAATACAAT TGATGCAAAA AAACAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAACA 180 AAAACACAAA AACACAAAGA AAAAAAACAC AAAGAAAAAA AACACAGAAC ATCCAAAACA 240 AAACAACAAT ATATATATAT TTGCTAATAC CATCACCCTC CCTCATACAA AAAAAAAAAG 300 AAAATGGAAG GAGCACGTAT ATCTTTTCTA TGATCTTTGG ATATGGAATA GATAAGCAAC 360 CCCTCTAGTG AAGTACACAT CAAGATACTT GGGGAGCAAA CTGAGAGCAC ATGATATACA 420 CGAAAGCCAC CATATATCAT ATATAAAAAT ATGAAACATG AAAAGTTATT CATCTGTTGG 480 ATTCACTTTT ATATGTTTTC ATGCATTGTC TACTCTATGC CTCTGTCTTT TCTCTGTTCC 540
Figure imgf000170_0001
Figure imgf000171_0001
： 1 2
Figure imgf000171_0001
: 1 2
配列の長さ： 1 7.9 8¾m Array Length: 17.9 8¾m
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の觀： Genomi c DNA 物名：キャンディダ'ュティ リス （Cand i da, u t i l i s) Sequence view: Genomi cDNA Name of product: Candida da utiris
株名： A T C C 9 9 5 0  Stock name: ATCCC 995 0
配列 Array
AAGCTTATAG AATTTGAAGA TATAAAAACA CAACAAAGCT ATGAAAGCAA TGAGGGGACG 60 AAGCTTATAG AATTTGAAGA TATAAAAACA CAACAAAGCT ATGAAAGCAA TGAGGGGACG 60
ATTTGATGAA CAGAAGGAGC TATTCCCATT AATTTAATAT CTACCAATAG ATATGTCAGT 120ATTTGATGAA CAGAAGGAGC TATTCCCATT AATTTAATAT CTACCAATAG ATATGTCAGT 120
CAAACATGTC AGAAGTCATA CTCACTAATT ATATGAGCGG GTGCGTTAGA TATTTATATG 180CAAACATGTC AGAAGTCATA CTCACTAATT ATATGAGCGG GTGCGTTAGA TATTTATATG 180
AGTTTGCATC TTTCTACATG GGGCTTTCAA GTAACTGGAA GTAATACAAC TTTTGTTTAA 240AGTTTGCATC TTTCTACATG GGGCTTTCAA GTAACTGGAA GTAATACAAC TTTTGTTTAA 240
GTTGATAAAA ACAAAAAACA AAAAAACAAA AAACAAAAAA ACAAAAATAA AAAAAAAAAA 300GTTGATAAAA ACAAAAAACA AAAAAACAAA AAACAAAAAA ACAAAAATAA AAAAAAAAAA 300
AAACAAAAAA AAAAAAACAC ACACGCACAC ACACACATAT ACAAACACAT ACAAAAAACT 360AAACAAAAAA AAAAAAACAC ACACGCACAC ACACACATAT ACAAACACAT ACAAAAAACT 360
TATCATAATT AAGATAAATG AAAGCTATCT AAAATTTCCA GACATTTTCT GAAAAAGTGG 420TATCATAATT AAGATAAATG AAAGCTATCT AAAATTTCCA GACATTTTCT GAAAAAGTGG 420
CTGCCAGCTT TATTGCTTTG CTTTAAATTT ATAAAGAAAA CTTCTTTGAA ATCGAATATG 480AAACAAGAGG AAACGGATGA AAGGATAAAA CACAAATACA GGAAAACATT ATTACAAATA 540CTGCCAGCTT TATTGCTTTG CTTTAAATTT ATAAAGAAAA CTTCTTTGAA ATCGAATATG 480AAACAAGAGG AAACGGATGA AAGGATAAAA CACAAATACA GGAAAACATT ATTACAAATA 540
AAGCACCTGT AAGAGATAAA TTTGTTACAT TTAAAGGATT CTACTTACAT ATACAGAGAA 600AAGCACCTGT AAGAGATAAA TTTGTTACAT TTAAAGGATT CTACTTACAT ATACAGAGAA 600
AGCAATTTCA TAGACATAGG GTCTACCGAA CAGTCTTGAT ATTTCAGACT AGTATTTTTG 660AGCAATTTCA TAGACATAGG GTCTACCGAA CAGTCTTGAT ATTTCAGACT AGTATTTTTG 660
TTGTATTATG GGGCTTGGTC GGTATGTTAG TAAAAAGTTC ATTTTAAAAT TTTCCAAGAA 720TTGTATTATG GGGCTTGGTC GGTATGTTAG TAAAAAGTTC ATTTTAAAAT TTTCCAAGAA 720
GTGTTTTTAT TGCAGAAAAA TATCCGTGGT TCAAGAGATA ATGGGCTGTA AATTTGTTTT 780GTGTTTTTAT TGCAGAAAAA TATCCGTGGT TCAAGAGATA ATGGGCTGTA AATTTGTTTT 780
GTACCAAAAA TATCTTAATT AATACAAAGA ATACCTTTTA TGAAGGTAGA TCAAGATCTT 840GTACCAAAAA TATCTTAATT AATACAAAGA ATACCTTTTA TGAAGGTAGA TCAAGATCTT 840
AAATTTCATT ACTCAGAAAT GAATATACTT GAAACTTCCG AAATACTATG TTATGGGGAA 900 CAAATAAGAG GAGCCATTTC ATATTTATTT TGGAAAGATC GTTTTCTATG CGCAGTTGTT 960AAATTTCATT ACTCAGAAAT GAATATACTT GAAACTTCCG AAATACTATG TTATGGGGAA 900 CAAATAAGAG GAGCCATTTC ATATTTATTT TGGAAAGATC GTTTTCTATG CGCAGTTGTT 960
GGAATAGCGA TATTATCATG ACCTTATATT CAGTCAGAGA AAATAGGGTA CGAATTTGAA 1020GGAATAGCGA TATTATCATG ACCTTATATT CAGTCAGAGA AAATAGGGTA CGAATTTGAA 1020
AACAATGTTT CAGCTTCAAA GAGGACCTTT AAACGGTCAG GCAAAAGTTG AGGTGTCAGT 1080AACAATGTTT CAGCTTCAAA GAGGACCTTT AAACGGTCAG GCAAAAGTTG AGGTGTCAGT 1080
GTGTATAAAA ATGTTCAATT CATTTTTGGT TGAAAGATGC TTTAAAAGGT TGGTGCAAAG 1140GTGTATAAAA ATGTTCAATT CATTTTTGGT TGAAAGATGC TTTAAAAGGT TGGTGCAAAG 1140
AATCATATAT GTGTATTGGC TAGTTAAAAG TTGCTTTATT AAAAATATAT GCAAACTAAA 1200AATCATATAT GTGTATTGGC TAGTTAAAAG TTGCTTTATT AAAAATATAT GCAAACTAAA 1200
TTGTCTATAC GATTGATAAG GTGAAACTTA GATAAACAAT GAAAAAGGAA GGTGCTTTGA 1260TTGTCTATAC GATTGATAAG GTGAAACTTA GATAAACAAT GAAAAAGGAA GGTGCTTTGA 1260
AAACCGACCA GCTTCAAATA AATATGTAAC TATTTTTATG GATGTGAAAA TTAAATGTTG 1320AAACCGACCA GCTTCAAATA AATATGTAAC TATTTTTATG GATGTGAAAA TTAAATGTTG 1320
TCGAATCTGC TGTTTCTAGA TTTGTAGATG AAAATGTTGA CGTGAGAGTT TTCATTTGTT 1380TCGAATCTGC TGTTTCTAGA TTTGTAGATG AAAATGTTGA CGTGAGAGTT TTCATTTGTT 1380
TGTATTTTAT ATTATGCTTT GATTACTACT CATAGCTTGG GTTTAGCATG GCCTGAGTAA 1440TGTATTTTAT ATTATGCTTT GATTACTACT CATAGCTTGG GTTTAGCATG GCCTGAGTAA 1440
GTAGGAAGAT CCAATAAATT GACTGTTGTC GTTTTGAAAT TAAATACTGA AATGAATAAA 1500GTAGGAAGAT CCAATAAATT GACTGTTGTC GTTTTGAAAT TAAATACTGA AATGAATAAA 1500
AGTTTGACGA GAAAAGACCT GAAATATATA AAAATGTTTT GTATTATTTA AGTCGGTTAC 1560AGTTTGACGA GAAAAGACCT GAAATATATA AAAATGTTTT GTATTATTTA AGTCGGTTAC 1560
ATTCTCTCAC TTTATTGTAA CAACCATTAT AGTGATGGGG AAAAAATAAA ACATAAGCCA 1620ATTCTCTCAC TTTATTGTAA CAACCATTAT AGTGATGGGG AAAAAATAAA ACATAAGCCA 1620
CATAAGGAGA TATTGTTCTT TATTGAAAGG ATGGAATCAT TTTCTGGAAA TGTCAAAAAT 1680CATAAGGAGA TATTGTTCTT TATTGAAAGG ATGGAATCAT TTTCTGGAAA TGTCAAAAAT 1680
TAAATATTAC TTGGTTTTTG ATGAATTGTA GAAGAAAAAG TAAATGCTGC TATTCTCTTT 1740TAAATATTAC TTGGTTTTTG ATGAATTGTA GAAGAAAAAG TAAATGCTGC TATTCTCTTT 1740
CTTTACATTT TCCATGTTTC CTGATTCTGG CTATGTCACT TTAAGTTGTT GAGATATC 1798 配列番号： 1 3 CTTTACATTT TCCATGTTTC CTGATTCTGG CTATGTCACT TTAAGTTGTT GAGATATC 1798 SEQ ID NO: 1 3
,配列の長さ ： 1 0 5 4¾g , Array length: 1 0 5 4¾g
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖  Number of chains: double strand
配列の顧： Genomi c DNA 物名：キャンディダ'ュティ リス （Cand i da u t i l i s)  Reference of sequence: Genomi cDNA Name of product: Candida da utiris
株名： A T C C 9 9 5 0 0/ & : z ΟΑλ Stock Name: ATCC 9 9 5 0 0 / &: z ΟΑλ
τ卜 τ o o  τ u τ o o
C  C
Figure imgf000173_0001
Figure imgf000173_0001
§l ,v vvvv一 ε  §L, v vvvv-ε
,VVJU!UVV , VVJU! UVV
配列番号： 1 4 SEQ ID NO: 1 4
配列の長さ： 3 . m  Array Length: 3.m
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖  Number of chains: single strand
配列の鷗：合成 DNA  Sequence 鷗: Synthetic DNA
配列の特徴  Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
GGTCGACATA TCGTGGTAAG CGCCTTGTCA 30 番号： 1 5 GGTCGACATA TCGTGGTAAG CGCCTTGTCA 30 Number: 1 5
配列の長さ ： 3 0驢  Sequence length: 3 0 ass
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鑌  Number of chains: one strand
配列の ：合成 DNA  Sequence of: synthetic DNA
の特徴  Features of
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
,配列 , Array
TTCTAGACTT TATCCGCCAG TATGTTAGTC 30 配列番号： 1 6  TTCTAGACTT TATCCGCCAG TATGTTAGTC 30 SEQ ID NO: 16
配列の長さ ： 3 3塩基  Sequence length: 3 3 bases
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 配列の ：合成 DNA Number of chains: single strand Sequence of: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
GGGTACCTAA CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAC 33 配列番号： 1 7 GGGTACCTAA CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAC 33 SEQ ID NO: 1 7
配歹 |Jの長さ ： 3 0 ¾¾ Distribution system | Length of J: 30 ¾¾
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の ：合成 DNA Sequence of: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
GGAATTCAAC ATGAATGACA CGACGAAGGT 30 配列番号： 1 8 GGAATTCAAC ATGAATGACA CGACGAAGGT 30 SEQ ID NO: 18
配列の長さ ： 1 0 ¾¾ Array length: 10 ¾¾
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の ：他の核酸 Sequence of: other nucleic acids
配列 Array
AGCGGCCGCT 10 配列番号： 1 9 AGCGGCCGCT 10 SEQ ID NO: 1 9
配歹 ijの長さ： 3 o^m Length of system ij: 3 o ^ m
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の觀：合成 DNA Sequence view: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
ACCACTATTA CCACTACGGT TTGCTCTACA 30 配列番号： 2 0  ACCACTATTA CCACTACGGT TTGCTCTACA 30 SEQ ID NO: 20
配歹 ijの長さ ： 3 o^m Length of system ij: 3 o ^ m
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の S¾：合成 DNA Sequence S の: Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す言己号：プライマー  Characters expressing characteristics: primer
配列 Array
GACACATCTC TGAGCAGCAT GACTTGGTTG 30 番号： 2 1 GACACATCTC TGAGCAGCAT GACTTGGTTG 30 No .: 2 1
配列の長さ ： 1 2.驢 Array length: 1 2. Donkey
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の顧：合成 DNA Sequence Reference: Synthetic DNA
CTAGATGGTA GG 12 配列番号： 2 2 CTAGATGGTA GG 12 SEQ ID NO: 22
配列の長さ ： 1 0¾¾ Array length: 10¾¾
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
配列の ：他の核酸 Sequence of: other nucleic acids
配列 Array
CCGGATCCGG 1 0 配列番号： 2 3  CCGGATCCGG 1 0 SEQ ID NO: 2 3
配列の長さ ： 3 1塩基 Sequence length: 31 bases
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の鰂：合成腿 鰂 of the array: synthetic thigh
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマ' CCAAGCTTAC AGCGAGCACT CAAATCTGCC C 31 配列番号： 2 4 Characteristic symbol: Primer ' CCAAGCTTAC AGCGAGCACT CAAATCTGCC C 31 SEQ ID NO: 24
配列の長さ： 3 Array Length: 3
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の觀：合成 DNA Sequence view: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
CCTCTAGATA TGTTGTTTGT AAGTGTGTTT TGTATC 36 配列番号： 2 5  CCTCTAGATA TGTTGTTTGT AAGTGTGTTT TGTATC 36 SEQ ID NO: 25
E ^の長さ ： 3 0驢 E ^ Length: 30 Don
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の 合成 DNA Sequence Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
GGGATCCATT GTATGACTTT TATTTATGGG 30 番号： 2 6 GGGATCCATT GTATGACTTT TATTTATGGG 30 N °: 2 6
配歹 ijの長さ： 3 0  Length of system ij: 3 0
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖  Number of chains: single strand
配列の ：合成 DNA  Sequence of: synthetic DNA
配列の特徴  Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列  Array
GGACTAGTGA GATGACTCTA GGCATCTTCT 30 配列番号： 2 7  GGACTAGTGA GATGACTCTA GGCATCTTCT 30 SEQ ID NO: 27
配列の長さ ： 2 6驢  Sequence length: 2 6 ass
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖  Number of chains: single strand
'配列の ：合成 DNA 'Sequence: synthetic DNA
配列の特徴  Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
ATGACTGATA CATCATCCTC TTCATC 26 配列番号： 2 8 ATGACTGATA CATCATCCTC TTCATC 26 SEQ ID NO: 2 8
配列の長さ ： 2 8 Array length: 2 8
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の觀：合成 DNA Sequence view: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
TAACGACAGC TGGCAAACCG ACTGGGAC 配列番号： 2 9  TAACGACAGC TGGCAAACCG ACTGGGAC SEQ ID NO: 29
配列の長さ ： 3 4 ¾S Array length: 3 4 ¾S
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の觀：合成 DNA Sequence view: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
GGCGGCCGCA ATTAACCCTC ACTAAAGGGA ACGA 34 配列番号： 3 0 GGCGGCCGCA ATTAACCCTC ACTAAAGGGA ACGA 34 SEQ ID NO: 30
の長さ： 3 2^  Length: 3 2 ^
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の顧：合成 DNA Sequence Reference: Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
m\ m \
TTCTAGACTA TATCAATGGT TAGTATCACG TG 32 番号： 3 1  TTCTAGACTA TATCAATGGT TAGTATCACG TG 32 Number: 3 1
配列の長さ： 2 5¾m Array Length: 25¾m
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の顧：合成 DNA Sequence Reference: Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
CCGGTACCTA AGCCGCTAAT ACCCC 25 配列番号： 3 2 CCGGTACCTA AGCCGCTAAT ACCCC 25 SEQ ID NO: 3 2
配列の長さ： 3 5-¾g Sequence length: 3 5-¾g
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の顧：合成 DNA Sequence Reference: Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
GGGCGGCCGC ACTCGCTGAT CGAAA 25 配列番号： 3 3  GGGCGGCCGC ACTCGCTGAT CGAAA 25 SEQ ID NO: 3 3
配列の長さ： 2 5¾¾ Array length: 25¾¾
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖Number of chains: single strand
Figure imgf000182_0001
：合成 NA
Figure imgf000182_0001
： Synthetic NA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
GGTCTAGATA TGAAAAAGCC TGAAC 25 配列番号： 3 4 GGTCTAGATA TGAAAAAGCC TGAAC 25 SEQ ID NO: 3 4
E^jの長さ ： 2 5  Length of E ^ j: 2 5
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の顧：合成 DNA Sequence Reference: Synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
配列 Array
GGAGATCTAT TCCTTTGCCC TCGGA 25 配列番号： 3 5  GGAGATCTAT TCCTTTGCCC TCGGA 25 SEQ ID NO: 35
配列の長さ： 2 0驢  Sequence length: 20 ass
配列の型：核酸  Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖  Number of chains: single strand
配列の ：合成 DNA  Sequence of: synthetic DNA
配列の特徴  Array features
特徴を表す記号：プライマー  Characteristic code: Primer
'配列 'Array
CAAGTTGATC CTTCTCCGGA 20 配列番号： 3 6 CAAGTTGATC CTTCTCCGGA 20 SEQ ID NO: 3 6
配列の長さ： 2 o.^m Array length: 2 o. ^ M
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の觀：合成 DNA Sequence view: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマ'  Characteristic symbol: Primer '
配列 Array
GAAACTTCTC GACAGACGTC 20 配列番号： 3 7  GAAACTTCTC GACAGACGTC 20 SEQ ID NO: 3 7
配列の長さ： 2 0塩基 Sequence length: 20 bases
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
配列の種類：合成 DNA Sequence type: synthetic DNA
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号：プライマ'  Characteristic symbol: Primer '
配列 Array
CATCGGGTAA GGTCTACATG 20  CATCGGGTAA GGTCTACATG 20

Claims

83 請 求 の 範 囲 83 Scope of Claim
1 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ ー ム 構成蛋 白 質 L 4 1 を コ ー ドす る 遣伝子配列 を 含ん で な る 、1. It comprises a gene sequence encoding the ribosome constituent protein L41 of Candida * utilis,
D N A配列。 DNA array.
2 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の リ ボ ソ ー ム 構成蛋 白 質 L 4 1 が図 1 4 に記載の ア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 6 ) を有す る も の で あ る 、 請求項 1 記載の D N A配列。  2. The protein L41 of the ribosome of Candida utilis has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) shown in FIG. The DNA sequence according to claim 1, wherein the DNA sequence is:
3 . プ ロ モ ー タ ー配列、 お よ び タ ー ミ ネ ー タ 一配列 を さ ら に 含ん でな る 、 請求項 1 ま た は 2 記載の D N A配 列。  3. The DNA sequence according to claim 1 or 2, further comprising a promoter sequence and a terminator sequence.
4 . 図 1 3 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 5 ) を有 す る 、 請求項 3 記載の D N A配列。  4. The DNA sequence according to claim 3, which has the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) shown in FIG.
5 . 図 1 4 に記載の ア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 6 ) の 5 6 番 目 の プ ロ リ ン が グゾレ タ ミ ン に 置換 さ れた ア ミ ノ 酸配列 を有す る 蛋 白 質で あ っ て、 酵母 に シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性を付与す る シ ク ロ へキ シ ミ ド耐性型 L 4 1 蛋 白 質 を.コ ー ドす る 遺伝子配列 を 含ん で な る 、 D N A配列。  5. A protein having an amino acid sequence in which the 56th proline of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) shown in Fig. 14 has been substituted with guzoletamine. A cycloheximide-resistant L41 protein that confers cycloheximide resistance to yeast, and does not include the gene sequence that encodes it. The DNA sequence.
6 . 請求項 5 記載の D N A配列 を 含ん で な る 、 ブ ラ ス ミ ド。  6. A plasmid comprising the DNA sequence of claim 5.
7 . 図 6 ( b ) の 制限酵素地図で表 さ れ る 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の r R N A遺伝子群を 含ん で な る 、 約 1 3 . 5 k b の D N A 断片お よ び そ の部分 D N A配列 7. An approximately 13.5 kb DNA fragment, containing the Candida utilis rRNA gene group, represented by the restriction map in Fig. 6 (b). And its partial DNA sequence
8 . 請求項 7 記載の 約 1 3 . 5 k b の D N A 断片を 反復 し て含ん で な る 、 D N A配列。 8. The about 13.5 kb DNA fragment according to claim 7 A DNA sequence that is repeatedly contained.
9 . 請求項 7 記載の D N A配列 を含ん で な る 、 ブ ラ ス ミ ド。  9. A plasmid comprising the DNA sequence of claim 7.
1 0 . サ ッ カ ロ ミ セ ス * セ レ ビ シ ェ酵母 の u r a 3 変異を相補す る 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由来の オ ル チ ジ ン 一 5 ' 一 フ ォ ス フ エ 一 ト デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ A 5′-one fragment derived from Candida utilis that complements the ura3 mutation in Saccharomyces cerevisiae yeast. Office decal box lase
( U R A 3 ) 蛋 白 質を コ ー ドす る 遣伝子配列 を含ん でな る 、 D N A配列。 A DNA sequence comprising a gene sequence encoding a (URA3) protein.
1 1 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由来の U R A 3 蛋 白質が図 1 0 お よ び図 1 1 に記載の ア ミ ノ 酸配列 （配列 番号 ： 4 ) る 、 請求項 1 0 記載の D N A配列。  11. The URA3 protein derived from Candida dutilis has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) shown in FIGS. 10 and 11. DNA sequence according to 0.
1 2 . 図 9 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 3 ) 、 ま た は サ ッ カ ロ ミ セ ス · セ レ ビ シ ェ酵母 の u r a 3 変異 を 相補す る 機能を保持す る そ の 部分配列 を含ん で な る 、 請 求項 1 1 記載の  1 2. The nucleotide sequence shown in Fig. 9 (SEQ ID NO: 3) or the portion that retains the function to complement the ura3 mutation of Saccharomyces cerevisiae yeast Claim 11 comprising an array.
D N A配列。  DNA array.
1 3 . 請求項 1 2 記載の D N A配列 を含ん で な る 、 ラ ス ミ ド。  13. A lasmid comprising the DNA sequence of claim 12.
1 4 . キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の ホ ス ホ グ リ セ リ ン 酸キ ナ ー ゼ （ P G K ) 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー配列。  14 4. Candida utilis hoshoglycerinate kinase (PGK) gene promoter sequence.
1 5 . 図 3 に 記載の塩基配列 （配列番号 ： 2 ) の う ち 少な く と も 9 4 6 番〜 1 3 4 6 番 ま で の配列 を有す る 配列、 ま た は P G K遺伝子 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る そ の 部分配列 を含ん で な る 、 請求項 1 4 記載の P G K遺伝 子プ ロ モ ー タ ー配列。 15 5. A sequence having at least 946 to 1346 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) shown in Fig. 3, or a PGK gene pro 15. The PGK gene according to claim 14, which comprises a partial sequence having motor activity. Child promoter array.
1 6 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の P G K遣伝子 タ 一 ミ ネ ー タ ー配列。  16 6. Candidate * PKG transmitter terminal array of utilities.
1 7 . 図 2 に記載の 塩基配列 （配列番号 ： 1 ) 、 ま た は P G K遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー 活性を有す る そ の 部分 配列 を 含ん でな る 、 請求項 1 6 記載の P G K遣伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー配列。  17. The method according to claim 16, comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 2 (SEQ ID NO: 1) or a partial sequence thereof having PGK gene terminator activity. PGK terminator sequence.
1 8 . 請求項 1 4 ま た は 1 5 記載の P G K遺伝子 プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 請求項 1 6 ま た は 1 7 記載の P G K 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一配列 と を含ん で な る 、 遺伝子発現 ュ ニ ッ 卜 0  18. A PGK gene mouth motor sequence according to claim 14 or 15, and a PGK gene terminator sequence according to claim 16 or 17. Gene expression unit 0
1 9 . 請求項 1 8 記載の 遺伝子発現ュニ ッ ト を含ん で な る 、 プ ラ ス ミ ド。  19. A plasmid comprising the gene expression unit according to claim 18.
2 0 . プ ラ ス ミ ド p P G K P T 3 、 p P G K P T 4 ま た は P P G K P T 5 で あ る 、 請求項 1 9 記載の プ ラ ス ミ ドヽ  20. The plasmid according to claim 19, wherein the plasmid is pPGKPT3, pPGKT4 or PPKGPT5.
2 1 . 請求項 1 4 ま た は 1 5 記載の P G K遺伝子 プ 口.モ ー タ ー配列 と 、 そ の配列 の下流 に連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と を含ん で な る 、 D N A配列。  21. The PGK gene port according to claim 14 or 15, wherein the DNA sequence comprises a motor sequence and a heterologous gene linked downstream of the sequence. .
2 2 . 請求項 1 4 ま た は 1 5 記載の P G K遺伝子 プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 そ の配列 の 下流 に 連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と 、 そ の異種遺伝子の下流 に連結 さ れて な る 請 求項 1 6 ま た は 1 7 記載の P G K遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 配列 と を含ん で な る 、 D N A配列。 22. The PGK gene mouth motor sequence according to claim 14 or 15, a heterologous gene linked downstream of the sequence, and a downstream gene linked to the heterologous gene A DNA sequence comprising the PGK gene terminator sequence according to claim 16 or 17.
2 3 . キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス の グ リ セ ロ ア ノレ デ ヒ ド ー 3 — リ ン酸デ ヒ ド ロ ゲナ ー ゼ （ G A P ) 遺伝子プ 口 モ ー タ ー配列。 23. Candida 《Glycerol Anore Dehyde 3 of Utilis 3 — Phosphate dehydrogenase (GAP) gene motor sequence.
2 4 . 図 3 0 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 7 ) 、 ま た は G A P 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る そ の部分 配列 を含んで な る 、 請求項 2 3 記載の G A P 遣伝子プ ロ モ ー タ ー配列。  24. The method according to claim 23, comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 30 (SEQ ID NO: 7) or a partial sequence having GAP gene promoter activity. GAP gene promoter promoter sequence as described.
2 5 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の G A P 遣伝子 夕 一 ミ ネ ー タ ー配列。  25. Gap transmitter of the CANDU DUTILIS * 1.
2 6 . 図 3 1 に記載の塩基配列 （配列番号 ： 8 ) 、 ま た は G A P 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー 活性を有す る そ の 部 分配列 を含ん で な る 、 請求項 2 5 記載の G A P 遺伝子 タ 一 ミ ネ ー タ ー 配列。  26. The method according to claim 25, comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 31 (SEQ ID NO: 8) or a partial sequence thereof having GAP gene terminator activity. The described GAP gene terminator sequence.
2 7 . 請求項 2 3 ま た は 2 4 記載の G A P 遺伝子プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 請求項 2 5 ま た は 2 6 記載の G A P 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一配列 と を 含ん で な る 、 遺伝子発現 ュニ ッ ト  27. A GAP gene promoter motor sequence according to claim 23 or 24 and a GAP gene terminator sequence according to claim 25 or 26. Gene expression unit
..  ..
2 8 . 請求項 2 7 記載の遺伝子発現ュニ ッ ト を含ん で な る 、 プ ラ ス ミ ド 。 28. A plasmid comprising the gene expression unit according to claim 27.
2 9 . プ ラ ス ミ ド p G A P P T l ま た は p G A P P T 2 で あ る 、 請求項 2 6 記載の プ ラ ス ミ ド。  29. The plasmid of claim 26, wherein the plasmid is pGAPPTl or pGAPPT2.
3 0 . 請求項 2 3 ま た は 2 4 記載の G A P 遺伝子 プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 そ の配列 の 下流 に連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と を含ん で な る 、 D N A配列。 30. A DNA sequence comprising the GAP gene promoter motor sequence according to claim 23 or 24, and a heterologous gene linked downstream of the sequence.
3 1 . 請求項 2 3 ま た は 2 4 記載の G A P 遺伝子プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 そ の配列 の下流 に連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と 、 そ の異種遺伝子の下流 に連結 さ れて な る 請 求項 2 5 ま た は 2 6 記載の G A P 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 配列 と を 含ん で な る 、 D N A配列。 31. The GAP gene promoter motor sequence according to claim 23 or 24, a heterologous gene ligated downstream of the sequence, and ligated downstream of the heterologous gene A DNA sequence comprising the GAP gene terminator sequence according to claim 25 or 26.
3 2 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 原形質膜 プ ロ ト ン A T P a s e ( P M A ) 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー配列。  32 2. Candida utilis plasma membrane protein ATPase (PMA) gene promoter sequence.
3 3 . 図 3 4 に記載の塩基 （配列配列番号 ： 9 ) 、 ま た は P M A 遣伝子 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る そ の部分 配列 を含ん で な る 、 請求項 3 2 記載の P M A 遺伝子 プ ロ モ ー タ ー配列。  33. The method according to claim 32, which comprises the base (SEQ ID NO: 9) shown in Fig. 34 or a partial sequence thereof having PMA gene promoter activity. The described PMA gene promoter sequence.
3 4 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の P M A 遺伝子 タ 一 ミ ネ ー タ ー配列。  3 4. The primer sequence of the CMA gene of Candida * utilis.
3 5 . 図 3 5 に記載の 塩基配列 （配列番号 ： 1 0 ) ま た は P M A 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ ー 活性を有す る そ の 部 分配列 を含ん で な る 、 請求項 3 4 記載の P M A 遺伝子 タ 一 ミ ネ ー タ ー配列。  35. The method according to claim 34, comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 35 (SEQ ID NO: 10) or a partial sequence thereof having PMA gene terminator activity. The described PMA gene terminal sequence.
.  .
3 6 . 請求項 3 2 ま た は 3 3 記載の P M A 遺伝子プ 口 モ ー タ ー 配列 と 、 請求項 3 4 ま た は 3 5 記載の P M A 遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一配列 と を 含ん で な る 、 遺伝子発現 ュニ ッ ト o 36. A PMA gene promoter motor sequence according to claim 32 or 33 and a PMA gene terminator single sequence according to claim 34 or 35. A gene expression unit
3 7 . 請求項 3 6 記載の遺伝子発現ユ ニ ッ ト を含ん で な る 、 プ ラ ス ミ ド。  37. A plasmid comprising the gene expression unit according to claim 36.
3 8 . プ ラ ス ミ ド D M A P T I で あ る 、 請求項 3 7 記載の プ ラ ス ミ ド。 38. Claim 37, which is a Plusmid DMAPTI The described plush.
3 9 . 請求項 3 2 ま た は 3 3 記載の P M A遺伝子 プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 そ の 配列 の下流 に連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と を 含ん で な る 、 D N A配列。  39. A DNA sequence comprising the PMA gene promoter motor sequence according to claim 32 or 33, and a heterologous gene linked downstream of the sequence.
4 0 . 請求項 3 2 ま た は 3 3 記載の P M A遺伝子 プ 口 モ ー タ ー配列 と 、 そ の配列 の下流 に連結 さ れて な る 異 種遺伝子 と 、 そ の異種遣伝子の下流 に連結 さ れて な る 請 求項 3 4 ま た は 3 5 記載の P M A遺伝子 タ ー ミ ネ ー タ 一 配列 と を 含ん で な る 、 D N A配列。  40. The PMA gene promoter motor sequence according to claim 32 or 33, a heterologous gene linked downstream of the sequence, and downstream of the heterologous gene A DNA sequence comprising the PMA gene terminator sequence according to claim 34 or 35, which is linked to:
4 1 . 請求項 2 1 、 2 2 、 3 0 、 3 1 、 3 9 、 4 0 の い ずれか一項記載の D N A配列で宿主細胞を形質転換 し 、 該形質転換細胞を培養 し て異種遺伝子を発現 さ せ る こ と を 含ん で な る 、 異種遣伝子の 発現法。  41. A host cell is transformed with the DNA sequence according to any one of claims 21, 22, 30, 31, 31, 39 and 40, and the transformed cell is cultured to obtain a heterologous gene. A method for expressing a heterologous gene, comprising expressing a gene.
4 2 . 宿主細胞が酵母で あ る 、 請求項 4 1 記載の異種 遺伝子の 発現法。  42. The method for expressing a heterologous gene according to claim 41, wherein the host cell is yeast.
4 3 . 宿主細胞がキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で あ る 請求項 4 2 記載の異種遺伝子の 発現法。  43. The method for expressing a heterologous gene according to claim 42, wherein the host cell is a Candida utilis.
.4 4 . キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A と 相 同 な 配列 ( 「相同 D N A配列」 ） と 、 形質転換体選択 の た め の マ ー カ ー 遺伝子 と 、 そ し て場合 に よ っ て異種遺 伝子 と を含ん で な る ベ ク タ ー で あ っ て、 前記相同 D N A 配列 内 に お い て制限酵素切断 さ れ直鎖状 と さ れて 、 相 同 組換え に よ っ て異種遺伝子を キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A に 組み込む こ と がで き る 、 ベ ク タ ー 。 .4 4. A sequence homologous to the chromosomal DNA of Candida utilis ("homologous DNA sequence"), a marker gene for selection of transformants, and A vector comprising a heterologous gene as the case may be, wherein the homologous DNA sequence is cleaved with a restriction enzyme into a linear form to form a homologous group. A vector capable of integrating a heterologous gene into the chromosomal DNA of a Candida dutilis by replacement.
4 5 . 前記マ 一 力 一遺伝子 と 、 場合 に よ っ て前記異 種遣伝子 と を 含ん だ D N A 配列が、 そ の両端 に お い て前 記相 同 D N A 配列 に挟 ま れて な り 、 該相 同 D N A 配列 に お い て制限酵素切断 さ れ直鎖状 と さ れて、 相同組換え に よ っ て前記 D N A 配列 を キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 染 色体 D N A に組み込む こ と がで き る 、 請求項 4 4 記載の ベ ク タ ' o 45. A DNA sequence containing the above-mentioned gene and, in some cases, the above-mentioned heterologous gene, must be sandwiched between the homologous DNA sequences at both ends thereof. The homologous DNA sequence is cleaved with a restriction enzyme to form a linear form, and the DNA sequence is subjected to homologous recombination to obtain a chromosome of Candida utilis. The vector according to claim 44, which can be incorporated into DNA.
4 6 3±  4 6 3 ±
. 刖 記相同 D N A 配列が、 求項 1 〜 5 い ずれ か一項記載の r R N A 遺伝子配列 ま た は そ の一部の D N A 配列 を含ん で な る も の で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の ベ ク タ O  The method according to claim 44, wherein the homologous DNA sequence comprises the rRNA gene sequence of any one of claims 1 to 5 or a partial DNA sequence thereof. Or O described in 45
4 7 . 前記相同 D N A 配列が、 請求項 7 〜 8 い ずれ か一項記載の U R A 3 遺伝子配列 ま た は そ の一部の D N A 配列 を含ん で な る も の 、 で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の べ ク 夕 一。  47. The said homologous DNA sequence is one comprising the URA3 gene sequence or any part of the DNA sequence according to any one of claims 7 to 8. 4 or 4 1
4 8 . 前記相 同 D N A 配列が、 請求項 1 0 〜 1 2 い ずれか—項記載の L 1 遣伝子配列 ま た は そ の一部の D. N A 配列 を含ん で な る も の で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の ベ ク タ o  48. The homologous DNA sequence comprises the L1 gene sequence according to any one of claims 10 to 12 or a part of the DNA sequence. Yes, the vector according to claim 44 or 45
4 9 . 前記相 同 D N A 配列が、 P G K 遺伝子配列 を 含ん で な る も の で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の ベ ク タ 一 0  49. The vector according to claim 44 or 45, wherein said homologous DNA sequence comprises a PGK gene sequence.
5 0 . 前記相同 D N A 配列が、 G A P 遺伝子配列 を 含ん で な る も の で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の ベ ク タ 一。 50. The method according to claim 44 or 45, wherein the homologous DNA sequence comprises a GAP gene sequence. Kuta one.
5 1 . 前記相同 D N A配列が、 P M A遗伝子配列を 含ん で な る も の で あ る 、 請求項 4 4 ま た は 4 5 記載の ベ ク タ 一。  51. The vector according to claim 44 or 45, wherein the homologous DNA sequence comprises a PMA gene sequence.
5 2 . マ ー カ ー 遺伝子が薬剤耐性マ ー カ ー遺伝子で あ る 、 請求項 4 4 〜 5 1 の い ずれか一項 に記載の ベ ク タ  52. The vector according to any one of claims 44 to 51, wherein the marker gene is a drug-resistant marker gene.
5 3 . 薬剤耐性 マ ー カ ー遺伝子が シ ク ロ へキ シ ミ ド 耐性を付与す る 遣伝子で あ る 、 請求項 5 2 記載の ベ ク タ 53. The vector of claim 52, wherein the drug-resistant marker gene is a gene that imparts cycloheximide resistance.
5 4 . シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性を付与す る 遺伝子が シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子であ る 、 請求項 5 3 記載の べ ク タ ー。 54. The vector according to claim 53, wherein the gene that imparts cycloheximide resistance is a cycloheximide-resistant L41 gene.
5 5 . シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐性型 L 4 1 遣伝子 と し て 請求項 5 記載の D N A配列 を含ん で な る 、 請求項 5 4 記 載の べ ク タ ー 。  55. The vector according to claim 54, which comprises the DNA sequence according to claim 5 as a cycloheximide resistant L41 gene.
5 6 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で機能す る プ ロ モ 一.タ ー で発現す る 薬剤耐性 マ ー カ ー遺伝子を含ん で な る 請求項 5 2 記載の ベ ク タ ー 。  56. The vector according to claim 52, comprising a drug-resistant marker gene expressed in a promoter that functions in a Canadian * utility. Tar.
5 7 . 薬剤耐性 マ ー カ ー 遺伝子が抗生物質 G 4 1 8 耐性を付与す る 遺伝子で あ る 、 請求項 5 6 記載の ベ ク タ ο  57. The vector according to claim 56, wherein the drug resistance marker gene is a gene that confers resistance to the antibiotic G418.
5 8 . 抗生物質 G 4 1 8 耐性を付与す る 遺伝子が、 バ ク テ リ ア ト ラ ン ス ポ ゾ ン T n 9 0 3 由 来 の ア ミ ノ グ リ コ シ ド ー 3 ' — ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ A P T ) 遣 伝子で あ る 、 請求項 5 7 記載の ベ ク タ ー。 5 8. The gene that confers resistance to the antibiotic G 4 18 is an amino acid derived from bacterium transposon Tn903. 58. The vector of claim 57, which is a cosid 3'-hosphotransferase (APT) gene.
5 9 . 薬剤耐性 マ ー カ ー遺伝子が抗生物質ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を付与す る 遺伝子で あ る 、 請求項 5 6 記 載の ベ ク タ ー 。  59. The vector according to claim 56, wherein the drug-resistant marker gene is a gene that confers resistance to the antibiotic Hygromycin B.
6 0 . 抗生物質ハ イ グ ロ マ イ シ ン B 耐性を付与す る 遣伝子が、 大腸菌 プ ラ ス ミ ド 由来の ハ イ グ ロ マ イ シ ン B ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ヱ ラ ー ゼ （ H P T ) 遺伝子で あ る 、 請 求項 5 9 記載の ベ ク タ ー 。  60. The gene that confers resistance to the antibiotic Hygromycin B is Hygromycin B phosphotransfer derived from Escherichia coli plasmid. The vector according to claim 59, which is a rose (HPT) gene.
6 1 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で機能す る プ ロ モ 一 夕 一配列 と 、 該 プ ロ モ ー タ ー配列 に よ り 発現す る 異種 遣伝子を含ん で な り 、 場合 に よ っ て さ ら に タ ー ミ ネ ー タ 一配列 を含ん で な る 、 請求項 4 4 〜 6 0 いずれか一項記 載の ベ ク タ ー 。  61 1. It does not include a promoter sequence that functions in a candid * utility and a heterologous gene that is expressed by the promoter sequence. The vector of any one of claims 44 to 60, optionally further comprising an array of terminators.
6 2 . プ ロ モ ー タ ー配列 ま た は タ ー ミ ネ ー タ 一配列 がキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 由 来の も の で あ る 、 請求項 6 1 記載の ベ ク タ ー 。  62. The vehicle according to claim 61, wherein the promoter array or the terminator array is derived from a candidutility. Cutter.
. 6 3 . プ ロ モ ー タ ー配列が請求項 1 4 、 1 5 、 2 3 2 4 、 3 2 、 3 3 の い ずれか一項 に 記載の プ ロ モ ー タ ー 配列 で あ り 、 タ ー ミ ネ ー タ 一配列が請求項 1 6 、 1 7 、 2 5 、 2 6 、 3 4 、 3 5 の い ずれか一項 に記載の タ ー ミ ネ ー タ ー配列で あ る 、 請求項 6 2 記載の ベ ク タ ー 。  6 3. The promoter array is the promoter array according to any one of claims 14, 15, 23, 24, 32, and 33, The terminal array according to any one of claims 16, 17, 25, 26, 34, and 35, wherein the terminal array is the terminal array according to any one of claims 16, 17, 25, 26, 34, and 35. The vector according to Item 62.
6 4 . 請求項 4 4 〜 6 3 の い ずれか一項 に記載の ベ ク タ 一 でキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換 し 、 薬剤 耐性 と な っ た形質転換体を選択す る こ と を含んでな る 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 形質転換法。 64. A method for transforming a candida * utilis with the vector according to any one of claims 44 to 63, wherein the method comprises the steps of: A method of transforming a Candida utilis, comprising selecting a transformant that has become resistant.
6 5 . 請求項 4 4 〜 6 3 の い ずれか一項記載の べ ク タ ー の D N A配列力く キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 染色体 に 保持 さ れ る 、 請求項 6 4 記載の 形質転換法。  65. The DNA sequence of the vector according to any one of claims 44 to 63, which is retained on a chromosome of a Candida utilis. The transformation method according to 4.
6 6 . ベ ク タ ー D N A配列力くキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 染色体 に多 コ ピ ー で導入 さ れ る 、 請求項 6 5 記載 の 形質転換法。  66. The transformation method according to claim 65, wherein the vector DNA sequence is introduced into the chromosome of the Candida utilis in multiple copies.
6 7 . マ ー カ ー遣伝子 と し て の シ ク ロ へ キ シ ミ ド耐 性型 L 4 1 遣伝子を 含ん で な る ベ ク タ ー を用 い る 、 請求 項 6 6 記載の形質転換法。  67. A claim according to claim 66, wherein a vector containing a cycloheximide resistant type L41 generative element as a marker element is used. Transformation method.
6 8 . r R N A遺伝子配列 を 含ん で な る ベ ク タ ー を 用 い、 そ の 結果高頻度で形質転換体が得 ら れ る 、 請求項 6 7 記載の形質転換法。  68. The method according to claim 67, wherein a transformant is obtained at a high frequency by using a vector comprising the rRNA gene sequence.
6 9 . ベ ク タ ー の マ ー カ ー遺伝子力 シ ク ロ へ キ シ ミ ド 耐 性型 L 4 1 遣 伝子 で あ る べ ク タ ー を 用 い る 請求項 6 8 記載の形質転換法。  69. The transformation according to claim 68, wherein a vector which is a gene resistant to L-41 of the vector is used. Law.
.7 0 . ベ ク タ ー D N A配列が相 同組換え に よ っ て染 色体 に導入 さ れ る 、 請求項 6 4 〜 6 9 の い ずれか一項記 載の 形質転換法。  70. The transformation method according to any one of claims 64 to 69, wherein the vector DNA sequence is introduced into the chromosome by homologous recombination.
7 1 . ベ ク タ ー D N A配列力く U R A 3 遺伝子座、 L 4 1 遺伝子座、 P G K遺伝子座、 G A P 遺伝子座、 ま た は P M A遺伝子座 に 保持 さ れ る 請求項 7 0 記載の 形質転 換法。 71. The transformation of claim 70, wherein the vector DNA sequence is harbored at the URA3 locus, the L41 locus, the PGK locus, the GAP locus, or the PMA locus. Law.
7 2 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス が A T C C 7 2 .Candidate * Utility is ATCCC
9 2 5 6 、 A T C C 9 2 2 6 、 お よ び A T C C 9 9 5 0 か ら な る 群か ら 選択 さ れ る も の で あ る 、 請求項 6 4 〜Claims 64 to Claim 94, which are selected from the group consisting of 9256, ATCCC226, and ATCCC950.
7 1 の い ずれか一項記載の 形質転換法。 71. The transformation method according to any one of 1).
7 3 . 電気パ ル ス 法 に よ る 、 請求項 6 4 〜 7 2 の い ずれか一項 に 記載の形質転換法。  73. The transformation method according to any one of claims 64 to 72, wherein the transformation method is an electric pulse method.
7 4 . 電気パ ル ス 条件が、 菌生存率が 1 0 〜 4 0 % で あ り 、 タ イ ム コ ン ス タ ン ト 力く 1 0 〜 2 0 ミ リ 秒 で あ る 請求項 7 3 記載の形質転換法。  7 4. Claim 7 3, wherein the electric pulse condition is that the bacterial viability is 10 to 40% and the time constant is 10 to 20 milliseconds. The transformation method as described above.
7 5 . 自 律複製機能を有す る D N A 断片であ っ て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内 で、 当該 D N A 断片を含む ベ ク タ ー を、 染色体外要素で あ る プ ラ ス ミ ド と し て保持 さ せ、 宿主の形質転換頻度を増加 さ せ る こ と がで き る 、 D N A断片。  7 5. A DNA fragment that has an autonomous replication function, and the vector containing the DNA fragment is an extrachromosomal element in a Candida dutilis. A DNA fragment that can be retained as a plasmid and increase the frequency of transformation of a host.
7 6 . 前記 自 律複製 D N A 断片が酵母由来で あ る 、 請求項 7 5 記載の D N A 断片。  76. The DNA fragment of claim 75, wherein said autonomously replicating DNA fragment is derived from yeast.
7 7 . 前記酵母がキ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス で あ る 睛.求項 7 6 記載の D N A断片。  77. The DNA fragment according to claim 76, wherein the yeast is a Candida utilis.
7 8 . 前記 自 律複製 D N A 断片が図 4 1 お よ び 4 2 に記載の 塩基配列 （配列番号 ： 1 1 ) 、 ま た は 自 律複製 機能を有す る そ の 部分配列 を 含ん で な る 、 D N A 断片。  78. The autonomously replicating DNA fragment does not contain the nucleotide sequence shown in FIGS. 41 and 42 (SEQ ID NO: 11) or a partial sequence having an autonomous replication function. A DNA fragment.
7 9 . 前記 自 律複製 D N A 断片が図 4 3 お よ び 4 4 に 記載の塩基配列 （配列番号 ： 1 2 ) 、 ま た は 自 律複製 機能を有す る そ の 部分配列 を含ん で な る 、 D N A 断片。 79. The autonomously replicating DNA fragment does not include the nucleotide sequence shown in FIGS. 43 and 44 (SEQ ID NO: 12) or a partial sequence having an autonomous replication function. A DNA fragment.
8 0 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換で き 、 さ ら に請求項 7 5 〜 7 9 の いずれか一項 に記載の D N A 断片 を 含ん で な り 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 内 で ブ ラ ス ミ ド と し て存在 し 得 る 、 ベ ク タ ー 。 80. A candida * utilis that can be transformed and further comprises a DNA fragment according to any one of claims 75 to 79, wherein the DNA fragment comprises a DNA fragment according to any one of claims 75 to 79. A vector that can exist as a brassmid in a Didactylist.
8 1 . 選択マ ー カ ー遺伝子 と し て請求項 5 6 〜 6 0 の い ずれか一項 に記載の 薬剤耐性遺伝子を含ん で な る 、 請求項 8 0 記載の ベ ク タ ー 。  81. The vector according to claim 80, wherein the vector comprises the drug resistance gene according to any one of claims 56 to 60 as a selection marker gene.
8 2 . キ ャ ン デ ィ ダ * ュ デ ィ リ ス 酵母の形質転換法 で あ っ て、  8 2) This is a method for transforming a candida * yeast strain.
請求項 7 5 〜 7 9 い ずれか一項に 記載の 自 律複製能を 有す る D N A 断片お よ び選択マ ー カ ー遺伝子を含ん でな る プ ラ ス ミ ド と 、  A plasmid comprising a DNA fragment capable of autonomous replication according to any one of claims 75 to 79 and a selection marker gene,
キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A と 相同 な D N A配列 （ 「相同 D N A配列」 ） を両末端 に有す る D N A 断片 と  A DNA fragment having a DNA sequence homologous to the chromosome DNA of Candida utilis ("homologous DNA sequence") at both ends;
で キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母を 同時 に形質転換 し 、 該酵母の う ち 前記 プ ラ ス ミ ド に よ っ て形質転 ^ さ れ た形 霄.転換体を選択 し 、 さ ら に相同 な D N A配列 を有す る 断 片が染色体上 に 組み込 ま れ た形質転換体を選択す る こ と か ら な る 、 形質転換法。 , And simultaneously transforming a candida * utilis yeast with the yeast, and selecting a transformant transformed from the yeast by the above plasmid. And a transformation method comprising selecting a transformant in which a fragment having a more homologous DNA sequence has been integrated into the chromosome.
8 3 . 請求項 8 2 で得 ら れ る 形質転換体を、 さ ら に 非選択条件下で培養 し て前記 プ ラ ス ミ ド を脱落 さ せ る こ と に よ り 、 外来 D N A 断片を含むが、 選択 マ ー カ ー 遺伝 子を 含 ま な い株を選択す る 方法。 83. The transformant obtained in claim 82 is further cultured under non-selective conditions to remove the plasmid, thereby containing a foreign DNA fragment. How to select strains that do not contain the selectable marker gene.
8 4 . 前記 プ ラ ス ミ ドが請求項 8 1 記載の ベ ク タ ー で あ る 、 請求項 8 2 記載の 形質転換法。 84. The method according to claim 82, wherein the plasmid is the vector according to claim 81.
8 5 . 相 同 D N A配列 を両末端 に 有す る D N A断片 が異種遺伝子を含む も の で あ る 、 請求項 8 2 の形質転換 法  85. The transformation method according to claim 82, wherein the DNA fragment having a homologous DNA sequence at both ends is a DNA fragment containing a heterologous gene.
8 6 . 異種遺伝子を 含む D N A配列 と 、 キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス の 染色体 D N A と 相 同 な配列 （ 「相 同 D N A配列」 ） と を 含ん で な り 、 かつ マ ー カ ー遺伝子を 含 ま な い ベ ク タ ー で あ っ て、 前記異種遺伝子を 含む D N A配列が そ の 両端 に お い て前記相同 D N A配列 に挟 ま れて な り 、 前記相 同 D N A配列 に お い て制限酵素切断 さ れ直鎖状 と さ れて、 相 同組換え に よ っ て前記異種遣伝 子を含む D N A配列 を キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス の 染色 体 D N A に組み込む こ と がで き る 、 ベ ク タ ー。  8 6. It contains a DNA sequence containing a heterologous gene and a sequence homologous to the chromosomal DNA of Candida utilis (“homologous DNA sequence”), and The vector does not contain the gene, and the DNA sequence containing the heterologous gene is sandwiched between the homologous DNA sequences at both ends thereof. The DNA sequence containing the heterologous gene is converted into a chromosomal DNA of a Candida utilis by homologous recombination. Vectors that can be incorporated.
' 8 7 . 相 同 D N A配列が、 請求項 1 〜 5 い ずれか一 項 に記載の r R N A遺伝子配列、 請求項 7 〜 8 い ずれか 一項 に記載の P M A遺伝子配列の U R A 3 遣伝子配列、 靖.求項 1 0 〜 1 2 い ずれか一項 に記載の L 4 1 遺伝子配 列、 P G K遺伝子配列、 G A P 遺伝子配列、 ま た は P M A遺伝子配列 の う ち い ずれか、 ま た は そ れ ら の 部分 D N A配列か ら 選択 さ れ る 、 請求項 8 6 記載の ベ ク タ ー 。  '87. The homologous DNA sequence is the rRNA gene sequence according to any one of claims 1 to 5, and the URA3 gene of the PMA gene sequence according to any one of claims 7 to 8. The L41 gene sequence, the PGK gene sequence, the GAP gene sequence, or the PMA gene sequence according to any one of claims 10 to 12; or The vector according to claim 86, wherein the vector is selected from those partial DNA sequences.
8 8 . 異種遺伝子を 含む D N A配列 で形質転換 さ れ た、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 形質転換体。  8 8. A Candida utilis transformant transformed with a DNA sequence containing a heterologous gene.
8 9 . 異種遺伝子を含む D N A配列が請求項 4 4 〜 6 3 いずれか一項 に 記載の ベ ク タ ー で あ る 、 請求項 8 8 記載の キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 形質転換体。 8 9. The DNA sequence containing a heterologous gene is claimed in claim 44. 63. The Candida ducilis transformant according to claim 88, which is the vector according to any one of claims.
9 0 . 異種遺伝子を含む D N A 配列が請求項 8 6 ま た は 8 7 記載の ベ ク タ ー で あ る 、 請求項 8 8 記載の キ ヤ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス 形質転換体。  90. The Candida utililis transformant according to claim 88, wherein the DNA sequence containing the heterologous gene is the vector according to claim 86 or 87. .
9 1 . 選択マ ー カ ー遺伝子を 含 ま な い、 請求項 9 0 記載の キ ヤ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス 形質転換体。  91. The Candida utilis transformant according to claim 90, which does not contain a selection marker gene.
9 2 . キ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス 力く A T C C  9 2. Candida << Utility
9 2 5 6 、 A T C C 9 2 2 6 . お よ び A T C C 9 9 5 0 か ら な る 群力、 ら 選択 さ れ る も の で あ る 、 請求項 8 8 〜 Claims 88 to 92, which are selected from the group consisting of ATCC 925 and ATCC 925.
9 1 の いずれか一項 に 記載の キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 形質転換体。 91. The Candida utilis transformant according to any one of 1 to 9 above.
9 3 . 異種遺伝子 に よ り コ ー ド さ れ る ペ プチ ド の製 造法で あ っ て、 請求項 8 8 〜 9 2 の い ずれか一項 に 記載 の キ ャ ン デ ィ ダ · ュ テ ィ リ ス形質転換体を培養 し 、 該培 養物か ら 異種遣伝子の 発現産物を単離、 精製す る こ と を 含ん で な る 、 方法。  93. A method for producing a peptide coded by a heterologous gene, which is described in any one of claims 88 to 92. A method comprising culturing a T. cerevisiae transformant, and isolating and purifying an expression product of a heterologous gene from the culture.
.9 4 . 選択マ ー カ ー遺伝子 と し て、 転写の た め の プ 口 モ ー タ ー配列 を持 た な い 薬剤耐性遺伝子を含ん で な り キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母内 で、 プ ラ ス ミ ド と し て 存在 し う る 、 請求項 8 1 記載の プ ラ ス ミ ド。  .9 4. As a selectable marker gene, it must contain a drug resistance gene that does not have a transcriptional motor sequence for transcription. 28. The plasmid of claim 81, which is present as a plasmid in yeast.
9 5 . 薬剤耐性遺伝子が G 4 1 8 耐性 を与え る パ ク テ リ ア ト ラ ン ス ポ ゾ ン T n 9 0 3 由 来の A P T 遺伝子で あ る 、 請求項 9 4 記載の プ ラ ス ミ ド。 95. The plus or minus plasmid according to claim 94, wherein the drug resistance gene is an APT gene derived from a pacteria transposon Tn903 conferring G418 resistance. Mid.
9 6 . プ ラ ス ミ ド p P C V 2 で あ る 、 請求項 9 5 記 載 の プ ラ ス ミ ド。 96. A plusmid according to claim 95, which is plusmid pPCV2.
9 7 . 請求項 9 4 〜 9 6 の いずれか一項 に記載の プ ラ ス ミ ドの薬剤耐性遺伝子の 5 ' 側 に D N A の制限酵素 部分分解断片を ク ロ ー ン 化 し た D N A ラ イ ブ ラ リ 一 に よ つ て、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス を形質転換 し 、 当該薬 剤耐性 と な る 形質転換体を選択 し 、 そ の形質転換体か ら 回収 さ れ る プ ラ ス ミ ド D N A 力、 ら キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母内 で機能す る 転写 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 断片を単離す る 、 転写 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A の単離方法。  97. A DNA line obtained by cloning a restriction enzyme partially degraded fragment of DNA on the 5 'side of the drug resistance gene of the plasmid according to any one of claims 94 to 96. The library is used to transform a Candida utilis, a transformant having the drug resistance is selected, and the transformant is recovered from the transformant. To isolate DNA fragments with transcriptional promoter activity that function in Candida utilis yeast. A method for isolating DNA having motor activity.
9 8 . 制限酵素で部分分解 さ れ た D N Aがキ ャ ン デ イ ダ · ュ テ ィ リ ス酵母染色体 D N A で あ る 、 請求項 9 7 記載の方法。  98. The method according to claim 97, wherein the DNA partially digested with a restriction enzyme is a Candida utilis yeast chromosome DNA.
9 9 . 請求項 9 7 ま た は 9 8 記載の方法 に よ り 単離 さ れ得 る 、 キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス 酵母内 で転写 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る D N A 断片。  99. A transcription promoter activity in a Candida utilis yeast, which can be isolated by the method according to claim 97 or 98. DNA fragment.
1 0 0 . D N A 断片が制限酵素 A l u l 、  100. The DNA fragment is the restriction enzyme Alu
H a e 1 I 1 、 ま た は R s a I 、 も し く は そ の組み 合わせ の 制限酵素分解 に よ り 染色体か ら 切 り 出 さ れ、 かつ 0 . 8 〜 1 . 8 k b の 長 さ を有す る 、 請求項 9 9 記載の D N A 断片。  Hae 1 I 1 or Rsa I or a combination thereof is cut out from the chromosome by restriction enzyme digestion and has a length of 0.8 to 1.8 kb. The DNA fragment according to claim 99, which has the DNA fragment.
1 0 1 . 図 4 8 に記載の 塩基配列 （配列番号 ： 1 3 ) 、 ま た は キ ャ ン デ ィ ダ * ュ テ ィ リ ス酵母内 で転写 プ ロ モ ー タ ー 活性を有す る そ の 部分配列を含ん で な る 、 D N A 断片。 . 101. The nucleotide sequence shown in Fig. 48 (SEQ ID NO: 13), or transcribed in yeast Candida utilis A DNA fragment comprising a partial sequence having promoter activity. .
1 0 2 . 請求項 9 9 〜 ： L 0 1 の いずれか 1 つ に記載 の プ ロ モ ー タ ー配列 と 、 そ の 下流 に連結 さ れてな る 異種 遺伝子 と を含ん で な る 、 D N A配列。  Claims 99-: DNA comprising the promoter sequence according to any one of L011 and a heterologous gene linked downstream thereof. Array.
1 0 3 . 請求項 1 0 2 記載の D N A配列で宿主細胞 を形質転換 し 、 当該形質転換細胞を培養 し て異種遺伝子 を発現 さ せ る こ と を 含ん で な る 、 異種遺伝子の発現法。  103. A method for expressing a heterologous gene, comprising transforming a host cell with the DNA sequence of claim 102 and culturing the transformed cell to express the heterologous gene.
1 0 4 . 宿主細胞がキ ャ ン デ ィ ダ 《 ュ テ ィ リ ス で あ る 、 請求項 1 0 3 記載の 異種遺伝子の 発現法。  104. The method for expressing a heterologous gene according to claim 103, wherein the host cell is Candida utilis.
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